FR2785613A1

FR2785613A1 - New conotoxin, useful for treating neurodegenerative disorders, e.g. multiple sclerosis, have selective presynaptic action on neuronal sodium channels

Info

Publication number: FR2785613A1
Application number: FR9814134A
Authority: FR
Inventors: Andre Menez; Philippe Favreau; Gall Frederic Le; Yves Letourneux; Jordi Molgo
Original assignee: Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Current assignee: Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Priority date: 1998-11-10
Filing date: 1998-11-10
Publication date: 2000-05-12
Anticipated expiration: 2018-11-10
Also published as: FR2785613B1

Abstract

Conotoxins (I) of 28-40 amino acids (aa), containing six Cys residues that form three disulfide bridges. Conotoxins of formula (I) are new: (I) UCX1X2X3X4X5X6CY1Y2Y3Y4Y5Y6Y7Y8Y9CCZ1Z2Z3CV1V2V3CR: U and R = 1-3 hydrophobic, charged and/or polar, neutral aa; at least one X = charged, basic aa, preferably Lys or Arg, with the other Xs preferably being polar aa; Y (except Y6) = hydrophobic aa; Y6 = charged, basic aa, preferably Lys, Arg, ornithine, homoArg, N-methyl-lysine, dimethyl-lysine, or trimethyl-lysine; Z and V = hydrophobic or polar neutral aa. Independent claims are also included for the following: (1) pharmaceutical composition containing at least one (I) and at least one vehicle; (2) composition containing at least one (I) and at least one aminopyridine (II); and (3) biological reagent comprising (I) conjugated to a marker, preferably a fluorophore such as rhodamine.

Description

La présente invention est relative à des peptides, comprenant entre 28 et 40 acides aminés, ayant une activité de conotoxine. The present invention relates to peptides, comprising between 28 and 40 amino acids, having conotoxin activity.

La présente invention est également relative aux applications desdits peptides, comme réactif biologique et comme médicament, notamment pour le traitement des maladies neurodégénératives. The present invention also relates to the applications of said peptides, as a biological reagent and as a medicament, in particular for the treatment of neurodegenerative diseases.

Les cônes sont des mollusques prédateurs qui possèdent un appareil venimeux très évolué leur permettant de capturer leur proie en l'immobilisant. Cones are predatory molluscs that have a highly advanced venomous device that allows them to capture their prey by immobilizing it.

Ils peuvent être classés en trois groupes selon leur régime alimentaire : il existe ainsi environ 50 espèces de cônes piscivores qui se nourrissent de poissons, 50 espèces de cônes malacophages qui se nourrissent de mollusques et plus de 500 espèces de vermivores qui se nourrissent de vers. Plusieurs toxines ont été isolées à partir des venins de cônes, en particulier piscivores. Ces toxines, impliquées dans l'immobilisation de la proie par le cône, sont communément appelées conotoxines. They can be divided into three groups according to their diet: there are approximately 50 species of piscivorous cones that feed on fish, 50 species of malacophagous cones that feed on molluscs and more than 500 species of vermivores that feed on worms. Several toxins have been isolated from venoms of cones, especially piscivorous. These toxins, involved in the immobilization of the prey by the cone, are commonly called conotoxins.

Ces molécules sont des peptides de 10 à 40 résidus d'acides aminés dont l'action physiologique est de se lier avec une forte affinité et spécificité aux récepteurs et aux canaux ioniques des cellules excitables et non excitables. These molecules are peptides of 10 to 40 amino acid residues whose physiological action is to bind with high affinity and specificity to receptors and ion channels of excitable and non excitable cells.

Plusieurs familles de conotoxines responsables des effets toxiques provoqués par le venin brut ont été caractérisées, en fonction de leur cible physiologique. Certaines d'entre elles agissent au niveau du canal sodique. Ces toxines, en se fixant sur le canal, altèrent son activité en affectant l'une ou l'autre de ses trois fonctions (conductance, activation et inactivation). Au moins six sites de fixation des toxines ont ainsi été mis en évidence sur le canal sodique (Catterall, 1986 ; Gordon, 1997). Parmi les conotoxines qui agissent sur ce canal, on peut citer :

- les -conotoxines et les p0-conotoxines
On les retrouve aussi bien dans les venins de cônes piscivores (C. geographus, par exemple) que dans les venins de cônes malacophages (C. pennaceus, par exemple). Several families of conotoxins responsible for the toxic effects caused by the raw venom have been characterized, according to their physiological target. Some of them act at the level of the sodium channel. These toxins, binding to the channel, alter its activity by affecting one or the other of its three functions (conductance, activation and inactivation). At least six toxin binding sites have been identified on the sodium channel (Catterall 1986, Gordon 1997). Among the conotoxins that act on this channel, we can mention:

- the -conotoxins and p0-conotoxins
They are also found in venoms of piscivorous cones (C. geographus, for example) and in the venoms of malacophagous cones (C. pennaceus, for example).

Les p-conotoxines de cônes piscivores telles que la -GIIA et la u-GIIIB de C. geographus bloquent les canaux sodiques du muscle squelettique The p-conotoxins of piscivorous cones such as C. geographus -GIIA and u-GIIIB block the sodium channels of skeletal muscle.

d'amphibien et de mammifère. La composition en acides aminés de ces trois toxines a été déterminée (Cruz et coll., 1985b) : ce sont des peptides basiques composés de 22 résidus d'acides aminés réticulés par trois ponts disulfures et ayant l'extrémité C-terminale amidée. Les deux premières toxines (à 50 nM) bloquent les canaux sodiques musculaires d'une manière réversible et dépendante du potentiel de membrane, sans affecter (à 50 M) les canaux sodiques neuronaux. L'action spécifique des u-conotoxines sur les canaux sodiques du muscle squelettique a été confirmée par des expériences de fixation. En effet, il a été montré que les - conotoxines (à 10 M) n'ont aucune affinité pour les canaux sodiques neuronaux
3 3 alors qu'elles inhibent la fixation spécifique de la H-saxitoxine et de la H-tétro- dotoxine sur le site 1 des canaux sodiques du muscle squelettique (Moczydlowsky et coll., 1986). of amphibians and mammals. The amino acid composition of these three toxins has been determined (Cruz et al., 1985b): they are basic peptides composed of 22 amino acid residues crosslinked by three disulfide bridges and having the C-terminal amide end. The first two toxins (at 50 nM) block the muscular sodium channels in a reversible and membrane-dependent manner, without affecting (at 50 M) the neuronal sodium channels. The specific action of u-conotoxins on the sodium channels of skeletal muscle was confirmed by binding experiments. Indeed, it has been shown that - conotoxins (at 10 M) have no affinity for neuronal sodium channels
While they inhibit the specific binding of H-saxitoxin and H-tetro-dotoxin at site 1 of the sodium channels of skeletal muscle (Moczydlowsky et al., 1986).

Une autre u-conotoxine de cône piscivore, la u-PIIIA, un poly- peptide de 22 résidus d'acides aminés réticulés par trois ponts disulfures, qui a été isolée à partir du venin de C. purpurascens (Shon et coll., 1998), bloque de manière irréversible les canaux sodiques musculaires d'amphibien et de mammi- fère en se fixant sur leur site 1. Cependant, contrairement aux u-conotoxines décrites ci-dessus, la u-PIIIA bloque également les canaux sodiques de type II du cerveau de rat exprimés dans des ovocytes de xénope, mais de manière réversible. Another piscivorous cone u-conotoxin, u-PIIIA, a polypeptide of 22 amino acid residues crosslinked by three disulfide bridges, was isolated from the venom of C. purpurascens (Shon et al., 1998). ), irreversibly blocks the amphibian and mammalian muscle sodium channels by binding to their site 1. However, unlike the u-conotoxins described above, u-PIIIA also blocks the type II sodium channels. of rat brain expressed in xenopus oocytes, but reversibly.

La -PIIIA permet ainsi de distinguer trois catégories de canaux sodiques sensibles à la tétrodotoxine (TTX) : (1) les canaux sensibles à la u-PIIIA et à la -GIIIA (canaux sodiques du muscle squelettique), (2) les canaux sensibles à la u-PIIIA et insensibles à la toxine III (ou u-GIIIA) (canaux sodiques neuronaux de type (II)) et (3) les canaux résistants à ces deux toxines (Shon et coll., 1998). The -PIIIA thus makes it possible to distinguish three categories of tetrodotoxin-sensitive sodium channels (TTX): (1) the channels sensitive to u-PIIIA and -GIIIA (sodium channels of skeletal muscle), (2) sensitive channels u-PIIIA and insensitive to toxin III (or u-GIIIA) (neuronal sodium channels of type (II)) and (3) the channels resistant to both toxins (Shon et al., 1998).

Fainzilber et coll. (1995a) ont isolé deux u-conotoxines de cônes malacophages, la u-PnIVA et la u-PnIVB à partir du venin de C. pennaceus. Fainzilber et al. (1995a) isolated two u-conotoxins from malacophagous cones, u-PnIVA and u-PnIVB from the venom of C. pennaceus.

Ces toxines bloquent spécifiquement les canaux sodiques neuro- naux de mollusque. En effet, elles n'exercent aucune action sur les canaux sodiques These toxins specifically block the neuronal sodium channels of mollusc. Indeed, they do not exert any action on the sodium channels

neuronaux de mammifère, que ce soit au niveau des cellules chromaffines de boeuf ou des synaptosomes de cerveau de rat.

Récemment, deux p0-conotoxines, MrVIA et MrVIB, ont été isolées à partir du venin du cône malacophage C. marmoreus. Ces peptides sont constitués de 31 résidus d'acides aminés réticulés par 3 ponts disulfures. Ces deux toxines inhibent la conductance sodique au niveau des neurones d'aplysie (Fainzilber et coll., 1995b ; Mclntosh et coll., 1995b). De plus, la O-MrVIA bloque les canaux sodiques de type II du cerveau de rat, exprimés dans les ovo- cytes de xénope, sans cependant affecter ou modifier la fixation spécifique de la 3
H-saxitoxine sur des membranes de cerveau de rat ou d'organe électrique de torpille (Terlau et coll., 1996b). Ces résultats indiquent que la O-MrVIA exerce une action inhibitrice sur les canaux sodiques neuronaux en se fixant sur un site différent du site 1. mammalian neurons, either at the level of chromaffin cells of beef or synaptosomes of rat brain.

Recently, two pO-conotoxins, MrVIA and MrVIB, have been isolated from the venom of the C. marmoreus malacophagous cone. These peptides consist of 31 amino acid residues crosslinked by 3 disulfide bridges. Both of these toxins inhibit sodium conductance in Aplysia neurons (Fainzilber et al., 1995b, Mclntosh et al., 1995b). In addition, O-MrVIA blocks the rat brain type II sodium channels, expressed in xenopus ovocytes, without, however, affecting or modifying the specific binding of the brain.
H-saxitoxin on rat brain membranes or torpedo organs (Terlau et al., 1996b). These results indicate that O-MrVIA has an inhibitory action on neuronal sodium channels by binding to a site other than site 1.

Il apparaît donc que, d'un point de vue général, l'action des - conotoxines et des uO-conotoxines se traduit par un blocage des canaux sodiques sensibles au potentiel de membrane, certaines d'entre elles ayant une spécificité d'espèces et/ou de tissus. It therefore appears that, from a general point of view, the action of - conotoxins and uO-conotoxins results in a blocking of the sodium channels sensitive to the membrane potential, some of them having species specificity and / or fabrics.

- Les 8-conotoxines dans les venins de cônes malacophages ou piscivores
L'action des 8-conotoxines se traduit, d'une manière générale, par un ralentissement de l'inactivation des canaux sodiques. De plus, certaines d'entre elles, telles que la 8-TxVIA, isolée à partir du venin C. textile (Fainzilber et coll., 1994), et la 5-GmVIA, isolée à partir du venin du cône malacophage C. gloriama- ris (Shon et coll., 1994) possèdent des propriétés de liaison effective et silencieuse respectivement chez le mollusque et le mammifère. - 8-conotoxins in venoms of malacophagous or piscivorous cones
The action of 8-conotoxins generally results in a slowing down of the inactivation of the sodium channels. In addition, some of them, such as 8-TxVIA, isolated from C. textile venom (Fainzilber et al., 1994), and 5-GmVIA, isolated from the venom of the C. gloriama malacophagous cone. ris (Shon et al., 1994) have effective and silent binding properties in mollusc and mammal, respectively.

Deux 8-conotoxines, la 8-NgVIA et la 8-PVIA, isolées respecti- vement à partir du venin de C. nigropunctatus et de C. purpurascens (Fainzilber et coll., 1995c ; Shon et coll., 1995), ont une activité toxique lorsqu'elles sont injec- tées chez le mammifère. De plus, la 8-PVIA supprime une partie du processus Two 8-conotoxins, 8-NgVIA and 8-PVIA, respectively isolated from the venom of C. nigropunctatus and C. purpurascens (Fainzilber et al., 1995c, Shon et al. toxic activity when injected into the mammal. In addition, 8-PVIA removes part of the process

d'inactivation des canaux sodiques au niveau des cellules d'hippocampe de rat (Terlau et coll., 1996a) alors que la 8-NgVIA exerce un effet similaire au niveau des neurones de mollusques (Fainzilber et coll., 1995c).

sodium channel inactivation at rat hippocampus cells (Terlau et al., 1996a), whereas 8-NgVIA exerts a similar effect at the level of molluscan neurons (Fainzilber et al., 1995c).

La structure générale des p-conotoxines, des fiO-conotoxines et des 8-conotoxines est illustrée à la figure 6. The general structure of β-conotoxins, β-conotoxins and δ-conotoxins is illustrated in Figure 6.

Compte tenu de l'activité des conotoxines sur les canaux sodiques, les Inventeurs ont cherché s'il était possible d'obtenir une conotoxine capable d'avoir une activité spécifique au niveau des canaux sodiques neuronaux et plus particulièrement sur l'inhibition de l'inactivation des canaux sodiques neuronaux. Given the activity of conotoxins on the sodium channels, the inventors have investigated whether it was possible to obtain a conotoxin capable of having a specific activity at the level of sodium neuronal channels and more particularly on the inhibition of inactivation of neuronal sodium channels.

La présente invention a pour objet une conotoxine, caractérisée en ce qu'elle comprend entre 28 et 40 acides aminés, en ce qu'elle comprend six cystéines qui forment trois ponts disulfure et en ce qu'elle présente la structure générale suivante : U C XI X2 X3 X4 X5 X6 C Yl Y2 Y3 Y4 Y5 Y6 Y7 Y8 Y9 C C Zl Z2 Z3 C VI V2 V3 C R, dans laquelle : U représente 1 à 3 acides aminés sélectionnés parmi les acides aminés hydrophobes, les acides aminés chargés et les acides aminés polaires neutres, au moins l'un des X est un acide aminé chargé basique, sélectionné de préférence parmi Lys et Arg, les autres X étant de préférence sélectionnés parmi les acides aminés polaires, Yl, Y2, Y3, Y4, Y5, Y7, Y8 et Y9 sont sélectionnés parmi les acides aminés hydrophobes, Y6 est sélectionné dans le groupe constitué par les acides aminés chargés basiques et notamment : Lys, Arg, omithine, homoarginine, N-méthyl-lysine, diméthyllysine et triméthyl-lysine, Zl, Z2, Z3, VI, V2 et V3 sont sélectionnés dans le groupe constitué par les acides aminés hydrophobes et les acides aminés polaires neutres et The present invention relates to a conotoxin, characterized in that it comprises between 28 and 40 amino acids, in that it comprises six cysteines which form three disulphide bridges and in that it has the following general structure: UC XI X2 X3 X4 X5 X6 C Y1 Y2 Y3 Y4 Y5 Y6 Y7 Y8 Y9 CC Z1 Z2 Z3 C VI V2 V3 CR, wherein: U represents 1 to 3 amino acids selected from hydrophobic amino acids, charged amino acids and amino acids at least one of X is a basic charged amino acid, preferably selected from Lys and Arg, the other X preferably being selected from polar amino acids, Y1, Y2, Y3, Y4, Y5, Y7, Y8 and Y9 are selected from the hydrophobic amino acids, Y6 is selected from the group consisting of basic charged amino acids and in particular: Lys, Arg, omithine, homoarginine, N-methyl-lysine, dimethyllysine and trimethyl-lysine, Zl, Z2 , Z3, VI, V 2 and V3 are selected from the group consisting of hydrophobic amino acids and neutral polar amino acids and

R représente 1 à 3 acides aminés sélectionnés parmi les acides aminés hydrophobes, les acides aminés chargés et les acides aminés polaires neutres. R represents 1 to 3 amino acids selected from hydrophobic amino acids, charged amino acids and neutral polar amino acids.

Les peptides sont de préférence amidés en C-terminal. The peptides are preferably amidated at the C-terminal.

On entend par : - acides aminés hydrophobes, les acides aminés suivants : Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met et Trp ; - les acides aminés chargés acides, les acides aminés suivants : Asp et Glu - les acides aminés chargés basiques, les acides aminés suivants : Lys, Arg, ornithine et leurs dérivés, et - les acides aminés polaires neutres, les acides aminés suivants : Gly, Ser, Cys, Tyr, Asn, Gln, His. The term "hydrophobic amino acids" means the following amino acids: Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met and Trp; - the acid-loaded amino acids, the following amino acids: Asp and Glu - the basic charged amino acids, the following amino acids: Lys, Arg, ornithine and their derivatives, and - the polar neutral amino acids, the following amino acids: Gly , Ser, Cys, Tyr, Asn, Gln, His.

Selon un mode de réalisation avantageux de ladite conotoxine, elle présente la séquence suivante : Asp-Asp-Cys-Ile-Lys-OHPro-Tyr-Gly-Phe-Cys-Ser-Leu-Pro-Ile-Leu-Lys-AsnGly-Leu-Cys-Cys-Ser-Gly-Ala-Cys-Val-Gly-Val-Cys-Ala-Asp-Leu (DDCIKOYGFCSLPILKNGLCCSGACVGVCADL) . Cette conotoxine, dénommée EVIA par les Inventeurs, est considérée comme appartenant d'un point de vue structurel à la O-superfamille. According to an advantageous embodiment of said conotoxin, it has the following sequence: Asp-Asp-Cys-Ile-Lys-OHPro-Tyr-Gly-Phe-Cys-Ser-Leu-Pro-Ile-Leu-Lys-AsnGly- Leu-Cys-Cys-Ser-Gly-Ala-Cys-Val-Gly-Val-Cys-Ala-Asp-Leu (DDCIKOYGFCSLPILKNGLCCSGACVGVCADL). This conotoxin, called EVIA by the inventors, is considered to belong structurally to the O-superfamily.

Une comparaison de la répartition des motifs cystéine apparte-

nant à la O-superfamille et agissant au niveau du canal sodique (u0-conotoxines et 8-conotoxines) ou non (co-conotoxines et K-conotoxines) est illustrée à la figure 7. A comparison of the distribution of cysteine motifs

O-superfamily and acting at the level of the sodium channel (u0-conotoxins and 8-conotoxins) or not (co-conotoxins and K-conotoxins) is illustrated in Figure 7.

Les conotoxines selon l'invention, bien qu'elles présentent le même motif en cystéines que les conotoxines définissant la O-superfamille, présentent, de manière inattendue, une activité spécifique au niveau des canaux sodiques neuronaux : action au niveau présynaptique sans affecter les fibres musculaires. Les expériences électro-physiologiques, réalisées au niveau de la jonction neuromusculaire d'amphibien et de mammifère ainsi que sur des fibres nerveuse myélinisées, montrent que ces toxines et notamment la toxine EVIA, inhibent l'inactivation des canaux sodiques neuronaux, ce qui provoque une The conotoxins according to the invention, although they have the same cysteine motif as the conotoxins defining the O-superfamily, unexpectedly exhibit a specific activity at the level of the sodium neuronal channels: action at the presynaptic level without affecting the fibers muscle. Electro-physiological experiments, performed at the level of the neuromuscular junction of amphibians and mammals as well as on myelinated nerve fibers, show that these toxins, and in particular the EVIA toxin, inhibit the inactivation of the neuronal sodium channels, which causes a

augmentation de l'excitabilité des terminaisons nerveuses. Cette augmentation de l'excitabilité se traduit par des réponses synaptiques répétées qui déclenchent des potentiels d'action musculaires. Ces potentiels d'action entraînent une augmentation de la force contractile. De plus, les toxines et notamment la toxine EVIA n'affecte ni les canaux sodiques du muscle squelettique, ni le potentiel de membrane des fibres musculaires. increased excitability of nerve endings. This increase in excitability results in repeated synaptic responses that trigger muscular action potentials. These action potentials lead to an increase in the contractile force. In addition, the toxins and in particular the EVIA toxin does not affect the sodium channels of the skeletal muscle nor the membrane potential of the muscle fibers.

De manière surprenante, les toxines selon l'invention et notamment la toxine EVIA agissent de manière sélective sur les canaux sodiques neuronaux sans affecter ceux du muscle squelettique. Cette action se traduit par une augmentation (i) de la durée du potentiel d'action au niveau des axones et (ii) l'excitabilité membranaire au niveau des terminaisons nerveuses. Surprisingly, the toxins according to the invention, and in particular the EVIA toxin, act selectively on the neuronal sodium channels without affecting those of the skeletal muscle. This action results in an increase (i) in the duration of the action potential at the level of the axons and (ii) the excitability of the membrane at the level of the nerve endings.

De telles conotoxines peuvent avantageusement être obtenues par synthèse ; en outre, la conotoxine EVIA existe, en petites quantités, dans le venin de Conus ermineus, un cône piscivore de l'atlantique. Cette toxine est un polypeptide de 32 acides aminés réticulés par trois ponts disulfures. Such conotoxins may advantageously be obtained by synthesis; in addition, the conotoxin EVIA exists, in small quantities, in the venom of Conus ermineus, a piscivorous cone of the Atlantic. This toxin is a polypeptide of 32 amino acids crosslinked by three disulfide bridges.

L'invention englobe également des peptides dérivés de cette conotoxine par addition, délétion ou substitution d'un ou plusieurs acides aminés ; il peut s'agir par exemple de peptides dans lesquels des modifications ont été apportées, notamment par substitution des acides aminés dextrogyres par des acides aminés levogyres (pseudopeptides) ou des peptides obtenus par modélisation moléculaire et présentant une activité sur les canaux sodiques telle que définie ci-dessus. The invention also encompasses peptides derived from this conotoxin by addition, deletion or substitution of one or more amino acids; for example, they may be peptides in which modifications have been made, in particular by substitution of the dextrorotatory amino acids by levogyrous amino acids (pseudopeptides) or peptides obtained by molecular modeling and having an activity on the sodium channels as defined above.

La présente invention a également pour objet des compositions pharmaceutiques, caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins un peptide tel que défini ci-dessus associé à au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable. The present invention also relates to pharmaceutical compositions, characterized in that they comprise at least one peptide as defined above associated with at least one pharmaceutically acceptable vehicle.

Les conotoxines selon l'invention, et notamment la conotoxine EVIA, en augmentant de manière sélective l'excitabilité nerveuse membranaire peuvent restituer une conduction nerveuse déficitaire et augmenter la réponse contractile du muscle squelettique en réponse à la stimulation nerveuse. The conotoxins according to the invention, and especially the conotoxin EVIA, by selectively increasing the membrane nervous excitability can restore a deficit nerve conduction and increase the contractile response of the skeletal muscle in response to nerve stimulation.

Certaines maladies neurodégénératives du système nerveux, telles que la sclérose en plaques ou les syndromes myasthéniques, tels que le syndrome de Lambert-Eaton et la myasthénie congénitale, se caractérisent par une diminution de l'excitabilité nerveuse au niveau des nerfs moteurs périphériques et une diminution de l'efficacité neuromusculaire. Les conotoxines selon l'invention constituent ainsi un agent efficace dans le traitement symptomatique de ces maladies. Certain neurodegenerative diseases of the nervous system, such as multiple sclerosis or myasthenic syndromes, such as Lambert-Eaton syndrome and congenital myasthenia, are characterized by a decrease in peripheral exciter nerve excitability and decreased neuromuscular efficacy. The conotoxins according to the invention thus constitute an effective agent in the symptomatic treatment of these diseases.

La présente invention a également pour objet une composition contenant au moins une conotoxine selon l'invention et au moins une aminopyridine. The present invention also relates to a composition containing at least one conotoxin according to the invention and at least one aminopyridine.

L'utilisation des aminopyridines (4-aminopyridine ou 3,4-diaminopyridine) seules ont notamment été décrites dans le traitement symptomatique du syndrome de LAMBERT-EATON. Elles sont administrées, per os entre 5 mg trois fois/j à 15 mg quatre fois/j ; des doses journalières supérieures à 80 mg doivent être évitées. Elles ont l'inconvénient de présenter un certain nombre d'effets indésirables sur le système nerveux central (instabilité à la marche, anxiété, convulsions...) (J. Molgo et al., Eur. J Physiol., 1996, 431, suppl., R295R296). The use of aminopyridines (4-aminopyridine or 3,4-diaminopyridine) alone have been described in the symptomatic treatment of LAMBERT-EATON syndrome. They are administered per os between 5 mg three times daily and 15 mg four times daily; daily doses above 80 mg should be avoided. They have the drawback of presenting a certain number of undesirable effects on the central nervous system (gait instability, anxiety, convulsions, etc.) (J. Molgo et al., Eur J Physiol., 1996, 431). suppl., R295R296).

Les compositions selon l'invention, qui comprennent en combinaison une conotoxine telle que définie ci-dessus et une aminopyridine, présentent, de manière surprenante, une action synergique dans les myasthénies et ont l'avantage de permettre de diminuer les doses d'aminopyridine et ainsi de diminuer le risque d'apparition des effets indésirables de ces dernières, notamment au niveau du système nerveux central. The compositions according to the invention, which comprise in combination a conotoxin as defined above and an aminopyridine, have, surprisingly, a synergistic action in myasthenia and have the advantage of making it possible to reduce the doses of aminopyridine and thus reduce the risk of occurrence of adverse effects of the latter, particularly in the central nervous system.

Elles sont avantageusement administrées par voie parentérale. They are advantageously administered parenterally.

La présente invention a également pour objet un réactif biologique, caractérisé en ce qu' il comprend une conotoxine, telle que définie ci-dessus, conjuguée à un marqueur approprié, notamment un fluorochrome tel que la rhodamine. Un tel réactif constitue un outil remarquable pour marquer au niveau des cellules les canaux sodiques neuronaux et en étudier la distribution. The present invention also relates to a biological reagent, characterized in that it comprises a conotoxin, as defined above, conjugated to a suitable marker, in particular a fluorochrome such as rhodamine. Such a reagent is a remarkable tool for labeling neuronal sodium channels at the level of cells and for studying their distribution.

Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en #uvre du procédé objet de la présente invention ainsi qu'aux dessins annexés, dans lesquels : - la figure 1 illustre les étapes de purification de la toxine EVIA à partir du venin de C. ermineus ; la figure 1A correspond au fractionnement du venin brut de C. ermineus par chromatographie d'exclusion moléculaire (gel Sephadex G-50) ; figure 1B correspond à la fraction active (hachurée), qui a été fractionnée par chromatographie liquide haute pression à phase inverse sur une colonne C18 semi-préparative. La fraction indiquée par une flèche induit spontanément des contractions musculaires lorsqu'elle est appliquée sur une préparation nerf-muscle de grenouille. Les figures 1C et 1D correspondent à la purification de la toxine EVIA sur deux types de colonnes analytiques C18; - la figure 2 illustre l'effet de la toxine EVIA au niveau de la jonction neuromusculaire de grenouille. La figure 2A correspond à la réponse synaptique contrôle. La figure 2B correspond à la réponse obtenue, 15 minutes après l'addition de la toxine EVIA (200 nM) : trains de potentiels synaptiques ont été enregistrés en réponse à une stimulation du nerf moteur. La figure 2C correspond à un potentiel d'action musculaire contrôle. Les figures 2D et 2E montrent que la toxine EVIA (200 nM) provoque des potentiels d'action musculaires répétés en réponse à une stimulation du nerf moteur. Potentiel d'action musculaire évoqué par stimulation directe du muscle en contrôle (figure 2F) et 30 minutes après l'addition de la toxine EVIA (2 M) (figure 2G) ; - la figure 3 illustre l'effet de la toxine EVIA sur la fibre nerveuse myélinisée de grenouille : . figure 3A : potentiel d'action est enregistré dans des condi- tions contrôles (a) et après addition de la toxine EVIA (200 nM) ; . figure 3B : courant sodium a été enregistré en absence (a) et en présence de la toxine EVIA (200 nM) après des impulsions dépolarisantes à 0 mV à partir d'un potentiel de maintien de-70 mV. Les traces de courants en (b) In addition to the foregoing, the invention also comprises other arrangements, which will emerge from the description which follows, which refers to examples of implementation of the method which is the subject of the present invention as well as to the appended drawings. in which: - Figure 1 illustrates the steps of purification of the EVIA toxin from the venom of C. ermineus; FIG. 1A corresponds to the fractionation of the crude venom of C. ermineus by molecular exclusion chromatography (Sephadex G-50 gel); FIG. 1B corresponds to the active fraction (hatched), which was fractionated by reversed-phase high pressure liquid chromatography on a semi-preparative C18 column. The fraction indicated by an arrow spontaneously induces muscular contractions when applied to a frog nerve-muscle preparation. FIGS. 1C and 1D correspond to the purification of the EVIA toxin on two types of analytical columns C18; FIG. 2 illustrates the effect of the EVIA toxin at the frog neuromuscular junction. Figure 2A corresponds to the control synaptic response. Figure 2B corresponds to the response obtained, 15 minutes after the addition of the EVIA toxin (200 nM): synaptic potential trains were recorded in response to stimulation of the motor nerve. Figure 2C corresponds to a control muscle action potential. Figures 2D and 2E show that the EVIA toxin (200 nM) causes repeated muscle action potentials in response to motor nerve stimulation. Muscle action potential evoked by direct stimulation of the muscle in control (FIG. 2F) and 30 minutes after the addition of the EVIA toxin (2 M) (FIG. 2G); FIG. 3 illustrates the effect of the EVIA toxin on the myelinated frog nerve fiber: FIG. 3A: action potential is recorded under control conditions (a) and after addition of the EVIA toxin (200 nM); . Figure 3B: Sodium current was recorded in absence (a) and in the presence of the EVIA toxin (200 nM) after depolarizing pulses at 0 mV from a holding potential of -70 mV. The traces of currents in (b)

représentent la différence des courants enregistrés avant et après l'addition de 0,5 M de TTX ; - la figure 4 illustre l'action de la toxine EVIA à 400 nM sur un diaphragme de souris ; la figure 4A correspond au contrôle ; la figure 4B correspond aux réponses synaptiques répétées obtenues 20 minutes après l'addition de la toxine EVIA ; - la figure 5 illustre la synergie d'action entre la conotoxine EVIA et une diaminopyridine ; - les figures 6 et 7 illustrent une comparaison de structure entre différentes conotoxines. represent the difference in currents recorded before and after the addition of 0.5 M TTX; FIG. 4 illustrates the action of the 400 nM EVIA toxin on a mouse diaphragm; Figure 4A corresponds to the control; FIG. 4B corresponds to the repeated synaptic responses obtained 20 minutes after the addition of the EVIA toxin; FIG. 5 illustrates the synergy of action between the EVIA conotoxin and a diaminopyridine; FIGS. 6 and 7 illustrate a structure comparison between different conotoxins.

Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. It should be understood, however, that these examples are given solely by way of illustration object of the invention, they do not constitute in any way a limitation.

EXEMPLE 1 : et séquencage de la toxine EVIA. EXAMPLE 1 and Sequencing of the EVIA toxin

* Préparation du venin
La méthode de dissection utilisée est celle décrite par Cruz et coll. (1976). Elle consiste, dans un premier temps, à extraire l'animal entier de sa coquille puis à le placer dans une cuve à dissection contenant de l'eau de mer. Le conduit à venin, la glande à venin, le sac radulaire et le pharynx sont prélevés et placés dans une cuve contenant 5 ml d'eau de mer. L'extrémité du conduit reliée au pharynx est coupée. Deux forceps sont ensuite utilisés : l'un pour maintenir la glande, l'autre pour presser le conduit et faire couler le venin dans une cuve stérile contenant environ 2 ml d'H2O 0,1% TFA (pH 2,5). Le venin est ainsi prélevé puis lyophilisé, pesé et conservé à -80 C. * Preparation of venom
The dissection method used is that described by Cruz et al. (1976). It consists, firstly, in extracting the whole animal from its shell and then placing it in a dissection vessel containing sea water. The venom conduit, the venom gland, the radicular sac and the pharynx are collected and placed in a tank containing 5 ml of sea water. The end of the duct connected to the pharynx is cut off. Two forceps are then used: one to hold the gland, the other to squeeze the duct and run the venom into a sterile tank containing about 2 ml of 0.1% TFA H2O (pH 2.5). Venom is removed and lyophilized, weighed and stored at -80C.

Des aliquots de 10 mg de venin de C. ermineus sont extraits deux fois par H2O 0,1% TFA de la façon suivante : des aliquots de 500 l de solution contenant 5 mg de venin sont agités à 4 C pendant une heure puis centrifugés à 6000 g à 4 C pendant 4 minutes. Une troisième extraction est effectuée en utilisant Aliquots of 10 mg of C. ermineus venom are extracted twice with 0.1% HFA TFA in the following manner: aliquots of 500 l of solution containing 5 mg of venom are stirred at 4 ° C. for one hour and then centrifuged at room temperature. 6000 g at 4 ° C. for 4 minutes. A third extraction is performed using

un mélange H2O/CH3CN (20/80). Les surnageants, contenant les peptides et les protéines solubles, sont rassemblés, lyophilisés puis conservés à -80 C. H2O / CH3CN (20/80). The supernatants, containing the peptides and soluble proteins, are pooled, lyophilized and then stored at -80 ° C.

* Purification du peptide par HPLC
Pour l'isolement du peptide, à partir du venin et les purifications ultérieures, on utilise le tampon A, qui consiste en 0,08 % d'acide trifluoroacétique et le tampon B qui consiste en 0,08 % d'acide trifluoroacétique et 80 % d'acétonitrile. * Purification of the peptide by HPLC
For the isolation of the peptide from the venom and subsequent purifications, buffer A, which consists of 0.08% trifluoroacetic acid and buffer B, which consists of 0.08% trifluoroacetic acid and 80% trifluoroacetic acid, is used. % acetonitrile.

Le venin brut est fractionné par chromatographie sur colonne Sephadex G-50. Les fractions actives sont combinées et fractionnées par HPLC en phase inverse sur une colonne semi-préparative C18 Vydac. The crude venom is fractionated by Sephadex G-50 column chromatography. The active fractions are combined and fractionated by reverse phase HPLC on a C18 Vydac semi-preparative column.

La purification de la toxine EVIA est réalisée en deux étapes par chromatographie en phase inverse sur une colonne C18 Vydac (4,6 mm x 25 cm, granulométrie 5 m) et sur une colonne C18 Merck (4,6 mm x 25 cm, granulométrie 5 m). The purification of the EVIA toxin is carried out in two stages by reverse phase chromatography on a C18 Vydac column (4.6 mm × 25 cm, particle size 5 μm) and on a C18 Merck column (4.6 mm × 25 cm, granulometry). 5 m).

* Analyse de la séquence en acides aminés
Pour analyser sa composition en acides aminés, le peptide purifié (1 nmole) a été hydrolysé par 200 l d'HCl 6M à 120 C pendant 16 heures. Les hydrolysats ainsi obtenus ont été analysés sur un analyseur automatique "Applied Biosystem 130A". * Analysis of the amino acid sequence
To analyze its amino acid composition, the purified peptide (1 nmol) was hydrolysed with 200 l of 6M HCl at 120 ° C. for 16 hours. The hydrolysates thus obtained were analyzed on an automatic analyzer "Applied Biosystem 130A".

Pour déterminer sa séquence en acides aminés, le peptide a été pyridyléthylé de la façon suivante : 1 nmole de toxine est réduite par le dithiothréitol dans l'hydrochlorure de guanidinium 6 M ; Tris/HCl 0,5 M ;EDTA, 2 mM (pH 7,5) pendant une heure puis traitée par la 4-vinylpyridine (1,5 M) à température ambiante pendant trois heures. Le dérivé obtenu est purifié par CLHP sur une colonne C18 Vydac (4,6 mm x 25 cm, granulométrie 5 m). La séquence en acides aminés est déterminée, par dégradation d'Edman, sur un microséquenceur "Applied Biosystem 477A" et les dérivés phénylthiohydantoïnes sont identifiés en utilisant un analyseur "Applied Biosystem 120A". To determine its amino acid sequence, the peptide was pyridylethylated as follows: 1 nmol of toxin was reduced by dithiothreitol in 6 M guanidinium hydrochloride; Tris / 0.5M HCl, 2mM EDTA (pH 7.5) for one hour and then treated with 4-vinylpyridine (1.5M) at room temperature for three hours. The derivative obtained is purified by HPLC on a C18 Vydac column (4.6 mm × 25 cm, 5 m particle size). The amino acid sequence is determined, by Edman degradation, on an Applied Biosystem 477A microsequencer and the phenylthiohydantoin derivatives are identified using an Applied Biosystem 120A analyzer.

L'analyse du produit par dégradation chimique d'Edman a ainsi conduit à la séquence peptidique de 32 résidus d'acides aminés (0 : hydroxyproline, "extrémité N-terminale amidée) :
DDCIKOYGFCSLPILKNGLCCSGACVGVCADL*
La séquence a été confirmée par l'analyse du peptide par spectrométrie de masse. L'ion moléculaire MH+ détecté correspond à la masse théorique du peptide séquence (masse observée : 3288.3 ; masse théorique 3288.4). Analysis of the product by chemical degradation of Edman thus led to the peptide sequence of 32 amino acid residues (O: hydroxyproline, "N-terminal amide end):
DDCIKOYGFCSLPILKNGLCCSGACVGVCADL *
The sequence was confirmed by peptide analysis by mass spectrometry. The detected molecular ion MH + corresponds to the theoretical mass of the sequence peptide (observed mass: 3288.3, theoretical mass 3288.4).

Ce peptide a été nommé EVIA. This peptide has been named EVIA.

La conotoxine EVIA contient 32 acides aminés dont 6 résidus cystéine. Le motif formé par les cystéines (-C-C-CC-C-C-) est caractéristique des conotoxines de la "O-superfamille" incluant les w-conotoxines qui inhibent les canaux calcium voltage-sensible, la conotoxine GS et les uO-conotoxines qui bloquent les canaux sodiques, les 8-conotoxines qui inhibent l'inactivation des canaux sodium voltage-sensible et la K-conotoxine qui bloque le canal potassium du type "shaker". La conotoxine EVIA présente le même motif cystéine et le même espacement entre les cystéines que les uO-conotoxines. De plus, comme les Oconotoxines et les 8-conotoxines, EVIA possède un nombre de résidus hydrophobes important expliquant les temps d'élution relativement important observés en chromatographie à phase inverse. Conotoxin EVIA contains 32 amino acids including 6 cysteine residues. The pattern formed by cysteines (-CC-CC-CC-) is characteristic of "O-superfamily" conotoxins including w-conotoxins that inhibit voltage-sensitive calcium channels, GS conotoxin and uO-conotoxins that block sodium channels, 8-conotoxins which inhibit the inactivation of voltage-sensitive sodium channels and K-conotoxin which blocks the potassium channel of the "shaker" type. Conotoxin EVIA has the same cysteine pattern and the same spacing between cysteines as uO-conotoxins. In addition, like oconotoxins and 8-conotoxins, EVIA has a large number of hydrophobic residues explaining the relatively large elution times observed in reverse phase chromatography.

* Spectrométrie de masse
Le système utilisé est une ESI-IMS ("Electrospray Ionization Mass Spectra") comprenant une source d'ionisation par électrovaporisation ( electrospray ) (Analytica, Brandford, CT, USA), un analyseur de masse quadrupole (Model RI 0-10 ; Nermag) et un système d'analyse de données (ChemMS Chemstation, Hewlett-Packard). * Mass spectrometry
The system used is an ESI-IMS ("Electrospray Ionization Mass Spectra") comprising an electrospray ionization source (electrospray) (Analytica, Brandford, CT, USA), a quadrupole mass analyzer (Model RI 0-10; Nermag ) and a data analysis system (ChemMS Chemstation, Hewlett-Packard).

EXEMPLE 2 : Activité biologique du peptide EVIA
Pour quantifier les activités biologiques du venin et du peptide isolé, plusieurs bioessais sont réalisés sur les poissons, les souris et les mollusques. EXAMPLE 2 Biological Activity of the EVIA Peptide
To quantify the biological activities of the venom and the isolated peptide, several bioassays are carried out on fish, mice and molluscs.

L'injection intramusculaire est réalisée sur des poissons (Gambusia affinis, 1-2 g). Intramuscular injection is performed on fish (Gambusia affinis, 1-2 g).

Les souris utilisées sont des Swiss-Webster pesant entre 20 et 25 g. Les injections intra-cérébroventriculaires (i. c.v.) sont effectuées avec un appareil de stéréotaxie Harvard/ASI. The mice used are Swiss-Webster weighing between 20 and 25 g. Intra-cerebroventricular (i.v.v.) injections are performed with a Harvard / ASI stereotaxis apparatus.

Les mollusques utilisés sont des patelles (0,4-0,5 g). The molluscs used are limpets (0.4-0.5 g).

Les réponses positives, chez le poisson et la souris sont quantifiées par la DES , dose qui produit une hyperactivité chez 50 % des animaux testés pendant la durée de l'essai. Positive responses in fish and mice are quantified by DES, a dose that produces hyperactivity in 50% of the animals tested during the trial.

Des préparations nerf-muscle Sartorius sont utilisées pour le criblage des différentes fractions. Cette méthode consiste à prélever sur des grenouilles mâles Rana esculenta, le Sartorius, à appliquer dans le milieu chaque fraction et à observer visuellement celles qui sont capables de provoquer spontanément des contractions musculaires (présence de la toxine). Sartorius nerve-muscle preparations are used for screening different fractions. This method consists in taking from male frogs Rana esculenta, Sartorius, to apply in the middle each fraction and to visually observe those which are capable of spontaneously provoking muscular contractions (presence of the toxin).

La fraction provoquant des contractions spontanées du muscle est indiquée par les hachures (figure lA). Cette fraction active est ensuite fractionnée par chromatographie liquide haute pression à phase inverse (figure 1 B). Les composants de cette fraction ont été testés sur la préparation nerf-muscle Sartorius et un seul composé (flèche) éluant à 43% d'acétonitrile provoque des contractions spontanées au niveau de la jonction neuromusculaire de grenouille. Ce composé a été purifié par CLHP en utilisant deux types de colonne analytique C18 (figure 1C et 1 D). The fraction causing spontaneous contractions of the muscle is indicated by the hatching (Figure 1A). This active fraction is then fractionated by reversed-phase high pressure liquid chromatography (FIG. 1B). The components of this fraction were tested on the Sartorius nerve-muscle preparation and a single compound (arrow) eluting at 43% acetonitrile causes spontaneous contractions at the frog's neuromuscular junction. This compound was purified by HPLC using two types of analytical column C18 (Figure 1C and 1D).

Les souris utilisées sont des Swiss-Webster pesant entre 20 et 25 g. Les injections intra-cérébroventriculaires (i. c.v.) sont effectuées avec un appareil de stéréotaxie Harvard/ASI. La toxine EVIA est solubilisée dans une solution saline (NaCl : 0,15 M). Un volume de 5-10 III de solution est injecté avec une seringue Hamilton de 50 l dans le ventricule droit de la souris. Cette toxine (40 nmoles) provoque une hyperactivité se caractérisant par des courses rapides et des crises convulsives. The mice used are Swiss-Webster weighing between 20 and 25 g. Intra-cerebroventricular (i.v.v.) injections are performed with a Harvard / ASI stereotaxis apparatus. The EVIA toxin is solubilized in a saline solution (NaCl: 0.15 M). A volume of 5-10 μl of solution is injected with a 50 μl Hamilton syringe into the right ventricle of the mouse. This toxin (40 nmol) causes hyperactivity characterized by rapid strokes and seizures.

L'injection de toxine (10 nmoles) par voie intramusculaire sur le poisson (Gambusia affinis pesant entre 1 et 1,5 g) provoque une hyper-activité et The injection of toxin (10 nmol) intramuscularly on the fish (Gambusia affinis weighing between 1 and 1.5 g) causes a hyper-activity and

une contraction de toutes les nageoires. A plus fortes doses (1 nmole), le peptide est extrêmement toxique chez la souris, provoquant la mort en moins d'une minute. a contraction of all the fins. At higher doses (1 nmol), the peptide is extremely toxic in mice, causing death in less than a minute.

Le peptide EVIA a été injecté dans le pied du mollusque Patella. The EVIA peptide was injected into the foot of the Patella mollusc.

A la différence des résultats observés avec la toxine 8-TxVIA (Fainzilber, 1991 ; Hillyard, 1989) qui provoque une paralysie rigide du pied du mollusque, la toxine EVIA ne produit par d'effet significatif. Le peptide EVIA est donc actif spécifiquement sur les vertébrés. Unlike the results observed with the 8-TxVIA toxin (Fainzilber, 1991, Hillyard, 1989), which causes rigid foot palsy, the EVIA toxin produces no significant effect. The EVIA peptide is therefore active specifically on vertebrates.

Le Tableau 1 ci-après montre que l'EVIA est une toxine active mais non toxique chez les vertébrés. Table 1 below shows that EVIA is an active but non-toxic toxin in vertebrates.

Tableau 1
EFFET DE LA TOXINE EVIA SUR LA JONCTION NEUROMUSCULAIRE
ISOLEE DE GRENOUILLE

Table 1
EFFECT OF EVIA TOXIN ON NEUROMUSCULAR JUNCTION
ISOLATED OF FROG

<tb>
<tb> DE50 <SEP> dans <SEP> DE50 <SEP> sur
<tb> poisson <SEP> mammifère <SEP> mollusque <SEP> jonction <SEP> neuromusculaire
<tb> g.g <SEP> masse <SEP> corporelle-' <SEP> g
<tb> Venin <SEP> brut <SEP> 0,53 <SEP> 0,25 <SEP> pas <SEP> d'effet <SEP> 1,5
<tb> pmole.masse <SEP> corporelle-' <SEP> nmole
<tb> EVIA <SEP> 4,1 <SEP> 1,8 <SEP> pas <SEP> d'effet <SEP> 1,2 <SEP> ii:l
<tb> <Tb>
<tb> DE50 <SEP> in <SEP> DE50 <SEP> on
<tb> fish <SEP> mammalian <SEP> mollusc <SEP> junction <SEP> neuromuscular
<tb> gg <SEP> mass <SEP> corporal- '<SEP> g
<tb> Venom <SEP> crude <SEP> 0.53 <SEP> 0.25 <SEP> not <SEP> of effect <SEP> 1.5
<tb> pmole.masse <SEP> corporal- '<SEP> nmole
<tb> EVIA <SEP> 4.1 <SEP> 1.8 <SEP> not <SEP> of effect <SEP> 1.2 <SEP> ii: l
<Tb>

La préparation nerf-muscle pectoral cutané (Cutaneous pectoris) est prélevée sur des grenouilles mâles Rana esculenta, pesant entre 20 et 25 g, préalablement décérébrées et démédullées. Ce muscle présente l'avantage d'être plat et de ne contenir que très peu de couches de fibres musculaires, ce qui permet de suivre facilement le trajet des branches nerveuses. The cutaneous pectoral nerve-muscle preparation (Cutaneous pectoris) is taken from male frogs Rana esculenta, weighing between 20 and 25 g, previously decerebrated and demedullated. This muscle has the advantage of being flat and containing only a few layers of muscle fibers, which makes it easy to follow the path of the nerve branches.

Après dissection, la préparation est fixée et épinglée dans une cuve en Plexiglass, dont le fond est recouvert de Rhodorsil, contenant 2 ml de solution physiologique de composition suivante en mM) : NaCI, 115 ; KCI, 2,1 ; CaCl2, 1,8 ; tampon HEPES (N-(2-hydroxyéthyl)pipérazine-N'-2-éthanesul-fonate de sodium), 5. Le pH est ajusté à 7,25. After dissection, the preparation is fixed and pinned in a Plexiglass tank, the bottom of which is covered with Rhodorsil, containing 2 ml of physiological solution of the following composition in mM: NaCl, 115; KCl, 2.1; CaCl2, 1.8; HEPES buffer (N- (2-hydroxyethyl) piperazine-N'-2-ethanesul-sodium fonate), 5. The pH is adjusted to 7.25.

Un milieu de découplage excitation-contraction a été utilisé lors des enregistrements électrophysiologiques intracellulaires au cours de l'étude de An excitation-contraction decoupling medium was used during intracellular electrophysiological recordings during the study of

l'action de la toxine EVIA qui entraîne des contractions musculaires spontanées incompatibles avec ce type d'enregistrement. Le découplage consiste en un choc osmotique entraînant des perturbations de système tubulaire des fibres musculaires, ce qui a pour conséquence un découplage entre l'excitation membranaire et la contraction musculaire (del Castillo et Escalona de Motta, 1978). Pour cela, les préparations sont traitées pendant 17 min. avec une solution physiologique contenant 2 M de formamide, puis abondamment rincées avec une solution physiologique standard pendant 1 h 30. Dans ces conditions, le potentiel de repos des fibres est légèrement diminué (-60 mV au lieu de-80 mV) mais les terminaisons nerveuses répondent normalement à la stimulation électrique. the action of the EVIA toxin which causes spontaneous muscle contractions incompatible with this type of recording. Decoupling consists of an osmotic shock causing tubular system disturbances of the muscle fibers, which results in a decoupling between membrane excitation and muscle contraction (del Castillo and Escalona de Motta, 1978). For this, the preparations are treated for 17 min. with a physiological solution containing 2 M of formamide, then abundantly rinsed with a standard physiological solution for 1 h 30. Under these conditions, the resting potential of the fibers is slightly decreased (-60 mV instead of -80 mV) but the terminations nerve normally respond to electrical stimulation.

Les potentiels d'action et les réponses synaptiques sont enregistrés sur le muscle Cutaneous pectoris à l'aide d'une microélectrode de verre selon les techniques conventionnelles d'enregistrement intracellulaire. Après amplification, les signaux électriques sont observés sur un oscilloscope digital (Tektronix 5223) et simultanément enregistrés sur un magnétoscope (Sony PCM 701 ES). The action potentials and synaptic responses are recorded on the Cutaneous pectoris muscle using a glass microelectrode according to conventional intracellular recording techniques. After amplification, the electrical signals are observed on a digital oscilloscope (Tektronix 5223) and simultaneously recorded on a video recorder (Sony PCM 701 ES).

Le nerf moteur est stimulé à l'aide d'une électrode de succion formée d'un tube de verre étiré et poli à l'une de ses extrémités de manière à pouvoir aspirer le nerf sans le détériorer. L'autre extrémité est reliée à une seringue d'aspiration. Deux fils de platine sont fixés sur l'électrode, l'un enroulé à l'extérieur du tube, l'autre à l'intérieur, et connectés tous les deux à la sortie d'isolement d'un stimulateur "Grass S44". The motor nerve is stimulated using a suction electrode formed of a glass tube drawn and polished at one of its ends so as to suck the nerve without damaging it. The other end is connected to a suction syringe. Two platinum wires are attached to the electrode, one wound outside the tube, the other inside, and both connected to the isolation output of a "Grass S44" stimulator.

Dans certaines expériences réalisées sur la fibre musculaire, la technique de courant imposé a été utilisée pour maintenir le potentiel membranaire de repos à une valeur choisie en injectant un courant par une deuxième électrode. In some experiments on the muscle fiber, the imposed current technique was used to maintain the resting membrane potential at a selected value by injecting a current through a second electrode.

Comme le montre la figure 2B, après l'application de l'EVIA (200 nM) sur une préparation neuro-musculaire isolée de grenouille préalablement traitée avec le formamide, une stimulation du nerf moteur provoque un train de potentiels synaptiques pouvant atteindre une fréquence de 300 Hz. Ces trains de potentiels synaptiques engendrent des trains de potentiels d'action dans les régions extrajonctionnelles des fibres musculaires. As shown in FIG. 2B, after the application of EVIA (200 nM) on an isolated neuromuscular preparation of frog previously treated with formamide, stimulation of the motor nerve causes a train of synaptic potentials which can reach a frequency of 300 Hz. These trains of synaptic potentials generate trains of action potentials in the extrajunctional regions of the muscular fibers.

Sur les préparations neuro-musculaires non formamidées (couplage excitation-contraction non bloqué), l'addition de (+)-tubocurarine (20 M) supprime la contraction du muscle provoqué par la toxine EVIA. Ce résultat indique que la toxine agit principalement au niveau présynaptique. L'effet de la toxine EVIA sur le muscle squelettique a été étudié par stimulation directe de la fibre musculaire en injectant un courant de 2,5 ms de durée. La figure 2G montre que l'application de 2 M d'EVIA ne modifie ni le potentiel d'action musculaire, ni l'excitabilité des fibres musculaires. On non-formamidated neuromuscular preparations (unblocked excitation-contraction coupling), the addition of (+) - tubocurarine (20 M) suppresses the contraction of the muscle caused by the EVIA toxin. This result indicates that the toxin acts primarily at the presynaptic level. The effect of the EVIA toxin on skeletal muscle was studied by direct stimulation of the muscle fiber by injecting a current of 2.5 ms duration. FIG. 2G shows that the application of 2 M EVIA modifies neither the muscular action potential nor the excitability of the muscle fibers.

La toxine EVIA augmente donc de façon significative l'excitabilité de la jonction neuro-musculaire de grenouille sans affecter directement le muscle squelettique. The EVIA toxin therefore significantly increases the excitability of the frog neuromuscular junction without directly affecting the skeletal muscle.

EFFETS DE L'EVIA SUR LA FIBRE NERVEUSE MYELINISEE DE GRENOUILLE
Pour les expériences électrophysiologiques réalisées sur le noeud de Ranvier, une fibre nerveuse myélinisée d'environ 0,5 cm de long a été isolée et montée dans une chambre comportant cinq compartiments telle qu'elle a été décrite par Nonner (1969). EFFECTS OF EVIA ON MYELINIZED NERVE FIBER FROG
For the electrophysiological experiments performed on the Ranvier node, a myelinated nerve fiber about 0.5 cm long was isolated and mounted in a chamber with five compartments as described by Nonner (1969).

La solution physiologique a la composition suivante (en mM) : NaCl, 115 ; KCI, 2,1 ; CaCl2, 1,8 ; tampon HEPES (N-(2-hydroxyéthyl)pipérazineN'-éthanesulfonate de sodium), 5. Le pH est ajusté à 7,25. The physiological solution has the following composition (in mM): NaCl, 115; KCl, 2.1; CaCl2, 1.8; HEPES buffer (N- (2-hydroxyethyl) piperazine-N-ethanesulfonate), 5. The pH is adjusted to 7.25.

Le potentiel d'action et le courant sodium ont été enregistrés en utilisant respectivement les techniques conventionnelles de courant et de potentiel imposés. Le potentiel membranaire de repos des fibres est de -70mV, ce qui correspond à 30% d'inactivation du pic de courant sodium. Le noeud de Ranvier étudié est stimulé à une fréquence de 0,7 Hz. Dans les conditions de potentiel imposé, la membrane est maintenue à un potentiel de-70 mV entre les impulsions. The action potential and the sodium current were recorded using respectively conventional imposed current and potential techniques. The membrane resting potential of the fibers is -70mV, which corresponds to 30% inactivation of the sodium current peak. The Ranvier node studied is stimulated at a frequency of 0.7 Hz. Under the conditions of imposed potential, the membrane is maintained at a potential of -70 mV between the pulses.

Le courant sodium a été calculé en supposant une résistance axoplasmique de 10 M#. Les courants de fuite et capacitifs sont soustraits électroniquement du courant total. Pour enregistrer le potentiel d'action, les extrémités ont été coupées dans une The sodium current was calculated assuming an axoplasmic resistance of 10 M #. The leakage and capacitive currents are electronically subtracted from the total current. To record the action potential, the ends were cut in a

solution contenant 120 nM de KCl. Pour enregistrer le courant sodium, le courant potassium a été bloqué par du CsCI interne (110 mM) et par du TEA externe (10 mM). Le courant sodium a été caractérisé par sa sensibilité à la TTX (0,5 M). solution containing 120 nM KCl. To record the sodium current, the potassium current was blocked by internal CsCl (110 mM) and by external TEA (10 mM). The sodium current was characterized by its sensitivity to TTX (0.5 M).

Le potentiel d'action de fibres myélinisées, induit par une dépolarisation, n'est pas notablement modifié par 20 nM EVIA. En revanche, 200 nM de toxine provoque, après une minute, un allongement de la durée du potentiel d'action d'environ 6 fois. L'amplitude du pic du potentiel d'action est réduite d'environ 15% (figure 3A). The action potential of myelinated fibers, induced by depolarization, is not significantly modified by 20 nM EVIA. On the other hand, 200 nM of toxin causes, after one minute, an extension of the duration of the action potential of approximately 6 times. The amplitude of the peak of the action potential is reduced by about 15% (FIG. 3A).

L'effet de la toxine EVIA sur le courant sodique TTX-sensible a été étudié en voltage imposé sur les fibres myélinisées. Dans ces conditions, la toxine EVIA ralentit et/ou supprime une partie de l'inactivation du courant sodique (figure 3B). Par ailleurs, en présence de toxine, un courant sodique entrant est observé au potentiel de repos de la fibre (-70 mV). Enfin la toxine provoque une diminution de l'amplitude du courant sodique d'environ 40%. The effect of the EVIA toxin on the TTX-sensitive sodium current was studied in voltage imposed on the myelinated fibers. Under these conditions, the EVIA toxin slows down and / or suppresses part of the inactivation of the sodium current (FIG. 3B). Moreover, in the presence of toxin, an incoming sodium current is observed at the resting potential of the fiber (-70 mV). Finally the toxin causes a decrease in the amplitude of the sodium current of about 40%.

EFFETS DE L'EVIA SUR UN DIAPHRAGME DE SOURIS
On observe des réponses synaptiques répétées 20 minutes après l'addition d'EVIA 400nM (figure 4B). EFFECTS OF THE EVIA ON A MOUSE DIAPHRAGM
Repeated synaptic responses were observed 20 minutes after addition of 400nM EVIA (Figure 4B).

EXEMPLE 3 : d'action d'une composition contenant la conotoxine EVIA et une diaminopyridine. EXAMPLE 3: Action of a Composition Containing the Conotoxin EVIA and a Diaminopyridine

La figure 5A montre la réponse synaptique contrôle à environ 0,2 mV : les réponses sont faibles car pour visualiser une augmentation de " release " (libération) de neurotransmetteur, on bloque partiellement les récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine au curare 3 M. Figure 5A shows the control synaptic response at approximately 0.2 mV: the responses are weak because to visualize an increase in "release" (release) of the neurotransmitter, the nicotinic acetylcholine receptors are partially blocked by 3 M curare.

La figure 5B montre la réponse synaptique obtenue après stimu- lation avec 200 nM d'EVIA : obtient des réponses répétées, après stimulation du nerf moteur. Figure 5B shows the synaptic response obtained after stimulation with 200 nM EVIA: repeated responses are obtained after stimulation of the motor nerve.

La figure 5C montre que la toxine provoque des réponses synaptiques répétées, spontanément, sans stimulation. Figure 5C shows that the toxin causes repeated synaptic responses, spontaneously, without stimulation.

En B et C, les réponses ont une amplitude de 0,15-0,2 mV, comme pour le contrôle. In B and C, the responses have an amplitude of 0.15-0.2 mV, as for control.

Par contre, lorsque l'on ajoute la DAP, on a toujours des réponses répétées mais, en plus, les réponses ont une amplitude de 2,5-3 mV (soit
10 fois plus) (figure 5D), alors que la DAP seule, provoque également des réponses répétées, mais jamais à cette fréquence. On the other hand, when the DAP is added, there are always repeated responses but, in addition, the responses have an amplitude of 2.5-3 mV (
10 times more) (Figure 5D), while the DAP alone, also causes repeated responses, but never at this frequency.

EXEMPLE 4 : Synthèse de la toxine EVIA. EXAMPLE 4 Synthesis of the toxin EVIA

Elle est réalisée sur phase solide par la technique Fmoc. La synthèse est mise en #uvre sur un synthétiseur automatisé ABI 430A (PerkinElmer, en utilisant une résine amidée comme phase solide et HBTU/HOBt, comme agents de couplage (Field C.G. et al., Peptide Res., 1991,4, 95-101). A l'issue du couplage, le peptide est déprotégé et clivé de sa matrice solide par de l'acide trifluoroacétique, puis purifié sur colonne préparative C18. It is carried out on solid phase by the Fmoc technique. The synthesis is carried out on an ABI 430A automated synthesizer (PerkinElmer, using an amidated resin as a solid phase and HBTU / HOBt, as coupling agents (Field CG et al., Peptide Res., 1991, 4, 95- At the end of the coupling, the peptide is deprotected and cleaved from its solid matrix with trifluoroacetic acid, and then purified on preparative column C18.

REFERENCES # Catterall W. A., Ann. Rev. Biochem., 1986, 55, 953-985. REFERENCES # Catterall W. A., Ann. Rev. Biochem., 1986, 55, 953-985.

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# Fainzilber M. et al., J Biol. Chem., 1994, 269, 2574-2580. # Fainzilber M. et al., J Biol. Chem., 1994, 269, 2574-2580.

# Fainzilber M. et al., Biochemistry, 1995a, 34, 5364-5371. # Fainzilber M. et al., Biochemistry, 1995a, 34, 5364-5371.

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# Gordon D., 1997, in Gutman, Y. & Lazarowici P., Toxins and signal transduc- tion, cellular and molecular mechanisms of toxins action series, Harwood
Acadelic publishers, The Netherlands 119-149. # Gordon D., 1997, in Gutman, Y. & Lazarowici P., Toxins and signal transduction, cellular and molecular mechanisms of toxin action series, Harwood
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# Hillyard D. R. et al., Biochemistry, 1989, 28, 358-361. # Hillyard, D.R. et al., Biochemistry, 1989, 28, 358-361.

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# Shon K. J. et al., J Neurosci., 1998, 18, 4473-4481 # Terlau H. et al., Nature, 1996a, 381, 148-151. # Shon K. J. et al., J. Neurosci., 1998, 18, 4473-4481. Terlau H. et al., Nature, 1996a, 381, 148-151.

# Terlau H. et al., J Neurophys., 1996b, 76, 1-7. # Terlau H. et al., J. Neurophys., 1996b, 76, 1-7.

Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en #uvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. As is apparent from the foregoing, the invention is not limited to those of its modes of implementation, implementation and application which have just been described more explicitly; it encompasses all the variants that may come to the mind of the technician in the field, without departing from the scope or scope of the present invention.

Claims

REVENDICATIONS

1 ) Conotoxine, caractérisée en ce qu'elle comprend entre 28 et 40 acides aminés, en ce qu'elle comprend six cystéines qui forment trois ponts disulfure et en ce qu'elle présente la structure générale suivante : U C XI X2 X3 X4 X5 X6 C Yl Y2 Y3 Y4 Y5 Y6 Y7 Y8 Y9 C C Zl Z2 Z3 C VI V2 V3 C R, dans laquelle : U représente 1 à 3 acides aminés sélectionnés parmi les acides aminés hydrophobes, les acides aminés chargés et les acides aminés polaires neutres, au moins l'un des X est un acide aminé chargé basique, sélectionné de préférence parmi Lys et Arg, les autres X étant de préférence sélectionnés parmi les acides aminés polaires, Yl, Y2, Y3, Y4, Y5, Y7, Y8 et Y9 sont sélectionnés parmi les acides aminés hydrophobes, Y6 est sélectionné dans le groupe constitué par les acides aminés chargés basiques et notamment : Lys, Arg, omithine, homoarginine, N-méthyl-lysine, diméthyle lysine et triméthyle lysine, Zl, Z2, Z3, VI, V2 et V3 sont sélectionnés dans le groupe constitué par les acides aminés hydrophobes et les acides aminés polaires neutres et R représente 1 à 3 acides aminés sélectionnés parmi les acides aminés hydrophobes, les acides aminés chargés et les acides aminés polaires neutres. 1) Conotoxin, characterized in that it comprises between 28 and 40 amino acids, in that it comprises six cysteines which form three disulphide bridges and in that it has the following general structure: UC XI X2 X3 X4 X5 X6 Wherein Y represents 1 to 3 amino acids selected from hydrophobic amino acids, charged amino acids and neutral polar amino acids, at least one of X is a basic loaded amino acid, preferably selected from Lys and Arg, the other X being preferably selected from polar amino acids, Y1, Y2, Y3, Y4, Y5, Y7, Y8 and Y9 are selected among the hydrophobic amino acids, Y6 is selected from the group consisting of basic charged amino acids and in particular: Lys, Arg, omithine, homoarginine, N-methyl-lysine, dimethyl lysine and trimethyl lysine, Zl, Z2, Z3, VI, V2 and V3 are selected in the group consisting of hydrophobic amino acids and neutral polar amino acids and R represents 1 to 3 amino acids selected from hydrophobic amino acids, charged amino acids and neutral polar amino acids.

2 ) Conotoxine selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle présente la séquence suivante : 2) Conotoxin according to claim 1, characterized in that it has the following sequence:

Asp-Asp-Cys-Ile-Lys-OHPro-Tyr-Gly-Phe-Cys-Ser-Leu-Pro-Ile- Leu-Lys-Asn-Gly-Leu-Cys-Cys-Ser-Gly-Ala-Cys-Val-Gly-Val-Cys-Ala-Asp- Leu. Asp-Asp-Cys-Ile-Lys-OHPro-Tyr-Gly-Phe-Cys-Ser-Leu-Pro-Ile-Leu-Lys-Asn-Gly-Leu-Cys-Cys-Ser-Gly-Ala-Cys- Val-Gly-Val-Cys-Ala-Asp-Leu.

3 ) Compositions pharmaceutiques, caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins un peptide selon la revendication 1 ou la revendication 2 associé à au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 3) Pharmaceutical compositions, characterized in that they comprise at least one peptide according to claim 1 or claim 2 associated with at least one pharmaceutically acceptable vehicle.

4 ) Composition contenant au moins une conotoxine selon la revendication 1 ou la revendication 2 et au moins une aminopyridine. 4) Composition containing at least one conotoxin according to claim 1 or claim 2 and at least one aminopyridine.

5 ) Réactif biologique, caractérisé en ce qu'il comprend une conotoxine selon la revendication 1 ou la revendication 2, conjuguée à un marqueur approprié, notamment un fluorochrome tel que la rhodamine. 5) biological reagent, characterized in that it comprises a conotoxin according to claim 1 or claim 2, conjugated to a suitable marker, in particular a fluorochrome such as rhodamine.