FR2797888A1 - Procede de detection de l'expression d'une proteine d'enveloppe d'un retrovirus endogene humain et utilisations d'un gene codant pour cette proteine - Google Patents
Procede de detection de l'expression d'une proteine d'enveloppe d'un retrovirus endogene humain et utilisations d'un gene codant pour cette proteine Download PDFInfo
- Publication number
- FR2797888A1 FR2797888A1 FR9911141A FR9911141A FR2797888A1 FR 2797888 A1 FR2797888 A1 FR 2797888A1 FR 9911141 A FR9911141 A FR 9911141A FR 9911141 A FR9911141 A FR 9911141A FR 2797888 A1 FR2797888 A1 FR 2797888A1
- Authority
- FR
- France
- Prior art keywords
- protein
- cells
- gene
- polypeptide
- expression
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/10022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Le procédé de détection de l'expression d'une protéine ou d'un polypeptide d'enveloppe d'un rétrovirus endogène humain, est caractérisé en ce que la protéine ou le polypeptide présente une séquence polypeptidique qui comprend la séquence SEQ ID NO : 1 ou un fragment de SEQ ID NO : 1 ou une séquence présentant, pour toute suite de 20 acides aminés, au moins 90% d'identité avec la séquence SEQ ID NO : I ou avec un fragment de SEQ ID NO : 1, et en ce qu'on détecte le pouvoir fusogène de ladite protéine ou dudit fragment dans des cellules d'un tissu cellulaire ou d'une culture cellulaire, par la mise en évidence de la formation de syncytia.On utilise un gène ou un acide nucléique ou un fragment de ceux-ci pour préparer une composition thérapeutique ou prophylactique, notamment pour traiter des cancers et prévenir une déficience dans l'élaboration du placenta.
Description
<Desc/Clms Page number 1>
Les rétrovirus sont des virus enveloppés qui portent des spicules glycoprotéiques codées par les virus à leur surface. Ces glycoprotéines d'enveloppe sont synthétisées sous la forme de précurseurs polyprotéiques (Pré-env) qui sont ensuite clivés par des protéases cellulaires en protéine de surface mature (SU) et en protéine transmembranaire (TM). Les glycoprotéines d'enveloppe sont impliquées dans l'entrée des virus dans les cellules hôte. Elles reconnaissent spécifiquement et se lient à des récepteurs de surface cellulaire et sont nécessaires pour la fusion de l'enveloppe virale et des membranes cellulaires de l'hôte. Pour tous les virus enveloppés, les interactions des glycoprotéines d'enveloppe avec le ou les récepteur (s) conduisent à des réarrangements conformationnels de l'enveloppe nécessaires à l'exposition du peptide de fusion. La fusion a lieu à la surface de la cellule ou dans des vésicules cellulaires suivant la voie d'endocytose du virion. De plus, pour permettre l'entrée du virus, une fusion médiée par les protéines de surface virales peut, dans certaines conditions, provoquer une fusion cellule à cellule avec pour résultat la formation de cellules multinucléées géantes ou syncytia. La formation de syncytia est réalisée par au moins deux voies : un virion peut simultanément fusionner avec deux cellules, on parle alors de fusion from without , ou une cellule infectée qui exprime les glycoprotéines d'enveloppe à sa surface peut fusionner avec une cellule adjacente (fusion from within ).
Les déterminants de l'enveloppe et la séquence des événements causant les changements conformationnels de l'enveloppe lors des processus de fusion from without sont bien documentés pour les orthomyxovirus qui nécessitent un environnement acide des vésicules d'endocytose pour leur entrée (Skehel, J. J. et al., PNAS, 79 :968-972 (1982)). Pour les rétrovirus, pour lesquels la voie d'entrée est indépendante du pH, les déterminants précis et les étapes, menant de la reconnaissance du récepteur à l'activation de la fusion ne sont pas encore élucidés. D'autres rétrovirus sont connus pour induire une fusion cellule à cellule ( fusion from within ), tels que le virus de la leucémie féline, le virus de la tumeur mammaire de la souris, le virus de la réticuloendothéliose aviaire, VIH et SIV.
Par ailleurs, Fefferey S. Jones et Rex Risser ( Journal of Virology, Janv.
1993, p 67-74) ont montré que les glycoprotéines d'enveloppe du virus de la leucémie murine écotrope (MuLV) de type sauvage, sous la dépendance du LTR viral, étaient capables d'induire la formation de syncytia dans des cellules de rat XC en l'absence de virion (fusion from within ).
<Desc/Clms Page number 2>
De la connaissance des inventeurs, il n'a jamais été montré de pouvoir fusogène, dans un processus de fusion from within , des glycoprotéines d'enveloppe d'un rétrovirus endogène humain.
Des auteurs ont bien émis l'hypothèse que l'enveloppe rétrovirale endogène de ERV3, un rétrovirus endogène humain proche de MLV (Moloney Leukemia Virus), pouvait être impliquée in vivo dans l'élaboration du placenta via un processus de fusion (Patrick J. W. Venables et al., Virology, 211,589-592 (1995)) mais ce phénomène n'a jamais été démontré in vitro. D'autre part, les études sur le polymorphisme de env ERV3, sur des individus d'origine caucasienne, ont permis de mettre en évidence la présence d'une mutation dans la région (SU) de l'enveloppe ERV3 générant un codon stop précoce présent à l'état homozygote dans 1% de la population étudiée, sans que ces individus présentent d'anomalie de la grossesse ou du développement placentaire (Nathalie de Parseval et Thierry Heidmann, Journal of Virology, Vol ; 72, N 4, pages 3442-3445 (1998)).
Les présents inventeurs ont maintenant mis en évidence in vitro que la protéine d'enveloppe de HERV-W non modifiée, exprimée sous la dépendance d'un promoteur hétérologue possède des propriétés fusogènes.
HERV-W est une famille de rétrovirus endogènes humains multi-copie récemment décrite, dénommée ainsi en raison de l'homologie entre le site de fixation de l'amorce de la transcription inverse et celle des rétrovirus aviaires utilisant l'ARNt Trp. Aucune entité compétente pour sa réplication n'a été mise en évidence. La fonctionnalité d'une région promotrice a été vérifiée et, parmi différents tissus humains sains testés, son expression semble être restreinte au placenta (J. L Blond et al., Journal of Virology, Vol. 73, N 2, pages 1175-1185 (1999)). Un cadre ouvert de lecture unique codant pour une enveloppe rétrovirale potentiellement fonctionnelle existe sur le chromosome 7. Un transcrit sous génomique portant la séquence de l'enveloppe complète a été isolé à partir de matériel placentaire (clone cl.PH74, GenBank AF072506, dont la séquence est identifiée par SEQID NO :1). Les études phylogénétiques effectuées au niveau protéique indiquent que la protéine d'enveloppe est de type D. La séquence SEQ ID NO : 2 donnée en fin de description correspond à la séquence nucléotidique en ADNc complète du clone cl.PH74 dont la séquence protéique est identifiée par SEQ ID NO :1.
Env HERV-W possède tous les attributs d'une enveloppe rétrovirale : en particulier, un peptide leader, les deux sous unités caractéristiques SU et TM séparées par un site de clivage par les furines et, au niveau de sa TM, elle possède un peptide de fusion hydrophobe, une région immunosuppressive et une région carboxyl
<Desc/Clms Page number 3>
transmembranaire suivie d'une queue cytoplasmique longue. L'expression de Env HERV-W a été mise en évidence dans le placenta.
Les expériences réalisées par les inventeurs montrent que Env HERV-W entraîne, par fusion de cellule à cellule, la formation de syncytia dans différentes lignées cellulaires testées d'origine humaine et simienne. Le phénomène de fusion observé est dépendant de la reconnaissance de récepteur (s) comme montré de manière directe lors de transfections et de manière indirecte lors de cocultures des cellules transfectées avec d'autres types cellulaires.
Aussi la présente invention a pour objet un procédé de détection de l'expression d'une protéine ou d'un polypeptide d'enveloppe d'un rétrovirus endogène humain, selon lequel la protéine ou le polypeptide présente une séquence polypeptidique qui comprend la séquence SEQ ID NO:1 ou un fragment de SEQ ID NO :1, ou une séquence présentant, pour toute suite de 20 acides aminés, au moins 90% d'identité avec la séquence SEQ ID NO:1ou avec un fragment de SEQ ID NO :1, et selon lequel on détecte le pouvoir fusogène de ladite protéine ou dudit fragment dans des cellules d'un tissu cellulaire ou d'une culture cellulaire, par la mise en évidence de la formation de syncytia.
Un autre objet de l'invention est un procédé de détection de l'expression d'une protéine ou d'un polypeptide d'enveloppe d'un rétrovirus endogène humain, selon lequel la protéine ou le polypeptide présente une séquence polypeptidique présentant, pour toute suite de 20 acides aminés, au moins 90% d'identité avec la séquence SEQ ID NO:1, et selon lequel on détecte le pouvoir fusogène de ladite protéine dans des cellules d'un tissu cellulaire, ou d'une culture cellulaire par la mise en évidence de la formation de syncytia.
Selon l'invention, ladite protéine ou ledit polypeptide présente une séquence polypeptidique qui comprend la séquence SEQ ID NO : 1 ou un fragment de SEQ ID NO : :1, ou une séquence présentant, pour toute suite de 20 acides aminés, au moins 80%, de préférence au moins 90%, ou encore au moins 95%, d'identité avec la séquence SEQ ID NO:1ou avec un fragment de SEQ ID NO :1.
Il est bien entendu selon la présente invention, que ladite protéine ou ledit polypeptide, ou leurs dits fragments, s'ils ne présentent pas une identité complète avec SEQ ID NO : 1 ou ses fragments, doivent posséder un pouvoir fusogène, de préférence au moins égal ou supérieur à celui de SEQ ID NO : 1 ou ses fragments.
Les variations prévues selon l'invention dans la séquence polypeptidique de la protéine ou du polypeptide ou de leurs fragments comprennent les variations liées au polymorphisme, mais aussi les modifications telles que substitution (s), et
<Desc/Clms Page number 4>
addition (s) susceptibles d'être apportées à ladite séquence polypeptidique pour obtenir une protéine, un polypeptide ou un fragment de ceux-ci possédant un pouvoir fusogène, en particulier au moins égal ou supérieur à celui de SEQ ID NO :1 ou ses fragments.
Si les fragments de la protéine ou du polypeptide de l'invention présentent une identité complète avec les fragments de SEQIDNO :1, alors la taille de ces fragments peut être inférieure à 20 acides aminés, par exemple elle peut être d'environ 10 acides aminés, voire d'environ 5 acides aminés.
De manière préférentielle, ladite protéine présente au moins l'une des caractéristiques suivantes : - elle est codée par le gène env du rétrovirus endogène HERV-W ; - elle est codée par un cadre de lecture ouvert situé sur le chromosome 7 du génome humain ; - elle présente une séquence polypeptidique qui consiste en
SEQ ID NO :1.
SEQ ID NO :1.
Les cellules dudit tissu ou de ladite culture cellulaire dans lesquelles on recherche à mettre en évidence le pouvoir fusogène sont avantageusement choisies parmi les cellules osseuses, les cellules musculaires, les cellules placentaires, les cellules endothéliales, en particulier des vaissaux sanguins, les cellules épithéliales, les cellules gliales et les cellules tumorales ou issues de lignées cellulaires tumorales.
Comme cela sera illustré dans l'exemple qui suivra, la détection du pouvoir fusogène de ladite protéine peut être mise en oeuvre selon au moins l'un quelconque des deux protocoles suivants.
Selon un premier protocole, on obtient un vecteur d'expression de ladite protéine à partir duquel l'expression de la protéine ou de son gène est sous la dépendance d'un promoteur ; on transfecte des cellules par le vecteur obtenu pour obtenir des cellules productrices, exprimant à leur surface ladite protéine ; et on observe la formation de syncytia ou l'absence de formation de syncytia.
Selon un second protocole, on obtient un vecteur d'expression de ladite protéine à partir duquel l'expression de la protéine ou de son gène est sous la dépendance d'un promoteur ; on transfecte des cellules par le vecteur obtenu pour obtenir des cellules productices, exprimant à leur surface ladite protéine ; on cultive des cellules naïves indicatrices exprimant à leur surface un récepteur de ladite protéine en présence desdites cellules productices ; et on observe la formation de syncytia ou l'absence de formation de syncytia.
La présente invention concerne en outre l'utilisation d'un gène ou d'un acide nucléique ou d'un fragment de gène ou d'un acide nucléique codant pour une
<Desc/Clms Page number 5>
protéine ou un polypeptide tels que définis précédemment dans la description des procédés objets de l'invention, dans des conditions appropriées permettant son expression, pour préparer une composition thérapeutique ou prophylactique.
Un autre objet de l'invention est une composition thérapeutique ou prophylactique comprenant un gène ou un acide nucléique ou un fragment de gène ou d'acide nucléique codant pour une protéine ou un polypeptide tels que définis précédemment.
Une telle composition peut comprendre en outre un promoteur hétérologue ou autologue, de préférence hétérologue, pour l'expression de ladite protéine ou dudit polypeptide.
L'invention concerne aussi les objets suivants : - un vecteur d'expression comprenant au moins un gène ou un acide nucléique ou un fragment de gène ou d'acide nucléique codant pour une protéine ou un polypeptide tels que définis précédemment, et des éléments nécessaires à son expression dans une cellule hôte ; - une cellule hôte comprenant au moins un vecteur de l'invention, et - une composition thérapeutique ou prophylactique comprenant au moins un vecteur d'expression ou une cellule hôte de l'invention.
Les différentes compositions thérapeutiques de l'invention sont en particulier destinée au traitement de cancers, tel que par destruction des cellules cancéreuses au moyen de la formation de syncytia. Les différentes compositions prophylactiques de l'invention sont notamment destinées à prévenir une déficience dans l'élaboration du placenta.
Les compositions de l'invention sont avantageusement destinées à un traitement par thérapie génique.
L'invntion concerne aussi un procédé pour la sélection de drogues ou substances médicamenteuses ou de systèmes gène/pro-drogue susceptibles d'intervenir qualitativement et/ou quantitativement sur le pouvoir fusogène d'une protéine ou d'un poypeptide tel que défini précédemment. Selon ce procédé, on met en contact ladite drogue ou substance médicamenteuse ou ledit système gène/pro-drogue avec des cellules d'une culture cellulaire exprimant ladite protéine ou ledit polypeptide et, on observe une régression ou une disparition dans la formation de syncytia.
Comme énoncé ci-dessus, les propriétés fusogènes de la protéine Env HERV-W, du polypeptide Env HERV-W ou de leurs fragments tels que définis dans la présente invention trouvent notamment une application dans le domaine de la thérapie génique des cancers.
<Desc/Clms Page number 6>
A ce jour les gènes les plus fréquemment utilisés dans la thérapie contre les cancers sont (i) les gènes qui codent pour des protéines qui augmentent l'immunogénicité des cellules tumorales, telles que les cytokines pro-inflamatoires, (ii) les gènes qui codent pour des enzymes qui rendent les cellules cancéreuses sensibles à un pro-médicament dans des systèmes gène/pro-drogue, tels que le système thymidine kinase du virus Herpes Simplex/Ganciclovir ou le système cytosine désaminase/5FC.
De manière idéale, le transfert de gènes thérapeutiques devrait conduire à la fois à une destruction locale des cellules cancéreuses, à l'activation de l'immunité anti-tumorale pour éliminer les zones tumorales auxquelles les gènes thérapeutiques ne peuvent être délivrés et le traitement ne devrait pas causer de dommages aux tissus cellulaires normaux de l'hôte, en particulier aux tissus des organes vitaux.
La protéine ou le polypeptide de l'invention qui comprend ou consiste en la protéine Env HERV-W ou ses fragments, ou en une séquence polypeptidique présentant pour toute suite de 20 acides aminés, au moins 90% d'identité avec SEQ ID NO :1, sous la dépendance d'un promoteur hétérologue ou autologue capable d'induire son expression répond aux critères définis ci dessus via la formation de syncytia. Ces syncytia se forment à partir de cellule (s) par un processus de fusion de cellule à cellule.
Dans un mode de réalisation en vu d'optimiser ses caractéristiques thérapeutiques, le polypeptide de l'invention est éventuellement fusionné avec d'autres protéine(s) ou fragment(s) de protéine(s), même si intrinsèquement il répond aux critères définis précédemment. Le polypeptide de l'invention est capable d'induire la formation de syncytia à un pH voisin de la neutralité ou à pH neutre. Typiquement le vecteur d'expression ou plasmide sera adapté pour permettre l'expression du polypeptide induisant la formation de syncytia, de telle sorte que lorsqu'il est exprimé le polypeptide puisse induire la fusion des cellules transfectées avec d'autres cellules humaines non transfectées. Il est souhaitable que la protéine ou le polypeptide de l'invention soit exprimé indépendamment d'autres composants viraux, à moins que ceux ci soient utiles à la vectorisation.
Aussi, la présente invention a pour objet un gène ou un acide nucléique, ou un fragment de gène ou d'un acide nucléique, recombinant codant pour un polypeptide de l'invention qui induit la formation de syncytia par fusion de cellules transformées et de cellules malignes cibles et son utilisation dans le domaine de la thérapie de maladies malignes, telles que les cancers.
L'invention concerne également une méthode de traitement d'une maladie maligne chez un patient qui consiste à administrer au patient le gène ou un acide
<Desc/Clms Page number 7>
nucléique, , ou un fragment de gène ou d'un acide nucléique, recombinant codant pour une protéine ou un polypeptide de l'invention qui induit la formation de syncytia par fusion de cellules transformées et de cellules malignes cibles.
Le gène ou l'acide nucléique, ou le fragment de gène ou d'acide nucléique est introduit in vitro dans des cellules humaines appropriées, telles que des cellules de lignées continues immortalisées, par des techniques standards connues de l'homme du métier, telle que transfection, transduction ou transformation, et les cellules ainsi transformées sont ensuite introduites chez le patient où elles peuvent exercer leur propriétés fusogènes.
Le gène ou l'acide nucléique, ou le fragment de gène ou d'acide nucléique de l'invention peut être utilisé de différentes manières pour le traitement de cancers, en particulier pour le traitement de tumeurs solides ou molles. Les cellules cibles peuvent être transformées ex vivo ou in vivo par les vecteurs (plasmides) codant pour le polypeptide de l'invention.
Les propriétés fusogènes de la protéine Env HERV-W, du polypeptide Env HERV-W ou de leurs fragments tels que définis dans la présente invention trouvent également une application dans le domaine de la prophylaxie pour prévenir une déficience dans l'élaboration du placenta et pallier des échecs de grossesse.
Le gène ou l'acide nucléique ou leurs fragments tels que définis dans l'invention peuvent donc être utilisé pour différents effets thérapeutiques ou prophylactiques, le but ultime étant soit (i) de détruire les cellules cibles par formation de syncytia induisant une mort cellulaire des cellules cibles par un processus de mort différent de la mort cellulaire par apoptose, soit (ii) d'induire ou de favoriser la formation de syncytia, par exemple pour pallier une déficience dans la formation des syncytiotrophoblastes lors de la grossesse, ou pour prévenir une déficience dans la formation naturelle de tout autre type de syncytia, ladite déficience étant associée à une pathologie.
Les propriétés ou pouvoir fusogène(s) de la protéine ou du polypeptide de l'invention sont également utilisées dans un procédé pour tester l'efficacité et sélectionner des drogues ou substances médicamenteuses ou des systèmes gène/prodrogue susceptibles d'intervenir qualitativement et/ou quantitativement sur leur pouvoir fusogène par mise en contact de ladite drogue ou substance médicamenteuse ou dudit système gène/pro-drogue avec des cellules d'une culture cellulaire exprimant ladite protéine ou ledit polypeptide et, observation d'une régression ou d'une disparition dans la formation de syncytia, étant entendu que la formation de syncytia à l'état naturel est associée à un état pathologique. A titre d'exemple, on peut citer les phénomènes
<Desc/Clms Page number 8>
hémorragiques, la destruction ou l'altération des cellules neuronales, la destruction ou l'altération exacerbée des ostéoblastes.
Par gène ou acide nucléique ou leurs fragments, on entend (i) un gène ou acide nucléique natif isolé ou leurs fragments isolés obtenus par coupure enzymatique, ou (ii) un gène ou acide nucléique ou leurs fragments obtenu(s) par synthèse chimique à l'aide de synthétiseurs automatiques, tels que les synthétiseurs commercialisés par la société Applied Biosystems.
Par cellules tumorales, on entend (i) des cellules de lignées cellulaires immortalisées ou (ii) des cellules primaires tumorales prélevées chez un patient.
Par promoteur autologue, on entend un LTR 5' de HERV-W, à la condition qu'il soit fonctionnel et par promoteur hétérologue on entend tout promoteur n'appartenant pas à la famille de HERV-W, d'origine virale, rétrovirale ou cellulaire, éventuellement modifié, à la condition qu'il soit fonctionnel. Avantageusement, le promoteur autologue ou hétérologue est un promoteur fort c'est-à-dire qu'il est capable d'induire une expression quantitativement importante de la protéine ou du polypeptide.
Exemple :
Lignées cellulaires:
La lignée TELCeB6 (Cosset et al., Journal of Virology, 69 (12) : 7430- 7436 (1995)) dérive de la lignée TELac2 après transfection et sélection clonale d'un plasmide d'expression destiné à produire des protéine Gag et Pol de type MoMLV (virus de la leucémie murine de Moloney). La lignée TELac2 dérive initialement des cellules humaines de rhabdomyosarcome TE671 (ATCC CRL 8805) et exprime le vecteur rétroviral rapporteur nlsLacZ (Takeuchi et al., Journal of Virology, 68 (12) : 8001-8007 (1994)). La production de particules rétrovirales infectieuses par les cellules TELCeB6 dépend des vecteurs d'expression d'enveloppe transfectés.
Lignées cellulaires:
La lignée TELCeB6 (Cosset et al., Journal of Virology, 69 (12) : 7430- 7436 (1995)) dérive de la lignée TELac2 après transfection et sélection clonale d'un plasmide d'expression destiné à produire des protéine Gag et Pol de type MoMLV (virus de la leucémie murine de Moloney). La lignée TELac2 dérive initialement des cellules humaines de rhabdomyosarcome TE671 (ATCC CRL 8805) et exprime le vecteur rétroviral rapporteur nlsLacZ (Takeuchi et al., Journal of Virology, 68 (12) : 8001-8007 (1994)). La production de particules rétrovirales infectieuses par les cellules TELCeB6 dépend des vecteurs d'expression d'enveloppe transfectés.
Ces cellules sont cultivées en milieu DMEM (Dulbecco modified Eagle medium - Life Technologies) avec 10% de sérum de veau foetal (Life Technologies).
D'une manière générale, ce milieu a été utilisé pour tous les autres types cellulaires, i.e. les cellules A204 (ATCC HTB-82 - rhabdomyosarcome humain), A375 (ATCC CRL- 1619 - tumeur solide, mélanome malin humain), A 431 (ATCC CRL-1555 - tumeur solide, carcinome épidermoïde humain), PAE (cellules endothéliales d'aorte de porc), TE671 (ATCC CRL 8805 - rhabdomyosarcome humain), XC (ATCC CCL-165 sarcome de rat) et COS (ATCC CRL-1650 - rein de singe (African green monkey)).
<Desc/Clms Page number 9>
Construction des vecteurs d'expression d'enveloppe :
Le plasmide pHCMV a été utilisé pour l'expression de env HERV-W. Le plasmide FBASALF-ARless a été utilisé en qualité de témoin positif de fusion ; produit une forme hautement fusogénique de la glycoprotéine d'enveloppe MLV amphotrope, modifiée par introduction d'un codon stop avant le premier acide aminé du peptide intracytoplasmique p2-R (Rein et al., Journal of Virology, 68 (3) : 1773-1781 (1994)). env HERV-W cloné en anti-sens dans le plasmide pHCMV a été utilisé comme témoin négatif.
Le plasmide pHCMV a été utilisé pour l'expression de env HERV-W. Le plasmide FBASALF-ARless a été utilisé en qualité de témoin positif de fusion ; produit une forme hautement fusogénique de la glycoprotéine d'enveloppe MLV amphotrope, modifiée par introduction d'un codon stop avant le premier acide aminé du peptide intracytoplasmique p2-R (Rein et al., Journal of Virology, 68 (3) : 1773-1781 (1994)). env HERV-W cloné en anti-sens dans le plasmide pHCMV a été utilisé comme témoin négatif.
Transfection et tests de fusion de cellule à cellule (coculture) :
Les plasmides d'expression des glycoprotéines d'enveloppe sont transfectés dans les cellules TELCeB6 par précipitation au phosphate de calcium (Cosset et al., Journal of Virology, 69 (10) : 6314-6322 (1995)). Les cellules TELCeB6 confluentes exprimant Env sont fixées au Glutaraldéhyde à 0,5% en PBS, 24 h. après transfection. Une coloration par des solutions de May-Grunwald et Giemsa (MERCK) est alors effectuée selon les recommandations du fournisseur. Elle colore les noyaux en violet et les cytoplasmes en mauve et permet de visualiser les syncytia.
Les plasmides d'expression des glycoprotéines d'enveloppe sont transfectés dans les cellules TELCeB6 par précipitation au phosphate de calcium (Cosset et al., Journal of Virology, 69 (10) : 6314-6322 (1995)). Les cellules TELCeB6 confluentes exprimant Env sont fixées au Glutaraldéhyde à 0,5% en PBS, 24 h. après transfection. Une coloration par des solutions de May-Grunwald et Giemsa (MERCK) est alors effectuée selon les recommandations du fournisseur. Elle colore les noyaux en violet et les cytoplasmes en mauve et permet de visualiser les syncytia.
Pour les expériences de coculture, les cellules transfectées sont décrochées du support, comptées puis ré-ensemencées à concentration égale (3 x 105 cellules/puit) en plaques 6 puits. Des cellules fraîches indicatrices sont alors ajoutées aux cellules transfectées à raison de 106 cellules par puit et la co-culture est poursuivie pendant 24 h. Une coloration XGal (5-bromo-4chloro-3-indolyl-(3-D-galactopyranoside peut alors être effectuée pour colorer le noyau des cellules TELCeB6 (Cosset et al., Journal of Virology, 69 (10) : 6314-6322 (1995)). Elle est suivie d'une coloration par des solutions de May-Grünwald et Giemsa (MERCK) effectuée selon les recommandations du fournisseur.
La majorité des syncytia est observable 18 à 24 heures après le début de la transfection ; le décollement progressif des cellules ne permet plus d'observation, ni de coloration 36 heures après la transfection. La fusion observée correspond à une fusion from within , c'est-à-dire à une fusion de cellule-à-cellule, à partir d'une cellule exprimant l'enveloppe, par opposition à une fusion from without qui correspond à une formation de syncytia consécutive à une fusion virion-cellule(s).
Le tableau I ci-après rassemble les résultats obtenus concernant la capacité de fusion de cellule à cellule de Env HERV-W par transfection directe, comparée à
<Desc/Clms Page number 10>
celle de l'enveloppe témoin Arless. Les cellules TELCeB6 et TE671 correspondent à des lignées d'origine humaine. Les cellules COS sont des cellules de rein de singe vert.
Les cellules sont des cellules de rat.
Tableau I
<tb>
<tb> indexa <SEP> de <SEP> fusion <SEP> sur <SEP> les <SEP> cellules
<tb> Enveloppe <SEP> TELCeB6 <SEP> TE671 <SEP> COS <SEP> XC
<tb> Arless <SEP> 2,5 <SEP> 0,4 <SEP> Inn. <SEP> 2,0
<tb> HERV-W <SEP> 10,0 <SEP> 2,0 <SEP> 0,08 <SEP> 0
<tb>
aL'index de fusion correspond au pourcentage (N-S)/T, où N est le nombre de noyaux en syncytia, S est le nombre de syncytia et Test le nombre total de noyaux comptés. inn. signifie innombrables, organisés en "réseau".
<tb> indexa <SEP> de <SEP> fusion <SEP> sur <SEP> les <SEP> cellules
<tb> Enveloppe <SEP> TELCeB6 <SEP> TE671 <SEP> COS <SEP> XC
<tb> Arless <SEP> 2,5 <SEP> 0,4 <SEP> Inn. <SEP> 2,0
<tb> HERV-W <SEP> 10,0 <SEP> 2,0 <SEP> 0,08 <SEP> 0
<tb>
aL'index de fusion correspond au pourcentage (N-S)/T, où N est le nombre de noyaux en syncytia, S est le nombre de syncytia et Test le nombre total de noyaux comptés. inn. signifie innombrables, organisés en "réseau".
Le tableau 1 montre que les résultats sont au moins aussi importants pour Env HERV-W que pour le témoin sur les cellules d'origine humaine. Ils sont moindres sur les cellules simiennes. Env HERV-W n'induit pas la formation de syncytia sur des cellules de rat.
Le tableau II ci-après rassemble les données observées dans des expériences de coculture de cellules indicatrices avec des cellules TELCeB6 transfectées par pHCMV-env HERV-W. Le type, l'origine et l'espèce des cellules indicatrices sont indiqués. La formation de syncytia est indiquée par les mentions oui/non et semi-quantifié par des croix.
<Desc/Clms Page number 11>
Tableau II
<tb>
<tb> Espèce <SEP> Type <SEP> cellulaire <SEP> Origine <SEP> Fusion <SEP> en <SEP> coculture
<tb> avec <SEP> TELCeB6
<tb> Homme <SEP> TE671 <SEP> Rhabdomyosarcome <SEP> Oui <SEP> ++
<tb> A204 <SEP> Rhabdomyosarcome <SEP> Non
<tb> A375 <SEP> Mélanome <SEP> Non
<tb> A431 <SEP> Carcinome <SEP> Oui <SEP> ++
<tb> porc <SEP> PAE <SEP> épidermoïde <SEP> Non
<tb> rat <SEP> XC <SEP> Endothelium <SEP> Non
<tb> Sarcome
<tb>
<tb> Espèce <SEP> Type <SEP> cellulaire <SEP> Origine <SEP> Fusion <SEP> en <SEP> coculture
<tb> avec <SEP> TELCeB6
<tb> Homme <SEP> TE671 <SEP> Rhabdomyosarcome <SEP> Oui <SEP> ++
<tb> A204 <SEP> Rhabdomyosarcome <SEP> Non
<tb> A375 <SEP> Mélanome <SEP> Non
<tb> A431 <SEP> Carcinome <SEP> Oui <SEP> ++
<tb> porc <SEP> PAE <SEP> épidermoïde <SEP> Non
<tb> rat <SEP> XC <SEP> Endothelium <SEP> Non
<tb> Sarcome
<tb>
Le tableau II détaille les résultats des expériences de coculture en fonction des lignées cellulaires humaines testées. On observe des syncytia dans des cellules humaines de carcinome épidermoïde (A431) et de rhabdomyosarcome (TE671) ; on notera cependant qu'une autre lignée de rhabdomyosarcome (A204) ne présente pas de syncytia.
<Desc/Clms Page number 12>
LISTE DE SEQUENCES <110> BIO MERIEUX <120> Procédé de détection de l'expression d'une protéine d'enveloppe d'un rétrovirus endogène humain et utilisations d'un gène codant pour cette protéine <130> Pouvoir fusogène de env de ERV-W <140> <141> <160> 2 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 538 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Leu Pro Tyr His Ile Phe Leu Phe Thr Val Leu Leu Pro Ser 1 5 10 15 Phe Thr Leu Thr Ala Pro Pro Pro Cys Arg Cys Met Thr Ser Ser Ser
20 25 30 Pro Tyr Gln Glu Phe Leu Trp Arg Met Gln Arg Pro Gly Asn Ile Asp
35 40 45 Ala Pro Ser Tyr Arg Ser Leu Ser Lys Gly Thr Pro Thr Phe Thr Ala
50 55 60 His Thr His Met Pro Arg Asn Cys Tyr His Ser Ala Thr Leu Cys Met
65 70 75 80 His Ala Asn Thr His Tyr Trp Thr Gly Lys Met Ile Asn Pro Ser Cys
85 90 95 Pro Gly Gly Leu Gly Val Thr Val Cys Trp Thr Tyr Phe Thr Gln Thr
100 105 110 Gly Met Ser Asp Gly Gly Gly Val Gln Asp Gln Ala Arg Glu Lys His
115 120 125 Val Lys Glu Val Ile Ser Gln Leu Thr Arg Val His Gly Thr Ser Ser
130 135 140 Pro Tyr Lys Gly Leu Asp Leu Ser Lys Leu His Glu Thr Leu Arg Thr 145 150 155 160 His Thr Arg Leu Val Ser Leu Phe Asn Thr Thr Leu Thr Gly Leu His
165 170 175 Glu Val Ser Ala Gln Asn Pro Thr Asn Cys Trp Ile Cys Leu Pro Leu
180 185 190
20 25 30 Pro Tyr Gln Glu Phe Leu Trp Arg Met Gln Arg Pro Gly Asn Ile Asp
35 40 45 Ala Pro Ser Tyr Arg Ser Leu Ser Lys Gly Thr Pro Thr Phe Thr Ala
50 55 60 His Thr His Met Pro Arg Asn Cys Tyr His Ser Ala Thr Leu Cys Met
65 70 75 80 His Ala Asn Thr His Tyr Trp Thr Gly Lys Met Ile Asn Pro Ser Cys
85 90 95 Pro Gly Gly Leu Gly Val Thr Val Cys Trp Thr Tyr Phe Thr Gln Thr
100 105 110 Gly Met Ser Asp Gly Gly Gly Val Gln Asp Gln Ala Arg Glu Lys His
115 120 125 Val Lys Glu Val Ile Ser Gln Leu Thr Arg Val His Gly Thr Ser Ser
130 135 140 Pro Tyr Lys Gly Leu Asp Leu Ser Lys Leu His Glu Thr Leu Arg Thr 145 150 155 160 His Thr Arg Leu Val Ser Leu Phe Asn Thr Thr Leu Thr Gly Leu His
165 170 175 Glu Val Ser Ala Gln Asn Pro Thr Asn Cys Trp Ile Cys Leu Pro Leu
180 185 190
<Desc/Clms Page number 13>
Asn Phe Arg Pro Tyr Val Ser Ile Pro Val Pro Glu Gln Trp Asn Asn
195 200 205 Phe Ser Thr Glu Ile Asn Thr Thr Ser Val Leu Val Gly Pro Leu Val
210 215 220 Ser Asn Leu Glu Ile Thr His Thr Ser Asn Leu Thr Cys Val Lys Phe 225 230 235 240 Ser Asn Thr Thr Tyr Thr Thr Asn Ser Gln Cys Ile Arg Trp Val Thr
245 250 255 Pro Pro Thr Gln Ile Val Cys Leu Pro Ser Gly Ile Phe Phe Val Cys
260 265 270 Gly Thr Ser Ala Tyr Arg Cys Leu Asn Gly Ser Ser Glu Ser Met Cys
275 280 285 Phe Leu Ser Phe Leu Val Pro Pro Met Thr Ile Tyr Thr Glu Gln Asp
290 295 300 Leu Tyr Ser Tyr Val Ile Ser Lys Pro Arg Asn Lys Arg Val Pro Ile 305 310 315 320 Leu Pro Phe Val Ile Gly Ala Gly Val Leu Gly Ala Leu Gly Thr Gly
325 330 335 Ile Gly Gly Ile Thr Thr Ser Thr Gln Phe Tyr Tyr Lys Leu Ser Gln
340 345 350 Glu Leu Asn Gly Asp Met Glu Arg Val Ala Asp Ser Leu Val Thr Leu
355 360 365 Gln Asp Gln Leu Asn Ser Leu Ala Ala Val Val Leu Gln Asn Arg Arg
370 375 380 Ala Leu Asp Leu Leu Thr Ala Glu Arg Gly Gly Thr Cys Leu Phe Leu 385 390 395 400 Gly Glu Glu Cys Cys Tyr Tyr Val Asn Gln Ser Gly Ile Val Thr Glu
405 410 415 Lys Val Lys Glu Ile Arg Asp Arg Ile Gln Arg Arg Ala Glu Glu Leu
420 425 430 Arg Asn Thr Gly Pro Trp Gly Leu Leu Ser Gln Trp Met Pro Trp Ile
435 440 445 Leu Pro Phe Leu Gly Pro Leu Ala Ala Ile Ile Leu Leu Leu Leu Phe
450 455 460 Gly Pro Cys Ile Phe Asn Leu Leu Val Asn Phe Val Ser Ser Arg Ile 465 470 475 480 Glu Ala Val Lys Leu Gln Met Glu Pro Lys Met Gln Ser Lys Thr Lys
485 490 495
195 200 205 Phe Ser Thr Glu Ile Asn Thr Thr Ser Val Leu Val Gly Pro Leu Val
210 215 220 Ser Asn Leu Glu Ile Thr His Thr Ser Asn Leu Thr Cys Val Lys Phe 225 230 235 240 Ser Asn Thr Thr Tyr Thr Thr Asn Ser Gln Cys Ile Arg Trp Val Thr
245 250 255 Pro Pro Thr Gln Ile Val Cys Leu Pro Ser Gly Ile Phe Phe Val Cys
260 265 270 Gly Thr Ser Ala Tyr Arg Cys Leu Asn Gly Ser Ser Glu Ser Met Cys
275 280 285 Phe Leu Ser Phe Leu Val Pro Pro Met Thr Ile Tyr Thr Glu Gln Asp
290 295 300 Leu Tyr Ser Tyr Val Ile Ser Lys Pro Arg Asn Lys Arg Val Pro Ile 305 310 315 320 Leu Pro Phe Val Ile Gly Ala Gly Val Leu Gly Ala Leu Gly Thr Gly
325 330 335 Ile Gly Gly Ile Thr Thr Ser Thr Gln Phe Tyr Tyr Lys Leu Ser Gln
340 345 350 Glu Leu Asn Gly Asp Met Glu Arg Val Ala Asp Ser Leu Val Thr Leu
355 360 365 Gln Asp Gln Leu Asn Ser Leu Ala Ala Val Val Leu Gln Asn Arg Arg
370 375 380 Ala Leu Asp Leu Leu Thr Ala Glu Arg Gly Gly Thr Cys Leu Phe Leu 385 390 395 400 Gly Glu Glu Cys Cys Tyr Tyr Val Asn Gln Ser Gly Ile Val Thr Glu
405 410 415 Lys Val Lys Glu Ile Arg Asp Arg Ile Gln Arg Arg Ala Glu Glu Leu
420 425 430 Arg Asn Thr Gly Pro Trp Gly Leu Leu Ser Gln Trp Met Pro Trp Ile
435 440 445 Leu Pro Phe Leu Gly Pro Leu Ala Ala Ile Ile Leu Leu Leu Leu Phe
450 455 460 Gly Pro Cys Ile Phe Asn Leu Leu Val Asn Phe Val Ser Ser Arg Ile 465 470 475 480 Glu Ala Val Lys Leu Gln Met Glu Pro Lys Met Gln Ser Lys Thr Lys
485 490 495
<Desc/Clms Page number 14>
Ile Tyr Arg Arg Pro Leu Asp Arg Pro Ala Ser Pro Arg Ser Asp Val
500 505 510 Asn Asp Ile Lys Gly Thr Pro Pro Glu Glu Ile Ser Ala Ala Gln Pro
515 520 525 Leu Leu Arg Pro Asn Ser Ala Gly Ser Ser
530 535 <210> 2 <211> 2781 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 2 atgggagctg ttttcatgct atttcactct attaaatctt gcaactgcac tcttctggtc 60 catgtttctt acggctcgag ctgagctttt gctcaccgtc caccactgct gtttgccacc 120 accgcagacc tgccgctgac tcccatccct ctggatcctg cagggtgtcc gctgtgctcc 180 tgatccagcg aggcgcccat tgccgctccc aattgggcta aaggcttgcc attgttcctg 240 cacggctaag tgcctgggtt tgttctaatt gagctgaaca ctagtcactg ggttccatgg 300 ttctcttctg tgacccacgg cttctaatag aactataaca cttaccacat ggcccaagat 360 tccattcctt ggaatccgtg aggccaagaa ctccaggtca gagaatacga ggcttgccac 420 catcttggaa gcggcctgct accatcttgg aagtggttca ccaccatctt gggagctctg 480 tgagcaagga ccccccggta acattttggc aaccacgaac ggacatccaa agtgatacat 540 cctgggaagg accctaccca gtcattttat ctaccccaac tgcggttaaa gtggctggag 600 tggagtcttg gatacatcac acttgagtca aatcctggat actgccaaag gaacctgaaa 660 atccaggaga caacgctagc tattcctgtg aacctctaga ggatttgcgc ctgctcttca 720 aacaacaacc aggaggaaag taactaaaat cataaatccc catggccctc ccttatcata 780 tttttctctt tactgttctt ttaccctctt tcactctcac tgcaccccct ccatgccgct 840 gtatgaccag tagctcccct taccaagagt ttctatggag aatgcagcgt cccggaaata 900 ttgatgcccc atcgtatagg agtctttcta agggaacccc caccttcact gcccacaccc 960 atatgccccg caactgctat cactctgcca ctctttgcat gcatgcaaat actcattatt 1020 ggacaggaaa aatgattaat cctagttgtc ctggaggact tggagtcact gtctgttgga 1080 cttacttcac ccaaactggt atgtctgatg ggggtggagt tcaagatcag gcaagagaaa 1140 aacatgtaaa agaagtaatc tcccaactca cccgggtaca tggcacctct agcccctaca 1200 aaggactaga tctctcaaaa ctacatgaaa ccctccgtac ccatactcgc ctggtaagcc 1260 tatttaatac caccctcact gggctccatg aggtctcggc ccaaaaccct actaactgtt 1320 ggatatgcct ccccctgaac ttcaggccat atgtttcaat ccctgtacct gaacaatgga 1380 acaacttcag cacagaaata aacaccactt ccgttttagt aggacctctt gtttccaatc 1440 tggaaataac ccatacctca aacctcacct gtgtaaaatt tagcaatact acatacacaa 1500 ccaactccca atgcatcagg tgggtaactc ctcccacaca aatagtctgc ctaccctcag 1560 gaatattttt tgtctgtggt acctcagcct atcgttgttt gaatggctct tcagaatcta 1620 tgtgcttcct ctcattctta gtgcccccta tgaccatcta cactgaacaa gatttataca 1680 gttatgtcat atctaagccc cgcaacaaaa gagtacccat tcttcctttt gttataggag 1740 cgggagtgct aggtgcacta ggtactggca ttggcggtat cacaacctct actcagttct 1800 actacaaact atctcaagaa ctaaatgggg acatggaacg ggtcgccgac tccctggtca 1860 ccttgcaaga tcagcttaac tccctagcag cagtagtcct tcaaaatcga agagctttag 1920 acttgctaac cgctgaaaga gggggaacct gtttattttt aggggaagaa tgctgttatt 1980 atgttaatca atccggaatc gtcactgaga aagttaaaga aattcgagat cgaatacaac 2040 gtagagcaga ggagcttcga aacactggac cctggggcct cctcagccaa tggatgccct 2100 ggattctccc cttcttagga cctctagcag ctataatatt gctactcctc tttggaccct 2160 gtatctttaa cctccttgtt aactttgtct cttccagaat cgaagctgta aaactacaaa 2220 tggagcccaa gatgcagtcc aagactaaga tctaccgcag acccctggac cggcctgcta 2280 gcccacgatc tgatgttaat gacatcaaag gcacccctcc tgaggaaatc tcagctgcac 2340 aacctctact acgccccaat tcagcaggaa gcagttagag cggtcgtcgg ccaacctccc 2400 caacagcact taggttttcc tgttgagatg ggggactgag agacaggact agctggattt 2460
500 505 510 Asn Asp Ile Lys Gly Thr Pro Pro Glu Glu Ile Ser Ala Ala Gln Pro
515 520 525 Leu Leu Arg Pro Asn Ser Ala Gly Ser Ser
530 535 <210> 2 <211> 2781 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 2 atgggagctg ttttcatgct atttcactct attaaatctt gcaactgcac tcttctggtc 60 catgtttctt acggctcgag ctgagctttt gctcaccgtc caccactgct gtttgccacc 120 accgcagacc tgccgctgac tcccatccct ctggatcctg cagggtgtcc gctgtgctcc 180 tgatccagcg aggcgcccat tgccgctccc aattgggcta aaggcttgcc attgttcctg 240 cacggctaag tgcctgggtt tgttctaatt gagctgaaca ctagtcactg ggttccatgg 300 ttctcttctg tgacccacgg cttctaatag aactataaca cttaccacat ggcccaagat 360 tccattcctt ggaatccgtg aggccaagaa ctccaggtca gagaatacga ggcttgccac 420 catcttggaa gcggcctgct accatcttgg aagtggttca ccaccatctt gggagctctg 480 tgagcaagga ccccccggta acattttggc aaccacgaac ggacatccaa agtgatacat 540 cctgggaagg accctaccca gtcattttat ctaccccaac tgcggttaaa gtggctggag 600 tggagtcttg gatacatcac acttgagtca aatcctggat actgccaaag gaacctgaaa 660 atccaggaga caacgctagc tattcctgtg aacctctaga ggatttgcgc ctgctcttca 720 aacaacaacc aggaggaaag taactaaaat cataaatccc catggccctc ccttatcata 780 tttttctctt tactgttctt ttaccctctt tcactctcac tgcaccccct ccatgccgct 840 gtatgaccag tagctcccct taccaagagt ttctatggag aatgcagcgt cccggaaata 900 ttgatgcccc atcgtatagg agtctttcta agggaacccc caccttcact gcccacaccc 960 atatgccccg caactgctat cactctgcca ctctttgcat gcatgcaaat actcattatt 1020 ggacaggaaa aatgattaat cctagttgtc ctggaggact tggagtcact gtctgttgga 1080 cttacttcac ccaaactggt atgtctgatg ggggtggagt tcaagatcag gcaagagaaa 1140 aacatgtaaa agaagtaatc tcccaactca cccgggtaca tggcacctct agcccctaca 1200 aaggactaga tctctcaaaa ctacatgaaa ccctccgtac ccatactcgc ctggtaagcc 1260 tatttaatac caccctcact gggctccatg aggtctcggc ccaaaaccct actaactgtt 1320 ggatatgcct ccccctgaac ttcaggccat atgtttcaat ccctgtacct gaacaatgga 1380 acaacttcag cacagaaata aacaccactt ccgttttagt aggacctctt gtttccaatc 1440 tggaaataac ccatacctca aacctcacct gtgtaaaatt tagcaatact acatacacaa 1500 ccaactccca atgcatcagg tgggtaactc ctcccacaca aatagtctgc ctaccctcag 1560 gaatattttt tgtctgtggt acctcagcct atcgttgttt gaatggctct tcagaatcta 1620 tgtgcttcct ctcattctta gtgcccccta tgaccatcta cactgaacaa gatttataca 1680 gttatgtcat atctaagccc cgcaacaaaa gagtacccat tcttcctttt gttataggag 1740 cgggagtgct aggtgcacta ggtactggca ttggcggtat cacaacctct actcagttct 1800 actacaaact atctcaagaa ctaaatgggg acatggaacg ggtcgccgac tccctggtca 1860 ccttgcaaga tcagcttaac tccctagcag cagtagtcct tcaaaatcga agagctttag 1920 acttgctaac cgctgaaaga gggggaacct gtttattttt aggggaagaa tgctgttatt 1980 atgttaatca atccggaatc gtcactgaga aagttaaaga aattcgagat cgaatacaac 2040 gtagagcaga ggagcttcga aacactggac cctggggcct cctcagccaa tggatgccct 2100 ggattctccc cttcttagga cctctagcag ctataatatt gctactcctc tttggaccct 2160 gtatctttaa cctccttgtt aactttgtct cttccagaat cgaagctgta aaactacaaa 2220 tggagcccaa gatgcagtcc aagactaaga tctaccgcag acccctggac cggcctgcta 2280 gcccacgatc tgatgttaat gacatcaaag gcacccctcc tgaggaaatc tcagctgcac 2340 aacctctact acgccccaat tcagcaggaa gcagttagag cggtcgtcgg ccaacctccc 2400 caacagcact taggttttcc tgttgagatg ggggactgag agacaggact agctggattt 2460
<Desc/Clms Page number 15>
cctaggctga ctaagaatcc ctaagcctag ctgggaaggt gaccacatcc acctttaaac 2520 acggggcttg caacttagct cacacctgac caatcagaga gctcactaaa atgctaatta 2580 ggcaaagaca ggaggtaaag aaatagccaa tcatctattg cctgagagca cagcaggagg 2640 gacaatgatc gggatataaa cccaagtctt cgagccggca acggcaaccc cctttgggtc 2700 ccctcccttt gtatgggagc tctgttttca tgctatttca ctctattaaa tcttgcaact 2760 gcaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 2781
Claims (20)
1. Procédé de détection de l'expression d'une protéine ou d'un polypeptide d'enveloppe d'un rétrovirus endogène humain, caractérisé en ce que la protéine ou le polypeptide présente une séquence polypeptidique qui comprend la séquence SEQ ID NO : 1 ou un fragment de SEQ ID NO : 1 ou une séquence présentant, pour toute suite de 20 acides aminés, au moins 90% d'identité avec la séquence SEQ ID NO:1ou avec un fragment de SEQ ID NO :1, et en ce qu'on détecte le pouvoir fusogène de ladite protéine ou dudit fragment dans des cellules d'un tissu cellulaire ou d'une culture cellulaire, par la mise en évidence de la formation de syncytia.
2. Procédé de détection de l'expression d'une protéine ou d'un polypeptide d'enveloppe d'un rétrovirus endogène humain, caractérisé en ce que la protéine ou le polypeptide présente une séquence polypeptidique présentant, pour toute suite de 20 acides aminés, au moins 90% d'identité avec la séquence SEQ ID NO:1, et en ce qu'on détecte le pouvoir fusogène de ladite protéine dans des cellules d'un tissu cellulaire, ou d'une culture cellulaire par la mise en évidence de la formation de syncytia.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la protéine est codée par le gène env du rétrovirus endogène HERV-W.
4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la protéine est codée par un cadre de lecture ouvert situé sur le chromosome 7 du génome humain.
5. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la protéine présente une séquence polypeptidique qui consiste en SEQ ID NO: 1.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les cellules dudit tissu ou de ladite culture cellulaire sont choisies parmi les cellules osseuses, les cellules musculaires, les cellules placentaires, les cellules endothéliales, en particulier des vaissaux sanguins, les cellules épithéliales, les cellules gliales et les cellules tumorales ou issues de lignées cellulaires tumorales.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la détection du pouvoir fusogène de ladite protéine consiste à : obtenir un vecteur d'expression de ladite protéine à partir duquel l'expression de la protéine ou de son gène est sous la dépendance d'un promoteur, transfecter des cellules par le vecteur obtenu pour obtenir des cellules productrices, exprimant à leur surface ladite protéine, et observer la formation de syncytia ou l'absence de formation de syncytia.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que la détection du pouvoir fusogène de la protéine consiste à :
<Desc/Clms Page number 17>
obtenir un vecteur d'expression de ladite protéine à partir duquel l'expression de la protéine ou de son gène est sous la dépendance d'un promoteur, transfecter des cellules par le vecteur obtenu pour obtenir des cellules productices, exprimant à leur surface ladite protéine, cultiver des cellules naïves indicatrices exprimant à leur surface un récepteur de ladite protéine en présence desdites cellules productrices, et observer la formation de syncytia ou l'absence de formation de syncytia.
9. Utilisation d'un gène ou d'un acide nucléique ou d'un fragment de gène ou d'un acide nucléique codant pour une protéine ou un polypeptide tels que définis dans la revendication 1 ou 2, dans des conditions appropriées permettant son expression, pour préparer une composition thérapeutique ou prophylactique.
10. Utilisation selon la revendication 9, caractérisée en ce que ladite composition est destinée au traitement de cancers
11. Utilisation selon la revendication 9, caractérisée en, ce que ladite composition est destinée à prévenir une déficience dans l'élaboration du placenta.
12. Utilisation selon la revendication 9,10 ou 11, caractérisée en ce que la composition est destinée à un traitement par thérapie génique
13. Composition thérapeutique ou prophylactique comprenant un gène ou un acide nucléique ou un fragment de gène ou d'acide nucléique codant pour une protéine ou un polypeptide tels que définis dans la revendication 1 ou 2,
14. Composition selon la revendication 13, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre un promoteur hétérologue ou autologue, de préférence hétérologue, pour l'expression de ladite protéine ou dudit polypeptide.
15. Vecteur d'expression comprenant au moins un gène ou un acide nucléique ou un fragment de gène ou d'acide nucléique codant pour une protéine ou un polypeptide tels que définis dans la revendication 1 ou 2, et des éléments nécessaires à son expression dans une cellule hôte
16. Cellule hôte comprenant au moins un vecteur selon la revendication 15.
17. Composition thérapeutique ou prophylactique comprenant au moins un vecteur d'expression selon la revendication 15.
18. Utilisation d'une composition selon l'une quelconque des revendications 13,14, et 17, caractérisée en ce que ladite composition est destinée au traitement de cancers par destruction des cellules cancéreuses au moyen de la formation de syncytia.
<Desc/Clms Page number 18>
19. Utilisation d'une composition selon l'une quelconque des revendications 13,14, et 17, caractérisée en ce que ladite composition est destinée à prévenir une déficience dans l'élaboration du placenta.
20. Procédé pour la sélection de drogues ou substances médicamenteuses ou de systèmes gène/pro-drogue susceptibles d'intervenir qualitativement et/ou quantitativement sur le pouvoir fusogène d'une protéine ou d'un poypeptide tel que défini dans la revendication 1 ou 2, selon lequel on met en contact ladite drogue ou substance médicamenteuse ou ledit système gène/pro-drogue avec des cellules d'une culture cellulaire exprimant ladite protéine ou ledit polypeptide et, on observe une régression ou une disparition dans la formation de syncytia.
Priority Applications (13)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9911141A FR2797888A1 (fr) | 1999-09-01 | 1999-09-01 | Procede de detection de l'expression d'une proteine d'enveloppe d'un retrovirus endogene humain et utilisations d'un gene codant pour cette proteine |
| FR9911793A FR2797889A1 (fr) | 1999-09-01 | 1999-09-15 | Procede de detection de l'expression d'une proteine d'enveloppe d'un retrovirus endogene humain et utilisations d'un gene codant pour cette proteine |
| AU72971/00A AU7297100A (en) | 1999-09-01 | 2000-09-01 | Method for detecting the expression of an envelope protein of a human endogenous retrovirus and uses of a gene coding for said protein |
| ES10183612.0T ES2444649T3 (es) | 1999-09-01 | 2000-09-01 | Procedimiento de detección de la expresión de una proteína de cubierta de un retrovirus endógeno humano y utilizaciones de un gen que codifica para esta proteína |
| US10/069,883 US7442550B1 (en) | 1999-09-01 | 2000-09-01 | Method for detecting the expression of an envelope protein of a human endogenous retrovirus and uses of a gene coding for said protein |
| JP2001519732A JP4283475B2 (ja) | 1999-09-01 | 2000-09-01 | ヒト内因性レトロウイルスのエンベロープタンパク質の発現を検出する方法、並びに上記タンパク質をコードする遺伝子の使用 |
| ES00960783T ES2376726T3 (es) | 1999-09-01 | 2000-09-01 | Procedimiento de detección de la expresión de una proteína de cubierta de un retrovirus endógeno humano y utilizaciones de un gen que codifica para esta proteína |
| AT00960783T ATE531726T1 (de) | 1999-09-01 | 2000-09-01 | Verfahren zum nachweis der expression eines hüllproteins eines endogenen menschlichen retrovirus und verwendungen des gens, das für solch ein protein kodiert |
| EP00960783A EP1212359B1 (fr) | 1999-09-01 | 2000-09-01 | Procede de detection de l'expression d'une proteine d'enveloppe d'un retrovirus endogene humain et utilisations d'un gene codant pour cette proteine |
| EP10183612.0A EP2385058B1 (fr) | 1999-09-01 | 2000-09-01 | Procédé de détection de l'expression d'une protéine d'enveloppe d'un rétrovirus endogène humain et utilisations d'un gène codant pour cette protéine |
| CA2383877A CA2383877C (fr) | 1999-09-01 | 2000-09-01 | Procede de detection de l'expression d'une proteine d'enveloppe d'un retrovirus endogene humain et utilisations d'un gene codant pour cette proteine |
| PCT/FR2000/002429 WO2001016171A1 (fr) | 1999-09-01 | 2000-09-01 | Procede de detection de l'expression d'une proteine d'enveloppe d'un retrovirus endogene humain et utilisations d'un gene codant pour cette proteine |
| JP2008244988A JP4824731B2 (ja) | 1999-09-01 | 2008-09-24 | ヒト内因性レトロウイルスのエンベロープタンパク質の発現を検出する方法、並びに上記タンパク質をコードする遺伝子の使用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9911141A FR2797888A1 (fr) | 1999-09-01 | 1999-09-01 | Procede de detection de l'expression d'une proteine d'enveloppe d'un retrovirus endogene humain et utilisations d'un gene codant pour cette proteine |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2797888A1 true FR2797888A1 (fr) | 2001-03-02 |
Family
ID=9549578
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR9911141A Withdrawn FR2797888A1 (fr) | 1999-09-01 | 1999-09-01 | Procede de detection de l'expression d'une proteine d'enveloppe d'un retrovirus endogene humain et utilisations d'un gene codant pour cette proteine |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| FR (1) | FR2797888A1 (fr) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999002696A1 (fr) * | 1997-07-07 | 1999-01-21 | Bio Merieux | Sequences retroviraux endogenes, associees a des maladies auto-immunes et/ou a des perturbations de la grossesse |
| WO1999026972A1 (fr) * | 1997-11-21 | 1999-06-03 | Genetics Institute, Inc. | Proteines secretees et polynucleotides les codant |
-
1999
- 1999-09-01 FR FR9911141A patent/FR2797888A1/fr not_active Withdrawn
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999002696A1 (fr) * | 1997-07-07 | 1999-01-21 | Bio Merieux | Sequences retroviraux endogenes, associees a des maladies auto-immunes et/ou a des perturbations de la grossesse |
| WO1999026972A1 (fr) * | 1997-11-21 | 1999-06-03 | Genetics Institute, Inc. | Proteines secretees et polynucleotides les codant |
Non-Patent Citations (7)
| Title |
|---|
| BLOND JEAN-LUC ET AL: "An envelope glycoprotein of the human endogenous retrovirus HERV-W is expressed in the human placenta and fuses cells expressing the type D mammalian retrovirus receptor.", JOURNAL OF VIROLOGY, vol. 74, no. 7, April 2000 (2000-04-01), pages 3321 - 3329, XP000946327, ISSN: 0022-538X * |
| BLOND JEAN-LUC ET AL: "Molecular characterization and placental expression of HERV-W, a new human endogenous retrovirus family.", JOURNAL OF VIROLOGY, vol. 73, no. 2, February 1999 (1999-02-01), pages 1175 - 1185, XP000946152, ISSN: 0022-538X * |
| DORANZ B J ET AL: "A SMALL-MOLECULE INHIBITOR DIRECTED AGAINST THE CHEMOKINE RECEPTOR CXCR4 PREVENTS ITS USE AS AN HIV-1 CORECEPTOR", JOURNAL OF EXPERIMENTAL MEDICINE,JP,TOKYO, vol. 186, no. 8, 20 October 1997 (1997-10-20), pages 1395 - 1400, XP000669413, ISSN: 0022-1007 * |
| LIN L ET AL: "Expression of endogenous retrovirus ERV-3 induces differentiation in BeWo, a choriocarcinoma model of human placental trophoblast.", PLACENTA, vol. 20, no. 1, January 1999 (1999-01-01), pages 109 - 118, XP000925932, ISSN: 0143-4004 * |
| MI SHA ET AL: "Syncytin is a captive retroviral envelope protein involved in human placental morphogenesis.", NATURE (LONDON), vol. 403, no. 6771, 17 February 2000 (2000-02-17), pages 785 - 789, XP002147935, ISSN: 0028-0836 * |
| VOISSET CECILE ET AL: "Chromosomal distribution and coding capacity of the human endogenous retrovirus HERV-W family.", AIDS RESEARCH AND HUMAN RETROVIRUSES, vol. 16, no. 8, 20 May 2000 (2000-05-20), pages 731 - 740, XP000925926, ISSN: 0889-2229 * |
| WANG BIN ET AL: "Molecular cloning, expression, and biological characterization of an HTLV-II envelope glycoprotein: HIV-1 expression is permissive for HTLV-II-induced cell fusion.", AIDS RESEARCH AND HUMAN RETROVIRUSES, vol. 9, no. 9, 1993, pages 849 - 860, XP000925933, ISSN: 0889-2229 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP1071804B1 (fr) | Utilisation de sequences d'adn de structure triplex pour le transfert de sequences nucleotidiques | |
| Van Zeijl et al. | A human amphotropic retrovirus receptor is a second member of the gibbon ape leukemia virus receptor family. | |
| Milev et al. | Live cell visualization of the interactions between HIV-1 Gag and the cellular RNA-binding protein Staufen1 | |
| JP4824731B2 (ja) | ヒト内因性レトロウイルスのエンベロープタンパク質の発現を検出する方法、並びに上記タンパク質をコードする遺伝子の使用 | |
| FR2700169A1 (fr) | Nouveaux variants trans-dominants TAT du virus de l'immunodéficience humaine. | |
| US20100099162A1 (en) | Nuclear localization signal of lentiviral integrase and method of use thereof | |
| US7135339B2 (en) | Methods for producing and using in vivo pseudotyped retroviruses using envelope glycoproteins from lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) | |
| JP3954151B2 (ja) | フォーミーウイルスエンベロープタンパク質の発現 | |
| EP1078094B1 (fr) | Methodes et compositions pour la production de particules virales | |
| EP1000158B1 (fr) | Sequences retroviraux endogenes, associees a des maladies auto-immunes et/ou a des perturbations de la grossesse | |
| FR2797888A1 (fr) | Procede de detection de l'expression d'une proteine d'enveloppe d'un retrovirus endogene humain et utilisations d'un gene codant pour cette proteine | |
| FR2773561A1 (fr) | Utilisation d'une sequence riche en proline pour augmenter le caractere fusogenique d'enveloppes de retrovirus | |
| EP0796338B1 (fr) | Lignees cellulaires d'encapsidation pour la transcomplementation de vecteurs retroviraux defectifs | |
| FR2651005A1 (fr) | Lignees de cellules infectables par un retrovirus et contenant un marqueur activable a l'occasion de l'infection | |
| Gautam et al. | Evidence that Vpu modulates HIV-1 Gag-envelope interaction towards envelope incorporation and infectivity in a cell type dependent manner | |
| EP1006123A2 (fr) | Protéines d'enveloppe, methodes et utilisations | |
| Truncations | Fusogenicity of Jaagsiekte Sheep | |
| Milev et al. | Research Live cell visualization of the interactions between HIV-1 Gag and the cellular RNA-binding protein Staufen1 | |
| FR2777007A1 (fr) | Mutants de glycoproteines d'enveloppes de retrovirus et leurs applications biologiques | |
| Novakovic | Protein motifs in the cytoplasmic tail of the bovine leukemia virus transmembrane protein govern protein expression on the cell surface | |
| Bertrand | Understanding the mechanisms of entry of Jaagsiekte sheep retrovirus | |
| Occur | Receptor-Mediated Moloney Murine | |
| Ryu | Modification of a retroviral envelope protein to achieve cell type specific targeted entry |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| ST | Notification of lapse |