FR2803599A1

FR2803599A1 - Nouveau virus mute de l'hepatite b, ses constituants nucleiques et proteiques et leurs applications

Info

Publication number: FR2803599A1
Application number: FR0000129A
Authority: FR
Inventors: Christian Trepo; Bernard Mandrand; Alan Kay; Isabelle Chemin; Pradel Florence Komurian
Original assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date: 2000-01-06
Filing date: 2000-01-06
Publication date: 2001-07-13
Anticipated expiration: 2020-01-06
Also published as: EP1244773A1; US20030129202A1; JP2003519477A; WO2001049828A1; AU3184701A; FR2803599B1; BR0107457A

Abstract

Virus HBVm isolé présentant les caractéristiques suivantes :(i) un génome à ADN circulaire partiellement double brin,(ii) ledit génome comprenant les gènes Pré-S, S, C, P et X,(iii) les gènes Pré-S codant pour des antigènes de surface, le gène S codant pour une protéine d'enveloppe HBsAg, le gène C codant pour une protéine HBeAg et une protéine HBcAg, le gène P codant pour une enzyme ADN polymérase/ transcriptase inverse et le gène X codant pour une protéine HBxAg, caractérisé en ce que le gène S comprend une séquence nucléotidique ADN référencée SEQ ID NO 1 et en ce que le gène Pré-S comprend une séquence nucléotidique ADN référencée SEQ ID NO 3; molécule d'ADN et molécule d'ARN; protéines de surface modifiées et applications notamment diagnostique, thérapeutique et vaccinale.

Description

NOUVEAU VIRUS MUTE DE L'HEPATITE B, SES CONSTITUANTS NUCLEIQUES ET PROTEIQUES ET LEURS APPLICATIONS
Cinq types d'hépatites virales, les hépatites A, B, C, D, E, sont assez bien connues à ce jour. Dans chaque cas, le virus envahit le foie et provoque un état inflammatoire avec une destruction des cellules hépatiques
L'hépatite B est causée par un virus, le virus de l'hépatite B humain (HBV). Le virus HBV a été découvert par Blumberg et al. A new antigen in leukemia sera, JAMA 191 : 541,(1965). Le virus est transmis par voie sanguine, par contact sexuel ou par voie périnatale.

L'infection par HBV dans la majorité des cas n'entraîne aucun symptôme et est responsable d'hépatites aiguës asymptomatiques. L'hépatite aiguë se caractérise par des troubles digestifs, des douleurs abdominales, une coloration des urines et une décoloration des fèces anormales, une asthénie et un ictère. L'hépatite aiguë peut évoluer vers une forme fulminante avec une nécrose rapide du foie.

L'infection virale peut également évoluer vers une forme chronique, soit chez des patients ayant présenté une hépatite aiguë, soit chez des individus pour lesquels l'infection était asymptomatique. Les porteurs chroniques présentent des lésions hépatiques d'importance variable et un risque élevé d'évolution vers une cirrhose et le développement d'un cancer primitif du foie. En Asie et en Afrique où la chronicité des infections est fréquente, les cancers primitifs du foie représentent un problème crucial de santé publique. Par ailleurs, les porteurs chroniques représentent des réservoirs pour le virus et permettent sa propagation transposant le problème de santé publique au niveau mondial.

L'infection par HBV est une des infections virales les plus courantes chez l'homme. C'est une maladie ubiquitaire avec une incidence géographique distincte. En Europe et en Amérique du Nord entre environ 0,1 % et 1 % de la population est infectée, alors qu'en Asie et en Afrique jusqu'à 20% de la population est porteuse de HBV. On estime à environ 350 millions le nombre de personnes infectées par HBV à travers le monde.

Une hiérarchisation des infections virales suite à une transfusion montre que la transmission de HBV est la première, suivie de HCV et ensuite de HIV.

HBV est un petit virus à ADN de 42 nm de diamètre qui appartient au groupe des virus à ADN hépatotropes (hepadnavirus) et est classé dans la famille des Hepadnaviridae. Sa structure génomique est remarquablement compacte. Le virus comprend une enveloppe externe et une nucléocapside. L'enveloppe est composée principalement de trois antigènes de surface (HBsAgs : hepatitis B surface antigens) qui jouent un rôle majeur dans le diagnostic des infections par HBV. La nucléocapside contient l'antigène du core (HBcAg), une ADN polymérase/transcriptase inverse, ainsi que le génome viral. Le noyau viral constitue l'élément infectieux du virus et la membrane externe porte le principal déterminant antigénique du virus, l'antigène HBs. Le noyau viral demeure à l'intérieur de la nucléocapside. Son diamètre est d'environ 28 nm.

En dépit de sa petite taille (3200 paires de bases) l'ADN circulaire, partiellement double brin, de HBV code pour quatre types de produits viraux à partir de ses gènes chevauchants S, C, P, et X.

Le gène S code pour la protéine d'enveloppe HBsAg exprimée sur la surface externe du virion. La protéine d'enveloppe HBsAg est constituée de deux polypeptides majeurs, un polypeptide de 24 kDa et sa forme glycosylée de 28 kDa. Un certains nombre de sous déterminants de HBsAg ont été identifiés. Le sous déterminant a est porté par tous les isolats de HBsAg. Mais HBsAg peut de plus contenir un antigène spécifique des sous types d ou y, w ou r. En amont du gène S, les gènes Pré-S codent pour divers antigènes de surface de HBV.

Le gène P code pour l'ADN polymérase/transcriptase inverse, très importante dans le mécanisme de la réplication virale.

Le gène C code pour deux protéines de la nucléocapside, HBeAg qui est une protéine sécrétée soluble et HBcAg, la protéine core intracellulaire.

HBeAg est un marqueur sérologique d'une réplication virale élevée.

Le gène X code pour HBxAg qui a différents effets biologiques et qui peut notamment transactiver la transcription de gènes viraux et cellulaires.

Quand HBV infecte un individu, l'ADN viral se réplique totalement à l'intérieur des cellules hépatiques de l'hôte.

Après infection par HBV, le premier marqueur détectable dans le sérum de patient est l'antigène HBsAg, mais ce marqueur persiste rarement au delà de six mois. Après que l'antigène HBs ait disparu dans le sérum, les anticorps anti-HBsAg deviennent détectables et persistent. Parce que l'antigène HBc est séquestré par l'antigène d'enveloppe HBs, il n'est pas détectable en routine dans les sérums de patients, mais la présence d'anticorps anti-HBc est facilement mise en évidence dans les une à deux semaines suivant l'apparition de l'antigène HBs.

Il est cependant maintenant certain que les tests sérologiques conventionnels, mettant en #uvre les marqueurs précités, ne permettent pas de détecter les variants de HBV. Or, le fait que des patients porteurs de HBV et ayant développé une hépatite B chronique existent, sans qu'il soit possible de mettre en évidence une infection par HBV à l'aide des marqueurs sérologiques traditionnels, est de la plus haute importance et montre la nécessité de développer de meilleurs tests, en particulier dans le contexte de transplantation d'organes et pour le traitement des patients.

L'existence de variants de HBV est suspectée depuis de nombreuses années. Cette présomption est basée sur la détection d'ADN viral dans le sérum et/ou le foie de patients présentant une hépatite chronique, en l'absence de mise en évidence des marqueurs sérologiques conventionnels (HBsAg et anti-HBc).

L'incapacité à détecter HBsAg chez des patients porteurs de séquences ADN du virus pourraient avoir plusieurs explications, telles qu'une faible expression de l'antigène de surface ou la présence de mutations au niveau du déterminant antigénique de la protéine S. Dans le premier cas, une coinfection virale pourrait supprimer la réplication de HBV (Jilg W et al., J. Hepatol, 1995, 23 : 14-20, Jylberberg et al., Clinical infection diseases, 1996, 23 : 1117-1125, Ushida et al., J. of Med. Virol. 1997,52 : 399-405, Hofer et al., Eur. J. Clin ; Microbiol. Infect. Dis., 1998, 17 : 6-13. Une autre explication pourrait être que l'antigène HBs est masqué lors de la formation in vivo de complexes immuns avec les anticorps anti-HBs.

Les présents inventeurs ont maintenant identifié et caractérisé un nouveau variant ou mutant de l'hépatite B, dont la détection échappe à certains tests sérologiques du commerce utilisant un anticorps polyclonal à la fois en capture et en détection. Le nouveau variant ou mutant présente, entre autres, des mutations au niveau du gène codant pour l'antigène HBs. Aux fins de la présente demande de brevet, ils ont dénommé ce nouveau variant ou mutant HBVm.

Les présents inventeurs ont par ailleurs montré que la négativité des tests disponibles commercialement pourrait être due à ces mutations au niveau du sous déterminant a de l'antigène HBs. En effet, le sous déterminant a est un site antigénique majeur de l'antigène de surface de HBV et des mutations à ce niveau expliquent une absence de détection par les tests existants.

Aussi, la présente invention a pour objet le virus HBVm dont l'ADN génomique comprend une séquence nucléotidique du gène S qui code pour un antigène HBsm (antigène HBs muté), ladite séquence nucléotidique étant référencée SEQ ID NO 1. L'ADN génomique de HBVm comprend également une séquence nucléotidique du gène Pré-S référencée en SEQ ID NO 3.

Le virus HBVm présente les caractéristiques suivantes : (i) un génome à ADN circulaire partiellement double brin, (ii) ledit génome comprenant les gènes Pré-S, S, C, P et X, (iii) le gène Pré-S codant pour des antigènes de surface, le gène S codant pour une protéine d'enveloppe HBsAg, le gène C codant pour une protéine HBeAg et une protéine HBcAg, le gène P codant pour une enzyme ADN polymérase/transcriptase inverse et le gène X codant pour une protéine HBxAg et est caractérisé en ce que le gène S comprend une séquence nucléotidique ADN référencée SEQ ID NO 1 et en ce que la région Pré-S comprend une séquence nucléotidique ADN référencée SEQ ID NO 3 ; étant entendu que le reste du génome du virus HBVm est sensiblement identique au génome du virus HBV sauvage, comme l'ont montré les inventeurs par un séquençage complet du génome du virus HBVm.

L'invention concerne également une molécule d'ADN, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence nucléotidique ADN choisie parmi SEQ ID NO

1, SEQ ID NO 3, leurs fragments et leurs séquences complémentaires et une molécule d'ARN, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence nucléotidique ARN qui est le produit de transcription d'une séquence nucléotidique ADN choisie parmi SEQ ID N01, SEQ ID NO 3, leurs fragments et leurs séquences complémentaires.

L'invention concerne aussi une protéine de surface modifiée, caractérisée en ce qu'elle comprend ou consiste en une séquence peptidique choisie parmi SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 4 et leurs fragments.

L'invention a aussi pour objet un fragment nucléotidique d'ADN ou d'ARN d'au moins 12 nucléotides, de préférence d'au moins 15 nucléotides ou 18 nucléotides et avantageusement d'au moins 21 nucléotides et qui comprend une séquence nucléotidique ADN qui comprend les nucléotides 325 à 336 de SEQ ID NO 1 et/ou les nucléotides 235 à 237 de SEQ ID NO 1 et/ou les nucléotides 391 à 393 de SEQ ID NO 1 et/ou les nucléotides 478 à 480 de SEQ ID NO 1 et/ou les nucléotides 28 à 30 de SEQ ID NO 1 et/ou les nucléotides 39 à 41.de SEQ ID NO 1 et/ou les nucléotides 385 à 387.de SEQ ID NO 1 et/ou et/ou les nucléotides 118 à 120 de SEQ ID NO 1 et/ou les nucléotides 628 à 630. de SEQ ID NO 1 et/ou les nucléotides 249 à 251 de SEQ ID NO 3, ou est le produit de transcription desdites séquences nucléotidiques ADN ; un fragment nucléotidique d'ADN ou d'ARN qui comprend une séquence nucléotidique qui comprend les séquences nucléotiques d'ADN SEQ ID NO 1 et SEQ ID NO 3 ou les séquences complémentaires desdites séquences SEQ ID NO 1 et SEQ ID NO 2 ou les séquences nucléotidiques d'ARN qui sont les produits de transcription de séquences SEQ ID NO 1 et SEQ ID NO 3 ; et un fragment nucléotidique d'ADN ou d'ARN, caractérisé en ce qu'il consiste en une séquence nucléotidique d'ADN qui correspond à SEQ ID NO 1 et SEQ ID NO 3 ou les séquences complémentaires desdites séquences SEQ ID NO 1 et SEQ ID NO 3 ou en ce qu'il consiste en une séquence nucléotidique d'ARN qui correspond aux produits de transcription de séquences SEQ ID NO 1 et SEQ ID NO 3.

L'invention concerne encore un fragment protéique, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence peptidique d'au moins 4 acides aminés, de préférence d'au moins 5 ou 6 acides aminés et avantageusement d'au moins 7

acides aminés, en particulier de 6 à 15 acides aminés et avantageusement de 6 à 10 ou de 8 à 12 acides aminés, et qui comprend les acides aminés 109-112 et/ou 79 et/ou 131 et/ou 160 et/ou 10 et/ou 14 et/ou 129 et/ou 40 et/ou 210 de SEQ ID NO 2 et/ou l'acide aminé 84 de SEQ ID NO 4 ; un fragment protéique qui comprend ou consiste en une séquence peptidique qui comprend les séquences peptidiques SEQ ID NO 2 et SEQ ID NO 4 ; un fragment protéique dont la séquence peptidique consiste en une séquence choisie parmi SEQ ID NO 2 et SEQ ID NO 4.

La protéine HBsAg mutée présente des caractéristiques antigéniques et/ou immunologiques différentes de la protéine HBsAg sauvage et n'est notamment pas reconnue par des anticorps polyclonaux dirigés contre la protéine sauvage.

La protéine mutée (HBsAgm) et/ou la protéine de surface Pré-S mutée (Pré-Sm) peuvent être obtenues par synthèse peptidique ou par des techniques de recombinaison génétique bien connues de l'homme du métier.

Les méthodes de construction, de manipulation et de vérification de molécules d'ADN recombinant et de séquences nucléotidiques sont bien connues de l'homme du métier. Pour modifier le gène qui code pour la protéine HBsAgm et/ou la protéine Pré-Sm et obtenir les protéines HBsAgm et/ou Pré-Sm de l'invention, il convient d'insérer les codons CAA, ACT, ACA, AGA, CAT, AAA, AGC, AGA, GGG, CGC, AGT, AGG ou tout autre codon qui code pour les acides aminés Gln, Thr, Thr, Arg, His, Lys, Ser, Arg, Gly, Arg, Ser, Arg respectivement aux positions 109, 110, 111, 112, 79,131, 160, 10, 14,129, 40 et 210 de SEQ ID NO 2 et/ou le codon ACA qui code pour la Thr ou tout autre codon qui code pour cet acide aminé en position 84 de SEQ ID NO 4.

Les mutations significatives de HBVm ont été identifiées et mises en évidence par clonage, séquençage et alignement des séquences nucléotidiques et protéiques de HBVm par rapport aux 102 séquences de l'antigène HBs de la base NBRF/PIR, disponible sur le serveur Infobiogen de Villejuif.

Plusieurs procédés sont disponibles pour effectuer les modifications appropriées de séquences. Un des procédé approprié est la synthèse de novo, par la chimie des phosphoramidite ou phosphite, de la séquence souhaitée en

utilisant les fréquences de codons de virus ou de levures. La synthèse d'ADN est réalisable à partir d'éléments commerciaux. Un exemple d'une telle synthèse d'ADN est décrite par Hayden and Mandecki, DNA 7 : (1988). Une autre méthode est le clonage, dans un vecteur simple brin approprié, d'un fragment de restriction approprié à partir d'un vecteur qui comprend déjà le génome de HBV et d'effectuer ensuite in vitro une mutagènèse dirigée, comme décrit par exemple par Bolstein et al., Science, 229,1193 (1982). Une culture de E. coli K12, souche C600 contenant le plasmide recombinant pRIT10601 comprenant un génome de HBV de sous type ay cloné dans pBR322 a fait l'objet d'un dépôt à l'ATCC le 2 juin 1982 sous le numéro d'accession ATCC 39132, conformément aux dispositions du Traité de Budapest. La séquence du gène S codant pour la protéine HBsAgm ou des séquences plus longues codant également pour les polypeptides Pré-S peuvent être excisées de tels clones par des techniques conventionnelles. Un fragment de restriction approprié est par exemple le fragment Xbal-Accl de la région codante du gène S de PRIT 1060 1. Des systèmes de vectorisation pour la mutagènèse in vitro sont disponibles dans le commerce.

Le fragment de gène muté est ensuite réintroduit dans le gène S. Une autre méthode pour obtenir les modifications de séquences souhaitées est l'utilisation de la PCR (Polymerase Chain Reaction) comme décrit par Ho et al., Gene, 77,51 (1989). Dans chaque cas la séquence codante pour une protéine mutée est exprimée dans une cellule hôte appropriée sous le contrôle d'un promoteur approprié. Il est ainsi possible d'utiliser une cassette d'expression fonctionnelle dans une cellule issue d'un organisme eucaryote ou procaryote permettant l'expression du gène S codant pour la protéine HBsAgm et/ou l'expression de la protéine de surface mutée codée par le gène Pré-S ou l'expression de fragments de ces protéines, le gène étant placé sous le contrôle des éléments nécessaires à son expression. Parmi les systèmes microbiens , Escherichia coli et Saccharomyces cerevisiae ont largement été utilisés pour l'expression de protéines recombinantes, mais l'expression de l'antigène HBs en système procaryote, tel que E. coli, s'est révélée très difficile. De préférence, la cellule est une cellule issue d'un organisme eucaryote, telle que les cellules CHO ou COS et avantageusement une cellule issue d'un organisme eucaryote inférieur, telle que

les cellules de levures. La protéine recombinante HBsAgm peut être obtenue dans une cellule de Saccharomyces cerevisiae comme décrit par Harford et al., Develop. Biol. Standard. 54 : 125 (1983), Valenzuela et al., Nature 298, page 347 (1982) et Bitter et al. , J. Med. Virol. 25, page 123 (1988) ou exprimée dans Pichia pastoris, comme décrit par Gregg et al., Biotechnology, 5, page 479 (1987). Les protéines de surface de HBVm peuvent être également exprimées dans une souche mutante de Saccharomyces cerevisiae comme décrit par Kniskern et al. dans le brevet américain US 5,614,384.

Aussi, la présente invention englobe également une cassette d'expression fonctionnelle dans une cellule issue d'un organisme procaryote ou eucaryote permettant l'expression d'une séquence d'ADN ou d'un fragment d'ADN tel que défini précédemment, placé sous le contrôle des éléments nécessaires à son expression ; le vecteur comprenant la cassette d'expression et la cellule issue d'un organisme procaryote ou eucaryote, de préférence un organisme eucaryote inférieur et avantageusement une cellule issue de Saccharomyces cerevisiae ou de Pichia pastoris comprenant la cassette d'expression ou le vecteur, ainsi que la protéine de surface produite par la cassette d'expression, le vecteur ou la cellule.

Le procédé pour préparer une protéine de surface modifiée recombinante de l'invention consiste à cultiver une cellule hôte telle que définie précédemment dans un milieu de culture approprié, ladite cellule hôte étant transformée avec un vecteur d'expression qui contient une séquence nucléotidique d'ADN telle que représentée en SEQ ID NO 1 et/ou SEQ ID NO 3, leurs fragments et leurs séquences complémentaires ou un fragment nucléotidique tel que défini précédemment et, à purifier ladite protéine de surface modifiée produite jusqu'à un degré de pureté requis.

Un autre objet de l'invention est un peptide immunogène qui présente une séquence peptidique telle que définie précédemment ou qui consiste en une protéine recombinante obtenue selon les protocoles précités et son utilisation pour la production d'un anticorps monoclonal ou polyclonal par immunisation d'un animal mammifère, de préférence une souris, un rat ou un lapin, avec ledit peptide immunogène. La production d'anticorps polyclonaux et monoclonaux fait

partie des connaissances générales de l'homme du métier. On peut citer à titre de référence Kôhler G. et Milstein C. (1975) : Continuous culture of fused cells secreting antibody of predefined specificity, Nature 256 : 495-497 et Galfre G. et al. (1977) Nature, 266 : pour la production d'anticorps monoclonaux et Roda A., Bolelli G.F. : Production of high-titer antibody to bile acids, Journal of Steroid Biochemistry, Vol. 13, pp 449-454 (1980) pour la production d'anticorps polyclonaux. Des anticorps peuvent également être produits par immunisation de souris ou de lapins avec les particules virales de HBVm. Pour la production d'anticorps monoclonaux, l'immunogène peut être couplé à de l'hémocyanine de Lymphet Keyhole (peptide KLH) comme support pour l'immunisation ou à de l'albumine sérique (peptide SA). Les animaux sont soumis à une injection d'immunogène en utilisant de l'adjuvant complet de Freund. Les sérums et les surnageants de culture d'hybridome issus des animaux immunisés sont analysés pour leur spécificité et leur sélectivité en utilisant des techniques classiques, telles que par exemple des tests ELISA ou de Western Blot. Les hybridomes produisant les anticorps les plus spécifiques et les plus sensibles sont sélectionnés. Des anticorps monoclonaux peuvent également être produits in vitro par culture cellulaire des hybridomes produits ou par récupération de liquide d'ascite, après injection intrapéritonéale des hybridomes chez la souris. Quelque soit le mode de production, en surnageant ou en ascite, les anticorps sont ensuite purifiés. Les méthodes de purification utilisées sont essentiellement la filtration sur gel échangeur d'ions et la chromatographie d'exclusion ou la chromatographie d'affinité (protéine A ou G). Un nombre suffisant d'anticorps sont criblés dans des tests fonctionnels pour identifier les anticorps les plus performants. La production in vitro d'anticorps, de fragments d'anticorps ou de dérivés d'anticorps, tels que des anticorps chimères produits par génie génétique est bien connue de l'homme du métier.

Plus particulièrement, par fragment d'anticorps on entend les fragments F (ab)2, Fab,Fab', sFv (Blazar et al., 1997, Journal of Immunology 159 : 5821-5833 et Bird et al., 1988, Science 242 : 423-426) d'un anticorps natif et par dérivé on entend, entre autres, un dérivé chimérique d'un anticorps

natif (voir par exemple Arakawa et al., 1996, J. Biochem 120 : 657-662 et Chaudray et al., 1989, Nature 339 : L'anticorps monoclonal ou polyclonal ainsi obtenu est incorporé dans une composition diagnostique qui est utilisée dans un procédé pour détecter au moins une protéine de surface mutée qui consiste en SEQ ID NO 2 et/ou SEQ ID NO 4 dans un échantillon biologique, selon lequel on met en contact l'échantillon biologique avec ladite composition diagnostique dans des conditions prédéterminées qui permettent la formation de complexes anticorps/antigène et on détecte la formation desdits complexes. En particulier les anticorps monoclonaux obtenus sont spécifiques de la protéine mutée recherchée et ne reconnaissent pas la protéine sauvage, par exemple une protéine HBsAg sauvage.

L'invention concerne aussi une composition diagnostique pour la détection d'auto-anticorps dans un échantillon biologique, ladite composition comprenant, entre autre, une protéine ou un fragment protéique muté tel que défini précédemment et le procédé pour détecter lesdits auto-anticorps dirigés contre au moins une protéine de surface mutée qui consiste en SEQ ID NO 2 et/ou SEQ ID NO 4 dans un échantillon biologique, selon lequel on met en contact l'échantillon biologique avec la composition diagnostique dans des conditions prédéterminées qui permettent la formation de complexes anticorps/antigène et on détecte la formation desdits complexes.

Le clonage du génome de virions de l'hépatite B de différents sérotypes est bien connu. On peut, entre autres, citer à titre de référence Miller et al., Hepatology, 9 (1989), page 322.

La présente invention a aussi pour objet un vaccin contre le virus HBVm. Ce vaccin est préparé selon des méthodes connues déjà utilisées pour la préparation de vaccins disponibles dans le commerce. Ce vaccin comprend au moins la protéine HBsAgm et/ou la protéine Pré-Sm, soit sous forme native, soit sous forme recombinante, soit un polypeptide de synthèse dont la séquence peptidique correspond à la séquence en acides aminés de HBsAgm et/ou Pré-Sm, ou des fragments desdites protéines et dudit polypeptide. Les protéines HBsAgm et/ou Pré-Sm sous forme native sont récupérées à partir du plasma de patients

infectés par HBVm. Les protéines HBsAgm et/ou Pré-Sm sous forme recombinante sont obtenues par utilisation d'une cassette d'expression fonctionnelle dans une cellule issue d'un organisme eucaryote ou procaryote permettant l'expression du gène S codant pour la protéine HBsAgm et/ou du gène Pré-Sm codant pour la région Pré-Sm, placé sous le contrôle des éléments nécessaires à son expression. De préférence, la cellule est une cellule issue d'un organisme eucaryote, telle que les cellules de levures. Les protéines recombinantes HBsAgm et/ou Pré-Sm pour la production de vaccins peuvent être obtenues dans une cellule de Saccharomyces cerevisiae comme décrit par Harford et al., Develop. Biol. Standard. 54 : 125 (1983), Valenzuela et al., Nature 298, page 347 (1982) et Bitter et al. , J. Med. Virol. 25, page 123 (1988) ou exprimées dans Pichia pastoris, comme décrit par Gregg et al., Biotechnology, 5, page 479 (1987). Les vaccins peuvent également être préparé à partir de particules immunogènes hybrides comprenant la protéine HBsAgm et/ou la protéine Pré-Sm, comme décrit dans la demande de brevet EP 0 278 940. De telles particules peuvent contenir, par exemple, tout ou partie de la protéine précurseur de HBsAgm codée par la séquence codante qui précède immédiatement le gène S dans le génome HBV, c'est à dire la séquence codante Pré-S. Le vaccin peut comprendre de plus la protéine Pré-Sm de l'invention, soit isolée et purifiée à partir du plasma de patients, soit obtenue par recombinaison génétique, soit encore obtenue par synthèse peptidique ou un fragment de ladite protéine. Avantageusement, le vaccin comprend les protéines HBsAgm et Pré-Sm définies précédemment, éventuellement associées aux protéines HBsAgm' et/ou Pré-Sm', définies par la suite, ou à leurs fragments et/ou aux protéines HBsAg et/ou Pré-S ou leurs fragments, de type sauvage ; étant entendu que les protéines HBsAgm', Pré-Sm', HBsAg et Pré-S répondent aux définitions générales données pour les protéines HBsAgm et Pré-Sm.

Une composition immunogène ou vaccinale selon l'invention est une composition qui comprend une protéine ou un fragment protéique tel que défini ci dessus , éventuellement associé à un véhicule et/ou ou adjuvant approprié et/ou un excipient pharmaceutiquement acceptable. Les vaccins comprenant la protéine HBsAgm et/ou la protéine Pré-Sm ou leurs fragments sont préparés de

manière conventionnelle et contiennent une quantité immunoprotectrice de la protéine HBsAgm et/ou de a protéine Pré-Sm et/ou de leurs fragments, de préférence dans une solution saline tamponnée et mélangée ou adsorbée à l'aide d'adjuvants connus, tels que l'hydroxyde et le phosphate d'aluminium.

La présente invention concerne également des vaccins incluant des molécules d'acides nucléiques qui codent pour une ou des protéine(s) de l'invention ou pour des peptides immunogènes ou leur(s) fragment(s. Les vaccins d'acides nucléiques, en particulier les vaccins ADN, sont administrés généralement en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable en injection intramusculaire ou sous-cutanée. Les vaccins d'acides nucléiques précités peuvent comprendre de plus des molécules d'acides nucléiques qui codent pour les protéines HBsAgm' et/ou Pré-Sm' et/ou HBsAg et/ou Pré-S définies ci-dessus. Ces vaccins sont composés d'au moins un gène codant pour au moins une protéine ou antigène de l'invention dont l'expression est régulée par un promoteur fort, de préférence un promoteur mammifère, exprimé sur un plasmide ou vecteur ADN d'origine bactérienne. Quand ils sont administrés par injection intramusculaire ou sous cutanée les vaccins ADN sont transcrits et traduits et la protéine qu'ils codent est présentée au système immunitaire induisant une réponse humorale et cellulaire. Un des principaux avantages des vaccins ADN est qu'ils peuvent être construits et manipulés. Ils sont susceptibles de fournir leur propre adjuvant sous la forme de séquences CpG présentes dans l'ADN bactérien. Les vaccins ADN provoque la synthèse de novo de protéines dans les cellules transfectées conduisant à l'association de peptides antigéniques avec les déterminants du CMH # et donc l'activation des cellules T cytotoxiques.

De plus les vaccins ADN n'induisent pas de réponses immunes mesurables au vecteur ou plasmide, permettant ainsi une utilisation répétée.

Le terme immunoprotecteur signifie qu'une quantité suffisante de protéine, en particulier de la protéine HBsAgm et/ou de la protéine Pré-Sm ou de leurs fragments, est administrée à un individu pour induire une production d'anticorps (réponse immunitaire humorale) suffisante pour qu'elle soit protectrice ou une réponse immune médiée par les cellules cytotoxiques (réponse immunitaire cellulaire) pour conférer une protection contre l'agent infectieux sans

induire d'effets secondaires. Les deux types de réponse se distinguent en ce que les anticorps reconnaissent les antigènes sous leur forme tridimensionnelle alors que les cellules cytotoxiques reconnaissent des portions desdits antigènes, associés à des glycoprotéines codées par le complexe majeur d'histocompatibilité (CMH). Les lymphocytes T cytotoxiques (CTLs) jouent un rôle essentiel dans la défense des cellules infectées par des virus. Ils agissent directement par cytotoxicité mais également en fournissant une aide spécifique et non spécifique à d'autres immunocytes, tels que les macrophages, les cellules B et les autres cellules T. Les cellules infectées transforment l'antigène au travers d'événements intracellulaires impliquant des protéases. L'antigène transformé est ensuite présenté à la surface des cellules sous la forme de peptides liés aux molécules du HLA classe # au niveau des récepteurs des cellules T sur les CTLs. Les molécules du CMH classe # peuvent également lier des peptides exogènes et les présenter aux CTLs sans transformation intracellulaire. Chisari et al. (Microbiol. Pathogen.

6 :31 (1989)) ont suggérés que les lésions du foie pouvaient être médiées par une réponse des cellules T cytotoxiques CD8 + restreinte par le HLA classe # aux antigènes codés par HBV. Or, les vaccins contre HBV, disponibles dans le commerce, qui utilisent soit la protéine HBsAg purifiée à partir du plasma de porteurs d'HBV à un stade chronique de la maladie, soit une protéine HBsAg recombinante, soit des peptides de synthèse ne confèrent une réelle protection à la personne que dans environ 90% des cas. En conséquence, les personnes qui sont soit non immunisées, soit immunisées mais non protégées constituent un réservoir significatif pour une infection potentielle. Il est donc important de stimuler le réponse immune cellulaire des individus pour obtenir une réponse appropriée aux antigènes de HBV. Moriyama et al., Science, 248 : 361-364 (1990) ont rapporté que l'antigène majeur d'enveloppe de HBV (HBsAg) est exprimé à la surface des hépatocytes sous une forme qui est reconnaissable par des anticorps spécifiques de l'enveloppe et par les lymphocytes T cytotoxiques CD8 + restreints par les molécules du CMH de classe I.

Aussi, la présente invention concerne également les peptides qui induisent des réponses des lymphocytes T cytotoxiques restreintes par les molécules du CMH de classe 1, dérivés de SEQ ID NO 2, dont la séquence

peptidique consiste en une séquence d'au moins 6 acides aminés, de préférence d'au moins 8 ou 9 acides aminés et avantageusement de 8 à 12 acides aminés contigus, ladite séquence étant sélectionnée dans SEQ ID NO 2 et induisant une réponse des lymphocytes T cytotoxiques restreinte par les molécules du CMH de classe # et leurs utilisations dans une composition immunogène.

La quantité de protéine ou de peptide administré (e) fonction de l'addition ou non d'un adjuvant, mais généralement est comprise entre 10 et 50 g/ml de protéine ou de peptide. Ainsi, de manière courante, on administre par dose 20 //g/0,5 ml de protéine chez l'adulte et 10 //g/0,5 ml chez l'enfant. La protéine HBsAgm et/ou la protéine Pré-Sm ou leurs fragments peuvent également être mélangées avec des protéines HBsAg et/ou Pré-S ou des fragments desdites protéines de type sauvage pour la formulation d'un vaccin. Elles peuvent être également mélangées avec des particules hybrides portant des épitopes de protéines d'autres organismes ou avec d'autres composés immunogènes pour la formulation de vaccins bivalents ou multivalents. La préparation de vaccins est notamment décrite dans Vaccines , ed. Voiler et al., University Park Press, Baltimore, Md., USA, 1978.

Le vaccin est administré à une dose déterminée en une ou plusieurs injection (s) par voie intramusculaire ou sous cutanée, suivie (s) derappel(s), si nécessaire. L'effet immunisant du vaccin est suivi par un dosage d'anticorps antiHBsAgm et/ou anti-protéine Pré-Sm chez l'individu vacciné. Dans le cas de vaccins d'acides nucléiques la concentration en acide nucléique dans la composition utilisée pour une administration in vivo est d'environ 100 g /ml à 10 mg/ml, de préférence 1 mg/ml.

L'administration de protéine (s) peptide (s) dérivésd'intérêt ou de leur(s) fragment (s), seuls ou en combinaison est utilisée pour la prophylaxie et/ou la thérapie. Ces protéines ou peptides administrés sont caractérisés en ce qu'ils ne présentent pas la virulence de HBV mais sont susceptibles d'induire une réponse immunitaire, humorale ou cellulaire, chez l'individu auquel ils sont administrés. De telles protéines sont dites modifiées , mais leur immunogénicité est conservée. Les molécules modifiées peuvent être obtenues

par des techniques synthétiques ou/et recombinantes ou à partir de molécules naturelles modifiées par des traitements chimiques ou physiques.

L'identification de protéine(s) ou peptide(s) vaccin(s) est réalisée comme suit : les molécules candidates modifiées sont analysées dans un test fonctionnel pour s'assurer qu'elles ont perdues leur toxicité et pour vérifier leur immunogénicité (i) en réalisant un test in vitro de prolifération de lymphocytes T CD4+ spécifiques de l'antigène administré (T cell assay) ou un test in vitro de cytotoxicité des lymphocytes CD8+ spécifiques de l'antigène administré et, (ii) en mesurant, entre autres, le taux d'anticorps circulants dirigés contre la protéine naturelle. Ces formes modifiées sont utilisées pour immuniser des hommes par des procédures standardisées avec des adjuvants appropriés.

Les acides nucléiques à usage vaccinal sont également analysés (i) en réalisant un test in vitro de prolifération de lymphocytes T CD4+ spécifiques de l'antigène administré (T cell assay) ou un test in vitro de cytotoxicité des lymphocytes CD8 + spécifiques de l'antigène administré et, (ii) en mesurant, entre autres, le taux d'anticorps circulants dirigés contre la protéine codée par l'ADN viral.

Les vaccins préparés sont injectables, c'est-à-dire en solution liquide ou en suspension. En option, la préparation peut aussi être émulsifiée. La molécule antigénique peut être mélangée avec des excipients qui sont pharmaceutiquement acceptables et compatibles avec l'ingrédient actif. Des exemples d'excipients favorables sont l'eau, une solution saline, le dextrose, le glycérol, l'éthanol ou des équivalents et leurs combinaisons. Si désiré, le vaccin peut contenir des quantités mineures de substances auxiliaires comme des agents mouillants ou émulsifiants, des agents qui tamponnent le pH ou des adjuvants comme l'hydroxide d'aluminium, le dipeptide muramyl ou leurs variations. Dans le cas des peptides, leur couplage à une plus grosse molécule (KLH, toxine tétanique) augmente quelquefois l'immunogénicité. Les vaccins sont administrés conventionnellement par injection par exemple intramusculaire. Des formulations additionnelles favorables avec d'autres modes d'administration incluent des suppositoires et quelquefois des formulations orales.

Par véhicule pharmaceutiquement acceptable on entend les supports et véhicules administrables à l'être humain ou à un animal, tels que décrits par exemple dans Remington's Pharmaceutical Sciences 16th ed., Mack Publishing Co. Le véhicule pharmaceutiquement acceptable est de préférence isotonique, hypotonique ou présente une faible hypertonicité et a une force ionique relativement basse. Les définitions des excipients et adjuvants pharmaceutiquement acceptables sont également données dans Remington's Pharmaceutical Sciences précité.

Un aspect de l'invention concerne également une préparation thérapeutique ou prophylactique pour le traitement ou la prévention d'une infection par la virus HBVm qui comprend un agent thérapeutique ou prophylactique, c'est à dire au moins des anticorps anti-protéine HBSAgm et/ou anti-protéine Pré-Sm et/ou des anticorps dirigés contre des fragments desdites protéines, éventuellement associés à des anticorps anti-HBsAg sauvage et/ou anti-protéine Pré-S sauvage et/ou des anticorps dirigés contre des fragments desdites protéines, en particulier des anticorps neutralisants et leurs utilisations pour le traitement ou la prévention de la maladie. Des immunoglobulines dont le titre en anticorps, en particulier en anticorps anti-HBs a été contrôlé peuvent être utilisés en prophylaxie chez des sujets non vaccinés contre l'hépatite B, accidentellement contaminés, et chez les enfants nouveaux nés de mère infectée.

Dans la définition de préparation thérapeutique ou prophylactique sont également incluses les compositions vaccinales ou immunogènes précitées.

L'évaluation de l'efficacité d'un agent thérapeutique ou prophylactique est effectuée en utilisant un modèle animal. A un animal sont injectées au moins une protéine de l'invention HbsAgm ou Pré-Sm, de préférence les deux, obtenue par isolement et purification à partir de sérum ou de plasma, par recombinaison génétique ou par synthèse peptidique, éventuellement associée (s) à la protéine HBsAgm' et/ou Pré-Sm' et/ou à une protéine HBsAg sauvage et/ou Pré-S sauvage. Les injections sont effectuées, à différentes concentrations établies, à des animaux mammifères, tels que souris ou rat, par voie intramusculaire, sous cutanée ou autres. Un contrôle négatif est effectué en parallèle. Les injections sont réalisées en une seule dose ou en doses répétées, avec différents temps

d'intervalle entre chaque administration. Quelques heures à quelques semaines après l'administration, des échantillons biologiques, de préférence du sang ou du sérum sont prélevés. Sur ces échantillons sont réalisés : - (i) un dosage d'anticorps spécifiques des protéine (s) peptide(s) d'intérêt ou de leurs fragments, seuls ou en combinaison, et/ou - (ii) un dosage de la réponse immune cellulaire induite contre les protéine (s) ou peptide (s) ou leurs fragments et contre tout peptide immunogène dérivant desdites protéines ou peptides ou de leurs fragments, en réalisant, par exemple, un test d'activation in vitro de cellules lymphocytes T helper spécifiques de l'antigène administré, en quantifiant les lymphocytes T cytotoxiques selon la technique dite ELISPOT, décrite par Scheibenbogen et al., 1997 Clinical Cancer Research 3 : 221-226.

Une telle détermination est particulièrement avantageuse pour l'évaluation de l'efficacité d'une approche vaccinale chez un individu ou pour diagnostiquer et/ou pronostiquer un état pathologique potentiel en cherchant à mettre en évidence une réponse immune qui serait naturellement développée chez un patient.

L'animal est ensuite sacrifié et l'efficacité de l'agent thérapeutique est mis en évidence - (i) par des analyses d'immunohistologie classiques en utilisant des ligands des protéines d'intérêt et/ou de leurs fragments, en particulier des anticorps monoclonaux ou polyclonaux ou des fragments desdits anticorps, et/ou - (ii) par des techniques d'hybridation in situ classiques en utilisant des fragments d'acides nucléiques ou des oligonucléotides définis à partir des connaissances des séquences nucléotidiques qui codent pour les protéines d'intérêt ou pour leurs fragments ou à partir des connaissances des séquences polypeptidiques desdites protéiques d'intérêt ou de leurs fragments ; et/ou - (iii) par des techniques d'amplification par PCR in situ en utilisant des fragments d'acides nucléiques ou des amorces définis à partir des séquences nucléotidiques ou polypeptidiques des protéiques d'intérêt ou de leurs fragments.

L'évaluation de l'efficacité d'un agent thérapeutique ou prophylactique et le suivi thérapeutique ex vivo, chez l'homme est déterminé de la manière

suivante : les agents thérapeutiques à tester pour une activité thérapeutique et/ou pour un suivi thérapeutique sont administrés par différentes voies à l'homme, telles que les voies intramusculaire, sous cutanée ou autres.

Différentes doses sont administrées à l'être humain. Le dossier clinique du patient au moment de la première administration est parfaitement connu. Une ou plusieurs administrations peuvent être réalisées avec des temps d'intervalle différents entre chaque administration pouvant aller de quelques jours à quelques années. Des échantillons biologiques sont prélevés à des intervalles de temps déterminés après administration de l'agent thérapeutique, de préférence du sang, du sérum. Différentes analyses sont réalisées à partir de ces échantillons. Juste avant la première administration de l'agent thérapeutique, ces prélèvements et ces mêmes analyses sont également réalisés. Un examen clinique et biologique classique est réalisé également en parallèle des analyses supplémentaires qui sont être décrites ci dessous, à différentes temps de l'analyse. Les analyses réalisées sont : une mesure qualitative et quantitative des protéines d'intérêt dans le sérum ou dans le sang par ELISA et/ou Western Blot, en utilisant des anticorps ou des fragments d'anticorps capables de se fixer à au moins une des protéines ou à un de leur fragment et/ou une mesure de l'activité desdites protéines et/ou un dosage d'anticorps spécifiques des protéines d'intérêt ou de leurs fragments dans des échantillons de sang ou de sérum par ELISA et/ou Western Blot en utilisant une protéine naturelle isolée et purifiée ou un fragment de la protéine naturelle et/ou une protéine recombinante ou un fragment de cette protéine recombinante ou un polypeptide de synthèse, et/ou un dosage de la réponse immune cellulaire induite contre la ou les protéine (s) d'intérêt et tout peptide immunogène dérivant de ces protéines, comme décrit précédemment, et/ou une détection de fragments d'ADN et/ou d'ARN codant pour la ou les protéine (s) d'intérêt ou un fragment desdites protéines d'intérêt par hybridation nucléotidique selon les techniques bien connues de l'homme de l'art (Southern blot, Northern blot, ELOSA Enzyme-Linked Oligosorbent Assay (Katz JB et al., Am. J. Vet. Res., 1993 Dec ; 54 (12) : 2021-6 et François Mallet et al., Journal of Clinical Microbiology, June 1993, p1444-1449)) et/ou par méthode d'amplification de l'ADN et/ou l'ARN , par exemple par PCR, RT-PCR, en utilisant

des fragments d'acides nucléiques codant pour la ou les protéine (s) d'intérêt, et/ou par biopsie de tissus, de préférence du foie, et observation des effets caractéristiques de la ou des protéine(s).

Quand l'agent thérapeutique est un anticorps, un fragment d'anticorps ou un mélange d'anticorps et/ou de fragments d'anticorps, on administre au patient soit des anticorps solubles neutralisants ou des fragments d'anticorps pour inhiber l'activité protéique, soit des anticorps solubles spécifiques ou des fragments d'anticorps pour éliminer la protéine par formation de complexes immuns. Les anticorps neutralisants sont polyclonaux ou monoclonaux ou sont des fragments d'anticorps qui reconnaissent le site actif de la protéine et en se fixant, inhibe la fonction de la protéine. Les anticorps non neutralisants sont des anticorps polyclonaux ou monoclonaux ou des fragments desdits anticorps qui sont capables de reconnaître une région immunodominante de la protéine et de l'éliminer par formation d'un complexe immun. La capacité de l'anticorps à se fixer spécifiquement à la protéine est analysé par des techniques conventionnelle décrites, comme par exemple par des tests ELISA ou de Western Blot en utilisant la protéine ou le peptide immunogène naturel ou synthétique. Le titre de l'anticorps est déterminé. La capacité de l'anticorps à neutraliser la fonction de la protéine peut être analysée par différents moyens, par exemple en déterminant la diminution de l'activité de la protéine ou du peptide immunogène en présence de l'anticorps. Des anticorps monoclonaux ou polyclonaux dirigés contre une protéine cible ou une partie de cette protéine sont produits par des techniques conventionnelles utilisées pour produire des anticorps contre des antigènes de surface. Des souris ou des lapins sont immunisées (i) soit avec une protéine naturelle ou recombinante, (ii) soit avec tout peptide immunogène dérivé de cette protéine, (iii) soit avec des cellules murines qui expriment la protéine d'intérêt ou le peptide et des molécules du CMH. La lignée murine Balb/c est la plus fréquemment utilisée.

La présente invention concerne donc un matériel biologique pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement des êtres humains infectés par au moins le virus HBVm, ladite composition comprenant :

- (i) soit au moins une protéine naturelle et/ou une protéine recombinante et/ou un polypeptide de synthèse ou leurs fragments dont la séquence correspond à tout ou partie des séquences référencées SEQ ID NO 2 et 4, indépendamment ou en combinaison, et éventuellement associées avec tout ou partie d'au moins une protéine naturelle et/ou une protéine recombinante et/ou un polypeptide ou leurs fragments dont les séquences sont référencées en SEQ ID NOs 5 et 6 et/ou à tout ou partie d'une protéine naturelle et/ou recombinante et/ou d'un polypeptide de synthèse ou de leurs fragments de type HBV sauvage. Les présents inventeurs ont en effet identifié après clonage, séquençage et alignement avec les séquences protéiques disponibles dans la banque NBRF-PIR, un autre variant de génotype D, isolé à partir du même individu et qui présente deux mutations significatives. La première mutation concerne l'acide aminé Arg, en position 201 de la protéine HBsAg identifiée en SEQ ID NO 5 et la deuxième mutation concerne l'acide aminé Gly, en position 102 de la région Pré-S identifiée en SEQ ID NO 6. Les codons codant respectivement pour ces deux acides aminés sont les codons AGG à la position 628-630 dans le gène S et à la position 782-784 par rapport à la séquence du génome complet et le codon GGA à la position 304-306 dans la région Pré-S et à la position 3151-3153 par rapport à la séquence du génome complet ; - (ii) soit au moins un anticorps monoclonal ou polyclonal ou un fragment desdits anticorps, spécifique d'au moins une desdites protéines ou de ses fragments, lesdits anticorps ou fragments pouvant être utilisés seuls ou en combinaison et étant capables de se fixer à au moins une des protéines répondant aux définitions ci dessus. Cet anticorps peut être neutralisant ou non neutralisant, c'est à dire capable de neutraliser ou non l'activité protéique. Ces anticorps sont très utiles notamment pour permettent la mise en oeuvre de compositions thérapeutiques car ils conduisent par exemple, à des réactions immunes, dirigées spécifiquement à l'encontre d'épitopes immunodominants ou contre les antigènes.

L'invention concerne aussi des ligands susceptibles de s'associer à une séquence nucléotidique d'ADN ou d'ARN ou à un fragment nucléotidique tel que défini ci dessus. Ainsi, par ligand, on entend toute molécule susceptible de

s'associer à une séquence nucléotidique d'ADN ou d'ARN ou à un fragment nucléotidique, telle qu'un fragment nucléotidique partiellement ou totalement complémentaire, un polynucléotide complémentaire, un anticorps anti-acide nucléique. La production de fragments nucléotidiques ou de polynucléotides fait partie des connaissances générales de l'homme du métier. On peut notamment citer l'utilisation d'enzymes de restriction, et la synthèse chimique sur synthétiseur automatique. Les sondes et amorces susceptibles de s'hybrider dans des conditions de stringence déterminées à une séquence nucléotidique d'ADN ou d'ARN ou à un fragment nucléotidique tel que défini précédemment font partie de cette définition. Il est à la portée de l'homme du métier de définir les conditions de stringence appropriées. Des conditions de stringence caractéristiques sont celles qui correspondent à une combinaison de la température et de la concentration saline choisie approximativement entre 12 à 20 C sous le Tm ( melting température ) de l'hybride à l'étude. Les conditions de stringence pour discriminer même une seule mutation ponctuelle sont connues depuis au moins les années 1979 ; On peut citer à titre d'exemples Wallace R. B et al., DNA. Nucleic. Acids. Res. 6,3543-3557 (1979), Wallace R. B et al., Science, 209,1396-1400 (1980), Itakura K. and Riggs A. D., Science, 209, 1401-1405 (1980), Suggs S. V. et al., PNAS, 78,6613-6617 (1981), Wallace R. B et al. DNA. Nucleic. Acids. Res., 9,3647-3656 (1981), Wallace R. B et al.

DNA. Nucleic. Acids. Res., 9,879-894 (1981) et Conner B.J. etal, PNAS, 80, 278-282 (1983). Par ailleurs, on connaît des techniques pour la production d'anticorps anti-acides nucléiques. On peut citer à titre d'exemples Philippe Cros et al., Nucleic Acides Researc, 1994, Vol. 22, N . 15,2951-2957 ; Anderson, W. F. et al. (1988) Bioessays, 8 (2), 69-74 ; J. S. et al. (1984) FEBS Lett., 168, 303-306; Malfoy, B. et al. (1982) Biochemistry, 21(22), 5463-5467 ; Stollar, B. D. et al., J. J. (eds) Methods in Enzymology, Academic Press, pp 70- 85 ; Traincard, F. et al. (1989) J. Immunol. Meth., 123, 83-91 et Traincard, F. et al. (1989) Mol. Cell. Probes, 3,27-38).

Par fragment nucléotidique, on entend soit des fragments associés à une même unité moléculaire, soit des fragments dans un complexe moléculaire comprenant plusieurs sous-unités homologues ou hétérologues obtenues de

manière naturelle ou artificielle, notamment par multi-épissage différentiel ou par synthèse sélective.

On définit ainsi une composition diagnostique qui comprend au moins une sonde ou une amorce ou un anticorps anti-acide nucléique.

Les amorces, sondes et anticorps anti-acides nucléiques de l'invention sont par ailleurs utilisées dans un procédé de diagnostic d'ADN et/ou d'ARN viral, selon lequel on prélève un échantillon de sérum ou de plasma d'un patient, on traite si nécessaire ledit échantillon pour en extraire l'ADN et/ou l'ARN, on met en contact ledit échantillon avec au moins une sonde ou une amorce ou un anticorps anti-acide nucléique tels que défini précédemment, dans des conditions de stringence déterminées quand le ligand est une sonde ou une amorce et on détecte la présence d'ADN et/ou d'ARN viral dans l'échantillon soit par mise en évidence d'une hybridation dudit ADN et/ou ARN viral avec au moins une sonde, soit par amplification dudit ADN et/ou ARN, ou dans des conditions d'incubation déterminées lorsque le ligand est anticorps anti-acide nucléique et on détecte le complexe ainsi formé. Dans le cas de l'utilisation d'un anticorps anti-acide nucléique, l'anticorps peut lui même être marqué par tout marqueur approprié pour la révélation du complexe formé ou bien la formation du complexe peut être révélée par l'addition au milieu d'incubation d'un anticorps antianticorps acide nucléique marqué. Dans le cas d'utilisation de sondes la mise en évidence du complexe d'hybridation peut être effectuée directement par utilisation d'une sonde complémentaire ou sensiblement complémentaire de la séquence de la cible, ladite sonde étant marquée par tout marqueur approprié ou par mise en oeuvre de la technique dite sandwich en une ou deux étapes qui consiste à utiliser une sonde de capture complémentaire ou sensiblement complémentaire d'une partie de la séquence de la cible et une sonde dite de détection marquée complémentaire ou sensiblement complémentaire d'une autre partie de la séquence de la cible. Dans le cas d'utilisation d'amorces, celles ci peuvent être directement marquées pour la mise en évidence d'un produit d'amplification.

La présente invention concerne également un matériel biologique pour la préparation de compositions pharmaceutiques destinées au traitement d'une

infection au moins par HBVm, ladite composition comprenant (i) soit au moins une séquence d'acide nucléique capable de s'hybrider à au moins une des séquence d'acides nucléiques SEQ ID NO 1 et SEQ ID NO 3 ou leurs séquences complémentaires, en particulier à la séquence d'acide nucléique SEQ ID NO 1 ou sa séquence complémentaire, éventuellement en association avec une séquence d'acide nucléique susceptible de s'hybrider à au moins une des séquences nucléotidiques codant pour SEQ ID NO 5 et pour SEQ ID NO 6 ou leurs séquences complémentaires et/ou avec au moins une séquence d'acide nucléique de type HBV sauvage ; ou des fragments desdites séquences précitées, (ii) soit au moins une séquence d'acide nucléique comprenant au moins un gène d'intérêt thérapeutique et des éléments assurant l'expression dudit gène in vivo dans des cellules cibles destinées à être génétiquement modifiées par ladite séquence nucléique, (iii) soit au moins une cellule de mammifère ne produisant pas naturellement la ou les protéine(s) de l'invention ou leurs fragments ou des anticorps spécifiques d'au moins une desdites protéines ou de ses fragments ; ladite cellule mammifère étant génétiquement modifiée in vitro par au moins une séquence d'acide nucléique ou un fragment d'une séquence d'acide nucléique ou une association de séquences d'acides nucléiques correspondant à des fragments d'acides nucléiques issus d'un même gène ou de gènes différents, ledit gène d'intérêt thérapeutique codant pour tout ou partie de la ou des protéine(s) d'intérêt ou leur(s) fragment(s) ou pour un anticorps spécifique de la ou des protéine(s) d'intérêt qui sera exprimé à la surface de ladite cellule de mammifère (Toes et al., 1997, PNAS 94 : 14660-14665). La composition pharmaceutique peut contenir un agent thérapeutique seul dirigé contre une cible seule ou des agents pris en combinaison dirigés contre plusieurs cibles.

Aussi, la présente invention concerne également un matériel biologique pour la préparation de compositions pharmaceutiques comprenant au moins une séquence d'acide nucléique capable de s'hybrider à une séquence d'acide nucléique telle que définie ci dessus.

Les séquences d'acides nucléiques et/ou vecteurs (anti-sens ou codant pour une protéine) permettent notamment de cibler les cellules dans lesquelles un gène est exprimé.

Des séquences d'acides nucléiques ou des oligonucléotides anti-sens sont capables d'interférer spécifiquement avec la synthèse d'une protéine cible d'intérêt, par inhibition de la formation et/ou du fonctionnement du polysome, selon le positionnement de l'anti-sens dans l'ARNm de la cible. Donc le choix fréquent de la séquence entourant le codon d'initiation de la traduction comme cible pour une inhibition par un oligonucléotide anti-sens vise à prévenir la formation du complexe d'initiation. D'autres mécanismes dans l'inhibition par des oligonucléotides anti-sens impliquent une activation de la ribonucléase H qui digère les hybrides oligonucléotide anti-sens/ARNm ou une interférence au niveau de sites d'épissage par des oligonucléotides anti-sens dont la cible est un site d'épissage de l'ARNm. Les oligonucléotides anti-sens sont également complémentaires de séquences ADN et peuvent donc interférer au niveau de la transcription par la formation d'une triple hélice, l'oligonucléotide anti-sens s'appariant par des liaisons hydrogène dites de Hoogsteen au niveau du grand sillon de la double hélice d'ADN. Dans ce cas particulier, on parle plus précisément d'oligonucléotides antigènes. Il est bien entendu que les oligonucléotides anti-sens peuvent être strictement complémentaires de la cible ADN ou ARN à laquelle ils doivent s'hybrider, mais aussi non strictement complémentaires à la condition qu'ils s'hybrident à la cible. De même, il peut s'agir d'oligonucléotides anti-sens non modifiés ou modifiés au niveau des liaisons inter-nucléotidiques. Toutes ces notions font partie des connaissances générales de l'homme de l'art.

La présente invention concerne donc une composition pharmaceutique comprenant, entre autres, une séquence nucléique ou oligonucléotide anti-sens tels que définis ci-dessus.

La présente invention concerne aussi l'utilisation de vecteurs comprenant au moins un gène d'intérêt thérapeutique par rapport aux gènes des protéines d'intérêt identifiées dans la présente invention et un matériel biologique pour la préparation de compositions pharmaceutiques destinées au traitement de patients infectés par au moins le virus HBVm, ladite composition comprenant une séquence d'acide nucléique comprenant un gène d'intérêt thérapeutique et des éléments d'expression dudit gène d'intérêt. Les gènes peuvent être non mutés ou

mutés. Ils peuvent également consister en des acides nucléiques modifiés de sorte qu'il ne leur est pas possible de s'intégrer dans le génome de la cellule cible ou des acides nucléiques stabilisés à l'aide d'agents, tels que la spermine.

Un tel gène d'intérêt thérapeutique code notamment : - (i) soit au moins pour une protéine ou un fragment de protéine de l'invention ; - (ii) soit au moins pour tout ou partie d'un anticorps polyclonal ou monoclonal capable de se fixer à au moins une protéine de la présente invention.

Il peut notamment s'agir d'anticorps transmembranaire natif, ou de fragment ou dérivé d'un tel anticorps, pour autant que ledit anticorps, fragment ou dérivé d'anticorps soit exprimé à la surface d'une cellule cible d'un mammifère génétiquement modifiée aux fins de la présente invention et soit capable de se fixer à un polypeptide présent à la surface d'une cellule effectrice cytotoxique ou d'un lymphocyte T helper impliqué dans le procédé d'activation d'une telle cellule ; - (iii) soit au moins pour une molécule inhibitrice d'au moins une protéine de l'invention ; - (iv) soit au moins pour un ligand ou toute partie d'un ligand capable de se fixer à au moins une protéine ou un fragment de protéine de l'invention et/ou d'inhiber sa fonction.

Par anticorps transmembranaire on entend un anticorps dont au moins la région fonctionnelle capable de reconnaître et de se fixer à son antigène spécifique est exprimée à la surface des cellules cibles pour permettre lesdites reconnaissance et fixation. Plus particulièrement, les anticorps selon la présente invention consistent en des polypeptides de fusion comprenant les amino acides définissant ladite région fonctionnelle et une séquence d'amino acides (polypeptide transmembranaire) permettant l'ancrage au sein de la double couche lipidique membranaire de la cellule cible ou à la surface externe de cette bicouche. Les séquences nucléiques codant pour de nombreux polypeptides transmembranaires sont décrites dans la littérature.

Par éléments assurant l'expression dudit gène in vivo on fait notamment référence aux éléments nécessaires pour assurer l'expression dudit

gène après son transfert dans une cellule cible. Il s'agit notamment des séquences promotrices et/ou des séquences de régulation efficaces dans ladite cellule, et éventuellement les séquences requises pour permettre l'expression à la surface des cellules cibles d'un polypeptide. Le promoteur utilisé peut être un promoteur viral, ubiquitaire ou spécifique de tissu ou encore un promoteur synthétique. A titre d'exemple, on mentionnera les promoteurs, tels que les promoteurs des virus RSV (Rous Sarcoma Virus), MPSV, SV40 (Simian Virus), CMV (Cytomegalovirus) ou du virus de la vaccine. Il est en outre possible de choisir une séquence promotrice spécifique d'un type cellulaire donné, ou activable dans des conditions définies. La littérature procure un grand nombre d'informations relatives à de telles séquences promotrices.

Selon un mode de réalisation de l'invention, le gène thérapeutique consiste en une séquence d'acide nucléique d'ADN ou ARN nue, c'est à dire libre de tout composé facilitant son introduction dans les cellules (transfert de séquence d'acide nucléique). Toutefois, afin de favoriser son introduction dans les cellules cibles et afin d'obtenir les cellules génétiquement modifiées de l'invention, la séquence d'acide nucléique peut être sous la forme d'un vecteur , et plus particulièrement sous la forme d'un vecteur viral, tel que par exemple un vecteur adénoviral, rétroviral, un vecteur dérivé d'un poxvirus, notamment dérivé du virus de la vaccine ou du Modified Virus Ankara (MVA) ou d'un vecteur non viral tel que, par exemple, un vecteur consistant en au moins une séquence d'acide nucléique complexée ou conjuguée à au moins une molécule ou substance porteuse. La littérature procure un nombre important d'exemples de tels vecteurs viraux et non viraux.

De tels vecteurs peuvent en outre et de préférence comprendre des éléments de ciblage pouvant permettre de diriger le transfert de séquences d'acide nucléique vers certains types cellulaires ou certains tissus particuliers, tels que les cellules cytotoxiques et les cellules présentatrices de l'antigène). Ils peuvent également permettre de diriger le transfert d'une substance active vers certains compartiments intracellulaires préférés, tels que le noyau ou les peroxysomes. Il peut en outre s'agir d'éléments facilitant la pénétration à l'intérieur de la cellule ou la lyse de compartiments intracellulaires. De tels

éléments de ciblage sont largement décrits dans la littérature. Il peut par exemple s'agir de tout ou partie de peptides, d'oligonucléotides, d'antigènes, d'anticorps, de ligands spécifiques de récepteurs membranaires, de ligands susceptibles de réagir avec un anti-ligand, seuls ou en combinaison.

La présente invention concerne un matériel biologique pour la préparation de compositions pharmaceutiques comprenant au moins un vecteur contenant un gène thérapeutique, capable d'être introduit dans une cellule cible in vivo et d'exprimer le gène d'intérêt thérapeutique in vivo. L'avantage de cette invention repose sur la possibilité de maintenir sur le long terme un niveau basal de molécules exprimées chez le patient traité. Des vecteurs ou acides nucléiques codant pour des gènes d'intérêt thérapeutique sont injectés. Ces vecteurs et acides nucléiques doivent être transportés jusqu'aux cellules cibles et transfecter ces cellules dans lesquelles ils doivent être exprimés in vivo.

L'invention concerne aussi l'expression in vivo de séquences nucléotidiques et/ou de vecteurs tels que décrits dans le paragraphe précédent, c'est-à-dire des séquences correspondant à des gènes d'intérêt thérapeutique codant notamment pour: - (i) soit au moins pour une protéine invention, ou ses fragments, - (ii) soit au moins pour tout ou partie d'un anticorps polyclonal ou monoclonal capable de se fixer à au moins une protéine de l'invention. Il peut s'agir d'anticorps transmembranaire natif, ou de fragment ou dérivé d'un tel anticorps, pour autant que ledit anticorps, fragment ou dérivé d'anticorps soit exprimé à la surface de la cellule cible d'un mammifère génétiquement modifiée et en ce que ledit anticorps soit capable de se fixer à un polypeptide présent à la surface d'une cellule effectrice cytotoxique ou d'un lymphocyte T helper et impliqué dans le procédé d'activation d'une telle cellule. Il peut s'agir de fragments d'anticorps exprimés par des cellules capables de sécréter lesdits anticorps dans la circulation sanguine d'un mammifère porteur des cellules génétiquement modifiées par le gène codant pour l'anticorps, soit au moins pour une molécule inhibitrice d'au moins une protéine choisie parmi les protéines de l'invention, soit au moins pour un ligand ou toute partie du ligand capable de se fixer sur au moins une protéine de l'invention, et/ou d'inhiber sa fonction.

Selon un mode de réalisation particulier, on utilise la thérapie génique de manière à diriger la réponse immune contre au moins une protéine, en particulier HBsAgm, de l'invention, et/ou contre toute molécule inhibitrice de la fonction et/ou de l'expression et/ou du métabolisme d'au moins une protéine de l'invention, et/ou contre des ligands d'au moins une des protéines de l'invention, en particulier contre un ou des récepteur (s). cela il est évident que les cellules à cibler pour la tansformation avec un vecteur sont des cellules appartenant au système immun, soit des cellules de type lymphocytes (CD4/CD8), soit des cellules présentatrices de l'antigène.

Selon un mode de réalisation particulier, on modifie génétiquement, notamment in vivo, les cellules présentatrices de l'antigène (CPAs). Les CPAs comme les macrophages, les cellules dendritiques, les microgliocytes, les astrocytes jouent un rôle dans l'initiation de la réponse immune. Elles sont les premiers composants cellulaires qui capturent l'antigène, l'apprête intracellulairement et expriment des molécules du CMHI et CMHII transmembranaires impliquées dans la présentation de l'immunogène aux cellules T CD4+ et CD8 + , elles produisent des protéines accessoires spécifiques qui participent à l'activation des cellules T (Debrick et al ;, 1991, J. Immunol 147 : 2846 ; Reis et al., 1993, J Ep Med 178 : Kovacsovics-bankowski et al., 1993, PNAS 90 : 4942 ; Kovacsovics-bankowski et al., 1995 Science 267 : 243 ; Svensson et al., 1997, J Immunol 158 : 4229 ; Norbury et al ;, 1997, Eur J Immunol 27 : 280). Pour une vaccination, il peut être avantageux de disposer d'un système de thérapie génique qui peut cibler le transfert de gène dans de telles cellules APCs, c'est à dire un gène qui code pour un polypeptide qui peut, après sa production intracellulaire et sa transformation, être présenté aux cellules CD8+ et/ou CD4+ par les molécules des complexes CMHI et CMHII respectivement à la surface de ces cellules.

On choisit d'exprimer à la surface des cellules CPAs in vivo tout ou partie d'un anticorps et/ou d'un ligand comme par exemple un récepteur, capable de réagir avec une protéine de l'invention. De telles cellules vont alors spécifiquement phagocyter la protéine, la transformer de façon à ce que des fragments soient présentés à la surface des cellules présentatrices de l'antigène.

La littérature propose un grand nombre d'exemples de gènes codant pour des anticorps capables de réagir avec des polypeptides ou récepteurs. Il est à la portée de l'homme de l'art d'obtenir les séquences d'acides nucléiques codant pour de tels anticorps. Citons par exemple les gènes codant pour les chaines légère et lourde de l'anticorps YTH 12. 5 (anti-CD3) (Routledge et al.

1991, Eur J Immunol 21 : 2717-2725), de l'anti-CD3 selon Arakawa et al ; 1996, J. Biochem. 120 : 657-662. Les séquences d'acide nucléique de tels anticorps sont aisément identifiables à partir des bases de données communément utilisées par l'homme du métier. Il est également possible à partir d'hybridomes disponibles auprès de l'ATCC de cloner les séquences d'acides nucléiques codant pour les chaines lourdes et/ou légères de ces différents anticorps par les méthodes d'amplification telles que la RT-PCR à l'aide d'oligonucléotides spécifiques ou les techniques mettant en oeuvre des banques de cDNA (Maniatis et al ., 1982, Molecular cloning. A laboratory manual CSH Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). Les séquences ainsi clonées sont alors disponibles pour leur clonage dans des vecteurs. Selon un cas préféré de l'invention, la séquence d'acide nucléique codant pour la chaîne lourde de l'anticorps est fusionnée par recombinaison homologue avec la séquence d'acide nucléique codant pour un polypeptide transmembranaire tel que la glycoprotéine rabique ou la gp160 (Polydefkis et al., 1990J Exp Med 171 : 875-887). Ces techniques de biologie moléculaire ont été parfaitement bien décrites.

On choisit d'exprimer à la surface des cellules CPA in vivo des fragments immunogènes correspondant à au moins une protéine de l'invention.

Pour cela, on peut choisir de faire exprimer par le vecteur soit un polypeptide complet, soit des polypeptides sélectionnés pour réagir avec des ligands et/ou récepteurs spécifiques. Le peptide immunogène codé par l'acide nucléique ou le polynucléotide introduit dans la cellule du vertébré in vivo peut être produit et/ou sécrété, apprêté puis présenté à une cellule présentatrice de l'antigène (APC) dans le contexte des molécules du CMH. Les APCs ainsi transférées in vivo induisent une réponse immune dirigée contre T'immunogène exprimé in vivo. Les APCs possèdent différents mécanismes pour capturer les antigènes : (a) la capture des antigènes par des récepteurs membranaires comme les récepteurs

aux immunoglobulines (Fc) ou pour le complément disponibles à la surface des granulocytes, des monocytes ou macrophages permettant une délivrance efficace de l'antigène dans les compartiments intracellulaires après phagocytose médiée par les récepteurs. (b) l'entrée dans les APC par pinocytose en phase fluide.

Selon un mode de réalisation particulier, on modifie génétiquement notamment in vivo, les cellules effectrices cytotoxiques ou les lymphocytes T helper de façon à ce qu'elles expriment à leur surface un polypeptide ou un ou des ligand(s) dudit polypeptide, naturellement non exprimé(s) par ces cellules, et capables d'induire leur activation, par l'introduction dans ces cellules de séquences d'acide nucléique renfermant le gène codant pour le polypeptide.

Conformément à la présente invention, il est également possible de sélectionner une séquence d'acide nucléique contenant un gène d'intérêt thérapeutique codant pour tout ou partie d'un anticorps dirigé contre au moins une protéine de l'invention et susceptible d'être exprimé à la surface des cellules cibles du patient à traiter, ledit anticorps étant capable de se fixer à un polypeptide naturellement non exprimé par les cellules effectrices cytotoxiques ou lymphocytes T helper .

Par cellules effectrices cytotoxiques, on entend les macrophages, les astrocytes, les lymphocytes T cytotoxiques (TCLs) et les cellules tueuses (NKs) ainsi que leurs dérivés tels que par exemple les LAK (Versteeg 1992 Immunology today 13 : 244-247 ; Brittende et al 1996, Cancer 77 :1226-1243). Par lymphocytes T helper , on entend notamment les CD4 qui permettent, après activation, la sécrétion de facteurs d'activation des cellules effectrices de la réponse immune. Les polypeptides et notamment les récepteurs exprimés à la surface de ces cellules et qui sont impliqués dans l'activation de telles cellules consistent notamment en tout ou partie du complexe TCR ou le CD3, tout ou partie des complexes CD8, CD4, CD28, LFA-1, 4-1 BB (Melero et al., 1998, Eur J Immunol 28 : 1116-1121), CD47, CD2, CD1, CD9, CD45, CD30, CD40, tout ou partie des récepteurs de cytokines (Finke etal., 1998, Gene therapy 5 : 31-39),telles que IL-7, IL-4, IL-2, IL-15 ou GM-CSF, tout ou partie du complexe récepteur des cellules NK tel que par exemple NKAR, Nkp46,.. ; (Kawano et al., 1998 Immunology 95 : 5690-5693 ; Pessino et al., 1998 J Exp Med188 : 953-

960), Nkp44, tout ou partie des récepteurs de macrophages tels que par exemple le récepteur Fc (Deo et al., 1997, Immunology Today 18 : 127-135).

De nombreux outils ont été développés pour introduire différents gènes hétérologues et/ou vecteurs dans des cellules, en particulier des cellules de mammifères. Ces techniques peuvent être divisées en deux catégories : la première catégorie implique des technique physiques comme la micro-injection, l'électroporation ou le bombardement de particules. La seconde catégorie est basée sur l'utilisation de techniques en biologie moléculaire et cellulaire avec lesquelles le gène est transféré avec un vecteur biologique ou synthétique qui facilite l'introduction du matériel dans la cellule in vivo. Aujourd'hui, les vecteurs les plus efficaces sont les vecteurs viraux en particulier les adénoviraux et rétroviraux. Ces virus possèdent des propriétés naturelles pour traverser les membranes plasmiques, éviter la dégradation de leur matériel génétique et introduire leur génome dans le noyau de la cellule. Ces virus ont été largement étudiés et certains sont déjà utilisés expérimentalement dans des applications humaines en vaccination, en immunothérapie, ou pour compenser des déficiences génétiques. Cependant cette approche virale a des limitations notamment due à la capacité de clonage restreinte dans ces génomes viraux, le risque de disséminer les particules virales produites dans l'organisme et l'environnement, le risque de mutagénèse artéfactuelle par insertion dans la cellule hôte dans le cas des rétrovirus, et la possibilité d'induire une forte réponse immune inflammatoire in vivo pendant le traitement, ce qui limite le nombre d'injections possibles (Mc Coy et al. 11995, human Gene Therapy 6 : 1553-1560 ; Yang et al., 1996 Immunity 1 : 433-422). D'autres systèmes alternatifs à ces vecteurs viraux existent. L'utilisation de méthodes non virales comme par exemple la coprécipitation avec le phosphate de calcium, l'utilisation de récepteurs qui miment les systèmes viraux (pour un résumé voir Cotten et Wagner 1993, Current Opinion in Biotehcnology, 4 : 705-710), ou l'utilisation de polymères comme les polyamidoamines (Haensler et Szoka 1993, Bioconjugate Chem 4 : 372-379).

D'autres techniques non virales sont basées sur l'utilisation de liposomes dont l'efficacité pour l'introduction de macromolécules biologiques comme l'ADN, l'ARN des protéines ou des substances pharmacteutiques actives a été largement

décrite dans la littérature scientifique. Dans ce domaine des équipes ont proposé l'utilisation de lipides cationiques ayant une forte affinité pour les membranes cellulaires et/ou les acides nucléiques. En fait il a été montré qu'une molécule d'acide nucléique elle-même pouvait traverser la membrane plasmique de certaines cellules in vivo (WO 90/11092), l'efficacité étant dépendante en particulier de la nature polyanionique de l'acide nucléique. Dès 1989 (Felgner et al ;, Nature 337 : 387-388)les lipides cationiques ont été proposés pour faciliter l'introduction de larges molécules anioniques, ce qui neutralise les charges négatives de ces molécules et favorise leur introduction dans les cellules.

Différentes équipes ont développés de tels lipides cationiques : le DOTMA (Felgner et al., 1987, PNAS 84 : 7413-7417), leDOGS ou TransfectamTM (Behr et al., 1989, PNAS 86 : 6982-6986),le DMRIE et le DORIE (Felgner et al., 1993 methods 5 : 67-75),le DC-CHOL (Gao et Huang 1991, BBRC 179 : 280-285),le DOTAPTM (McLachlan et al., 1995, Gene therapy 2: 674-622) ou la LipofectamineTM, et les autres molécules décrites dans les brevets W091 16024, W09514651, W09405624. D'autre groupes ont développés des polymères cationiques qui facilitent le transfert de macromolécules en particulier des macromolécules anioniques dans les cellules. Le brevet W095/24221 décrit l'utilisation de polymères dendritiques, le document W096/02655 décrit l'utilisation du polyéthylèneimine ou polypropylèneimine et les document US-A- 5595897 et FR 2719316, l'utilisation des conjugués polylysine.

Etant donné que l'on souhaite obtenir in vivo une transformation ciblée vers un type cellulaire donné, il est évident que le vecteur utilisé doit pouvoir être lui-même ciblé .

La présente invention concerne aussi un matériel biologique pour la préparation de compositions pharmaceutiques, la composition comprenant au moins une cellule, notamment une cellule ne produisant pas naturellement des anticorps, sous une forme permettant son administration dans un organisme mammifère, humain ou animal, ainsi qu'éventuellement sa culture préalable, ladite cellule étant génétiquement modifiée in vitro par au moins une séquence d'acide nucléique contenant au moins un gène thérapeutique codant in vivo pour au moins une protéine ou un fragment d'une protéine de l'invention ou pour au

moins une molécule inhibitrice de la fonction et/ou de la fixation et/ou de l'expression d'au moins une protéine ou d'un fragment de protéine de l'invention ou pour au moins un anticorps ou une partie d'anticorps capable de se lier à au moins une protéine de l'invention.

Plus particulièrement, ladite cellule cible provient soit de l'individu à traiter, soit d'un autre mammifère. Dans ce dernier cas, il convient de noter que ladite cellule cible aura subi un traitement la rendant compatible avec l'homme.

Ces cellules sont établies en lignées cellulaires et sont préférentiellement CMHII + ou CMHII + inductibles comme les lymphocytes, les monocytes, les astrocytes, les oligodendrocytes.

L'invention concerne également les cellules modifiées et un procédé de préparation d'une cellule telle que décrite ci dessus caractérisé en ce que l'on introduit dans une cellule de mammifère ne produisant pas naturellement d'anticorps, par tout ou moyen approprié, au moins une séquence d'acide nucléique contenant au moins un gène d'intérêt thérapeutique et des éléments assurant l'expression dudit gène dans ladite cellule, ledit gène d'intérêt thérapeutique contenant une séquence d'acide nucléique codant pour une molécule ou un fragment de molécule in vivo, comme décrit ci-dessus. Plus particulièrement, elle concerne des cellules eucaryotes , en particulier les cellules COS et CHO et des cellules issues d'organismes eucaryotes inférieurs, telles que des cellules de levure, en particulier les cellules isuues de Saccharomyces cerevisiae et de Pichia pastoris , en particulier des cellules transformées par au moins une séquence nucléotidique et/ou un vecteur tel que décrit précédemment.

Selon un mode de réalisation particulier, les cellules (cellules dendritiques, macrophages, astrocytes, lymphocytes T CD4 + , lymphocytes T CD8 + ou autres) du patient ou cellules allogéniques sont placées en contact d'une préparation purifiée d'au moins une protéine ou d'un fragment de protéine de l'invention. La protéine ou son fragment est internalisé, apprêté et présenté à la surface de la cellule et associé aux molécules du CMHI et/ou CMHII pour induire une réponse immune spécifique contre la protéine ou son fragment. Les cellules ainsi activées sont ensuite administrées au patient chez lequel elles vont induire une réponse immune spécifique des antigènes.

Dans un cas particulier, les cellules présentatrices d'antigène sont modifiées in vitro pour exprimer les antigènes dans la cellule transformée qui vont s'associer aux molécules du CMHI et/ou CMHII et être présentées à la surface des cellules pour induire chez le patient, chez lequel on administre la cellule modifiée, une réaction immune parfaitement ciblée.

Les approches vaccinales ne sont pas toujours entièrement satisfaisantes et peuvent conduire à des réactions immunes limitées dirigées uniquement à l'encontre d'épitopes immunodominants. De même une présentation incorrecte des antigènes par les glycoprotéines du système CMH à la surface des cellules, ne permet pas de développer chez le patient traité une immunité anti-protéique convenable. Afin de pallier ces problèmes, des auteurs ont proposé dans le cadre de procédés vaccinaux, de sélectionner les fragments minimaux antigéniques correspondant aux portions de peptide susceptibles d'être reconnus spécifiquement par les lymph ocytes T cytotoxiques, de les exprimer dans les cellules afin qu'ils s'associent aux molécules du CMHI et soient présentés à la surface des cellules pour induire chez le patient traité une réaction immunitaire parfaitement ciblée (Toes ot al. 1997, PNAS 94: 14660-14665).

Plus particulièrement, il a été montré que des épitopes de très petites tailles (variant de 7 à environ 13 acides aminés ) qui sont exprimés à partir de minigènes introduits dans un virus de la vaccine, pouvaient induire une immunisation de type cellulaire. Il a par ailleurs été montré que plusieurs minigènes pouvaient être exprimés conjointement à partir d'un même vecteur (cette construction particulière est appelée string of beads ). Une telle construction présente l'avantage d'induire une réaction immune de type CTL synergique (Whitton et al ;, 1993 J. of Virology 67 : 348-352).

La présentation des fragments antigéniques par les molécules CMHI repose sur un procédé intracellulaire identifié (voir Groettrup et al., 1996 Immunology Today 17 : 429-435 pour une revue) au cours duquel des peptides antigéniques de très courtes tailles (environ 7 à 13 ou 8 à 12 acides aminés) sont produits par dégradation d'un polypeptide plus complexe contre lequel la réaction immune finale sera dirigée. Ces peptides courts sont ensuite associés aux molécules du CMHI ou du CMHII pour former un complexe protéique qui est

transporté à la surface cellulaire afin de présenter lesdits peptides aux lymphocytes T cytotoxiques circulants ou aux lymphocytes T helper circulants, respectivement.

Selon un mode de réalisation particulier, les cellules, telles que les cellules dendritiques, les macrophages, les astrocytes, les lymphocytes T CD4+, les lymphocytes T CD8 +, sont modifiées de manière à exprimer à leur surface des anticorps spécifiques du peptide ciblé. Le peptide est neutralisé par les anticorps exprimés à la surface des cellules. Ces cellules qui de préférence ont été prélevées chez le patient sont des cellules du système immunitaire, de préférence cytotoxiques, modifiées pour exprimer tout ou partie d'un anticorps spécifique du polypeptide cible.

En 1968, Boyum décrivit une technique rapide qui permet par centrifugation du sang sur gradient de densité, de séparer les cellules mononuclées (lymphocytes et monocytes) avec un bon rendement (rendement théorique 50%, c'est-à-dire 106 cellules/ml de sang). Selon ce protocole, 50 ml de sang périphérique prélevés stérilement sont centrifugés 20 minutes à 150g à 20 C. Les cellules récupérées sont diluées dans deux volumes de sang périphérique initial de PBS stérile. 10 ml de cette suspension sont déposés sur 3ml d'une solution de Ficoll-Hypaque (milieu de séparation des lymphocytes, Flow). Après centrifugation pendant 20 minutes à 400g et 20 C sans freinage de décélération , les cellules mononuclées sédimentent à l'interface PBS-Ficoll, en une couche dense, opalescente, alors que la quasi-totalité des globules rouges et des polynucléaires sédimentent au fond du tube. Les cellules mononuclées sont récupérées et lavées en PBS stérile.

Les cellules présentatrices de l'antigène sont préalablement lavées avec un tampon PBS-BSA à 0.5% (poids/volume) puis comptées. Elles sont ensuite préincubées en présence de différents inhibiteurs de réduction, trois fois dans du PBS-BSA 0. 5% contenant de 10 M à 10 mM final de DTNB (acide 5,5'dithio-bis-2-nitrobenzoïque) ou de NEM (N-éthylmaléimide). Les étapes ultérieures de fixation d'antigènes à la surface cellulaire ou d'internalisation d'antigènes se réalisent aussi en présence des différentes concentrations d'inhibiteurs.

8.106 cellules sont internalisées en présence de quantité saturante de protéines radiomarquées à l'iode 125 (1 g) dans des micropuits. Après une heure d'incubation à 4 C sous agitation, les antigènes sont fixés à la surface des cellules. La suspension cellulaire est lavée deux fois en PBS-BSA et les culots cellulaires sont repris dans 70 l de tampon et incubées à 37 C pendant différentes périodes allant jusqu'à 2 heures. Cellules et surnageants sont séparés par centrifugation à 800g pendant 5 minutes 4 C. Pour des plus longues périodes d'incubation, l'étape préliminaire de pré-fixation des antigènes à la surface des cellules est supprimée. Les cellules sont diluées dans un milieu RPMI- 10% SVF en présence de 20 mM Hépès, à 106cellules /ml. Les cellules sont incubées en présence d'un excès d'antigène pendant différentes périodes à 37 C (1 g de molécules / 5.107 cellules monocytes/macrophages ou /108 cellules BEBV).

Tous les agents thérapeutiques définis dans le cadre de la présente invention sont utilisés pour prévenir et/ou traiter une infection par au moins le virus HBVm. Ils peuvent être utilisés également pour évaluer leur efficacité in vitro ou in vivo.

Le matériel biologique est administré in vivo notamment sous forme injectable par voie intramusculaire ou sous cutanée ou tout autre moyen équivalent. L'administration peut avoir lieu en dose unique ou répétée, une ou plusieurs fois après un certain délai d'intervalle. La voie d'administration et le dosage les mieux appropriés varient en fonction de différents paramètres tels que par exemple l'individu, le stade et/ou l'évolution de la maladie, ou encore de l'acide nucléique et/ou de la protéine et/ou peptide et/ou molécule et/ou cellule à transférer ou de l'organe/tissus cible.

Pour la mise en oeuvre du traitement, il est possible de disposer de compositions pharmaceutiques comprenant un matériel biologique tel que précédemment décrit, avantageusement associé avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour l'administration à l'homme ou à l'animal.

L'utilisation de tels supports est décrite dans la littérature (voir par exemple Remington's Pharmaceutical Sciences 16th ed. 1980, Mack Publishing Co). Ce véhicule pharmaceutiquement acceptable est préférentiellement isotonique,

hypotonique ou présente une faible hypertonicité et a une force ionique relativement basse, tel que par exemple une solution de sucrose. Par ailleurs, ladite composition peut contenir des solvants, des véhicules aqueux ou partiellement aqueux tels que de l'eau stérile, libre d'agents pyrogène et des milieux de dispersion par exemple. Le pH de ces compositions pharmaceutiques est convenablement ajusté et tamponné selon les techniques conventionnelles.

L'invention concerne donc également (i) un procédé pour le traitement d'un patient infecté par le virus HBVm de l'invention selon lequel on administre audit patient un matériel biologique tel que défini précédemment, éventuellement associé à un adjuvant et/ou un diluant et/ou un excipient et/ou un véhicule pharmaceutiquement acceptable et (ii) un procédé pour prévenir une infection par au moins le virus HBVm de l'invention selon lequel on administre à un individu un matériel biologique tel que défini ci-dessus éventuellement associé à un adjuvant et/ou diluant et/ou véhicule pharmaceutiquement acceptable, en particulier une composition vaccinale.

Enfin, l'invention a pour objet une composition comprenant une séquence d'ADN codant pour une protéine de surface mutée du virus HBVm (HBsAgm) ou ses fragments, ladite protéine HBsAgm comprenant un déterminant a modifié d'une protéine HBs représenté en SEQ ID NO 2, ledit ADN étant mélangé avec un véhicule et/ou un adjuvant et/ou un excipient et/ou un diluant approprié et pouvant comprendre également une séquence codante Pré-S mutée qui code pour une protéine de surface mutée, référencée en SEQ ID NO 4 et/ou une séquence d'ADN codant pour une protéine de surface mutée référencée en SEQ ID NO 5 ou ses fragments et/ou une séquence d'ADN codant pour une région Pré-S mutée référencée en SEQ ID NO 6 ou ses fragments.

La figure 1 représente la séquence complète du clone x27~16 de génotype A de l'invention. Les séquences soulignées correspondent aux codons d'initiation et de terminaison pour les différents gènes.

La figure 2 représente la séquence complète du clone x27~9 de génotype D de l'invention. Les séquences soulignées correspondent aux codons d'initiation et de terminaison pour les différents gènes.

Les figures 3 et 4 représentent respectivement les séquences en acides aminés du gène HBs et de la totalité de la région Pré-S des clones x27~16 et x27~9, alignées avec 102 séquences HBs ou Pré-S trouvées dans la banque NBRF/PIR.

Exemple 1 : Identification du variant ou mutant HBVm.

Le patient est un homme de 86 ans avec un historique d'hépatite non A, non B chronique, dont la pathologie a évoluée jusqu'au stade de cirrhose. Il ne présentait aucun facteur de risque identifié. Son taux de transaminases dans le sang était sensiblement plus élevé que la normale (1 à 2 fois par rapport à la normale). Il n'était ni HCV, ni HGV, ni HDV positif par les tests de détection d'ARN par PCR. Une détection potentielle du virus TTV a également été effectuée par PCR qui est s'est révélée négative.

1. Tests sérologiques : la détection de l'antigène HBsAg a été réalisée dans le sérum du patient premièrement avec le test MonoLisa (nom commercial) de seconde génération commercialisé par Sanofi Diagnostics Pasteur et deuxièmement avec le kit de détection VIDAS HBsAg commercialisé par la société bioMérieux. Les résultats étaient négatifs avec chacun des test de détection utilisé. La détection d'anticorps anti-HBs a été effectuée à l'aide du test ELISA DiaSorin (nom commercial) commercialisé par la société Sorin dans le sérum du patient. Les résultats du test de détection d'anticorps anti-HBs s'est révélé également négatif. La détection d'anticorps anti-HBc totaux a été réalisée par un test de compétition CORAB rDNA (nom commercial) de la société Abbott Diagnostics et à l'aide du test ELISA Ortho HBc Elisa commercialisé par Ortho Diagnostic System. Les résultats montrent la présence de 104 molécules d'ADN par ml de sérum chez le patient contre les 108 molécules d'ADN/ml habituellement trouvées chez les patients HBV positifs à un stade chronique de la maladie.

2. Immunomarquage dans le foie : l'immunomarquage a été réalisé sur des prélèvements de foie par immunofluorescence pour l'antigène HBsAg en utilisant des anticorps polyclonaux de lapin dirigés contre HBsAg (commercialisés par la société Janssen) et des anticorps anti-lapin fluorescents (commercialisés

par la société DAKO). Le marquage par la peroxydase a été réalisé en utilisant un anticorps polyclonal de lapin dirigé contre l'antigène HBc et des anticorps antilapin (commercialisés par DAKO) comme décrit par Vitvitski-Trepo et al., Hepatology, 6 :1278-1283 (1990). Ces tests se sont révélés être négatifs pour la présence des antigènes HBsAg et HBcAg dans le foie du patient.

3. Test de détection du génome viral par PCR : détection par PCR du génome viral dans le sérum a été réalisée à l'aide du test Expand High Fidelity PCR System, commercialisé par la société Roche pour HBV et à l'aide du test AMPLICOR (nom commercial) de la société Abbott pour HCV. 140 l de sérum ont été utilisés pour l'extraction des acides nucléiques. L'acide nucléique a été extrait en utilisant un kit d'extraction des acides nucléiques commercialisé par la société Qiagen, qui permet de purifier à la fois l'ADN et l'ARN. Le sérum a été soumis à une incubation en présence d'un tampon de lyse pendant 10 min. A température ambiante, puis passé sur colonnes de silice. L'ADN a été elué de la colonne avec 50 l d'eau stérile. Le contenu en acides nucléiques total provenant de sang total ou de biopsies du foie a été extrait en utilisant les kits commercialisés par la société Quiagen, respectivement pour le sang et pour les tissus.

La détection de l'ADN de HBv a été réalisée par une amplification nichée en deux étapes, au moyen d'amorces sélectionnées dans une région connue pour être bien conservée dans le gène S de HBV.

Première étape d'amplification : les premiers 35 cycles d'amplification sont précédés par un pré-chauffage à 95 C pendant 5 min., 95 C pendant 45 secondes, 48 C pendant 45 secondes et 72 C pendant 1 min. Une étape d'élongation pendant 10 min. a ensuite été réalisée.

Amorce 1 (Pol 1) : 5' CCT GCT GGT GGC TCC AGT TC 3' (Pichoud étal., Hepatology, 1999,1 :230-237)
Amorce 2 (POR4) : 5' TAC CCA AAG ACA AAA GAA AAT TGG 3'
La seconde étape d'amplification est de 40 cycles avec un préchauffage à 95 C pendant 5 min., 5 cycles d'amplification à 95 C pendant 25 secondes, 37 C pendant 45 secondes, 72 C pendant 1 min. et les 35 autres

cycles à 95 C pendant 45 secondes, 48 C pendant 45 secondes et 72 C pendant 1 min. A la fin une étape d'élongation est réalisée.

Amorce 3 : TAG TAA ACT GAG CCA RGA GAA AC 3'
Amorce 4 : 5' GTT GAC AAR AAT CCT CAC AAT AC 3'
R représente A ou G.

La PCR est réalisée à partir de 10 l d'acides nucléiques totaux qui ont été extraits de 140 l de sérum, 200,u1 de sang total, 25 mg d'une biopsie du foie congelée ou fixée à la formaline dans de la paraffine.

Une amplification par PCR du gène X a également été réalisée en suivant la technique décrite par Uchida et al., Microbiol, Immunol, 1994,38, 281-285. L'amplification du gène X est intéressante parce que le produit du gène X transactive les promoteurs HBV et parce que le promoteur du core de HBV chevauche le gène X. En conséquence, des mutations affectant soit le produit du gène X ou le promoteur du core ou les deux, pourraient conduire à une diminution des niveaux de transcription et de réplication du virus, expliquant sa non-détectabilité par les tests commerciaux.

18 tour : amorce 1 : 5' CCA TAC TGC GGA ACT CCT AG 3' amorce 2 : 5' ATT TGC TCG CAG CCG GTC TG 3'
2e tour : amorce 3 : 5' TTT TGC CAG CCG GTC TG 3' amorce 4 : 5' ATT TGC TCG CAG CCG GTC TG 3'
Des dilutions en série de plasmide dilué dans un sérum de contrôle ont permis de déterminer la sensibilité de la PCR. La PCR nichée dans les gènes S et X de HBV permet de détecter dix génomes de HBV.

4. Quantification de l'ADN de HBV dans le sérum : la quantification a été réalisée en utilisant le test Amplicor HBV monitor (nom commercial), commercialisé par la société ROCHE. Le test comprend des amorces choisies dans la région pré-C/C de HBV qui permettent la détection de 4 x 102 à 4 x 107 copies d'ADN de HBV/ml. 50 NI de sérum ont été utilisés dans ce test (Kessler et al., Clin. Chem., 1998 ; 601-604).

5. Amplification du génome complet de HBV : l'amplification du génome de HBV a été exécutée en utilisant la technique décrite par Günther et

al., Journal of Virology, Sept. 1995, pages 5437-5444 en utilisant les amorces suivantes :
Amorce 1 (P1) : 5' CCG GAA AGC TTG AGC TCT TCT TTT TCA CCT CTG CCT AAT CA 3'
Amorce 2 (P2) : 5' CCG GAA AGC TTG AGC TCT TCA AAA AGT TGC ATG GTG CTG G 3'
Le kit Expand High Fidelity (nom commercial) commercialisé par la société Roche contenant 1,5 mmol/l de MgCI2, 200 mol/l de désoxynucléoside triphosphate, 2,6 U d'un mélange de Taq et Pwo ADN polymérase (High Fidelity, commercialisé par la société Roche) ont été utilisés avec 1 mol/l de chaque amorce décrite ci-dessus.

La technique exploite le fait que bien que le génome de HBV trouvé dans les virions circulants soit circulaire, les brins ne sont pas fermés de manière covalente et peuvent donc rapidement s'hybrider aux amorces de PCR et le fait qu'il existe une courte redondance terminale aux extrémités 5' et 3' du brin moins. L'extrémité 3' de l'amorce P1 est complémentaire à l'extrémité 5' du brin moins, incluant la séquence redondante, tandis que l'extrémité 3' de l'amorce P2 est complémentaire à la séquence du brin plus, commençant avec la séquence redondante. Les extrémités 5' des deux amorces contiennent les sites d'enzymes de restriction pour Hind III, Sac # et Sap # qui sont rarement trouvés dans les génomes de HBV.

Après un démarrage à chaud, 40 cycles de PCR ont été réalisés avec une dénaturation à 94 C pendant 40 secondes, une hybridation à 60 C pendant 1,30 min. et une élongation à 72 C pendant 3 min., avec une incrémentation de 10 secondes après chaque cycle, dans un appareil pour amplification par PCR commercialisé par la société Perkin Elmer. Une extension finale de 10 min. est réalisée à la fin des cycles.

L'obtention du brin ADN positif par l'action de la polymérase virale a été réalisée comme décrit par Hantz et al., Antimicrobiol. Agent Chemether, 1984,25 : 240-246, avec incubation du sérum en présence de DNTPs, à une température de 37 C pendant une nuit. Quand le génome n'était pas amplifié ou peu amplifié, des aliquotes de PCR du génome entier ont été réamplifiés en

utilisant une combinaison de l'amorce P1 et de l'amorce Por1 ou de l'amorce P2 et de l'amorce Poil. Ces PCR semi-nichées permettent chacune d'obtenir un fragment d'environ 1800 paires de bases, avec des chevauchements de l'une à l'autre d'environ 300 paires de bases.

6. Analyse des produits de PCR : des aliquotes des produits de réaction PCR ont été passés en électrophorèse sur gels d'agarose (1 à 2 % en fonction de la taille du produit amplifié supposée).Les gels ont été colorés avec du bromure d'éthydium ou avec la coloration de GELSTAR et photographiés.

L'ADN est ensuite été transféré sur une membrane de nylon (Hybon N + nylon membrane) commercialisée par Amersham, en présence de 0,4 M de NaOH. La membrane de nylon a été ensuite soumise ensuite à une hybridation avec une sonde ADN de HBV de 3,2 kb, marquée au 32P en utilisant le kit Ready to go Random Primer Kit , commercialisé par la société Pharmacia Biotech.

7. Purification des produits de PCR : quandles bandes spécifiques de HBV ont été amplifiées, le reste des produits de réaction PCR est passé en électrophorèse sur gels d'agarose, coloré, et les bandes spécifiques sont excisées à l'aide d'un scalpel sous irradiation UV à la longueur d'ondes 312 nm. L'ADN est ensuite isolée du gel d'agarose en utilisant le kit Geneclean, commercialisé par Bio 101, et élué dans un faible volume d'eau.

8. Clonage des produits d'amplification de PCR : les stratégies de clonage utilisées sont fonction de la nature des produits d'amplification PCR. Les amplifications de HBs et HBx sous génoniques, ont été exécutées avec la Taq polymérase qui possède une activité de type transférase terminale naturelle et l'addition d'un nucléotide, habituellement l'adénosine, aux extrémités 3' des fragments amplifiés. Ces fragments sont clonés directement dans le vecteur pGEM-T (Promega), un vecteur de clonage linéarisé contenant un codon supplémentaire qui code pour la thymine à son extrémité 3'. Les amplifications du génome complet par PCR ou les amplifications PCR semi-nichées subséquentes ont été exécutées avec un mélange de Taq et Pwo polymérases et les fragments amplifiés sont des fragments à extrémité franche ou sont un mélange de molécules avec des extrémités franches ou encore un résidu A supplémentaire à l'extrémité 3'. De tels fragments sont soit clonés dans un vecteur à extrémité

franche, le vecteur pSTBLUe-1, après conversion de tous les fragments en fragments à extrémité franche, (Perfectly Blunt Cloning Kit, Novagen) ou un résidu A est ajouté aux extrémités 3' en incubant les fragments avec la Taq polymérase en présence de dATP et en les clonant ensuite dans le vecteur pGEM-T. Après ligation, selon les instructions préconisées par le fabricant, les produits de ligation sont purifiés en utilisant une résine PCR Preps resin, commercialisée par la société Promega, et élués dans l'eau. Des aliquotes sont utilisés pour transformer les cellules de E. coli XL-2 Blue par électroporation. Les cellules transformées sont étalées sur des plaques d'agar LB contenant de l'ampicilline (100 g/ml), de l'IPTG (80 L) et de la X-gal (70 g/ml) et incubées pendant une nuit à 37 C.

9. Identification des plasmides recombinants d'HBV : le criblage initial implique la sélection des colonies blanches qui peuvent contenir l'insert d'intérêt, par opposition aux colonies bleues qui sont supposées ne pas contenir d'insert.

Si la transformation semble être particulièrement réussie, c'est à dire si on observe une quantité conséquente de colonies blanches par rapport aux colonies bleues qui constituent le contrôle négatif, les colonies blanches sont ensuite directement amplifiées dans un milieu liquide (Terrific Broth contenant 100 g/ml d'ampicilline) pendant une nuit à 37 C sous agitation. Autrement, les colonies blanches sont repiquées sur deux plaques LB agar contenant de l'ampicilline. Une des plaques comprend une membrane de nylon à la surface de l'agar. Environ 100 colonies peuvent être repiquées sur chaque plaque. Les plaques sont incubées une nuit à 37 C. La plaque sans la membrane de nylon est conservée à 4 C. La membrane de nylon est traitée avec NaOH pour lyser les bactériés, puis neutralisée et séchée. Après fixation de l'ADN par irradiation UV, la membrane est soumise à une hybridation avec des sondes spécifiques de HBV marquées au 32P. Les colonies appropriées sont ensuite reprises de la plaque principale et amplifiées en milieu liquide.

10. Purification de l'ADN du plasmide : l'ADN est purifié par mini preps en utilisant le Qtips-20, commercialisé par la société Qiagen, selon les instructions préconisées par la société. D'autres ADN sont préparés manuellement par lyse alcaline, précipitation de surnageant avec de l'isopropanol,

resuspension et traitement du culot avec du phénol puis chloroforme et précipitation avec de l'éthanol. Dans les deux cas, l'ADN est finalement resuspendu dans 30 l de TE. Les quantités d'ADN sont estimées par électrophorèse de gel d'agarose.

11. Séquençage : approximativement 350 ng de plasmide sont séquences avec 5 pmoles d'amorces, en utilisant le kit de séquençage BigDye commercialisé par la société Perkin Elmer et un appareil d'amplification (9600 thermal cycler de Perkin Elmer). Après purification des produits de séquençage par spin chromatographie sur Sephadex G50, les produits du séquençage sont analysés sur une appareil de séquençage ABI Prism 377, commercialisé par la société Applied Biosystems. Le séquençage initial est habituellement réalisé avec des amorces complémentaires aux séquences des promoteurs T7 et SP6 qui chevauchent le kit de clonage à la fois dans les vecteurs pGEM-T et pSTBLue-1.

Pour les fragments courts, de moins de 500 à 600 paires de bases, une bonne information sur les séquences des deux brins de l'insert peut habituellement être obtenue avec ces deux amorces. Pour des inserts plus longs, tels des génomes de HBV entiers, des amorces spécifiques d'HBV sont choisies dans le génome d'HBV, grossièrement à des intervalles de 500 paires de bases, dans les deux sens, afin que les deux brins puissent être complètement séquences. Plusieurs clones de chaque fragment sont séquences.

12. Analyse de séquences : la plupart des analyses informatiques ont été exécutées en utilisant des programmes disponibles sur le serveur INFOBIOGEN (Villejuif, France). Les données des séquences brutes sont corrigées en utilisant le programme de la machine de séquençage. A cette étape, seules les ambiguïtés (appelées N par la machine) et les erreurs évidentes de base à proximité des ambiguïtés sont corrigées. Une recherche par BLAST est ensuite effectuée, dans la majorité des cas, pour identifier la séquence de HBV de la base qui est la plus proche de celle du clone de l'invention. Un alignement complet, en utilisant le logiciel CLUSTAL W, de cette séquence et de la séquence du clone permet une correction supplémentaire. Seules des erreurs évidentes, telles que l'omission de bases par la machine ou l'addition de bases à l'extrémité de la séquence sont corrigées. Les séquences corrigées partiellement sur les deux brins

du clone sont assemblées et alignées. Des conflits éventuels sont résolus en choisissant la séquence la mieux supportée par les données. Finalement, les séquences corrigées des différents clones provenant du même patient sont comparées et les différences sont vérifiées de nouveau. Pour faciliter l'analyse biologique des séquences amplifiées, 81 séquences du génome complet de HBV trouvées dans les bases de données ont été alignées en utilisant CLUSTAL W. L'analyse phylogénique de cet alignement montre que les séquences de l'invention appartiennent aux 6 groupes majeurs, correspondant aux génotypes A à F, déterminés antérieurement par alignement de séquences du gène HBs.

L'addition à cet alignement de séquences dérivées de génomes d'HBV cryptiques permet d'attribuer ces génomes à un génotype particulier ou permet d'établir que les génomes de HBV cryptiques appartiennent à un génotype encore inconnu. De plus, les séquences en acides aminés des différentes protéines de HBV trouvées dans les bases de données (PréS/s, HBs, HBc, HBx, PréC/c et pol) ont été alignées. Ceci permet une comparaison des séquences en acides aminés déduites des séquences nuclélotidiques des clones de l'invention avec des séquences protéiques d'HBV déjà décrites, qui vraisemblablement sont dérivées de génomes de HBV non cryptiques. Il a été ainsi possible d'identifier des mutations dans les protéines du virus HBV ctyptique de l'invention qui sont absentes dans les isolats de HBV décrit antérieurement et qui ne sont pas dues simplement à une variation du génotype.

13. Analyse fonctionnelle : l'analyse fonctionnelle a été effectuée avec les clones dérivés des amplifications du génome complet. Les clones sont coupés avec l'enzyme de restriction Sap I. Les sites de reconnaissance et de coupure de cet enzyme sont CTCTTCNNNN. Ce site est présent dans les amorces P1 et P2 utilisées pour l'amplification du génome entier. Ceci a pour conséquence la libération d'un insert du génome entier avec des extrémités cohésives et, en raison de la redondance terminale du brin moins, une recircularisation dans un génome HBV complet sans séquences superflues. Après coupure avec l'enzyme de restriction Sap I, l'ADN est extrait avec du phénol et précipitée avec de l'éthanol. L'ADN est ensuite transfecté dans des cellules HuH7, une lignée cellulaire d'hépatocarcinome humain permissive pour la

réplication d'HBV, en utilisant le réactif de transfection FuGene-6, commercialisé par la société Roche. La recircularisation de l'insert a lieu dans les cellules et permet la transcription et la réplication virale . Le contrôle négatif est constitué par des cellules transformées avec un vecteur pGEM sans insert et les contrôles positifs sont un dimère des génomes complets d'un HBV de type sauvage cloné au niveau du site EcoRI, intact ou coupé avec l'enzyme de restriction EcoRI. La transfection est contrôlée par une co-transfection avec pSEAP, un plasmide exprimant la Phosphatase Alcaline Sécrétée Soluble, dont l'activité est mesurée dans le milieu de culture 48 heures après la transfection. Les milieux sont changés chaque jour et les milieux des jours 2 à la fin de l'expérience (normalement jour 5 ou 6) sont collectés. La présence de l'antigène HBs dans le milieu est mesurée en utilisant le kit Ausria, commercialisé par la société Abbott.

A la fin de l'expérience, les cellules sont lysées et l'ADN, l'ARN et les protéines sont extraites. Le milieu est stocké et concentré par précipitation avec du PEG.

La présence de protéines virales, d'ADN ou d'ARN est analysée dans les différentes préparation. Pour les clones sous-génomiques, les fragments sont insérés dans des vecteurs d'expression de HBV, soit dans le contexte d'un génome complet pour étudier les effets des mutations du gène HBs, du gène HBx ou du promoteur du core sur le cycle de réplication, soit dans des vecteurs d'expression pour HBs ou HBx pour étudier les propriétés des protéines mutées, en particulier pour savoir si les protéines HBs mutées sont normalement synthétisées et sécrétées et si elles sont reconnues par les tests de détection du commerce.

14. Résultats : selon les protocoles décrits ci dessus, le génome complet de HBV du patient a été amplifié par PCR et cloné. Deux amplifications par PCR ont été réalisées et des clonages indépendants ont été effectués.

L'analyse phylogénique montre que le génome est de génotype A, mais qu'il est à la frontière de la famille et qu'il pourrait représenter un nouveau sous-groupe dans le génotype A. Les éléments importants de structure et de régulation sont conservés dans les séquences nucléotidiques et il n'y a pas de modifications majeures dans les séquences en acides aminés déduites de HBx et de pol par rapport au type sauvage. Le génome est donc en compétent pour sa réplication.

Toutefois, la séquence en acides aminés et la protéine HBsAg présente des substitutions nombreuses, particulièrement dans les déterminant a, qui correspond à une partie de l'antigène exposé à la surface des particules virales et qui est reconnu par les tests sérologiques disponibles dans le commerce. Il est particulièrement intéressant de noter qu'il existe des substitutions successives aux positions 109-112 de la séquence en acides aminés de la protéine HBsAgm et d'autres substitutions isolées au niveau de HBsAgm. Les substitutions majeures sont dans HBsAgm QTTR (acides aminés 109 à 112) au lieu de LIPG trouvé au niveau de la protéine de HBsAg sauvage. Ces substitutions, entre autre, peuvent induire une altération de l'antigénicité de la protéine HBsAgm et expliquer qu'elle ne soit pas reconnu par les tests disponibles commercialement. Par ailleurs, une mutation est également retrouvée au niveau de la protéine PréSm qui consiste en un remplacement de l'acide aminé Ile trouvé en position 84 de la protéine sauvage, en référence à SEQ ID NO 4, par l'acide aminé Thr dans la protéine Pré-Sm (position 84 de SEQ ID NO 4).

Exemple 2 : Identification d'un mutant ou variant HBVm'.

Chez ce même patient de 86 ans avec un historique d'hépatite non A, non B chronique a également été identifié un autre virus HBV muté (HBVm'). Le génome de ce virus a été amplifié, cloné et séquence comme décrit dans l'exemple 1. L'analyse phylogénique montre que son génome est de génotype D.

L'analyse des séquences montre que HBVm' est un mutant pré-core avec un codon stop dans PréC/c, juste avant le gène HBc. Par ailleurs, il présente une mutation dans la partie Pré-S, juste avec le début de HBs, qui consiste dans le remplacement d'une Arg par une Gly à la position 102 de le protéine Pré-Sm' identifiée en SEQ ID NO 6 et une mutation près de la fin de HBs, également partagée avec HBsm qui consiste dans le remplacement d'une sérine par une arginine à la position 210 de SEQ ID NO 5. A des fins de simplification les séquences nucléotidiques codant pour SEQ ID NO 6 et SEQ ID NO 5 n'ont pas été introduites dans la présente description, mais les inventeurs ont réalisé un séquençage complet qui permet d'affirmer que Gly est codée par le codon GGA,

en position 304-306 de la région Pré-S ou en position 3151-3153 par rapport à la séquence du génome complet et que Arg est codée par le codon AGG, en position 628-630 du gène S ou en position 782-784 par rapport à la séquence du génome complet.

LISTE DE SEQUENCES <110> BIOMERIEUX
INSERM <120> NOUVEAU VIRUS MUTE DE L'HEPATITE B, SES CONSTITUANTS
NUCLEIQUES ET PROTEIQUES ET LEURS APPLICATIONS <130> IFB 99 INS HBVM <140> <141> <160> 6 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 681 <212> ADN <213> virus de l'hépatite B muté HBVm <220> <221> CDS <222> (1)..(678) <400> 1 atg gag aac atc aca tca gga ttc cta aga ccc ctg ctc ggg tta cag 48 Met Glu Asn Ile Thr Ser Gly Phe Leu Arg Pro Leu Leu Gly Leu Gln 1 5 10 15 gcg ggg ttt ttc ttg ttg aca aga atc ctc aca ata ccg cag agt cta 96 Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu
20 25 30 gac tcg tgg tgg act tct ctc agt ttt cta ggg gga tca ccc gtg tgt 144 Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Ser Phe Leu Gly Gly Ser Pro Val Cys
35 40 45 ctt ggc caa aat tcg cag tcc cca ace tcc aat cac tca cca ace tcc 192 Leu Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser
50 55 60 tgt cet cca act tgt cet ggt tat cgc tgg atg tgt ctg cgg cat ttt 240 Cys Pro Pro Thr Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg His Phe
65 70 75 80 atc ata ttc ctc ttc atc ctg ctg cta tgc ctc atc ttc tta ttg gtt 288 Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val
85 90 95 ctt ctg gat tat caa ggt atg ttg ccc gtt tgt cet caa act aca aga 336 Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Gln Thr Thr Arg
100 105 110 tca aca aca ace agt acg gga tca tgc aaa ace tgc acg att cet gct 384 Ser Thr Thr Thr Ser Thr Gly Ser Cys Lys Thr Cys Thr Ile Pro Ala
115 120 125 cgc ggc aaa tct atg ttt ccc tca tgt tgc tgt aca aaa cet acg gat 432 Arg Gly Lys Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Thr Asp
130 135 140 gga aat tgc ace tgt att ccc atc cca tcg tct tgg gct ttc gca age 480 Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Ser 145 150 155 160

tac cta tgg gag tgg gcc tca gtc cgt ttc tct tgg ctc agt tta cta 528 Tyr Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu
165 170 175 gtg ccc ttt gtt cag tgg ttc gta ggg ctt tcc ccc act gtt tgg ctt 576 Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu
180 185 190 tca gct ata tgg atg atg tgg tat tgg ggg cca agt ctg tac agc atc 624 Ser Ala Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Ser Ile
195 200 205 gtg agg ccc ttt ata ccg ctg tta cca att ttc ttt tgt ctc tgg gta 672 Val Arg Pro Phe Ile Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val
210 215 220 tac att taa 681 Tyr Ile 225 <210> 2 <211> 226 <212> PRT <213> virus de l'hépatite B muté HBVm <400> 2 Met Glu Asn Ile Thr Ser Gly Phe Leu Arg Pro Leu Leu Gly Leu Gln
1 5 10 15 Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu
20 25 30 Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Ser Phe Leu Gly Gly Ser Pro Val Cys
35 40 45 Leu Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser
50 55 60 Cys Pro Pro Thr Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg His Phe
65 70 75 80 Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val
85 90 95 Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Gln Thr Thr Arg
100 105 110 Ser Thr Thr Thr Ser Thr Gly Ser Cys Lys Thr Cys Thr Ile Pro Ala
115 120 125 Arg Gly Lys Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Thr Asp
130 135 140 Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Ser 145 150 155 160 Tyr Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu
165 170 175 Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu
180 185 190 Ser Ala Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Ser Ile
195 200 205

Val Arg Pro Phe Ile Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val
210 215 220 Tyr Ile 225 <210> 3 <211> 522 <212> ADN <213> virus de l'hépatite B muté HBVm <220> <221> CDS <222> (1)..(522) <400> 3 atg gga ggt tgg tca tca aaa cet cgc aaa ggc atg ggg acg aat ctt 48 Met Gly Gly Trp Ser Ser Lys Pro Arg Lys Gly Met Gly Thr Asn Leu
1 5 10 15 tct gtt ccc aac cet ctg gga ttc ttt ccc gat cat cag ttg gac cet 96 Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro
20 25 30 gca ttc gga gcc aac tca aac aat cca gat tgg gac ttc aac ccc atc 144 Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Ile
35 40 45 aag gac cac tgg cca gca gcc aac cag gta gga gtg gga gca ttc ggg 192 Lys Asp His Trp Pro Ala Ala Asn Gln Val Gly Val Gly Ala Phe Gly
50 55 60 cca ggg ttc ace cet cca cac ggc ggt gtt ttg ggg tgg agc cet cag 240 Pro Gly Phe Thr Pro Pro His Gly Gly Val Leu Gly Trp Ser Pro Gln
65 70 75 80 gct cag ggc aca ttg acc aca gtg cca aca att cet cet cet gca tcc 288 Ala Gln Gly Thr Leu Thr Thr Val Pro Thr Ile Pro Pro Pro Ala Ser
85 90 95 ace aat cgg cag tca gga agg cag ccc act ccc atc tct cca cet ctc 336 Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu
100 105 110 aga gac agt cat cet cag gcc atg cag tgg aat tcc act gcc ttc cac 384 Arg Asp Ser His Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn Ser Thr Ala Phe His
115 120 125 caa gct ctg cag gat ccc aga gtc agg ggt ctg tat ctt cet gct ggt 432 Gln Ala Leu Gln Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Leu Pro Ala Gly
130 135 140 ggc tcc agt tca gga aca gta aac cet gct ccg aat att gcc tct cac 480 Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro Ala Pro Asn Ile Ala Ser His 145 150 155 160 atc tcg tca atc tcc gcg agg act ggg gac cet gtg acg aac 522 Ile Ser Ser Ile Ser Ala Arg Thr Gly Asp Pro Val Thr Asn
165 170 <210> 4 <211> 174

<212> PRT <213> virus de l'hépatite B muté HBVm <400> 4 Met Gly Gly Trp Ser Ser Lys Pro Arg Lys Gly Met Gly Thr Asn Leu 1 5 10 15 Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro
20 25 30 Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Ile
35 40 45 Lys Asp His Trp Pro Ala Ala Asn Gln Val Gly Val Gly Ala Phe Gly
50 55 60 Pro Gly Phe Thr Pro Pro His Gly Gly Val Leu Gly Trp Ser Pro Gln
65 70 75 80 Ala Gln Gly Thr Leu Thr Thr Val Pro Thr Ile Pro Pro Pro Ala Ser
85 90 95 Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu
100 105 110 Arg Asp Ser His Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn Ser Thr Ala Phe His
115 120 125 Gln Ala Leu Gln Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Leu Pro Ala Gly
130 135 140 Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro Ala Pro Asn Ile Ala Ser His 145 150 155 160 Ile Ser Ser Ile Ser Ala Arg Thr Gly Asp Pro Val Thr Asn
165 170 <210> 5 <211> 226 <212> PRT <213> virus de l'hépatite B muté <400> 5 Met Glu Asn Ile Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln 1 5 10 15 Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu
20 25 30 Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Thr Thr Val Cys
35 40 45 Leu Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser
50 55 60 Cys Pro Pro Thr Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe
65 70 75 80 Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val
85 90 95 Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly
100 105 110

Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys Thr Thr Pro Ala
115 120 125 Gln Gly Thr Ser Met Tyr Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp
130 135 140 Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Gly Lys 145 150 155 160 Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Ala Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu
165 170 175 Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu
180 185 190 Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Asn Ile
195 200 205 Leu Arg Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val
210 215 220 Tyr Ile 225 <210> 6 <211> 389 <212> PRT <213> virus de l'hépatite B muté <400> 6 Met Gly Gln Asn Leu Ser Thr Ser Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp
1 10 15 His Gln Leu Asp Pro Ala Phe Arg Ala Asn Thr Ala Asn Pro Asp Trp
20 25 30 Asp Phe Asn Pro Asn Lys Asp Thr Trp Pro Asp Ala Asn Lys Val Gly
35 40 45 Ala Gly Ala Phe Gly Leu Gly Phe Thr Pro Pro His Gly Gly Leu Leu
50 55 60 Gly Trp Ser Pro Gln Ala Gln Gly Ile Leu Gln Thr Leu Pro Ala Asn
65 70 75 80 Pro Pro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro
85 90 95 Leu Ser Pro Pro Leu Gly Asn Thr His Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn
100 105 110 Ser Thr Thr Phe His Gln Thr Leu Gln Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu
115 120 125 Tyr Leu Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro Val Pro
130 135 140 Thr Thr Val Ser His Ile Ser Ser Ile Phe Ser Arg Ile Gly Asp Pro 145 150 155 160 Ala Leu Asn Met Glu Asn Ile Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu
165 170 175

Val Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro
180 185 190 Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Thr
195 200 205 Thr Val Cys Leu Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser
210 215 220 Pro Thr Ser Cys Pro Pro Thr Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu 225 230 235 240 Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe
245 250 255 Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu
260 265 270 Ile Pro Gly Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys Thr
275 280 285 Thr Pro Ala Gln Gly Thr Ser Met Tyr Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys
290 295 300 Pro Ser Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala 305 310 315 320 Phe Gly Lys Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Ala Arg Phe Ser Trp Leu
325 330 335 Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr
340 345 350 Val Trp Leu Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu
355 360 365 Tyr Asn Ile Leu Arg Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys
370 375 380 Leu Trp Val Tyr Ile 385

Claims

REVENDICATIONS

1. Virus HBVm isolé présentant les caractéristiques suivantes : (i) un génome à ADN circulaire partiellement double brin, (ii) ledit génome comprenant les gènes Pré-S, S, C, P et X, (iii) le gène Pré-S codant pour des antigènes de surface, le gène S codant pour une protéine d'enveloppe HBsAg, le gène C codant pour une protéine HBeAg et une protéine HBcAg, le gène P codant pour une enzyme ADN polymérase/transcriptase inverse et le gène X codant pour une protéine HBxAg, caractérisé en ce que le gène S comprend une séquence nucléotidique ADN référencée SEQ ID NO 1 et en ce que le gène Pré-S comprend une séquence nucléotidique ADN référencée SEQ ID NO 3.

2. Molécule d'ADN, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence nucléotidique ADN choisie parmi SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 3, leurs fragments et leurs séquences complémentaires.

3. Molécule d'ARN, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence nucléotidique ARN qui est le produit de transcription d'une séquence nucléotidique ADN choisie parmi SEQ ID N01, SEQ ID NO 3, leurs fragments et leurs séquences complémentaires.

4. Protéine de surface modifiée, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence peptidique choisie parmi SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 4 et leurs fragments.

5. Protéine de surface modifiée, caractérisée en ce qu'elle consiste en une séquence peptidique choisie parmi SEQ ID NO 2 et SEQ ID NO 4.

6. Fragment nucléotidique d'ADN ou d'ARN, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique ADN ou ARN d'au moins 12 nucléotides,

de préférence d'au moins 15 ou 18 nucléotides et avantageusement d'au moins 21 nucléotides qui comprend les nucléotides 325 à 336 de SEQ ID NO 1 et/ou les nucléotides 235 à 237 de SEQ ID NO 1 et/ou les nucléotides 391 à 393 de SEQ ID NO 1 et/ou les nucléotides 478 à 480 de SEQ ID NO 1 et/ou les nucléotides 28 à 30 de SEQ ID NO 1 et/ou les nucléotides 39 à 41 de SEQ ID NO 1 et/ou les nucléotides 385 à 387 de SEQ ID NO 1 et/ou les nucléotides 118 à 120 de SEQ ID NO 1 et/ou les nucléotides 628 à 630 de SEQ ID NO 1 et/ou les nucléotides 249 à 251 de SEQ ID NO 3, ou est le produit de transcription desdites séquences nucléotidiques ADN.

7. Fragment nucléotidique d'ADN ou d'ARN, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique qui comprend les séquences nucléotiques d'ADN SEQ ID NO 1 et SEQ ID NO 3 ou les séquences complémentaires desdites séquences SEQ ID NO 1 et SEQ ID NO 3 ou les séquences nucléotidiques d'ARN qui sont les produits de transcription de séquences SEQ ID NO 1 et SEQ ID NO 3.

8. Fragment nucléotidique d'ADN ou d'ARN, caractérisé en ce qu'il consiste en une séquence nucléotidique d'ADN qui correspond à SEQ ID NO 1 et SEQ ID NO 3 ou les séquences complémentaires desdites séquences SEQ ID NO 1 et SEQ ID NO 3 ou en ce qu'il consiste en une séquence nucléotidique d'ARN qui correspond aux produits de transcription de séquences SEQ ID NO 1 et SEQ ID NO 3.

9. Fragment protéique, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence peptidique d'au moins 4 acides aminés, de préférence d'au moins 5 ou 6 acides aminés et avantageusement d'au moins 7 acides aminés, en particulier de 6 à 15 acides aminés et avantageusement de 6 à 10 ou de 8 à 12 acides aminés et qui comprend les acides aminés 109-112 et/ou 79 et/ou 131 et/ou 160 et/ou 10 et/ou 14 et/ou 129 et/ou 40 et/ou 210 de SEQ ID NO 2 et/ou l'acide aminé 84 de SEQ ID NO 4.

10. Fragment protéique selon la revendication 9, caractérisé en ce qui) comprend une séquence peptidique qui comprend les séquences peptidiques SEQ ID NO 2 et SEQ ID NO 4.

11. Fragment selon la revendication 9, caractérisé en ce qui) consiste en une séquence peptidique choisie parmi SEQ ID NO 2 et SEQ ID NO 4.

12. Fragment protéique selon la revendication 9, caractérisé en ce qui) consiste en SEQ ID NO 2 et SEQ ID NO 4.

13. Cassette d'expression fonctionnelle dans une cellule issue d'un organisme procaryote ou eucaryote permettant l'expression d'un fragment d'ADN tel que défini dans les revendications 7 ou 8, placé sous le contrôle des éléments nécessaires à son expression.

14. Cassette d'expression selon la revendication 13, caractérisée en ce qu'elle est fonctionnelle dans une cellule issue d'un organisme eucaryote ou eucaryote inférieur.

15. Cassette d'expression selon la revendication 14, caractérisée en ce que la cellule issue d'un organisme eucaryote est sélectionnée parmi les cellules COS et CHO et en ce que la cellule issue d'un organisme eucaryote inférieur est sélectionnée parmi les cellules de Saccharomyces cerevisiae et de Pichia pastoris.

16. Vecteur comprenant une cassette d'expression selon l'une des revendications 13 à 15.

17. Cellule issue d'un organisme procaryote ou eucaryote, de préférence un organisme eucaryote ou eucaryote inférieur et avantageusement une cellule COS ou CHO ou une cellule issue de Saccharomyces cerevisiae ou de

Pichia pastoris comprenant une cassette d'expression selon l'une des revendications 13 à 15 ou un vecteur selon la revendication 16.

18. Protéine de surface produite par une cassette d'expression selon l'une des revendications 13 à 15, un vecteur selon la revendication 16 ou une cellule selon la revendication 17.

19. Procédé pour préparer une protéine de surface modifiée selon les revendications 4 ou 5 ou un fragment protéique selon les revendications 9 à 12 qui consiste à cultiver une cellule hôte selon la revendication 17 dans un milieu de culture approprié, ladite cellule hôte étant transformée avec un vecteur d'expression qui contient une séquence nucléotidique d'ADN telle que définie dans la revendication 2 ou un fragment nucléotidique tel que défini dans les revendications 6 à 8 et, à purifier ladite protéine de surface modifiée produite jusqu'à un degré de pureté requis.

20. Peptide immunogène, caractérisé en ce qu'il présente une séquence peptidique telle que définie dans les revendications 4,5, 9 à 12 ou en ce qui) consiste en une protéine telle que définie dans les revendications 18 et 19.

21. Anticorps monoclonal ou polyclonal, caractérisé en ce qu'il est obtenu par immunisation d'un animal mammifère avec un peptide immunogène tel que défini dans la revendication 20.

22. Composition diagnostique, caractérisée en ce qu'elle comprend, entre autre, une protéine ou un fragment protéique tel que défini dans les revendications 4,5, 9 à 12, 18 et 19.

23. Procédé pour détecter des anticorps dirigés contre au moins une protéine de surface mutée qui consiste en SEQ ID NO 2 et/ou SEQ ID NO 4 dans un échantillon biologique, selon lequel on met en contact l'échantillon biologique

avec une composition diagnostique telle que définie dans la revendication 22 dans des conditions prédéterminées qui permettent la formation de complexes anticorps/antigène et on détecte la formation desdits complexes.

24. Composition diagnostique, caractérisée en ce qu'elle comprend, entre autre, un anticorps monoclonal ou un anticorps polyclonal tel que défini dans la revendication 21.

25. Procédé pour détecter au moins une protéine de surface mutée qui consiste en SEQ ID NO 2 et/ou SEQ ID NO 4 dans un échantillon biologique, selon lequel on met en contact l'échantillon biologique avec une composition diagnostique telle que définie dans la revendication 24 dans des conditions prédéterminées qui permettent la formation de complexes anticorps/antigène et on détecte la formation desdits complexes.

26. Matériel biologique pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement des êtres humains infectés par au moins le virus HBVm, ladite composition comprenant : (i) soit au moins une protéine naturelle et/ou une protéine recombinante et/ou un polypeptide de synthèse ou leurs fragments dont la séquence correspond à tout ou partie de la séquence identifiée en SEQ ID NO 2 et/ou de la séquence identifiée en SEQ ID NO 4, éventuellement associée à au moins une protéine naturelle et/ou une protéine recombinante et/ou un polypeptide de synthèse ou leurs fragments dont la séquence correspond à tout ou partie de la séquence identifiée en SEQ ID NO 5 et/ou de la séquence identifiée en SEQ ID NO 6 et/ou à au moins une protéine naturelle et/ou une protéine recombinante et/ou un polypeptide de synthèse ou leurs fragments d'un antigène HBs de type sauvage et/ou d'une protéine Pré-S de type sauvage ; soit (ii) au moins un anticorps monoclonal ou polyclonal ou un fragment desdits anticorps, spécifique d'au moins une des protéines référencées SEQ ID NO 2 et 4 ou de leurs fragments, éventuellement associé avec au moins un anticorps monoclonal ou polyclonal ou un fragment desdits anticorps spécifique

d'au moins une protéines référencées SEQ ID NO 5 et SEQ ID NO 6 et/ou avec au moins un anticorps monoclonal ou polyclonal ou un fragment desdits anticorps spécifique d'au moins une protéine HBs ou Pré-S de type sauvage.

27. Composition immunogène ou vaccinale, caractérisée en ce qu'elle comprend une protéine ou un fragment protéique tel que défini dans les revendications 4,5, 9 à 12,18 et 19, éventuellement associé à un véhicule et/ou adjuvant et/ou diluant approprié et à un excipient pharmaceutiquement acceptable.

28. Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend un matériel biologique tel que défini dans la revendication 26, éventuellement associé à un véhicule et/ou adjuvant et/ou diluant approprié et à un excipient pharmaceutiquement acceptable.

29. Sonde, caractérisée en ce qu'elle est susceptible de s'hybrider dans des conditions de stringence déterminées à une séquence nucléotidique d'ADN ou d'ARN telle que définie dans les revendications 2 et 3 ou à un fragment nucléotidique tel que défini dans les revendications 6 à 8.

30. Amorce, caractérisée en ce qu'elle est susceptible de s'hybrider dans des conditions de stringence déterminées à une séquence nucléotidique d'ADN ou d'ARN telle que définie dans les revendications 2 et 3 ou à un fragment nucléotidique tel que défini dans les revendications 6 à 8.

31. Anticorps anti-acide nucléique, caractérisé en ce qu'il est susceptible de se lier à une séquence nucléotidique d'ADN ou d'ARN telle que définie dans les revendications 2 et 3 ou à un fragment nucléotidique tel que défini dans les revendications 6 à 8.

32. Composition diagnostique, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une sonde ou une amorce ou un anticorps anti-acide nucléique tel(le) que défini (e) dans les revendications 29,30 et 31.

33. Procédé de diagnostic d'ADN et/ou d'ARN viral, selon lequel on prélève un échantillon de sérum ou de plasma d'un patient, on traite si nécessaire ledit échantillon pour en extraite l'ADN et/ou l'ARN, on met en contact ledit échantillon avec au moins une sonde ou une amorce telle que définie dans les revendications 29 et 30, dans des conditions de stringence déterminées et on détecte la présence d'ADN et/ou d'ARN viral dans l'échantillon soit par mise en évidence d'une hybridation dudit ADN et/ou ARN viral avec au moins une sonde, soit par amplification dudit ADN et/ou ARN.

34. Procédé de diagnostic d'ADN et/ou d'ARN viral, selon lequel on prélève un échantillon de sérum ou de plasma d'un patient, on traite si nécessaire ledit échantillon pour en extraite l'ADN et/ou l'ARN, on met en contact ledit échantillon avec au moins un anticorps anti-acide nucléique tel que défini dans la revendication 31, ledit anticorps étant éventuellemnt marqué par tout marqueur approprié et on met en évidence la formation d'un complexe acide nucléique/anticorps.

35. Composition vaccinale comprenant une séquence d'ADN codant pour au moins une protéine de surface mutée du virus HBVm (HBsAgm) ou ses fragments, ladite protéine HBsAgm comprenant un déterminant a modifié d'une protéine HBs représenté en SEQ ID NO 2, ledit ADN étant mélangé avec un véhicule ou un diluant approprié.

36. Composition selon la revendication 35, caractérisée en ce qu'elle comprend de plus une séquence d'ADN codant pour au moins une protéine de surface mutée représentée en SEQ ID NO 4 ou ses fragments et/ou une séquence d'ADN codant pour au moins une protéine de surface ou ses fragments représentée en SEQ ID NO 5 et/ou SEQ ID NO 6 et/ou une séquence d'ADN

codant pour au moins un antigène HBs de type sauvage et/ou une région Pré-S de type sauvage.

37. Oligonucléotide anti-sens ou anti-gène, caractérisé en ce qu'il est capable d'interférer spécifiquement avec la synthèse d'au moins une protéine choisie parmi les protéines identifiées en SEQ ID NO 2 et/ou SEQ ID NO 4 et/ou SEQ ID NO 5 et/ou SEQ ID NO 6.

38. Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend, entre autre, au moins un oligonucléotide anti-sens ou un oligonucléotide anti-gène tel que défini dans la revendication 37.

39. Vecteur, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un gène d'intérêt thérapeutique ou vaccinal, ledit gène codant notamment - (i) soit au moins pour une protéine ou un fragment de protéine choisie parmi les protéines identifiées en SEQ ID NO 2 et/ou SEQ ID NO 4 et/ou SEQ ID NO 5 et/ou SEQ ID NO 6 ; - (ii) soit au moins pour tout ou partie d'un anticorps polyclonal ou monoclonal capable de se fixer à au moins une des protéines définies en (i) ou à ses fragments ; - (iii) soit au moins pour une molécule inhibitrice d'au moins une des protéines définies en (i) ; - (iv) soit au moins pour un ligand ou toute partie d'un ligand capable de se fixer à au moins une protéine des protéines définies en (i) ou à un fragment desdites protéines et/ou d'inhiber sa fonction.

40. Composition thérapeutique ou vaccinale, caractérisée en ce qu'elle comprend, entre autre, un vecteur tel que défini dans la revendication 39 et en ce que ledit gène d'intérêt est placé sous la dépendance d'éléments assurant son expression in vivo.

41. Matériel biologique pour la préparation d'une composition pharmaceutique ou vaccinale, comprenant au moins une cellule, notamment une cellule ne produisant pas naturellement des anticorps, sous une forme permettant son administration dans un organisme mammifère, humain ou animal, ainsi qu'éventuellement sa culture préalable, ladite cellule étant génétiquement modifiée in vitro par au moins une séquence d'acide nucléique contenant au moins un gène codant in vivo pour au moins une protéine ou un fragment d'une protéine choisie parmi les protéines identifiées en SEQ ID NO 2 et/ou SEQ ID NO 4 et/ou SEQ ID NO 5 et/ou SEQ ID NO 6 ou codant pour au moins une molécule inhibitrice de la fonction et/ou de la fixation et/ou de l'expression d'au moins une protéine ou d'un fragment de protéine choisie parmi les protéines identifiées en SEQ ID NO 2 et/ou SEQ ID NO 4 et/ou SEQ ID NO 5 et/ou SEQ ID NO 6 ou codant pour au moins un anticorps ou un fragment d'anticorps capable de se lier à au moins une protéine ou un fragment de protéines choisie parmi les protéines identifiées en SEQ ID NO 2 et/ou SEQ ID NO 4 et/ou SEQ ID NO 5 et/ou SEQ ID NO 6.

42. Cellule génétiquement modifiée, en particulier choisie parmi les cellules d'eucaryotes, telles que les cellules COS et CHO et les cellules d'eucaryotes inférieurs, telles que les cellules de levure, en particulier les cellules issues de Saccaromyces cerevisiae et de Pichia pastoris, transformées par au moins une séquence nucléotidique ou un fragment nucléotidique tel que défini dans les revendications 2,3 et 6 à 8 ou par un vecteur tel que défini dans la revendication 39.

43. Composition pharmaceutique ou vaccinale, caractérisée en ce qu'elle comprend, entre autre, une cellule telle que définie dans les revendication 41 et 42.

44. Procédé d'évaluation d'un agent thérapeutique selon lequel on administre à un animal des doses déterminées, en une dose ou en des doses répétées et à des intervalles de temps déterminés, au moins une des protéines

naturelles, recombinantes ou de synthèse ou leurs fragments, ou encore obtenues à partir de plasma ou de sérum, lesdites protéines étant identifiée en SEQ ID NO 2 et/ou SEQ ID NO 4, de préférence SEQ ID NO 2 et SEQ ID NO 4 et éventuellement au moins une des protéines naturelles, recombinantes ou de synthèse ou leurs fragments, ou encore obtenues à partir de plasma ou de sérum, lesdites protéines étant identifiée en SEQ ID NO 5 et/ou SEQ ID NO 6, de préférence SEQ ID NO 5 et SEQ ID NO 6 et/ou au moins une des protéines naturelles, recombinantes ou de synthèse ou leurs fragments, ou encore obtenues à partir de plasma ou de sérum correspondant à un antigène HBs de type sauvage et/ou à la protéine Pré-S de type sauvage, de préférence l'antigène HBs de type sauvage et la protéine Pré-S de type sauvage, on prélève un échantillon biologique de l'animal, de préférence du sang ou du sérum et on réalise : - (i) un dosage d'anticorps spécifique (s) dela ou desdites protéine(s) ; et/ou - (ii) un dosage de la réponse immune cellulaire induite contre la ou lesdites protéine (s) ou leurs fragments, par exemple par un test d'activation in vitro de celules lymphocytes T helper spécifique (s) dela ou desdites protéine(s).