FR2809744A1

FR2809744A1 - METHOD FOR THE PRODUCTION AND CRYOPRESERVATION OF CATTLE EMBRYOS DEVELOPED IN VITRO AND FROZEN FLAKE FOR THE DIRECT TRANSFER THEREOF

Info

Publication number: FR2809744A1
Application number: FR0007096A
Authority: FR
Inventors: Catherine Joly; Leguienne Brigitte Mi Marquant; Patrice Christian Humblot
Original assignee: UNION NATIONALE DES COOPERATIV
Current assignee: UNION NATIONALE DES COOPERATIV
Priority date: 2000-06-02
Filing date: 2000-06-02
Publication date: 2001-12-07
Anticipated expiration: 2020-06-02
Also published as: AU2001274167A1; WO2001092478A1; FR2809744B1; EP1287117A1

Abstract

The invention concerns a method for producing cryopreserved bovine embryos from bred oocytes in vitro comprising the following steps: 1) maturing and breeding bovine oocytes in vitro; 2) culturing in vitro said bred oocytes until the morula or blastocyst stage; 3) selecting quality 1 embryos; 4) freezing the selected embryos. The culturing step (2) is a co-culture on a mat of Vero cells carried out serum-free, and the freezing step (4) is carried out while the embryo is conditioned in a freezing medium containing a glycerol-trehalose mixture as cryoprotectant.

Description

L'invention se rapporte à une méthode de production et de cryoconservation d'embryons bovins développés in vitro et à une paillette congelée pour le transfert direct de ceux-ci. The invention relates to a method for the production and cryopreservation of bovine embryos developed in vitro and to a frozen straw for direct transfer thereof.

Au cours de ces 10 dernières années, les techniques de production de l'embryon bovin in vitro ont atteint un niveau d'efficacité élevé si bien qu'aujourd'hui de nombreuses sociétés privées et laboratoires proposent cette technologie pour produire de façon régulière des embryons bovins. Toutefois, pour accroître l'impact de cette biotechnologie dans les élevages et l'utiliser à grande échelle dans les programmes d'amélioration génétique, il est indispensable de disposer d'une méthode fiable de congélation de ce embryons. Over the past 10 years, the techniques for producing the bovine embryo in vitro have reached a high level of efficiency, so that today many private companies and laboratories offer this technology to produce embryos on a regular basis. cattle. However, to increase the impact of this biotechnology on farms and to use it on a large scale in genetic improvement programs, it is essential to have a reliable method of freezing this embryo.

Chez la plupart des mammifères domestiques, les embryons développés in vivo sont congelés selon des méthodes lentes basées sur le maintien de l'équilibre osmotique entre les cellules embryonnaires et leur milieu environnant. La cryoconservation se déroule typiquement en trois étapes principales : - le pré-traitement : équilibration des embryons en une ou plusieurs étapes dans un cryoprotecteur perméable de type polyols afin de limiter la formation de glace intracellulaire et les stress osmotiques en présence de glace extracellulaire ; - le traitement : refroidissement des embryons, stockage dans l'azote liquide (-196 C) et réchauffement ; - le post-traitement : étapes de dilution du cryoprotecteur perméable afin de rétablir au mieux les qualités biologiques des embryons cryoconservés. In most domestic mammals, embryos developed in vivo are frozen using slow methods based on maintaining the osmotic balance between embryonic cells and their surrounding environment. Cryopreservation typically takes place in three main stages: - pre-treatment: balancing of embryos in one or more stages in a permeable cryoprotective of the polyol type in order to limit the formation of intracellular ice and osmotic stress in the presence of extracellular ice; - treatment: cooling of embryos, storage in liquid nitrogen (-196 C) and warming; - post-treatment: stages of dilution of the permeable cryoprotective in order to best restore the biological qualities of cryopreserved embryos.

La nature du cryoprotecteur, sa concentration compatible avec une toxicité limitée, les vitesses de refroidissement et de réchauffement qui vont régir les mouvements de l'eau à travers les membranes cellulaires sont des facteurs déterminants du succès des méthodes de cryoconservation. Ainsi, le choix d'un cryoprotecteur pour un type de cellule donné dépend non seulement des propriétés physico-chimiques qu'il manifeste en solution mais aussi de ses propriétés biologiques sur les cellules. Des études sur les modalités d'addition et de dilution du cryoprotecteur ont abouti à la The nature of the cryoprotector, its concentration compatible with limited toxicity, the cooling and heating rates which will govern the movement of water through cell membranes are determining factors for the success of cryopreservation methods. Thus, the choice of a cryoprotective for a given type of cell depends not only on the physicochemical properties which it manifests in solution but also on its biological properties on the cells. Studies on the modalities of addition and dilution of the cryoprotector have led to the

simplification des protocoles de congélation de l'embryon bovin développé in vivo tout en améliorant leur efficacité. L'utilisation d'un cryoprotecteur non perméable comme le saccharose dans la solution de dilution a permis tout d'abord de limiter le nombre des étapes de dilution du cryoprotecteur perméable. Le saccharose élève la pression osmotique du milieu extracellulaire ce qui a pour effet de limiter les mouvements de l'eau vers l'intérieur des cellules pendant que le cryoprotecteur perméable diffuse à l'extérieur des cellules au moment de la décongélation. Par la suite, diverses méthodes ont été proposées pour éviter cette étape de dilution et permettre le transfert direct de l'embryon après décongélation sans manipulation supplémentaire : - équilibration des embryons dans une solution de glycérol 1,5 M et conditionnement en paillette en incluant la solution de dilution (0,5 à 1 M de saccharose) de part et d'autre du milieu de congélation comme décrit par J.P. simplification of the bovine embryo freezing protocols developed in vivo while improving their efficiency. The use of a non-permeable cryoprotector such as sucrose in the dilution solution made it possible first of all to limit the number of stages of dilution of the permeable cryoprotector. Sucrose raises the osmotic pressure of the extracellular medium which has the effect of limiting the movement of water towards the interior of the cells while the permeable cryoprotective diffuses outside the cells at the time of thawing. Subsequently, various methods have been proposed to avoid this dilution step and allow direct transfer of the embryo after thawing without additional manipulation: - equilibration of the embryos in a 1.5 M glycerol solution and packaging in flake including the dilution solution (0.5 to 1 M sucrose) on either side of the freezing medium as described by JP

Renard et coll., Ann. Méd. Vét., 126 : 23-32 (1982), et par S. P. Leibo, Theriogenology, 21 : 767-790 (1984). Renard et al., Ann. Med. Vet., 126: 23-32 (1982), and by S. P. Leibo, Theriogenology, 21: 767-790 (1984).

- équilibration des embryons dans une solution de glycérol 1,4 M additionnée de 0,25 M de saccharose et conditionnement en paillettes en incluant la solution de dilution (0,5 M de saccharose) comme décrit par K. Touati et coll., Ann. Méd. Vét., 134 : 249-251 (1990). La présence de saccharose pendant l'équilibration entraîne une déshydratation partielle des cellules avant le refroidissement. La conséquence est une augmentation de la concentration intracellulaire en glycérol et en solutés ce qui limite la cristallisation intracellulaire ; - équilibration des embryons dans une solution d'éthylène glycol 1,5 M. - equilibration of the embryos in a 1.4 M glycerol solution with 0.25 M sucrose and packaging in flakes including the dilution solution (0.5 M sucrose) as described by K. Touati et al., Ann . Med. Vet., 134: 249-251 (1990). The presence of sucrose during equilibration leads to partial dehydration of the cells before cooling. The consequence is an increase in the intracellular concentration of glycerol and of solutes which limits the intracellular crystallization; - equilibration of the embryos in a 1.5 M ethylene glycol solution.

La vitesse de pénétration de l'éthylène glycol est élevée et proche de celle de l'eau. Ainsi les embryons tolèrent une réhydratation directe dans le milieu de conservation sans passer par des étapes de dilution, comme décrit par Voelkel et Hu , Theriogenology, 37 : 687-697 (1992). The penetration speed of ethylene glycol is high and close to that of water. Thus the embryos tolerate direct rehydration in the preservation medium without going through dilution steps, as described by Voelkel and Hu, Theriogenology, 37: 687-697 (1992).

Les taux de gestation après transfert direct d'un embryon bovin développé in vivo et congelé selon la méthode au glycérol-saccharose ou à l'éthylène glycol sont voisins de 50 % ou même supérieurs. The gestation rates after direct transfer from a bovine embryo developed in vivo and frozen according to the glycerol-sucrose or ethylene glycol method are close to 50% or even higher.

Les premières tentatives de cryoconservation des embryons cultivés in vitro ont souligné la difficulté d'utiliser directement les techniques de congélation appliquées à grande échelle pour l'embryon développé in vivo (Leibo et Loskutoff, Theriogenology, 39 : 81-94 (1993). De nombreux protocoles de cryoconservation ont été élaborés mais leur efficacité a été le plus souvent validée par des taux de survie in vitro après décongélation et culture in vitro. Seules quelques études rapportent des taux de gestation après transplantation d'un embryon sur un nombre significatif de receveuses. The first attempts to cryopreserve embryos cultured in vitro have highlighted the difficulty of directly using the freezing techniques applied on a large scale for the embryo developed in vivo (Leibo and Loskutoff, Theriogenology, 39: 81-94 (1993). numerous cryopreservation protocols have been developed but their efficacy has most often been validated by in vitro survival rates after thawing and in vitro culture. Only a few studies report pregnancy rates after embryo transplantation on a significant number of recipients .

Ces taux sont très variables et restent insuffisants pour une application dans les élevages, comme illustré par le tableau ci-après. These rates are highly variable and remain insufficient for application in farms, as illustrated by the table below.

Tableau 1 : Efficacité des méthodes de congélation lente appliquées à l'embryon bovin développé in vitro Auteurs Cryoprotecteur Dilution du Taux de cryoprotecteur gestation, % (1) 1,4 M glycérol 4 étapes 11,3% (28/248) (2) 1,4 M glycérol + 0,2 M 1 étape 23 % saccharose (4/17) (3) 1,2 M glycérol 4 étapes 14% (5/35) (4) 1,4 M glycérol 3 étapes 35% (34/97) (5) 3,6 M éthylène glycol 1 étape 34,1% (14/41) (6) 1,4 M glycérol 3 étapes 35% (156/446) Table 1: Effectiveness of slow freezing methods applied to bovine embryos developed in vitro Authors Cryoprotective Dilution of the rate of cryoprotective gestation,% (1) 1.4 M glycerol 4 steps 11.3% (28/248) (2) 1.4 M glycerol + 0.2 M 1 step 23% sucrose (4/17) (3) 1.2 M glycerol 4 steps 14% (5/35) (4) 1.4 M glycerol 3 steps 35% ( 34/97) (5) 3.6 M ethylene glycol 1 step 34.1% (14/41) (6) 1.4 M glycerol 3 steps 35% (156/446)

(1) Reichenbach H. D., Liebrich J., berg U et Brem G., 1991 : Pregnancyresults following transfer of frozen-thawed in vitro produced bovine embryos to récipients. 7th Scientific meeting of the European Embryo
Transfer Association, 14-15 September, Cambridge, 198. (1) Reichenbach HD, Liebrich J., berg U and Brem G., 1991: Pregnancyresults following transfer of frozen-thawed in vitro produced bovine embryos to recipients. 7th Scientific meeting of the European Embryo
Transfer Association, 14-15 September, Cambridge, 198.

(2) Massip A., Mermillod P., Wils C. et Dessy F., 1993 : of dilution procédure and culture conditions after thawing on survival of frozen bovine blastocysts produced in vitro. J. Reprod. Fert., 97 : 65-69. (2) Massip A., Mermillod P., Wils C. and Dessy F., 1993: of dilution procedure and culture conditions after thawing on survival of frozen bovine blastocysts produced in vitro. J. Reprod. Fert., 97: 65-69.

(3) Wurth Y. A., Reinders J.M.C., Rail W. F. et Kruip T.A.M., 1994 :
Developpment potential of in vitro produced bovine embryos following cryopreservation and single-embryo transfer. Theriogenology, 42 :
1275-1284 (4) Hasler J. F. , Henderson W. B., Hurtgen P. J., Jin Z.Q., McCauley A. D.,
Mower S.A., Neely B., Shuey L. S., Stokes J. E. et Trimmer S.A., 1995 :
Production, freezing and transfer of bovine IVF embryos and subséquent calving results. Theriogenology, 43 : 141-152. (3) Wurth YA, Reinders JMC, Rail WF and Kruip TAM, 1994:
Development potential of in vitro produced bovine embryos following cryopreservation and single-embryo transfer. Theriogenology, 42:
1275-1284 (4) Hasler JF, Henderson WB, Hurtgen PJ, Jin ZQ, McCauley AD,
Mower SA, Neely B., Shuey LS, Stokes JE and Trimmer SA, 1995:
Production, freezing and transfer of bovine IVF embryos and subsequent calving results. Theriogenology, 43: 141-152.

(5) Sommerfeld V. et Niemann H., 1999 : of bovine in vitro produced embryos using ethylene glycol in controlled freezing or vitrification. Cryobiology, 38 : 95105. (5) Sommerfeld V. and Niemann H., 1999: of bovine in vitro produced embryos using ethylene glycol in controlled freezing or vitrification. Cryobiology, 38: 95105.

(6) Van Wagtendonk-de Leeuw A.M., Mullaart E., de Roos A.P.W., Merton
J. S., den Daas J.H.G., Kemp B. et de Ruigh L., 2000 : Effects of différent reproduction techniques : AI, MOET or IVP, on health and welfare of bovine offspring. Theriogenology, 53 : 575-597. (6) Van Wagtendonk-de Leeuw AM, Mullaart E., de Roos APW, Merton
JS, den Daas JHG, Kemp B. and de Ruigh L., 2000: Effects of different reproduction techniques: AI, MOET or IVP, on health and welfare of bovine offspring. Theriogenology, 53: 575-597.

Ainsi donc, à la connaissance de la demanderesse, on ne dispose pas, à ce jour, de méthode de production d'embryons bovins développés in vitro et cryoconservés pouvant être utilisée par des éleveurs avec des taux de réussite (pourcentage de gestations menées à terme) satisfaisants, et susceptible d'être employée dans les schémas de sélection ou à des fins commerciales en particulier pour l'exportation. Thus, to the knowledge of the plaintiff, to date, there is no method of producing bovine embryos developed in vitro and cryopreserved which can be used by breeders with success rates (percentage of gestations completed ) satisfactory, and capable of being used in breeding schemes or for commercial purposes, in particular for export.

L'invention vise à combler cette lacune en fournissant une méthode de production perfectionnée d'embryons bovins développés in vitro et cryoconservés susceptibles d'être implantés par transfert direct. The invention aims to fill this gap by providing an improved production method for bovine embryos developed in vitro and cryopreserved capable of being implanted by direct transfer.

Plus précisément, l'invention concerne une méthode de production d'embryons bovins cryoconservés à partir d'ovocytes fécondés in vitro qui comprend les étapes suivantes : (1) maturer et féconder in vitro des ovocytes bovins ; (2) cultiver in vitro lesdits ovocytes fécondés jusqu'au stade morula ou blastocyste ; (3) sélectionner les embryons de qualité 1 ; et (4) congeler les embryons sélectionnés, caractérisée en ce que l'étape de culture (2) est une co-culture sur un tapis de cellules Vero effectuée en l'absence de sérum, et en ce que l'étape de congélation (4) est effectuée tandis que l'embryon est conditionné dans un milieu de congélation contenant un mélange glycérol-tréhalose comme cryoprotecteur. More specifically, the invention relates to a method for producing cryopreserved bovine embryos from in vitro fertilized oocytes which comprises the following steps: (1) maturing and in vitro fertilizing bovine oocytes; (2) culturing said fertilized oocytes in vitro up to the morula or blastocyst stage; (3) select quality 1 embryos; and (4) freezing the selected embryos, characterized in that the culture step (2) is a co-culture on a Vero cell mat carried out in the absence of serum, and in that the freezing step ( 4) is carried out while the embryo is conditioned in a freezing medium containing a glycerol-trehalose mixture as cryoprotector.

L'étape de culture (2) est une co-culture d'ovocytes fécondés sur un tapis de cellules Vero (lignée de cellules épithéliales de rein de singe). Cette technique de co-culture est bien connue en soi et décrite notamment par C. Guyader-Joly et coll., 12th Congress of European Embryo Transfer Association, 136, (1996) et par L. M.C. Pegoraro et coll., Theriogenology 49 : 1579-1590 (1998). The culture step (2) is a co-culture of fertilized oocytes on a mat of Vero cells (monkey kidney epithelial cell line). This co-culture technique is well known in itself and described in particular by C. Guyader-Joly et al., 12th Congress of European Embryo Transfer Association, 136, (1996) and by LMC Pegoraro et al., Theriogenology 49: 1579- 1590 (1998).

Contrairement aux préconisations usuelles, on a trouvé que cette coculture doit être effectuée dans un milieu exempt de sérum. Le milieu de coculture utilisé peut être le milieu synthétique pour la culture cellulaire dénommé "B2 INRA" ou de préférence le milieu dénommé "Upgraded B2 INRA". Le milieu B2 INRA est décrit en détail par Yves Ménézo, C. R. Acad. Sc. Paris, t.282, (14 juin 1976), Série D, pages 1967-1970. Le milieu "Upgraded B2 INRA" ne diffère du milieu "B2 INRA" que par l'utilisation de constituants répondant à des critères de sécurité poussés. Contrary to the usual recommendations, it has been found that this coculture must be carried out in a medium free of serum. The coculture medium used can be the synthetic medium for cell culture called "B2 INRA" or preferably the medium called "Upgraded B2 INRA". The B2 INRA medium is described in detail by Yves Ménézo, C. R. Acad. Sc. Paris, t.282, (June 14, 1976), Series D, pages 1967-1970. The "Upgraded B2 INRA" medium differs from the "B2 INRA" medium only in the use of constituents that meet advanced safety criteria.

On a trouvé, en effet, que la présence de sérum était néfaste à l'aptitude à la congélation/décongélation des embryons bovins résultants, les embryons développés en présence de sérum, tel que le sérum de veau, présentant après décongélation un taux de survie in vitro et un taux de gestation après transplantation inférieurs. It was found, in fact, that the presence of serum was detrimental to the freezing / thawing ability of the resulting bovine embryos, the embryos developed in the presence of serum, such as calf serum, exhibiting a survival rate after thawing. in vitro and lower gestation rate after transplantation.

Selon un mode de mise en oeuvre particulier préféré, le refroidissement de l'embryon sélectionné est précédée de deux étapes successives d'équilibration de cet embryon, la première étant effectuée dans un milieu de congélation additionné de glycérol et la deuxième dans un milieu de congélation additionné d'un mélange de glycérol et de tréhalose. Avantageusement, la congélation est opérée tandis que l'embryon est conditionné dans une paillette en matière plastique, dans le milieu de congélation contenant, comme cryoprotecteur, le mélange glycérol-tréhalose. According to a particular preferred embodiment, the cooling of the selected embryo is preceded by two successive stages of equilibration of this embryo, the first being carried out in a freezing medium supplemented with glycerol and the second in a freezing medium with a mixture of glycerol and trehalose. Advantageously, the freezing is carried out while the embryo is conditioned in a plastic straw, in the freezing medium containing, as cryoprotective, the glycerol-trehalose mixture.

La paillette peut être de tout type couramment utilisé pour la congélation d'embryons de mammifères. The straw can be of any type commonly used for freezing mammalian embryos.

L'invention concerne également une paillette congelée utile pour le transfert direct d'un embryon bovin caractérisée en ce qu'elle comprend une zone centrale dans laquelle se trouve l'embryon dans un milieu de congélation contenant, comme cryoprotecteur, un mélange de glycérol et de tréhalose et deux zones extrêmes dans lesquelles se trouve une solution de tréhalose, chaque zone extrême étant séparée de la zone centrale par une bulle d'air. Un telle paillette congelée, après décongélation, autorise un transfert direct aisé de l'embryon à la vache receveuse à l'aide d'un pistolet de transfert, sans avoir à effectuer un traitement de dilution préalable du cryoprotecteur. The invention also relates to a frozen straw useful for the direct transfer of a bovine embryo, characterized in that it comprises a central zone in which the embryo is found in a freezing medium containing, as cryoprotective, a mixture of glycerol and of trehalose and two end zones in which there is a solution of trehalose, each end zone being separated from the central zone by an air bubble. Such frozen straw, after thawing, allows easy direct transfer from the embryo to the recipient cow using a transfer gun, without having to perform a prior dilution treatment of the cryoprotector.

De préférence, l'embryon bovin est un blastocyste. Preferably, the bovine embryo is a blastocyst.

Le milieu de congélation peut être constitué, à titre illustratif, d'une solution saline de tampon phosphate (PBS) additionnée de sérum de veau foetal (SVF) ou autre sérum. La proportion de SVF peut aller, par exemple, de 5 % à 40 % en volume. La concentration de tréhalose peut aller, par exemple, de 0,1 M à 0,5 M. Elle est de préférence d'environ 0,2 M . La proportion de glycérol peut aller de 8 % à 11 % en volume, de préférence de 8 à 10 % en volume. Elle est avantageusement d'environ 9 % en volume. La concentration de tréhalose dans les zones extrêmes est, de préférence, plus élevée que dans la zone centrale. Elle peut aller de 0,2 M à 1 M. De préférence, elle est d'environ 0,5 M . The freezing medium can consist, by way of illustration, of a saline solution of phosphate buffer (PBS) supplemented with fetal calf serum (SVF) or other serum. The proportion of SVF can range, for example, from 5% to 40% by volume. The trehalose concentration can range, for example, from 0.1 M to 0.5 M. It is preferably about 0.2 M. The proportion of glycerol can range from 8% to 11% by volume, preferably from 8 to 10% by volume. It is advantageously around 9% by volume. The trehalose concentration in the extreme zones is preferably higher than in the central zone. It can range from 0.2 M to 1 M. Preferably, it is around 0.5 M.

L'exemple non limitatif suivant est donné afin de bien faire comprendre la méthode de l'invention. The following nonlimiting example is given in order to clearly understand the method of the invention.

I) PRODUCTION DES EMBRYONS IN VITRO
A) Collecte des ovocytes par ponction folliculaire
Les ovaires sont prélevés à l'abattoir immédiatement après l'éviscération des femelles. Ils sont désinfectés à l'alcool 70 et transportés au laboratoire dans du tampon phosphate (PBS) à une température de 30-35 C, de préférence d'environ 30-32 C dans un délai 3 à 6 heures, de préférence de 4 heures. Les ovocytes sont collectés par aspiration des follicules visibles à la surface de l'ovaire (2 à 8 mm) à l'aide d'une pompe péristaltique à débit constant reliée à une aiguille 18 G x 11/2 TW (1,2 x 40 mm). Le liquide folliculaire est recueilli dans un tube de 50 ml. Après sédimentation, le culot cellulaire est prélevé et dilué dans du milieu M 199 tamponné par 25 mM d'hépès (M 7528, Sigma) additionné de 10% de sérum de vache en oestrus, 5 g/ml de gentamicine (G 1264, Sigma), 100 UI/ml de pénicilline G (P 4875, Sigma), 50 pg/ml de streptomycine (S 9137, Sigma) et 20 pg/ml de nystatine (N 4014, Sigma). I) PRODUCTION OF IN VITRO EMBRYOS
A) Collection of oocytes by follicular puncture
The ovaries are removed from the slaughterhouse immediately after the females are gutted. They are disinfected with alcohol 70 and transported to the laboratory in phosphate buffer (PBS) at a temperature of 30-35 C, preferably about 30-32 C within 3 to 6 hours, preferably 4 hours . The oocytes are collected by aspiration from the visible follicles on the surface of the ovary (2 to 8 mm) using a peristaltic pump with constant flow rate connected to an 18 G x 11/2 TW needle (1.2 x 40 mm). Follicular fluid is collected in a 50 ml tube. After sedimentation, the cell pellet is removed and diluted in M 199 medium buffered with 25 mM of hepatis (M 7528, Sigma) supplemented with 10% of cow serum in estrus, 5 g / ml of gentamicin (G 1264, Sigma ), 100 IU / ml of penicillin G (P 4875, Sigma), 50 μg / ml of streptomycin (S 9137, Sigma) and 20 μg / ml of nystatin (N 4014, Sigma).

Les ovocytes peuvent également être prélevés chez l'animal vivant, sous échographie et de façon répétée (Nibart et coll., 1995). Dans les deux cas, les complexes ovocyte - cumulus compact (COC) sont recherchés sous la loupe binoculaire. Les ovocytes immatures sont sélectionnés sur des critères morphologiques : ovocytes entourés d'au moins 3 couches de cellules du cumulus compact avec un cytoplasme non granuleux de couleur homogène. Oocytes can also be collected from live animals, under ultrasound and repeatedly (Nibart et al., 1995). In both cases, the oocyte - cumulus compact (COC) complexes are searched under the binocular microscope. Immature oocytes are selected on morphological criteria: oocytes surrounded by at least 3 layers of compact cumulus cells with a non-granular cytoplasm of homogeneous color.

B) Maturation in vitro des ovocytes
Les COC sont maturés pendant 20-24 heures à 38,5 C sous une atmosphère de 5% de C02 dans l'air en présence ou non de cellules de la granulosa. Le milieu de maturation est composé de M199 (N 31150014, Gibco) tamponné au bicarbonate et supplémenté de 10 % de sérum de veau foetal (SVF, Hyclone), 10 g/ml de FSH-LH (Stimufol N. D., Mérial), 1 g/ml d'oestradiol 17ss (E 2257, Sigma). Un facteur de croissance peut, facultativement, être ajouté. B) In vitro maturation of oocytes
The COCs are matured for 20-24 hours at 38.5 C under an atmosphere of 5% of CO 2 in the air in the presence or not of granulosa cells. The maturing medium is composed of M199 (N 31150014, Gibco) buffered with bicarbonate and supplemented with 10% fetal calf serum (SVF, Hyclone), 10 g / ml of FSH-LH (Stimufol ND, Mérial), 1 g / ml of estradiol 17ss (E 2257, Sigma). A growth factor can optionally be added.

C) Préparation de la semence et fécondation in vitro des ovocytes
Les spermatozoïdes sont sélectionnés pour la fécondation selon la technique de migration ascendante. Après décongélation d'une paillette de C) Preparation of semen and in vitro fertilization of oocytes
Sperm are selected for fertilization using the upward migration technique. After thawing a straw of

semence dans un bain-marie à 37 C pendant 30 secondes, son contenu est vidé délicatement dans le fond d'un cryotube contenant 1 ml de sperm-TALP (Parrish et coll., 1988). Le sperm-TALP est une solution de lactate-tyrode modifiée (pH = 7,2) contenant 6 mg/ml d'albumine bovine sérique (BSA, A 7906, Sigma) et 1,0 mM de Na-pyruvate (P 2256, Sigma). Après 45 minutes d'incubation à 38,5 C, la fraction supérieure contenant les spermatozoïdes les plus mobiles est prélevée puis centrifugée pendant 10 minutes à 200 g. La concentration en spermatozoïdes dans le culot cellulaire est estimée après comptage sur une cellule de Thoma. seed in a water bath at 37 C for 30 seconds, its content is carefully emptied into the bottom of a cryotube containing 1 ml of sperm-TALP (Parrish et al., 1988). Sperm-TALP is a modified lactate-tyrode solution (pH = 7.2) containing 6 mg / ml of serum bovine albumin (BSA, A 7906, Sigma) and 1.0 mM Na-pyruvate (P 2256, Sigma). After 45 minutes of incubation at 38.5 ° C., the upper fraction containing the most mobile spermatozoa is removed and then centrifuged for 10 minutes at 200 g. The sperm concentration in the cell pellet is estimated after counting on a Thoma cell.

Après la maturation in vitro, les ovocytes à cumulus expansé sont lavés deux fois dans le milieu de fécondation et placés par groupe de 20 à 25 dans des tubes à hémolyse contenant 500 l de fert-TALP (Parrish et coll., 1988). After in vitro maturation, the oocytes with expanded cumulus are washed twice in the fertilization medium and placed in groups of 20 to 25 in hemolysis tubes containing 500 l of fert-TALP (Parrish et al., 1988).

Cette solution de lactate-tyrode modifiée (pH = 7,6) contient 6 mg/ml de BSA (Sigma) et 0,2 mM de Na-pyruvate. Le milieu de fécondation est également supplémenté de 10 g/ml d'héparine (H 3393, Sigma), 20 M de D-pénicillamine (P 4875, Sigma), 10 M d'hypotaurine (H 1384, Sigma) et 1 M d'adrénaline (E 4250, Sigma). Les ovocytes et les spermatozoïdes à une concentration finale de 1 x 106/ml sont incubés pour une durée de 16 à 20 heures, de préférence d'environ 18 heures à 38,5 C sous une atmosphère de 5% de CO2. This modified lactate-tyrode solution (pH = 7.6) contains 6 mg / ml of BSA (Sigma) and 0.2 mM of Na-pyruvate. The fertilization medium is also supplemented with 10 g / ml of heparin (H 3393, Sigma), 20 M of D-penicillamine (P 4875, Sigma), 10 M of hypotaurine (H 1384, Sigma) and 1 M d adrenaline (E 4250, Sigma). Oocytes and spermatozoa at a final concentration of 1 x 106 / ml are incubated for a period of 16 to 20 hours, preferably about 18 hours at 38.5 C under an atmosphere of 5% CO2.

D) Préparation des tapis de cellules Vero
La lignée établie de cellules Vero (Mérial) a été multipliée selon le protocole décrit par Ménézo et coll. (1990). A partir d'un cryotube contenant 2 à 3 x 106 cellules congelées, des flacons de culture de 25 cm2 (S20/C160, Falcon) sont ensemencés à raison de 1 x 106cellules/flacon dans du milieu M199 (N 31150014, Gibco) + 10% SVF. Après 4 jours de culture à 38,5 C sous 5% de CO2 dans l'air, les cellules sont à confluence (6 à 8 X 106 cellules par flacon de culture) et décollées avec une solution de trypsine à 0,05% (T 4174, Sigma) préparée dans du milieu de Hank's (N 04104175, Gibco). D) Preparation of Vero cell mats
The established Vero (Mérial) cell line was multiplied according to the protocol described by Ménézo et al. (1990). From a cryotube containing 2 to 3 x 10 6 frozen cells, 25 cm2 culture flasks (S20 / C160, Falcon) are seeded at the rate of 1 x 10 6 cells / flask in M199 medium (N 31150014, Gibco) + 10% SVF. After 4 days of culture at 38.5 ° C. under 5% CO 2 in air, the cells are at confluence (6 to 8 × 10 6 cells per culture flask) and detached with a 0.05% trypsin solution ( T 4174, Sigma) prepared in Hank's medium (N 04104175, Gibco).

Après inactivation de l'enzyme par addition de SVF (VA/) et centrifugation à 1000 g pendant 10 minutes, les cellules sont ensemencées à des densités différentes en fonction de la surface de culture. L'inoculum est de 1 X 106 cellules par flacon de 25 cm2 et de 1 x 103cellules par microgoutte de 50 l After inactivation of the enzyme by addition of SVF (VA /) and centrifugation at 1000 g for 10 minutes, the cells are seeded at different densities depending on the culture surface. The inoculum is 1 X 106 cells per 25 cm2 bottle and 1 x 103 cells per 50 l microdrop

recouverte d'huile minérale (M 3516, Sigma). Les cellules restantes sont congelées. covered with mineral oil (M 3516, Sigma). The remaining cells are frozen.

La méthode de congélation et de décongélation des cellules est celle décrite par Ouhibi et coll. (1990) légèrement modifiée. Les cellules sont congelées à raison de 2 à 3 x 106 cellules dans du milieu M199 (N 31150014, Gibco) supplémenté de 50% de SVF et de 10% de diméthyl sulfoxide (DMSO, D 5879, Sigma). La courbe de congélation est la suivante : - 1 C/min de +2 C à -10 C ; - 2 C/min de - 10 C à -30 C ; - 10 C/min de -30 C à - 150 C. The method of freezing and thawing cells is that described by Ouhibi et al. (1990) slightly modified. The cells are frozen at a rate of 2 to 3 × 10 6 cells in M199 medium (N 31150014, Gibco) supplemented with 50% of SVF and 10% of dimethyl sulfoxide (DMSO, D 5879, Sigma). The freezing curve is as follows: - 1 C / min from +2 C to -10 C; - 2 C / min from - 10 C to -30 C; - 10 C / min from -30 C to - 150 C.

Les cellules sont alors plongées très rapidement dans l'azote liquide et stockées à -196 C. The cells are then immersed very quickly in liquid nitrogen and stored at -196 C.

La décongélation est effectuée dans un bain-marie à 37 C. Son contenu est vidé dans 1 ml de SVF puis centrifugé 10 minutes à 1000 g. Le culot cellulaire est resuspendu dans du milieu M199 + 10% SVF et les cellules sont ensemencées selon le protocole précédemment décrit. Thawing is carried out in a 37 C water bath. Its contents are emptied into 1 ml of FCS and then centrifuged for 10 minutes at 1000 g. The cell pellet is resuspended in M199 medium + 10% FCS and the cells are seeded according to the protocol previously described.

E) Culture in vitro des embryons
Après la fécondation in vitro, les cellules du cumulus et les spermatozoïdes surnuméraires accolés à la zone pellucide sont enlevés mécaniquement par agitation au vortex pendant 1 minute. Les zygotes sont ensuite lavés une fois dans le fert-TALP puis deux fois dans le milieu de culture (milieu dénommé Upgraded B2 INRA, disponible auprès du Laboratoire C.C.D, 60 rue Pierre Charron, 75008 Paris). Les zygotes sont cultivés par groupes de 20 à 25 dans des microgouttes de 50 l de milieu Upgraded B2 sans sérum (contrairement à ce qui est généralement préconisé) recouvertes d'huile (M 3516, Sigma) sur des monocouches préétablies (appelées aussi "tapis") de cellules Vero (Ménézo et coll., 1990). E) In vitro culture of embryos
After in vitro fertilization, the cumulus cells and the supernumerary sperm attached to the pellucid zone are removed mechanically by vortexing for 1 minute. The zygotes are then washed once in fert-TALP and then twice in the culture medium (medium called Upgraded B2 INRA, available from the CCD Laboratory, 60 rue Pierre Charron, 75008 Paris). The zygotes are cultivated in groups of 20 to 25 in 50 l microdrops of Upgraded B2 medium without serum (contrary to what is generally recommended) covered with oil (M 3516, Sigma) on pre-established monolayers (also called "carpets"") of Vero cells (Ménézo et al., 1990).

La culture est réalisée dans un incubateur à 38,5 C sous 5% de C02 dans l'air pendant 7 jours (jour 0 = jour de l'insémination in vitro). Les embryons non segmentés sont enlevés du milieu de culture à J2. Les embryons jugés de qualité 1 (selon les critères de l'IETS, International Embryo Transfer Society), sont sélectionnés pour la congélation à J7. The culture is carried out in an incubator at 38.5 ° C. under 5% CO 2 in air for 7 days (day 0 = day of insemination in vitro). Unsegmented embryos are removed from the culture medium on D2. The embryos judged to be of quality 1 (according to the criteria of the IETS, International Embryo Transfer Society), are selected for freezing on D7.

Il) CONGELATION DES BLASTOCYSTES
Les embryons de qualité 1 sont lavés dans 10 bains successifs de solution saline de tampon phosphate (PBS, IMV) selon les recommandations IETS (1990). Tous les milieux de congélation sont préparés à partir d'une base constituée de solution saline de tampon phosphate (PBS, IMV) additionné de 20% SVF, et utilisés à température ambiante. Les embryons sont équilibrés en deux étapes successives de 10 minutes dans un milieu constitué de la base ci-dessus additionnée de 5 % en volume de glycérol (G 7757, Sigma) puis dans un milieu de congélation constitué de la base cidessus additionnée de 9 % en volume de glycérol + 0,2 M de tréhalose (18,835-2, Sigma). Les embryons sont conditionnés en paillettes de 250 l (N 005592, IMV) par aspiration successive de : tréhalose 0,5 M (sur une longueur de 3 cm), bulles d'air, milieu de base additionné de 9 % de glycérol, et de tréhalose 0,2 M contenant l'embryon (sur une longueur de 1,5 cm), bulle d'air, tréhalose 0,5 M (sur une longueur de 6 cm). Chaque paillette est alors fermée par un jonc plastique puis déposée horizontalement sur un portoir métallique. Celui-ci est placé à température ambiante dans l'enceinte d'un congélateur biologique programmé (Nicoolbag MS 21, Air Liquide). II) FREEZING BLASTOCYSTS
Quality 1 embryos are washed in 10 successive baths of phosphate buffered saline (PBS, IMV) according to the IETS recommendations (1990). All freezing media are prepared from a base consisting of saline phosphate buffer (PBS, IMV) added with 20% FCS, and used at room temperature. The embryos are balanced in two successive steps of 10 minutes in a medium consisting of the above base added with 5% by volume of glycerol (G 7757, Sigma) then in a freezing medium consisting of the above base added with 9% by volume of glycerol + 0.2 M trehalose (18.835-2, Sigma). The embryos are packaged in 250 l flakes (N 005592, IMV) by successive aspiration of: 0.5 M trehalose (over a length of 3 cm), air bubbles, base medium supplemented with 9% glycerol, and 0.2 M trehalose containing the embryo (over a length of 1.5 cm), air bubble, 0.5 M trehalose (over a length of 6 cm). Each straw is then closed with a plastic rod and then placed horizontally on a metal rack. This is placed at room temperature in the enclosure of a programmed biological freezer (Nicoolbag MS 21, Air Liquide).

L'ensemble est refroidi à une vitesse de 1,5 C/min jusqu'à -7 C. Après 3 à 4 minutes à -7 C, la cristallisation est induite manuellement par contact de la paroi des paillettes avec l'extrémité d'une tige métallique préalablement refroidie dans l'azote liquide. Trois minutes après l'induction de changement de phase, les paillettes sont refroidies à une vitesse de 0,3 C/minute jusqu'à - 32 C, puis plongées directement et stockées dans l'azote liquide à -196 C. The whole is cooled at a speed of 1.5 C / min to -7 C. After 3 to 4 minutes at -7 C, crystallization is induced manually by contact of the wall of the flakes with the end of a metal rod previously cooled in liquid nitrogen. Three minutes after the induction of phase change, the flakes are cooled at a speed of 0.3 C / minute to -32 C, then immersed directly and stored in liquid nitrogen at -196 C.

III) DECONGELATION POUR LE TRANSFERT DIRECT
La décongélation s'effectue en tenant par une extrémité la paillette 10 secondes dans l'air à température ambiante, puis 30 secondes dans un bainmarie à 20 C sans agitation. La paillette est ensuite insérée (sans agitation) dans un pistolet de transfert, son extrémité coupée et l'embryon est déposé dans la corne utérine ipsilatérale au corps jaune d'une receveuse à jour 6 à 7 de son cycle. III) DEFROST FOR DIRECT TRANSFER
Defrosting is carried out by holding the straw at one end for 10 seconds in air at room temperature, then 30 seconds in a bain-marie at 20 C without stirring. The straw is then inserted (without stirring) into a transfer gun, its cut end and the embryo is deposited in the ipsilateral uterine horn with the corpus luteum of a recipient on day 6 to 7 of her cycle.

IV) RESULTATS D'ESSAIS
Une expérimentation ayant impliqué 49 transferts directs a donné des taux de gestation qui sont de 58 % à J 35 et de 51 % (25/49) à J 90. IV) TEST RESULTS
An experiment involving 49 direct transfers gave pregnancy rates which are 58% on D 35 and 51% (25/49) on D 90.

Antérieurement à l'invention, on n'avait pas obtenu des taux de gestation excédant 35 % (voir par exemple A.M. Van Wagtendonk - de Leeuw et coll., Theriogenology, 53 : 575-597 (2000). L'invention constitue donc une avancée technique notable, résultant d'une synergie inattendue entre les moyens mis en oeuvre. Prior to the invention, pregnancy rates in excess of 35% had not been obtained (see for example AM Van Wagtendonk - de Leeuw et al., Theriogenology, 53: 575-597 (2000). The invention therefore constitutes a notable technical breakthrough, resulting from an unexpected synergy between the means used.

Références bibliographiques : Ménézo Y., Guérin J. F. et Czyba J. C., 1990: Improvement of human early development in vitro by co-culture on monolayers of Vero cells. Biol. Reprod., 42 : 301 - 306. Bibliographic references: Ménézo Y., Guérin J. F. and Czyba J. C., 1990: Improvement of human early development in vitro by co-culture on monolayers of Vero cells. Biol. Reprod., 42: 301-306.

Nibart M., Silva Peixer M., Thuard J. M., Durand M., Guyader-Joly C., Ponchon S., Marquant Le Guienne B. et Humblot P., 1995 : production by OPU and IVF in dairy cattle . 11th Congress of European Embryo Transfer Association, Hannover, 8 - 9 Septembre, 216. Nibart M., Silva Peixer M., Thuard J. M., Durand M., Guyader-Joly C., Ponchon S., Marquant Le Guienne B. and Humblot P., 1995: production by OPU and IVF in dairy cattle. 11th Congress of European Embryo Transfer Association, Hannover, September 8-9, 216.

Ouhibi N., Hamadi J., Guillaud J. et Ménézo Y., 1990 : Coculture of 1-cell mouse embryos on différent cell supports. Human Reprod., 5 : 737 - 743. Ouhibi N., Hamadi J., Guillaud J. and Ménézo Y., 1990: Coculture of 1-cell mouse embryos on different cell supports. Human Reprod., 5: 737 - 743.

Parrish J. J., Susko-Parrish J., Winer M.A. et First N.L., 1988 : Capacitation of bovine sperm by heparin. Biol. Reprod., 3 8 : 1171 - 1180.Parrish J. J., Susko-Parrish J., Winer M.A. and First N.L., 1988: Capacitation of bovine sperm by heparin. Biol. Reprod., 3 8: 1171 - 1180.

Claims

REVENDICATIONS

1. Méthode de production et de cryoconservation d'embryons bovins développés in vitro qui comprend les étapes suivantes : (1) maturer et féconder in vitro des ovocytes bovins ; (2) cultiver in vitro lesdits ovocytes fécondés jusqu'au stade morula ou blastocyste ; (3) sélectionner les embryons de qualité 1 ; et (4) congeler les embryons sélectionnés, caractérisée en ce que l'étape de culture (2) est une co-culture sur un tapis de cellules Vero effectuée en l'absence de sérum , et en ce que l'étape de congélation (4) est effectuée tandis que l'embryon est conditionné dans un milieu de congélation contenant un mélange glycérol-tréhalose comme cryoprotecteur. 1. A method of producing and cryopreserving bovine embryos developed in vitro which comprises the following steps: (1) maturing and fertilizing bovine oocytes in vitro; (2) culturing said fertilized oocytes in vitro up to the morula or blastocyst stage; (3) select quality 1 embryos; and (4) freezing the selected embryos, characterized in that the culture step (2) is a co-culture on a Vero cell mat carried out in the absence of serum, and in that the freezing step ( 4) is carried out while the embryo is conditioned in a freezing medium containing a glycerol-trehalose mixture as cryoprotector.

2. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que le milieu de co-culture est du milieu "Upgraded B2 INRA". 2. Method according to claim 1, characterized in that the coculture medium is "Upgraded B2 INRA" medium.

3. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que la concentration de tréhalose est comprise entre 0,1 M et 0,5 M. 3. Method according to claim 1, characterized in that the concentration of trehalose is between 0.1 M and 0.5 M.

4. Méthode selon la revendication 1 ou 3, caractérisée en ce que la concentration de glycérol est de 8 à 11% en volume. 4. Method according to claim 1 or 3, characterized in that the glycerol concentration is 8 to 11% by volume.

5. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que l'embryon est conditionné dans une paillette en vue de la congélation. 5. Method according to any one of claims 1 to 4, characterized in that the embryo is packaged in a straw for freezing.

6. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que la congélation est précédée de deux stades successifs d'équilibrage de l'embryon, le premier stade étant effectué dans un milieu de congélation additionné de glycérol et le deuxième stade dans un milieu de congélation additionné d'un mélange de glycérol et de tréhalose. 6. Method according to any one of claims 1 to 5, characterized in that the freezing is preceded by two successive stages of equilibration of the embryo, the first stage being carried out in a freezing medium supplemented with glycerol and the second stage in a freezing medium supplemented with a mixture of glycerol and trehalose.

7. Paillette congelée utile pour le transfert direct d'un embryon bovin caractérisée en ce qu'elle comprend une zone centrale dans laquelle se trouve l'embryon dans un milieu de congélation contenant, comme cryoprotecteur, un mélange de glycérol et de tréhalose et deux zones extrêmes dans lesquelles se trouve une solution de tréhalose, chaque zone extrême étant séparée de la zone centrale par une bulle d'air. 7. Frozen straw useful for the direct transfer of a bovine embryo characterized in that it comprises a central zone in which the embryo is found in a freezing medium containing, as cryoprotector, a mixture of glycerol and trehalose and two extreme zones in which there is a trehalose solution, each extreme zone being separated from the central zone by an air bubble.

8. Paillette selon la revendication 7, caractérisée en ce que le milieu de congélation contient une concentration de tréhalose comprise entre 0,1 M et 0,5 M, et une concentration de glycérol comprise entre 8 % et 11 % en volume. 8. A straw according to claim 7, characterized in that the freezing medium contains a concentration of trehalose between 0.1 M and 0.5 M, and a concentration of glycerol between 8% and 11% by volume.

9. Paillette selon la revendication 7 ou 8 caractérisée en ce que la concentration de tréhalose dans les zones extrêmes est comprise entre 0,2 M et 1 M. 9. A straw according to claim 7 or 8 characterized in that the concentration of trehalose in the extreme zones is between 0.2 M and 1 M.