FR2796839A1

FR2796839A1 - Utilisation d'une fraction proteique de la graine de la plante vigna trilobata dans une composition cosmetique ou dermopharmaceutique

Info

Publication number: FR2796839A1
Application number: FR9909766A
Authority: FR
Inventors: Gilles Pauly; Philippe Moser; Veronique Gillon
Original assignee: Laboratoires Serobiologiques SA
Current assignee: BASF Health and Care Products France SAS
Priority date: 1999-07-26
Filing date: 1999-07-26
Publication date: 2001-02-02
Anticipated expiration: 2019-07-26
Also published as: FR2796839B1; WO2001007005A1; AU6276500A

Abstract

La présente invention a pour objet l'utilisation en tant qu'agent actif dans une composition cosmétique ou dermopharmaceutique à usage topique pour la peau, les phanères et/ ou les muqueuses d'au moins une fraction protéique soluble extraite de la graine de la plante Vigna trilobata.

Description

DESCRIPTION La présente invention concerne le domaine de la cosmétique et de la dermopharmacologie, et a pour objet l'utilisation d'au moins un extrait protéique de la graine de la plante Vigna trilobata, ainsi qu'un produit cosmétique comprenant un tel extrait.

Dans les pays en voie de développement, la recherche de nouvelles sources alimentaires et notamment de protéines, bon marché et de qualité, constitue un des buts principaux des autorités responsables de l'alimentation et de la nutrition.

De ce fait, la recherche de nouvelles sources alimentaires dans les lignées de plantes légumières domestiquées ou dans les plantes sauvages retient depuis quelques années leur attention.

En Inde du sud, les graines matures de Vigna trilobata sont connues pour être grillées et consommées par la "secte tribale" kurumba elles sont également consommées par les habitants les plus pauvres de ces régions.

Cette plante est mentionnée dans différents articles anciens sous la dénomination Phaseolus trilobus Ait (voir notamment G.C. Toms J. Pharmacy & Pharmacol, vol. 30, 79 P, 1978) et sa composition chimique et son potentiel nutritif ont été décrits par P. Siddhuraju, K. Vijayakumari et K. Janardanan ("Nutritionnal and chemical évaluation of raw seeds of thé tribal pulse Vigna trilobata" (L.) Verdc. International journal of food sciences and nutrition (1992), 43, n 2, 97-103).

La composition chimique (g/100 g de farine de graines) des graines de Vigna trilobata est d'après cet article la suivante - humidité : 5, 19 - protéines (N x 6,25) : 20,31 - fibres : 8,81 %, - lipides : 5,54 - cendres :2,71 avec une énergie de 1594 kJ/100 g matière sèche.

La composition minérale de ces graines laisse apparaître une richesse en potassium (1397 mg/100 g de farine), en calcium (464 mg/100 g de farine), en magnésium (29l mg/100 g de farine). D'un point de vue nutritionnel, la composition en acides aminés indique que les acides aminés souffrés (cystine et méthionine), la thréonine et fisoleucine sont présents en quantités limitées, alors que les teneurs en valine, leucine, tyrosine, phénylalanine et lysine sont suffisantes.

La fraction globuline des protéines aurait une activité hémagglutinante vis à vis des groupes A, B, O.

Or, les inventeurs ont constaté, de manière inattendue et surprenante, qu'en dehors de leurs propriétés nutritives, les extraits protéiques des graines de Vigna trilobata présentent également, en application topique sur la peau, les phanères et les muqueuses, des effets biologiques particuliers et une très bonne tolérance et que l'utilisation, en tant qu'agent actif, unique ou associé à au moins un autre agent actif, d'au moins une fraction protéique soluble extraite de Vigna trilobata dans une composition ou un produit cosmétique ou dermopharmaceutique permet d'aboutir à des propriétés spécifiques identifiables et quantifiables en application topique sur la peau, les phanères et/ou les muqueuses.

Ainsi, il a été notamemnt constaté des effets adoucissant, biofilmogène et tenseur confirmés par des mesures biophysiques, des effets conditionneur et réparateur, ainsi que des effets anti-irritant, apaisant et anti- peau sensible (traitement préventif et curatif des peaux sensibles).

Il a également été constaté que ces extraits facilitaient le coiffage des cheveux secs et mouillés et amélioraient la douceur et la souplesse des cheveux non endommagés.

Les tests effectués par les inventeurs ont d'autre part mis en évidence les propriétés supplémentaires suivantes - un fort pouvoir nutritif cellulaire, - des effets de stimulation de la croissance et du métabolisme cellulaire (activité énergisante, stimulante, anti-vieillissement), - une activation et stimulation de la contraction des lattices de collagène et de la sécrétion de glycosaminoglucanes (action cicatrisante, raffermissante, tonifiante, réduction de l'atrophie du derme), - une forte activité anti-apoptose, - une activité cytophotoprotectrice élevée vis à vis du stress oxydatif produit par les rayonnements UV-A, - une diminution de l'inflammation induite par les rayonnements UV-B, - une activité anti-protéase pouvant déboucher sur une activité anti-élastase.

Dans ce qui suit, on décrira différents exemples de procédés d'obtention des extraits précités, puis les tests mis en oeuvre pour la caractérisation et l'évaluation des propriétés desdits extraits découverts par les inventeurs.

I) PREPARATION DES EXTRAITS PROTEIQUES DE GRAINES DE VIGNA TRILOBATA La préparation des protéines est réalisée par les techniques conventionnelles d'extraction des protéines végétales, de préparation des concentrés ou isolats protéiques, ou de purification (ultrafiltration, chromatographie d'échange d'ions, chromatographie d'affinité, précipitation, adsorption) connues de l'homme de l'art.

Toutefois, de manière préférentielle, l'extraction se fera par l'eau ou une solution aqueuse à pH donné, éventuellement par l'intermédiaire d'un générateur à ultrasons.

A titres d'exemples illustratifs et non limitatifs, on décrira ci- après différents procédés d'obtention et de préparation d'extraits protéiques à partir de deux lots distincts de graines de Vigna trilobata d'origine indienne.

La teneur en protéines (N x 6,25) des deux lots de graines appelées respectivement A et B est respectivement de 20,75 % et 20,92 %. EXEMPLE I On ajoute dans1,25 litres d'eau distillée 125 g de farine obtenue par broyage de graines sèches de Vigna trilobata.

Après 15 minutes d'agitation, le pH de la solution est ajusté à pH 7,5 avec de la soude.

L'extraction est menée pendant 2 heures à température ambiante en maintenant le pH d'extraction à 7,5.

Après centrifugation pendant 10 minutes à 5000 g, le surnageant beige est recueilli, puis filtré sur 0,5 pm.

L'extrait peut être déshydraté par les techniques communes telles que l'atomisation, la lyophilisation ou analogue.

Après atomisation, le produit poudreux obtenu présente une teneur en protéines (N x 6,25) de 42,5 % (extrait la). Un deuxième extrait préparé dans les mêmes conditions sur un lot différent de graines permet d'obtenir un extrait qui présente une teneur en protéines (N x 6,25) de 46,4 % (extrait lb).

EXEMPLE 2 On ajoute dans 2,5 litres d'eau distillée 250 g de farine obtenue par broyage de graines de Vigna trilobata, et on traite la solution comme dans l'exemple 1.

On obtient 2,15 litres d'une solution beige.

Le pH de la solution est ajusté à pH 4,5 avec de l'acide sulfurique et laissée sous agitation pendant 30 minutes.

La solution est ensuite centrifugée pendant 15 minutes à 5 000 g : le précipité et le surnageant sont recueillis.

Le précipité est mis en solution dans un volume d'eau correspondant à 20 % du volume avant précipitation. Le pH de la solution est ajusté avec NaOH jusqu'à ce qu'il se stabilise à 7,5.

La solution est de nouveau centrifugée pour éliminer l'insoluble. On obtient 600 ml d'une solution d'extrait sec de 3,5 % que l'on déshydrate par atomisation.

Après atomisation, le produit poudreux obtenu présente une teneur en protéines (N x 6,25) de 80,6 % (extrait 2a).

Un deuxième extrait préparé dans les mêmes conditions sur un lot différent de graines permet d'obtenir un extrait qui présente une teneur en protéines (N x 6,25) de 80,7 % (extrait 2b).

Des expériences de précipitation fractionnée à différents pH mènent aux résultats suivants

Nature <SEP> de <SEP> la <SEP> fraction <SEP> Teneur <SEP> en <SEP> protéines <SEP> (%)
<tb> Précipité <SEP> H <SEP> 6,5 <SEP> 65,3
<tb> Précipité <SEP> H <SEP> 6,0 <SEP> 83,1
<tb> Précipité <SEP> H <SEP> 5,5 <SEP> 85,0
<tb> Précipité <SEP> H <SEP> 5,0 <SEP> 84,8 EXEMPLE 3 Les surnageants obtenus après précipitation des protéines à pH 4,5 selon l'exemple 2 sont filtrés sur 0,5 pm puis 0,22 l.im : les solutions claires obtenues sont déshydratées par atomisation.

La poudre obtenue présente une teneur en protéines de 15 % à 20 % et une activité inhibitrice de la trypsine déterminée selon la technique de Kakade de 8,4 TUI/mg à13,3 TUI/mg.

Ces fractions peuvent donc servir de base à la purification d'inhibiteurs de protéases (en vue de l'utilisation d'un extrait consistant en une fraction enrichie en inhibiteurs de protéases).

EXEMPLE 4 200 ml de l'extrait brut (pH 7,5) préparé selon l'exemple 1 sont transférés dans une cellule d'ultrafiltration du type Amicon 8200 munie d'une membrane d'ultrafiltration de100 000 Da (ré YM100, diamètre 6 cm).

La solution est concentrée jusqu'à 50 ml (pression d'air comprimé 3 bars).

Le perméat P1 et le rétentat RI sont recueillis.

On ajoute au rétentat 150 ml d'eau distillée et on concentre de nouveau la solution jusqu'à 50 ml (rétentat R2).

Le rétentat R2 est déshydraté par lyophilisation : on obtient une fraction ayant une teneur de 80,7 % en protéines (N x 6,25).

EXEMPLE 5 Un concentré protéique est préparé selon l'exemple 2 à partir de 350 g de graines, l'extraction initiale se déroulant avec un rapport farine / solvant de 1I15. Le précipité est solubilisé à pH 7,5 dans 1,5 litres d'eau distillée. On obtient au final 500 ml de solution de concentré protéique à 57,53 g/1 de protéines (N x 6,25).

Les protéines sont hydrolysées à pH compris entre 7,5 et 8,5 à l'aide d'une protéase alcaline (2,5 % par rapport aux protéines de la solution).

L'hydrolyse est menée pendant 2 heures à la température et au pH optimums de l'enzyme utilisée et connus de l'homme du métier. L'enzyme est inactivée par chauffage à l00 C pendant au minimum 10 minutes. Après refroidissement à température ambiante, la solution est centrifugée puis filtrée jusqu'à 0,22 gym.

On obtient 460 ml de filtrat limpide foncé à 6,39 % d'extrait sec (protéines 45,2 g/1).

Après atomisation, la poudre obtenue présente une teneur en protéines de 70,75 % (extrait 3a).

L'analyse en perméation de gel sur colonne type Superose 12 HR des fractions extraites par ces différentes méthodes permet de caractériser au moins 10 fractions protéiques plus ou moins importantes selon les extraits et visibles, à titres d'exemples, sur la figure 1 (distribution des composés protéiques de l'extrait lb) et sur la figure 2 (distribution des composés protéiques de l'extrait obtenu dans l'exemple 4), à savoir - une fraction (notée FI) de très haut poids moléculaire (supérieure à 500 000 Da et proche de 1000 000 Da d'après l'étalonnage de la colonne), - une fraction F2 de poids moléculaire compris entre 250 000 Da et 300 000 Da (295 000 Da), - une fraction F3 de poids moléculaire compris entre 100 000 Da et 150 000 Da (138 000 Da), - quatre fractions notées F4, F5, F6 et F7 de poids moléculaires compris entre 5 000 Da et 70 000 Da, - trois fractions notées F8, F9 et F 10 de poids moléculaires compris entre 500 Da et 3 000 Da.

Les composants de l'hydrolysât réalisé selon l'exemple 5 précédent présentent un poids moléculaire moyen de 3 000 Da (voir figure 3 : courbe de même type que celles des figures 1 et 2).

Les extraits obtenus au moyen des exemples de procédé décrits sont directement utilisables sous forme liquide, ou après séchage selon les techniques conventionnelles de déshydratation (atomisation, lyophilisation).

Les fractions protéiques peuvent être utilisées soit sous leur forme native, sans modification des structures, soit sous la forme d'association(s) naturelle(s) d'au moins deux ou de toutes les fractions extraites de poids moléculaires apparents différents et correspondant aux différents pics de chromatogrammes représentés sur les dessins annexés et présentes naturellement dans les graines (extrait protéique total ou partiel) ou sous forme isolée. Les fractions protéiques peuvent être utilisées dans les compositions sous leur forme modifiée ou fonctionnalisée par l'un quelconque des traitements suivants - la polymérisation des protéines natives ; - l'hydrolyse chimique des protéines natives ; - l'hydrolyse enzymatique des protéines natives par des protéases d'origine animale, végétale, microbienne, ou fongique : pepsine, trypsine, chymotrypsine, papaïne, pronase, bromelaine, endoprotéinase, thermitase, protéases de Bacillus subtillis, d'Aspergillus niger ou d'Aspergillus aryzae (subtilisine, alcalase, neutrase) ; - transformation microbienne avec utilisation de protéines de Vigna trilobata en tant que substrat de fermentation par divers microorganismes comme les levures (Saccharomyces), moisissures (Aspergillus), bactéries (Bacillus et analogues) ; - fonctionnalisation chimique ou enzymatique par des procédés tels que la désamidation, succinilation ou phosphorylation ; - quaternisation ; - greffage de molécules saccharidiques ou lipidiques ou toute autre modification chimique par greffage.

Les extraits ou fractions protéiques solubles selon l'invention peuvent également être incorporés ou associés à tout autre vecteur cosmétique adéquat comme, par exemple, les agents filmogènes, les liposomes, les cyclodextrines, les micelles, les macro-, micro- et nanoparticules ainsi que les macro-, micro- et nanocapsules ou encore être absorbées ou greffées sur des polymères organiques ou des supports minéraux. II) MISE EN ÉVIDENCE DES PROPRIETES DES EXTRAITS PROTÉIQUES DE VIGNA TRILOBATA Les propriétés et activités biologiques des extraits protéiques de Vigna trilobata ont pu être déterminées et mesurées par des tests connus de l'homme de l'art dont les résultats sont présentés ci-après 1) EFFETS SUR LA CROISSANCE CELLULAIRE Des fibroblastes humains sont ensemencés dans un milieu optimum (avec SVF) et incubés 24 heures à 37 C.

Le milieu de croissance est remplacé ensuite par un milieu sub- optimum (sans SVF) contenant différentes concentrations d'extraits selon la description de l'invention. Après une incubation de 3 jours, la croissance a été évaluée par un dénombrement des cellules adhérentes par un compteur automatique de particules et par dosage du taux d'ATP intracellulaire.

Les essais sont réalisés en triplicata et répétés deux ou trois fois. Les résultats sont calculés par rapport à une gamme étalon puis exprimés en pourcentage par rapport au témoin non traité et enfin présentés sous forme de moyenne avec SEM (erreur type de la moyenne).

Les résultats de la figure 4 montrent que les extraits 1 a et 2a à des doses comprises entre 0,003 % et 0,03 % (p/v - poids/volume) augmentent nettement le nombre de cellules et le taux d'ATP dans les fibroblastes humains en croissance in vitro (les figures 4A et 4B représentent respectivement les cellules dénombrées à trois jours et le taux d'ATP à trois jours pour différentes concentrations en extraits la et 2a).

2) EFFETS SUR LA SURVIE Le test est réalisé sur des fibroblastes selon le même protocole que la croissance, la durée d'incubation étant de 72 heures.

La survie a été évaluée par dosage du taux - de protéines, - d'adénosine triphosphate (ATP), composé riche en énergie, produit principalement par les mitochondries et nécessaire à l'activité des nombreuses enzymes de la machinerie cellulaire, - du glutathion (GSH), peptide produit directement par la cellule pour lutter contre le stress oxydatif ou divers polluants comme les métaux lourds. Sa synthèse nécessite l'ATP comme source d'énergie.

Le mode d'expression des résultats est identique à celui du test de croissance. Les figures 5A et 5B représentent respectivement les taux de protéines et les taux de GSH mesurés à trois jours pour différentes concentrations en extraits 2a, 2b et 3.

Les résultats des figures 5A et 5B (figure 5) indiquent que les extraits protéiques de Vigna trilobata selon l'exemple 2 à 0,05 % (p/v) augmentent nettement le taux de protéines et de glutathion dans les fibroblastes humains en survie in vitro.

L'extrait selon l'exemple 3 à 0,01 % (p/v) augmente également légèrement le taux de protéines et de glutathion dans les fibroblastes humains en survie in vitro.

Ces résultats indiquent que les extraits protéiques natifs ou hydrolysés de Vigna trilobata selon l'invention présentent de fortes capacités pour améliorer la croissance et le métabolisme (synthèse de l'ATP, des protéines et du glutathion) par les fibroblastes humains, ce qui indique nettement une activité énergisante, stimulante et "anti-vieillissement" de ces extraits.

3) MISE EN EVIDENCE DE L'ACTIVATION DE LA CONTRACTION DES LATTICES DE COLLAGENE a)Principe La contraction des lattices de collagène résulte d'un ensemble de fonctions biologiques mises en oeuvre par les fibroblastes qui permet in vivo la cicatrisation des plaies et aussi le maintien d'un derme de qualité.

Ainsi, la contraction des lattices de collagène in vitro constitue un bon modèle pour évaluer les capacités d'une substance à activer la cicatrisation ou à réduire l'atrophie du derme de la personne âgée.

b)Mode opératoire - mise en suspension des fibroblastes humains par trypsinisation, - mélange des fibroblastes humains avec un milieu de culture contenant des extraits selon l'invention et une solution de collagène type I, - incubation 14 jours à 37 C, C02 = 5 %, - mesure de deux diamètres orthogonaux tous les 2 à 3 jours et calcul de la surface en cm2, - coloration des GAG par le bleu alcian et quantification de l'intensité de coloration de l'auréole entourant les fibroblastes par un analyseur d'images. Les figures 6 et 7 des dessins annexés représentent respectivement les surfaces des lattices en cm2 et les taux de GAG sécrétés (en intensité de coloration péricellulaire) au 14ème jour d'incubation avec différentes concentrations d'extraits 2a et 2b.

En règle générale, dans un milieu de culture sans sérum de veau foetal (SVF), il n'y a pas de contraction des lattices de collagène.

La vitesse et l'intensité de la contraction des lattices varient sensiblement d'un essai à l'autre, mais en comparant les résultats à l'intérieur d'un même essai, on peut noter que - le SVF a permis la contraction des lattices de collagène par les fibroblastes humains, - les extraits protéiques de Vigna trilobata selon l'exemple 2 assurent à eux seuls la contraction des lattices aussi bien ou mieux que le SVF et cet effet est retrouvé en présence de SVF à 2 %, - de plus, le taux de GAG sécrété par les fibroblastes est augmenté en présence de l'extrait 2b.

Ces résultats indiquent une activité raffermissante et tonifiante des extraits selon l'invention ainsi qu'une capacité à réduire l'atrophie du derme chez la personne âgée.

4) MISE EN ÉVIDENCE D'UNE ACTIVITÉ ANTI- APOPTOSE a)Principe L'apoptose est un processus biologique actif utilisé par les organismes vivants pour éliminer certaines cellules de leurs tissus, par autolyse avec en particulier une destruction des protéines et de l'ADN nucléaire en petits fragments relargués dans le cytoplasme.

Ces petits fragments d'ADN sont pris comme paramètre d'évaluation du taux d'apoptose induite dans les kératinocytes en culture in vitro.

L'apoptose peut aussi être induite par un stress oxydatif (UV-R, inflammation), par une privation en facteurs de croissance ou par des substances toxiques (polluants, agents génotoxiques,...).

Le principe du test est de mettre en évidence les capacités des extraits selon l'invention à réduire le taux d'apoptose induite dans une culture de cellules carencées en facteurs de croissance.

b)Préparation des cellules humaines Les kératinocytes humains sont ensemencés dans un milieu de culture complet (avec du sérum de veau foetal ou SVF) contenant un marqueur del'ADN: la Bromodésoxy-uridine ou BrdU.

Les cellules reçoivent ensuite un milieu de culture sans sérum contenant les diverses concentrations des substances à tester et sont incubées durant 1 à 2 jours à 37 C. Après incubation, les cellules sont récupérées par trypsination puis analysées.

c)Quantification du taux de cellules apoptotiques Dans cette méthode, les cellules sont lysées et le taux de cellules apoptotiques est quantifié par un test ELISA révélant le BrdU incorporé dans les fragments d'ADN cytoplasmiques.

Les résultats sont exprimés en pourcentage par rapport au témoin (Henseleit U, Rosenbach T, Kolde G : "Induction of apoptosis in human HaCaT keratinocytes.", Archiv. Dermatol. Res., (288) 11, 676-683, 1996). d)Conclusions Les figures 8A à 8D représentent les numérations des cellules et les taux d'apoptose (taux de fragments d'ADN) pour les extraits la, lb, 2a et 2b pour différentes concentrations.

Les résultats de la figure 8 montrent que - dans les kératinocytes traités par les extraits 1 a et 1 b à 0,01 et 0,03 % (p/v), le taux d'apoptose chute fortement par rapport au lot témoin traité par un milieu sans SVF, - dans les kératinocytes traités par les extraits 2a et 2b à des doses comprises entre 0,01 % et 0,02 % (p/v), le taux d'apoptose chute fortement par rapport au lot témoin traité par un milieu sans SVF.

Les extraits selon l'invention ont présenté des capacités significatives à réduire le taux d'apoptoses induites dans une culture de cellules humaines privées de facteurs de croissance ce qui indique de fortes capacités de ces extraits à lutter contre le vieillissement des tissus par un effet "growth-factor-like" (type facteur de croissance).

5) MISE EN EVIDENCE DES CAPACITES DE CYTOPROTECTION VIS A VIS D'UN STRESS OXYDATIF a)Principe Le but de ce test est d'évaluer les capacités anti-stress oxydatif des extraits protéiques de Vigna trilobata selon l'invention par un test sur fibroblastes humains en culture in vitro.

Ce test in vitro évalue les capacités de cytophotoprotection des fibroblastes humains vis à vis des UV-A. Les UV-A sont choisis comme modèle d'étude car ils pénètrent jusque dans le derme et ils induisent dans la peau un stress oxydatif révélé en particulier par une lipoperoxydation des membranes cytoplasmiques et par une chute de l'activité de nombreuses enzymes dont la catalase. Les lipoperoxydes formés se fragmentent en malonaldialdéhyde responsable de la réticulation de nombreuses molécules biologiques comme les protéines (inhibition d'enzymes) et les bases nucléiques (mutagenèse).

De plus, il a été démontré que l'inhibition de la catalase rendait les fibroblastes très sensibles au peroxyde d'hydrogène (H202) induit par les UV-B ou par les UV-A.

En effet, H202 doit être rapidement éliminé, car sinon il forme en présence du fer des radicaux hydroxyles (HO') très toxiques. b)Test de cytophotoprotection Les fibroblastes sont ensemencés dans un milieu de culture défini avec du sérum de veau foetal (SVF).

Les extraits de Vigna trilobata selon l'invention ont été ajoutés 2 à 3 jours après l'ensemencement.

Après une incubation de 1 à 2 jours à 37 C et C02 = 5 %, le milieu de culture est remplacé par une solution saline et les fibroblastes sont irradiés par une dose d'UV-A (3 à 15 J/cm2).

Dès la fin de l'irradiation, le taux de MDA (malonaldialdéhyde) est dosé dans la solution saline surnageante et les taux de protéines, de glutathion réduit (GSH) et de catalase active sont mesurés dans les fibroblastes. Le MDA est dosé par la réaction à l'acide thiobarbiturique et les protéines selon la méthode dite de Bradford tandis que le GSH est dosé par une sonde fluorescente. Le taux de catalase active est dosé selon une méthode spectrophotométrique et l'activité de la catalase est rapportée au taux de protéines mesuré dans les fibroblastes.

c)Conclusion Les figures 9A et 9B représentent les taux mesurés de MDA, de protéines, de GSH et de catalase représentant l'activité cytophotoprotectrice relative (% par rapport aux témoins) des extraits l a et 2a.

Les résultats de la figure 9 montrent que les extraits de Vigna trilobata selon l'invention ont présenté des capacités significatives à réduire les taux de lipoperoxydes induits et le taux de catalase inhibée par les UV-A appliqués sur une culture de fibroblastes humains en survie in vitro.

Ils pourraient agir au moins en partie par une activation de la synthèse du glutathion dans les fibroblastes.

Ces résultats indiquent donc de fortes capacités des extraits de Vigna trilobata à réduire les effets nocifs d'un stress oxydatif sur la peau.

6) MISES EN ÉVIDENCE DES PROPRIETES ANTI- INFLAMMATOIRES IN VITRO a)Principe Le but de ces tests est de mettre en évidence les capacités anti- inflammatoires des extraits de Vigna trilobata sur une culture de kératinocytes humains en survie in vitro.

Les UV-B ont été choisis comme agent inducteur car ils déclenchent une inflammation cutanée (érythème, oedème) par activation d'enzymes telle que la phospholipase A2 (PLA2) qui libère l'acide arachidonique (acide gras insaturé) présent dans les membranes biologiques. Ceci entraine à la fois une dégradation des membranes et la synthèse de médiateurs de l'inflammation, car l'acide arachidonique est transformé sous l'action d'enzymes appelées "cyclo-oxygénases", en prostaglandines (PG) comme les PGE2. Les PGE2 sont relarguées hors de la cellule et vont induire par fixation sur des récepteurs spécifiques, un érythème et un oedème. De plus, les UV-B induisent des lésions de l'ADN dans les kératinocytes qui peuvent être directes comme les dimères de thymidine ou indirectes comme dans le cas de l'apoptose (induite par les UV) où l'ADN est fragmenté puis relargué dans le cytoplasme sous forme de petits fragments.

b)Mode opératoire L'ensemble des effets des UV-B a été évalué sur les cultures de kératinocytes in vitro.

* Préparation des kératinocytes - ensemencement dans un milieu de culture complet contenant le cas échéant du BrdU (bromodésoxyuridine) pour le dosage de fragments d'ADN cytoplasmiques, - incubation pendant 3 jours à 37 C, - mise en place des actifs dans une solution saline glucosée, - irradiation par les UV-B avec une dose de 50 mJ/cm2, - incubation un jour à 37 C * Dosages Récupération du milieu surnageant pour - le dosage de la LDH active pour évaluer les effets délétères des UV-B sur les membranes, - le dosage du taux de PGE2 (test ELISA).

Récupération des kératinocytes adhérents par trypsinisation pour - un dénombrement par un compteur automatique de particules, - le dosage du taux de fragments d'ADN cytoplasmiques (test ELISA) pour évaluer les effets délétères des UV-B sur l'ADN.

Les résultats sont calculés par rapport à une gamme étalon puis rapportées au nombre de cellules et exprimés en % par rapport au témoin non traité et irradié. c)Conclusion Les figures 10A et 10B des dessins annexés représentent les activités relatives en termes de propriétés anti-inflammatoires des extraits la, 1 b, 2a et 2b.

Les résultats de la figure 10 indiquent que les différents extraits de Vigna trilobata selon l'invention (à 0,01 % ou 0,02 %) ont sensiblement réduit les effets des UV-B sur le nombre de kératinocytes, sur le taux de LDH et de PGE2 relarguées et sur le taux de fragments d'ADN cytoplasmiques.

Ces extraits de Vigna trilobata selon l'invention présentent donc des capacités élevées à réduire les lésions induites par les UV-B sur les membranes biologiques et sur l'ADN et à réduire le processus inflammatoire induit par les UV-B sur les kératinocytes humains.

7) MISE EN EVIDENCE D'UNE ACTIVITE ANTI-PEAU SENSIBLE PAR UN TEST A LA CAPSAÏCINE a)Principe de l'essai L'essai consiste en une appréciation sensorielle des effets générés après une application standardisée de capsaïcine à 0,075 % in vivo chez l'homme : irritation, brûlure, douleur et érythème. L'essai est mené dans des conditions standardisées de température et d'humidité relative, sur un sujet très sensible à la capsaïcine au niveau du visage, par un manipulateur expert ; tous deux sont entraînés à la description sensorielle des effets observés au cours du test.

b)Mise en évidence de l'activité anti-peau sensible Sur une zone cutanée délimitée au niveau de la joue, l'extrait 2a incorporé à 1,5 % dans une émulsion H/E a été appliqué. 30 minutes après séchage, une crème dosée à 0,075 % de capsaïcine a été ensuite également appliquée. Pendant les 30 minutes suivantes, les effets générés par la capsaïcine sont évalués sur une échelle semi-quantitative à 4 points (de 0 = nul à 3 = sévère) - par le sujet : irritation, brûlure, douleur en fonction de son ressenti, - par le manipulateur expert : érythème.

L'essai est réalisé contre placebo (émulsion H/E seule) et contre témoin (peau non traitée au préalable, recevant la crème à la capsaïcine seule). Dans ces conditions, l'extrait 2a améliore les paramètres de douleur et d'irritation de 83 % (25 % pour le placebo) et le paramètre érythème de 22 % (14 % pour le placebo), démontrant son effet apaisant, anti-irritant et anti-peau sensible.

8) MISE EN EVIDENCE D'UN EFFET TENSEUR PAR UNE MESURE QUANTITATIVE IN VIVO CHEZ L'HOMME A L'AIDE D'UNE TECHNIQUE D'EXTENSIONMETRIE HORIZONTALE a)Principe de l'essai L'essai consiste à mesurer le déplacement de la peau en fonction d'une force sinusoïdale constante qui est appliquée parallèlement à sa surface. Les mesures sont réalisées au moyen d'un dispositif du type de celui objet de la demande de brevet français n 98 12125 au nom de la demanderesse. Le traitement des signaux de force et d'allongement par une ellipse d'hystérèse permet de calculer l'effort dynamique ou DSR (Dynamic Spring Rate). L'application d'un produit tenseur à la surface de la peau se traduit par une augmentation du DSR, conséquence à force constante d'une diminution de l'allongement de la peau lors de la contrainte. L'appareillage est entièrement piloté par ordinateur. Les essais sont menés dans des conditions standardisées de température et d'humidité relative.

b)Mise en évidence de l'activité Sur une zone cutanée située sur le dos de la main du volontaire, un pion est collé à l'aide de colle super glue. Cinq mesures d'extensiométrie horizontale sont alors réalisées sur la peau non traitée témoin. Puis le véhicule placebo est appliqué. Après 5 minutes de séchage, cinq mesures servent à contrôler l'effet du véhicule.

Puis enfin la peau est à nouveau traitée avec le principe actif dont l'effet tenseur est mesuré par les cinq dernières mesures après 5 minutes d'attente. Lors de chaque étape, la moyenne des cinq mesures est effectuée. Les résultats finaux sont exprimés en % de variation du DSR entre, d'une part, l'effet produit par le véhicule placebo (eau) et, d'autre part, l'activité du principe actif.

Dans ces conditions, l'extrait 2a testé sur un sujet volontaire sain féminin, en solution aqueuse à la concentration de 1,5 % a augmenté le DSR de 76 %, démontrant son effet tenseur cutané. 9) MISE EN EVIDENCE D'UN EFFET ADOUCISSANT PAR UNE MESURE QUANTITATIVE IN VIVO CHEZ L'HOMME A L'AIDE D'UNE TECHNIQUE DE FRICTIOMETRIE a)Principe de l'essai L'essai consiste à appliquer sur la peau une force constante par l'intermédiaire d'un patin qui est mis en rotation à vitesse et pression contrôlées. Le couple de frottement est mesuré. Il permet de calculer le coefficient de friction du patin sur la peau. Le coefficient de friction dépend de l'état de surface de la peau, notamment de son hydratation et de sa douceur. Plus la peau est hydratée et douce au toucher, plus le coefficient de friction augmente. L'appareillage est entièrement piloté par ordinateur. Les essais sont menés dans des conditions standardisées de température et d'humidité relative.

b)Mise en évidence de l'activité Sur une zone cutanée de 9 cm2 sur la face antéro-interne de l'avant-bras du volontaire, une mesure de frictiométrie est réalisée sur la peau sans traitement (T0). Puis le principe actif est appliqué. Après 15 minutes de séchage, une mesure de frictiométrie sert à contrôler l'efficacité du principe actif (T15). Simultanément, une zone cutanée voisine témoin est mesurée dans les mêmes conditions. Le résultat est exprimé en différence de de variation entre TO et T l 5 de la zone traitée par rapport à la zone témoin.

Dans ces conditions, l'extrait 2a testé sur un sujet volontaire sain féminin, en solution aqueuse à la concentration de 1,5 % augmente le coefficient de friction de 20,9 % démontrant son efficacité d'amélioration de la douceur et de l'hydratation cutanées.

La présente invention a également pour objet une composition cosmétique ou dermopharmaceutique à usage topique pour la peau, les phanères et/ou les muqueuses, comportant à titre d'agent actif, unique ou associé à au moins un autre agent actif, au moins une fraction protéique extraite de graines de Vigna trilobata.

Cette composition cosmétique pourra comporter à titre d'agent actif unique ou associé à au moins un autre agent actif, au moins un extrait du type précité utilisé pour produire au moins l'un des effets biologiques particuliers décrits précédemment, voire plusieurs de ces effets en combinaison. La composition cosmétique ou dermopharmaceutique selon l'invention pourra avantageusement comporter entre0,001 % et 50 % en poids de fraction(s) protéique(s) extraites de graines de Vigna trilobata (extraits tels qu'obtenus par l'un des procédés précités), éventuellement intégrés dans des vecteurs cosmétiques adaptés, tels que les liposomes, les macro-, micro- et nanocapsules, les macro-, micro- et nanoparticules et autres formes analogues connues.

Les extraits précités peuvent être utilisés, non seulement pour des applications de soins et d'hygiène de la peau (produits pour le visage et le corps, produits de jour ou de nuit, produits solaires, produits revitalisants et régénérants, produits antirides, produits amincissants, produits anti- vieillissement) mais également dans le domaine des soins et de l'hygiène capillaires, sous différentes formes galéniques telles que lotion ou shampooing, crèmes, mousses, savons, bâtonnets, gels, hydrogels, produits à pulvériser, émulsions, produits protecteurs, réparateurs, adoucissants, filmogènes et photoprotecteurs ; produits pour permanente et produits de coloration.

A titre d'exemples non limitatifs, on décrira ci-après différents exemples de réalisations pratiques de compositions cosmétiques selon l'invention, ainsi que les principales étapes de leurs procédés d'obtention. Exemple 1 Un produit cosmétique sous forme de crème nutritive, raffermissante, tonifiante et énergisante, qui est destinée à lutter notamment contre le vieillissement cutané, l'atrophie du derme et la perte d'élasticité de la peau, pourra être constitué des phases suivantes

Phase <SEP> grasse
<tb> ceteareth <SEP> 25 <SEP> 2,00
<tb> ceteareth <SEP> 6 <SEP> et <SEP> alcool <SEP> stéarilyque <SEP> 1,00
<tb> alcool <SEP> cétylique <SEP> 4,00
<tb> stéarate <SEP> de <SEP> glycol <SEP> 4,00
<tb> pétrolatum <SEP> 5,00
<tb> triglycérides <SEP> capryliques <SEP> /capriques <SEP> 5,00
<tb> Phase <SEP> aqueuse
<tb> glycérine <SEP> 10,00
<tb> protéines <SEP> de <SEP> Vigna <SEP> selon <SEP> l'exemple <SEP> 1 <SEP> de <SEP> procédé <SEP> 5,00 -18- eau distillée 8,50 conservateur Elestab 4112 (Laboratoires Sérobiologiques) 0,40 parfum 0,30 eau distillée qsp 100,00 Le procédé de préparation de la crème précitée consiste essentiellement à porter la phase grasse à 80 C, à porter la phase aqueuse également à 80 C et à y dissoudre l'Elestab 4112, à préparer séparément la solution mère d'extrait de Vigna, à verser la phase grasse dans la phase aqueuse sous agitation turbine, puis, aux environs de 50 C, à y introduire la solution mère d'extrait de Vigna et enfin à poursuivre l'agitation jusqu'au refroidissement.

EXEMPLE 2 Un produit cosmétique sous forme de crème adoucissante, bïofilmogène, apaisante et cicatrisante, qui est destinée à lutter notamment contre les agressions solaires et liées à la pollution et à traiter les peaux sensibles (anti-irritante, diminuant l'inflammation) pourra être constitué des phases suivantes

Phase <SEP> grasse
<tb> stéarate <SEP> de <SEP> glycol <SEP> 14,00
<tb> octyl <SEP> dodécanol <SEP> 6,00
<tb> adipate <SEP> dibutylique <SEP> 6,00
<tb> ceteareth <SEP> 12 <SEP> 1,50
<tb> ceteareth <SEP> 20 <SEP> 1,50

Phase <SEP> aqueuse
<tb> PVP <SEP> (polyvinylpyrrolidone) <SEP> 0,50
<tb> glycérine <SEP> 4,00
<tb> Elestab <SEP> 388 <SEP> (Laboratoires <SEP> Sérobiologiques) <SEP> 2,00
<tb> protéines <SEP> de <SEP> Vigna <SEP> selon <SEP> l'exemple <SEP> 2 <SEP> (extrait <SEP> 2a) <SEP> 5,00
<tb> eau <SEP> distillée <SEP> 9,00
<tb> parfum <SEP> 0,20
<tb> eau <SEP> distillée <SEP> qsp <SEP> 100,00 Le procédé de préparation de la crème précitée consiste essentiellement à porter la phase grasse à 80 C, à porter la phase aqueuse également à 80 C et à y dissoudre Elestab 388 et PVP, à verser la phase grasse dans la phase aqueuse sous agitation turbine à 80 C, puis, à refroidir progressivement sous agitation, à y introduire ensuite, aux environs de 50 C, la dispersion mère de l'extrait de Vigna et enfin à poursuivre l'agitation jusqu'au refroidissement.

EXEMPLE 3 Un produit cosmétique sous forme de lotion capillaire conditionneuse, non rincée et biofilmogène, qui est destinée notamment à faciliter le coiffage des cheveux et à améliorer la douceur et la souplesse de ces derniers, pourra présenter la composition suivante Le procédé de préparation de la lotion non rincée consiste essentiellement à dissoudre Elestab 305 et hydroxyéthylcellulose dans l'eau chauffée aux environs de 50 C, à y disperser le parfum et cremophor RH 410, puis à ramener le mélange à température ambiante, à y dissoudre ensuite l'extrait de Vigna et enfin à réaliser un filtrage.

Bien entendu, l'invention n'est pas limitée aux modes de réalisation décrits. Des modifications restent possibles, notamment du point de vue de la constitution des divers éléments ou par substitution d'équivalents techniques, sans sortir pour autant du domaine de protection de l'invention.

protéines <SEP> de <SEP> Vigna <SEP> selon <SEP> l'exemple <SEP> 1 <SEP> (extrait <SEP> la) <SEP> 2,00
<tb> eau <SEP> distillée <SEP> 9,50
<tb> hydroxyéthylcellulose <SEP> 0,50
<tb> Elestab <SEP> 305 <SEP> (Laboratoires <SEP> Sérobiologiques) <SEP> 0,50
<tb> parfum <SEP> 0,10
<tb> cremophor <SEP> RH <SEP> 410 <SEP> 0,30
<tb> eau <SEP> distillée <SEP> qsp <SEP> l00,00

Claims

REVENDICATIONS

1. Utilisation en tant qu'agent actif dans une composition cosmétique ou dermopharmaceutique à usage topique pour la peau, les phanères et/ou les muqueuses d'au moins une fraction protéique soluble extraite de la graine de la plante Vigna trilobata.

2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'extrait de graines de Vigna trilobata est mis en oeuvre en tant qu'agent actif présentant des activités de stimulation de la croissance et du métabolisme cellulaire, de stimulation de la contraction des lattices de collagène, de stimulation de la sécrétion des glycosaminoglycanes, des activités anti- apoptose, des activités anti-inflammatoires et/ou des activités cytophotoprotectrices.

3. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisée en ce que la ou les fraction(s) protéique(s) sont extraites par l'eau ou une solution saline à pH donné.

4. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que la ou les fraction(s) protéique(s) sont extraites en solution aqueuse au moyen d'un générateur à ultrasons.

5. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 3 et 4, caractérisée en ce que la ou les fraction(s) protéique(s) sont purifiées par un mode opératoire choisi dans le groupe formé par la précipitation, l'adsorption, la chromatographie d'échange d'ions, la chromatographie d'affinité et l'ultrafiltration.

6. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que la fraction extraite consiste en une fraction enrichie en inhibiteurs de protéases.

7. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que la ou les fraction(s) protéique(s) formant agent actif consistent) en un hydrolysât chimique ou enzymatique préparé à partir de protéines natives.

8. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que la ou les fraction(s) protéique(s) finale(s) sont obtenues par polymérisation des protéines natives.

9. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que la ou les fraction(s) protéique(s) extraite(s) est (sont) chimiquement modifiées par greffage.

10. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que les fractions extraites formant agent actif comportent au moins deux fractions protéiques de poids moléculaires apparents différents.

11. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que l'extrait consiste en un extrait total, constitué par l'ensemble des fractions protéiques extractibles présentes naturellement dans les graines.

12. Composition cosmétique ou dermopharmaceutique à usage topique pour la peau, les phanères et/ou les muqueuses, caractérisée en ce qu'elle comporte à titre d'agent actif, unique ou associé à au moins un autre agent actif, au moins une fraction protéique extraite de graines de Vigna trilobata.

13. Composition cosmétique ou dermopharmaceutique selon la revendication 12, caractérisée en ce qu'elle comporte à titre d'agent stimulant la croissance et le métabolisme cellulaire au moins une fraction protéique soluble extraite de graines de Vigna trilobata.

14. Composition cosmétique ou dermophannaceutique selon l'une quelconque des revendications 12 et 13, caractérisée en ce qu'elle comporte à titre d'agent stimulant la contraction des lattices de collagène au moins une fraction protéique soluble extraite de graines de Vigna trilobata.

15. Composition cosmétique ou dermopharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 12 à 14, caractérisée en ce qu'elle comporte à titre d'agent stimulant la sécrétion des glycosaminoglycanes au moins une fraction protéique soluble extraite de graines de Vigna trilobata.

16. Composition cosmétique ou dermopharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 12 à 15, caractérisée en ce qu'elle comporte à titre d'agent anti-apoptose au moins une fraction protéique soluble extraite de graines de Vigna trilobata.

17. Composition cosmétique ou dermopharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 12 à 16, caractérisée en ce qu'elle comporte à titre d'agent cytophotoprotecteur contre les effets des UV-A au moins une fraction protéique soluble extraite de graines de Vigna trilobata.

18. Composition cosmétique ou dermopharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 12 à 17, caractérisée en ce qu'elle comporte à titre d'agent protecteur contre l'inflammation induite par les UV-B au moins une fraction protéique soluble extraite de graines de Vigna trilobata.

19. Composition cosmétique ou dermopharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 12 à 18, caractérisée en ce qu'elle comporte à titre d'agent destiné au traitement préventif et curatif des peaux sensibles au moins une fraction protéique soluble extraite de graines de Vigna trilobata.

20. Composition cosmétique ou dermopharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 12 à 19, caractérisée en ce qu'elle comporte à titre d'agent tenseur pour la peau et/ou les muqueuses au moins une fraction protéique soluble extraite de graines de Vigna trilobata.

21. Composition cosmétique ou dermopharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 12 à 20, caractérisée en ce qu'elle comporte à titre d'agent adoucissant pour la peau et/ou les muqueuses au moins une fraction protéique soluble extraite de graines de Vigna trilobata.

22. Composition cosmétique ou dermopharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 12 à 19, caractérisée en ce qu'elle comporte à titre d'agent actif capillaire facilitant le coiffage des cheveux secs et mouillés et améliorant la douceur et la souplesse des cheveux non endommagés, au moins une fraction protéique soluble extraite de graines de Vigna trilobata.

23. Composition cosmétique ou dermopharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 12 à 22, caractérisée en ce qu'elle comporte entre 0,001 % et 50 % en poids de fraction(s) protéique(s) extraites de graines de Vigna trilobata, éventuellement intégrés dans des vecteurs cosmétiques adaptés.