FR2798292A1

FR2798292A1 - Utilisation d'ammoniums quaternaires aliphatiques pour induire une reponse mixte th1/th2

Info

Publication number: FR2798292A1
Application number: FR9911284A
Authority: FR
Inventors: Alain Beck; Christine Klinguer; Thien Ngoc Nguyen
Original assignee: Pierre Fabre Medicament SA
Current assignee: Pierre Fabre Medicament SA
Priority date: 1999-09-09
Filing date: 1999-09-09
Publication date: 2001-03-16

Abstract

La présente invention concerne l'utilisation d'ammoniums quaternaires aliphatiques, de préférence du Diméthyl Dioctadécyl Ammonium sous forme de bromure (DDAB) ou de chlorure (DDAC) en association avec un immunogène ou antigène pour améliorer l'immunogénicité et pour obtenir une réponse immunitaire équilibrée de type Th1/ Th2 pour ledit immunogène ou antigène. L'invention porte également sur un produit de combinaison comprenant un ammonium quaternaire aliphatique et un immunogène ou un antigène dérivé de la protéine G du virus respiratoire syncytial.

Description

La présente invention concerne l'utilisation d'ammoniums quaternaires aliphatiques, de préférence du Diméthyl Dioctadécyl Ammonium sous forme de bromure (DDAB) ou de chlorure (DDAC) en association avec un immunogène ou antigène pour améliorer l'immunogénicité et pour obtenir une réponse immunitaire équilibrée de type Thl/Th2 pour ledit immunogène ou antigène. L'invention porte également sur un produit de combinaison comprenant un ammonium quaternaire aliphatique et un immunogène ou un antigène dérivé de la protéine G du virus respiratoire syncytial Le virus respiratoire syncytial (VRS) est la cause la plus fréquente d'hospitalisation des nourrissons de moins d'un an pour les infections respiratoires aiguës. Les enfants atteints de laryngo-trachéo-bronchites, bronchiolites et pneumonies nécessitent des soins hospitaliers et chez les nourrissons présentant des maladies cardiaques congénitales, le taux de mortalité est supérieur à 37 %. D'autres troubles comme les dysplasies bronchopulmonaires, les maladies rénales et l'immunodéficience sont autant de facteurs responsables de mortalités élevées. Les infections à VRS peuvent également être une cause de mortalité chez les personnes âgées.

Dans les pays tempérés, l'épidémie de VRS se manifeste pendant la période hivernale de novembre à avril et la plus grande incidence de sérieuses maladies survient chez le nourrisson de 2 à 6 mois On distingue deux types de VRS par la variation antigénique de la glycoprotéine G du VRS (sous groupe A et sous groupe B) Une étude récente en France de 1982 à 1990 a montré une alternance d'un sous-groupe à l'autre sur une période de 5 ans. La souche A est souvent la cause d'infections plus graves que la souche B Le VRS humain appartient au genre pneumovirus, membre de la famille des Paramyxoviridae. Le génome du virus est constitué d'un brin d'ARN à polarité

négative, non segmenté, codant pour 10 protéines distinctes . NS1, NS2, N ; P,M, SH (ou IA), G, F, M2 (ou 22K ) et L.

De nombreuses expériences publiées ont démontré que les protéines majeures impliquées dans la protection sont : F, G, et N. La glycoprotéine de fusion F synthétisée comme précurseur FO est scindée en deux sous - unités FI (48 kDa) et F2 (20 kDa) reliées par des ponts disulfures. La protéine F est conservée entre le VRS-A et le VRS-B (91 % homologie). A l'inverse, la séquence d'acides aminés de la glycoprotéine d'attachement G entière est variable d'un sous-groupe à l'autre (environ
50 % homologie). Mais la partie centrale de cette protéine est assez conservée : en particulier une région de 13 acides aminés (aa 164 à aa 176) est hautement conservée avec quatre résidus cystéines (173, 176, 182 et 186) qui sont maintenus dans chaque sous-groupe. Il a été démontré à l'aide de modèles animaux que les deux glycoprotéines F et G jouent un rôle majeur dans l'immunologie du VRS. Les anticorps monoclonaux dirigés contre G et F sont capables de neutraliser le virus in vitro et passivement administrés, ils protègent le rat des cotonniers contre l'infection par le VRS. Dans les années 60, la tentative de mise au point de vaccins classiques , c'est-à-dire le VRS inactivé par le formol (FI-VRS), analogue à des vaccins antirougeoleux, a échoué. Au lieu de conférer une protection chez l'enfant vacciné, ce type de vaccin a eu pour effet de potentialiser la maladie virale naturelle.

Les traitements actuels contre l'aggravation de la maladie due au VRS chez le nourrisson consiste à aspirer les mucosités pour dégager les voies respiratoires avec une assistance respiratoire par ventilation. Un antiviral, la Ribavirine semble être efficace dans les cas gravement atteints. Cependant, son utilisation dans la thérapie pédiatrique est encore mal définie. L'immunisation passive avec des immunoglobulines anti-VRS est une voie alternative dans les traitements des infections graves au VRS : effet secondaire indésirable n'a été observé Néanmoins, ce type de traitement est très coûteux et difficilement extrapolable à grande échelle.

Les différentes approches de vaccination contre le VRS humain ont été entreprises soit le vaccin protège contre l'infection du VRS chez l'animal (rongeurs, primates) mais induit une pathologie pulmonaire, soit le vaccin n'est pas assez immunogénique

et n'est pas protecteur. Dans les modèles animaux, il a été montré que la pathologie observée était corrélée à une réponse immunitaire de type Th2.

On a montré que BBG2Na, une protéine chimérique recombinante exprimée dans E. coli, est immunogénique et protectrice chez les rongeurs (Power et col, Virology, 1997,230, 155-166) Cette protéine a également été décrite dans WO 96/14416. Cette molécule est administrée avec de l'hydroxyde d'aluminium, adjuvant bien connu pour induire une réponse de type Th2. Le vaccin BBG2Na adjuvé avec de l'Alum et injecté chez l'animal induit une réponse Th2. Bien que cette réponse ne soit pas potentialisée après infection au VRS (Corvaïa et col, J. Infect. Dis, 1997,176, 560-509) comme cela était le cas pour le FI-VRS, une réponse équilibrée Thl/Th2 serait préférable pour un vaccin chez le nouveau-né.

Les adjuvants constituent un groupe de composés variés quant à leur structure et leur origine. Ainsi l'on trouve, entre autres, dans cette catégorie aussi bien des émulsions eau dans huile (adjuvant incomplet de Freund) ou huile dans eau, des composés d'origine bactérienne comme des dérivés du lipopolysaccharide des bactéries à Gram négatif, que des sels d'aluminium. A l'heure actuelle, les sels d'aluminium ( Alum ) sont les seuls autorisés à être injectés chez l'homme pour adjuver les antigènes vaccinaux. L'Alum est connu pour augmenter la réponse d'anticorps contre l'immunogène néanmoins il est réputé pour induire également une réponse fortement Th2. Un grand mouvement actuel de l'OMS incite à la recherche de nouveaux adjuvants non seulement de toxicité acceptable chez l'homme mais également induisant une réponse immunitaire de type mixte Thl/Th2 (Aguado et col, Vaccine, 1999, 17, 2321-2328).

Dans le cadre de l'invention, on a testé pour le candidat vaccin BBG2Na avec des adjuvants tels que l'adjuvant de Freund (AF) et Titermax. Ces deux adjuvants ont démontré chez la souris une potentialisation des réponses anticorps anti-VRS protectrices. Par ailleurs un rééquilibrage vers une réponse Thl/Th2 a été observé avec les deux adjuvants (Siegrist et col, J. Infect Dis , 1999, 179 :1326-33). Néanmoins, leur caractère toxique ne permet pas de les incorporer dans une formulation vaccinale

acceptable pour un individu sain. Parmi les adjuvants testés en clinique chez l'homme, on a choisi d'étudier un mélange DDA (Diméthyl Dioctadécyl Ammonium sous forme de bromure, de chlorure ou d'un autre anion biocompatible) comme adjuvant associé à BBG2Na : BBG2Na/DDA. Deux groupes de souris (groupe 1 et 2) ont été immunisées avec BBG2Na/DDA et avec BBG2Na/Alum respectivement : de manière surprenante, non seulement les réponses en anticorps de type IgG1 (marqueur de Th2) du groupe 1 sont aussi fortes en intensité que celles du groupe 2, mais les réponses en isotype IgG2a (marqueur de Thl) ont été induites de manière significative dans le groupe 1 comparées à un réponse nulle obtenue chez les souris du groupe 2. Le DDA/BBG2Na permet donc d'induire des réponses immunitaires plus équilibrées que l'Alum/BBG2Na. Le DDA permet non seulement de potentialiser les réponses d'anticorps mais également de rééquilibrer la réponse Th vers une réponse Thl/Th2 Description Ainsi, la présente invention concerne l'utilisation d'ammoniums quaternaires aliphatiques de formule générale :

dans laquelle RI, R2, R3, et R4 représentent un groupe alkyl linéaire ou ramifié, saturé ou insaturé, comprenant de 1 à 25 atomes de carbone, et X représente un ion halogène, en association avec un immunogène ou antigène pour améliorer l'immunogénicité et pour obtenir une réponse immunitaire équilibrée de type Thl/Th2 pour ledit immunogène ou antigène Avantageusement, l'ammonium quaternaire aliphatique est le Diméthyl Dioctadécyl Ammonium sous forme de bromure (DDAB) ou de chlorure (DDAC) de formule

Dans un mode particulier de réalisation, ledit immunogène ou antigène est dérivé de la protéine G du virus respiratoire syncytial De préférence, il comprend une séquence sélectionnée parmi les séquences ID N 1 à N 10 Les SEQ ID N 1 à SEQ ID N 7 suivantes sont des séquences peptidiques de fragments de la protéine G du VRS humain sous-groupe A et du VRS sous-groupe B SEQ ID N 1 (G2NA) : N - Thr Val Lys Thr Lys Asn Thr Thr Thr Thr Gln Thr Gln Pro Ser Lys Pro Thr Thr Lys Gln Arg Gln Asn Lys Pro Pro Asn Lys Pro Asn Asn Asp Phe His Phe Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Cys Ser Ile Cys Ser Asn Asn Pro Thr Cys Trp Ala Ile Cys Lys Arg Ile Pro Asn Lys Lys Pro Gly Lys Lys Thr Thr Thr Lys Pro Thr Lys Lys Pro Thr Phe Lys Thr Thr Lys Lys Asp His Lys Pro Gln Thr Thr Lys Pro Lys Glu Val Pro Thr Thr Lys Pro - C La séquence SEQ ID N 1peut être codée par la SEQ ID N 14 5'- ACC GTG AAA ACC AAA AAC ACC ACG ACC ACC CAG ACC CAG CCG AGC AAA CCG ACC ACC AAA CAG CGT CAG AAC AAA CCG CCG AAC AAA CCG AAC AAC GAT TTC CAT TTC GAA GTG TTC AAC TTC GTG CCG TGC AGC ATC TGC AGC AAC AAC CCG ACC TGC TGG GCG ATC TGC AAA CGT ATC CCG AAC AAA AAA CCG GGC AAA AAA ACC ACG ACC AAA CCG ACC AAA AAA CCG ACC TTC AAA ACC ACC AAA AAA GAT CAT AAA CCG CAG ACC ACC AAA CCG AAA GAA GTG CCG ACC ACC AAA CCG - 3' SEQ ID N 2 (G2NB) : N - Thr Ala Gln Thr Lys Gly Arg Ile Thr Thr Ser Thr Gln Thr Asn Lys Pro Ser Thr Lys Ser Arg Ser Lys Asn Pro Pro Lys Lys Pro Lys Asp Asp Tyr His Phe Glu Val Phe

Asn Phe Val Pro Cys Ser Ile Cys Gly Asn Asn Gin Leu Cys Lys Ser Ile Cys Lys Thr Ile Pro Ser Asn Lys Pro Lys Lys Lys Pro Thr Ile Lys Pro Thr Asn Lys Pro Thr Thr Lys Thr Thr Asn Lys Arg Asp Pro Lys Thr Pro Ala Lys Met Pro Lys Lys Glu Ile Ile Thr Asn - C La séquence SEQ ID N 2 peut être codée par la SEQ ID N 15 5'- ACC GCG CAG ACC AAA GGC CGT ATC ACC ACC AGC ACC CAG ACC AAC AAA CCG AGC ACC AAA AGC CGT AGC AAA AAC CCG CCG AAA AAA CCG AAA GAT GAT TAC CAC TTC GAA GTG TTC AAC TTC GTG CCC TGC AGC ATC TGC GGC AAC AAC CAG CTG TGC AAA AGC ATC TGC AAA ACC ATC CCG AGC AAC AAA CCG AAA AAG AAA CCG ACC ATC AAA CCG ACC AAC AAA CCG ACC ACC AAA ACC ACC AAC AAA CGT GAT CCG AAA ACC CCG GCG AAA ATG CCG AAG AAG GAA ATC ATC ACC AAC - 3' SEQ ID N 3 (G4A) : N - Val Pro Cys Ser Ile Cys Ser Asn Asn Pro Thr Cys Trp Ala Ile Cys Lys - C La séquence SEQ ID N 3 peut être codée par la SEQ ID N 16 5'- GTG CCG TGC AGC ATC TGC AGC AAC AAC CCG ACC TGC TGG GCG ATC TGC AAA - 3' SEQ ID N 4 (G4A5C) : N - Val Pro Ser Ser Ile Cys Ser Asn Asn Pro Thr Cys Trp Ala Ile Ser Lys - C La séquence SEQ ID N 4 peut être codée par la SEQ ID N 17 5'- GTG CCG AGC AGC ATC TGC AGC AAC AAC CCG ACC TGC TGG GCG ATC AGC AAA - 3' SEQ ID N 5 (G4B) : N - Val Pro Cys Ser Ile Cys Gly Asn Asn Gln Leu Cys Lys Ser Ile Cys Lys - C La séquence SEQ ID N 5 peut être codée par la SEQ ID N 18 5' -GTG CCC TGC AGC ATC TGC GGC AAC AAC CAG CTG TGC AAA AGC ATC TGC AAA - 3'

SEQ ID N 6 (G4'A) : N - Val Pro Asp Ser Ile Asp Ser Asn Asn Pro Thr Orn Trp Ala Ile Orn Lys - C
SEQ ID N 7 (G4'B) : N - Val Pro Asp Ser Ile Asp Gly Asn Asn Gln Leu Orn Lys Ser Ile Orn Lys - C Les SEQ ID N 8 à SEQ ID N 10 suivantes sont des séquences peptidiques de fragments de la protéine G du VRS bovin.

SEQ ID N 8 (G2V) : N - Gln Asn Arg Lys Ile Lys Gly Gln Ser Thr Leu Pro Ala Thr Arg Lys Pro Pro Ile Asn Pro Ser Gly Ser Ile Pro Pro Glu Asn His Gln Asp His Asn Asn Phe Gln Thr Leu Pro Tyr Val Pro Cys Ser Thr Cys Glu Gly Asn Leu Ala Cys Leu Ser Leu Cys His Ile Glu Thr Glu Arg Ala Pro Ser Arg Ala Pro Thr Ile Thr Leu Lys Lys Thr Pro Lys Pro Lys Thr Thr Lys Lys Pro Thr Lys Thr Thr Ile His His Arg Thr Ser Pro Glu Thr Lys Leu Gln - C La séquence SEQ ID N 8 peut être codée par la SEQ ID N 19 .

5'- CAA AAC AGA AAA ATC AAA GGT CAA TCA ACA CTA CCA GCC ACA AGA AAA CCA CCA ATT AAT CCA TCA GGA AGC ATC CCA CCA GAA AAC CAT CAA GAC CAC AAC AAC TTC CAA ACA CTC CCC TAT GTT CCC TGC AGT ACA TGT GAA GGT AAT CTT GCA TGC TTA TCA CTC TGC CAT ATT GAG ACG GAA AGA GCA CCA AGC AGA GCA CCA ACA ATC ACC CTC AAA AAG ACA CCA AAA CCA AAA ACC ACA AAA AAG CCA ACC AAG ACA ACA ATC CAT CAC AGA ACC AGC CCA GAA ACC AAA CTG CAA - 3' SEQ ID N 9 (G4V) : N - Val Pro Cys Ser Thr Cys Glu Gly Asn Leu Ala Cys Leu Ser Leu Cys His - C La séquence SEQ ID N 9 peut être codée par la SEQ ID N 20 5'- GTT CCC TGC AGT ACA TGT GAA GGT AAT CTT GCA TGC TTA TCA CTC TGC CAT - 3'

SEQ ID N 10 (G4'V) : N - Val Pro Asp Ser Thr Asp Glu Gly Asn Leu Ala Orn Leu Ser Leu Orn His - C L'immunogène ou l'antigène peut être une protéine de fusion entre un fragment polypeptidique dérivé de la protéine G du virus respiratoire syncytial et un fragment polypeptidique dérivé de la protéine G du Streptocoque Dans cette protéine, les fragments peuvent être liés de manière covalente et le fragment polypeptidique dérivé de la protéine G du Streptocoque peut comprendre une séquence sélectionnée parmi les séquences ID N 11et ID N 12.

SEQ ID N 11 (BB) : N - Lys Tyr Gly Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Leu Ile Asn Asn Ala Lys Thr Val Glu Gly Val Lys Asp Leu Gln Ala Gin Val Val Glu Ser Ala Lys Lys Ala Arg Ile Ser Glu Ala Thr Asp Gly Leu Ser Asp Phe Leu Lys Ser Gin Thr Pro Ala Glu Asp Thr Val Lys Ser Ile Glu Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly Val Ser Asp Tyr His Lys Asn Leu Ile Asn Asn Ala Lys Thr Val Glu Gly Val Lys Asp Leu Gln Ala Gln Val Val Glu Ser Ala Lys Lys Ala Arg Ile Ser Glu Ala Thr Asp Gly Leu Ser Asp Phe Leu Lys Ser Gln Thr Pro Ala Glu Asp Thr Val Lys Ser Ile Glu Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Leu Ile Asn Asn Ala Lys Thr Val Glu Gly Val Lys Ala Leu Ile Asp Glu Ile Leu Ala Ala Leu Pro Lys Thr Asp Thr Tyr Lys Leu Ile Leu Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Glu Ala Val Asp Ala Ala Thr Ala Arg Ser Phe Asn Phe Pro Ile Leu C La séquence SEQ ID N 1 1 peut être codée par la SEQ ID N 21 : 5'- AAA TAT GGA GTA AGT GAC TAT TAC AAG AAT CTA ATC AAC AAT GCC AAA ACT GTT GAA GGC GTA AAA GAC CTT CAA GCA CAA GTT GTT GAA TCA GCG AAG AAA GCG CGT ATT TCA GAA GCA ACA GAT GGC TTA TCT GAT TTC TTG AAA TCA CAA ACA CCT GCT GAA GAT ACT GTT AAA TCA ATT GAA TTA GCT GAA GCT AAA GTC TTA GCT AAC AGA GAA CTT

GAC AAA TAT GGA GTA AGT GAC TAT CAC AAG AAC CTA ATC AAC AAT GCC AAA ACT GTT GAA GGT GTA AAA GAC CTT CAA GCA CAA GTT GTT GAA TCA GCG AAG AAA GCG CGT ATT TCA GAA GCA ACA GAT GGC TTA TCT GAT TTC TTG AAA TCA CAA ACA CCT GCT GAA GAT ACT GTT AAA TCA ATT GAA TTA GCT GAA GCT AAA GTC TTA GCT AAC AGA GAA CTT GAC AAA TAT GGA GTA AGT GAC TAT TAC AAG AAC CTA ATC AAC AAT GCC AAA ACT GTT GAA GGT GTA AAA GCA CTG ATA GAT GAA ATT TTA GCT GCA TTA CCT AAG ACT GAC ACT TAC AAA TTA ATC CTT AAT GGT AAA ACA TTG AAA GGC GAA ACA ACT ACT GAA GCT GTT GAT GCT GCT ACT GCA AGA TCT TTC AAT TTC CCT ATC CTC - 3' SEQ ID N 12 (#BB, fragment de BB) : N-Lys Tyr Gly Val Ser Asp Tyr His Lys Asn Leu Ile Asn Asn Ala Lys Thr Val Glu Gly Val Lys Asp Leu Gln Ala Gln Val Val Glu Ser Ala Lys Lys Ala Arg Ile Ser Glu Ala Thr Asp Gly Leu Ser Asp Phe Leu Lys Ser Gln Thr Pro Ala Glu Asp Thr Val Lys Ser Ile Glu Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Leu Ile Asn Asn Ala Lys Thr Val Glu Gly Val Lys Ala Leu Ile Asp Glu Ile Leu Ala Ala Leu Pro - C La séquence SEQ ID N 12 peut être codée par la SEQ ID N 22 .

5'- AAA TAT GGA GTA AGT GAC TAT CAC AAG AAC CTA ATC AAC AAT GCC AAA ACT GTT GAA GGT GTA AAA GAC CTT CAA GCA CAA GTT GTT GAA TCA GCG AAG AAA GCG CGT ATT TCA GAA GCA ACA GAT GGC TTA TCT GAT TTC TTG AAA TCA CAA ACA CCT GCT GAA GAT ACT GTT AAA TCA ATT GAA TTA GCT GAA GCT AAA GTC TTA GCT AAC AGA GAA CTT GAC AAA TAT GGA GTA AGT GAC TAT TAC AAG AAC CTA ATC AAC AAT GCC AAA ACT GTT GAA GGT GTA AAA GCA CTG ATA GAT GAA ATT TTA GCT GCA TTA CCT - 3'

Une protéine de fusion préférée de l'invention, protéine désignée BBG2Na, comporte la séquence ID N 13.

SEQ ID N 13 (BBG2Na) : N - Met Lys Ala Ile Phe Val Leu Asn Ala Gln His Asp Glu Ala Val Asp Ala Asn Phe Asp Gln Phe Asn Lys Tyr Gly Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Leu Ile Asn Asn Ala Lys Thr Val Glu Gly Val Lys Asp Leu Gln Ala Gln Val Val Glu Ser Ala Lys Lys Ala Arg Ile Ser Glu Ala Thr Asp Gly Leu Ser Asp Phe Leu Lys Ser Gin Thr Pro Ala Glu Asp Thr Val Lys Ser Ile Glu Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly Val Ser Asp Tyr His Lys Asn Leu Ile Asn Asn Ala Lys Thr Val Glu Gly Val Lys Asp Leu Gin Ala Gln Val Val Glu Ser Ala Lys Lys Ala Arg Ile Ser Glu Ala Thr Asp Gly Leu Ser Asp Phe Leu Lys Ser Gin Thr Pro Ala Glu Asp Thr Val Lys Ser Ile Glu Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Leu Ile Asn Asn Ala Lys Thr Val Glu Gly Val Lys Ala Leu Ile Asp Glu Ile Leu Ala Ala Leu Pro Lys Thr Asp Thr Tyr Lys Leu Ile Leu Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Glu Ala Val Asp Ala Ala Thr Ala Arg Ser Phe Asn Phe Pro Ile Leu Glu Asn Ser Met Thr Val Lys Thr Lys Asn Thr Thr Thr Thr Gin Thr Gln Pro Ser Lys Pro Thr Thr Lys Gln Arg Gln Asn Lys Pro Pro Asn Lys Pro Asn Asn Asp Phe His Phe Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Cys Ser Ile Cys Ser Asn Asn Pro Thr Cys Trp Ala Ile Cys Lys Arg Ile Pro Asn Lys Lys Pro Gly Lys Lys Thr Thr Thr Lys Pro Thr Lys Lys Pro Thr Phe Lys Thr Thr Lys Lys Asp His Lys Pro Gln Thr Thr Lys Pro Lys Glu Val Pro Thr Thr Lys Pro Val Asp - C La séquence SEQ ID N 13peut être codée par la SEQ ID N 23 : 5'- ATG AAA GCA ATT TTC GTA CTG AAT GCG CAA CAC GAT GAA GCC GTA GAC GCG AAT TTC GAC CAA TTC AAC AAA TAT GGA GTA AGT GAC TAT TAC AAG AAT CTA ATC AAC AAT GCC AAA ACT GTT GAA GGC GTA AAA GAC CTT CAA GCA CAA GTT GTT GAA TCA GCG AAG AAA GCG CGT ATT TCA GAA GCA ACA GAT GGC TTA TCT GAT TTC TTG AAA TCA CAA ACA CCT GCT GAA GAT ACT GTT AAA TCA ATT GAA TTA GCT GAA GCT

AAA GTC TTA GCT AAC AGA GAA CTT GAC AAA TAT GGA GTA AGT GAC TAT CAC AAG AAC CTA ATC AAC AAT GCC AAA ACT GTT GAA GGT GTA AAA GAC CTT CAA GCA CAA GTT GTT GAA TCA GCG AAG AAA GCG CGT ATT TCA GAA GCA ACA GAT GGC TTA TCT GAT TTC TTG AAA TCA CAA ACA CCT GCT GAA GAT ACT GTT AAA TCA ATT GAA TTA GCT GAA GCT AAA GTC TTA GCT AAC AGA GAA CTT GAC AAA TAT GGA GTA AGT GAC TAT TAC AAG AAC CTA ATC AAC AAT GCC AAA ACT GTT GAA GGT GTA AAA GCA CTG ATA GAT GAA ATT TTA GCT GCA TTA CCT AAG ACT GAC ACT TAC AAA TTA ATC CTT AAT GGT AAA ACA TTG AAA GGC GAA ACA ACT ACT GAA GCT GTT GAT GCT GCT ACT GCA AGA TCT TTC AAT TTC CCT ATC CTC GAG AAT TCC ATG ACC GTG AAA ACC AAA AAC ACC ACG ACC ACC CAG ACC CAG CCG AGC AAA CCG ACC ACC AAA CAG CGT CAG AAC AAA CCG CCG AAC AAA CCG AAC AAC GAT TTC CAT TTC GAA GTG TTC AAC TTC GTG CCG TGC AGC ATC TGC AGC AAC AAC CCG ACC TGC TGG GCG ATC TGC AAA CGT ATC CCG AAC AAA AAA CCG GGC AAA AAA ACC ACG ACC AAA CCG ACC AAA AAA CCG ACC TTC AAA ACC ACC AAA AAA GAT CAT AAA CCG CAG ACC ACC AAA CCG AAA GAA GTG CCG ACC ACC AAA CCG GTC GAC- TAA 3' Les ammoniums quaternaires aliphatiques et les protéines de fusions évoqués ci-dessus sont utiles pour la préparation d'un vaccin contre le virus respiratoire syncytial Un autre aspect de l'invention a trait à un produit de combinaison comprenant un ammonium quaternaire aliphatique de formule générale

dans laquelle RI, R2, R3, et R4 représentent un groupe alkyl linéaire ou ramifié, saturé ou insaturé, comprenant de 1 à 25 atomes de carbone, et X représente un ion halogène, et immunogène ou un antigène dérivé de la protéine G du virus respiratoire syncytial pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps Avantageusement, l'ammonium quaternaire aliphatique est le Diméthyl Dioctadécyl Ammonium sous forme de bromure (DDAB) ou de chlorure (DDAC) de formule :

Dans un mode particulier de mise en #uvre, ledit immunogène ou antigène comprend une séquence sélectionnée parmi les séquences ID N 1 à N 10. L'immunogène ou l'antigène peut être une protéine de fusion entre un fragment polypeptidique dérivé de la protéine G du virus respiratoire syncytial et un fragment polypeptidique dérivé de la protéine G du Streptocoque. Dans cette protéine de fusion, les fragments sont liés de manière covalente.

Le fragment polypeptidique dérivé de la protéine G du Streptocoque peut comprendre une séquence sélectionnée parmi les séquences ID N 11 et ID N 12.

La protéine de fusion préférée de l'invention comporte la séquence ID N 13 (protéine BBG2Na).

L'invention porte également sur l'utilisation d'un produit de combinaison tel que défini ci-dessus comme vaccin permettant de réorienter la réponse cellulaire Th2 d'un composé immunogène vers une réponse mixte Thl/Th2. Elle porte aussi sur leur utilisation pour la préparation d'un vaccin contre le virus respiratoire syncytial Légendes Figure lA . Immunogénicité de BBG2Na mélangé au DDA

Figure 1B : Orientation de la réponse immunitaire de BBG2Na mélangé au DDA.

Les exemples qui suivent sont destinés à illustrer l'invention sans aucunement en limiter la portée.

Exemple 1 : d'une protéine chimérique recombinante BBG2Na.

Cet exemple illustre l'obtention de BBG2Na recombinante à partir d'une culture de bactéries Escherichia coli, transformé par un vecteur plasmide d'expression, nommé pvaBBG2Na : le plasmide contient le gène codant pour l'Albumin binding domain de la protéine G du Streptocoque (BB) suivi par un fragment de 101 aa de la protéine G du VRS (Long strain) (aa 130 à aa 230), l'expression du gène est sous contrôle du promoteur de l'opéron tryptophane (trp). Dans un fermenteur équipé de sondes de régulation de t , de pH et de taux d'oxygénation, contenant 2 litres de milieu contenant (en g/l) : glycérol, 5 ; Sulfate d'ammonium, 2.6 ; de potassium, 3 ; hydrogénophosphate dipotassium, 2 ; de sodium 0.5 ; de levure, 1 ; Ampicilline, 0.1 ; Tétracycline 0.008 ; Thiamine, 0.07 ; de magnésium, 1 et 1 ml/l de solution de traces éléments et 0.65 ml/l de solution de vitamines.

L'alimentation de sources carbonées (Glycérol et/ou Glucose). Sont maintenus constants : le pH à 7.3 ; la température à 37 C , le signal de tension en Oxygène dissous à 30%. Lorsque la turbidité de la culture (à 580 nm) atteint la valeur de 80, l'expression de la protéine est induite par ajout de l'acide indole acrylique (IAA) à la concentration finale de 25 mg/l. Environ 3 heures après, les cellules sont récoltées par centrifugation. On obtient environ 150 g de biomasse humide par litre de culture.

On resuspend une fraction de biomasse (environ 30 g) dans une solution de TST (Tris- HCl 50mM pH 8.0, NaCI 200 mM, 0. 05 % Tween 20 et EDTA 0. 5 mM) On peut lyser les cellules soit par sonication soit par French press. Après centrifugation du lysat cellulaire, on filtre sur 1.2 m, les protéines solubles peuvent être purifiées directement sur colonne d'affinité, les protéines insolubles (corps d'inclusion) présentes en

majorité sont solubilisées dans 30 ml de Chlorhydrate de guanidine 7 M, Tris-HCI 25 mM (pH 8.5), Dithiotreitol (DTT) 10 mM, suivi d'une incubation à 37 C pendant 2 H On dilue le milieu avec un tampon de renaturation (Tris-HCI 25 mM (pH 8.5) , NaCl
150 mM et 0. 05 % Tween 20) afin d'arriver à ajuster en concentration finale 0.5M (HCI-Guanidine). Incubation à température ambiante sous agitation pendant 16 heures Après filtration, les protéines solubles sont purifiées soit par chromatographie d'affinité soit par chromatographie par échange d'ions.

Les exemples suivants illustrent de façon non exhaustive et non limitative, quelques modes de mises en #uvre de la préparation du mélange BBG2Na et Diméthyl Dioctadécyl Ammonium sous forme de bromure (DDAB) ou de chlorure (DDAC).

Exemple 2 : Préparation du mélange BBG2Na et DDA sous forme vesiculaire.

Le DDA est mis en suspension en NaCl 0. 9 %, PBS, ou autre tampon (de 0.01 mg/ml à 10 mg/ml) ou dans l'eau (de 0.01 mg/ml à 20 mg/ml), vortexé pendant 2 min, soniqué 10 min au bain à ultrasons et chauffé pendant 30 min à 62 C afin d'obtenir une solution limpide. La solution peut être laissée à température ambiante afin de permettre la formation des micelles, ou passée sur membranes filtrantes On ajoute ensuite une quantité adéquate d'une solution de BBG2Na solubilisé dans l'eau Cette solution est mise sous agitation.

La taille moyenne des vésicules de DDA ainsi obtenues varie entre 300 nm et 2000 nm en fonction de la quantité de DDA utilisée et du tampon de reprise La quantité de BBG2Na adsorbée mesurée par BCA (bicinchoninic acid) est de 100% à une concentration en DDA de 3 mg/ml.

Exemple 3: Préparation du mélange BBG2Na et DDA sous forme d'une suspension.

Le DDA est mis en suspension en PBS, NaCI 0. 9 % ou tout autre tampon (de 0.01 mg/ml à 40 mg/ml), vortexé 2 min, soniqué 20 min au bain à ultrasons On ajoute ensuite une quantité adéquate d'une solution de BBG2Na solubilisée dans l'eau Cette solution est mise sous agitation. La quantité de BBG2Na adsorbée mesurée par BCA est de 100% à une concentration en DDA de 3 mg/ml.

Exemple 4 : Préparation du mélange BBG2Na, mannitol et DDA sous forme de lyophilisât.

Le DDA est mis en suspension dans de l'eau (de 0.01 mg/ml à 20 mg/ml) La solution de DDA est chauffée pendant 30 min à 62 C. Elle est ensuite laissée à température ambiante. Lorsque la température est de 37 C environ, on ajoute une quantité adéquate d'une solution de BBG2Na solubilisé dans l'eau ainsi qu'une quantité adéquate de mannitol. Le mélange est ensuite congelé et lyophilisé. Le lyophilisat peut être repris dans de l'eau de qualité ppi (préparation pour injection) avant l'injection.

Exemple 5: Immunogénicité et orientation de la réponse immunitaire de BBG2Na mélangé au DDA.

Afin de tester l'immunogénicité de BBG2Na mélangée au DDA, des souris BALB/c ont été immunisées (J0, J14) avec 20ug de BBG2Na en intramusculaire mélangée à 400ug de DDA. Aucun anticorps anti-G2Na n'est détecté après immunisation avec BBG2Na seul. De manière surprenante, le DDA permet de potentialiser la réponse immunitaire anti-G2Na : un titre anticorps de 5 logIO est détecté après immunisation avec BBG2Na/DDA (Figure 1B). Le DDA est aussi efficace que l'hydroxyde d'aluminium pour induire une réponse anti-G2Na

L'analyse du rapport IgGl/IgG2a montre que BBG2Na induit une réponse de type Th2 en hydroxyde d'aluminium De manière intéressante, le profil de la réponse immunitaire obtenu avec BBG2Na plus DDA est de type Thl/Th2 (Figure 1B). Ces niveaux de réponses d'anticorps IgGl et IgG2a anti-G2Na se trouvent corrélés à une réponse similaire en anticorps anti-VRS qui protège contre une infection à VRS

LISTE DE SEQUENCES <110> Pierre Fabre Médicament <120> Utilisation d'ammoniums quaternaires aliphatiques pour induire une réponse mixte Thl/Th2 <130> D18378 <160> 23 <170> PatentIn Vers. 2.0 <210> 1 <211> 101 <212> PRT <213> Virus syncytial respiratoire (VRS) humain.

<220> <223> G2NA <400> 1 Thr Val Lys Thr Lys Asn Thr Thr Thr Thr Gln Thr Gln Pro Ser Lys
1 5 10 15 Pro Thr Thr Lys Gln Arg Gln Asn Lys Pro Pro Asn Lys Pro Asn Asn
20 25 30 Asp Phe His Phe Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Cys Ser Ile Cys Ser
35 40 45 Asn Asn Pro Thr Cys Trp Ala Ile Cys Lys Arg Ile Pro Asn Lys Lys
50 55 60 Pro Gly Lys Lys Thr Thr Thr Lys Pro Thr Lys Lys Pro Thr Phe Lys
65 70 75 80 Thr Thr Lys Lys Asp His Lys Pro Gln Thr Thr Lys Pro Lys Glu Val
85 90 95 Pro Thr Thr Lys Pro
100 <210> 2 <211> 101 <212> PRT <213> Virus syncytial respiratoire (VRS) humain.

<220> <223> G2NB <400> 2 Thr Ala Gln Thr Lys Gly Arg Ile Thr Thr Ser Thr Gln Thr Asn Lys
1 5 10 15

Pro Ser Thr Lys Ser Arg Ser Lys Asn Pro Pro Lys Lys Pro Lys Asp
20 25 30 Asp Tyr His Phe Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Cys Ser Ile Cys Gly
35 40 45 Asn Asn Gln Leu Cys Lys Ser Ile Cys Lys Thr Ile Pro Ser Asn Lys
50 55 60 Pro Lys Lys Lys Pro Thr Ile Lys Pro Thr Asn Lys Pro Thr Thr Lys
65 70 75 80 Thr Thr Asn Lys Arg Asp Pro Lys Thr Pro Ala Lys Met Pro Lys Lys
85 90 95 Glu Ile Ile Thr Asn
100 <210> 3 <211> 17 <212> PRT <213> Virus syncytial respiratoire (VRS) humain.

<220> <223> G4A <400> 3 Val Pro Cys Ser Ile Cys Ser Asn Asn Pro Thr Cys Trp Ala Ile Cys 1 5 10 15 Lys <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> Virus syncytial respiratoire (VRS) humain.

<220> <223> G4A delta C <400> 4 Val Pro Ser Ser Ile Cys Ser Asn Asn Pro Thr Cys Trp Ala Ile Ser
1 5 10 15 Lys <210> 5 <211> 17 <212> PRT

<213> Virus syncytial respiratoire (VRS) humain.

<220> <223> G4B <400> 5 Val Pro Cys Ser Ile Cys Gly Asn Asn Gln Leu Cys Lys Ser Ile Cys
1 5 10 15 Lys <210> 6 <211> 17 <212> PRT <213> Virus syncytial respiratoire (VRS) humain.

<220> <223> Xaa signifie Orn.

<220> <223> G4'A <400> 6 Val Pro Asp Ser Ile Asp Ser Asn Asn Pro Thr Xaa Trp Ala Ile Xaa
1 5 10 15 Lys <210> 7 <211> 17 <212> PRT <213> Virus syncytial respiratoire (VRS) humain.

<220> <223> Xaa signifie Orn.

<220> <223> G4'B <400> 7 Val Pro Asp Ser Ile Asp Gly Asn Asn Gln Leu Xaa Lys Ser Ile Xaa
1 5 10 15 Lys <210> 8 <211> 101 <212> PRT <213> Virus syncytial respiratoire (VRS) bovin.

<220> <223> G2V <400> 8 Gln Asn Arg Lys Ile Lys Gly Gln Ser Thr Leu Pro Ala Thr Arg Lys
1 5 10 15 Pro Pro Ile Asn Pro Ser Gly Ser Ile Pro Pro Glu Asn His Gln Asp
20 25 30 His Asn Asn Phe Gln Thr Leu Pro Tyr Val Pro Cys Ser Thr Cys Glu
35 40 45 Gly Asn Leu Ala Cys Leu Ser Leu Cys His Ile Glu Thr Glu Arg Ala
50 55 60 Pro Ser Arg Ala Pro Thr Ile Thr Leu Lys Lys Thr Pro Lys Pro Lys
65 70 75 80 Thr Thr Lys Lys Pro Thr Lys Thr Thr Ile His His Arg Thr Ser Pro
85 90 95 Glu Thr Lys Leu Gln
100 <210> 9 <211> 17 <212> PRT <213> Virus syncytial respiratoire (VRS) bovin.

<220> <223> G4V <400> 9 Val Pro Cys Ser Thr Cys Glu Gly Asn Leu Ala Cys Leu Ser Leu Cys
1 5 10 15 His <210> 10 <211> 17 <212> PRT <213> Virus syncytial respiratoire (VRS) bovin.

<220> <223> G4'V <220> <223> Xaa signifie Orn.

<400> 10

Val Pro Asp Ser Thr Asp Glu Gly Asn Leu Ala Xaa Leu Ser Leu Xaa
1 5 10 15 His <210> 11 <211> 219 <212> PRT <213> Streptocoque.

<220> <223> BB <400> 11 Lys Tyr Gly Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Leu Ile Asn Asn Ala Lys 1 5 10 15 Thr Val Glu Gly Val Lys Asp Leu Gln Ala Gln Val Val Glu Ser Ala
20 25 30 Lys Lys Ala Arg Ile Ser Glu Ala Thr Asp Gly Leu Ser Asp Phe Leu
35 40 45 Lys Ser Gln Thr Pro Ala Glu Asp Thr Val Lys Ser Ile Glu Leu Ala
50 55 60 Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly Val Ser
65 70 75 80 Asp Tyr His Lys Asn Leu Ile Asn Asn Ala Lys Thr Val Glu Gly Val
85 90 95 Lys Asp Leu Gln Ala Gln Val Val Glu Ser Ala Lys Lys Ala Arg Ile
100 105 110 Ser Glu Ala Thr Asp Gly Leu Ser Asp Phe Leu Lys Ser Gln Thr Pro
115 120 125 Ala Glu Asp Thr Val Lys Ser Ile Glu Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu
130 135 140 Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn 145 150 155 160 Leu Ile Asn Asn Ala Lys Thr Val Glu Gly Val Lys Ala Leu Ile Asp
165 170 175 Glu Ile Leu Ala Ala Leu Pro Lys Thr Asp Thr Tyr Lys Leu Ile Leu
180 185 190 Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Glu Ala Val Asp Ala
195 200 205

Ala Thr Ala Arg Ser Phe Asn Phe Pro Ile Leu
210 215 <210> 12 <211> 108 <212> PRT <213> Streptocoque.

<220> <223> delta BB <400> 12 Lys Tyr Gly Val Ser Asp Tyr His Lys Asn Leu Ile Asn Asn Ala Lys 1 5 10 15 Thr Val Glu Gly Val Lys Asp Leu Gln Ala Gln Val Val Glu Ser Ala
20 25 30 Lys Lys Ala Arg Ile Ser Glu Ala Thr Asp Gly Leu Ser Asp Phe Leu
35 40 45 Lys Ser Gln Thr Pro Ala Glu Asp Thr Val Lys Ser Ile Glu Leu Ala
50 55 60 Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly Val Ser
65 70 75 80 Asp Tyr Tyr Lys Asn Leu Ile Asn Asn Ala Lys Thr Val Glu Gly Val
85 90 95 Lys Ala Leu Ile Asp Glu Ile Leu Ala Ala Leu Pro
100 105 <210> 13 <211> 349 <212> PRT <213> Protéine BBG2Na.

<220> <223> BBG2Na <400> 13 Met Lys Ala Ile Phe Val Leu Asn Ala Gln His Asp Glu Ala Val Asp
1 5 10 15 Ala Asn Phe Asp Gln Phe Asn Lys Tyr Gly Val Ser Asp Tyr Tyr Lys
20 25 30 Asn Leu Ile Asn Asn Ala Lys Thr Val Glu Gly Val Lys Asp Leu Gln
35 40 45 Ala Gln Val Val Glu Ser Ala Lys Lys Ala Arg Ile Ser Glu Ala Thr
50 55 60

Asp Gly Leu Ser Asp Phe Leu Lys Ser Gln Thr Pro Ala Glu Asp Thr
65 70 75 80 Val Lys Ser Ile Glu Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu
85 90 95 Leu Asp Lys Tyr Gly Val Ser Asp Tyr His Lys Asn Leu Ile Asn Asn
100 105 110 Ala Lys Thr Val Glu Gly Val Lys Asp Leu Gln Ala Gln Val Val Glu
115 120 125 Ser Ala Lys Lys Ala Arg Ile Ser Glu Ala Thr Asp Gly Leu Ser Asp
130 135 140 Phe Leu Lys Ser Gln Thr Pro Ala Glu Asp Thr Val Lys Ser Ile Glu 145 150 155 160 Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly
165 170 175 Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Leu Ile Asn Asn Ala Lys Thr Val Glu
180 185 190 Gly Val Lys Ala Leu Ile Asp Glu Ile Leu Ala Ala Leu Pro Lys Thr
195 200 205 Asp Thr Tyr Lys Leu Ile Leu Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr
210 215 220 Thr Thr Glu Ala Val Asp Ala Ala Thr Ala Arg Ser Phe Asn Phe Pro 225 230 235 240 Ile Leu Glu Asn Ser Met Thr Val Lys Thr Lys Asn Thr Thr Thr Thr
245 250 255 Gln Thr Gln Pro Ser Lys Pro Thr Thr Lys Gln Arg Gln Asn Lys Pro
260 265 270 Pro Asn Lys Pro Asn Asn Asp Phe His Phe Glu Val Phe Asn Phe Val
275 280 285 Pro Cys Ser Ile Cys Ser Asn Asn Pro Thr Cys Trp Ala Ile Cys Lys
290 295 300 Arg Ile Pro Asn Lys Lys Pro Gly Lys Lys Thr Thr Thr Lys Pro Thr 305 310 315 320 Lys Lys Pro Thr Phe Lys Thr Thr Lys Lys Asp His Lys Pro Gln Thr
325 330 335 Thr Lys Pro Lys Glu Val Pro Thr Thr Lys Pro Val Asp
340 345

<210> 14 <211> 303 <212> ADN <213> Virus syncytial respiratoire (VRS) humain.

<220> <223> La séquence SEQ ID n 1 peut être codée par la séquence SEQ ID n 14.

<400> 14 accgtgaaaa ccaaaaacac cacgaccacc cagacccagc cgagcaaacc gaccaccaaa 60 cagcgtcaga acaaaccgcc gaacaaaccg aacaacgatt tccatttcga agtgttcaac 120 ttcgtgccgt gcagcatctg cagcaacaac ccgacctgct gggcgatctg caaacgtatc 180 ccgaacaaaa aaccgggcaa aaaaaccacg accaaaccga ccaaaaaacc gaccttcaaa 240 accaccaaaa aagatcataa accgcagacc accaaaccga aagaagtgcc gaccaccaaa 300 ccg 303 <210> 15 <211> 303 <212> ADN <213> Virus syncytial respiratoire (VRS) humain.

<220> <223> La séquence SEQ ID n 2 peut être codée par la séquence SEQ ID n 15.

<400> 15 accgcgcaga ccaaaggccg tatcaccacc agcacccaga ccaacaaacc gagcaccaaa 60 agccgtagca aaaacccgcc gaaaaaaccg aaagatgatt accacttcga agtgttcaac 120 ttcgtgccct gcagcatctg cggcaacaac cagctgtgca aaagcatctg caaaaccatc 180 ccgagcaaca aaccgaaaaa gaaaccgacc atcaaaccga ccaacaaacc gaccaccaaa 240 accaccaaca aacgtgatcc gaaaaccccg gcgaaaatgc cgaagaagga aatcatcacc 300 aac 303 <210> 16 <211> 51 <212> ADN <213> Virus syncytial respiratoire (VRS) humain.

<220> <223> La séquence SEQ ID n 3 peut être codée par la séquence SEQ ID n 16.

<400> 16 gtgccgtgca gcatctgcag caacaacccg acctgctggg cgatctgcaa a 51 <210> 17 <211> 51 <212> ADN <213> Virus syncytial respiratoire (VRS) humain.

<220> <223> La séquence SEQ ID n 4 peut être codée par la séquence SEQ ID n 17.

<400> 17 gtgccgagca gcatctgcag caacaacccg acctgctggg cgatcagcaa a 51 <210> 18 <211> 51 <212> ADN <213> Virus syncytial respiratoire (VRS) humain.

<220> <223> La séquence SEQ ID n 5 peut être codée par la séquence SEQ ID n 18.

<400> 18 gtgccctgca gcatctgcgg caacaaccag ctgtgcaaaa gcatctgcaa a 51 <210> 19 <211> 303 <212> ADN <213> Virus syncytial respiratoire (VRS) bovin.

<220> <223> La séquence SEQ ID n 8 peut être codée par la séquence SEQ ID n 19.

<400> 19 caaaacagaa aaatcaaagg tcaatcaaca ctaccagcca caagaaaacc accaattaat 60 ccatcaggaa gcatcccacc agaaaaccat caagaccaca acaacttcca aacactcccc 120 tatgttccct gcagtacatg tgaaggtaat cttgcatgct tatcactctg ccatattgag 180 acggaaagag caccaagcag agcaccaaca atcaccctca aaaagacacc aaaaccaaaa 240 accacaaaaa agccaaccaa gacaacaatc catcacagaa ccagcccaga aaccaaactg 300 caa 303 <210> 20 <211> 51 <212> ADN <213> Virus syncytial respiratoire (VRS) bovin.

<220> <223> La séquence SEQ ID n 9 peut être codée par la séquence SEQ ID n 20.

<400> 20 gttccctgca gtacatgtga aggtaatctt gcatgcttat cactctgcca t 51 <210> 21 <211> 657 <212> ADN <213> Streptocoque <220> <223> La séquence SEQ ID n 11 peut être codée par la séquence SEQ ID n 21.

<400> 21

aaatatggag taagtgacta ttacaagaat ctaatcaaca atgccaaaac tgttgaaggc 60 gtaaaagacc ttcaagcaca agttgttgaa tcagcgaaga aagcgcgtat ttcagaagca 120 acagatggct tatctgattt cttgaaatca caaacacctg ctgaagatac tgttaaatca 180 attgaattag ctgaagctaa agtcttagct aacagagaac ttgacaaata tggagtaagt 240 gactatcaca agaacctaat caacaatgcc aaaactgttg aaggtgtaaa agaccttcaa 300 gcacaagttg ttgaatcagc gaagaaagcg cgtatttcag aagcaacaga tggcttatct 360 gatttcttga aatcacaaac acctgctgaa gatactgtta aatcaattga attagctgaa 420 gctaaagtct tagctaacag agaacttgac aaatatggag taagtgacta ttacaagaac 480 ctaatcaaca atgccaaaac tgttgaaggt gtaaaagcac tgatagatga aattttagct 540 gcattaccta agactgacac ttacaaatta atccttaatg gtaaaacatt gaaaggcgaa 600 acaactactg aagctgttga tgctgctact gcaagatctt tcaatttccc tatcctc 657 <210> 22 <211> 324 <212> ADN <213> Streptocoque <220> <223> La séquence SEQ ID n 12 peut être codée par la séquence SEQ ID n 22.

<400> 22 aaatatggag taagtgacta tcacaagaac ctaatcaaca atgccaaaac tgttgaaggt 60 gtaaaagacc ttcaagcaca agttgttgaa tcagcgaaga aagcgcgtat ttcagaagca 120 acagatggct tatctgattt cttgaaatca caaacacctg ctgaagatac tgttaaatca 180 attgaattag ctgaagctaa agtcttagct aacagagaac ttgacaaata tggagtaagt 240 gactattaca agaacctaat caacaatgcc aaaactgttg aaggtgtaaa agcactgata 300 gatgaaattt tagctgcatt acct 324 <210> 23 <211> 1050 <212> ADN <213> Protéine BBG2Na <220> <223> La séquence SEQ ID n 13 peut être codée par la séquence SEQ ID n 23.

<400> 23 atgaaagcaa ttttcgtact gaatgcgcaa cacgatgaag ccgtagacgc gaatttcgac 60 caattcaaca aatatggagt aagtgactat tacaagaatc taatcaacaa tgccaaaact 120 gttgaaggcg taaaagacct tcaagcacaa gttgttgaat cagcgaagaa agcgcgtatt 180 tcagaagcaa cagatggctt atctgatttc ttgaaatcac aaacacctgc tgaagatact 240 gttaaatcaa ttgaattagc tgaagctaaa gtcttagcta acagagaact tgacaaatat 300 ggagtaagtg actatcacaa gaacctaatc aacaatgcca aaactgttga aggtgtaaaa 360 gaccttcaag cacaagttgt tgaatcagcg aagaaagcgc gtatttcaga agcaacagat 420 ggcttatctg atttcttgaa atcacaaaca cctgctgaag atactgttaa atcaattgaa 480 ttagctgaag ctaaagtctt agctaacaga gaacttgaca aatatggagt aagtgactat 540 tacaagaacc taatcaacaa tgccaaaact gttgaaggtg taaaagcact gatagatgaa 600 attttagctg cattacctaa gactgacact tacaaattaa tccttaatgg taaaacattg 660 aaaggcgaaa caactactga agctgttgat gctgctactg caagatcttt caatttccct 720 atcctcgaga attccatgac cgtgaaaacc aaaaacacca cgaccaccca gacccagccg 780 agcaaaccga ccaccaaaca gcgtcagaac aaaccgccga acaaaccgaa caacgatttc 840 catttcgaag tgttcaactt cgtgccgtgc agcatctgca gcaacaaccc gacctgctgg 900 gcgatctgca aacgtatccc gaacaaaaaa ccgggcaaaa aaaccacgac caaaccgacc 960

aaaaaaccga ccttcaaaac caccaaaaaa gatcataaac cgcagaccac caaaccgaaa 1020 gaagtgccga ccaccaaacc ggtcgactaa 1050

Claims

dans laquelle RI, R2, R3, et R4 représentent un groupe alkyl linéaire ou ramifié, saturé ou insaturé, comprenant de 1 à 25 atomes de carbone, et X représente un ion halogène, en association avec un immunogène ou antigène pour améliorer l'immunogénicité et pour obtenir une réponse immunitaire équilibrée de type Thl/Th2 pour ledit immunogène ou antigène.

REVENDICATIONS 1 Utilisation d'ammoniums quaternaires aliphatiques de formule générale
2 Utilisation selon la revendication 1 caractérisée en ce que l'ammonium quaternaire aliphatique est le Diméthyl Dioctadécyl Ammonium sous forme de bromure (DDAB) ou de chlorure (DDAC) de formule :
3. Utilisation selon l'une des revendications 1 et 2 caractérisée en ce que ledit immunogène ou antigène est dérivé de la protéine G du virus respiratoire syncytial
4. Utilisation selon l'une des revendications 1 et 3 caractérisée en ce que ledit immunogène ou antigène comprend une séquence sélectionnée parmi les séquences ID N 1 à N 10 5 Utilisation selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisée en ce que l'immunogène ou l'antigène est une protéine de fusion entre un fragment polypeptidique dérivé de la

<Desc/Clms Page number 29>

protéine G du virus respiratoire syncytial et un fragment polypeptidique dérivé de la protéine G du Streptocoque.

6. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisée en ce que les fragments sont liés de manière covalente.

7. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 6 caractérisée en ce que le fragment polypeptidique dérivé de la protéine G du Streptocoque comprend une séquence sélectionnée parmi les séquences ID N 11 et ID N 12.

8. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 7 caractérisée en ce que la protéine de fusion comporte la séquence ID N 13 (protéine BBG2Na).

9. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 8 pour la préparation d'un vaccin contre le virus respiratoire syncytial.

dans laquelle RI, R2, R3, et R4 représentent un groupe alkyl linéaire ou ramifié, saturé ou insaturé, comprenant de 1 à 25 atomes de carbone, et X représente un ion halogène, et immunogène ou un antigène dérivé de la protéine G du virus respiratoire syncytial pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps 11 Produit de combinaison selon la revendication 10 caractérisé en ce que l'ammonium quaternaire aliphatique est le Diméthyl Dioctadécyl Ammonium sous forme de bromure (DDAB) ou de chlorure (DDAC) de formule -

10. Produit de combinaison comprenant un ammonium quaternaire aliphatique de formule générale :

<Desc/Clms Page number 30>

12. Produit de combinaison selon l'une des revendications 10 et Il caractérisé en ce que ledit immunogène ou antigène comprend une séquence sélectionnée parmi les séquences ID N 1 à N 10.

13. Produit de combinaison selon l'une des revendications 10 à 12 caractérisé en ce que l'immunogène ou l'antigène est une protéine de fusion entre un fragment polypeptidique dérivé de la protéine G du virus respiratoire syncytial et un fragment polypeptidique dérivé de la protéine G du Streptocoque.

14. Produit de combinaison selon l'une des revendications 10 à 13 caractérisé en ce que les fragments sont liés de manière covalente.

15. Produit de combinaison selon l'une des revendications 10 à 14 caractérisé en ce que le fragment polypeptidique dérivé de la protéine G du Streptocoque comprend une séquence sélectionnée parmi les séquences ID N 11 et ID N 12.

16. Produit de combinaison selon l'une des revendications 10 à 15caractérisé en ce que la protéine de fusion comporte la séquence ID N 13 (protéine BBG2Na) 17. Utilisation d'un produit de combinaison selon l'une des revendications 10 à 16 comme vaccin permettant de réorienter la réponse cellulaire Th2 d'un composé immunogène vers une réponse mixte Thl/Th2 18 Utilisation d'un produit de combinaison selon l'une des revendications 10 à 17 pour la préparation d'un vaccin contre le virus respiratoire syncytial