FR2807756A1 - Polypeptides pla2 de plantes impliques dans la reaction de defense des plantes, polynucleotides codant ces polypeptides et plantes transformees les contenant - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne des polypeptides de plantes possédant une activité phospholipase PLA2 (Polypeptides PLA2) et impliqués dans la réaction de défense des plantes vis-à-vis des agressions d'organismes pathogènes. L'invention concerne également des polynucléotides codant pour les Polypeptides PLA2 de l'invention, ainsi que des gènes chimères comprenant lesdits polynucléotides, des vecteurs comprenant ces gènes chimères, et des organismes hôtes transformés avec ces vecteurs. Parmi les organismes hôtes transformés, l'invention concerne plus particulièrement des plantes transformées avec un vecteur de l'invention. Ces plantes contiennent un gène chimère de la présente invention qui leur permet de surexprimer, de manière constitutive ou induite, un Polypeptide PLA2 de l'invention, laquelle accroît leur résistance aux agressions d'organismes pathogènes. La présente invention concerne également un procédé de recherche de molécules stimulant la synthèse de Polypeptides PLA2 dans les plantes, ainsi que les molécules obtenues par ce procédé.
Description
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Polypeptides PLA2 de plantes impliqués dans la réaction de défense des plantes, polynucléotides codant ces polypeptides et plantes transformées les contenant.
La présente invention concerne des polypeptides de plantes possédant une activité phospholipase A2 (ci-après désignés Polypeptides PLA2) et impliqués dans la réaction de défense des plantes vis-à-vis des agressions d'organismes pathogènes. En particulier, les Polypeptides PLA2 de la présente invention ne présentent pas de similarité de séquence avec des Polypeptides PLA2 connus, mais avec la protéine de réserve majeure du tubercule de Pomme de Terre, la Patatine. L'invention concerne également des polynucléotides codant pour les Polypeptides PLA2 de l'invention, ainsi que des gènes chimères comprenant lesdits polynucléotides, des vecteurs comprenant ces gènes chimères, et des organismes hôtes transformés avec ces vecteurs. Parmi les organismes hôtes transformés, l'invention concerne plus particulièrement des plantes transformées avec un vecteur de l'invention. Ces plantes contiennent un gène chimère de la présente invention qui leur permet de surexprimer, de manière constitutive ou induite, un Polypeptide PLA2 de l'invention, laquelle accroît leur résistance aux agressions d'organismes pathogènes.
Les plantes cultivées subissent l'agression de nombreux agents pathogènes tels que les virus, les bactéries, et les champignons, mais également d'organismes ravageurs tels que les insectes et les nématodes. Ces agressions affaiblissent les plantes et diminuent les rendements de leur culture. Il existe donc un besoin important de limiter ces agressions. Parmi les solutions mises en #uvre à ce jour, les pesticides occupent une place majeure. Cependant, le développement des techniques d'isolement de gènes et de transformation des plantes permet d'envisager d'autres voies. Une de ces voies consiste à isoler un gène codant pour une protéine toxique pour l'agent pathogène ou le ravageur et à l'introduire dans le génome d'une plante afin qu'elle exprime cette protéine toxique dans ses tissus. Une autre voie consiste à augmenter les défenses naturelles des plantes. Cette dernière voie constitue le problème technique de la présente invention. La solution à ce problème technique consiste à isoler un gène codant pour une protéine impliquée dans le système de défense naturelle des plantes, et à transformer une plante avec ce gène de manière à ce que, en surexprimant ladite protéine dans ses tissus, elle acquière un système de défense amplifié lui conférant un niveau de résistance accru vis-à-vis des agressions d'agents pathogènes.
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Les plantes supérieures ont élaboré au cours de l'évolution des systèmes de défense contre les agents pathogènes. Il s'agit de réactions induites suite à l'agression de la plante par un agent pathogène. L'une des réactions de défense induite les plus efficaces est la réaction d'hypersensibilité (RH, In The hypersensitive response in plants to pathogens : arésistance phenomenon, Goodman RN and Novacky AJ, 1994, APS Press, St-Paul). Au cours de cette réaction, l'agent pathogène agresseur (virus, bactérie, champignon, nématode) reste confiné dans une zone limitée de la plante entourant son point de pénétration initiale où des mécanismes de défense très actifs sont induits (Hammond-Kozack et Jones, 1996, Plant Cell 8,1773-1791). Les plantes qui ont développé une RH génèrent également un second phénomène de résistance partielle et durable, la résistance systémique acquise, qui se manifeste dans les parties non infectées de la plante. Les événements moléculaires précoces de la RH (flux ioniques à travers la membrane plasmique, formation d'espèces réactives de l'oxygène, phosphorylations de protéines...) initiés après la reconnaissance de l'agresseur par la plante, entraînent la production de signaux et de messagers chimiques divers qui ont la propriété d'induire un vaste répertoire de gènes de défense, aboutissant à un état de résistance très efficace (Yang et al., 1997, Genes Dev. 11, 1621-1639; Fritig et al., 1998, Curr. Opin.
Immunol. 10,16-22). Parmi ces signaux produits par les plantes suite à l'agression d'un agent pathogène, deux sont bien connus, l'acide salicylique et l'éthylène (Dong, 1998, Curr. Opin.
Plant Biol. 1, 316-323). Les oxylipines constituent une troisième classe de signaux mise en évidence plus récemment et contrôlant l'induction de gènes de défense particuliers (Penninckx et al., 1996, Plant Cell 8,2309-2323; Thomma et al., 1998, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95, 15107-15111; Vijayan et al., 1998, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95,7209-7214). Les oxylipines sont synthétisées à partir d'acides gras insaturés issus des membranes cellulaires, et certaines d'entre-elles (de la famille de l'acide jasmonique) ont une structure similaire aux médiateurs lipidiques de l'inflammation chez les animaux (eicosanoïdes). Cependant, bien que plusieurs enzymes de la voie de biosynthèse des oxylipines végétales aient été étudiés (Mueller, 1997, Physiol. Plant 100,653-663; Blée, 1998, Prog. Lipid Res. 37,33-72), l'étape enzymatique initiale qui libère les acides gras précurseurs à partir des membranes cellulaires et contrôle la synthèse d'oxylipines n'est pas connue chez les plantes.
Le problème technique que se propose de résoudre la présente invention consiste à produire des plantes possédant des capacités de résistance accrues vis-à-vis des agents pathogènes par surexpression dans lesdites plantes d'une enzyme impliquée dans le processus de réaction de défense. Ce problème technique implique d'isoler ladite enzyme ainsi que le gène la codant, puis de transformer une plante avec ce gène. La meilleure solution à ce
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problème technique consiste à isoler plus particulièrement une enzyme impliquée dans une étape précoce et amplificatrice de la réaction de défense des plantes. L'étape répondant le mieux à ces critères est l'étape initiant la synthèse des signaux lipidiques de type oxylipines. En effet, cette étape est déclenchée suite à la reconnaissance de l'agent pathogène par la plante, et déclenche en retour, par le biais des signaux lipidiques synthétisés, l'activation d'un nombre important de gènes participant à la réaction de défense elle-même. Cette étape de mobilisation des acides gras membranaires est supposée être catalysée par une enzyme particulière, la phospholipase A2. En effet, l'acide linolénique, un précurseur majeur de la plupart des oxylipines, est présent de manière dominante en position sn-2 des phospholipides de plantes, laquelle position sn-2 est spécifiquement hydrolysée par les phospholipases A2 (Figure 1A). D'autre part, chez les animaux, il a été montré que la synthèse de lipides médiateurs de la réaction inflammatoire est corrélée avec l'activité de certaines formes de phospholipases A2 (Balboa et al., 1996, J. Biol. Chem. 271,32381-32384; Bingham et Austen, 1999, Proc. Assoc. Amer. Physic. 111 516-524). Chez les plantes, des preuves indirectes tendent à montrer l'implication de phospholipases (A, C et D) dans la signalisation au cours d'une réaction de défense. De plus, l'activation d'une phospholipase A2 a été montrée en réponse à l'auxine (Paul et al., 1998, Plant J. 16,601-611) ou à une blessure (Narvâez- Vâsquez et al., 1999, Plant cell 11, 2249-2260), et des cellules de Soja ont montré une activité phospholipase A2 augmentée suite au traitement avec des éliciteurs bactériens et fongiques (Chandra et al., 1996, Plant Physiol. 110,979-986). L'état de la technique, à travers ces documents, oriente donc l'homme du métier vers l'implication d'une phospholipase A2 dans une étape de la réaction de défense des plantes, mais ne décrit pas l'isolement ni la caractérisation d'une telle enzyme, ou l'isolement du gène codant pour cette enzyme.
Il apparaît donc, au regard de l'état de la technique, et notamment de la possible implication d'une enzyme possédant une activité phospholipase A2 dans les mécanismes de défense des plantes sans toutefois présupposer du niveau d'implication ni de l'étape contrôlée par cette enzyme, que la solution au problème technique de la présente invention se trouve dans l'isolement et la caractérisation d'une enzyme phospholipase A2 ainsi que du gène la codant, après démonstration de l'implication effective de cette enzyme dans l'étape initiale de synthèse des oxylipines. Aucune enzyme phospholipase A2 de plante impliquée dans les réactions de défense n'avait été isolée et caractérisée avant cette invention. La difficulté majeure de l'isolement des polypeptides PLA2 de la présente invention a résidé dans le fait que, de manière surprenante, leur structure est différente de celle des enzymes phospholipases A2 connues (Dennis, 1997, Trends Biochem. Sci. 2,1-2). Leur particularité est de présenter
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une forte similarité avec la protéine majeure du tubercule de Pomme de Terre, la Patatine. De ce fait, une recherche de polypeptides PLA2 induits lors de la RH ou d'ARNm codant de tels polypeptides sur la base des séquences connues d'enzymes phospholipases A2 ou de séquences polynucléotidiques codant de telles enzymes se révéla infructueuse. En conséquence, la recherche et l'isolement des polypeptides PLA2 de l'invention durent être effectués sur la base d'un travail de purification.
Description des figures: Figure 1 : Exemples de structures de glycérolipides. Chez les plantes, l'acide gras en position sn-2 est majoritairement l'acide linolénique (CI 8:3). B : Structure de l'acide 12-oxo- phytodiénoique (APD). C : de l'acide jasmonique (AJ).
Figure 2 : des activités phospholipase A2 (symboles ronds) et des quantités d'acides phytodiénoique (triangles) et jasmonique (carrés) dans les feuilles de Tabac. Symboles vides : plantes traitées à l'eau. Symboles pleins : plantes inoculées avec le virus de la mosaïque du tabac. La flèche verticale indique le moment de l'apparition des lésions nécrotiques.
Figure 3 : d'induction de l'activité phospholipase A2 et de 3 familles de protéines PR (Pathogenesis-Related) dans des feuilles se défendant contre le virus de la mosaïque du tabac. IP : inhibiteur de protéases. Chit : chitinase.Gluc : B-l,3-glucanase.
Figure 4 : Isolement d'un Polypeptide PLA2 à partir d'un extrait protéique soluble de feuilles infectées depuis 6 jours par le VMT. Ligne pleine : absorbance à 280 nm. Triangles : activité PLA2. Les fractions qui ont été rassemblées pour l'étape suivante sont surmontées d'un crochet.
(a) : chromatographie d'échange de cations sur SP-Sepharose (b) : chromatographie d'échange de cations sur CM-TSK en conditions FPLC (c) : gel filtration sur Superdex HR 75 en conditions FPLC (d) : Analyse par gel de polyacrylamide dénaturant des fractions provenant de l'étape (c) et contenant l'activité PLA2. La flèche indique la protéine de 28 kDa qui a été séquencée.
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Figure 5 : des séquences N-terminales du Polypeptide PLA2 purifié et de la patatine de pomme de terre (Bevan et al., 1986, Nucleic Acids Res. 14, 4625-4638).
Figure 6 : des séquences protéiques de polypeptides PLA2 selon l'invention (NtPatl, NtPat2 et NtPat3) avec celles du gène spécifique du pétale de tabac NtTP12 (Drews, et al., 1992, Plant Cell 4,1383-1404) et de celle de la patatine de tubercule de pomme de terre (Bevan et al., 1986, Nucleic Acids Res. 14,4625-4638). Les résidus d'acides aminés conservés dans plus de 3 séquences sont entourés de noir. Les interruptions créées dans l'alignement sont représentées par un tiret. Le motif GXSXG typique des hydrolases à sérine est souligné.
Figure 7 : de similarité/identité entre les séquences protéiques NtPatl, NtPat2 NtPat3, NtTP12 (Drews, et al., 1992, Plant Cell 4,1383-1404) de tabac et les séquences de type patatine de pomme de terre (Bevan et al., 1986, Nucleic Acids Res. 14,4625-4638), arabidopsis (numéro d'accession AJ002596), concombre (May et al., 1998, Biochim.
Biophys. Acta 1393,267-276), et d'hévéa (Kostyal et al., 1998, Clin. Exp. Immunol. 112, 355-362). Les comparaisons ont été effectuées à l'aide du programme GAP de l'Université du Wisconsin.
Figure 8 : par Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) de l'expression des gènes NtPat au cours de la réaction hypersensible au VMT. Les produits d'amplification présentent les tailles suivantes : NtPatl : 445 pb, NtPat2 : 380 pb, NtPat3 : 660 pb.
Figure 9 : Activités acyl-hydrolase des protéines NtPatl et NtPat3 recombinantes.
(a) : Analyse par gel de polyacrylamide dénaturant des protéines NtPatl et NtPat3 recombinantes produites dans E. coli. M : marqueurs de masse moléculaire (b) : Activité enzymatique spécifique à l'encontre de substrats lipidiques. Les activités PLA1 et PLA2 ont été mesurées sur de la phosphatidylcholine. L'activité estérase a été mesurée sur le p-nitro-palmitate. ND : détectable.
Figure 10 : d'activités phénylalanine ammoniac lyase (PAL) dans des extraits de cellules de tabac traitées pendant 4 h avec différentes doses de protéines NtPatl (A) et NtPat3 (B) recombinantes.
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Description de l'invention:
La présente invention a donc pour objet des polypeptides PLA2 de plantes impliqués dans la réaction de défense des plantes. Par Polypeptides PLA2, on entend des polypeptides possédant une activité enzymatique de type Phospholipase A2, laquelle activité enzymatique peut être mise en évidence par des tests connus de l'homme du métier, de préférence le test enzymatique décrit dans Elsbach et Weiss (1991, in Methods in Enzymol. 197, Dennis E.A. ed., New York, Academic Press, 24-30) ou celui décrit dans l'Exemple 10 utilisant la phosphatidylcholine comme substrat. La particularité des Polypeptides PLA2 de la présente invention est qu'ils contribuent à la mise en #uvre de la réaction de défense des plantes, c'est- à-dire qu'ils catalysent une des étapes de cette réaction. Par réaction de défense des plantes, on entend de préférence la réaction d'hypersensibilité (RH).
La présente invention a donc pour objet des polypeptides PLA2 de plantes impliqués dans la réaction de défense des plantes. Par Polypeptides PLA2, on entend des polypeptides possédant une activité enzymatique de type Phospholipase A2, laquelle activité enzymatique peut être mise en évidence par des tests connus de l'homme du métier, de préférence le test enzymatique décrit dans Elsbach et Weiss (1991, in Methods in Enzymol. 197, Dennis E.A. ed., New York, Academic Press, 24-30) ou celui décrit dans l'Exemple 10 utilisant la phosphatidylcholine comme substrat. La particularité des Polypeptides PLA2 de la présente invention est qu'ils contribuent à la mise en #uvre de la réaction de défense des plantes, c'est- à-dire qu'ils catalysent une des étapes de cette réaction. Par réaction de défense des plantes, on entend de préférence la réaction d'hypersensibilité (RH).
Les Polypeptides PLA2 de la présente invention catalysent la libération d'acides gras précurseurs d'oxylipines. Les acides gras libérés par ces Polypeptides PLA2 sont fixés sur un support biologique. Parmi les acides gras libérés par lesdits Polypeptides PLA2, on trouve l'acide oléique (Cl 8:1), l'acide linoléique (C18:2) ou l'acide linolénique (C18:3), de préférence l'acide linolénique. De plus, par support biologique, on entend tout élément constitutif d'une cellule, de préférence d'une cellule végétale, en particulier toutes les membranes lipidiques cellulaires, y compris celles des organites cellulaires. De manière préférentielle, ces supports sont les membranes plasmiques constituées d'une bi-couche phospholipidique, les membranes des organites dont la structure de base est une bi-couche lipidique, y compris les membranes de chloroplastes constituées de bicouches lipidiques enrichies en galactolipides (Figure 1A). La description de ces différents constituants cellulaires est répertoriée dans des ouvrages de référence (Trémolières A., Les lipides végétaux, 1998, Université De Broeck) et fait partie des connaissances générales de l'homme du métier. De manière générale, la structure moléculaire du support biologique est celle d'un glycérolipide, en particulier un phospholipide ou un galactolipide. Par glycérolipide, on entend une molécule lipidique constituée d'un squelette glycérol dont deux fonctions alcool sont estérifiées chacune par un acide gras insaturé. La troisième fonction alcool est estérifiée par un groupement polaire variable (Figure 1A). De manière préférentielle, l'action des Polypeptides PLA2 est spécifiquement portée sur la position sn-2 desdits glycerolipides.
Les acides gras libérés par les Polypeptides PLA2 de l'invention sont des précurseurs d'oxylipines, de préférence des oxylipines de la famille des jasmonates, et plus préférentiellement ces oxylipines sont l'acide 12-oxophytodiénoïque (Figure 1B) ou l'acide
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jasmonique (Figure 1C). Les acides gras libérés par les PLA2 de l'invention peuvent aussi être précurseurs d'autres oxylipines non identifiées mais qui peuvent également être des activateurs de gènes impliqués dans la défense des plantes.
Les Polypeptides PLA2 de la présente invention sont des Polypeptides PLA2 de plantes.
Ils peuvent provenir d'une plante monocotylédone, de préférence le riz, le maïs ou le blé, ou d'une plante dicotylédone, de préférence Arabidopsis, le tabac, le colza, le tournesol, le soja, ou le coton. De manière préférentielle, les Polypeptides PLA2 de l'invention proviennent du tabac.
Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, les Polypeptides PLA2 sont représentés par les séquences d'acides aminés décrites par les identificateurs de séquences SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6 ou un fragment de ces séquences. Par fragment, on entend essentiellement un fragment biologiquement actif, c'est-à-dire un fragment de la séquence d'un Polypeptide PLA2 possédant la même activité enzymatique qu'un Polypeptide PLA2 complet, en particulier l'activité phospholipase A2 telle que décrite et mesurée cidessus et dans les Exemples 2 et 10.
Une des particularités des Polypeptides PLA2 de la présente invention réside dans leur similarité avec la protéine de réserve majeure du tubercule de pomme de terre, la Patatine.
Jusqu'à présent, aucune séquence d'enzyme phospholipase A2 présente dans les feuilles n'a été assimilée à celle d'une Patatine. En outre, la Patatine était uniquement connue comme une protéine de réserve du tubercule de pomme de terre mais aucune forme inductible au cours d'une infection pathogénique n'a été décrite dans aucune espèce végétale. Il a été démontré que la Patatine extraite du tubercule de pomme de terre possède une activité acyl hydrolase (Andrews et al., 1988, Biochem. J. 252,199-206), et même une faible activité phospholipase A2 (Senda et al, 1996, Plant Cell Physiol. 37,347-353), mais aucun document de l'état de la technique ne suggère que la Patatine puisse être impliquée dans la réaction de défense des plantes. En outre, les Polypeptides PLA2 de la présente invention possèdent une activité phospholipase A2 (telle que mesurée à l'aide du test utilisant la phosphatidylcholine décrit dans l'Exemple 10) supérieure à 2,5 moles d'acide gras libéré/mg de protéine/min, de préférence supérieure à 10 umoles d'acide gras libéré/mg de protéine/min, encore plus préférentiellement supérieure à 50 moles d'acide gras libéré/mg de protéine/min. De manière préférentielle, cette activité est comprise entre 40 et 60 moles d'acide gras libéré/mg de protéine/min.
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La présente invention concerne également des polynucléotides isolés codant pour des Polypeptides PLA2 de plantes catalysant une étape de la réaction de défense des plantes. On entend par polynucléotide un polymère nucléotidique de type ADN ou ARN, simple ou double-brin, de préférence double-brin, pouvant être notamment un polynucléotide de type ADN complémentaire (ADNc) ou un oligonucléotide, d'origine naturelle ou synthétique. Les polynucléotides de la présente invention ont été isolés de leur environnement naturel par des techniques de biologie moléculaire connues de l'homme du métier, notamment celles décrites dans Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning : Laboratory Manual, Nolan C. ed., New York : Cold Spring Harbor Laboratory Press).
Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, les polynucléotides codant pour les Polypeptides PLA2 de plantes codent pour des séquences d'acides aminés représentées par les identificateurs de séquences SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, ou SEQ ID NO: 6, ou un fragment de ces séquences. Il est bien connu de l'homme du métier que cette définition inclut tous les polynucléotides qui, bien que comprenant des séquences nucléotidiques différentes comme résultat de la dégénérescence du code génétique, codent pour une même séquence d'acides aminés, laquelle est représentée par les identificateurs de séquences SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, ou SEQ ID NO: 6, ou un fragment de ces séquences.
La présente invention comprend également des polynucléotides codant pour des Polypeptides PLA2 de plantes et capables de s'hybrider de manière sélective à un des polynucléotides précédemment décrits. Par polynucléotide capable de s'hybrider de manière sélective , on entend selon l'invention les polynucléotides qui, par une des méthodes usuelles de l'état de la technique (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning : Laboratory Manual, Nolan C. ed., New York : Spring Harbor Laboratory Press), s'hybrident avec les polynucléotides ci-dessus à un niveau supérieur au bruit de fond de manière significative. Le bruit de fond peut être lié à l'hybridation d'autres polynucléotides présents, notamment d'autres ADNc présents dans une banque d'ADNc. Le niveau du signal généré par l'interaction entre le polynucléotide capable de s'hybrider de manière sélective et les polynucléotides définis par les séquences ID ci-dessus selon l'invention est généralement 10 fois, de préférence 100 fois plus intense que celui de l'interaction des autres séquences d'ADN générant le bruit de fond. Le niveau d'interaction peut être mesuré par exemple , par marquage de la sonde avec des éléments radioactifs, comme le 32P. L'hybridation sélective est généralement obtenue en employant des conditions de milieu très sévères (par exemple NaCl 0,03 M et citrate de sodium 0,03 M à environ 50 C-60 C).
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L'invention comprend également des polynucléotides codant pour des Polypeptides PLA2 de plantes et homologues des polynucléotides précédemment décrits. Par homologue , on entend selon l'invention des polynucléotides présentant une ou plusieurs modifications de séquence par rapport aux séquences nucléotidiques décrites ci-dessus et codant pour un Polypeptide PLA2. Ces modifications peuvent être obtenues selon les techniques usuelles de mutation conduisant notamment à l'addition, la délétion, ou la substitution d'un ou plusieurs nucléotides par rapport aux séquences de l'invention. De manière avantageuse, le degré d'homologie sera d'au moins 70 % par rapport aux séquences de l'invention, de préférence d'au moins 80 %, plus préférentiellement d'au moins 90 %. Les méthodes de mesure et d'identification des homologies entre les séquences d'acides nucléiques sont bien connues de l'homme du métier. On peut employer par exemple les programmes PILEUP ou BLAST (notamment Altschul et al., 1993, J. Mol. Evol. 36 :290- 300 ; Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215 :403-10).
La présente invention concerne également des fragments des polynucléotides décrits ci-dessus. Le terme "fragment" désigne notamment un fragment d'au moins 20 nucléotides, en particulier d'au moins 100 nucléotides, avantageusement d'au moins 500 nucléotides et de préférence d'au moins 1000 nucléotides.
Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention a pour objet des polynucléotides comprenant une séquence nucléotidique représentée par les identificateurs de séquences SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, ou SEQ ID NO: 5, des polynucléotides capables de s'hybrider de manière sélective à un de ces polynucléotides, des polynucléotides homologues de ces polynucléotides, et une portion de ces polynucléotides.
La présente invention concerne également un gène chimère comprenant au moins, liés entre eux de manière opérationnelle, un promoteur fonctionnel dans un organisme hôte, un polynucléotide codant pour un Polypeptide PLA2 tel que défini dans la présente invention, et un élément terminateur fonctionnel dans ce même organisme hôte. Les différents éléments qu'un gène chimère peut contenir sont, d'une part, des éléments régulateurs de la transcription, de la traduction et de la maturation des protéines, tels qu'un promoteur, une séquence codant pour un peptide signal ou un peptide de transit, ou un élément terminateur constituant un signal de polyadénylation, et d'autre part un polynucléotide codant pour une protéine. L'expression "liés entre eux de manière opérationnelle" signifie que lesdits éléments du gène chimère sont liés entre eux de manière à ce que le fonctionnement d'un de ces éléments est affecté par celui d'un autre. A titre d'exemple, un promoteur est lié de manière opérationnelle
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à une séquence codante lorsqu'il est capable d'affecter l'expression de ladite séquence codante.
La construction du gène chimère selon l'invention et l'assemblage de ses différents éléments est réalisable par l'emploi de techniques bien connues de l'homme du métier, notamment celles décrites dans Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning : Laboratory Manual, Nolan C. ed., New York : Spring Harbor Laboratory Press). Le choix des éléments régulateurs constituant le gène chimère est essentiellement fonction de l'espèce hôte dans laquelle ils doivent fonctionner, et l'homme du métier est capable de sélectionner des éléments régulateurs fonctionnels dans un organisme hôte donné. Par "fonctionnels", on entend capables de fonctionner dans un organisme hôte donné.
Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, le gène chimère contient un promoteur dit "constitutif'. Un promoteur constitutif selon la présente invention est un promoteur qui induit l'expression d'une séquence codante dans tous les tissus d'un organisme hôte et en permanence, c'est-à-dire durant toute la durée du cycle vital dudit organisme hôte.
Certains de ces promoteurs peuvent être tissu-spécifiques, c'est-à-dire exprimer la séquence codante en permanence, mais uniquement dans un tissu particulier de l'organisme hôte. Des promoteurs constitutifs peuvent provenir de tout type d'organisme. Parmi les promoteurs constitutifs qui peuvent être utilisés dans le gène chimère de la présente invention, nous pouvons citer à titre d'exemple, des promoteurs bactériens, comme celui du gène de l'octopine synthase ou celui du gène de la nopaline synthase, des promoteurs viraux, comme celui du gène contrôlant la transcription des ARN19S ou 35S du virus de la mosaïque du Choux-Fleur (Odell et al., 1985, Nature, 313,810-812), ou les promoteurs du virus de la mosaïque de la nervure du Manioc (tels que décrits dans la demande de brevet WO 97/48819). Parmi les promoteurs d'origine végétale on citera le promoteur du gène de la petite sous-unité de ribulose-biscarboxylase/oxygénase (RuBisCO), le promoteur d'un gène d'histone tel que décrit dans la demande EP 0 507 698, ou le promoteur d'un gène d'actine de riz (US 5,641,876).
Selon un autre mode particulier de réalisation de l'invention, le gène chimère contient un promoteur inductible. Un promoteur inductible est un promoteur qui ne fonctionne, c'est-à- dire qui n'induit l'expression d'une séquence codante, que lorsqu'il est lui-même induit par un agent inducteur. Cet agent inducteur est en général une substance qui peut être synthétisée dans l'organisme hôte suite à un stimulus externe audit organisme, ce stimulus externe pouvant être par exemple un agent pathogène. L'agent inducteur peut également être une substance externe à cet organisme hôte capable de pénétrer à l'intérieur de celui-ci. De manière avantageuse, le promoteur utilisé dans la présente invention est inductible suite à l'agression de l'organisme hôte par un agent pathogène. De tels promoteurs sont connus,
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comme par exemple le promoteur du gène d'O-méthyltransférase de classe II (COMT II) de plante décrit dans la demande de brevet FR 99 03700, le promoteur PR-1 d'Arabidopsis (Lebel et al., 1998, Plant J. 16 (2):223-233), promoteur EAS4 du gène de la sesquiterpène synthase du Tabac (Yin et al., 1997, Plant Physiol. 115(2), 437-451), ou le promoteur du gène codant la 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase (Nelson et al., 1994, Plant Mol. Biol.
25 (3):401-412).
Parmi les éléments terminateurs pouvant être utilisés dans le gène chimère de la présente invention, nous pouvons citer à titre d'exemple l'élément terminateur nos du gène codant la nopaline synthase d'Agrobacterium tumefaciens (Bevan et al., 1983, Nucleic Acids Res. 11 (2), ou l'élément terminateur d'un gène d'histone tel que décrit dans la demande EP 0 633 317.
Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, le promoteur et l'élément terminateur du gène chimère selon l'invention sont tous les deux fonctionnels dans les plantes.
La présente invention concerne également un vecteur contenant un gène chimère selon l'invention. Le vecteur selon l'invention est utile pour transformer un organisme hôte et exprimer dans celui-ci un Polypeptide PLA2. Ce vecteur peut être un plasmide, un cosmide, un bactériophage ou un virus. De manière générale, les principales qualités de ce vecteur doivent être une capacité à se maintenir et à s'autorépliquer dans les cellules de l'organisme hôte, notamment grâce à la présence d'une origine de réplication, et à y exprimer un Polypeptide PLA2. Le choix d'un tel vecteur ainsi que les techniques d'insertion dans celui-ci du gène chimère selon l'invention sont largement décrits dans Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning : Laboratory Manual, Nolan C. ed., New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press) et font partie des connaissances générales de l'homme du métier. De manière avantageuse, le vecteur utilisé dans la présente invention contient également, en plus du gène chimère de l'invention, un gène chimère contenant un marqueur de sélection. Ce marqueur de sélection permet de sélectionner les organismes hôtes effectivement transformés, c'est-à-dire ceux ayant incorporé le vecteur. De manière préférentielle, l'organisme hôte à transformer est une plante. Parmi les marqueurs de sélection utilisables dans les plantes, on peut citer des marqueur contenant des gènes de résistance aux antibiotiques tel que celui du gène de l'hygromycine phosphotransférase (Gritz et al., 1983, Gene 25 :179-188), mais également des marqueurs contenant des gènes de tolérance aux herbicides tel que le gène bar (White et al., NAR 18:1062, 1990) pour la tolérance au bialaphos, le gène EPSPS (US 5,188,642) pour la tolérance au glyphosate ou encore le gène HPPD (WO 96/38567) pour la tolérance aux isoxazoles. On peut également citer des gènes codant pour des enzymes facilement identifiables comme l'enzyme GUS, des gènes codant
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pour des pigments ou des enzymes régulant la production de pigments dans les cellules transformées. De tels gènes marqueurs de sélection sont notamment décrits dans les demandes de brevet WO 91/02071 et WO 95/06128.
La présente invention concerne également des organismes hôte transformés, contenant un vecteur tel que décrit ci-dessus. De préférence, les organismes hôtes transformés sont des plantes. On entend par "organisme hôte transformé", un organisme hôte qui a incorporé dans son génome le gène chimère de l'invention, et produit en conséquence un Polypeptide PLA2 dans ses tissus. Pour obtenir les organismes hôtes selon l'invention, l'homme du métier peut utiliser une des nombreuses méthodes de transformation connues.
Une de ces méthodes consiste à mettre les cellules à transformer en présence de polyéthylène glycol (PEG) et des vecteurs de l'invention (Chang and Cohen, 1979, Mol. Gen. Genet. 168(1), 111-115 ; Mercenier and Chassy, 1988, Biochimie 70 (4), L'électroporation est une autre méthode qui consiste à soumettre les cellules ou tissus à transformer et les vecteurs de l'invention à un champ électrique (Andreason and Evans, 1988, Biotechniques 6 (7), 650-660 ; Shigekawa and Dower, 1989, Aust. J. Biotechnol. 3(1), 56-62). Une autre méthode consiste à directement injecter les vecteurs dans les cellules ou les tissus hôtes par micro-injection (Gordon and Ruddle, 1985, Gene 33 (2), 121-136). De manière avantageuse, la méthode dite de "biolistique" pourra être utilisée. Elle consiste à bombarder des cellules ou des tissus avec des particules sur lesquelles sont adsorbés les vecteurs de l'invention (Bruce et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (24), Klein et al., 1992, Biotechnology
10 (3), 286-291 ; US Patent No. 4,945,050). De manière préférentielle, la transformation de plantes se fera à l'aide de bactéries du genre Agrobacterium, de préférence par infection des cellules ou tissus desdites plantes par A. tumefaciens (Knopf, 1979, Subcell. Biochem. 6,143-
173 ; Shaw et al., 1983, Gene 23(3):315-330) ou A. rhizogenes (Bevan et Chilton, 1982, Annu.
10 (3), 286-291 ; US Patent No. 4,945,050). De manière préférentielle, la transformation de plantes se fera à l'aide de bactéries du genre Agrobacterium, de préférence par infection des cellules ou tissus desdites plantes par A. tumefaciens (Knopf, 1979, Subcell. Biochem. 6,143-
173 ; Shaw et al., 1983, Gene 23(3):315-330) ou A. rhizogenes (Bevan et Chilton, 1982, Annu.
Rev. Genet. 16 :357-384; Tepfer and Casse-Delbart, 1987, Microbiol. Sci. 4(1), 24-28). De manière préférentielle, la transformation de cellules végétales par Agrobacterium tumefaciens est réalisée selon le protocole décrit par Ishida et al. (1996, Nat. Biotechnol. 14 (6), Ces différentes techniques sont notamment décrites dans les brevets et demandes de brevet suivants : US 4,459,355, US 4,536,475, US 5,464,763, US 5,177,010, US 5,187,073, EP 267,159, EP 604 662, EP 672 752, US 4,945,050, US 5,036,006, US 5,100,792, US 5,371,014, US 5,478,744, US 5,179,022, US 5,565,346, US 5,484,956, US 5,508,468, US 5,538,877, US 5,554,798, US 5,489,520, US 5,510,318, US 5,204,253, US 5,405,765, EP 270 615, EP 442 174, EP 486 233, EP 486 234, EP 539 563, EP 674 725, WO 91/02071 et WO
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La présente invention a également pour objet un procédé de production de plantes résistantes aux agressions d'organismes pathogènes. Ce procédé consiste à transformer lesdites plantes avec un gène chimère selon l'invention, c'est-à-dire à incorporer ledit gène chimère dans leur génome, afin qu'elles expriment dans leurs tissus un Polypeptide PLA2 de la présente invention.
Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, les plantes obtenues par ledit procédé ont incorporé dans leur génome un gène chimère contenant un promoteur constitutif, lequel permet l'expression d'au moins un Polypeptide PLA2 de manière constitutive dans les tissus de la plante. Des plantes produites par ce procédé expriment en permanence un Polypeptide PLA2, lequel confère à ladite plante une résistance continue vis-à-vis des agressions d'organismes pathogènes tout au long de son développement, dans tout ou partie de ses tissus.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, les plantes obtenues par ledit procédé ont incorporé dans leur génome un gène chimère contenant un promoteur inductible. De manière préférentielle, ce promoteur est induit suite à l'agression de la plante par un organisme pathogène, et l'expression d'un Polypeptide PLA2 dans les tissus de la plante n'est réalisée que lors de telles agressions. Des plantes produites par ce procédé ne développent un état de résistance aux organismes pathogènes que lorsqu'elles sont agressées par un organisme pathogène.
La présente invention comprend également les plantes obtenues par ce procédé, des parties de ces plantes, et la descendance de ces plantes. On entend par "partie de ces plantes", tout organe de ces plantes, qu'il soit aérien ou souterrain. Les organes aériens sont les tiges, les feuilles, les fleurs. Les organes souterrains sont principalement les racines, mais ils peuvent également être des tubercules. Par "descendance", on entend principalement les graines contenant les embryons issus de la reproduction de ces plantes entre-elles. Par extension, le terme "descendance" s'applique à toutes les graines formées à chaque nouvelle génération issue de croisements entre une plante et la plante transformée par le procédé selon l'invention.
Les plantes obtenues par le présent procédé peuvent être des monocotylédones ou des dicotylédones. De préférence, ces plantes sont des plantes d'intérêt agronomique. De manière avantageuse, les plantes monocotylédones sont le blé, le maïs, le riz. De manière avantageuse, les plantes dicotylédones sont le colza, le soja, le tabac, le coton.
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Les organismes pathogènes vis-à-vis desquels les plantes obtenues par le présent procédé ont acquis une résistance peuvent être des virus, des bactéries, des champignons, ou des nématodes. Parmi les virus, on peut citer de manière avantageuse les virus de la mosaïque, en particulier le virus de la mosaïque du tabac.
Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, les plantes obtenues par le procédé selon l'invention contiennent, en plus d'un gène chimère selon l'invention, au moins un autre gène chimère contenant un polynucléotide codant pour une protéine d'intérêt. Parmi les polynucléotides codant pour une protéine d'intérêt, on peut citer des polynucléotides codant une enzyme de résistance à un herbicide, par exemple le polynucléotide codant pour l'enzyme bar (White et al., NAR 18 :1062, pour la tolérance au bialaphos, le polynucléotide codant pour l'enzyme EPSPS (US 5,188,642 ; 97/04103) pour la tolérance au glyphosate ou encore le polynucléotide codant pour l'enzyme HPPD (WO 96/38567) pour la tolérance aux isoxazoles. On peut également citer un polynucléotide codant pour une toxine insecticide, par exemple un polynucléotide codant pour une toxine de la bactérie Bacillus thuringiensis (pour exemple, voir International Patent Application WO 98/40490). Peuvent également être contenus dans ces plantes d'autres polynucléotides de résistance aux maladies, par exemple un polynucléotide codant pour l'enzyme oxalate oxydase tel que décrit dans la demande de brevet EP 0 531 498 ou le brevet US 5,866,778, ou un polynucléotide codant pour un peptide antibactérien et/ou antifongique tels que ceux décrits dans les demandes de brevets WO 97/30082, WO 99/24594, WO 99/02717, WO 99/53053, et W099/91089. On peut également citer des polynucléotides codant pour des caractères agronomiques de la plante, en particulier un polynucléotide codant pour une enzyme delta-6 désaturase tel que décrit dans les brevets US 5,552,306, US 5,614,313, et demandes de brevets WO 98/46763 et WO 98/46764.
La présente invention a également pour objet des anticorps monoclonaux ou polyclonaux dirigés contre un Polypeptide PLA2 selon l'invention, ou un fragment de celui-ci.
Les techniques de production d'anticorps sont largement décrites dans la littérature générale et dans des ouvrages de référence tels que Immunological Techniques Made Easy (1998, O. Cochet, J.-L. Teillaud, C. Sautès eds, John Wiley & Sons, Chichester).
La présente invention a également pour objet un procédé de recherche de molécules stimulant la synthèse d'au moins un Polypeptide PLA2 selon l'invention dans les plantes. Ce
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procédé est caractérisé en ce que l'on utilise deux groupes de plantes dont un est traité avec une molécule. On mesure ensuite le niveau d'expression (i. e., la quantité) d'au moins un des Polypeptides PLA2 selon l'invention dans les tissus des deux groupes de plantes. Si le niveau d'expression d'au moins un Polypeptide PLA2 est significativement supérieur dans le groupe des plantes traitées par rapport au groupe des plantes non traitées, la molécule appliquée est retenue comme étant une molécule stimulant la synthèse de Polypeptides PLA2 selon l'invention dans les plantes. Parmi les techniques permettant de mesurer le niveau d'expression des Polypeptide PLA2, l'homme du métier peut utiliser les techniques bien connues de l'amplification après transcription inverse (RT-PCR) et du Northern blot pour la mesure des ARN messagers (ARNm) codant pour les Polypeptides PLA2, ou du Western blot pour la mesure des Polypeptides PLA2. Les protocoles de ces techniques sont notamment décrits dans Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning : Laboratory Manual, Nolan C. ed., New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press). La technique de l'amplification par RTPCR consiste à extraire les ARNm des plantes suite à l'application de la molécule, à les soumettre à une transcription inverse, à soumettre les produits de cette transcription inverse à une amplification sélective par PCR avec des couples d'amorces constituées de fragments de polynucléotides selon l'invention, à faire migrer les produits de l'amplification sur un gel d'électrophorèse, puis à mesurer l'intensité des fragments dans le gel.
La technique du Northern blot consiste à extraire les ARNm des plantes suite à l'application de la molécule, à séparer ces ARNm sur un gel par électrophorèse, à transférer ces ARNm sur une membrane, puis à hybrider ces ARNm avec une sonde constituée par un polynucléotide selon l'invention ou un fragment de celui-ci sur laquelle est greffée une molécule marqueur permettent de la détecter après hybridation pour mesurer la quantité d'ARNm hybridée. La technique du Western blot consiste à extraire les protéines des plantes suite à l'application de la molécule, à séparer ces protéines sur un gel par électrophorèse, à transférer ces protéines sur une membrane, puis à hybrider ces protéines avec des anticorps selon l'invention sur lesquels est greffée une molécule marqueur permettant de les détecter après hybridation pour mesurer la quantité de Polypeptide PLA2 hybridée.
La présente invention comprend donc également des molécules obtenues par le procédé décrit ci-dessus. Ces molécules ont pour caractéristique principale une capacité à stimuler la synthèse naturelle dans les plantes d'au moins un Polypeptide PLA2 selon l'invention.
La présente invention a également pour objet un procédé d'amélioration de la défense des plantes vis-à-vis des agressions d'organismes pathogènes. Ce procédé consiste à
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augmenter le niveau d'expression d'au moins un polypeptide PLA2 de l'invention dans lesdites plantes. Cette augmentation peut être réalisée de manière constitutive ou induite dans les plantes transformées de la présente invention, mais également par application sur des plantes transformées ou non, d'une molécule stimulant la synthèse d'au moins un polypeptide PLA2 dans lesdites plantes. Par agressions d'organismes pathogènes, on entend selon la présente invention, des agressions des plantes par des virus, des bactéries, des champignons ou des nématodes.
Exemples : Exemple 1. Matériel végétal et technique d'inoculation du virus
Les plantes (Nicotiana tabacum cv. Samsun NN) sont cultivées en serre puis en logette climatisée à 22 C 4 C sous une photopériode de 16 heures.
Les plantes (Nicotiana tabacum cv. Samsun NN) sont cultivées en serre puis en logette climatisée à 22 C 4 C sous une photopériode de 16 heures.
Les feuilles de plants de tabac âgés de 6 à 8 semaines sont frottées à l'aide d'un coton imprégné d'une suspension de virus de la mosaïque du tabac purifié (VMT, souche commune U1) mélangée à un abrasif, la célite (10 mg/ml). Après quelques minutes de contact, les feuilles sont rincées à l'eau tiède pour éliminer l'excès de célite et de particules virales. Les feuilles sont récoltées et dénervurées après différents temps d'infection avant d'être conservées à -80 C jusqu'à utilisation.
Exemple 2. Méthode de mesure de l'activité phospholipase A2
2.1. Préparation des extraits enzymatiques
Un gramme de feuilles de tabac est broyé dans de l'azote liquide. Le broyage est poursuivi dans la glace en présence de quartz et de 2 ml de tampon d'extraction froid (Acétate de sodium 100 mM pH 5,2, CaCl2 5 mM, B-mercaptoéthanol 15 mM). L'ensemble est centrifugé 15 min à 13000 g à 4 C. Le surnageant (1,5 ml) est déposé sur une colonne de Sephadex G-25 (Hi Trap Desalting, Pharmacia) équilibrée avec une solution acétate de sodium 20 mM, CaCl2 5 mM. L'élution s'effectue avec 2 ml de tampon d'équilibration et la fraction exclue contenant les protéines est recueillie. Cette étape permet l'élimination des pigments et des composés de faible poids moléculaire.
2.1. Préparation des extraits enzymatiques
Un gramme de feuilles de tabac est broyé dans de l'azote liquide. Le broyage est poursuivi dans la glace en présence de quartz et de 2 ml de tampon d'extraction froid (Acétate de sodium 100 mM pH 5,2, CaCl2 5 mM, B-mercaptoéthanol 15 mM). L'ensemble est centrifugé 15 min à 13000 g à 4 C. Le surnageant (1,5 ml) est déposé sur une colonne de Sephadex G-25 (Hi Trap Desalting, Pharmacia) équilibrée avec une solution acétate de sodium 20 mM, CaCl2 5 mM. L'élution s'effectue avec 2 ml de tampon d'équilibration et la fraction exclue contenant les protéines est recueillie. Cette étape permet l'élimination des pigments et des composés de faible poids moléculaire.
2. 2. Dosage de l'activité phospholipase A2 (Elsbach and Weiss, 1991, in Methods in Enzymol. 197, Dennis E.A. ed., New York, Academic Press, 24-30) - préparation du substrat : le substrat utilisé consiste en des cellules de la souche NM 522 d'Escherichia coli cultivées dans du milieu LB en présence d'acide oléique marqué au
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[14C] (C18:1). L'acide gras radioactif étant ajouté au milieu de culture, son incorporation s'effectue principalement pendant la phase exponentielle de croissance des bactéries et sur plusieurs générations, permettant un marquage uniforme des phospholipides membranaires.
Les bactéries marquées sont lavées avec de la sérum albumine bovine (SAB) 1%, puis sont resuspendues dans l'eau. Afin d'inactiver les phospholipases bactériennes et pour permettre l'exposition des phospholipides aux phospholipases A contenues dans l'échantillon à tester, les bactéries sont autoclavées pendant 15 min à 121 C. Les cellules marquées sont diluées avec des cellules non marquées pour avoir une concentration finale de 1,5 x 1010 cellules/ml contenant 7 x 105 cpm/ml puis le substrat est conservé à -80 C.
- dosage de l'activité : le milieu réactionnel est composé de 50 (il d'extrait enzymatique, 50 l de tampon Tris-HCl 100 mM pH 7,5, CaCl2 5 mM et de 50 l de substrat marqué. La réaction est conduite 30 min à 37 C. Un témoin (substrat sans enzyme) est réalisé en parallèle. La réaction est arrêtée par addition de 0,5% de SAB froide puis centrifugation à 13000 g pendant 3 min à température ambiante. Les bactéries sédimentées contiennent les phospholipides non dégradés et les produits d'hydrolyse complexés à l'albumine sont dans le surnageant. Afin de quantifier le taux d'hydrolyse, 100 l du surnageant sont prélevés et comptés par scintillation. La quantité de radioactivité libérée est une mesure de l'activité phospholipase.
Exemple 3. Activité phospholipase A2 au cours de la réaction hypersensible (RH)
Le test enzymatique développé par Elsbach et Weiss (1991, in Methods in Enzymol.
Le test enzymatique développé par Elsbach et Weiss (1991, in Methods in Enzymol.
197, Dennis E.A. ed., New York, Academic Press, 24-30) faisant intervenir des membranes de bactéries E. coli radiomarquées comme substrat a été utilisé pour mesurer l'activité phospholipase A2. Ce test possède l'avantage de présenter les phospholipides dans un environnement membranaire, ce qui le rapproche plus de conditions physiologiques que l'emploi de substrats synthétiques solubilisés. La culture des bactéries est réalisée en présence d'acide oléique-[14C] (Cl 8:1) qui est incorporé de façon quasi exclusive dans les phospholipides des membranes bactériennes en position sn-2, ce qui rend ce test spécifique des phospholipases A2.
L'activité phospholipase A2 a été mesurée dans des extraits protéiques solubles de feuilles de tabac développant une RH au virus de la mosaïque du tabac (VMT). L'activité enzymatique, très faible dans les feuilles saines, augmente rapidement entre 2 et 4 jours après inoculation pour atteindre un maximum dès 4 jours post-inoculation et se stabiliser jusqu'aux temps tardifs de la RH (Figure 2). L'apparition de l'activité phospholipase A2 coïncide avec la formation des lésions nécrotiques, typique de la RH (36-48 heures). Une telle stimulation
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dans des plantes infectées n'était pas connue et suggère que le métabolisme de mobilisation d'acides gras soit activé pendant cette réponse de défense.
Exemple 4. Relation entre l'activité phospholipase A2 et les signaux de défense dérivés d'acides gras au cours de la RH
Afin de déterminer si l'apparition de l'activité phospholipase A2 au cours de la RH est suivie de l'accumulation de dérivés d'acides gras, les teneurs en oxylipines ont été déterminées dans les plantes infectées. Les quantités d'acide 12-oxophytodiénoïque (APD), précurseur de l'acide jasmonique (AJ), et celles d'acide jasmonique, ont été mesurées, ces deux composés étant des signaux inducteurs de réponses de défense.
Afin de déterminer si l'apparition de l'activité phospholipase A2 au cours de la RH est suivie de l'accumulation de dérivés d'acides gras, les teneurs en oxylipines ont été déterminées dans les plantes infectées. Les quantités d'acide 12-oxophytodiénoïque (APD), précurseur de l'acide jasmonique (AJ), et celles d'acide jasmonique, ont été mesurées, ces deux composés étant des signaux inducteurs de réponses de défense.
4.1. Dosage de l'acide jasmonique (AJ).
Extraction. La méthode est celle développée par Albrecht et al., (1993, Planta 191,86- 94), légèrement modifiée. Les feuilles de tabac (1 g) sont finement broyées dans l'azote liquide. Le broyage est poursuivi pendant 5 min à 4 C dans un mixer Waring contenant 50 ml de méthanol 80% et 0,1 Ci de () acide [3H]-dihydrojasmonique, qui permettra de calculer le rendement de l'extraction de l'AJ endogène. Un gramme de Polyclar AT est ensuite ajouté pour piéger les composés phénoliques solubles. Après filtration sur Büchner, le méthanol est évaporé au rotavapor. La phase aqueuse récupérée (- 10 ml) est ajustée à 12,5 ml avec de l'eau puis acidifiée avec de l'acide acétique (0,2% final). Après centrifugation 30 min à 4 C et à 12000 g, le surnageant clarifié est déposé sur une colonne C18 (Lichroprep RP 18, Merck) préalablement rincée avec deux fois 5 ml de méthanol puis équilibrée avec deux fois 5 ml d'acide acétique 0,2%. L'élution s'effectue avec 5 ml d'une solution de méthanol 70%/acide acétique 0,2%. Après évaporation du méthanol sous flux d'azote, la phase aqueuse est acidifiée avec 100 l d'acide acétique glacial puis extraite deux fois avec 2 ml d'acétate d'éthyle. Les phases organiques sont rassemblées puis évaporées à sec sous flux d'azote et le résidu sec est repris dans 300 l de méthanol. La méthylation des échantillons s'effectue par 300 l de diazométhane (dans l'éther) froid. Après 15 sec, la réaction est arrêtée par évaporation de l'éther sous flux d'azote pour éviter la surméthylation. Les extraits secs sont ensuite repris dans 300 l de méthanol 20%/TBS. 50 l sont prélevés pour le comptage de la radioactivité pour calculer le rendement de l'extraction de l'AJ.
Analyse quantitative par test ELISA. L'analyse quantitative s'effectue par ELISA (Enzyme Linked Immuno-Sorbant Assay) compétitif. Les plaques sont "coatées" avec un
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anticorps purifié, le RAMIG (Rabbit Anti-Mouse Immunoglobulin G, Pierce), puis avec un anticorps monoclonal anti-méthyle-jasmonate (Prof. Weiler, Bochum, Allemagne). Le RAMIG reconnaît la région Fc de l'anticorps spécifique anti-MJ. Cette configuration assure que l'anticorps anti-MJ est immobilisé à la phase solide par sa partie Fc et donc que les sites de fixation de l'antigène sont accessibles. L'échantillon est ensuite ajouté. Le nombre de sites spécifiques de fixation du MJ restés libres (car non occupé par le MJ contenu dans l'échantillon) est mesuré à l'aide d'un traceur (AJ couplé à la phosphatase alcaline). La détection du traceur se fait par test enzymatique : la phosphatase alcaline clive son substrat, le pNPP (p-nitrophényl phosphate de sodium) en p-nitrophénol, ce qui se traduit par l'apparition d'une coloration jaune dont l'intensité est mesurée par colorimétrie (absorbance = 405 nm).
La quantité de traceur fixée est inversement proportionnelle à la quantité de MJ présente dans les échantillons et permet de calculer la quantité d'AJ contenue dans les extraits.
Une gamme étalon est réalisée en parallèle avec du MJ (0,1à 100 pmol) ainsi que deux types de témoins (réaction sans antigène ou sans traceur).
4.2. Dosage de l'acide 12-oxo-phytodiénoïque (APD).
Extraction. Les feuilles (2 g) sont broyées dans l'azote liquide puis transférées dans un erlenmeyer. L'extraction est réalisée à température ambiante pendant 4 h avec trois fois 20 ml d'éther, en agitant de temps en temps. Lors de la première extraction, 30 l de [2H5]-APD (Prof. Weiler, Bochum, Allemagne) sont ajoutés (pour calculer le rendement de l'extraction de l'APD endogène). Les trois surnageants sont rassemblés puis filtrés sur Büchner. Le filtrat est ensuite chargé sur une colonne aminopropyl en phase inverse (Aminopropyl 500 mg, Macherey-Nagel). Après lavage de la colonne avec 8 ml de CHCl3/isopropanol (2: 1), les échantillons sont élués avec 13 ml d'éther/acide acétique (98: 2). L'éluat est évaporé sous flux d'azote. Les résidus secs sont repris dans 200 l de solution hexane/isopropanol/acide acétique (100: 1,61:0,11) (v/v/v) puis centrifugés 2 min à 13000 g.
Analyse quantitative par CLHP et spectrométrie de masse. (Prof. E. Weiler, Bochum, Allemagne). 100 l des échantillons sont injectés sur un système HPLC (colonne Nucleosil 25 x 4 mm, 10 m). L'élution, programmée en mode isocratique, s'effectue avec une solution hexane/isopropanol/acide acétique (100: 1,61:0,11) (v/v/v). On recueille une fraction toutes les 2 min à partir de 6,5 min jusqu'à 14,5 min. La colonne est ensuite lavée pendant 5,5 min avant une nouvelle injection. La fraction contenant l'APD est identifiée par comparaison du temps de rétention avec celui de l'APD de référence puis évaporée au rotavapor. Le séchage est terminé sous flux d'azote. Les résidus secs sont repris dans 100 l de méthanol et
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méthylés avec 200 l de diazométhane de la même manière que l'AJ. Après arrêt de la réaction sous flux d'azote, les échantillons sont repris dans 50 l de chloroforme puis analysés immédiatement par spectrométrie de masse (Laudert et al.,1997, Plant J. 15,675- 684). La quantité d'APD contenue dans l'échantillon est calculée par comparaison avec l'aire du pic de standard [2H5]-APD.
4.3. Résultats des dosages
Les résultats de ces dosages sont représentés dans la Figure 2. Les teneurs en APD et en AJ sont extrêmement faibles dans les plantes non traitées ou frottées avec de l'eau. En réponse à une infection par le VMT, l'APD s'accumule à partir de 48 heures et atteint un maximum vers 6-7 jours. L'AJ augmente plus faiblement et plus tardivement. Le point le plus intéressant est que l'activité phospholipase A2 précède clairement l'accumulation des dérivés lipidiques.
Les résultats de ces dosages sont représentés dans la Figure 2. Les teneurs en APD et en AJ sont extrêmement faibles dans les plantes non traitées ou frottées avec de l'eau. En réponse à une infection par le VMT, l'APD s'accumule à partir de 48 heures et atteint un maximum vers 6-7 jours. L'AJ augmente plus faiblement et plus tardivement. Le point le plus intéressant est que l'activité phospholipase A2 précède clairement l'accumulation des dérivés lipidiques.
Ceci est un argument fort en faveur d'une implication de cette activité enzymatique dans l'initiation de la synthèse d'oxylipines régulant des réponses de défense.
Pour situer la chronologie de cette activité lipolytique par rapport à des réponses de défense bien décrites dans ce pathosystème, la cinétique d'apparition de l'activité phospholipase A2 a été comparée à l'induction de protéines "Pathogenesis-Related" (PR). Les protéines PR possèdent des propriétés antimicrobiennes qui contribuent à la résistance contre les infections et plusieurs familles de protéines PR sont induites de façon coordonnée au cours de la RH. Trois familles de protéines PR (chitinase, 13-1,3-glucanase et un inhibiteur de protéases) ont été mesurées par leurs activités enzymatiques, et il apparaît que celles-ci atteignent leur maximum vers 7 jours post-inoculation, alors que le maximum d'activité phospholipase A2 est atteint entre 3 et 4 jours (Figure 3). Ce résultat montre que l'activité phospholipase A2 est un événement précoce de la RH et est impliquée dans des phénomènes de signalisation cellulaire qui déterminent l'établissement de l'état de résistance.
Exemple 5. Identification de Polypeptides PLA2
Les caractéristiques d'inductibilité précoce de l'activité phospholipase A2 ont stimulé une recherche de la (les) protéine (s) de cette activité. La fraction protéique soluble est extraite de 180 g de feuilles de tabac (Nicotiana tabacum cv. Samsun NN) infectées depuis 6 jours par le VMT. Le broyage s'effectue à 4 C dans 270 ml de tampon acétate de sodium 0,1 M pH 5,2,13-mercaptoéthanol 15 mM, CaCl2 2 mM. Le broyat est filtré sur gaze puis est centrifugé à 10000 g pendant 30 min à 4 C. Le surnageant est chargé sur
Les caractéristiques d'inductibilité précoce de l'activité phospholipase A2 ont stimulé une recherche de la (les) protéine (s) de cette activité. La fraction protéique soluble est extraite de 180 g de feuilles de tabac (Nicotiana tabacum cv. Samsun NN) infectées depuis 6 jours par le VMT. Le broyage s'effectue à 4 C dans 270 ml de tampon acétate de sodium 0,1 M pH 5,2,13-mercaptoéthanol 15 mM, CaCl2 2 mM. Le broyat est filtré sur gaze puis est centrifugé à 10000 g pendant 30 min à 4 C. Le surnageant est chargé sur
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une colonne de gel filtration Sephadex G25 (3,5 x 70 cm, Pharmacia) équilibrée dans une solution acétate de sodium 20 mM pH 5,2, CaCl2 2 mM (solution A). Cette étape permet d'éliminer les molécules de petite masse moléculaire. La fraction protéique éluée est stockée pendant une nuit à 4 C, ce qui entraîne la précipitation d'une grande partie des protéines cellulaires. La technique usuelle de préparation de l'extrait protéique total à un pH de 5,2 permet de préserver l'activité phospholipase A2 et d'éliminer des protéines "non-PR" par précipitation sélective. Une recherche sans a priori a consisté en un fractionnement de cet extrait protéique soluble sur différents supports chromatographiques, les différentes fractions éluées étant testées pour leur activité phospholipase A2 à l'aide du test sur substrat bactérien décrit ci-dessus (Elsbach and Weiss, 1991, in Methods in Enzymol. 197, Dennis E.A. ed., New York, Academic Press, 24-30). Le surnageant clarifié constitue l'extrait protéique de départ pour la purification de la phospholipase. L'extrait est chargé sur une colonne (2,1 x 8 cm) échangeuse de cations (S-Sepharose Fast Flow, Pharmacia) équilibrée dans la solution A.
Les protéines cationiques retenues sur ce support sont éluées avec un gradient de NaCl de 0 à 0,3 M dans la solution A. Aucune activité significative n'est détectée dans les protéines "acides" (anioniques), la totalité de l'activité enzymatique étant retenue sur un support de chromatographie d'échange de cations. L'élution de cette 1ère colonne avec un gradient salin permet de séparer trois pics d'activité (Figure 4a).
Les fractions contenant le pic majeur d'activité phospholipase A2 (PLA2) ont été rassemblées, dialysées contre la solution A puis chargées sur une colonne échangeuse de cations (CM-TSK 3 SW, Altex) montée sur un système FPLC et équilibrée dans la solution A.
L'élution est réalisée avec un gradient de 0,1à 0,2 M NaCl dans la solution A (Figure 4b). Les fractions contenant une activité PLA2 élevée sont rassemblées, concentrées sur des filtres Centricon 10 (Amicon), puis chargées sur une colonne de tamisage moléculaire (Superdex 75, Pharmacia) équilibrée dans la solution A contenant 0,2 M NaCl (Figure 4c). Un g de cytochrome C est ajouté aux tubes de collection avant récolte pour stabiliser l'activité PLA2.
Les fractions actives sont analysées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide 12,5% en conditions dénaturantes (Laemmli, 1970, Nature 227,680-685) colorés au nitrate d'argent (Geoffroy et al., 1990, Mol. Plant-Microbe Interact. 3, 327-333). Les fractions contenant une protéine de 28 kDa dont l'abondance est corrélée avec l'activité PLA2 sont rassemblées et chargées sur un gel préparatif (Figure 4d). Les protéines séparées sont transférées sur une membrane de PVDF, colorées au bleu de Coomassie d'après les instructions du fabricant (Problott, Applied Biosystems). La zone comportant la protéine de 28 kDa a été excisée de la membrane pour séquençage N-terminal par dégradation d'Edman (séquenceur Applied
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Biosystems modèle 473A). La séquence de 50 acides aminés obtenue est confrontée aux banques de données à l'aide du programme BLAST (National Center for Biotechnology Information, USA, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) qui a permis d'identifier la similarité existant entre la séquence codant le polypeptide PLA2 isolé et la patatine, la protéine de réserve majeure dans le tubercule de pomme de terre (Figure 5).
L'identification d'une phospholipase de feuilles de tabac comme une protéine de "type patatine" est nouvelle. Si une activité acyl hydrolase (sur différents substrats comprenant au moins une chaine d'acide gras) a été reportée pour la patatine (Andrews et al., 1988, Biochem.
J. 252,199-206), le rôle de protéines de ce type dans les réponses de défense n'a pas été étudié, notamment en relation avec la signalisation lipidique et la production d'oxylipines. Un extrait soluble de tubercules de pomme de terre (2 variétés) dans lequel la patatine a été identifiée immunologiquement comme représentant environ 30% des protéines a ensuite été préparé. Lorsque l'activité phospholipase A2 est mesurée dans ces extraits avec le substrat bactérien décrit précédemment, l'activité phospholipase A2 spécifique de la patatine de pomme de terre est jusqu'à 500 fois plus faible que celle mesurée pour le Polypeptide PLA2 isolé de feuilles de tabac infectées.
Exemple 6. Clonage d'ADNc codant pour des Polypeptides PLA2
Une seule séquence de type patatine est connue chez le tabac (Drews et al., 1992, Plant Cell 4,1383-1404). Il s'agit d'un ADNc exprimé spécifiquement au cours du développement des pétales de tabac mais la protéine correspondante n'a pas été étudiée. Une stratégie de clonage par PCR de nouvelles isoformes a été entreprise en utilisant d'une part une amorce dérivée de la séquence N-terminale du Polypeptide PLA2 isolé de feuilles infectées, et d'autre part des amorces dérivées de régions conservées identifiées dans 5 séquences nucléotidiques de type patatine (tabac, pomme de terre, concombre, hevea et arabidopsis) disponibles dans les banques de données. Les techniques usuelles de biologie moléculaire utilisées dans cette invention sont décrites dans Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning : Laboratory Manual, Nolan C. ed., New York : Spring Harbor Laboratory Press).
Une seule séquence de type patatine est connue chez le tabac (Drews et al., 1992, Plant Cell 4,1383-1404). Il s'agit d'un ADNc exprimé spécifiquement au cours du développement des pétales de tabac mais la protéine correspondante n'a pas été étudiée. Une stratégie de clonage par PCR de nouvelles isoformes a été entreprise en utilisant d'une part une amorce dérivée de la séquence N-terminale du Polypeptide PLA2 isolé de feuilles infectées, et d'autre part des amorces dérivées de régions conservées identifiées dans 5 séquences nucléotidiques de type patatine (tabac, pomme de terre, concombre, hevea et arabidopsis) disponibles dans les banques de données. Les techniques usuelles de biologie moléculaire utilisées dans cette invention sont décrites dans Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning : Laboratory Manual, Nolan C. ed., New York : Spring Harbor Laboratory Press).
Extraction des ARN. Les ARN totaux sont isolés à partir d'un gramme de matériel végétal broyé dans un tampon à base de tétraborate de sodium (Heitz et al., 1993, J. Biol.
Chem. 268,16987-16992). Deux extractions au phénol/chloroforme/alcool isoamylique (25:24:1) sont effectuées afin de déprotéiniser les échantillons. Les ARN sont ensuite précipités sélectivement par une solution de LiCI, puis lavés avant d'être repris dans l'eau.
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Les ARN sont quantifiés par mesure de l'absorbance à 260 nm (une unité d'absorbance correspond à 40 ug/ml d'ARN) puis stockés à -80 C. Le rapport des absorbances enregistrées à 260 nm et 280 nm donne une indication de la pureté des ARN (1,8<R<2).
Rétro-transcription. Cinq g d'ARN total auxquels sont ajoutés 500 ng d'oligodT dans un volume final de 13,5 l sont dénaturés à 65 C puis refroidis rapidement dans la glace. Le tampon réactionnel (Tris-HCl 50 mM pH 8,3, MgCl2 6 mM, KC1 40 mM, DTT 1 mM), les 4 dNTP à 1 mM et 20 unités de RNAsine (Biotech), un inhibiteur de RNAses sont ajoutés.
L'incubation a lieu dans un volume total de 20 l pendant 1 h à 37 C en présence de 200 unités de transcriptase inverse du virus Moloney de la leucémie murine (Promega).
Amplification par PCR. Le mélange réactionnel de rétro-transcription est précipité en ajoutant un volume d'acétate d'ammonium 5 M pH 5,0 et deux volumes d'éthanol absolu, puis lavé et repris dans 20 l d'eau. Un l de produit de transcription inverse sert de matrice pour la PCR. La réaction se fait dans un volume final de 50 l contenant le mélange Tris-HCl 20 mM pH 8,4, KC1 50 mM, MgCl2 1,5 mM, gélatine 0,01 % (p/v), chaque dNTP à 200 M et 500 ng d'un mélange d' amorces définies comme suit : trois amorces dégénérées ont été utilisés pour amplifier des fragments d'ADNc similaires à la patatine : Amorce 1 : 5'-GCIACIAAA/GGGIAAA/GATT/C/AGTIACIGT-3' (sens) Amorce 2 : 5'-TT/AGCA/GGATTAC/TTTT/CGAT/CG/ATG/AATT/AGC/G-3' (sens) Amorce 3 : 5'-TA/TG/TC/TA/TAIC/TAACTACCA/GCC/GICAAC/TG/AA/TC/TG/AG-3' (antisens) L'amorce 1 dérive des acides aminés 1 à 9 de la séquence N-terminale du polypeptide PLA2 purifié de feuilles de tabac. Les amorces 2 et 3 dérivent de deux régions consensus identifiées par alignement de 5 gènes de type patatine de tabac (NtTP12, Genbank U68484), pomme de terre (Z27221), concombre (Y12793), hévéa (U80598) et arabidopsis (AJ002596). Les expériences de PCR sont réalisées dans les conditions suivantes sur des ARN rétro-transcrits provenant de feuilles saines ou infectées depuis 3 jours : dénaturation : 94 C, hybridation : 47 C, élongation : 72 C (1 min chaque étape) pendant 35 cycles avec les combinaisons d'amorces 1 et 3 ou 2 et 3.
Le couple d'amorces 2 + 3 a permis d'amplifier un fragment d'ADN de taille attendue (0,5 kb) à partir de feuilles infectées. Ce fragment est réamplifié dans les mêmes conditions, purifié sur gel d'agarose, puis cloné dans le vecteur pGEM-T (Promega) et multiplié dans la souche E. coli DH5[alpha]. Ce fragment est identifié par séquençage comme une séquence de type
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"patatine" et est utilisé comme sonde pour cribler une banque d'ADNc construite dans le vecteur 1 ZAP II à partir d'ARN de plantes infectées depuis 5 jours par le VMT (Heitz, et al., 1993, J. Biol. Chem. 268,16987-16992). Les clones isolés présentent tous une séquence identique à celle de la sonde et le plus long de ces clones (1505 nt) est appelé NtPatl.
L'utilisation du couple des amorces 1 + 3 conduit à l'amplification d'un fragment d'ADN de 0,65 kb à partir d'ARN de feuilles infectées. Après clonage dans le vecteur pGEM-T et séquençage, ce fragment est identifié comme une deuxième séquence de type "patatine", et la séquence protéique prédite correspond à la séquence N-terminale du Polypeptide PLA2 purifié. Ce fragment partiel de 0,65 kb est appelé NtPat2 et est utilisé comme sonde pour cribler la banque d'ADNc. Les clones complets isolés représentent une troisième séquence, similaire à 80% à NtPat2 et définissent un troisième gène appelé NtPat3. De façon surprenante, aucun clone NtPat2 n'a pu être isolé de la banque. Nous disposons donc d'ADNc pleine longueur NtPatl (1506 nt) (SEQ ID NO:1) et NtPat3 (1505 nt) (SEQ ID NO:5) et d'une séquence partielle NtPat2 (620 nt) (SEQ ID NO:3). Ces gènes sont décrits pour la première fois dans le cadre de cette invention.
Exemple 7. Analyse des séquences protéiques déduites des ADNc
Les ADNc NtPatl et NtPat3 codent respectivement pour des protéines de masses prédites de 46,7 et 45,1 kDa. Un alignement des séquences protéiques NtPat-1, -2 et-3 avec celle du gène NtTP12 de tabac exprimé dans les pétales, et celle de la patatine de tubercule de pomme de terre est présenté dans la Figure 6. Cet alignement présente des informations nouvelles sur la variabilité existant dans la structure primaire de cette classe de protéines qui est mal connue. La moitié N-terminale des protéines est la mieux conservée alors que plus de divergence existe dans la moitié C-terminale. Les similarités/identités entre NtPatl et NtPat2 ou NtPat3 sont de 75/55%, et ces protéines de tabac sont similaires à 64-82% et identiques à 46-61% à des séquences protéiques déduites de gènes de concombre, d'hévéa et d'arabidopsis (Figure 7). Le motif GXSXG, typique des hydrolases à serine, est présent dans toutes ces séquences.
Les ADNc NtPatl et NtPat3 codent respectivement pour des protéines de masses prédites de 46,7 et 45,1 kDa. Un alignement des séquences protéiques NtPat-1, -2 et-3 avec celle du gène NtTP12 de tabac exprimé dans les pétales, et celle de la patatine de tubercule de pomme de terre est présenté dans la Figure 6. Cet alignement présente des informations nouvelles sur la variabilité existant dans la structure primaire de cette classe de protéines qui est mal connue. La moitié N-terminale des protéines est la mieux conservée alors que plus de divergence existe dans la moitié C-terminale. Les similarités/identités entre NtPatl et NtPat2 ou NtPat3 sont de 75/55%, et ces protéines de tabac sont similaires à 64-82% et identiques à 46-61% à des séquences protéiques déduites de gènes de concombre, d'hévéa et d'arabidopsis (Figure 7). Le motif GXSXG, typique des hydrolases à serine, est présent dans toutes ces séquences.
La séquence protéique de la patatine de pomme de terre présente une extension Nterminale hydrophobe (Figure 6), en accord avec la localisation vacuolaire qui a été démontrée pour cette protéine (Sonnewald et al., 1990, Plant Cell 2, 345-355). Des extensions de ce type sont également identifiables dans les séquences NtTP12 et NtPat3, mais pas dans la séquence NtPatl, ce qui indique que cette dernière protéine est caractérisée par une
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localisation non vacuolaire. Ces données montrent que les deux nouveaux gènes isolés de feuilles de tabac infectées codent pour des protéines localisées dans des compartiments cellulaires distincts. Ces enzymes sont donc en contact avec plusieurs systèmes membranaires végétaux qui sont des sources potentielles d'acides gras précurseurs d'oxylipines.
Exemple 8. Induction des gènes NtPat dans la réaction d'hypersensibilité
Les ARN totaux ont été extraits de plantes inoculées avec de l'eau ou avec du VMT puis récoltées à des temps croissants après traitement. Les signaux détectés par Northern blot à l'aide des sondes NtPatl et NtPat3 étant très faibles, l'expression des gènes a été étudiée par RT-PCR semi-quantitative en utilisant des amorces spécifiques choisies dans des régions divergentes des gènes NtPatl, NtPat2 et NtPat3. Trois couples d'amorces spécifiques dérivées de régions divergentes des gènes NtPatl, NtPat2 et NtPat3 ont été préparés.
Les ARN totaux ont été extraits de plantes inoculées avec de l'eau ou avec du VMT puis récoltées à des temps croissants après traitement. Les signaux détectés par Northern blot à l'aide des sondes NtPatl et NtPat3 étant très faibles, l'expression des gènes a été étudiée par RT-PCR semi-quantitative en utilisant des amorces spécifiques choisies dans des régions divergentes des gènes NtPatl, NtPat2 et NtPat3. Trois couples d'amorces spécifiques dérivées de régions divergentes des gènes NtPatl, NtPat2 et NtPat3 ont été préparés.
Ces amorces sont : NtPatl - (sens) : 5'-AGCTGGAACGAGCACTGGTGGTCTT-3' - (antisens) : 5'-GAGATGATGTTCTTTTACATTGCCTTTGG-3' NtPat2 - (sens) : 5'-ACATAGATGGACCGAATGCAAGAA-3' - (antisens) : 5'-CGTGAGTTTTGGCATCAGCAGTTG-3' NtPat3 - (sens) : 5'-AGCTTCGTGAGGAGGGTCACA-3' - (antisens) : 5'-CCTCTCCAGTCAAATTGTCGTC-3'
L'ARN total est extrait à différents temps après traitement des plantes et rétro-transcrit comme décrit précédemment. Des réactions de contrôle de la procédure de RT-PCR sont conduites avec des amorces dérivées de régions consensus des gènes d'actine de tabac Tob25, Tob53 et Tob66 (Moniz de Sa and Drouin, 1996, Mol. Biol. Evol. 13, 1198-1212).
L'ARN total est extrait à différents temps après traitement des plantes et rétro-transcrit comme décrit précédemment. Des réactions de contrôle de la procédure de RT-PCR sont conduites avec des amorces dérivées de régions consensus des gènes d'actine de tabac Tob25, Tob53 et Tob66 (Moniz de Sa and Drouin, 1996, Mol. Biol. Evol. 13, 1198-1212).
NtAct - (sens) : 5'-GATATGGAGAAG/AATC/ATGGCATCAT/CAC-3' NtAct - (antisens) : 5'-GTTTCA/GTGAATT/ACCT/AGCT-3'
Ces amorces permettent d'amplifier des fragments spécifiques qui peuvent être séparés par leurs tailles : NtPatl : 445 paires de bases (pb), NtPat2 : 380 pb, NtPat3 : 660 pb.
Ces amorces permettent d'amplifier des fragments spécifiques qui peuvent être séparés par leurs tailles : NtPatl : 445 paires de bases (pb), NtPat2 : 380 pb, NtPat3 : 660 pb.
Nous avons vérifié que les mêmes intensités de signaux sont obtenues lorsque les trois couples d'amorces sont mélangés dans une même réaction. Des amorces dérivées de gènes d'actine exprimés constitutivement ont été utilisées pour normaliser la procédure de RT-PCR. Les quantités d'ADNc 1er brin utilisées pour l'amplification sont de 100 ng pour visualiser les transcrits NtPat et de 20 ng pour visualiser les transcrits d'actine. Les conditions de PCR sont
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les suivantes : dénaturation 94 C, hybridation 50 C, élongation 72 C (1 min chaque étape) pendant 25 cycles. Dans ces conditions, l'amplification est reliée linéairement à la quantité d'ARN de départ. Pour vérifier que l'amplification ne résulte pas de la présence d'ADN génomique dans les préparations d'ARN, des expériences de PCR sont réalisées avec 10 ng d'ADN génomique purifié et les profils obtenus avec les différents couples d'amorces sont comparés avec ceux résultant de l'amplification avec de l'ARN rétro-transcrit. Comme illustré dans la Figure 8, aucun transcrit NtPat ne peut être détecté dans les plantes contrôles (temps 0) ni dans les plantes frottées à l'eau. Les transcrits NtPat commencent à être détectables vers 36 h après inoculation avec le VMT et des niveaux maximaux et constants sont atteints puis maintenus entre 2 et 7 jours. L'accumulation des 3 mARNs est remarquablement coordonnée et les transcrits NtPat3 apparaissent plus abondants que les transcrits NtPatl et NtPat2 au cours de la réaction hypersensible.
Ces données montrent que l'expression des gènes NtPat précède de 12-24 h l'apparition de l'activité phospholipase A2 avec un profil superposable (Figure 2). Ceci signifie que l'expression des gènes NtPat est responsable de l'activité phospholipase A2 soluble dans les extraits de tabac infecté.
L'invention décrite ci-dessus identifie les premiers gènes codant des Polypeptides PLA2 de plantes induits rapidement en réponse à une infection microbienne. Au contraire, le gène de tabac NtTP12 précédemment identifié comme spécifique des pétales (Drews et al., 1992, Plant Cell 4,1383-1404) n'est pas exprimé dans les feuilles saines ou infectées et ne joue donc pas de rôle crucial dans les réactions de défense.
L'inductibilité précoce des gènes NtPat au cours de la réaction hypersensible est un argument fort en faveur de leur implication dans la production de précurseurs des signaux lipidiques conduisant à la résistance hypersensible. Ces gènes pourraient par ailleurs être utilisés comme marqueurs dans la recherche d'inducteurs de la signalisation lipidique et/ou de la résistance.
Exemple 9. Expression des gènes NtPatl et NtPat3 dans E. coli : production de protéines hétérologues
9.1. Clonage des régions codantes des ADNc NtPatl et NtPat3 dans le vecteur pGEXKG
9.1. Clonage des régions codantes des ADNc NtPatl et NtPat3 dans le vecteur pGEXKG
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Le vecteur bactérien pGEX-KG (Pharmacia Biotech) est choisi comme vecteur d'expression pour son haut niveau d'expression et parce qu'il permet la production d'une protéine de fusion entre la protéine d'intérêt et la glutathione S-transférase (GST). Cette protéine de fusion est facilement purifiable par affinité pour du glutathion immobilisé. Les régions codantes des ADNc NtPatl et NtPat3 sont amplifiées par PCR en utilisant l'ADN polymérase Pfu (Stratagene) permettant un taux d'erreur très faible, et des amorces comprenant les sites de restriction XbaI et HindIII. Ces sites sont également présents dans le plasmide pGEX-KG et sont utilisés pour le clonage des ADNc en aval de la GST. Les amorces sont : NtPatlpGEX (sens) : 5'-GACTCTAGAGATGACTAAATTACCACAAATGGAGAG-3' NtPatlpGEX (antisens) : 5'-CTCAAGCTTCTAGGATTTTCTTGATAGACTGTATTTC-3' NtPat3pGEX (sens) : 5'-GACTCTAGAGGTTACCAAAGGAAAGATGGTAACAG-3' NtPat3pGEX (antisens) : 5'-CTCAAGCTTCTAGTTGTTTAATCTGAGTTTCCTTTC-3' Les produits d'amplification PCR et le plasmide pGEX-KG sont digérés indépendamment avec les enzymes XbaI et HindIII. Les fragments d'ADN sont purifiés après séparation sur gel d'agarose et chaque ADNc est inséré par ligature dans le vecteur pour créer les vecteurs d'expression pGEX-PATI et pGEX-PAT3. Des bactéries E. coli DH5a sont transformées avec les produits de ligature. Les bactéries ayant intégré le plasmide pGEX-PAT1 ou pGEXPAT3 sont identifiées par criblage PCR sur les colonies en utilisant les amorces spécifiques des ADNc NtPat. L'ADN plasmidique est extrait et la jonction GST-NtPat ainsi que toute la partie codante des ADNc NtPat sont séquences afin de s'assurer qu'aucune erreur ne s'est introduite lors du clonage. Les plasmides sont ensuite introduits dans la souche E. coli BL21 (Stratagene) adaptée à l'expression de protéines hétérologues.
9.2. Purification des protéines defusion
Une préculture de bactéries BL21 contenant les plasmides pGEX-PATl ou pGEXPAT3 dans du milieu LB est préparée en présence d'ampicilline. Un litre de milieu est ensuite inoculé avec cette préculture. La culture se développe pendant environ 2 h à 37 C sous forte agitation jusqu'à une absorbance de 0,6-0,8. L'IPTG (0,1mM) est ensuite ajouté et l'induction de l'expression des protéines de fusion a lieu à 18 C pendant 3 heures. Après centrifugation à 4000g pendant 20 min, le culot de cellules est repris dans le tampon PBS (NaCI 150 mM, NA2HP04 16 mM, NaH2P04 4 mM) additionné de Triton X-100 1%, EDTA 2 mM, B- mercaptoethanol 0,1%, PMSF 0,2 mM benzamidine. Les bactéries sont lysées à la presse de French. Le lysat est centrifugé à 10000 g pendant 30 min à 4 C puis mis en présence de 1 ml de billes de glutathion-agarose (50% v/v) et incubé sous agitation douce à 4 C pendant 1
Une préculture de bactéries BL21 contenant les plasmides pGEX-PATl ou pGEXPAT3 dans du milieu LB est préparée en présence d'ampicilline. Un litre de milieu est ensuite inoculé avec cette préculture. La culture se développe pendant environ 2 h à 37 C sous forte agitation jusqu'à une absorbance de 0,6-0,8. L'IPTG (0,1mM) est ensuite ajouté et l'induction de l'expression des protéines de fusion a lieu à 18 C pendant 3 heures. Après centrifugation à 4000g pendant 20 min, le culot de cellules est repris dans le tampon PBS (NaCI 150 mM, NA2HP04 16 mM, NaH2P04 4 mM) additionné de Triton X-100 1%, EDTA 2 mM, B- mercaptoethanol 0,1%, PMSF 0,2 mM benzamidine. Les bactéries sont lysées à la presse de French. Le lysat est centrifugé à 10000 g pendant 30 min à 4 C puis mis en présence de 1 ml de billes de glutathion-agarose (50% v/v) et incubé sous agitation douce à 4 C pendant 1
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heure. Après centrifugation à 500 g, les billes sont récupérées et le surnageant est remis en présence de billes fraîches et réincubé dans les mêmes conditions. Les billes sont rassemblées et lavées 2 fois avec du PBS-Triton, puis lavées 2 fois avec du tampon Tris-HCl 50 mM pH 7,5 et reprises dans un volume final de 1 ml. Cinquante unités de thrombine sont ajoutées et le clivage est poursuivi pendant la nuit à 10 C. Après centrifugation a 500 g, le surnageant est récupéré. La protéine purifiée est analysée par électrophorèse sur gel de polyacrylamide dénaturant et quantifiée par comparaison avec des quantités connues de SAB.
Exemple 10. Activités enzymatiques des polypeptides recombinants NtPatl et NtPat3
Pour étudier l'activité enzymatique, notamment phospholipase A2, des polypeptides codés par les gènes NtPat, les ADNc NtPatl et NtPat3 ont été exprimés dans les bactéries E. coli en fusion traductionnelle avec la glutathione-S-transférase (GST) dans le vecteur pGEXKG. Environ 50% des protéines de fusion ont été retrouvées dans la fraction protéique soluble du lysat bactérien et ont été purifiées par affinité puis clivées avec la thrombine (Figure 9a). Dans le test utilisant les membranes bactériennes comme substrat, les protéines NtPatl et NtPat3 présentent des activités spécifiques phospholipase A2 comparables à celle du Polypeptide PLA2 natif isolé de feuilles de tabac infectées.
Pour étudier l'activité enzymatique, notamment phospholipase A2, des polypeptides codés par les gènes NtPat, les ADNc NtPatl et NtPat3 ont été exprimés dans les bactéries E. coli en fusion traductionnelle avec la glutathione-S-transférase (GST) dans le vecteur pGEXKG. Environ 50% des protéines de fusion ont été retrouvées dans la fraction protéique soluble du lysat bactérien et ont été purifiées par affinité puis clivées avec la thrombine (Figure 9a). Dans le test utilisant les membranes bactériennes comme substrat, les protéines NtPatl et NtPat3 présentent des activités spécifiques phospholipase A2 comparables à celle du Polypeptide PLA2 natif isolé de feuilles de tabac infectées.
10.1. Mesure de l'activité estérase
Le substrat (p-nitrophényl-palmitate) est dissout dans la solution Triton X-100 1% SDS 0,01%. Le milieu réactionnel est composé de 750 l de Tris-HCl 0,1 M additionné de 150 l (130 nmol) de substrat et ce mélange est préincubé à 37 C. L'enzyme est apporté dans un volume de 100 l puis le mélange est incubé à 37 C. L'absorbance du p-nitrophénol libéré est mesurée à 400 nm.
Le substrat (p-nitrophényl-palmitate) est dissout dans la solution Triton X-100 1% SDS 0,01%. Le milieu réactionnel est composé de 750 l de Tris-HCl 0,1 M additionné de 150 l (130 nmol) de substrat et ce mélange est préincubé à 37 C. L'enzyme est apporté dans un volume de 100 l puis le mélange est incubé à 37 C. L'absorbance du p-nitrophénol libéré est mesurée à 400 nm.
A l'instar de la patatine de pomme de terre, les protéines NtPatl et NtPat3 possèdent une faible activité estérase, testée avec le p-nitrophényl-palmitate (Figure 9b).
10.2. Mesure de l'activitéphospholipase A2
Pour mettre en évidence leur activité phospholipase A2 sur un substrat pur, les protéines NtPatl et NtPat3 ont été incubées avec de la phosphatidylcholine radiomarquée au niveau de l'acide linoléique en position sn-2. test bactéries
Pour mettre en évidence leur activité phospholipase A2 sur un substrat pur, les protéines NtPatl et NtPat3 ont été incubées avec de la phosphatidylcholine radiomarquée au niveau de l'acide linoléique en position sn-2. test bactéries
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L'activité phospholipase A2 a été testée sur les membranes bactériennes marquées à l'acide oléique 14C préparées comme décrit précédemment. Des quantités de 1 à 20 ng de protéine enzymatique sont utilisées dans le test. test phosphatidylcholine
Le milieu réactionnel (90 l) contient 22,5 nmol de phosphatidylcholine (1-palmitoyl- 2-[14C ] -linoleoyl-phosphatidylcholine, PC) dans le tampon Tris-HCl 50 mM, CaCl2 3 mM, Triton X-100 0,05%. L'extrait enzymatique (10 l) est ajouté et le mélange est incubé à 37 C pendant 15 min. La réaction est arrêtée avec 300 l de chloroforme/méthanol (2/1) froid. Les deux phases sont séparées par centrifugation rapide. La phase organique contenant les lipides est évaporée sous flux d'azote puis resuspendue dans 50 l de chloroforme/méthanol (2/1). Le mélange est déposé sur une plaque de chromatographie en couche mince de silice (0,25 mm).
Le milieu réactionnel (90 l) contient 22,5 nmol de phosphatidylcholine (1-palmitoyl- 2-[14C ] -linoleoyl-phosphatidylcholine, PC) dans le tampon Tris-HCl 50 mM, CaCl2 3 mM, Triton X-100 0,05%. L'extrait enzymatique (10 l) est ajouté et le mélange est incubé à 37 C pendant 15 min. La réaction est arrêtée avec 300 l de chloroforme/méthanol (2/1) froid. Les deux phases sont séparées par centrifugation rapide. La phase organique contenant les lipides est évaporée sous flux d'azote puis resuspendue dans 50 l de chloroforme/méthanol (2/1). Le mélange est déposé sur une plaque de chromatographie en couche mince de silice (0,25 mm).
La migration est effectuée dans le système de solvant chloroforme/methanol/eau (65/25/4).
Les produits radioactifs sont visualisés par autoradiographie. Une phospholipase A2 de venin d'abeille est utilisée comme référence.
Les activités phospholipase A2 mesurées sont élevées et du même niveau que celle de la phospholipase A2 de référence provenant de venin d'insecte (Figure 9b), et bien supérieures à celle décrite pour la patatine de pomme de terre (Andrews, et al., 1988, Biochem. J. 252,199- 206 ; Senda et al., 1996, Plant Cell physiol. 37,347-353; Strickland et al., 1995, Plant Physiol.
109,667-674). L'activité PLA1, mesurée à partie de la quantité d'acide 2-lysophosphatidique généré à partir du même substrat, est 10 et 100 fois plus faible que l'activité phospholipase A2 pour NtPatl et NtPat3, respectivement.
Exemple 11. Effet inducteur des protéines NtPatl et NtPat3 sur les réponses de défense
Si les Polypeptides PLA2 NtPatl et NtPat3 possèdent des substrats endogènes dans les cellules végétales, l'incubation de ces polypeptides avec une suspension cellulaire de tabac devrait entraîner la libération d'acides gras qui seront convertis en oxylipines. Ces signaux lipidiques pourraient alors à leur tour induire des réponses de défense. La phénylalanine ammoniac lyase (PAL) est une enzyme clé indispensable à la synthèse de nombreux composés de défense chez les plantes. L'activité PAL est rapidement induite par le méthyljasmonate exogène chez le tabac. Nous avons mesuré l'activité PAL dans des extraits de cellules de tabac incubées pendant 4 h avec différentes doses d'enzymes NtPatl et NtPat3. Les résultats présentés dans la Figure 10 montrent que les deux polypeptides PLA2 induisent l'activité PAL dans ces cellules. Les résultats indiquent que les polypeptides PLA2 ont libéré
Si les Polypeptides PLA2 NtPatl et NtPat3 possèdent des substrats endogènes dans les cellules végétales, l'incubation de ces polypeptides avec une suspension cellulaire de tabac devrait entraîner la libération d'acides gras qui seront convertis en oxylipines. Ces signaux lipidiques pourraient alors à leur tour induire des réponses de défense. La phénylalanine ammoniac lyase (PAL) est une enzyme clé indispensable à la synthèse de nombreux composés de défense chez les plantes. L'activité PAL est rapidement induite par le méthyljasmonate exogène chez le tabac. Nous avons mesuré l'activité PAL dans des extraits de cellules de tabac incubées pendant 4 h avec différentes doses d'enzymes NtPatl et NtPat3. Les résultats présentés dans la Figure 10 montrent que les deux polypeptides PLA2 induisent l'activité PAL dans ces cellules. Les résultats indiquent que les polypeptides PLA2 ont libéré
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des acides gras à partir de substrats endogènes et que ces acides gras ont été convertis en oxylipines de type jasmonates.
Claims (49)
1- Polypeptide de plante possédant une activité phospholipase A2, caractérisé en ce qu'il catalyse une étape de la réaction de défense des plantes
2- Polypeptide selon la revendication 1, caractérisé en ce que la réaction de défense des plantes est la Réaction d'Hypersensibilité
3- Polypeptide selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que l'étape qu'il catalyse est la libération d'acides gras précurseurs d'oxylipines à partir de supports biologiques
4- Polypeptide selon la revendication 3, caractérisé en ce que lesdits acides gras sont l'acide oléique, l'acide linoléique ou l'acide linolénique
5- Polypeptide selon la revendication 3, caractérisé en ce que les oxylipines sont l'acide jasmonique ou l'acide 12-oxophytodiénoïque
6- Polypeptide selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la plante de laquelle il provient est le Tabac
7- Polypeptide selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence d'acides aminés sélectionnée parmi le groupe consistant en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, et SEQ ID NO: 6, ou un fragment de ces séquences.
8- Polynucléotide isolé codant pour un polypeptide de plante possédant une activité phospholipase A2, caractérisé en ce qu'il catalyse une étape de la réaction de défense des plantes
9- Polynucléotide isolé selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il code pour un polypeptide selon une des revendications 1 à 7
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10- Polynucléotide isolé selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il est sélectionné parmi le groupe consistant en: (a) un polynucléotide isolé codant une séquence d'acides aminés sélectionnée parmi le groupe consistant en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, et SEQ ID NO: 6, ou une portion de ces séquences.
(b) un polynucléotide isolé s'hybridant à un polynucléotide isolé selon (a) (c) un polynucléotide isolé homologue d'un polynucléotide isolé selon (a) ou (b) (d) un fragment d'un polynucléotide isolé selon (a), (b), ou (c)
11- Polynucléotide isolé selon l'une des revendications 8 à 10, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique sélectionnée parmi le groupe consistant en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, et SEQ ID NO: 5, ou un fragment de ces séquences.
12- Gène chimère comprenant au moins, liés entre eux de manière opérationnelle: (a) un promoteur fonctionnel dans un organisme hôte (b) un polynucléotide selon l'une des revendications 8 à 11 (c) un élément terminateur fonctionnel dans un organisme hôte
13- Gène chimère selon la revendication 12, caractérisé en ce que le promoteur est un promoteur constitutif
14- Gène chimère selon la revendication 12, caractérisé en ce que le promoteur est un promoteur inductible
15- Gène chimère selon l'une des revendications 12 à 14, caractérisé en ce que le promoteur et l'élément terminateur sont fonctionnels dans les plantes
16- Vecteur d'expression ou de transformation contenant un gène chimère selon l'une des revendications 12 à 15
17- Vecteur selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'il est un plasmide, un phage ou un virus
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18- Organisme hôte transformé avec l'un des vecteurs selon l'une des revendications 16 ou 17
19- Organisme hôte selon la revendication 18, caractérisé en ce qu'il est une plante
20- Procédé de production de plantes résistantes aux agressions d'organismes pathogènes caractérisé en ce que l'on introduit dans le génome desdites plantes un gène chimère selon l'une des revendications 12 à 15 afin qu'elles expriment dans leurs tissus un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 7.
21- Procédé selon la revendication 20, caractérisé en ce que l'expression dudit polypeptide dans lesdites plantes est constitutive
22- Procédé selon la revendication 20, caractérisé en ce que l'expression dudit polypeptide dans lesdites plantes est induite
23- Procédé selon la revendication 22, caractérisé en ce que l'expression dudit polypeptide dans lesdites plantes est induite lors de l'agression desdites plantes par un organisme pathogène
24- Procédé selon la revendication 23, caractérisé en ce que l'organisme pathogène est un virus, une bactérie, un champignon, ou un nématode
25- Procédé selon la revendication 24, caractérisé en ce que le virus est un virus de la mosaïque
26- Plante résistante aux agressions d'organismes pathogènes caractérisée en ce qu'elle est obtenue par le procédé selon l'un des revendications 20 à 25
27- Plante selon la revendication 26, caractérisée en ce qu'elle contient, en plus d'un gène chimère selon l'une des revendications 12 à 15, au moins un autre gène chimère contenant un polynucléotide codant pour une protéine d'intérêt
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28- Plante selon la revendication 27, caractérisée en ce que le polynucléotide codant pour une protéine d'intérêt est un polynucléotide codant pour une enzyme de résistance à un herbicide
29- Plante selon la revendication 28, caractérisée en ce que le polynucléotide codant pour une enzyme de résistance à un herbicide code pour l'enzyme bar de tolérance au bialaphos, l'enzyme EPSPS de tolérance au glyphosate ou encore l'enzyme HPPD de tolérance aux isoxazoles
30- Plante selon la revendication 27, caractérisée en ce que le polynucléotide codant pour une protéine d'intérêt est un polynucléotide codant pour une toxine insecticide
31- Plante selon la revendication 30, caractérisée en ce que le polynucléotide codant pour une toxine insecticide code pour une toxine de la bactérie Bacillus thuringiensis
32- Plante selon la revendication 27, caractérisée en ce que le polynucléotide codant pour une protéine d'intérêt est un polynucléotide codant pour une protéine de résistance aux maladies
33- Plante selon la revendication 32, caractérisée en ce que le polynucléotide codant pour une protéine de résistance aux maladies code pour l'enzyme oxalate oxydase, ou pour un peptide antibactérien ou antifongique
34- Plante selon la revendication 27, caractérisée en ce que le polynucléotide codant pour une protéine d'intérêt est un polynucléotide codant pour un caractère agronomique de plante
35- Plante selon la revendication 34, caractérisée en ce que le polynucléotide codant un caractère agronomique de plante code pour l'enzyme delta-6 désaturase
36- Partie d'une plante selon l'une des revendications 26 à 35
37- Graines d'une plante selon l'une des revendications 26 à 35
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38- Anticorps monoclonaux ou polyclonaux, caractérisés en ce qu'il sont dirigés contre une polypeptide selon l'une des revendications 1 à 7
39- Procédé de recherche de molécules stimulant la synthèse d'au moins un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 7 dans les plantes, caractérisé en ce que: (a) on utilise deux groupes de plantes dont un est traité avec une molécule (b) on mesure la quantité d'au moins un des polypeptides selon l'une des revendications 1 à 7 dans les tissus de chacun des groupes de plantes selon (a) (c) on retient la molécule selon (a) lorsque la quantité selon (b) est significativement supérieure dans le groupe des plantes traitées par rapport au groupe des plantes non traitées
40- Procédé selon la revendication 39, caractérisé en ce que: (a) on utilise deux groupes de plantes dont un est traité avec une molécule (b) on extrait les ARNm de ces plantes (c) on soumet ces ARNm à une transcription inverse (d) on soumet les produits de la transcription inverse à une amplification sélective par PCR avec des couples d'amorces constituées de fragments de polynucléotides selon l'une des revendications 8 à 11 (e) on fait migrer les produits de l'amplification sur un gel d'électrophorèse (f) on mesure l'intensité des fragments correspondant à l'ARNm d'un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 7 dans le gel (g) on retient la molécule selon (a) lorsque l'intensité selon (f) est significativement supérieure dans le groupe des plantes traitées par rapport au groupe des plantes non traitées
41- Procédé selon la revendication 40, caractérisé en ce que le couple d'amorces est sélectionné parmi le groupe consistant en: (a) la SEQ ID NO: 10 et la SEQ ID NO: 11 (b) la SEQ ID NO: 12 et la SEQ ID NO: 13 (c) la SEQ ID NO: 14 et la SEQ ID NO: 15
42- Procédé selon la revendication 39, caractérisé en ce que: (a) on utilise deux groupes de plantes dont un est traité avec une molécule (b) on extrait les ARNm de ces plantes (c) on sépare ces ARNm par électrophorèse, puis on les transfère sur une membrane
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(d) on hybride les ARNm transférés avec une sonde constituée par un polynucléotide selon l'une des revendications 8 à 11, et sur laquelle est greffée une molécule marqueur (e) on mesure l'intensité de l'hybridation de la sonde (f) on retient la molécule selon (a) lorsque l'intensité d'hybridation de la sonde selon (e) est significativement supérieure dans le groupe des plantes traitées par rapport au groupe des plantes non traitées
43- Procédé selon la revendication 39, caractérisé en ce que: (a) on utilise deux groupes de plantes dont un est traité avec une molécule (b) on extrait les protéines de ces plantes (c) on sépare ces protéines par électrophorèse, puis on les transfère sur une membrane (d) on hybride les protéines transférées avec des anticorps selon la revendication 38 sur lesquels est greffée une molécule marqueur (e) on mesure l'intensité de l'hybridation des anticorps (f) on retient la molécule selon (a) lorsque l'intensité d'hybridation des anticorps selon (e) est significativement supérieure dans le groupe des plantes traitées par rapport au groupe des plantes non traitées
44- Molécules obtenues par un procédé selon l'une des revendications 39 à 43
45- Procédé d'amélioration de la défense des plantes vis-à-vis des agressions d'organismes pathogènes, caractérisé en ce que l'on augmente le niveau d'expression d'au moins un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 7 dans lesdites plantes
46- Procédé selon la revendication 45, caractérisé en ce que lesdits organismes pathogènes sont des virus, des bactéries, des champignons ou des nématodes.
47- Procédé selon l'une des revendications 45 ou 46, caractérisé en ce qu'il s'applique à des plantes ou parties de plantes transformées selon l'une des revendications 26 à 37
48- Procédé selon l'une des revendications 45 ou 46, caractérisé en ce qu'il s'applique à des plantes ou parties de plantes non transformées
<Desc/Clms Page number 37>
49- Procédé selon l'une des revendications 45 à 48, caractérisé en ce que l'augmentation du niveau d'expression d'un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 7 est réalisée par application sur lesdites plantes d'une molécule obtenue par un procédé selon l'une des revendications 39 à 43
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