FR2794763A1

FR2794763A1 - Composition useful for producing medicaments, implants, hydrogels, microspheres and bone prostheses comprises hyaluronan partially esterified with higher aliphatic or araliphatic groups

Info

Publication number: FR2794763A1
Application number: FR9907183A
Authority: FR
Inventors: Edith Dellacherie; Patrick Hubert; Sophie Pelletier; Patrick Netter; Elisabeth Payan
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date: 1999-06-08
Filing date: 1999-06-08
Publication date: 2000-12-15
Anticipated expiration: 2019-06-08
Also published as: FR2794763B1

Abstract

New composition comprises a modified hyaluronan (I) consisting of hyaluronic acid, optionally in salt form, in which up to 50% of the carboxy groups are esterified with aliphatic or araliphatic groups containing at least 10 carbon atoms.

Description

L'invention concerne de nouveaux polymères dérivés de l'acide hyaluronique, leur préparation et leur utilisation. The invention relates to new polymers derived from hyaluronic acid, their preparation and their use.

On sait que l'acide hyaluronique est un polysaccharide constitué par la succession de motifs disaccharidiques N-acétylglucosamine/acide glucuronique. L'acide hyaluronique est un polysaccharide naturel dont les solutions aqueuses ont une viscosité élevée. Il est présent notamment dans le cordon ombilical, dans l'humeur vitrée et dans le liquide synovial. Il est également produit par certaines bactéries, notamment par des streptocoques hémolytiques des groupes A et C. La masse moléculaire de l'acide hyaluronique peut varier de 10 000 à 10 000 000 g/mol environ, selon l'origine. L'acide hyaluronique est commercialisé notamment sous la forme de sel de sodium (ou hyaluronate). It is known that hyaluronic acid is a polysaccharide constituted by the succession of disaccharide units N-acetylglucosamine / glucuronic acid. Hyaluronic acid is a natural polysaccharide whose aqueous solutions have a high viscosity. It is present in particular in the umbilical cord, in the vitreous humor and in the synovial fluid. It is also produced by certain bacteria, in particular by hemolytic streptococci from groups A and C. The molecular mass of hyaluronic acid can vary from 10,000 to 10,000,000 g / mol approximately, depending on the origin. Hyaluronic acid is marketed in particular in the form of sodium salt (or hyaluronate).

On utilise le terme générique "hyaluronane" pour désigner indistinctement l'acide hyaluronique et le hyaluronate. The generic term "hyaluronan" is used to denote hyaluronic acid and hyaluronate without distinction.

Le hyaluronane est un glycosaminoglycane biorésorbable des tissus conjonctifs. Sa particularité est d'emmagasiner une grande quantité d'eau, formant une matrice visqueuse autour des cellules. En solution à haute concentration, les macromolécules de hyaluronane s'interpénètrent, et cet enchevêtrement confère à la solution des propriétés viscoélastiques (intermédiaires entre les propriétés des solutions visqueuses et les propriétés des solides) qui sont encore renforcées, dans le liquide synovial, par la présence de protéines favorisant la formation de réseaux intermoléculaires. Le hyaluronane donne au liquide synovial le pouvoir d'absorber les chocs : lorsque la force de cisaillement est faible, le liquide synovial a un comportement visqueux. Si la force de cisaillement augmente, son comportement devient plus élastique. Hyaluronan is a bioresorbable glycosaminoglycan from connective tissues. Its particularity is to store a large amount of water, forming a viscous matrix around the cells. In high concentration solution, the hyaluronan macromolecules interpenetrate, and this tangle confers on the solution viscoelastic properties (intermediates between the properties of viscous solutions and the properties of solids) which are further reinforced, in the synovial fluid, by the presence of proteins promoting the formation of intermolecular networks. Hyaluronan gives the synovial fluid the power to absorb shocks: when the shear force is low, the synovial fluid has a viscous behavior. If the shear force increases, its behavior becomes more elastic.

Cependant, le hyaluronane pur, même de haute masse moléculaire et à concentration relativement forte (20 g/1) ne présente pas les propriétés rhéologiques souhaitées pour une utilisation efficace, par exemple, en viscosupplémentation (remplacement du liquide synovial) en viscochirurgie (chirurgie de l'oeil) ou pour la réalisation d'implants. However, pure hyaluronan, even of high molecular mass and relatively high concentration (20 g / 1) does not have the desired rheological properties for effective use, for example, in viscosupplementation (replacement of synovial fluid) in viscoosurgery (surgery the eye) or for making implants.

On a maintenant découvert qu'en estérifiant partiellement les groupes carboxyliques du hyaluronane à l'aide de chaînes aliphatiques hydrophobes (notamment chaînes alkyle de longueur suffisante), il est possible d'obtenir, selon le degré d'estérification, des dérivés du hyaluronane présentant des propriétés intéressantes. It has now been discovered that by partially esterifying the carboxylic groups of hyaluronan using hydrophobic aliphatic chains (in particular alkyl chains of sufficient length), it is possible to obtain, depending on the degree of esterification, derivatives of hyaluronan having interesting properties.

Les chaînes aliphatiques hydrophobes sont notamment des chaînes alkyle linéaires ou ramifiées (comportant par exemple un groupe isopropyle en bout de chaîne), pouvant comporter en outre une ou plusieurs insaturations, et comportant au moins 10 atomes de carbone. Dans ce qui suit, on parlera parfois de chaînes "alkyle", mais il faut comprendre que cette expression désigne et englobe des chaînes aliphatiques telles qu'elles viennent d'être définies. The hydrophobic aliphatic chains are in particular linear or branched alkyl chains (comprising, for example, an isopropyl group at the chain end), which can also comprise one or more unsaturations, and comprising at least 10 carbon atoms. In what follows, we will sometimes speak of "alkyl" chains, but it should be understood that this expression designates and encompasses aliphatic chains as they have just been defined.

Dans les dérivés de l'invention, le taux d'estérification des groupes carboxyliques est généralement au moins égal à 1 %. In the derivatives of the invention, the rate of esterification of the carboxylic groups is generally at least equal to 1%.

Lorsque le taux d'estérification est inférieur à un certain seuil (qui dépend de la longueur de la chaîne alkyle) les dérivés obtenus sont solubles dans l'eau (ou dans une solution de chlorure de sodium) en donnant des solutions de viscosité plus élevée que le hyaluronane. Lorsque le taux d'estérification est suffisant, ces dérivés solubles sont capables de former, par association des chaînes hydrophobes (réticulation physique), des réseaux intermoléculaires qui confèrent au milieu une viscosité élevée et qui peuvent même conduire à la formation d'hydrogels. La distinction entre "solution visqueuse" et "gel" est fondée sur le critère suivant : placés dans un tube, une solution visqueuse est capable d'écoulement après retournement du tube, contrairement à un gel, qui peut être mou ou dur selon le cas, mais qui ne s'écoule pas. When the esterification rate is below a certain threshold (which depends on the length of the alkyl chain) the derivatives obtained are soluble in water (or in a solution of sodium chloride) giving solutions of higher viscosity than hyaluronan. When the esterification rate is sufficient, these soluble derivatives are capable of forming, by association of the hydrophobic chains (physical crosslinking), intermolecular networks which give the medium a high viscosity and which can even lead to the formation of hydrogels. The distinction between "viscous solution" and "gel" is based on the following criterion: placed in a tube, a viscous solution is capable of flow after inversion of the tube, unlike a gel, which can be soft or hard depending on the case , but which does not flow.

On peut ainsi obtenir des solutions visqueuses, ou des hydrogels, avec des hyaluronanes modifiés par estérification, jusqu'à un taux d'estérification d'environ 20 % (pour une chaîne alkyle en C10) et d'environ 4 % (pour une chaîne alkyle en C18), et cela avec des concentrations très faibles en hyaluronanes modifiés, par exemple avec des concentrations de l'ordre de 1 %. La réticulation physique peut être renforcée par une réticulation chimique de faible importance conduisant à l'établissement de liaisons covalentes intercaténaires, notamment entre des groupes carboxyliques. It is thus possible to obtain viscous solutions, or hydrogels, with hyaluronans modified by esterification, up to an esterification rate of approximately 20% (for a C10 alkyl chain) and approximately 4% (for a chain C18 alkyl), and this with very low concentrations of modified hyaluronans, for example with concentrations of the order of 1%. The physical crosslinking can be reinforced by a minor chemical crosslinking leading to the establishment of intercatenary covalent bonds, in particular between carboxylic groups.

On peut ainsi, avec une légère modification chimique du hyaluronane, produire soit des solutions aqueuses à forte viscosité modulable, soit des hydrogels aux propriétés rhéologiques contrôlables, tout en restant dans des domaines de concentration relativement limités. Les produits obtenus conservent une charge négative (groupes carboxyliques résiduels) élevée, ce qui permet d'obtenir des hydrogels capables de fixer des cations et/ou de grands volumes d'eau, et qui sont capables de gonfler dans l'eau lorsqu'ils sont introduits par exemple sous la forme d'une poudre sèche (lyophilisât). Ce gonflement It is thus possible, with a slight chemical modification of the hyaluronan, to produce either aqueous solutions with high modular viscosity, or hydrogels with controllable rheological properties, while remaining in relatively limited concentration ranges. The products obtained retain a high negative charge (residual carboxylic groups), which makes it possible to obtain hydrogels capable of fixing cations and / or large volumes of water, and which are capable of swelling in water when are introduced for example in the form of a dry powder (lyophilisate). This swelling

peut être éventuellement limité par une faible réticulation conduisant à la formation de liaisons intercaténaires covalentes. can be possibly limited by a weak crosslinking leading to the formation of intercovalent covalent bonds.

Les hydrogels de l'invention forment un réseau tridimensionnel de chaînes hydrophiles reliées par des microdomaines hydrophobes constituées par agrégation des chaînes alkyle. Il en résulte une réticulation physique des chaînes hydrophiles. Les microdomaines hydrophobes formés par les agrégats de chaînes hydrophobes sont assimilables à des nanoparticules qui présentent la particularité de ne pas être libres et indépendantes, car elles font partie du réseau tridimensionnel formé par les molécules polymères dans l'hydrogel. Ces sortes de nanoparticules sont capables de solubiliser et donc de retenir des substances hydrophobes, par exemple des médicaments. En outre, le réseau formé par les chaînes polymères permet de retenir des macromolécules hydrophiles ; c'est là une propriété classique des hydrogels. The hydrogels of the invention form a three-dimensional network of hydrophilic chains linked by hydrophobic microdomains formed by aggregation of the alkyl chains. This results in physical crosslinking of the hydrophilic chains. The hydrophobic microdomains formed by aggregates of hydrophobic chains can be likened to nanoparticles which have the particularity of not being free and independent, because they are part of the three-dimensional network formed by the polymer molecules in the hydrogel. These kinds of nanoparticles are capable of solubilizing and therefore of retaining hydrophobic substances, for example drugs. In addition, the network formed by the polymer chains makes it possible to retain hydrophilic macromolecules; this is a classic property of hydrogels.

On peut donc également utiliser les hydrogels par exemple pour l'encapsulation et/ou la vectorisation de principes actifs tels que des macromolécules hydrophiles ou des principes actifs hydrophobes de petite taille. Les hydrogels obtenus peuvent également être utilisés pour favoriser la réparation de tissus vivants lésés, grâce aux possibilités de réhabitation cellulaire in vivo qu'ils autorisent, ou pour l'encapsulation de cellules d'origines diverses, notamment fibroblastes, chondrocytes ou cellules de moelle osseuse, afin de produire par culture in vitro, avant réimplantation in vivo, un tissu autologue. It is therefore also possible to use hydrogels, for example for the encapsulation and / or vectorization of active principles such as hydrophilic macromolecules or small hydrophobic active principles. The hydrogels obtained can also be used to promote the repair of damaged living tissues, thanks to the possibilities of cellular rehabitation in vivo which they allow, or for the encapsulation of cells of various origins, in particular fibroblasts, chondrocytes or bone marrow cells. , in order to produce by in vitro culture, before in vivo reimplantation, an autologous tissue.

Lorsque le degré d'estérification et/ou la longueur des chaînes aliphatiques augmente, les dérivés du hyaluronane de l'invention deviennent très peu solubles ou pratiquement insolubles dans les solutions de chlorure de sodium. De tels produits insolubles peuvent également être utilisés pour former des hydrogels, par addition d'eau à une solution de ces dérivés dans un solvant organique miscible à l'eau. When the degree of esterification and / or the length of the aliphatic chains increases, the hyaluronan derivatives of the invention become very slightly soluble or practically insoluble in sodium chloride solutions. Such insoluble products can also be used to form hydrogels, by adding water to a solution of these derivatives in an organic solvent miscible with water.

En outre, les hyaluronanes modifiés de l'invention qui sont insolubles dans l'eau sont utilisables soit sous forme de pièces massives, par exemple en tant que pièces de prothèse osseuse progressivement biodégradables, soit sous forme de microsphères ou de nanosphères permettant notamment la libération progressive de médicaments. In addition, the modified hyaluronans of the invention which are insoluble in water can be used either in the form of solid parts, for example as progressively biodegradable bone prosthesis parts, or in the form of microspheres or nanospheres allowing in particular the release progressive medication.

Les hyaluronanes modifiés de l'invention qui sont solubles dans l'eau ont en outre des propriétés émulsionnantes, et ils peuvent être utilisés comme agents émulsionnants dans la préparation de microsphères ou nanosphères, notamment celles constituées à l'aide des dérivés selon l'invention qui sont insolubles. The modified hyaluronans of the invention which are soluble in water also have emulsifying properties, and they can be used as emulsifying agents in the preparation of microspheres or nanospheres, in particular those formed using the derivatives according to the invention which are insoluble.

Les hyaluronanes modifiés de l'invention peuvent être préparés selon les procédés classiques d'estérification, par exemple en faisant réagir un dérivé aliphatique tel qu'un alcanol, un alcanethiol, un monohalogénoalcane, un époxyalcane ou un tosylate, mésylate ou trésylate d'alkyle sur un hyaluronane dont les fonctions carboxyliques sont éventuellement convenablement fonctionnalisées (par exemple sous forme d'ester de N-hydroxysuccinimide ou sous forme de sel de tétraalkylammonium). The modified hyaluronans of the invention can be prepared according to conventional esterification methods, for example by reacting an aliphatic derivative such as an alkanol, an alkanethiol, a monohaloalkane, an epoxyalkane or an alkyl tosylate, mesylate or mesylate on a hyaluronan, the carboxylic functions of which are optionally suitably functionalized (for example in the form of N-hydroxysuccinimide ester or in the form of tetraalkylammonium salt).

De façon analogue, pour l'étape facultative de réticulation, on peut utiliser des réticulants classiques bifonctionnels capables de réagir sur des groupements carboxyliques convenablement fonctionnalisés. Les agents réticulants sont notamment des dérivés dihalogénés, des diols, des dithiols, des diépoxydes ou des ditosylates, dimésylates ou ditrésylates dérivés de chaînes alkyle éventuellement interrompues par un ou plusieurs hétéroatomes (tels que -O-, -S-,-S-S-), par exemple des chaînes polyalkylèneglycol. Similarly, for the optional crosslinking step, conventional bifunctional crosslinkers can be used capable of reacting with suitably functionalized carboxylic groups. The crosslinking agents are in particular dihalogenated derivatives, diols, dithiols, diepoxides or ditosylates, dimesylates or ditresylates derived from alkyl chains optionally interrupted by one or more heteroatoms (such as -O-, -S -, - SS-) , for example polyalkylene glycol chains.

Les hyaluronanes modifiés de l'invention ont une masse moléculaire qui dépend essentiellement de la masse moléculaire du hyaluronane de départ. Les réactions d'estérification peuvent entraîner une légère dépolymérisation. Généralement, la masse moléculaire des hyaluronanes modifiés est dans la gamme de 5 000 à 8 000 000 g/mol, lorsqu'elle est mesurée par chromatographie d'exclusion stérique couplée à un photodiffu- siomètre laser (méthode dite SEC-MALLS : Exclusion Chromatography - Multian- gle Laser Light Scattering). La viscosité des hyaluronanes modifiés solubles dans l'eau augmente avec leur masse moléculaire. The modified hyaluronans of the invention have a molecular mass which essentially depends on the molecular mass of the starting hyaluronan. Esterification reactions may cause slight depolymerization. Generally, the molecular mass of the modified hyaluronans is in the range of 5,000 to 8,000,000 g / mol, when it is measured by steric exclusion chromatography coupled with a laser photodifferiometer (method known as SEC-MALLS: Exclusion Chromatography - Multiangle Laser Light Scattering). The viscosity of water-soluble modified hyaluronans increases with their molecular weight.

Les hyaluronanes modifiés de l'invention sont stables en milieu salin 0,15 M NaCI, au moins pendant 1 an à 4 C. A 37 C les fonctions ester s'hydrolysent partiellement et le polymère se dégrade : ainsi, la viscosité au plateau newtonien d'une solution à 1,5 % d'un dérivé contenant des chaînes en C18 (4 % de groupes carboxyliques estérifiés) est divisée par 2 environ au bout de 2 mois. Les hyaluronanes modifiés de l'invention constituent donc des produits progressivement biodégradables. Ils sont en outre biorésorbables et sont bien tolérés par l'organisme. En raison de leur biocompatibilité élevée, on peut les utiliser notamment dans un grand nombre d'applications biomédicales. The modified hyaluronans of the invention are stable in 0.15 M NaCl salt medium, at least for 1 year at 4 C. At 37 C the ester functions partially hydrolyze and the polymer degrades: thus, the viscosity at the Newtonian plateau of a 1.5% solution of a derivative containing C18 chains (4% of esterified carboxylic groups) is divided by approximately 2 after 2 months. The modified hyaluronans of the invention therefore constitute progressively biodegradable products. They are also bioresorbable and are well tolerated by the body. Due to their high biocompatibility, they can be used in particular in a large number of biomedical applications.

L'invention a donc pour objet une composition contenant un hyaluronane modifié constitué essentiellement d'acide hyaluronique, éventuellement sous forme salifiée, dans lequel une proportion non supérieure à 50 % des groupes carboxyliques sont sous forme d'esters aliphatiques ou arylaliphatiques dont le groupe aliphatique ou arylaliphati- The subject of the invention is therefore a composition containing a modified hyaluronan consisting essentially of hyaluronic acid, optionally in salified form, in which a proportion of not more than 50% of the carboxylic groups are in the form of aliphatic or arylaliphatic esters including the aliphatic group or arylaliphati-

que possède au moins 10 atomes de carbone. Les chaînes aliphatiques ou arylaliphatiques sont en particulier celles ayant de 10 à 22 atomes de carbone, et notamment celles ayant de 12 à 18 atomes de carbone. Les chaînes arylaliphatiques sont notamment des chaînes aralkyle et en particulier des chaînes phénylalkyle. that has at least 10 carbon atoms. The aliphatic or arylaliphatic chains are in particular those having from 10 to 22 carbon atoms, and in particular those having from 12 to 18 carbon atoms. The arylaliphatic chains are in particular aralkyl chains and in particular phenylalkyl chains.

Le terme "composition" désigne ici non seulement toute combinaison de l'acide hyaluronique modifié avec un autre ingrédient, par exemple de l'eau pour former un hydrogel (ou un hydrogel contenant des substances hydrophobes, des macromolécules hydrophiles ou des cellules), mais aussi l'acide hyaluronique modifié seul, par exemple sous forme de poudre lyophilisée, de film ou de pièce massive. The term "composition" here designates not only any combination of the modified hyaluronic acid with another ingredient, for example water to form a hydrogel (or a hydrogel containing hydrophobic substances, hydrophilic macromolecules or cells), but also hyaluronic acid modified alone, for example in the form of lyophilized powder, film or solid piece.

Dans la composition de l'invention, le hyaluronane modifié peut être en outre réticulé, notamment par des ponts alkylène éventuellement interrompus par un ou plusieurs hétéroatomes, notamment d'oxygène ou de soufre. In the composition of the invention, the modified hyaluronan can also be crosslinked, in particular by alkylene bridges optionally interrupted by one or more heteroatoms, in particular oxygen or sulfur.

Parmi les compositions de l'invention, on peut distinguer celles contenant un hyaluronane modifié dont la proportion de groupes carboxyliques estérifiés par des chaînes alkyle est suffisamment faible, et/ou celles pour lesquelles la réticulation éventuelle a été effectuée à un taux suffisamment faible, pour que le hyaluronane modifié résultant soit soluble dans une solution aqueuse de chlorure de sodium 0,15 M. De telles compositions peuvent se présenter sous la forme de solutions aqueuses visqueuses ou sous la forme d'hydrogels contenant éventuellement une substance hydrophobe et/ou une substance macromoléculaire hydrophile, ou encore des cellules vivantes. La composition peut également se présenter sous la forme d'un lyophilisat, et en particulier d'un lyophilisat obtenu par lyophilisation d'un hydrogel tel qu'il vient d'être défini. Among the compositions of the invention, one can distinguish those containing a modified hyaluronan whose proportion of carboxylic groups esterified by alkyl chains is sufficiently low, and / or those for which the possible crosslinking was carried out at a sufficiently low level, for that the resulting modified hyaluronan is soluble in an aqueous solution of sodium chloride 0.15 M. Such compositions may be in the form of viscous aqueous solutions or in the form of hydrogels optionally containing a hydrophobic substance and / or a substance hydrophilic macromolecular, or even living cells. The composition can also be in the form of a lyophilisate, and in particular of a lyophilisate obtained by lyophilization of a hydrogel as it has just been defined.

Lorsqu'on utilise un hyaluronane modifié réticulé, dans le but d'obtenir un hydrogel à résistance mécanique améliorée, on effectue de préférence la réticulation avec un taux suffisamment faible pour que le polymère puisse former un hydrogel capable de retenir une masse d'eau au moins égale à 50 % de la masse du polymère. Ce taux de réticulation peut être facilement déterminé, dans chaque cas, par de simples expériences de routine. When a crosslinked modified hyaluronan is used, in order to obtain a hydrogel with improved mechanical strength, the crosslinking is preferably carried out at a sufficiently low level that the polymer can form a hydrogel capable of retaining a body of water at the less than 50% of the mass of the polymer. This crosslinking rate can be easily determined, in each case, by simple routine experiments.

L'un des buts recherchés par les auteurs de la présente invention est l'obtention d'un matériau se présentant sous forme d'un hydrogel biocompatible et biorésorbable apte à être utilisé pour assurer et améliorer la réparation de certains tissus vivants lésés (peau ou cartilage par exemple), y compris des tissus ayant subi des lésions pathologiques One of the aims of the authors of the present invention is to obtain a material in the form of a biocompatible and bioresorbable hydrogel capable of being used to ensure and improve the repair of certain damaged living tissues (skin or cartilage for example), including tissue with pathological lesions

ou des pertes de matière, cette utilisation pouvant être faite soit in vivo, par implantation suivie d'une réhabitation cellulaire, soit ex vivo. Dans ce dernier cas, l'hydrogel sert de support pour la culture de cellules, ce support favorisant la néosynthèse in vitro d'une matrice extracellulaire. L'hydrogel obtenu après culture peut ensuite être réimplanté chez le donneur des cellules. or material losses, this use can be made either in vivo, by implantation followed by cell rehabitation, or ex vivo. In the latter case, the hydrogel serves as a support for cell culture, this support promoting in vitro neosynthesis of an extracellular matrix. The hydrogel obtained after culture can then be reimplanted in the cell donor.

On peut aussi employer ces hydrogels dans des domaines très variés (traumatismes, chirurgie esthétique), par exemple dans le traitement des lésions ostéochondrales traumatiques par comblement. On peut également effectuer une application directe de l'hydrogel sur un tissu lésé pour en activer la cicatrisation ou pour favoriser la régénération cellulaire des tissus ayant perdu leur élasticité et/ou leur résistance. These hydrogels can also be used in a wide variety of fields (trauma, cosmetic surgery), for example in the treatment of traumatic osteochondral lesions by filling. It is also possible to apply the hydrogel directly to injured tissue to activate healing or to promote cellular regeneration of tissues which have lost their elasticity and / or their resistance.

Les hydrogels de l'invention peuvent encore être utilisés notamment comme compositions pharmaceutiques permettant notamment de libérer progressivement les médicaments qu'elles renferment. De telles compositions s'avèrent particulièrement intéressantes dans le cas de principes actifs réputés insolubles dans l'eau. Les compositions de l'invention peuvent également être utilisées pour libérer progressivement des principes actifs hydrophiles, et en particulier des macromolécules hydrophiles, par exemple des facteurs de croissance. The hydrogels of the invention can also be used in particular as pharmaceutical compositions making it possible in particular to gradually release the medicaments which they contain. Such compositions are found to be particularly advantageous in the case of active principles known to be insoluble in water. The compositions of the invention can also be used to gradually release hydrophilic active principles, and in particular hydrophilic macromolecules, for example growth factors.

On peut aussi incorporer dans les hydrogels de l'invention des macromolécules immunogènes (notamment des protéines ou des conjugués protéine-antigène, par exemple des conjugués antigène-anatoxine tétanique, obtenus de façon connue en soi) et éventuellement des adjuvants. Les gels obtenus sont alors utilisables comme agents vaccinants présentant l'avantage que, du fait de la libération progressive de l'immunogène, l'organisme se trouve plus longtemps au contact de celui-ci. It is also possible to incorporate into the hydrogels of the invention immunogenic macromolecules (in particular proteins or protein-antigen conjugates, for example antigen-tetanus toxoid conjugates, obtained in a manner known per se) and optionally adjuvants. The gels obtained can then be used as vaccinating agents, with the advantage that, due to the gradual release of the immunogen, the organism is in contact with it for longer.

Les compositions pharmaceutiques à base d'hydrogels de l'invention sont utilisables dans des procédés de traitement thérapeutique comprenant leur administration notamment par voie orale ou rectale, ou par implantation. L'hydrogel, ou le lyophilisat correspondant, peut être encapsulé dans un matériau capable de se désagréger par fusion, ramollissement ou dissolution au contact du corps ou des fluides corporels. Les compositions sous forme d'implants peuvent être mises en place, notamment par injection. En effet, les hydrogels obtenus selon l'invention possèdent généralement des propriétés de rhéofluidification, c'est-à-dire que leur viscosité diminue lorsqu'après une période de repos, une contrainte suffisante est brusquement appliquée puis maintenue constante. Les The hydrogel-based pharmaceutical compositions of the invention can be used in methods of therapeutic treatment comprising their administration, in particular by oral or rectal route, or by implantation. The hydrogel, or the corresponding lyophilisate, can be encapsulated in a material capable of disintegrating by melting, softening or dissolving on contact with the body or body fluids. The compositions in the form of implants can be placed, in particular by injection. In fact, the hydrogels obtained according to the invention generally have shear thinning properties, that is to say that their viscosity decreases when after a period of rest, sufficient stress is suddenly applied and then kept constant. The

hydrogels ayant cette propriété sont capables de transiter à travers une aiguille creuse ayant par exemple 2 mm ou même 1 mm de diamètre intérieur, ce qui permet de réaliser des implantations par injection. Les implants ainsi injectés retrouvent leur viscosité d'origine, et donc leur comportement de gel, après un temps pouvant aller généralement de quelques dizaines à quelques centaines de secondes. Cela permet à l'implant de rester en place là où il a été introduit. hydrogels with this property are capable of passing through a hollow needle having for example 2 mm or even 1 mm internal diameter, which allows implantation by injection. The implants thus injected regain their original viscosity, and therefore their gel behavior, after a time which can generally range from a few tens to a few hundred seconds. This allows the implant to stay in place where it was inserted.

Les hydrogels de l'invention peuvent également servir de supports implantables et biorésorbables destinés à favoriser la régénération tissulaire, par exemple la régénération de tissus osseux ou de cartilage (éventuellement avec des hydrogels chargés de cellules autologues et/ou de facteurs de croissance), ou encore la régénération du parodonte selon la technique de la régénération tissulaire guidée. The hydrogels of the invention can also serve as implantable and bioresorbable supports intended to promote tissue regeneration, for example the regeneration of bone tissue or cartilage (optionally with hydrogels loaded with autologous cells and / or growth factors), or again the regeneration of the periodontium according to the technique of guided tissue regeneration.

On peut également incorporer dans les hydrogels de l'invention des substances colorantes, des substances aromatiques, des insecticides, etc. De tels hydrogels peuvent être utilisés notamment comme supports pour la diffusion prolongée de parfums, d'arômes, d'insecticides, etc. It is also possible to incorporate coloring substances, aromatic substances, insecticides, etc. into the hydrogels of the invention. Such hydrogels can be used in particular as carriers for the prolonged diffusion of perfumes, aromas, insecticides, etc.

Parmi les hyaluronanes modifiés de l'invention, on peut mentionner également ceux dans lesquels la proportion de groupes carboxyliques estérifiés et/ou le taux de réticulation sont suffisamment élevés pour que le polymère résultant soit pratiquement insoluble dans une solution aqueuse de chlorure de sodium 0,15 M. Parmi ces polymères, ceux dont la proportion de groupes carboxyliques estérifiés n'est pas trop élevée peuvent gonfler progressivement dans l'eau en formant des hydrogels. Les polymères insolubles dans l'eau peuvent également former des hydrogels par dissolution du polymère dans un solvant organique miscible à l'eau (par exemple le DMSO), suivie d'addition d'eau à cette solution. Lorsque le taux d'estérification devient suffisamment élevé, les polymères insolubles ne gonflent pas dans l'eau. Among the modified hyaluronans of the invention, mention may also be made of those in which the proportion of esterified carboxylic groups and / or the degree of crosslinking are sufficiently high so that the resulting polymer is practically insoluble in an aqueous solution of sodium chloride 0, Among these polymers, those in which the proportion of esterified carboxylic groups is not too high can swell gradually in water, forming hydrogels. Water-insoluble polymers can also form hydrogels by dissolving the polymer in a water-miscible organic solvent (eg DMSO), followed by addition of water to this solution. When the esterification rate becomes sufficiently high, the insoluble polymers do not swell in water.

La composition de l'invention, lorsqu'elle contient des hyaluronanes modifiés insolubles dans l'eau, peut se présenter sous la forme de microsphères. On entend ici par "microsphère" un système sphérique plein dont le diamètre moyen n'excède pas quelques centaines de micromètres (en particulier 500 m), cette notion englobant des sphères (appelées nanosphères) de diamètre moyen inférieur au micromètre. The composition of the invention, when it contains modified water-insoluble hyaluronans, may be in the form of microspheres. The term “microsphere” is understood here to mean a full spherical system whose average diameter does not exceed a few hundred micrometers (in particular 500 m), this concept encompassing spheres (called nanospheres) of mean diameter less than a micrometer.

De telles microsphères constituent des systèmes biorésorbables permettant de libérer progressivement certains principes actifs. Elles peuvent être administrées par voie Such microspheres constitute bioresorbable systems making it possible to gradually release certain active ingredients. They can be administered by

orale, intramusculaire ou intraveineuse, selon leur diamètre. L'un des avantages des microsphères est qu'elles permettent d'administrer facilement par injection des principes actifs ayant une durée d'action prolongée grâce à leur libération progressive, ce qui améliore l'action thérapeutique des principes actifs et réduit leur toxicité éventuelle. Cette méthode évite la mise en place d'implants et évite aussi les administrations répétées puisque l'action du principe actif se fait sur une durée plus longue. oral, intramuscular or intravenous, depending on their diameter. One of the advantages of microspheres is that they allow easy administration by injection of active principles having a prolonged duration of action thanks to their progressive release, which improves the therapeutic action of the active principles and reduces their possible toxicity. This method avoids the placement of implants and also avoids repeated administrations since the action of the active ingredient is done over a longer period.

Les microsphères peuvent être obtenues par diverses techniques connues en soi, notamment de la façon suivante : le polymère (insoluble dans l'eau) qui constitue les microsphères est dissous dans un solvant (tel que le DMSO) miscible à l'eau. La solution résultante est précipitée dans l'eau en présence de tensioactifs en agitant. La taille des particules obtenues peut être contrôlée notamment par la nature et la puissance de l'agitation. Le principe actif peut être dissous soit dans le solvant organique, soit dans l'eau dans laquelle la solution organique est versée. The microspheres can be obtained by various techniques known per se, in particular in the following way: the polymer (insoluble in water) which constitutes the microspheres is dissolved in a solvent (such as DMSO) miscible with water. The resulting solution is precipitated in water in the presence of surfactants with stirring. The size of the particles obtained can be controlled in particular by the nature and the power of the agitation. The active principle can be dissolved either in the organic solvent or in the water into which the organic solution is poured.

Les microsphères de l'invention peuvent être utilisées selon les méthodes connues. En particulier, lorsque la substance active incorporée est un médicament, les microsphères peuvent être utilisées par voie orale, sous forme de poudres, de suspensions aqueuses ou de capsules. Lorsque les microsphères ont une taille suffisamment faible, par exemple inférieure à 150 m, elles peuvent aussi être administrées par injection, selon les méthodes connues. En outre, des microsphères ne contenant éventuellement pas de substance active peuvent être injectées de façon à provoquer localement une embolisation du système de vascularisation des angiomes. The microspheres of the invention can be used according to known methods. In particular, when the active substance incorporated is a medicament, the microspheres can be used orally, in the form of powders, aqueous suspensions or capsules. When the microspheres have a sufficiently small size, for example less than 150 m, they can also be administered by injection, according to known methods. In addition, microspheres possibly containing no active substance can be injected so as to locally cause embolization of the vasculature system of angiomas.

La substance active incorporée dans les microsphères est généralement une substance hydrophobe. The active substance incorporated in the microspheres is generally a hydrophobic substance.

Parmi les substances hydrophobes qui peuvent être incorporées dans les hydrogels ou dans les microsphères de l'invention on citera notamment : des hormones, en particulier des hormones stéroïdes (par exemple progestérone, estradiol, norgestrel, noréthistérone, testostérone, hydrocortisone, prednisolone, dexaméthasone), d'autres hormones (par exemple prostaglandines, insuline, etc. ), des antibiotiques ou des antiparasitaires (par exemple griséofulvine, érythromycine, quinazoline et ses dérivés) des agents anticancéreux (par exemple nitrosourées, fluorouracile, azathioprine, doxorubicine, bléomycine, cis-platine, mitomycine) des anesthésiques ou des sédatifs (par exemple tétracaïne, chloropromazine, diazépam, méthadone, naltrexone), ou d'autres Among the hydrophobic substances which can be incorporated in the hydrogels or in the microspheres of the invention, there may be mentioned in particular: hormones, in particular steroid hormones (for example progesterone, estradiol, norgestrel, norethisterone, testosterone, hydrocortisone, prednisolone, dexamethasone) , other hormones (e.g. prostaglandins, insulin, etc.), antibiotics or antiparasitics (e.g. griseofulvin, erythromycin, quinazoline and its derivatives) anticancer agents (e.g. nitrosoureas, fluorouracil, azathioprine, doxorubicin, bleomycin, cis -platin, mitomycin) anesthetics or sedatives (e.g. tetracaine, chloropromazine, diazepam, methadone, naltrexone), or others

principes actifs tels que la théophylline, la caféine, la quinidine, ou encore des peptides (notamment la vasopressine). active ingredients such as theophylline, caffeine, quinidine, or even peptides (especially vasopressin).

L'invention concerne également l'utilisation d'un hyaluronane modifié tel que défini précédemment, dans la préparation d'un médicament, dans la préparation d'un implant, dans la préparation d'un hydrogel, dans la préparation de microsphères, dans la préparation d'une pièce de prothèse osseuse (par exemple pièce de comblement, plaque ou vis), comme support de culture cellulaire in vitro, comme agent de piégeage ou d'encapsulation d'une substance hydrophobe, d'une macromolécule hydrophile ou de cellules vivantes. L'invention concerne notamment l'utilisation d'un hyaluronane modifié, dans laquelle : - ledit hyaluronane modifié est sous forme d'hydrogel contenant une substance macromoléculaire hydrosoluble et/ou une substance hydrophobe et/ou des cellules vivantes ; ledit hyaluronane modifié est insoluble dans l'eau et se présente sous la forme de nanosphères ou de microsphères contenant un produit actif ; - ledit hyaluronane modifié est insoluble dans l'eau et est préparé, par exemple par moulage, sous la forme d'une pièce massive, destinée notamment à être utilisée comme substitut osseux. The invention also relates to the use of a modified hyaluronan as defined above, in the preparation of a medicament, in the preparation of an implant, in the preparation of a hydrogel, in the preparation of microspheres, in the preparation of a piece of bone prosthesis (for example a filling piece, plate or screw), as a cell culture support in vitro, as a trapping or encapsulating agent for a hydrophobic substance, a hydrophilic macromolecule or cells alive. The invention relates in particular to the use of a modified hyaluronan, in which: said modified hyaluronan is in the form of a hydrogel containing a water-soluble macromolecular substance and / or a hydrophobic substance and / or living cells; said modified hyaluronan is insoluble in water and is in the form of nanospheres or microspheres containing an active product; - Said modified hyaluronan is insoluble in water and is prepared, for example by molding, in the form of a solid piece, intended in particular to be used as a bone substitute.

Les exemples suivants illustrent l'invention. The following examples illustrate the invention.

EXEMPLES EXEMPLE 1 :
Le produit de départ est un hyaluronate de sodium commercialisé par ACROS Organics (France) sous la dénomination de Sodium Hyaluronate 85 %. EXAMPLES EXAMPLE 1:
The starting product is a sodium hyaluronate marketed by ACROS Organics (France) under the name of Sodium Hyaluronate 85%.

On dissout 1 g de ce produit dans 100 ml d'eau distillée. On met en contact la solution pendant 15 min avec 5 g de résine Dowex 50*8 échangeuse de cations, conditionnée en H+ à 2,5 méq/ g (st#chiométrie 1:6). Après filtration, la solution contenant la forme acide du hyaluronane est neutralisée jusqu'à pH 7 par addition d'hydroxyde de tétrabutylammonium. 1 g of this product is dissolved in 100 ml of distilled water. The solution is brought into contact for 15 min with 5 g of Dowex 50 * 8 cation exchange resin, conditioned in H + at 2.5 meq / g (st # chiometry 1: 6). After filtration, the solution containing the acid form of hyaluronan is neutralized to pH 7 by addition of tetrabutylammonium hydroxide.

On obtient ainsi le hyaluronate de tétrabutylammonium (HA-TBA). This gives tetrabutylammonium hyaluronate (HA-TBA).

On dissout 1 g de HA-TBA dans 100 ml de DMSO. On ajoute 57 fil de 1-bromododécane. Après 24 h d'agitation à température ambiante, on soumet le mélange à une dialyse contre de l'eau distillée pendant 1 jour, puis contre une solution de NaN3 (1/2500) dans l'eau distillée pendant 6 jours, et enfin, une journée contre de l'eau distillée. 1 g of HA-TBA is dissolved in 100 ml of DMSO. 57 thread of 1-bromododecane are added. After 24 hours of stirring at room temperature, the mixture is subjected to dialysis against distilled water for 1 day, then against a solution of NaN3 (1/2500) in distilled water for 6 days, and finally, one day against distilled water.

On soumet ensuite la solution à une lyophilisation. The solution is then subjected to lyophilization.

On obtient ainsi un dérivé du hyaluronate de sodium dont environ 10 % des fonctions carboxyliques sont estérifiées par des chaînes alkyle en C12. A derivative of sodium hyaluronate is thus obtained, of which about 10% of the carboxylic functions are esterified by C12 alkyl chains.

Le produit obtenu, dissous à raison de 1,2 % en solution aqueuse 0,15 M de chlorure de sodium, possède une viscosité de 140 Pa. s (à gradient de cisaillement 0,001 s-1) et un module élastique de 20 Pa (à 0,3 rad/s). Une telle solution peut être lyophilisée. The product obtained, dissolved at 1.2% in 0.15 M aqueous solution of sodium chloride, has a viscosity of 140 Pa. S (with shear gradient 0.001 s-1) and an elastic modulus of 20 Pa ( at 0.3 rad / s). Such a solution can be lyophilized.

La détermination du taux de fixation des chaînes alkyle est effectuée par dosage chromatographique en phase gazeuse : 100 mg du produit à analyser sont traités pendant 4 h en milieu basique (NaOH 0,08 N) à température ambiante de manière à hydrolyser les fonctions ester reliant les chaînes alkyle au squelette polysaccharidique, et à permettre la libération de l'alcool correspondant ; on ajoute à ce mélange du toluène et un étalon interne (tétradécanol). The fixation rate of the alkyl chains is determined by gas chromatographic assay: 100 mg of the product to be analyzed are treated for 4 h in basic medium (0.08 N NaOH) at room temperature so as to hydrolyze the ester functions linking alkyl chains to the polysaccharide backbone, and to allow the release of the corresponding alcohol; toluene and an internal standard (tetradecanol) are added to this mixture.

Après agitation au Vortex puis centrifugation à 3 000 x g pendant 20 min, on prélève la phase organique contenant l'alcool extrait et l'étalon interne, et on analyse cette phase organique par chromatographie en phase gazeuse (Chromatographe SHIMADZU GC mini 3, colonne 10 % SE30, Tinj = 280 C, Tcol = 210 C ; détection par ionisation de flamme). After stirring with a Vortex and then centrifugation at 3000 xg for 20 min, the organic phase containing the extracted alcohol and the internal standard is taken, and this organic phase is analyzed by gas chromatography (SHIMADZU GC mini 3 chromatograph, column 10 % SE30, Tinj = 280 C, Tcol = 210 C; detection by flame ionization).

EXEMPLE 2 :
De façon analogue à celle décrite à l'exemple 1, en remplaçant les 57 \il de 1-bromododécane par 36 l de 1-bromooctadécane, on obtient un dérivé du hyaluronate de sodium dont environ 4 % des fonctions carboxyliques sont estérifiées par des chaînes alkyle en C18. EXAMPLE 2:
Analogously to that described in Example 1, by replacing the 57 μl of 1-bromododecane with 36 l of 1-bromooctadecane, a derivative of sodium hyaluronate is obtained, of which approximately 4% of the carboxylic functions are esterified by chains. C18 alkyl.

Le produit obtenu, en solution à 0,7 % dans une solution aqueuse 0,15 M de chlorure de sodium, possède une viscosité de 5 000 Pa. s (à gradient de cisaillement 0,001 s-1) et un module élastique de 15 Pa (à 0,3 rad/s). The product obtained, in 0.7% solution in 0.15 M aqueous sodium chloride solution, has a viscosity of 5,000 Pa. S (with shear gradient 0.001 s-1) and an elastic modulus of 15 Pa (at 0.3 rad / s).

La solution obtenue peut être lyophilisée. The solution obtained can be lyophilized.

EXEMPLE 3 :
On dissout 1 g de HA-TBA dans 100 ml de DMSO. On ajoute 3 l de ditosylate de tétraéthylèneglycol. Après 24 h d'agitation à température ambiante, on ajoute 28 [il de bromododécane. On agite à température ambiante pendant 24 h puis on lyophilise. EXAMPLE 3:
1 g of HA-TBA is dissolved in 100 ml of DMSO. 3 l of tetraethylene glycol ditosylate are added. After 24 h of stirring at room temperature, 28 μl of bromododecane are added. Stirred at room temperature for 24 h then lyophilized.

On obtient ainsi un dérivé du hyaluronate de sodium dont environ 5% des fonctions carboxyliques sont estérifiés par des chaînes en Ci et dont environ 1% des fonctions carboxyliques sont réticulées par des ponts tétraéthylèneglycol. A derivative of sodium hyaluronate is thus obtained, of which approximately 5% of the carboxylic functions are esterified by C 1 chains and of which approximately 1% of the carboxylic functions are crosslinked by tetraethylene glycol bridges.

EXEMPLE 4 :
De façon analogue à celle décrite à l'exemple 1, on a préparé un hyaluronane modifié dans lequel environ 5 % des groupes carboxyliques sont estérifiés par des chaînes alkyle en C12. EXAMPLE 4:
Analogously to that described in Example 1, a modified hyaluronan was prepared in which approximately 5% of the carboxylic groups are esterified by C 12 alkyl chains.

EXEMPLE 5 :
De façon analogue à celle décrite à l'exemple 1, on a préparé un hyaluronane modifié dans lequel 1 % environ des groupes carboxyliques sont estérifiés par des chaînes alkyle en C18. EXAMPLE 5:
Analogously to that described in Example 1, a modified hyaluronan was prepared in which approximately 1% of the carboxylic groups are esterified by C18 alkyl chains.

EXEMPLE 6 :
On opère comme à l'exemple 2, en remplaçant les 36 l de 1-bromooctadécane par 120 l de ce produit bromé. Le hyaluronane modifié obtenu précipite au cours de la dialyse et est isolé par filtration. EXAMPLE 6
The procedure is as in Example 2, replacing the 36 l of 1-bromooctadecane with 120 l of this brominated product. The modified hyaluronan obtained precipitates during dialysis and is isolated by filtration.

Avec le produit obtenu, on peut préparer des pièces massives, des films ou des microsphères, de façon usuelle. With the product obtained, it is possible to prepare massive parts, films or microspheres, in the usual way.

EXEMPLE 7 : Etude des propriétés biologiques (a) Etude de cytotoxicité et de biocompatibilité in vitro
Des essais de culture de chondrocytes en monocouche ont montré que les dérivés du hyaluronate de sodium ne sont pas cytotoxiques et sont biocompatibles. La cytotoxicité a été évaluée par l'étude de la libération dans le milieu de culture de chromate de sodium marqué au 51Cr, ce chromate ayant été préalablement incorporé dans le EXAMPLE 7 Study of biological properties (a) Study of cytotoxicity and biocompatibility in vitro
Monolayer chondrocyte culture tests have shown that sodium hyaluronate derivatives are not cytotoxic and are biocompatible. Cytotoxicity was evaluated by studying the release into the culture medium of 51Cr-labeled sodium chromate, this chromate having been previously incorporated into the

cytoplasme des chondrocytes. L'évaluation de la prolifération cellulaire a été effectuée par comptage des cellules, et la viabilité des cellules a été étudiée par coloration au bleu trypan qui colore les cellules mortes. chondrocyte cytoplasm. The assessment of cell proliferation was carried out by counting the cells, and the viability of the cells was studied by staining with trypan blue which stains the dead cells.

Une autre expérience a porté sur des cultures tridimensionnelles de chondrocytes de tête fémorales de rats Wistar mâles. La culture est effectuée sur billes d'alginate de calcium, en présence de hyaluronate de sodium ou en présence de dérivés selon l'invention ; les proportions hyaluronate (modifié ou non)/alginate étaient 1:5. Le milieu de culture était un milieu DMEM complet contenant de la thymidine tritiée et du sulfate de sodium marqué au 35S. On a évalué l'activité de synthèse des chondrocytes par l'étude de l'incorporation de 35S (signal correspondant à un cycle d'activité de synthèse de protéoglycanes) et par l'étude de l'incorporation de tritium (signal qui caractérise l'ensemble des cellules vivantes présentes dans la culture). Another experiment focused on three-dimensional cultures of femoral head chondrocytes from male Wistar rats. The culture is carried out on calcium alginate beads, in the presence of sodium hyaluronate or in the presence of derivatives according to the invention; the hyaluronate (modified or unmodified) / alginate proportions were 1: 5. The culture medium was a complete DMEM medium containing tritiated thymidine and 35 S-labeled sodium sulfate. The synthesis activity of chondrocytes was evaluated by studying the incorporation of 35S (signal corresponding to a cycle of proteoglycan synthesis activity) and by studying the incorporation of tritium (signal which characterizes l all living cells present in the culture).

Le rapport de ces deux signaux illustre la proportion de cellules vivantes en cycle de synthèse des protéoglycanes. Au bout de 21 jours de culture, ce rapport est de l'ordre de 1,2 à 1,4 en présence, comme additifs, des composés des exemples 1 et 2, respectivement. Ce rapport est inférieur à 1 pour les cultures effectuées en présence de hyaluronate de sodium comme additif. Ce rapport est de l'ordre de 0,6 pour les cultures effectuées sans ces additifs. The ratio of these two signals illustrates the proportion of living cells in the proteoglycan synthesis cycle. After 21 days of culture, this ratio is of the order of 1.2 to 1.4 in the presence, as additives, of the compounds of Examples 1 and 2, respectively. This ratio is less than 1 for cultures carried out in the presence of sodium hyaluronate as an additive. This ratio is of the order of 0.6 for cultures carried out without these additives.

On sait qu'en culture, les cellules susceptibles d'élaborer la matrice extracellulaire des tissus conjonctifs peuvent être en phase de prolifération ou en phase de synthèse des protéoglycanes, l'une des deux phases étant toujours privilégiée par rapport à l'autre. It is known that in culture, the cells capable of developing the extracellular matrix of connective tissues can be in the proliferation phase or in the proteoglycan synthesis phase, one of the two phases being always favored over the other.

Avec les hyaluronanes modifiés de l'invention, on a en outre constaté, par l'étude du rapport thymidine tritiée/ADN total, que les cellules prolifèrent peu, contrairement aux cellules cultivées en l'absence de hyaluronate, et contrairement aux cellules cultivées en présence de hyaluronate qui prolifèrent encore davantage. With the modified hyaluronans of the invention, it has also been found, by studying the tritiated thymidine / total DNA ratio, that the cells proliferate little, unlike cells cultivated in the absence of hyaluronate, and unlike cells cultivated in presence of hyaluronate which proliferate even more.

Cela montre que, de façon surprenante, les hyaluronanes modifiés de l'invention favorisent les phases de synthèse des protéoglycanes plutôt que les phases de prolifération, ce qui est très favorable à l'élaboration d'une matrice extracellulaire par les cellules ainsi cultivées. This shows that, surprisingly, the modified hyaluronans of the invention favor the synthesis phases of proteoglycans rather than the proliferation phases, which is very favorable for the development of an extracellular matrix by the cells thus cultivated.

(b) Implantation de gels de hyaluronane modifié selon l'invention
Ces essais ont été effectués chez le rat dans un modèle de lésions ostéochondrales décrit par Moskalewski et al., Cell Transplant., 2, 467 (1993). Des lots de 6 rats ont été utilisés pour chaque mesure et pour chaque durée d'étude. Trois durées d'études ont été prises en considération (J10, J20 et J40). Sur chaque rat, seul le genou gauche a reçu l'implantation d'hydrogel au niveau de la lésion, le genou droit servant de témoin. (b) Implantation of Hyaluronan Gels Modified According to the Invention
These tests were carried out in rats in a model of osteochondral lesions described by Moskalewski et al., Cell Transplant., 2, 467 (1993). Lots of 6 rats were used for each measurement and for each study duration. Three study durations were taken into account (D10, D20 and D40). In each rat, only the left knee received hydrogel implantation at the level of the lesion, the right knee serving as a control.

Les produits étudiés étaient ceux des exemples 1 et 2 ci-dessus. The products studied were those of Examples 1 and 2 above.

Pendant les 10 premiers jours, les animaux étaient porteurs d'un émetteur permettant d'évaluer un indice de mobilité ainsi que les variations de température corporelle : on n'a constaté aucune réaction inflammatoire lorsque les lésions sont comblées par un hydrogel, ce qui met bien en lumière les propriétés de biotolérance vis-àvis du matériau. During the first 10 days, the animals were carrying a transmitter making it possible to evaluate a mobility index as well as the variations in body temperature: no inflammatory reaction was observed when the lesions are filled with a hydrogel, which puts highlight the biotolerance properties vis-à-vis the material.

L'analyse macroscopique de la réparation du tissu lésé est effectuée notamment selon les critères suivants : - régularité de la surface de l'implant, - aspect du raccordement, - coloration du cartilage périphérique, - aspect du cartilage périphérique. The macroscopic analysis of the repair of the injured tissue is carried out in particular according to the following criteria: - regularity of the surface of the implant, - aspect of the connection, - coloring of the peripheral cartilage, - appearance of the peripheral cartilage.

L'étude macroscopique a montré que, dans le cas de comblement par les hydrogels étudiés, le tissu de réparation est de type hyalin, c'est-à-dire qu'il présente un bon resurfaçage, et que sa coloration est proche de celle du tissu environnant. En outre, on observe une bonne intégration au niveau des bords de la lésion. Enfin, le dosage des constituants de la matrice et le dosage d'ADN mettent en évidence que les implants ont permis une bonne réhabitation cellulaire et que le tissu de réparation, non fibreux, a une nature très proche de celle du cartilage. The macroscopic study has shown that, in the case of filling with the hydrogels studied, the repair tissue is of the hyaline type, that is to say that it has good resurfacing, and that its coloring is close to that of the surrounding tissue. In addition, good integration is observed at the edges of the lesion. Finally, the assay of the constituents of the matrix and the assay of DNA show that the implants have enabled good cellular rehabitation and that the repair tissue, which is not fibrous, has a nature very close to that of cartilage.

Claims

REVENDICATIONS

1. Composition contenant un hyaluronane modifié constitué essentiellement d'acide hyaluronique, éventuellement sous forme salifiée, dans lequel une proportion non supérieure à 50 % des groupes carboxyliques sont sous forme d'esters aliphatiques ou arylaliphatiques dont le groupe aliphatique ou arylaliphatique comporte au moins 10 atomes de carbone. 1. Composition containing a modified hyaluronan consisting essentially of hyaluronic acid, optionally in salified form, in which a proportion not greater than 50% of the carboxylic groups are in the form of aliphatic or arylaliphatic esters of which the aliphatic or arylaliphatic group comprises at least 10 carbon atoms.

2. Composition selon la revendication 1, dans laquelle ledit hyaluronane modifié est en outre réticulé. 2. The composition of claim 1, wherein said modified hyaluronan is further crosslinked.

3. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle ladite proportion de groupes carboxyliques estérifiés est suffisamment faible et/ou la réticulation est effectuée à un taux suffisamment faible pour que ledit hyaluronane modifié soit soluble dans une solution aqueuse de chlorure de sodium 0,15 M. 3. Composition according to any one of the preceding claims, in which said proportion of esterified carboxylic groups is sufficiently low and / or the crosslinking is carried out at a sufficiently low level so that said modified hyaluronan is soluble in an aqueous solution of sodium chloride 0.15 M.

4. Composition selon la revendication 3, dans laquelle ledit acide hyaluronane est réticulé. 4. The composition of claim 3, wherein said hyaluronan acid is crosslinked.

5. Composition selon la revendication 4, dans laquelle le taux de réticulation est suffisamment faible pour que ledit hyaluronane modifié puisse former un hydrogel capable de retenir une masse d'eau au moins égale à 50 % de la masse du polymère. 5. Composition according to claim 4, in which the crosslinking rate is low enough for said modified hyaluronan to form a hydrogel capable of retaining a mass of water at least equal to 50% of the mass of the polymer.

6. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle ledit hyaluronane modifié est sous la forme d'un hydrogel aqueux contenant éventuellement une substance hydrophobe et/ou une macromolécule hydrophile. 6. Composition according to any one of the preceding claims, in which said modified hyaluronan is in the form of an aqueous hydrogel optionally containing a hydrophobic substance and / or a hydrophilic macromolecule.

7. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, sous la forme d'un lyophilisât. 7. Composition according to any one of claims 1 to 5, in the form of a lyophilisate.

8. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, sous la forme d'un hydrogel contenant des cellules vivantes et/ou au moins un facteur de croissance. 8. Composition according to any one of claims 1 to 6, in the form of a hydrogel containing living cells and / or at least one growth factor.

9. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 et 3, dans laquelle ladite proportion de groupes carboxyliques estérifiés est suffisamment élevée pour que ledit hyaluronane modifié soit insoluble dans une solution aqueuse de chlorure de sodium 0,15 M. 9. Composition according to any one of claims 1 and 3, in which said proportion of esterified carboxylic groups is sufficiently high for said modified hyaluronan to be insoluble in an aqueous solution of 0.15 M sodium chloride.

10. Composition selon la revendication précédente, dans laquelle ladite proportion de groupes carboxyliques estérifiés est suffisamment faible pour que ledit hyaluronane modifié gonfle dans l'eau en formant un hydrogel. 10. Composition according to the preceding claim, wherein said proportion of esterified carboxylic groups is low enough for said modified hyaluronan to swell in water, forming a hydrogel.

11. Composition selon la revendication 9 ou 10, présentée sous la forme d'une pièce massive, de microsphères, d'un hydrogel ou d'un hydrogel lyophilisé. 11. Composition according to claim 9 or 10, presented in the form of a solid part, of microspheres, of a hydrogel or of a lyophilized hydrogel.

12. Utilisation d'un hyaluronane modifié tel que défini dans l'une quelconque des revendications précédentes, dans la préparation d'un médicament, dans la préparation d'un implant, dans la préparation d'un hydrogel, dans la préparation de microsphères, dans la préparation d'une pièce de prothèse osseuse, comme support de culture cellulaire in vitro, comme agent de piégeage ou d'encapsulation d'une substance hydrophobe, d'une macromolécule hydrophile ou de cellules vivantes. 12. Use of a modified hyaluronan as defined in any one of the preceding claims, in the preparation of a medicament, in the preparation of an implant, in the preparation of a hydrogel, in the preparation of microspheres, in the preparation of a bone prosthesis part, as a cell culture support in vitro, as a trapping or encapsulating agent for a hydrophobic substance, a hydrophilic macromolecule or living cells.

13. Utilisation selon la revendication 12, dans laquelle : - ledit hyaluronane modifié est sous forme d'hydrogel contenant une substance macromoléculaire hydrosoluble et/ou une substance hydrophobe et/ou des cellules vivantes ; - ledit hyaluronane modifié est insoluble dans l'eau et se présente sous la forme de nanosphères ou de microsphères contenant un produit actif ; - ledit hyaluronane modifié est insoluble dans l'eau et est préparé sous la forme d'une pièce massive destinée à être utilisée comme substitut osseux. 13. Use according to claim 12, in which: said modified hyaluronan is in the form of a hydrogel containing a water-soluble macromolecular substance and / or a hydrophobic substance and / or living cells; - Said modified hyaluronan is insoluble in water and is in the form of nanospheres or microspheres containing an active product; - Said modified hyaluronan is insoluble in water and is prepared in the form of a solid piece intended to be used as a bone substitute.