FR2799839A1

FR2799839A1 - Determining antioxidant capacity of compounds, useful for assessing them for e.g. pharmaceutical application, based on inhibition of covalent reaction mediated by reactive oxygen species

Info

Publication number: FR2799839A1
Application number: FR0001299A
Authority: FR
Inventors: Fournier Laure Buscarlet; Philippe Pradelles; Frederic Taran; Herve Volland
Original assignee: Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Current assignee: Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Priority date: 2000-02-02
Filing date: 2000-02-02
Publication date: 2001-04-20

Abstract

Determining the antioxidant capacity of a compound (I), by measuring ability of (I) to inhibit a reaction that involves binding of a substance (A) to a solid phase, and requires reactive oxygen species (ROS), is new. Independent claims are also included for the following: (1) immobilizing (A) to a solid phase that carries a molecule (B) with specific affinity for (A), using ROS to form a covalent bond between (A) and (B); and (2) immunometric process in which the method of (1) is used to form a covalent bond between an analyte and a specific antibody, immobilized on a solid phase.

Description

PROCEDE POUR DETERMINER LA CAPACITE ANTIOXYDANTE DE COMPOSES CHIMIQUES ET PROCEDES DE DOSAGE ET D'IMMOBILISATION UTILISABLES POUR CETTE DETERMINATON. DESCRIPTION Domaine technique La présente invention a pour objet un procédé pour déterminer la capacité antioxydante de divers composés chimiques, notamment vis-à-vis des Ladicaux HO'. METHOD FOR DETERMINING THE ANTIOXIDANT CAPACITY OF CHEMICAL COMPOUNDS AND DETERMINATION AND FIXED EQUIPMENT THAT CAN BE USED FOR THIS DETERMINATION. DESCRIPTION Technical Field The present invention relates to a method for determining the antioxidant capacity of various chemical compounds, in particular with respect to Ladicals HO '.

Elle s'applique en particulier aux domaines de l'industrie pharmaceutique, de l'agro-alimentaire et de la cosmétologie, dans lesquels des composés antioxydants présentent un grand intérêt. It applies in particular to the fields of the pharmaceutical industry, the food industry and cosmetology, in which antioxidant compounds are of great interest.

Depuis de nombreuses années, on sait que les radicaux libres sont des espèces réactives à l'origine de plusieurs processus physiologiques normaux et pathologiques. For many years, it has been known that free radicals are reactive species at the origin of several normal physiological and pathological processes.

Les radicaux libres, ou espèces radicalaires, générés dans les processus biologiques peuvent appartenir à la famille des espèces actives de l'oxygène (EAO), qui comprend le peroxyde d'hydrogène et des radicaux libres comme les radicaux peroxyles R00*, le radical hydroxyle H0" et le radical superoxyde OZ*-. Ces radicaux libres, en particulier les EAO, sont impliqués à la fois dans les procédés de vieillissement, dans les maladies neurodégénératives et dans le cancer. Aussi, l'un des moyens pour lutter contre les effets délétères de ces radicaux libres sur l'organisme vivant est de les détruire in vivo par des molécules capables de réagir chimiquement avec eux, qui sont des composés antioxydants. Free radicals, or radical species, generated in biological processes can belong to the family of active oxygen species (EAO), which includes hydrogen peroxide and free radicals such as peroxyl radicals R00 *, the hydroxyl radical H0 "and the superoxide radical OZ * -. These free radicals, in particular the EAOs, are involved both in aging processes, in neurodegenerative diseases and in cancer. Also, one of the means to fight against deleterious effects of these free radicals on the living organism is to destroy them in vivo by molecules capable of reacting chemically with them, which are antioxidant compounds.

Il est donc nécessaire de tester in vitro la capacité antioxydante de divers composés pour vérifier s'ils sont intéressants ou non comme composés antioxydants pour les industries pharmaceutiques, agro- alimentaires et cosmétiques. On peut évaluer ce pouvoir antioxydant par différents tests qui sont soit spécifiques d'une espèce oxydante, soit asnécif iqües . It is therefore necessary to test in vitro the antioxidant capacity of various compounds to verify whether or not they are of interest as antioxidant compounds for the pharmaceutical, agro-food and cosmetic industries. This antioxidant power can be evaluated by various tests which are either specific to an oxidizing species, or asnecif ic.

Dans la présente invention, on s'intéresse aux tests spécifiques des EAO et en particulier du radical hydroxyle H0* car cette espèce radicalaire est la plus réactive (k = 109 à 101 L. mol-ls-1) . État de la technique antérieure on connaît plusieurs procédés pour tester la capacité antioxydante de composés vis-à-vis des radicaux hydroxyles. De tels procédés déterminent la quantité de radicaux hydroxyles en présence et en l'absence du composé à tester. Ces procédés sont basés soit sur la détection de radicaux secondaires engendrés par les radicaux hydroxyles, soit sur la détection de molécules engendrées par ces radicaux hydroxyles. In the present invention, we are interested in the specific tests of EAOs and in particular of the hydroxyl radical H0 * because this radical species is the most reactive (k = 109 to 101 L. mol-ls-1). State of the prior art, several methods are known for testing the antioxidant capacity of compounds vis-à-vis hydroxyl radicals. Such methods determine the amount of hydroxyl radicals in the presence and in the absence of the compound to be tested. These methods are based either on the detection of secondary radicals generated by hydroxyl radicals, or on the detection of molecules generated by these hydroxyl radicals.

Le document : Archives of Biochemistry and Biophysics, 15 septembre 1996, volume 333, n 2, pages 377-384 [1], décrit un procédé de détermination de la capacité antioxydante de composés vis-à-vis des radicaux hydroxyles, qui consiste à générer des radicaux hydroxyles soit par la réaction d'un complexe de Cu (II) avec du peroxyde d'hydrogène H202, soit par photolyse au moyen de rayons ultraviolets (UV) de H202, en présence ou non des composés à tester, et à déterminer ensuite la quantité de radicaux hydroxyles présents par différentes méthodes. Les méthodes utilisées sont la résonance paramagnétique électronique (RPE), la détection d'une substance réactive avec l'acide thiobarbiturique (TBARS) obtenue par décomposition du désoxyribose par des radicaux hydroxyles, et :une nithode faisant appel à la sciswir:n de brins d'ADN. La méthode utilisant la résonance paramagnétique électronique nécessite l'utilisation d'appareillages coûteux et cette technique sophistiquée est inadaptée à la mesure de séries de composés. La méthode basée sur la scission des brins d'ADN nécessite l'utilisation d'appareils d'électrophorèse sur gel d'agarose et rend difficile la comparaison entre les composés testés. La méthode basée sur la décomposition du désoxyribose ne peut être utilisée pour certaines mesures d'antioxydants. The document: Archives of Biochemistry and Biophysics, September 15, 1996, volume 333, n 2, pages 377-384 [1], describes a method for determining the antioxidant capacity of compounds with respect to hydroxyl radicals, which consists of generate hydroxyl radicals either by the reaction of a Cu (II) complex with hydrogen peroxide H202, or by photolysis by means of ultraviolet (UV) rays of H202, in the presence or absence of the compounds to be tested, and in then determine the amount of hydroxyl radicals present by various methods. The methods used are electronic paramagnetic resonance (EPR), the detection of a substance reactive with thiobarbituric acid (TBARS) obtained by decomposition of deoxyribose by hydroxyl radicals, and: a nithode using the sciswir: n of strands DNA. The method using electronic paramagnetic resonance requires the use of expensive equipment and this sophisticated technique is unsuitable for measuring series of compounds. The method based on the splitting of DNA strands requires the use of agarose gel electrophoresis apparatus and makes the comparison between the compounds tested difficult. The method based on the decomposition of deoxyribose cannot be used for certain measurements of antioxidants.

D'autres procédés de détermination de la capacité antioxydante de fluides faisant intervenir le piégeage de radicaux libres tels que les radicaux peroxyles sont décrits dans Methods in Enzymology, vol 234, pp. 279-293, 1994 [2]. Exposé de l'invention La présente invention a pour objet un procédé pour déterminer la capacité antioxydante d'un composé chimique, qui est facile à mettre en #uvre, ne nécessite pas un appareillage coûteux et peut être utilisé pour de nombreux composés antioxydants. Other methods of determining the antioxidant capacity of fluids involving the scavenging of free radicals such as peroxyl radicals are described in Methods in Enzymology, vol 234, pp. 279-293, 1994 [2]. Disclosure of the Invention The present invention relates to a method for determining the antioxidant capacity of a chemical compound, which is easy to process, does not require expensive equipment and can be used for many antioxidant compounds.

Selon l'invention, le procédé pour déterminer la capacité antioxydante d'un composé consiste à mesurer le taux d'inhibition engendré par ce composé sur une réaction chimique de fixation d'une substance sur une phase utilisant des espèces actives de l'oxygène, en particulier des radicaux hydroxyles HO*, pour cette réaction de fixation. According to the invention, the method for determining the antioxidant capacity of a compound consists in measuring the rate of inhibition generated by this compound on a chemical reaction of binding of a substance on a phase using active oxygen species, in particular HO * hydroxyl radicals, for this fixing reaction.

Ainsi, le procédé de l'invention comprend les trois opérations suivantes 1) production des espèces actives de l'oxygène (EAO) telles que des radicaux hydroxyles, 2) utilisation des EAO, par exemple des radicaux hydroxyles, pour effectuer la fixation d'une substance sur une phase solide, et 3) détermination de l'effet d'un composé antioxydant sur la réaction de fixation, c'est- à-dire du taux d'inhibition de cette réaction. Thus, the process of the invention comprises the following three operations 1) production of active oxygen species (EAO) such as hydroxyl radicals, 2) use of EAO, for example hydroxyl radicals, to effect the attachment of a substance on a solid phase, and 3) determining the effect of an antioxidant compound on the binding reaction, i.e. the rate of inhibition of this reaction.

Pour la production des radicaux hydroxyles 1), on peut utiliser différentes techniques telles que l'irradiation gamma, l'irradiation ultraviolette en présence ou non de peroxyde d'hydrogène, et d'autres réactions chimiques de formation de radicaux HO*. For the production of hydroxyl radicals 1), different techniques can be used such as gamma irradiation, ultraviolet irradiation in the presence or absence of hydrogen peroxide, and other chemical reactions of formation of HO * radicals.

De préférence, selon l'invention, les radiaux hydroxyles sont produits par une réaction de type Fenton. Cette réaction correspond â l'oxydation de métaux M tels que le fer, le cuivre, le nickel, le chrome et le titane, par le peroxyde d'hydrogène, selon le schéma réactionnel suivant

Preferably, according to the invention, the hydroxyl radials are produced by a reaction of the Fenton type. This reaction corresponds to the oxidation of metals M such as iron, copper, nickel, chromium and titanium, by hydrogen peroxide, according to the following reaction scheme

Mn+ <SEP> + <SEP> H202 <SEP> --->M <SEP> (n <SEP> + <SEP> 1) <SEP> + <SEP> + <SEP> HO <SEP> + <SEP> HO". Pour mettre en oeuvre cette réaction, on utilise des sels ou complexes de métaux tels que Fe2+, Fe3+, Cu2+, Ni2+, Cr2+ , Ti3+ ou d'autres ions de métaux de transition, et du peroxyde d'hydrogène éventuellement stabilisé par l'urée. Mn + <SEP> + <SEP> H202 <SEP> ---> M <SEP> (n <SEP> + <SEP> 1) <SEP> + <SEP> + <SEP> HO <SEP> + <SEP> HO ". To carry out this reaction, use is made of salts or complexes of metals such as Fe2 +, Fe3 +, Cu2 +, Ni2 +, Cr2 +, Ti3 + or other ions of transition metals, and hydrogen peroxide optionally stabilized by urea.

La réaction peut être effectuée en solution Salitlc üyant de préférence un pH de 5 àil. The reaction can be carried out in Salitlc solution preferably having a pH of 5 to 11.

A titre d'exemple de solutions salines susceptibles d'être utilisées, on peut citer les tampons phosphate, carbonate et borate. Les sels de métaux utilisés peuvent être les sulfates, chlorures et acétates. By way of example of saline solutions which may be used, mention may be made of phosphate, carbonate and borate buffers. The metal salts used can be sulfates, chlorides and acetates.

Pour réaliser cette réaction, on préfère en particulier le sulfate de cuivre et l'eau oxygénée, de préférence stabilisée par l'urée, en présence de tampon carbonate 0,1 M, pH 9. To carry out this reaction, copper sulphate and hydrogen peroxide, preferably stabilized with urea, in the presence of 0.1 M carbonate buffer, pH 9, are particularly preferred.

Pour l'opération 2), on choisit une substance et une phase solide capables d'être fixées l'une sur l'autre sous l'action des radicaux hydroxyles. For operation 2), a substance and a solid phase capable of being attached to one another under the action of hydroxyl radicals are chosen.

Selon l'invention, cette substance peut être en particulier un antigène ou un haptène, et la phase solide peut être une phase solide comprenant un anticorps spécifique de cette substance. According to the invention, this substance can in particular be an antigen or a hapten, and the solid phase can be a solid phase comprising an antibody specific for this substance.

On pourrait aussi utiliser comme substance et phase solide d'autres couples du même type, tels que les couples récepteurs-ligands, acides nucléiques- acides nucléiques et acides nucléiques-protéines. Other pairs of the same type, such as the receptor-ligands, nucleic acids-nucleic acids and nucleic acids-proteins pairs, could also be used as substance and solid phase.

Dans tous les cas, la réaction de fixation par les radicaux hydroxyles équivaut à la formation d'une liaison covalente entre les deux éléments du couple. In all cases, the reaction of attachment by hydroxyl radicals is equivalent to the formation of a covalent bond between the two elements of the couple.

En effet, on a constaté que des liaisons covalentes étaient susceptibles de se former par irradiation UV entre un antigène (ou haptène) et un anticorps spécifique comme il est décrit dans Analytical Chemistry [3] T 1Ü suite de ces travaux, on a pensé que les radicaux libres mis en #uvre dans la formation de ces liaisons étaient sans doute des radicaux hydroxyles, ce qui semble être confirmé en réalisant cette réaction de fixation par irradiation U.V. en présence de peroxyde d'hydrogène, procédure qui permet de générer plus proprement des radicaux hydroxyles. Nous avons ainsi pu constater que la cinétique de formation de ces liaisons était améliorée en présence de peroxyde d'hydrogène, ce qui semble confirmer la mise en jeu de radicaux hydroxyles dans ce processus de fixation et nous a amené à les produire par une réaction de type Fenton. Indeed, it was found that covalent bonds were capable of forming by UV irradiation between an antigen (or hapten) and a specific antibody as described in Analytical Chemistry [3] T 1Ü following this work, it was thought that the free radicals involved in the formation of these bonds were undoubtedly hydroxyl radicals, which seems to be confirmed by carrying out this binding reaction by UV irradiation in the presence of hydrogen peroxide, a procedure which makes it possible to generate more cleanly hydroxyl radicals. We were thus able to observe that the kinetics of formation of these bonds were improved in the presence of hydrogen peroxide, which seems to confirm the involvement of hydroxyl radicals in this fixing process and led us to produce them by a reaction of Fenton type.

Aussi, selon un mode de réalisation préféré de l'invention, la substance est un antigène ou un haptène, la phase solide comprend un anticorps spécifique de cette substance, et la réaction chimique de fixation consiste en la formation d'une liaison covalente entre la substance et l'anticorps sous l'action des radicaux hydroxyles. Pour l'opération 3) de détermination de l'effet du composé à tester sur la réaction de fixation, il convient de pouvoir mesurer un paramètre directement lié à cette réaction. Also, according to a preferred embodiment of the invention, the substance is an antigen or a hapten, the solid phase comprises an antibody specific for this substance, and the chemical binding reaction consists of the formation of a covalent bond between the substance. substance and antibody under the action of hydroxyl radicals. For operation 3) of determining the effect of the compound to be tested on the binding reaction, it is appropriate to be able to measure a parameter directly linked to this reaction.

Ce paramètre peut être le taux de substance fixée sur la phase solide. Dans le cas où la substance est un antigène ou un haptène, ce taux de substance peut être mesuré en mettant en #uvre un dosage immunométrique, en présence et en l'absence du composé à tester. This parameter can be the level of substance fixed on the solid phase. In the case where the substance is an antigen or a hapten, this level of substance can be measured by carrying out an immunometric assay, in the presence and in the absence of the compound to be tested.

Aussi, dans le mode de réalisation préféré du procédé de l'invention, on détermine le taux d'inhibition engendré par le composé à tester sur la réaction de fixation de la substance sur l'anticorps, en effectuant des dosages immunométriques de la substance (antigène ou haptène), en présence et en l'absence du composé. Ce dosage immunométrique comprend les étapes successives suivantes . Also, in the preferred embodiment of the method of the invention, the level of inhibition generated by the test compound on the reaction of binding of the substance to the antibody is determined by performing immunometric assays of the substance ( antigen or hapten), in the presence and absence of the compound. This immunometric assay comprises the following successive steps.

a) mettre en contact la substance avec une phase solide sur laquelle est fixé l'anticorps spécifique de cette substance, dit premier anticorps, pour lier immunologiquement la substance au premier anticorps, b) immobiliser la substance sur la phase solide par formation d'une liaison covalente entre la substance et le premier anticorps au moyen de radicaux H0* produits par une réaction de type Fenton, c) dénaturer la liaison immunologique entre la substance et le premier anticorps pour rendre accessible un épitope de cette substance en vue d'une nouvelle réaction immunologique, d) mettre en contact la phase solide ainsi traitée avec un anticorps marqué, dit second anticorps, spécifique de la substance, e) déterminer la quantité du second anticorps marqué fixé sur la phase solide, et f) effectuer à nouveau les étapes a) à e) ci-dessus en utilisant la même quantité de substance dans l'étape a) et en ajoutant dans l'étape b) le composé dont la capacité antioxydante est à déterminer, afin d' évaluer le taux d'inhibition du composé sur la réaction d'immobilisation de la substance. a) bringing the substance into contact with a solid phase on which is fixed the specific antibody of this substance, called the first antibody, to immunologically bind the substance to the first antibody, b) immobilize the substance on the solid phase by forming a covalent bond between the substance and the first antibody by means of H0 * radicals produced by a Fenton-type reaction, c) denature the immunological bond between the substance and the first antibody to make an epitope of this substance accessible for a new immunological reaction, d) bringing the solid phase thus treated into contact with a labeled antibody, called second antibody, specific for the substance, e) determining the amount of the second labeled antibody attached to the solid phase, and f) carrying out the steps again a) to e) above using the same amount of substance in step a) and adding in step b) the compound whose antioxidant capacity is to be determined, in order to evaluate the rate of inhibition of the compound on the immobilization reaction of the substance.

Un dosage immunométrique de ce type faisant intervenir une réaction antigène (ou haptène)- anticorps, suivie d'une fixation sur une phase solide pour libérer un épitope de la substance en cause en vue d'une nouvelle réaction immunologique est décrit en particulier dans le document FR-A- 2 700 855 [4] et dans Analytical Chemistry 71, n 5, 1999, pp. 1002-1008 [3]. Dans ce dernier document, la formation de liaisons covalentes entre l'antigène et l'anticorps était effectuée par irradiation au moyen de rayonnement ultraviolet. An immunometric assay of this type involving an antigen (or hapten) - antibody reaction, followed by attachment to a solid phase in order to release an epitope of the substance in question with a view to a new immunological reaction is described in particular in the document FR-A-2 700 855 [4] and in Analytical Chemistry 71, No. 5, 1999, pp. 1002-1008 [3]. In the latter document, the formation of covalent bonds between the antigen and the antibody was carried out by irradiation by means of ultraviolet radiation.

Dans l'invention, on reproduit les mêmes étapes que celles du dosage du document [4], mais on immobilise la substance sur la phase solide comprenant le premier anticorps au moyen de radicaux Ho' produits, de préférence, par une réaction de type Fenton. La substance utilisée dans le procédé de l'invention peut être tout antigène ou haptène, ou tout anticorps spécifique de ces antigènes ou haptènes, de préférence un anticorps monoclonal. In the invention, the same steps as those of the assay of document [4] are reproduced, but the substance is immobilized on the solid phase comprising the first antibody by means of Ho 'radicals produced, preferably, by a reaction of the Fenton type. . The substance used in the process of the invention can be any antigen or hapten, or any antibody specific for these antigens or haptens, preferably a monoclonal antibody.

A titre d'exemple, la substance peut être un haptène tel que l'estradiol, la substance P, le CGRP ( calcitonine gene related peptide ), le couple histamine-X (X étant par exemple un groupement tyrosyle ou une base nucléique). By way of example, the substance can be a hapten such as estradiol, substance P, CGRP (calcitonin gene related peptide), the histamine-X couple (X being for example a tyrosyl group or a nucleic base).

Les anticorps utilisés peuvent être des anticorps polyclonaux ou monoclonaux. De préférence, on utilisc- deux anticorps identiques, mr#noclciiaux dont l'un dénommé second anticorps, est un anticorps marqué. The antibodies used can be polyclonal or monoclonal antibodies. Preferably, two identical antibodies, one of which is called the second antibody, is a labeled antibody.

Ce dernier peut être marqué par différents marqueurs tels que des éléments radioactifs, des enzymes, des marqueurs fluorescents, des marqueurs luminescents et des molécules capables de réagir avec l'avidine ou la streptavidine. De préférence, on utilise un anticorps marqué par une enzyme, ce qui permet par exemple de déterminer l'anticorps marqué par une méthode colorimétrique. The latter can be labeled with various markers such as radioactive elements, enzymes, fluorescent markers, luminescent markers and molecules capable of reacting with avidin or streptavidin. Preferably, an antibody labeled with an enzyme is used, which makes it possible, for example, to determine the labeled antibody by a colorimetric method.

De préférence encore, l'enzyme est l'acétylcholinestérase et l'on mesure l'activité enzymatique en utilisant le réactif d'Ellman, constitué par un mélange d'acétylthiocholine et de DTNB, comme décrit par Pradelles et al dans Anal. Chem. 57, 1985, page 1170 [5] et en déterminant l'absorbance à 414 nanomètres. More preferably, the enzyme is acetylcholinesterase and the enzymatic activity is measured using Ellman's reagent, consisting of a mixture of acetylthiocholine and DTNB, as described by Pradelles et al in Anal. Chem. 57, 1985, page 1170 [5] and determining the absorbance at 414 nanometers.

Les étapes a) et c) à e) du dosage peuvent être effectuées comme il est décrit dans le document [4]. Selon l'invention, le taux d'inhibition du composé testé sur la réaction d'immobilisation de la substance peut être déterminé en tant que pourcentage d'inhibition du signal So représentatif de la quantité de substance immobilisée en l'absence du composé. Steps a) and c) to e) of the assay can be carried out as described in document [4]. According to the invention, the rate of inhibition of the compound tested on the reaction of immobilization of the substance can be determined as a percentage of inhibition of the signal So representative of the quantity of substance immobilized in the absence of the compound.

Selon l'invention, pour apprécier la capacité antioxydante du composé testé, on mesure de préférence le taux d'inhibition engendré par différentes concentrations de ce composé de façon à déterminer la concentration CISO de composé nécessaire pour obtenir 50 % d'inhibition de la réaction. According to the invention, to assess the antioxidant capacity of the compound tested, the rate of inhibition generated by different concentrations of this compound is preferably measured so as to determine the CISO concentration of compound necessary to obtain 50% inhibition of the reaction. .

Le procé--té de l'invention peut être mis en #uvre pour tester différents composés antioxydants ou vérifier la capacité antioxydante de composés. Ceux-ci peuvent être quelconques à condition bien entendu qu'ils ne perturbent pas et ne réagissent pas avec le complexe formé entre la substance et l'anticorps. The process of the invention can be used to test different antioxidant compounds or to verify the antioxidant capacity of compounds. These can be any, provided of course that they do not disturb and do not react with the complex formed between the substance and the antibody.

L'invention a encore pour objet un procédé pour immobiliser une substance sur une phase solide comportant une molécule présentant une affinité spécifique vis-à-vis de la substance, qui consiste à former une liaison covalente entre la substance et ladite molécule au moyen d'espèces actives de l'oxygène, par exemple de radicaux hydroxyles produits par une réaction de type Fenton. A further subject of the invention is a process for immobilizing a substance on a solid phase comprising a molecule exhibiting a specific affinity for the substance, which consists in forming a covalent bond between the substance and said molecule by means of active oxygen species, for example hydroxyl radicals produced by a Fenton-type reaction.

Cette substance peut être un antigène ou un haptène, la molécule à affinité spécifique étant dans ce cas un anticorps spécifique de l'antigène ou de l'haptène. This substance may be an antigen or a hapten, the molecule with specific affinity in this case being an antibody specific for the antigen or for the hapten.

La substance peut aussi être un récepteur biologique, la molécule spécifique étant dans ce cas un ligand du récepteur. La substance peut être un acide nucléique ou un fragment de celui-ci, la molécule spécifique étant dans ce cas un acide nucléique ou un fragment d'acide nucléique complémentaire de la substance. The substance can also be a biological receptor, the specific molecule in this case being a ligand of the receptor. The substance may be a nucleic acid or a fragment thereof, the specific molecule in this case being a nucleic acid or a fragment of nucleic acid complementary to the substance.

La substance peut être un acide nucléique ou un fragment de celui-ci et la molécule spécifique étant dans ce cas une protéine. The substance may be a nucleic acid or a fragment thereof and the specific molecule in this case being a protein.

Bien entendu, la substance pourrait aussi bien être l'anticorps, le ligand ou la protéine, et la molécule pourrait être l'antigène, l'haptène, le récepteur, l'acide nucléique ou ifragment d'acide nucléique. Of course, the substance could equally well be the antibody, the ligand or the protein, and the molecule could be the antigen, the hapten, the receptor, the nucleic acid or the nucleic acid fragment.

En effet, il est seulement nécessaire que la substance et la molécule aient une affinité spécifique l'une vis-à-vis de l'autre. In fact, it is only necessary that the substance and the molecule have a specific affinity towards each other.

Pour mettre en #uvre ce procédé d'immobilisation, on met en contact la phase solide comportant la molécule à affinité spécifique avec la substance et une solution aqueuse contenant du peroxyde d'hydrogène, éventuellement stabilisé par de l'urée, et un sel ou complexe de fer, de cuivre, de nickel, de chrome ou de titane. To carry out this immobilization process, the solid phase comprising the molecule with specific affinity is brought into contact with the substance and an aqueous solution containing hydrogen peroxide, optionally stabilized with urea, and a salt or complex of iron, copper, nickel, chromium or titanium.

De préférence, on utilise une solution aqueuse constituée par un tampon carbonate contenant le peroxyde d'hydrogène, éventuellement stabilisé par de l'urée, et un sel de cuivre tel que du sulfate de cuivre. Preferably, an aqueous solution is used consisting of a carbonate buffer containing hydrogen peroxide, optionally stabilized with urea, and a copper salt such as copper sulfate.

Le procédé d'immobilisation décrit ci- dessus peut être utilisé en particulier dans le procédé de dosage immunométrique de FR-A-2 700 855. Ce procédé de dosage immunométrique d'une substance comprenant les étapes suivantes - 1) mettre en contact un échantillon contenant la substance avec une phase solide sur laquelle est fixé un anticorps spécifique de cette substance, dit premier anticorps, pour lier immunologiquement la substance au premier anticorps, - 2) immobiliser la substance sur là phase solide par formation d'une liaison covalente entre la substance et le premier anticorps, - 3) dénaturer la liaison immunolcg.i.nue. entre la substance et le premier anticorps pour rendre accessible un épitope de cette substance en vue d'une nouvelle réaction immunologique, - 4) mettre en contact la phase solide ainsi traitée avec un anticorps marqué, dit second anticorps, spécifique de la substance, - 5) déterminer la quantité du second anticorps marqué fixé sur la phase solide, et - 6) déterminer sur une courbe d'étalonnage la quantité de substance à doser présente dans l'échantillon à partir de la quantité du second anticorps mesurée dans l'étape 5), se caractérise en ce que l'on réalise l'étape 2) d'immobilisation de la substance en formant la liaison covalente au moyen d'espèces actives de l'oxygène telles que des radicaux H0* produits par une réaction de type Fenton. The immobilization method described above can be used in particular in the immunometric assay method of FR-A-2 700 855. This method for the immunometric assay of a substance comprising the following steps - 1) contacting a sample containing the substance with a solid phase on which is fixed an antibody specific for this substance, called the first antibody, to immunologically bind the substance to the first antibody, - 2) immobilize the substance on the solid phase by forming a covalent bond between the substance and the first antibody, - 3) denature the immunolcg.i.nue binding. between the substance and the first antibody to make an epitope of this substance accessible for a new immunological reaction, - 4) bring the solid phase thus treated into contact with a labeled antibody, called second antibody, specific for the substance, - 5) determine the quantity of the second labeled antibody fixed on the solid phase, and - 6) determine on a calibration curve the quantity of substance to be assayed present in the sample from the quantity of the second antibody measured in step 5), is characterized in that step 2) of immobilization of the substance is carried out by forming the covalent bond by means of active oxygen species such as H0 * radicals produced by a reaction of the type Fenton.

D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront mieux à la lecture de la description qui suit, et des exemples de réalisation donnés bien entendu à titre illustratif et non limitatif, en référence aux dessins annexés. Other characteristics and advantages of the invention will emerge more clearly on reading the description which follows, and the embodiments given of course by way of illustration and without limitation, with reference to the appended drawings.

Brève description des dessins Les figures 1A à 1D illustrent schématiquement les différentes étapes du dosage immunométrique mis en ceuvre dans le procédé de l'invention. Brief Description of the Drawings Figures 1A to 1D schematically illustrate the different steps of the immunometric assay implemented in the method of the invention.

La figure 2 est une courbe illustrant le taux d'inhibition du signal (en %) d'un antioxydant en fonction de la concentration en antioxydant (en mM). FIG. 2 is a curve illustrating the rate of signal inhibition (in%) of an antioxidant as a function of the antioxidant concentration (in mM).

La figure 3 est un diagramme illustrant les taux d'inhibition (en ô) de différents antioxydants en fonction de leur concentration (en mM). FIG. 3 is a diagram illustrating the inhibition rates (in ô) of different antioxidants as a function of their concentration (in mM).

La figure 4 est une courbe d'étalonnage obtenue pour le dosage immunométrique de 17(3-estradiol. Exposé détaillé des modes de réalisation Sur la figure 1, on a représenté le principe de dosage immunométrique mis en #uvre dans l'invention. Comme on le voit sur la figure 1A, des anticorps 1, de préférence monoclonaux, sont immobilisés sur une phase solide 3, qui peut être par exemple une plaque de microtitration en plastique de 96 puits. Ces anticorps sont spécifiques d'un antigène ou d'un haptène 5 muni d'un épitope 5a. Par mise en contact de l'haptène avec les anticorps, on obtient une liaison immunologique entre l'hapténe 5 et l'anticorps 1. Après capture immunologique de cet haptène, on peut laver les puits, puis réaliser une réaction de type Fenton pour obtenir une liaison covalente entre l'haptène 5 et l'anticorps 1. Figure 4 is a calibration curve obtained for the immunometric assay of 17 (3-estradiol. Detailed description of the embodiments In Figure 1, the principle of immunometric assay implemented in the invention has been shown. As can be seen in FIG. 1A, antibodies 1, preferably monoclonal, are immobilized on a solid phase 3, which may for example be a 96-well plastic microtiter plate. These antibodies are specific for an antigen or for a hapten 5 provided with an epitope 5a. By bringing the hapten into contact with the antibodies, an immunological bond is obtained between the haptene 5 and the antibody 1. After immunological capture of this hapten, the wells can be washed. , then carry out a Fenton-type reaction to obtain a covalent bond between hapten 5 and antibody 1.

La figure 1B représente la formation de cette liaison covalente 7, l'haptène 5 étant toujours associé à l'anticorps 1 par liaison immunologique. FIG. 1B represents the formation of this covalent bond 7, hapten 5 always being associated with antibody 1 by immunological binding.

On procède alors à la dénaturation de cette liaison immunologique entre l'anticorps 1 et l'haptène 5 pour libérer l'épitope 5a. Cette étape peut être réalisée par addition d'un agent dissociant /dénaturant tel que la soude, et elle est illustrée sur la figure 1C. This immunological bond between antibody 1 and hapten 5 is then denatured to release epitope 5a. This step can be carried out by adding a dissociating / denaturing agent such as sodium hydroxide, and it is illustrated in FIG. 1C.

Dans l'étape suivante, illustrée par la figure 1D, on ajoute l'anticorps marqué 9 qui vient s'associer par liaison immunologique à l'haptène 5 au moyen de l'épitope 5a libéré précédemment. On peut alors déterminer la quantité d'anticorps marqué 9 présente dans le puits, qui correspond au signal de référence So et à la quantité d'antigène lié ou immobilisé. In the next step, illustrated by FIG. 1D, the labeled antibody 9 is added which is associated by immunological binding to the hapten 5 by means of the epitope 5a released previously. It is then possible to determine the quantity of labeled antibody 9 present in the well, which corresponds to the reference signal So and to the quantity of antigen bound or immobilized.

Pour mettre en #uvre le procédé de l'invention, on recommence alors les mêmes opérations en réalisant l'étape représentée sur la figure 1B en présence du composé à tester, c'est-à-dire en ajoutant ce composé à la concentration C1 aux réactifs de Fenton. To implement the method of the invention, the same operations are then repeated by carrying out the step shown in FIG. 1B in the presence of the compound to be tested, that is to say by adding this compound at the concentration C1 to Fenton's reagents.

Si ce composé a une activité antioxydante, il va inhiber la formation de liaisons 7 entre l'haptène 5 et l'anticorps 1. De la sorte lors de l'étape représentée sur la figure 1D, on détectera une quantité moindre d'anticorps marqué et le signal exprimé S1 sera inférieur au signal So correspondant à la même réaction en l'absence du composé. If this compound has antioxidant activity, it will inhibit the formation of bonds 7 between hapten 5 and antibody 1. In this way, during the step shown in FIG. 1D, a smaller amount of labeled antibody will be detected. and the signal expressed S1 will be less than the signal So corresponding to the same reaction in the absence of the compound.

En effet, le signal obtenu en fin de procédé est en relation directe avec la quantité d'hapténe immobilisé sur la phase solide par une réaction de type Fenton. Si au cours de l'étape 1B, l'ajout d'un composé interfère sur la formation de ces liaisons covalentes, la quantité d'haptène immobilisé sur la phase solide sera inférieure et il en résultera un signal inférieur lors de la détection de l'anticorps marqué en 1D. In fact, the signal obtained at the end of the process is directly related to the quantity of haptene immobilized on the solid phase by a reaction of the Fenton type. If during step 1B the addition of a compound interferes with the formation of these covalent bonds, the amount of hapten immobilized on the solid phase will be less and this will result in a lower signal upon detection of l antibody labeled in 1D.

Pour vérifier la capacité antioxydante du composé, on pourra effectuer le même dosage avec des quantités croissantes de composé à tester pour obtenir la courbe d'inhibition, c'est-à-dire la variation du pourcentage d'inhibition en fonction de la concentration en composé testé. To check the antioxidant capacity of the compound, the same assay can be carried out with increasing amounts of test compound to obtain the inhibition curve, that is to say the variation in the percentage of inhibition as a function of the concentration in compound tested.

Sur la figure 2, on a illustré une telle courbe d'inhibition. A partir de cette courbe, on peut déterminer la concentration CI5o en composé qui donne lieu à 50 % d'inhibition. Sur cette courbe, elle correspond à 0,06 mmol/l. In FIG. 2, such an inhibition curve has been illustrated. From this curve, it is possible to determine the IC 50 concentration of compound which gives rise to 50% inhibition. On this curve, it corresponds to 0.06 mmol / l.

Les exemples qui suivent illustrent l'invention. The examples which follow illustrate the invention.

Exemple 1 : Détermination de la capacité antioxydante de divers composés. Example 1 : Determination of the antioxidant capacity of various compounds.

Dans cet exemple, on utilise le 17p estradiol comme substance et des anticorps monoclonaux de souris anti-17(3-estradiol, et on effectue les étapes suivantes illustrées sur la figure 1. In this example, 17p estradiol is used as the substance and anti-17 (3-estradiol mouse monoclonal antibodies), and the following steps shown in Fig. 1 are carried out.

1. Capture immunologique (figure 1A) On utilise une plaque de microtitration comportant 96 puits que l'on a recouvert d'anticorps monoclonaux de souris anti-17(3-estradiol. On fait ensuite incuber dans les puits 100 u1 d'une solution d'estradiol dans le tampon de dosage (EIA) contenant du phosphate de potassium 0,1 M, pH7, 4, 0,15 M de NaCl, 0,1 % de sérum albumine bovine et 0,01 % d'azoture de sodium, la concentration en estradiol `tant de 500 pg/ml. 1. Immuno capture (Figure 1A) A 96-well microtiter plate is used which has been coated with anti-17 (3-estradiol mouse monoclonal antibodies. 100 µl of 3-estradiol is then incubated in the wells). a solution of estradiol in assay buffer (EIA) containing 0.1 M potassium phosphate, pH 7, 4, 0.15 M NaCl, 0.1% bovine serum albumin and 0.01% sodium azide, the estradiol concentration being 500 pg / ml.

On laisse la réaction de capture immunologique du 17@-estradiol se poursuivre pendant 1 heure à 22 C et on réalise des témoins en incubant seulement 100 p1 de tampon de dosage. On lave ensuite tous les puits 3 fois avec du tampon de lavage phosphate de potassium 0,01 M, pH7, 0, 0,05 % de Tween 20. On obtient ainsi la liaison immunologique de l'estradiol avec les anticorps monoclonaux représentée sur la figure 1A. The 17 @ -estradiol immunological capture reaction was allowed to continue for 1 hour at 22 ° C and controls were performed by incubating only 100 µl of assay buffer. All the wells are then washed 3 times with 0.01 M potassium phosphate washing buffer, pH 7.0.0, 0.05% Tween 20. This results in the immunological binding of the. estradiol with the monoclonal antibodies shown in Figure 1A.

2. Immobilisation (figure 1B) Après le lavage décrit ci-dessus, on ajoute dans l'ordre dans les puits, 50 pl du composé à tester à la concentration C1, 50 p1 de CUS04 (30 mM), et 50 u1 de H202 stabilisé par de l'urée (15 mM). On dilue tous les produits dans du tampon carbonate 100 mM, pH 9 et on laisse réagir pendant 5 minutes, puis on lave de nouveau les puits en utilisant le même tampon de lavage que précédemment. On obtient ainsi la formation des liaisons covalentes 7 représentées sur la figure 1B. La quantité de liaisons formées dépend de la concentration en composé à tester. 2. Immobilization (Figure 1B) After the washing described above, are added in order to the wells, 50 µl of the test compound at concentration C1, 50 µl of CUS04 (30 mM), and 50 µ1 of H202 stabilized with urea (15 mM). All the products are diluted in 100 mM carbonate buffer, pH 9 and allowed to react for 5 minutes, then the wells are washed again using the same washing buffer as before. The formation of the covalent bonds 7 shown in FIG. 1B is thus obtained. The amount of bonds formed depends on the concentration of compound to be tested.

3. Libération de l'épitope (figure 1C) On ajoute alors 200 u1 de NaOH 0,5 N dans les puits et on lave les puits. Ceci correspond à la dissociation et à la dénaturation des liaisons immunologiques entre l'anticorps 1 et l'haptène 5 avec libération de l'épitope 5a. Le lavage permet d'éliminer les molécules d'hapt`ne 5 non liées par liaison covalente aux_ anticorps 1. 3. Release of the epitope (Figure 1C) Then 200 µl of 0.5N NaOH is added to the wells and the wells are washed. This corresponds to the dissociation and denaturation of the immunological bonds between antibody 1 and hapten 5 with release of epitope 5a. Washing removes hapten 5 molecules not covalently linked to antibodies 1.

4. Révélation (figure 1D) On ajoute alors dans les puits 100 u1 d'une solution de traceur enzymatique constitué par le second anticorps marqué qui est le même anticorps monoclonal anti-estradiol, couplé à l'acétylcholinestérase à raison de 4 unités Ellman/ml. L'unité Ellman est définie comme il est décrit par Pradelles et al dans [5]. On obtient ainsi la liaison immunologique de ce second anticorps marqué avec les molécules d'haptène 5, ce qui correspond à la figure 1D. On laisse réagir pendant 1 heure à 22 C, puis on lave les puits et on ajoute alors 200 pl du substrat enzymatique (réactif d'Ellman) et on laisse la couleur se développer pendant 10 minutes. On mesure alors la densité optique à 414 nanomètres dans un lecteur automatique de plaques de microtitration. On obtient ainsi un signal S1 correspondant à la concentration C1 du composé à tester. 4. Revelation (Figure 1D) Then added to the wells 100 u1 of an enzymatic tracer solution consisting of the second labeled antibody which is the same monoclonal anti-estradiol antibody, coupled to acetylcholinesterase at a rate of 4 units Ellman / ml. The Ellman unit is defined as described by Pradelles et al in [5]. The immunological binding of this labeled second antibody with the hapten 5 molecules is thus obtained, which corresponds to FIG. 1D. The mixture is left to react for 1 hour at 22 ° C., then the wells are washed and 200 μl of the enzyme substrate (Ellman's reagent) are then added and the color is allowed to develop for 10 minutes. The optical density is then measured at 414 nanometers in an automatic microtiter plate reader. A signal S1 is thus obtained corresponding to the concentration C1 of the compound to be tested.

On a déterminé de la même façon le signal So obtenu sans addition du composé à tester. The signal So obtained was determined in the same way without adding the compound to be tested.

Le pourcentage d'inhibition est évalué par la formule suivante : S1/So x 100. The percentage of inhibition is evaluated by the following formula: S1 / So x 100.

On effectue ensuite les mêmes opérations avec des concentrations C2, C3 ... Cn en composé à tester, ce qui donne les signaux correspondant S2, S3 ... S,, et permet d'établir la courbe d'inhibition représentée sur la figure 2, à partir de laquellc on peut obtenir la valeur qui correspond à 50 % d'inhibition. The same operations are then carried out with concentrations C2, C3 ... Cn of compound to be tested, which gives the corresponding signals S2, S3 ... S ,, and makes it possible to establish the inhibition curve shown in the figure 2, from which one can obtain the value which corresponds to 50% inhibition.

Comme représenté sur la figure 2, on voit que la concentration CI5o qui correspond à 50 % d'inhibition est de 0,06 mM. As represented in FIG. 2, it can be seen that the IC50 concentration which corresponds to 50% inhibition is 0.06 mM.

On a réalisé ce dosage sur les composés suivants - albumine sérique bovine, - acide ascorbique, - mannitol, - thiourée, - diméthylsulfoxyde (DMSO), - cimétidine, - l'acide 6-hydroxy-2,5,7,8-tétraméthyl chroman-2- carboxylique (TroloxOO), - tyrosine, - acide urique, et - glucose. This assay was performed on the following compounds - bovine serum albumin, - ascorbic acid, - mannitol, - thiourea, - dimethylsulfoxide (DMSO), - cimetidine, - 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethyl acid chroman-2-carboxylic acid (TroloxOO), - tyrosine, - uric acid, and - glucose.

Les résultats obtenus sont donnés sur la figure 3 qui représente les courbes d'inhibition obtenues avec ces composés. On remarque ainsi que les composés antioxydants ayant les capacités antioxydantes les plus élevées sont l'albumine sérique bovine et la thiourée, qui ont des CI5p inférieures à0,1 mM. Le Trolox , la cimétidine, la tyrosine, l'acide urique et l'acide ascorbique ont des CI50 inférieures à 1mm. The results obtained are given in FIG. 3 which represents the inhibition curves obtained with these compounds. It is thus noted that the antioxidant compounds having the highest antioxidant capacities are bovine serum albumin and thiourea, which have IC5p lower than 0.1 mM. Trolox, cimetidine, tyrosine, uric acid and ascorbic acid have IC50s less than 1 mm.

En revanche, le mannitol, le glucose et le diméthylsulfoxyde ont une capacité antioxydante beaucoup plus faible. In contrast, mannitol, glucose and dimethyl sulfoxide have much lower antioxidant capacity.

Exemple 2 : Dosage immuncm4,trique du 17(3-estradicl. Example 2: Immuncm4 assay, 17 (3-estradicl.

Cet exemple illustre l'utilisation du procédé d'immobilisation par une réaction de type Fenton dans le dosage immunométrique de 17(3-estradiol. This example illustrates the use of the method of immobilization by a reaction of the Fenton type in the immunometric assay of 17 (3-estradiol.

Pour ce dosage, on utilise comme phase solide une plaque de microtitration à 96 puits revêtus de l'anticorps monoclonal de souris anti-17(3-estradiol comme dans l'exemple 1, et on réalise les étapes suivantes 1. Capture immunologique (figure 1A) On fait incuber dans les puits 100 pl du tampon de dosage EIA comme dans l'exemple 1, qui contient soit l'échantillon à doser, soit les sérums standards de 17p-estradiol, pendant 15 minutes à la température ambiante. 2. Immobilisation (figure 1B) Après lavage des puits comme dans l'exemple 1, on ajoute 50 pl peroxyde d'hydrogène stabilisé à l'urée 20 mM, puis 50 u1 de CuSO4 20 mM tous deux dissous dans le tampon carbonate 100 mM, pH 9. On laisse réagir pendant 2 minutes à la température ambiante. For this assay, a 96-well microtiter plate coated with the anti-17 (3-estradiol mouse monoclonal antibody as in Example 1) is used as the solid phase, and the following steps are carried out 1. Capture immunological (FIG. 1A) 100 μl of the EIA assay buffer as in Example 1, which contains either the sample to be assayed or the standard sera of 17p-estradiol, are incubated in the wells for 15 minutes at room temperature. 2. Immobilization (FIG. 1B) After washing the wells as in Example 1, 50 μl of hydrogen peroxide stabilized with 20 mM urea are added, then 50 μl of 20 mM CuSO4 both dissolved in 100 mM carbonate buffer, pH 9. Allowed to react for 2 minutes at room temperature.

3. Libération de l'épitope (figure 1C) Après lavage comme dans l'exemple 1, on ajoute 200 u1 de NaOH 0,5N et on laisse réagir pendant 2 minutes à température ambiante. 3. Release of the epitope (FIG. 1C) After washing as in Example 1, 200 μl of 0.5N NaOH are added and the mixture is left to react for 2 minutes at room temperature.

4. Révélation (figure 1D) Après lavage comme dans l'exemple 1, on ajoute 100 u1 d'anticorps monoclonaux anti-(3-estradiol marqués à l'acétylcholinestérase (4 unités Ellman par ml) et on laisse incuber pendant 1 heure à température ambiante. Après lavage comme dans l'exemple 1, on ajoute 200 u1 de réactif d'Ellman et on détermine l'absorbance à 414 nm exprimée en unités d'absorbance (UA), après 10 minutes de réaction enzymatique. 4. Revelation (Figure 1D) After washing as in Example 1, 100 µl of anti- (3-estradiol acetylcholinesterase-labeled monoclonal antibodies (4 Ellman units per ml) are added and incubated for 1 hour at room temperature After washing as in Example 1, 200 µl of Ellman's reagent is added and the absorbance at 414 nm, expressed in absorbance units (AU), is determined after 10 minutes of enzymatic reaction.

A partir des mesures d'absorbances obtenues pour les sérums standards, on trace la courbe d'étalonnage représentée sur la figure 4 qui illustre l'absorbance à 414 nm (en UA) en fonction des concentrations en 175-estradiol (en pg/ml). From the absorbance measurements obtained for the standard sera, the calibration curve shown in FIG. 4 is plotted which illustrates the absorbance at 414 nm (in AU) as a function of the concentrations of 175-estradiol (in pg / ml ).

A partir de l'absorbance obtenue pour l'échantillon, on peut déterminer sa concentration en 175-estradiol en se reportant à la courbe d'étalonnage de la figure 4.

From the absorbance obtained for the sample, its 175-estradiol concentration can be determined by referring to the calibration curve in Figure 4.

Références <SEP> citées
<tb> [1] <SEP> Archives <SEP> of <SEP> Biochemistry <SEP> and <SEP> Biophysics, <SEP> 15
<tb> septembre <SEP> 1996, <SEP> volume <SEP> 333, <SEP> n 2, <SEP> pages <SEP> 377-384.
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[41 <SEP> FR-A- <SEP> 2 <SEP> 700 <SEP> 855.
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[5] <SEP> Pradelles <SEP> et <SEP> al <SEP> dans <SEP> <SEP> Anal. <SEP> Chem. <SEP> 57, <SEP> 1985,
<tb> page <SEP> 1170.[5] <SEP> Pradelles <SEP> and <SEP> al <SEP> in <SEP><SEP> Anal. <SEP> Chem. <SEP> 57, <SEP> 1985,
<tb> page <SEP> 1170.

Claims

REVENDICATIONS

1. Procédé pour déterminer la capacité anti-oxydante d'un composé, consistant à mesurer le taux d'inhibition engendré par ce composé sur une réaction chimique de fixation d'une substance sur une phase solide utilisant des espèces actives de l'oxygène pour cette réaction de fixation.1. Method for determining the antioxidant capacity of a compound, consisting in measuring the rate of inhibition generated by this compound on a chemical reaction of binding of a substance on a solid phase using active species of oxygen for this fixing reaction.

2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel les espèces actives de l'oxygène sont les radicaux hydroxyles HO".2. The method of claim 1, wherein the active oxygen species are hydroxyl radicals HO ".

3. Procédé selon la revendi.cat:ion 2, dans lequel les radicaux HO & utiles pour cette réaction chimique de fixation sont produits par une réaction de type Fenton.3. Method according to revendi.cat:ion 2, in which the HO & radicals useful for this chemical fixing reaction are produced by a reaction of the Fenton type.

4. Procédé selon la revendication 3, dans lequel on utilise tout sel métallique ou complexe métallique, et du peroxyde d'hydrogène pour produire les radicaux HO*par une réaction de type Fenton.4. The method of claim 3, wherein any metal salt or metal complex is used, and hydrogen peroxide to produce the HO * radicals by a Fenton-type reaction.

5. Procédé selon la revendication 3 ou 4, dans lequel on réalise une réaction de type Fenton dans une solution saline ayant un pH de 5 à 11.5. The method of claim 3 or 4, wherein a Fenton-type reaction is carried out in a saline solution having a pH of 5 to 11.

6. Procédé selon la revendication 5, dans lequel la solution saline peut être un tampon phosphate, carbonate, ou borate.6. The method of claim 5, wherein the saline solution can be a phosphate, carbonate, or borate buffer.

7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel la substance est un antigène ou un haptène, la phase solide comprend un anticorps spécifique de cette substance, et la réaction chimique de fixation consiste en la formation d'une liaison covalente entre la substance et l'anticorps.7. A method according to any one of claims 1 to 6, wherein the substance is an antigen or a hapten, the solid phase comprises an antibody specific for this substance, and the chemical binding reaction consists of the formation of a bond. covalent between the substance and the antibody.

8. Procédé selon la revendication 7, dans lequel on détermine le taux d'inhibition en effectuant un dosage immunométrique de la substance, en présence et en l'absence du composé, ledit dosage immunométrique comprenant les étapes successives suivantes a) mettre en contact la substance avec une phase solide sur laquelle est fixé l'anticorps spécifique de cette substance, dit premier anticorps, pour lier immunologiquement la substance au premier anticorps, b) immobiliser la substance sur la phase solide par formation d'une liaison covalente entre la substance et le premier anticorps au moyen de radicaux HO* produits par une réaction de type Fenton, c) dénaturer la liaison immunologique entre la substance et le premier anticorps pour rendre accessible un épitope de cette substance en vue d'une nouvelle réaction immunologique, d) mettre en contact la phase solide ainsi traitée avec un anticorps marqué, dit second anticorps, spécifique de la substance, e) déterminer la quantité du second anticorps marqué fixé sur la phase solide, et f) effectuer à nouveau les étapes a) à e) ci-dessus en utilisant la même quantité de substance dans l'étape a) et en ajoutant dans l'étape b) le composé dont la capacité anti-oxydante est à déterminer, afin d'évaluer le taux d'inhibition du composé sur la réaction d'immobilisation de la substance.8. The method of claim 7, wherein the degree of inhibition is determined by performing an immunometric assay of the substance, in the presence and absence of the compound, said immunometric assay comprising the following successive steps a) contacting the substance. substance with a solid phase on which the specific antibody of this substance, called the first antibody, is attached to immunologically bind the substance to the first antibody, b) immobilize the substance on the solid phase by forming a covalent bond between the substance and the first antibody by means of HO * radicals produced by a Fenton-type reaction, c) denature the immunological bond between the substance and the first antibody to make an epitope of this substance accessible for a new immunological reaction, d) put in contact the solid phase thus treated with a labeled antibody, called second antibody, specific for the substance, e) determine the qu antity of the labeled second antibody attached to the solid phase, and f) perform steps a) to e) above again using the same amount of substance in step a) and adding in step b) the compound whose antioxidant capacity is to be determined, in order to evaluate the rate of inhibition of the compound on the immobilization reaction of the substance.

9. Procédé selon la revendication 8, dans lequel le second anticorps est un anticorps marqué par une enzyme.9. The method of claim 8, wherein the second antibody is an antibody labeled with an enzyme.

10. Procédé selon la revendication 9, dans lequel l'enzyme est l'acétylcholinéstérase, et on détermine la quantité du second anticorps marqué par colorimétrie.10. The method of claim 9, wherein the enzyme is acetylcholinesterase, and the amount of the labeled second antibody is determined by colorimetry.

11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, dans lequel on mesure le taux d'inhibition engendré par différentes concentrations du composé de façon à déterminer la quantité de composé nécessaire pour obtenir_ 50 % d'inhibition de la réaction.11. A method according to any one of claims 1 to 10, in which the rate of inhibition generated by different concentrations of the compound is measured so as to determine the amount of compound necessary to obtain 50% inhibition of the reaction.

12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, dans lequel la substance est le 17(3-estradiol.12. A method according to any one of claims 1 to 11, wherein the substance is 17 (3-estradiol.

13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, dans lequel le composé est choisi parmi l'albumine sérique bovine, l'acide ascorbique, le mannitol, la thiourée, le diméthylsulfoxyde (DMSO), l'acide urique, l'acide 6- hydroxy-2,5,7,8-tétraméthyl chroman-2-carboxylique, la tyrosine, la cimétidine et le glucose.13. A method according to any one of claims 1 to 12, wherein the compound is selected from bovine serum albumin, ascorbic acid, mannitol, thiourea, dimethylsulfoxide (DMSO), uric acid, l 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethyl chroman-2-carboxylic acid, tyrosine, cimetidine and glucose.

14. Procédé pour immobiliser une substance sur une phase solide comportant une molécule présentant une affinité spécifique vis-à-vis de la substance, qui consiste à former une liaison covalente entre la substance et ladite molécule au moyen d'espèces actives de l'oxygène.14. Method for immobilizing a substance on a solid phase comprising a molecule having a specific affinity for the substance, which consists in forming a covalent bond between the substance and said molecule by means of active oxygen species. .

15. Procédé selon la revendication 14, dans lequel les espèces actives de l'oxygène sont des radicaux hydroxyles HOO produits par une réaction de type Fenton.15. The method of claim 14, wherein the active oxygen species are hydroxyl radicals HOO produced by a Fenton-type reaction.

16. Procédé selon la revendication 15, dans lequel on utilise un sel ou complexe de fer, de cuivre, de nickel, de chrome ou de titane et du peroxyde d'hydrogène pour produire les radicaux H0* par une réaction de type Fenton.16. The method of claim 15, wherein a salt or complex of iron, copper, nickel, chromium or titanium and hydrogen peroxide is used to produce the H0 * radicals by a Fenton-type reaction.

17. Procédé selon la revendication 15 ou 16, dans lequel on réalise une réaction de type Fenton dans une solution saline ayant un pH de 5 à 11.17. The method of claim 15 or 16, wherein a Fenton-type reaction is carried out in a saline solution having a pH of 5 to 11.

18. Procédé selon la revendication 15, dans lequel ?_a solution saline est un tampon phosphate, carbonate ou borate.18. The method of claim 15, wherein the saline solution is a phosphate, carbonate or borate buffer.

19. Procédé de dosage immunométrique d'une substance comprenant les étapes suivantes - 1) mettre en contact un échantillon contenant la substance avec une phase solide sur laquelle est fixé un anticorps spécifique de cette substance, dit premier anticorps, pour lier immunologiquement la substance au premier anticorps, - 2) immobiliser la substance sur la phase solide par formation d'une liaison covalente entre la substance et le premier anticorps, - 3) dénaturer la liaison immunologique entre la substance et le premier anticorps pour rendre accessible un épitope de cette substance en vue d'une nouvelle réaction immunologique, - 4) mettre en contact la phase solide ainsi traitée avec un anticorps marqué, dit second anticorps, spécifique de la substance, - 5) déterminer la quantité du second anticorps marqué fixé sur la phase solide, et - 6) déterminer sur une courbe d'étalonnage la quantité de substance à doser présente dans l'échantillon à partir de la quantité du second anticorps mesurée dans l'étape 5), caractérisé en ce que l'on réalise l'étape 2) d'immobilisation de la substance en formant la liaison covalente au moyen d'espèces actives de l'oxygène.19. A method for the immunometric assay of a substance comprising the following steps - 1) bringing a sample containing the substance into contact with a solid phase on which is fixed an antibody specific for this substance, called the first antibody, in order to immunologically bind the substance to the substance. first antibody, - 2) immobilize the substance on the solid phase by forming a covalent bond between the substance and the first antibody, - 3) denature the immunological bond between the substance and the first antibody to make an epitope of this substance accessible with a view to a new immunological reaction, - 4) bringing the solid phase thus treated into contact with a labeled antibody, called second antibody, specific for the substance, - 5) determining the quantity of the second labeled antibody fixed on the solid phase, and - 6) determine on a calibration curve the quantity of substance to be assayed present in the sample from the quantity of the second antibody measured in step 5), characterized in that step 2) of immobilization of the substance is carried out by forming the covalent bond by means of active oxygen species.

20. Procédé selon la revendication 19, dans lequel les espèces actives de l'oxygène sont des radicaux hydzD:#yi.As_HO & produits par une réactic:# ne: type Fenton.20. The method of claim 19, wherein the active oxygen species are hydzD: # yi.As_HO & radicals produced by a reactic: # ne: Fenton type.

21. Procédé selon la revendication 20, dans lequel on utilise un sel ou complexe de fer, de cuivre, de nickel, de chrome ou de titane et du peroxyde d'hydrogène pour produire les radicaux HO* par une réaction de type Fenton.21. The method of claim 20, wherein a salt or complex of iron, copper, nickel, chromium or titanium and hydrogen peroxide is used to produce the HO * radicals by a Fenton-type reaction.

22. Procédé selon la revendication 20 ou 21, dans lequel on réalise une réaction de type Fenton dans une solution saline ayant un pH de 5 à 11.22. The method of claim 20 or 21, wherein a Fenton-type reaction is carried out in a saline solution having a pH of 5 to 11.

23. Procédé selon la revendication 22, dans lequel la solution saline est un tampon phosphate, carbonate ou borate.23. The method of claim 22, wherein the saline solution is a phosphate, carbonate or borate buffer.

24. Procédé selon l'une quelconque des revendications 19 à 23, dans lequel la substance est le 17(3-estradiol. 24. A method according to any one of claims 19 to 23, wherein the substance is 17 (3-estradiol.