FR2779445A1 - ENCAPSIDATION KIT - Google Patents

Abstract

The invention concerns a method for elaborating a cell line capable of producing in transient and/or stable manner recombinant retroviruses, of an order not less than 10<6> Ul/ml, and a kit for implementing said method. Said kit contains at least a non retroviral virus and a retrovirus.

Description

La présente invention concerne un procédé pour l'établissement de lignéesThe present invention relates to a method for establishing lines.

cellulaires eucaryotes hautement productrices de particules rétrovirales de manière stable ou transitoire. Elle porte également sur une trousse permettant l'encapsidation rétrovirale ainsi que eukaryotic cells highly producing retroviral particles in a stable or transient manner. It also relates to a kit allowing retroviral encapsidation as well as

sur une trousse pour l'établissement d'une lignée productrice de rétrovirus. on a kit for the establishment of a retrovirus-producing line.

La production de rétrovirus recombinants et défectifs pour leur réplication est une approche très attractive dans l'établissement de vecteurs pour la thérapie génique. En effet, un des objectifs de cette approche thérapeutique est la modification stable des cellules cibles. A cet effet, de nombreux vecteurs rétroviraux ont été développés basés sur l'aptitude des virus à assurer une expression stable dans les cellules qu'ils infectent. Tous les systèmes développés jusqu'à présent ont leurs avantages et leurs limites. Il s'agit essentiellement des systèmes The production of recombinant and replication-defective retroviruses is a very attractive approach in establishing vectors for gene therapy. Indeed, one of the objectives of this therapeutic approach is the stable modification of the target cells. To this end, many retroviral vectors have been developed based on the ability of viruses to ensure stable expression in the cells which they infect. All the systems developed so far have their advantages and limitations. These are mainly systems

rétroviraux et des systèmes adénoviraux. retroviral and adenoviral systems.

Les rétrovirus qui présentent l'avantage d'une intégration stable dans les cellules cibles, avantage tant pour la persistance de l'expression que pour la sécurité de l'utilisation, présentent des limites et des inconvénients: - le titre des particules infectieuses produites par les cellules d'empaquetage reste limité; - par ailleurs, les rétrovirus n'infectent pas les cellules quiescentes, ce qui limite leur expression à des cellules en division. En outre, on The retroviruses which have the advantage of stable integration into the target cells, an advantage both for the persistence of expression and for the safety of use, have limits and drawbacks: - the titer of the infectious particles produced by packaging cells remain limited; - moreover, retroviruses do not infect quiescent cells, which limits their expression to dividing cells. In addition, we

observe une efficacité médiocre du transfert de gènes in vivo. observed poor efficiency of gene transfer in vivo.

Une des raisons évoquées en est une activation rapide du complément du sérum entraînant l'inactivation des particules virales. Cet inconvénient peut être surmonté par la production rétrovirale in situ par greffage des cellules productrices (Rollins, S.A. et ai 1996, Human gene Therapy 7:619-626). La génération in situ de vecteurs rétroviraux a également été effectuée par une infection transitoire des cellules cibles avec des vecteurs rétroviraux avec un plasmide porteur des fonctions rétrovirales; par exemple, P. Noguiez-Hellin et al (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93: 41) ont décrit le transfert in situ de vecteurs rétroviraux et des éléments d'empaquetage par injection directe d'ADN plasmidique One of the reasons mentioned is a rapid activation of the complement of the serum resulting in the inactivation of the viral particles. This drawback can be overcome by retroviral production in situ by grafting the producer cells (Rollins, S.A. et al 1996, Human gene Therapy 7: 619-626). The in situ generation of retroviral vectors has also been carried out by transient infection of the target cells with retroviral vectors with a plasmid carrying the retroviral functions; for example, P. Noguiez-Hellin et al (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93: 41) have described the in situ transfer of retroviral vectors and packaging elements by direct injection of plasmid DNA.

porteurs de séquences rétrovirales défectives (plasmovirus). carriers of defective retroviral sequences (plasmovirus).

Les cellules cibles transfectées par le plasmovirus se transforment en cellules productrices de rétrovirus infectieux défectifs après transfection par une cassette d'expression porteuse des séquences absentes du vecteur rétroviral. Cette approche associe la simplicité d'utilisation des plasmides avec l'infectivité et l'expression à long terme des rétrovirus tout en apportant un taux de propagation compatible avec The target cells transfected with the plasmovirus are transformed into cells producing defective infectious retroviruses after transfection with an expression cassette carrying sequences absent from the retroviral vector. This approach combines the simplicity of use of plasmids with the infectivity and long-term expression of retroviruses while providing a rate of propagation compatible with

l'utilisation thérapeutique.therapeutic use.

Cette approche, qui a l'avantage de permettre d'améliorer I'efficacité du transfert de gènes, nécessite une mise au point longue et fastidieuse pour isoler les producteurs efficaces lorsque l'on cherche à optimiser un système de production au regard d'un transgène donné. Elle est donc peu adaptée aux utilisations ponctuelles ou sur cellules primaires, This approach, which has the advantage of making it possible to improve the efficiency of gene transfer, requires a long and tedious development to isolate the efficient producers when one seeks to optimize a production system with regard to a given transgene. It is therefore not very suitable for occasional use or on primary cells,

en recherche comme en clinique.in research and in clinical practice.

Des productions de rétrovirus à haut titre peuvent être obtenues à partir de lignées productrices stables (Davis J.L., 1997, Human Gene Therapy 8, 1459-67, 1997). Les cellules d'empaquetage, qui expriment de façon stable les protéines de structure gag-pol et env, sont transférées par un plasmide porteur des vecteurs génomiques et sélectionnées pour leur capacité de production de rétrovirus. Néanmoins, les sous- clones présentent une grande variété dans les titres obtenus et leur sélection requiert des mois de travail. Une méthode alternative consiste à obtenir une production de particules rétrovirales transitoires par transfection dans des cellules d'empaquetage, soit du vecteur directement, soit des trois plasmides porteurs respectivement de gag-pol, env. et le High titer retrovirus productions can be obtained from stable producer lines (Davis J.L., 1997, Human Gene Therapy 8, 1459-67, 1997). The packaging cells, which stably express the structural proteins gag-pol and env, are transferred by a plasmid carrying the genomic vectors and selected for their retrovirus production capacity. Nevertheless, the subclones show a great variety in the titers obtained and their selection requires months of work. An alternative method consists in obtaining a production of transient retroviral particles by transfection in packaging cells, either of the vector directly, or of the three plasmids carrying respectively gag-pol, env. and the

genome viral.viral genome.

Les titres de production obtenus sont malgré tout trop faibles et différentes stratégies ont été développées pour augmenter au moins l'expression transitoire des gènes. On peut citer: LANDAU, N.R., et al., 1992, J. VIROL. 66, 5110-5113, et SONEOKA, Y. et al, 1995, N.A.R., 23, In spite of everything, the production titres obtained are too low and various strategies have been developed to at least increase the transient expression of the genes. Mention may be made of: LANDAU, N.R., et al., 1992, J. VIROL. 66, 5110-5113, and SONEOKA, Y. et al, 1995, N.A.R., 23,

628-633.628-633.

Une nouvelle approche a été développée récemment visant à introduire un grand nombre de copies des plasmides dans les cellules productrices. (réf.) Les auteurs utilisent une chimère du virus Semliki Forest (SFV), du virus Herpes simplex (HSV) ou de l'adénovirus portant le gène gag-pol, env et/ou le vecteur. Néanmoins, la capacité à produire des rétrovirus recombinants diffère selon les systèmes, selon leur toxicité A new approach has recently been developed aimed at introducing a large number of copies of plasmids into producer cells. (ref.) The authors use a chimera of the Semliki Forest virus (SFV), of the Herpes simplex virus (HSV) or of the adenovirus carrying the gag-pol gene, env and / or the vector. However, the ability to produce recombinant retroviruses differs between systems, depending on their toxicity.

respective vis-à-vis de la cellule productrice. respective vis-à-vis the producer cell.

Par ailleurs, il est bien connu que l'utilisation de vecteurs adénoviraux permet d'obtenir un taux élevé de transfert de gènes dans différentes cellules cibles. Ces vecteurs sont limités par la durée de l'expression du transgène du fait qu'ils ne s'intègrent pas dans le génome de la cellule cible et donc sont rapidement perdus dans les descendances des cellules transfectées. Ils présentent en outre le risque de produire par Moreover, it is well known that the use of adenoviral vectors makes it possible to obtain a high rate of transfer of genes into various target cells. These vectors are limited by the duration of expression of the transgene because they do not integrate into the genome of the target cell and therefore are quickly lost in the progeny of the transfected cells. They also present the risk of producing by

recombinaison des adénovirus réplicatifs. recombination of replicative adenoviruses.

Feng et ai (1997, Nature Biotechnology, 15: 866) ont récemment développé un système de vecteur chimérique dans lequel les avantages des vecteurs adénoviraux et rétroviraux sont combinés pour Feng et al (1997, Nature Biotechnology, 15: 866) recently developed a chimeric vector system in which the advantages of adenoviral and retroviral vectors are combined to

I'obtention d'une transduction stable et d'une bonne productivité in vivo. Obtaining a stable transduction and good productivity in vivo.

Cela est réalisé par l'induction de la formation de cellules productrices de rétrovirus in situ par transfert d'un vecteur adéno- rétroviral et des fonctions This is achieved by inducing the formation of retrovirus-producing cells in situ by transfer of an adeno-retroviral vector and functions.

d'empaquetage rétrovirales.retroviral packaging.

Cette approche visait à réaliser des cellules cibles in vivo capables de produire des rétrovirus, eux-mêmes capables d'infecter les cellules voisines. Néanmoins, aucun élément quantitatif n'est donné en This approach aimed to produce target cells in vivo capable of producing retroviruses, themselves capable of infecting neighboring cells. However, no quantitative information is given in

faveur d'une bonne productivité de particules rétrovirales. favor of a good productivity of retroviral particles.

La présente invention vise à fournir les outils à l'homme du métier qui souhaite obtenir une production rapide et à haut rendement de particules rétrovirales porteuses d'un transgène d'intérêt et dans des The present invention aims to provide the tools to those skilled in the art who wish to obtain a rapid and high yield production of retroviral particles carrying a transgene of interest and in

conditions de sécurité satisfaisantes. satisfactory security conditions.

La présente invention résulte du besoin des scientifiques d'optimiser rapidement la production des particules rétrovirales porteuses d'un transgène, partant du fait que l'expression stable d'un transgène dans les cellules cibles était de préférence recherchée, expression qui passe par une intégration dudit transgène dans la cellule hôte, et donc par l'utilisation de rétrovirus recombinants. Il fallait donc associer différents moyens et proposer un protocole d'utilisation de ces moyens qui permette au scientifique, en recherche comme en clinique, de générer et de caractériser rapidement le système producteur le mieux adapté au transgène d'une The present invention results from the need of scientists to rapidly optimize the production of retroviral particles carrying a transgene, starting from the fact that the stable expression of a transgene in the target cells was preferably sought, expression which requires integration. of said transgene in the host cell, and therefore by the use of recombinant retroviruses. It was therefore necessary to combine different means and propose a protocol for the use of these means which would allow scientists, in research as well as in clinics, to quickly generate and characterize the producer system best suited to the transgene of a

part, et aux cellules cibles d'autre part. on the one hand, and target cells on the other.

Dans l'ensemble du texte qui suit, les termes utilisés auront les définitions suivantes: TRANSGENE signifie toute séquence hétérologue codant pour une protéine de structure ou une protéine enzymatique ou combinaison de gènes dont l'expression est recherchée dans une cellule Throughout the text which follows, the terms used will have the following definitions: TRANSGENE means any heterologous sequence encoding a structural protein or an enzymatic protein or combination of genes the expression of which is sought in a cell

cible pour quelque raison que ce soit. target for whatever reason.

VIRUS ou PARTICULE VIRALE DEFECTIVE est un virus ou VIRUS or DEFECTIVE VIRAL PARTICLE is a virus or

une particule virale incapable de réplication autonome. a viral particle incapable of autonomous replication.

TRANSFERT d'une séquence d'acide nucléique porteur de gènes recombinants dans une cellule désigne collectivement la transfection de ladite cellule pr un vecteur ou plasmide contenant des gènes recombinants ou l'infection de ladite cellule par un virus dont le génome TRANSFER of a nucleic acid sequence carrying recombinant genes into a cell collectively designates the transfection of said cell into a vector or plasmid containing recombinant genes or the infection of said cell by a virus whose genome

contient ces mêmes gènes recombinants. contains these same recombinant genes.

La présente invention porte sur un procédé de production de rétrovirus recombinants défectifs à haut titre par infection ou transfection in vivo de cellules cibles, par des virus ou des vecteurs viraux porteurs de séquences rétrovirales, caractérisé en ce que le ou les vecteurs viraux ou les virus sont d'origine adénovirale ou baculovirale. Elle porte également sur un procédé pour l'établissement d'une lignée cellulaire apte à produire des particules rétrovirales à haut titre et dans des conditions de sécurité satisfaisante, après infection ou transfection de ces cellules par un virus ou The present invention relates to a method of producing high titer defective recombinant retroviruses by infection or in vivo transfection of target cells, by viruses or viral vectors carrying retroviral sequences, characterized in that the viral vector (s) or viruses are of adenoviral or baculoviral origin. It also relates to a method for establishing a cell line capable of producing retroviral particles at high titre and under satisfactory safety conditions, after infection or transfection of these cells with a virus or

un plasmide porteur d'un vecteur rétroviral desdites cellules. a plasmid carrying a retroviral vector of said cells.

Le procédé de l'invention permet, soit d'obtenir une lignée exprimant le vecteur rétroviral transitoirement, ou de manière stable sous la forme d'un clone ou d'une population cellulaire et permettant une The method of the invention makes it possible either to obtain a line expressing the retroviral vector transiently, or in a stable manner in the form of a clone or of a cell population and allowing a

expression transitoire des particules rétrovirales. transient expression of retroviral particles.

L'invention porte également sur une lignée cellulaire The invention also relates to a cell line

hépatique et sur son utilisation dans le procédé de l'invention. hepatic and on its use in the method of the invention.

La présente invention porte également sur une trousse pour l'obtention et la production de particules rétrovirales porteuses d'un transgène et comprenant au moins: - un adénovirus porteur des fonctions rétrovirales gag-pol sous la forme d'une ou plusieurs ampoules permettant plusieurs manipulations distinctes à des concentrations variables; - un adénovirus porteur d'un gène env, présenté sous la même forme; le gène env peut être d'origine diverse. Il peut être écotrope, xénotrope ou amphotrope. Il peut provenir par exemple du RD44 (virus de chat), du GaLV (virus de Gibbon) ou du VSV-G (virus de la stomatite vésiculaire). - un plasmide portant le vecteur rétroviral, c'est-à-dire les séquences régulatrices contenant les LTR, la région d'encapsidation, avec des sites multiples de clonage pour insérer le transgène. Il peut contenir de plus, si nécessaire: 5. une origine de réplication de type SV40 et un marqueur de sélection de type néomycine, blasticydine ou autre; un plasmide contrôle portant le vecteur rétroviral contenant un gène rapporteur comme le gène LacZ pour vérifier la qualité de la manipulation. Le rationnel des procédés et des kits de l'invention est le suivant: Les systèmes de production classiques passent par la sélection de lignées cellulaires exprimant de façon stable le vecteur et les fonctions d'encapsidation. Cette méthode peut durer plusieurs mois, et nécessite l'analyse de nombreux clones pour isoler les producteurs efficaces. Si elle permet l'obtention de sumrnageants de culture infectieux à un titre raisonnable (106 à 107 particules infectieuses par ml), elle restreint néanmoins l'établissement de producteurs aux lignées cellulaires transformées. Elle est donc peu adaptée aux utilisations ponctuelles ou sur The present invention also relates to a kit for obtaining and producing retroviral particles carrying a transgene and comprising at least: an adenovirus carrying gag-pol retroviral functions in the form of one or more ampoules allowing several manipulations distinct at varying concentrations; - an adenovirus carrying an env gene, presented in the same form; the env gene can be of various origins. It can be ecotropic, xenotropic or amphotropic. It can come, for example, from RD44 (cat virus), GaLV (Gibbon virus) or VSV-G (vesicular stomatitis virus). a plasmid carrying the retroviral vector, that is to say the regulatory sequences containing the LTRs, the packaging region, with multiple cloning sites for inserting the transgene. It may additionally contain, if necessary: 5. an SV40 type origin of replication and a neomycin, blasticydin or other type selection marker; a control plasmid carrying the retroviral vector containing a reporter gene such as the LacZ gene to check the quality of the manipulation. The rationale for the methods and kits of the invention is as follows: Conventional production systems involve the selection of cell lines which stably express the vector and the packaging functions. This method can take several months, and requires the analysis of many clones to isolate efficient producers. If it allows the obtaining of infectious culture supernatants at a reasonable titer (106 to 107 infectious particles per ml), it nevertheless restricts the establishment of producers to transformed cell lines. It is therefore not very suitable for occasional use or on

des cellules primaires que ce soit en recherche ou en clinique. primary cells whether in research or in the clinic.

Un autre système de production utilisé est la production en transitoire, qui est plus souple et plus rapide, en permettant dès le lendemain de la transfection des cellules cibles avec les plasmides portant Another production system used is transient production, which is more flexible and faster, allowing target cells the day after transfection with the plasmids carrying

les fonctions d'encapsidation et le vecteur, de recueillir un surnageant. packaging functions and the vector, to collect a supernatant.

Mais cette approche permet d'atteindre des titres seulement de l'ordre de But this approach makes it possible to achieve titles only of

103 à 104 particules infectieuses par ml, exceptionnellement 105. 103 to 104 infectious particles per ml, exceptionally 105.

Les inventeurs ont donc cherché à fournir un système permettant, d'une part de sélectionner rapidement une lignée cellulaire bonne productrice et, d'autre part, de produire des particules rétrovirales défectives à haut titre porteuses du transgène et sans émergence de virus compétent pour la réplication, et ce: - soit en travaillant à partir d'une population cellulaire ou un clone exprimant le vecteur rétroviral en transitoire; - soit une population cellulaire ou un clone l'exprimant de The inventors therefore sought to provide a system making it possible, on the one hand, to rapidly select a good producer cell line and, on the other hand, to produce defective retroviral particles with a high titre carrying the transgene and without the emergence of a virus competent for the production. replication, and this: - either by working from a cell population or a clone expressing the retroviral vector in transit; - either a cell population or a clone expressing it from

façon stable.stable way.

Le vecteur rétroviral, porteur du transgène, des régions régulatrices du rétrovirus et des fonctions d'encapsidation, peut être introduit, soit par transfection des cellules par un plasmide porteur du vecteur, soit par infection par des particules rétrovirales dont le génome est The retroviral vector, carrying the transgene, the regulatory regions of the retrovirus and the packaging functions, can be introduced either by transfection of the cells with a plasmid carrying the vector, or by infection with retroviral particles whose genome is

porteur des séquences équivalentes. carrying equivalent sequences.

L'expression transitoire est obtenue quasiment immédiatement après transfection du plasmide porteur du vecteur alors que l'expression stable est obtenue après deux semaines au moins de culture en milieu sélectif après transfection du plasmide porteur du vecteur Transient expression is obtained almost immediately after transfection of the plasmid carrying the vector while stable expression is obtained after at least two weeks of culture in selective medium after transfection of the plasmid carrying the vector.

ou après infection simple.or after simple infection.

La production de particules rétrovirales par ces cellules ainsi transfectées ou infectées est réalisée en apportant les fonctions The production of retroviral particles by these cells thus transfected or infected is carried out by providing the functions

d'encapsidation rétrovirale au moyen d'un virus recombinant non rétroviral. retroviral packaging using a non-retroviral recombinant virus.

A titre d'exemple de virus particulièrement appropriés à la mise en oeuvre By way of example of viruses particularly suitable for the implementation

du procédé de l'invention, on peut citer les baculovirus ou les adénovirus. of the method of the invention, there may be mentioned baculoviruses or adenoviruses.

L'infection, bien plus performante que la transfection, permet de toucher I'ensemble des cellules avec un nombre élevé de copies introduites. Ce demrnier point a été jusqu'à présent suspecté être un facteur limitant dans Infection, which is much more efficient than transfection, makes it possible to affect all the cells with a high number of introduced copies. This last point has so far been suspected to be a limiting factor in

les systèmes de production transitoire. transitional production systems.

Pour des questions de sécurité, un mode de réalisation préféré est de placer les fonctions d'encapsidation rétrovirale gal-pol et env sur deux virus distincts. De la même façon, pour augmenter encore la sécurité du système, il est préférable de limiter les risques de recombinaison entre la fin de pot et le début de env (régions chevauchantes chez MoloneyMurine Leukemia virus (MoMLV) avec émergence de virus "helper", les unités gag-pol, d'une part, et env, d'autre part proviennent de virus différents. A titre d'exemple, gag-pol peut être issu de MoMLV alors que env peut provenir du virus de Gibbon (GaLV) ou du virus de chat (RD 114). Malgré une faible homologie de séquence, les virus chimériques associant gag-pol, d'une part, et env, d'autre part, For security reasons, a preferred embodiment is to place the retroviral packaging functions gal-pol and env on two separate viruses. Likewise, to further increase the security of the system, it is preferable to limit the risks of recombination between the end of the pot and the start of env (overlapping regions in MoloneyMurine Leukemia virus (MoMLV) with emergence of the "helper" virus, the gag-pol units, on the one hand, and env, on the other hand, originate from different viruses.For example, gag-pol may be derived from MoMLV while env may originate from Gibbon virus (GaLV) or cat virus (RD 114). Despite poor sequence homology, chimeric viruses combining gag-pol, on the one hand, and env, on the other hand,

d'origines différentes restent parfaitement infectieux. of different origins remain perfectly infectious.

Description détaillée de l'invention: Detailed description of the invention:

io L'invention porte sur un procédé de production de rétrovirus recombinants porteurs de gènes d'intérêt à un titre égal ou supérieur à 106 Ul/ml, comprenant: (a) sélection d'une lignée cellulaire eucaryote susceptible à l'infection virale, (b) transfection par un vecteur porteur d'un gène d'intérêt sous le contrôle de séquences régulatrices rétrovirales et porteur de la séquence d'encapsidation, et dépourvue des gènes de structure du rétrovirus, ou infection par une particule rétrovirale dont le génome est porteur des mêmes séquences que ledit vecteur, (c) infection de ladite lignée par au moins un virus recombinant dépourvu de séquence psi et apportant les séquences rétrovirales gag-pol et env, gag-pol et env étant de préférence issues de rétrovirus différents, ou transfection par au moins un vecteur adénoviral porteur des mêmes séquences, (d) la culture de ces cellules dans un milieu approprié à la The invention relates to a method for producing recombinant retroviruses carrying genes of interest at a titer of 106 IU / ml or greater, comprising: (a) selecting a eukaryotic cell line susceptible to viral infection, (b) transfection with a vector carrying a gene of interest under the control of retroviral regulatory sequences and carrying the packaging sequence, and devoid of the structural genes of the retrovirus, or infection by a retroviral particle whose genome is carrying the same sequences as said vector, (c) infection of said line by at least one recombinant virus lacking a psi sequence and providing the retroviral sequences gag-pol and env, gag-pol and env preferably originating from different retroviruses, or transfection with at least one adenoviral vector carrying the same sequences, (d) culturing these cells in a medium suitable for the

récolte des particules rétrovirales porteuses du transgène. harvesting of the retroviral particles carrying the transgene.

Dans ce procédé, le ou les vecteurs viraux ou les virus sont In this method, the viral vector (s) or viruses are

de préférence d'origine adénovirale ou baculovirale. preferably of adenoviral or baculoviral origin.

Le principe de base de l'invention est la constitution de vecteurs adénoviraux porteurs des séquences codant pour les fonctions rétrovirales. Dans l'ensemble du texte, il est bien entendu que, à chaque fois qu'il sera question d'adénovirus, de vecteur adénoviral, il pourra être entendu de la même façon les équivalents fonctionnels de ces virus ou de ces vecteurs. Plus particulièrement, le baculovirus ou les vecteurs The basic principle of the invention is the constitution of adenoviral vectors carrying sequences encoding the retroviral functions. Throughout the text, it is understood that, whenever adenovirus or adenoviral vector is referred to, the functional equivalents of these viruses or of these vectors may be understood in the same way. More particularly, the baculovirus or the vectors

baculoviraux pourront être utilisés de la même façon que les adénovirus. baculovirals can be used in the same way as adenoviruses.

L'ensemble des fonctions rétrovirales, associé à un transgène, est transféré dans la cellule cible, simultanément ou séquentiellement, en utilisant les systèmes de transfection ou d'infection All the retroviral functions, associated with a transgene, are transferred into the target cell, simultaneously or sequentially, using the transfection or infection systems.

des vecteurs adénoviraux ou des adénovirus. adenoviral vectors or adenoviruses.

Les fonctions virales d'encapsidation gag-pol et env. peuvent The viral functions of gag-pol and env. can

être portées par un seul vecteur adénoviral. be carried by a single adenoviral vector.

Cela présente néanmoins l'inconvénient de diminuer la flexibilité du kit. En effet, si env est porté par un vecteur séparé, il est possible de faire varier la nature du rétrovirus produit par les cellules en faisant varier l'origine du gène env introduit, ce qui n'est pas le cas quand This nevertheless has the drawback of reducing the flexibility of the kit. Indeed, if env is carried by a separate vector, it is possible to vary the nature of the retrovirus produced by the cells by varying the origin of the env gene introduced, which is not the case when

les différentes fonctions sont portées par le même vecteur. the different functions are carried by the same vector.

Aussi, un mode de réalisation préféré est-il de faire porter les éléments rétroviraux par trois vecteurs viraux distincts: - le premier porteur des séquences régulatrices incluant le LTR, les séquences d'encapsidation TI ou un équivalent fonctionnel, et le transgène introduit de manière appropriée au niveau des sites de restriction prévus à cet effet; - un vecteur viral porteur du gène gag-pol et un vecteur viral Also, a preferred embodiment is to cause the retroviral elements to be carried by three distinct viral vectors: the first carrier of the regulatory sequences including the LTR, the TI packaging sequences or a functional equivalent, and the transgene introduced in a manner appropriate to the level of restriction sites provided for this purpose; - a viral vector carrying the gag-pol gene and a viral vector

porteur du gène env.carrier of the env gene.

Par vecteur viral, on entend de préférence un vecteur adénoviral ou un vecteur baculoviral, dont les structures et les performances sont bien documentées. Néanmoins, tout autre virus non By viral vector is preferably meant an adenoviral vector or a baculoviral vector, the structures and performance of which are well documented. However, any other virus not

intégratif doit être considéré comme un équivalent fonctionnel d'un tel virus. integrative should be considered a functional equivalent of such a virus.

L'homme du métier comprendra que tout virus capable d'infecter une cellule cible avec une multiplicité d'infections faible et capable d'exprimer les fonctions portées par son génome dans ladite cellule cible doit être considéré comme équivalent fonctionnel de l'adénovirus. Aussi, dans le texte ci-après, on parlera de préférence de vecteur adénoviral, ou d'adénovirus. Dans l'ensemble du texte, et afin d'alléger ce dernier, il est entendu que quand il sera question de vecteur adénoviral, il faudra comprendre tant le vecteur lui-même administrable par transfection à la cellule cible que le virus contenant un génome porteur des mêmes Those skilled in the art will understand that any virus capable of infecting a target cell with a low multiplicity of infections and capable of expressing the functions carried by its genome in said target cell must be considered as a functional equivalent of the adenovirus. Also, in the text below, we will preferably speak of adenoviral vector, or adenovirus. Throughout the text, and in order to lighten the latter, it is understood that when it comes to adenoviral vector, it will be necessary to understand both the vector itself which can be administered by transfection to the target cell and the virus containing a carrier genome. the same

séquences administrable par infection de la cellule cible. sequences administrable by infection of the target cell.

De la même façon, par vecteur rétroviral susceptible de transfecter la cellule cible, il faudra entendre tant le vecteur administrable par transfection que la particule virale dont le génome porte les mêmes In the same way, by retroviral vector capable of transfecting the target cell, it will be necessary to understand both the vector which can be administered by transfection and the viral particle whose genome carries the same.

séquences que le vecteur en question. sequences as the vector in question.

Dans le procédé ci-dessus, les étapes b) et c) peuvent être In the above method, steps b) and c) can be

simultanées ou successives.simultaneous or successive.

En effet, si l'on cherche à avoir un système de production de particules rétrovirales transitoire, les trois vecteurs' peuvent être transférés simultanément (ou les trois virus infecter les cellules simultanément). Si le titre obtenu est plus faible que celui obtenu après une expression stable, Indeed, if one seeks to have a transient retroviral particle production system, the three vectors can be transferred simultaneously (or the three viruses infect cells simultaneously). If the titre obtained is lower than that obtained after stable expression,

l'avantage est que la réponse sur le choix de la cellule cible est quasi- the advantage is that the answer on the choice of the target cell is almost

instantanée. On peut également mettre au point un système d'expression stable par, dans un premier temps, transfection ou infection par le vecteur porteur du vecteur rétroviral (étape (b)), puis, après une quinzaine de jours, après intégration stable dans le génome dudit vecteur, la cellule cible peut être infectée ou transfectée par les adénovirus ou les vecteurs adénoviraux Il porteurs des gènes de structure du rétrovirus (étape (c)). Les étapes (b) et instant. It is also possible to develop a stable expression system by, firstly, transfection or infection with the vector carrying the retroviral vector (step (b)), then, after about two weeks, after stable integration into the genome. of said vector, the target cell can be infected or transfected with adenoviruses or adenoviral vectors II carrying the structural genes of the retrovirus (step (c)). Steps (b) and

(c) du procédé sont alors successives. (c) of the process are then successive.

Dans le procédé de l'invention, les gènes gag-pol et env sont sous le contrôle de promoteurs susceptibles d'être activés dans la cellule cible. On pourra choisir par exemple le promoteur du CMV pour gag-pol, le promoteur EFla pour env. L'homme du métier pourra sélectionner tout promoteur connu pour son efficacité dans la transcription des séquences In the method of the invention, the gag-pol and env genes are under the control of promoters capable of being activated in the target cell. It is possible, for example, to choose the CMV promoter for gag-pol, the EFla promoter for env. Those skilled in the art will be able to select any promoter known for its efficiency in the transcription of the sequences.

qu'il contrôle.that he controls.

Le transgéne quant a lui sera sous le contrôle de séquences o0 régulatrices rétrovirales contenant les LTR, ou sous le contrôle d'un As for the transgenic, it will be under the control of o0 retroviral regulatory sequences containing the LTRs, or under the control of a

promoteur interne de type P.GK'(Phospho glycerate kinase). internal promoter of the P.GK 'type (phospho glycerate kinase).

L'invention porte également sur un procédé pour établir une lignée cellulaire eucaryote apte à produire des particules rétrovirales à un titre supérieur à 106 UI par ml et comprenant les étapes de: (a) sélection d'une lignée cellulaire eucaryote susceptible à l'infection virale; (b) transfection par un vecteur rétroviral porteur d'un transgène sous le contrôle de séquences régulatrices rétrovirales et porteur de la séquence d'encapsidation, et dépourvue des gènes de structure du rétrovirus, ou infection par une particule rétrovirale dont le génome est porteur des séquences équivalentes; (c) infection de ladite lignée par au moins un virus recombinant dépourvu de séquence d'encapsidation et porteur de séquences rétrovirales gag-pol et env, gag- pol et env étant de préférence issues de rétrovirus différents, ou transfection par au moins un vecteur adénoviral porteur des mêmes séquences; (d) criblage des lignées productrices au titre recherché, sur The invention also relates to a method for establishing a eukaryotic cell line capable of producing retroviral particles at a titer greater than 106 IU per ml and comprising the steps of: (a) selecting a eukaryotic cell line susceptible to infection. viral; (b) transfection with a retroviral vector carrying a transgene under the control of retroviral regulatory sequences and carrying the packaging sequence, and devoid of the structural genes of the retrovirus, or infection by a retroviral particle whose genome carries the equivalent sequences; (c) infection of said line by at least one recombinant virus devoid of packaging sequence and carrying retroviral sequences gag-pol and env, gag-pol and env preferably originating from different retroviruses, or transfection by at least one vector adenoviral carrying the same sequences; (d) screening of the lines producing the desired title, on

la base du titre en rétrovirus obtenu dans le surnageant cellulaire. the basis of the retrovirus titer obtained in the cell supernatant.

Dans ce cas, le transgène présent dans le vecteur rétroviral sera de préférence un gène rapporteur permettant de sélectionner et de mesurer rapidement les lignées cellulaires produisant les rétrovirus au titre souhaité. Comme pour le procédé de production décrit ci-dessus, les étapes b) et c) peuvent être simultanées ou successives selon que le procédé utilise une expression transitoire ou une expression stable du vecteur rétroviral dans les cellules cibles. Pour le criblage des lignées In this case, the transgene present in the retroviral vector will preferably be a reporter gene making it possible to rapidly select and measure the cell lines producing the retroviruses at the desired titer. As for the production method described above, steps b) and c) can be simultaneous or successive depending on whether the method uses a transient expression or a stable expression of the retroviral vector in the target cells. For the screening of lines

productrices, une expression transitoire sera recherchée. producers, a transient expression will be sought.

o0 De la même façon, afin d'éviter toute recombinaison homologue, les séquences portées par les adénovirus gag-pol, d'une part, et env, d'autre part, sont portées par deux adénovirus distincts et sont de préférence d'origine rétrovirale différente. Pour mettre en oeuvre le procédé de l'invention, l'étape préalable était la constitution et caractérisation fonctionnelle des adénovirus porteurs de gag-pol, d'une part, et des adénovirus porteurs de env, d'autre part. La méthodologie In the same way, in order to avoid any homologous recombination, the sequences carried by the gag-pol adenoviruses, on the one hand, and env, on the other hand, are carried by two distinct adenoviruses and are preferably of origin different retroviral. To implement the method of the invention, the preliminary step was the constitution and functional characterization of the adenoviruses carrying gag-pol, on the one hand, and of the adenoviruses carrying env, on the other hand. Methodology

d'obtention de ces virus ou de ces vecteurs adénoviraux est exposée ci- for obtaining these viruses or these adenoviral vectors is set out below.

après dans les exemples. Des adénovirus recombinants particulièrement avantageux selon l'invention sont ceux dans lesquels gag-pol est issu du MoMTLV et env est issu du rétrovirus GaLV (Gibborf Ape Lekemia virus). Le gène env du virus de chat RDI 14 est également un bon candidat pour obtenir une reconstitution virale à haut titre et sans génération de virus "helper". Un adénovirus ou vecteur adénoviral porteur de séquences after in the examples. Particularly advantageous recombinant adenoviruses according to the invention are those in which gag-pol is derived from MoMTLV and env is derived from the GaLV retrovirus (Gibborf Ape Lekemia virus). The env gene of the RDI 14 cat virus is also a good candidate for obtaining high titer viral reconstitution without generation of "helper" viruses. An adenovirus or adenoviral vector carrying sequences

rétrovirales sont appelés adéno-rétrovirus ou vecteur adénorétroviral. retrovirals are called adeno-retroviruses or adenoretroviral vectors.

Les adéno-rétrovirus recombinants utilisables dans les procédés de l'invention seront toujours sélectionnés par: - la titration des surnageants rétroviraux obtenus après infection des cellules productrices, et son optimisation en fonction de la multiplicité d'infections adénovirales; - I'absence de rétrovirus "helper" dans le surnageant de production. Toute combinaison gag-pol et env. sur un ou deux vecteurs adénoviraux, quelle que soit l'origine des gènes rétroviraux, qu'il y ait o0 présence ou non d'une origine de réplication du SV 40 ou d'un site de polyadénylation ou de tout autre site utilisé de façon classique pour améliorer les performances des vecteurs ou des virus recombinants seront toujours criblés au vu des deux paramètres ci-dessus: titre et/ou absence The recombinant adeno-retroviruses which can be used in the methods of the invention will always be selected by: the titration of the retroviral supernatants obtained after infection of the producer cells, and its optimization as a function of the multiplicity of adenoviral infections; - the absence of "helper" retrovirus in the production supernatant. Any combination of gag-pol and approx. on one or two adenoviral vectors, regardless of the origin of the retroviral genes, whether or not there is an SV 40 origin of replication or a polyadenylation site or any other site used in such a way standard to improve the performance of vectors or recombinant viruses will always be screened in view of the two parameters above: titre and / or absence

de rétrovirus helper.helper retrovirus.

Dans les procédés de l'invention, toutes les cellules susceptibles à l'infection virale ou à la transfection peuvent être des bons In the methods of the invention, all cells susceptible to viral infection or transfection can be suitable.

candidats pour utiliser le procédé de production ou de criblage. candidates to use the production or screening process.

Néanmoins, les capacités de production des cellules présentent une grande variabilité sans que l'origine de cette variabilité puisse être déterminée. Les cellules HeLA (ATCC n CCL-2) et surtout les cellules hépatiques, dont un exemple est donné par les lignées d'hépato-carcinome HuH7 (NAKABAYASHI, H. et al., 1982, Cancer Research 42, 3858-3863) apparaissent être des producteurs particulièrement efficaces; on peut également citer la lignée Ht 1080 CRL-8805; en revanche, un très faible transfert de gènes a été détecté en utilisant les cellules A549 (ATCC Nevertheless, the production capacities of cells exhibit a great variability without the origin of this variability being able to be determined. HeLA cells (ATCC n CCL-2) and especially hepatic cells, an example of which is given by the hepato-carcinoma lines HuH7 (NAKABAYASHI, H. et al., 1982, Cancer Research 42, 3858-3863) appear be particularly efficient producers; mention may also be made of the line Ht 1080 CRL-8805; in contrast, very poor gene transfer was detected using A549 cells (ATCC

n CCL-185.1).n CCL-185.1).

L'invention porte également sur les lignées cellulaires hépatiques transfectées ou transformées par un vecteur rétroviral porteur des fonctions d'encapsidation et dépourvu des gènes de structures rétroviraux. Ledit vecteur peut être porteur d'un transgène dont l'expression est recherchée dans une cellule cible, le transgène étant soit un gène d'intérêt pour la thérapie génique, soit un gène rapporteur pour des études, The invention also relates to hepatic cell lines transfected or transformed with a retroviral vector carrying packaging functions and lacking the retroviral structural genes. Said vector may carry a transgene the expression of which is sought in a target cell, the transgene being either a gene of interest for gene therapy, or a reporter gene for studies,

ou optimisation d'un procédé.or optimization of a process.

Dans le choix des cellules cibles, certaines lignées hépatiques apparaissent comme particulièrement performantes. Il s'agit des lignées HuH7 et Ht 1080 citées plus haut ou les lignées Hep 3B ou In the choice of target cells, certain hepatic lines appear to be particularly efficient. These are the HuH7 and Ht 1080 lines mentioned above or the Hep 3B lines or

HEP G2, et dans lesquelles les vecteurs recombinants ont été transférés. HEP G2, and into which the recombinant vectors have been transferred.

De manière plus générale, les lignées embryonnaires sont de More generally, the embryonic lines are of

bons candidats dans les procédés et kits selon l'invention. good candidates in the methods and kits according to the invention.

L'utilisation de la lignée HuH7 dans les deux procédés décrits The use of the HuH7 line in the two methods described

ci-dessus fait également partie de l'invention. above is also part of the invention.

L'invention porte également sur une trousse pour la production de particules rétrovirales porteuses d'un transgène et s5 comprenant au moins: (a) un récipient contenant un adénovirus ou un plasmide adénoviral porteur d'un gène gag-pol; (b) un ou plusieurs récipients contenant un adénovirus ou un plasmide adénoviral porteur d'un gène env; - (c) un ou plusieurs récipients contenant un plasmide porteur d'un vecteur rétroviral, ou contenant un rétrovirus défectif ou un virus non rétroviral contenant au moins la séquence d'encapsidation, les séquences régulatrices, et des sites multiples de restriction permettant l'insertion d'un transgène; (d) le cas échéant, un récipient contenant un plasmide contrôle porteur d'un vecteur rétroviral, contenant au moins un gène rapporteur. Dans la trousse selon l'invention les virus o les plasmides en a), b), c) ou d) ci-dessus sont de préférence sous forme congelée mais The invention also relates to a kit for the production of retroviral particles carrying a transgene and s5 comprising at least: (a) a container containing an adenovirus or an adenoviral plasmid carrying a gag-pol gene; (b) one or more containers containing an adenovirus or an adenoviral plasmid carrying an env gene; - (c) one or more receptacles containing a plasmid carrying a retroviral vector, or containing a defective retrovirus or a non-retroviral virus containing at least the packaging sequence, the regulatory sequences, and multiple restriction sites allowing the insertion of a transgene; (d) where appropriate, a container containing a control plasmid carrying a retroviral vector, containing at least one reporter gene. In the kit according to the invention, the viruses o the plasmids in a), b), c) or d) above are preferably in frozen form but

peuvent également être sous forme lyophilisée. can also be in lyophilized form.

La trousse étant destinée à mettre en oeuvre le procédé décrit ci- dessus, les différentes possibilités de construction décrites plus haut sont bien sûr les modes préférés des plasmides ou des virus présents dans la trousse de l'invention, à savoir que gag-pol, d'une part, et env, d'autre part, sont issus de rétrovirus différents. Par exemple, gag-pol est issu de MoMLV et sous le contrôle du promoteur cytomégalovirus alors que o0 env est issu de GaLV et est sous le contrôle du promoteur de EF1oc. Les séquences régulatrices et les séquences d'encapsidation rétrovirales du plasmide ou dans le virus décrit en c) sont de préférence issues de The kit being intended to implement the method described above, the various construction possibilities described above are of course the preferred modes of the plasmids or viruses present in the kit of the invention, namely that gag-pol, on the one hand, and env, on the other hand, are derived from different retroviruses. For example, gag-pol is from MoMLV and under the control of the cytomegalovirus promoter while o0 env is from GaLV and is under the control of the EF1oc promoter. The regulatory sequences and the retroviral packaging sequences of the plasmid or in the virus described in c) are preferably derived from

rétrovirus murins, et de lentiviruses caprins et primates. murine retroviruses, and goat and primate lentiviruses.

Enfin, le plasmide en c) porteur du vecteur rétroviral contient Finally, the plasmid in c) carrying the retroviral vector contains

de préférence un marqueur de sélection. preferably a selection marker.

Une trousse similaire pour l'établissement d'une lignée A similar kit for establishing a lineage

productrice de particules rétrovirales fait également partie de l'invention. producer of retroviral particles is also part of the invention.

Elle comprend au moins: (a) un récipient contenant un adénovirus ou un plasmide adénoviral porteur d'un gène gag-pol; (b) un ou plusieurs récipients contenant un adénovirus ou un plasmide adénoviral porteur d'un gène env; (c) un ou plusieurs récipients contenant un plasmide porteur d'un vecteur rétroviral, ou contenant un rétrovirus défectif ou un virus non rétroviral contenant au moins la séquence d'encapsidation, les It comprises at least: (a) a container containing an adenovirus or an adenoviral plasmid carrying a gag-pol gene; (b) one or more containers containing an adenovirus or an adenoviral plasmid carrying an env gene; (c) one or more containers containing a plasmid carrying a retroviral vector, or containing a defective retrovirus or a non-retroviral virus containing at least the packaging sequence, the

séquences régulatrices, et un gène rapporteur. regulatory sequences, and a reporter gene.

La souplesse d'utilisation des kits selon l'invention résulte entre autres du choix des cellules productrices. Toutes les cellules susceptibles à la transfection par les plasmides ou l'infection par les virus et plus particulièrement par les adénovirus et par les baculovirus peuvent The flexibility of use of the kits according to the invention results, among other things, from the choice of the producer cells. All cells susceptible to transfection by plasmids or infection by viruses and more particularly by adenoviruses and by baculoviruses can

être utilisées.be used.

Plusieurs versions du kit peuvent être disponibles selon le choix de l'enveloppe rétrovirale choisie par l'utilisateur: il pourra s'agir d'un kit amphotrope lorsque l'adénovirus env correspondra à une enveloppe de l'amphotrope. Il peut également s'agir d'un kit GaLV lorsque l'adénovirusenv codera pour l'enveloppe du rétrovirus de Gibbon. Il en est de même pour l'enveloppe RD 114, ECO, Several versions of the kit may be available depending on the choice of the retroviral envelope chosen by the user: it may be an amphotropic kit when the adenovirus env corresponds to an envelope of the amphotrope. It can also be a GaLV kit when the adenovirusenv will code for the envelope of the Gibbon retrovirus. It is the same for the envelope RD 114, ECO,

XENO ainsi que l'adénovirus codant pour l'enveloppe VSV-G. XENO as well as the adenovirus encoding the VSV-G envelope.

o0 Plusieurs conditionnements peuvent être proposés en fonction de la quantité des surnageants souhaitée: - un kit mini comprenant 1 à 5 109 pfu pour chaque adénovirus et permettant l'obtention de 50 ml de surnageants infectieux; - un kit "maxi" contenant 1 à 5 101 pfu pour chaque adénovirus et permettant l'obtention de 500 ml de surnageants infectieux; - un kit "méga" contenant 5 à 10 1011 pfu pour chaque o0 Several packages can be offered depending on the quantity of supernatants desired: a mini kit comprising 1 to 5 109 pfu for each adenovirus and making it possible to obtain 50 ml of infectious supernatants; - a "maxi" kit containing 1 to 511 pfu for each adenovirus and making it possible to obtain 500 ml of infectious supernatants; - a "mega" kit containing 5 to 10 1011 pfu for each

adénovirus et permettant l'obtention de 2 I de surnageants infectieux. adenovirus and making it possible to obtain 2 I of infectious supernatants.

L'utilisation des kits selon l'invention peut se faire de plusieurs manières: 1) Il peut permettre de créer une population de cellules exprimant en stable le vecteur rétroviral porteur du transgène. Le plasmide est alors transfecté de préférence avec un marqueur de sélection de type néomycine ou blasticydine. Au bout de deux semaines de culture en présence de la drogue, la population est constituée. Si le transgène code pour une protéine visualisable en cytométrie de flux, elle peut être triée The kits according to the invention can be used in several ways: 1) It can make it possible to create a population of cells expressing in a stable manner the retroviral vector carrying the transgene. The plasmid is then preferably transfected with a selection marker of the neomycin or blasticydin type. At the end of two weeks of culture in the presence of the drug, the population is constituted. If the transgene encodes a protein visualizable by flow cytometry, it can be sorted

plus avant.further.

Après quoi, la lignée exprimant de façon stable le vecteur rétroviral sera infectée par les adénovirus d'encapsidation gag-pol, d'une Thereafter, the line stably expressing the retroviral vector will be infected with the gag-pol packaging adenoviruses, of a

part, et env, d'autre part, contenus dans les récipients en a) et b) cidessus. part, and env, on the other hand, contained in the receptacles in a) and b) above.

Le lendemain, le milieu de culture est changé. Il est recueilli, filtré et prêt à The next day, the culture medium is changed. It is collected, filtered and ready to

être utilisé le jour d'après et tous les jours pendant quatre jours. be used the next day and every day for four days.

2) Le vecteur rétroviral est transfecté dans les cellules 2) The retroviral vector is transfected into the cells

choisies au moment de la co-infection avec les adénovirus d'encapsidation. chosen at the time of co-infection with the packaging adenoviruses.

Le milieu de culture est changé le lendemain et le surnageant est recueilli 24 heures après. Les cellules cibles qui présentent alors une expression transitoire permettent néanmoins très rapidement de connaître les The culture medium is changed the next day and the supernatant is collected 24 hours later. The target cells which then present a transient expression nevertheless make it possible very quickly to know the

capacités de production de ces cellules. production capacities of these cells.

Les procédés et les kits de l'invention sont avantageusement utilisés dans les cas suivants: (a) production de vecteurs en temps limité et à faible coût: la flexibilité du kit et la rapidité d'obtention des résultats en fait un outil de choix pour les scientifiques cherchant à produire des rétrovirus recombinants; (b) application au transfert de gènes ex vivo, par exemple dans des cellules hématopoïétiques. Les cellules souches hématopoïétiques du sang périphérique sont considérées comme des cibles importantes pour les approches de thérapie génique liées au traitement des désordres hématologiques, incluant les maladies héréditaires. En particulier, cette approche est largement utilisée avec l'objectif de traiter par thérapie génique les tumeurs ou les cancers, après la mobilisation du système avec le GCSF. L'application du kit selon l'invention au transfert de gènes dans les cellules souches hématopoïétiques de type CD34+ peut permettre de combiner les avantages de deux systèmes de co-culture: - celui des cellules souches CD34+ sur un tapis de cellules stromales recréant un micro-environnement médulaire producteur de cytokines (Nolta, Chi.A. et ai, Blood 86:101-110, 1995); co-culture des cellules souches hématopoïétiques avec des cellules productrices de rétrovirus réalisée selon le procédé de l'invention et favorisant la transduction par contact direct cellule- cellule (Germeraad The methods and kits of the invention are advantageously used in the following cases: (a) production of vectors in limited time and at low cost: the flexibility of the kit and the speed in obtaining the results make it a tool of choice for scientists seeking to produce recombinant retroviruses; (b) application to the transfer of genes ex vivo, for example in hematopoietic cells. Peripheral blood hematopoietic stem cells are considered important targets for gene therapy approaches related to the treatment of hematological disorders, including hereditary diseases. In particular, this approach is widely used with the objective of treating tumors or cancers by gene therapy, after mobilization of the system with the GCSF. The application of the kit according to the invention to the transfer of genes into hematopoietic stem cells of the CD34 + type can make it possible to combine the advantages of two co-culture systems: that of CD34 + stem cells on a layer of stromal cells recreating a micro -medular environment producing cytokines (Nolta, Chi.A. et al., Blood 86: 101-110, 1995); co-culture of hematopoietic stem cells with retrovirus-producing cells carried out according to the method of the invention and promoting transduction by direct cell-cell contact (Germeraad

W.T., et al, Blood, 84:780-788, 1994). W.T., et al, Blood, 84: 780-788, 1994).

En pratique, un stroma humain primaire sera cultivé in vitro en respectant sa capacité à soutenir l'hématopoïèse. Il sera ensuite infecté avec les adénovirus portant les fonctions d'encapsidation et le vecteur pour le rendre producteur de particules rétrovirales infectieuses. La transduction des CD34+ sera alors réalisée par co- culture des cellules souches sur le In practice, a primary human stroma will be cultured in vitro while respecting its capacity to support hematopoiesis. It will then be infected with the adenoviruses carrying the packaging functions and the vector to make it a producer of infectious retroviral particles. The transduction of CD34 + will then be carried out by coculture of the stem cells on the

tapis stromal génétiquement modifié, en l'absence de cytokines exogènes. genetically modified stromal mat, in the absence of exogenous cytokines.

Les matériels et méthodes, protocoles et exemples ci-après pourront, sans être limitatifs, montrer la performance des procédés de l'invention et des kits pour la sélection de cellules hautement productrices The materials and methods, protocols and examples below may, without being limiting, show the performance of the methods of the invention and of the kits for the selection of highly productive cells.

de rétrovirus recombinants.of recombinant retroviruses.

Légendes des figuresFigure legends

La Figure 1 représente le vecteur MoMLV gag-pol. Figure 1 shows the MoMLV gag-pol vector.

La Figure 2 représente le gène env de GALV sous le contrôle Figure 2 shows the GALV env gene under the control

du promoteur du facteur humain d'élongation EF1Iox. the promoter of the human elongation factor EF1Iox.

La Figure 3 représente le mCD2 inséré dans le vecteur Figure 3 shows the mCD2 inserted into the vector

rétroviral, sous le contrôle d'un LTR. retroviral, under the control of an LTR.

La Figure 4 représente un Westemrn Blot réalisé avec un anticorps antip30 sur des extraits cellulaires indiquant la synthèse de la FIG. 4 represents a Westemrn Blot carried out with an antip30 antibody on cell extracts indicating the synthesis of the

protéine gag-pol après infection par l'adénovirus gag-pol. gag-pol protein after infection with gag-pol adenovirus.

La Figure 5 représente le Western Blot obtenu avec un anticorps anti- gp70 exprimant la synthèse de la protéine d'enveloppe après Figure 5 shows the Western Blot obtained with an anti-gp70 antibody expressing the synthesis of the envelope protein after

infection par l'adénovirus env.infection with adenovirus env.

La Figure 6 représente les profits obtenus en cytométrie de flux des cellules exprimant le mCD2 en fonction de la multiplicité d'infection. Des surnageants de culture de cellules Te-FLY-GALV infectées par AdmCD2 ont été utilisés pour transduire mCD2 dans les cellules Te671. La Figure 7 représente les profits en cytométrie de flux obtenus après infection de différents types de lignées cellulaires, soit deux FIG. 6 represents the benefits obtained by flow cytometry of the cells expressing mCD2 as a function of the multiplicity of infection. Culture supernatants from Te-FLY-GALV cells infected with AdmCD2 were used to transduce mCD2 in Te671 cells. Figure 7 represents the flow cytometric profits obtained after infection of different types of cell lines, i.e. two

jours après l'infection (Figure 7A), soit 21 jours après l'infection (Figure 7B). days after infection (Figure 7A), or 21 days after infection (Figure 7B).

Matériels et Méthodes Constructions adénovirales portant les séquences rétrovirales Les fonctions d'encapsidation gag-pol et env, le marqueur io d'infection adénovirale et le vecteur rétroviral ont été clonés indépendamment les uns des autres, entre deux sites de restriction uniques. Les différentes cassettes peuvent donc être sorties facilement des plasmides intermédiaires pour être ensuite insérées dans les plasmides Materials and Methods Adenoviral Constructs Carrying the Retroviral Sequences The gag-pol and env packaging functions, the adenoviral infection marker and the retroviral vector were cloned independently of each other, between two unique restriction sites. The different cassettes can therefore be easily taken out of the intermediate plasmids to be then inserted into the plasmids.

navettes définitifs.final shuttles.

Une cassette d'expression pour la chaîne cc du récepteur à l'interleukine 2 sera associée à la cassette gag-pol (il s'agit de la chaîne courte du récepteur membranaire qui n'est pas capable de déclencher, seule, une réponse intracellulaire après fixation de l'IL2). Elle permettra de An expression cassette for the cc chain of the interleukin 2 receptor will be associated with the gag-pol cassette (this is the short chain of the membrane receptor which is not capable of triggering, on its own, an intracellular response. after fixation of IL2). It will allow

suivre l'infection adénovirale.monitor adenoviral infection.

Construction des cassettes d'expression gag-pol En fait, trois unités différentes ont été construites, pour pallier à d'éventuelles interférences entre les épissages différenciels adénovirus/rétrovirus. Toutes sont dépourvues du signal d'encapsidation Y. * Deux d'entre elles sont également dépourvues du site donneur d'épissage (sd), avec délétion ou non du site accepteur (sa- et sa+ ) situé à la fin de pol. Lignées cellulaires utilisées Les lignées cellulaires A549, HuH7, HeLa, HT1080, 293, ont déjà été décrites et font l'objet de dépôt à l'ATCC. Les cellules Te671 et leurs clones dérivés transcomplémentants ont été décrits dans COSSET, F.L., et al., 1995 J. Virol., 69, 7430-7436. Brièvement, TeLFBASAF exprime de manière stable les protéines d'enveloppe amphotrope et le vecteur rétroviral LacZ. TeLCeB6 exprime de manière stable tant les protéines gag-pol de Mo- MLV que le vecteur LacZ. TeLacZ exprime Construction of the gag-pol expression cassettes In fact, three different units were constructed, to overcome any interference between the differential adenovirus / retrovirus splicing. All of them lack the Y packaging signal. * Two of them also lack the splice donor site (sd), with or without deletion of the acceptor site (sa- and sa +) located at the end of pol. Cell lines used The cell lines A549, HuH7, HeLa, HT1080, 293, have already been described and are the subject of deposit at the ATCC. Te671 cells and their transcomplementing derivative clones have been described in COSSET, F.L., et al., 1995 J. Virol., 69, 7430-7436. Briefly, TeLFBASAF stably expresses the amphotropic envelope proteins and the retroviral vector LacZ. TeLCeB6 stably expresses both the Mo-MLV gag-pol proteins and the LacZ vector. TeLacZ expresses

uniquement le vecteur rétroviral LacZ. TeFLY-GALV exprime le gène gag- only the LacZ retroviral vector. TeFLY-GALV expresses the gag- gene

pol de Mo-MLV et la protéine d'enveloppe GALV. Finalement, les lignées cellulaires TG18 produisent des particules rétrovirales du pseudo-type GALV codant pour la protéine nucléaire LacZ. Toutes ces cellules sont mises en culture dans du milieu de DMEM, Sigma (milieu Eagle modifié par Dulbecco) supplémenté en 10 % de sérum de veau foetal. Les cellules Vero sont cultivées dans du milieu RPMI 1640 (Gibco BRL) supplémenté pol of Mo-MLV and the coat protein GALV. Finally, the TG18 cell lines produce retroviral particles of the GALV pseudo-type encoding the nuclear protein LacZ. All these cells are cultured in DMEM medium, Sigma (Eagle medium modified by Dulbecco) supplemented with 10% fetal calf serum. Vero cells are cultured in RPMI 1640 medium (Gibco BRL) supplemented

avec 5 % de sérum de veau foetal.with 5% fetal calf serum.

Les plasmides Le plasmide navette de base pAd-Swal est dérivé du vecteur adénoviral pAd-Bglll, et est constitué de l'ITR en 5' et des séquences d'encapsidation (1400 pb) suivies par la région 9-16 mu de l'adénovirus humain type 5. Le polylinker Notl-EcoRV extrait du vecteur pAd-CMVlink a été inséré à la place du site Bglll. Finalement, un site de restriction Swal a été introduit en amont de I'ITR en 5'. Le plasmide'peut ainsi être linéarisé The Plasmids The basic shuttle plasmid pAd-Swal is derived from the adenoviral vector pAd-Bglll, and consists of the 5 'ITR and packaging sequences (1400 bp) followed by the 9-16 mu region of the human adenovirus type 5. The NotI-EcoRV polylinker extracted from the vector pAd-CMVlink was inserted in place of the BglII site. Finally, a Swal restriction site was introduced upstream of the ITR in 5 '. The plasmid can thus be linearized

par Swal ou Nhel.by Swal or Nhel.

La cassette d'expression gag-pol a été dans un premier temps sous-clonée dans le plasmide Bluescript BS-KS+ Il (Stratagene) The gag-pol expression cassette was first subcloned into the Bluescript BS-KS + II plasmid (Stratagene)

pour donner le plasmide pBGP. La région Notl-EcoRI du plasmide hCMV- to give the plasmid pBGP. The NotI-EcoRI region of the hCMV- plasmid

intron gag-pol, incluant le promoteur, le gène rétroviral et le gène de résistance à l'antibiotique blasticidin bsr (Cosset et al, 1995) a été inséré dans les sites correspondants de BS (plasmide pBGP-bsr). Le signal de polyadénylation de SV40 a été amplifié par PCR à partir du plasmide hCMV-intron gag-pol en utilisant les amorces suivantes: 'GGATCGATCTAGAGATCATAATCAGCC et gag-pol intron, including the promoter, the retroviral gene and the gene for resistance to the antibiotic blasticidin bsr (Cosset et al, 1995) was inserted into the corresponding sites of BS (plasmid pBGP-bsr). The SV40 polyadenylation signal was amplified by PCR from the hCMV-intron gag-pol plasmid using the following primers: 'GGATCGATCTAGAGATCATAATCAGCC and

3'-GGGAATTCGATCCAGACATGATAAG,3'-GGGAATTCGATCCAGACATGATAAG,

dans le but d'introduire les sites de restriction Clal et EcoRI. Un fragment pol de 472 pb a été obtenu par PCR avec le plasmide précédent comme matrice et en utilisant les amorces suivantes: 'GGATTCCGAGCCCGCAACACG (précédant le site accepteur de d'épissage) et 3'ATCGATTAGGGGGCCTCGCGGG, conférant un site Clal en aval du codon stop de pol. Ce fragment a été digéré avec Sfil et CIal, alors que Is signal de polyadénylation de SV40 a été digéré avec CIal et EcoRI. Ils ont été insérés par une ligation des deux fragments de PCR in order to introduce the ClaI and EcoRI restriction sites. A 472 bp pol fragment was obtained by PCR with the previous plasmid as template and using the following primers: 'GGATTCCGAGCCCGCAACACG (preceding the splice acceptor site) and 3'ATCGATTAGGGGGCCTCGCGGG, conferring a ClaI site downstream of the stop codon from pol. This fragment was digested with SfiI and CIal, while the SV40 polyadenylation signal was digested with CIal and EcoRI. They were inserted by ligation of the two PCR fragments

dans le plasmide pBGP-bsr, digéré par Sfil-EcoRI, à la place du gène bsr. in the plasmid pBGP-bsr, digested with SfiI-EcoRI, in place of the bsr gene.

Cette unité gag-pol de 6,4 kb a finalement été extraite de pBGP avec Notl et EcoRI, modifiée par l'ADN I polymérase de Klenow et insérée dans le This 6.4 kb gag-pol unit was finally extracted from pBGP with NotI and EcoRI, modified with Klenow DNA I polymerase and inserted into the

plasmide BamHI, digéré avec pAd-Swal en utilisant des linkers Bcil. BamHI plasmid, digested with pAd-Swal using Bcil linkers.

Le promoteur humain EFlca inclut le premier exon non codant, un intron et la partie 5' du deuxième exon coupé en aval du site ATG. Le promoteur a été extrait avec Hindll et Xbal du plasmide pKREFhu, et cloné dans ies sites correspondants du plasmide pSP72'(PROMEGA). Le signal The human EFlca promoter includes the first non-coding exon, an intron and the 5 'part of the second exon cut downstream of the ATG site. The promoter was extracted with Hindll and Xbal from the plasmid pKREFhu, and cloned into the corresponding sites of the plasmid pSP72 '(PROMEGA). The signal

de polyadénylation décrit ci-dessus a été inséré aux sites Xbal et EcoRI. polyadenylation described above was inserted at the XbaI and EcoRI sites.

Le plasmide pEGA exprimant le gène env de GALV a été digéré avec Sacll, traité à la polymérase de Klenow et ligué avec des linkers Xbal. Le gène de 2,1 kb a ensuite été extrait avec Xbal et inséré entre le promoteur HuEF1ct et le signal de polyadénylation de SV40 pour donner le plasmide pCE. Cette unité de 4 kb a été finalement extraite avec HindIll et Clal, traitée à la polymérase de Klenow et insérée dans le The pEGA plasmid expressing the env gene of GALV was digested with SacII, treated with Klenow polymerase and ligated with Xbal linkers. The 2.1 kb gene was then extracted with Xbal and inserted between the HuEF1ct promoter and the SV40 polyadenylation signal to give the pCE plasmid. This 4 kb unit was finally extracted with HindIII and ClaI, treated with Klenow polymerase and inserted into the

plasmide pAd-Swal digéré par BamHI en utilisant les linkers BcIl. BamHI digested pAd-Swal plasmid using BcIl linkers.

Les vecteurs rétroviraux MFG contenant le CD2 murin ont déjà été décrits (DRANOFF, G., et al., 1993, P.N.A.S., 90, 3539-3543). Le vecteur de 4 kb a été extrait par Sspl et inséré dans le plasmide pAd-Swal MFG retroviral vectors containing murine CD2 have already been described (DRANOFF, G., et al., 1993, P.N.A.S., 90, 3539-3543). The 4 kb vector was extracted by Sspl and inserted into the plasmid pAd-Swal

digéré par BamHI en utilisant les linkers BcIl. digested with BamHI using BcIl linkers.

Construction des adénovirus recombinants Les adénovirus recombinants délétés E1/E3 ont été réalisés en utilisant le mutant adénoviral dl327 contenant une délétion complète de la région E3. En bref, 10 pg de plasmide navette ont été linéarisés avec, soit Swal ou Nhel et cotransfectés dans les cellules 293 avec 2 pg d'ADN, l0 de dl327 digéré par CIal. Chaque adénovirus recombinant a ensuite été purifié par quatre cycles de purification en plaques et confirmé par des tests de production fonctionnels tels que décrits ci-dessous. Des virus compétents pour la réplication sont finalement propagés sur des cellules 293 et purifiés deux fois par centrifugation en gradient de chlorure de césium. La concentration des particules virales par ml a été déterminée par spectrophotométrie. Les stocks d'adénovirus ont été titrés en plaques en infectant des cellules 293 avec des dilutions en série dans du milieu Construction of the Recombinant Adenoviruses The E1 / E3 deleted recombinant adenoviruses were produced using the adenoviral mutant dl327 containing a complete deletion of the E3 region. Briefly, 10 µg of shuttle plasmid was linearized with either Swal or Nhel and co-transfected into 293 cells with 2 µg of DNA, 10 of CIaI digested dl327. Each recombinant adenovirus was then purified by four rounds of plaque purification and confirmed by functional production assays as described below. Replication competent viruses are finally propagated on 293 cells and purified twice by cesium chloride gradient centrifugation. The concentration of viral particles per ml was determined spectrophotometrically. Adenovirus stocks were titrated in plaques by infecting 293 cells with serial dilutions in medium.

DMEM supplémenté avec 2 % de sérum de veau pendant deux heures. DMEM supplemented with 2% calf serum for two hours.

Les milieux sont ensuite éliminés avant le recouvrement par les virus. Le nombre d'unités formant plaques par ml (pfu/ml) a été compté six jours plus tard. Mesures de la production de rétrovirus Les tests de production de particules rétrovirales sont réalisés par infection des cellules de pré-packaging par les adénovirus recombinants. Les cellules TeLCeB6, qui expriment en stable le vecteur NLS LacZ et la région gag-pol, sont infectées par l'adénovirus recombinant portant l'enveloppe et le vecteur rétroviral. De la même façon, les cellules TeLFBASF, qui expriment en stable le vecteur NLS LacZ et l'enveloppe The media are then removed before recovery by the viruses. The number of plaque forming units per ml (pfu / ml) was counted six days later. Measurements of the production of retroviruses The tests for the production of retroviral particles are carried out by infection of the pre-packaging cells with the recombinant adenoviruses. The TeLCeB6 cells, which express in a stable manner the NLS LacZ vector and the gag-pol region, are infected with the recombinant adenovirus carrying the envelope and the retroviral vector. Likewise, the TeLFBASF cells, which express the NLS LacZ vector in a stable manner and the envelope

amphotrope, sont infectées par les adénovirus portant la région gag-pol. amphotropic, are infected with adenoviruses carrying the gag-pol region.

Ces cellules de pré-packaging sont ensemencées à 4.105 cellules par puits dans des plaques à 6 puits. Le lendemain, elles sont infectées par les adénovirus recombinants à différentes multiplicités d'infection (MOI) pendant deux heures dans 1 ml de milieu DMEM contenant 2 % de sérum de veau foetal. Les cellules sont ensuite lavées une fois avec du PBS, et laissées dans 2 ml de DMEM contenant 10 % de sérum de veau foetal pendant 24 heures supplémentaires. Les cellules sont changées pour la nuit. Finalement, deux jours après l'infection avec les adénovirus, les surnageants de culture sont récoltés, filtrés à 0,45,m o0 et analysés pour la présence de particules rétrovirales infectieuses. Les cellules productrices sont analysées quant à leur production de protéines gag, env ou CD2. Dans un autre mode de réalisation, les cellules infectées peuvent être maintenues en culture pour des essais de production These pre-packaging cells are seeded at 4,105 cells per well in 6-well plates. The next day, they are infected with the recombinant adenoviruses at different multiplicities of infection (MOI) for two hours in 1 ml of DMEM medium containing 2% fetal calf serum. The cells are then washed once with PBS, and left in 2 ml of DMEM containing 10% fetal calf serum for an additional 24 hours. The cells are changed for the night. Finally, two days after infection with the adenoviruses, the culture supernatants are harvested, filtered at 0.45 m o0 and analyzed for the presence of infectious retroviral particles. Producer cells are analyzed for their production of gag, env or CD2 proteins. In another embodiment, the infected cells can be maintained in culture for production assays.

rétrovirale à long terme.long-term retroviral.

Titration des vecteurs codant pour NlsLacZ Pour le titrage des particules rétrovirales codant pour NlsLacZ, des cellules Te671 ont été ensemencées à 5x104 cellules par puits dans des plaques à 24 puits la veille de la transduction. Elles sont incubées pendant quatre heures avec des dilutions en série des surnageants infectieux contenant 8 pg de Polbrene par ml. Après changement du milieu de culture, les cellules sont laissées pendant deux jours. Elles sont ensuite fixées avec 2 % de glutaraldéhyde et colorées avec 5 mM K4(Fe(CN)6)-5 mM K4(Fe(CN)6)-2 mM MgCI2-1 mg/ml de X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D- galactopyranoside) (Promega) pendant 6 heures. Le nombre des colonies positives est compté en unités Titration of the Vectors Coding for NlsLacZ For the titration of the retroviral particles coding for NlsLacZ, Te671 cells were seeded at 5x104 cells per well in 24-well plates the day before transduction. They are incubated for four hours with serial dilutions of the infectious supernatants containing 8 μg of Polbrene per ml. After changing the culture medium, the cells are left for two days. They are then fixed with 2% glutaraldehyde and stained with 5 mM K4 (Fe (CN) 6) -5 mM K4 (Fe (CN) 6) -2 mM MgCl2 - 1 mg / ml of X-gal (5-bromo -4-Chloro-3-indolyl-bD-galactopyranoside) (Promega) for 6 hours. The number of positive colonies is counted in units

internationales par ml (lU/ml).international per ml (lU / ml).

Cytométrie de flux Les cellules productrices infectées avec des adénovirus recombinants porteurs du MFGmCD2 sont récoltées dans du PBS, 2 mM EDTA et incubées avec 1 pg/106 cellules avec un anticorps monoclonal purifié de rat contre le CD2 de souris (Cliniscience) pendant 1 heure, à 4 C. Les cellules sont ensuite incubées avec 1 pg/106 cellules de fragment F(ab')2 purifié conjugué au FITC et dirigé contre les IgG de rat (Bioatlantique, France) pendant 1 heure, à 4 C. Après le dernier lavage en PBS, elles sont colorées avec 20 pg/ml de iodure de propidium (PI), pour discriminer la population viable (PI négative) des cellules mortes (PI positive) conduisant à la réduction du bruit de fond de fluorescence non spécifique. Le marquage au FITC de 104 cellules viables est analysée par Flow cytometry The producer cells infected with recombinant adenoviruses carrying MFGmCD2 are harvested in PBS, 2 mM EDTA and incubated with 1 μg / 106 cells with a purified rat monoclonal antibody against mouse CD2 (Cliniscience) for 1 hour, at 4 C. The cells are then incubated with 1 μg / 106 cells of purified F (ab ') 2 fragment conjugated with FITC and directed against rat IgG (Bioatlantique, France) for 1 hour, at 4 C. After the last Washed in PBS, they are stained with 20 μg / ml of propidium iodide (PI), to discriminate the viable population (PI negative) from dead cells (PI positive) leading to the reduction of the background noise of non-specific fluorescence. The FITC labeling of 104 viable cells is analyzed by

cytométrie de flux.flow cytometry.

Western blotting Des lysats cellulaires sont préparés dans un tampon de lyse (20 mM Tris-HCI pH 7.6, 1%, Triton X100, sodium dodecyl sulfate 0,5 %, sodium deoxycholate 0,5 %, 150 mM NaCI, 1 mM phénylméthylsulfonyl Western blotting Cell lysates are prepared in lysis buffer (20 mM Tris-HCl pH 7.6, 1%, Triton X100, sodium dodecyl sulfate 0.5%, sodium deoxycholate 0.5%, 150 mM NaCl, 1 mM phenylmethylsulfonyl

fluoride, 1X d'un cocktail inhibiteur de protéases (Boehringer Mannheim). fluoride, 1X of a protease inhibitor cocktail (Boehringer Mannheim).

Après une séparation en électrophorèse de gel de polyacrylamide en After electrophoretic separation of polyacrylamide gel into

sodium dodécyl sulfate 10 % et transfert sur des membranes de nitro- sodium dodecyl sulfate 10% and transfer to nitro- membranes

cellulose Hybond (Amersham), I'immunoblott a été réalisé en utilisant un anticorps monoclonal anti-p30 (?) ou un anticorps monoclonal anti-gp70 amphotrope. Des anti-anticorps de chèvre marqués à la péroxidase ont été Hybond cellulose (Amersham), the immunoblotting was carried out using an anti-p30 (?) monoclonal antibody or an amphotropic anti-gp70 monoclonal antibody. Goat anti-antibodies labeled with peroxidase have been

utilisés pour l'immuno-détection en chimio-luminescence. used for chemiluminescence immunodetection.

Exemples de réalisationExamples of realization

Exemple 1Example 1

Caractérisation fonctionnelle des adénovirus porteurs de gag-pol (Ad gagpol) (a) Obtention des adénovirus recombinants Pour éviter une éventuelle interférence entre les deux systèmes d'épissage viraux contraire à la production des adénovirus recombinants, deux cassettes d'expression gag-pol ont été construites. La première porte la séquence nucléique sauvage de Moloney MLV (gag-pol SA+), et la deuxième porte une séquence modifiée au niveau du site accepteur d'épissage présent à la fin de pol mais respectant le cadre de lecture normal (gag-pol SA-). Le gène gag-pol de Mo-MLV est placé sous le contrôle du promoteur précoce du cytomégalovirus (CMV). Cet ensemble est inséré au site de la région E1 du génome adénoviral, conduisant à des virus défectifs pour sa réplication. Plusieurs clones adénoviraux ont été obtenus après co- transfection des cellules 293 (El+) io avec les plasmides navettes et le génome Ad327 tronqué de la partie 'ITR. Huit d'entre eux ont été testés dans les essais de production Functional characterization of adenoviruses carrying gag-pol (Ad gagpol) (a) Obtaining recombinant adenoviruses To avoid possible interference between the two viral splicing systems contrary to the production of recombinant adenoviruses, two gag-pol expression cassettes have been built. The first carries the wild-type Moloney MLV nucleic acid sequence (gag-pol SA +), and the second carries a sequence modified at the level of the splice acceptor site present at the end of pol but respecting the normal reading frame (gag-pol SA -). The Mo-MLV gag-pol gene is placed under the control of the cytomegalovirus (CMV) early promoter. This set is inserted at the site of the E1 region of the adenoviral genome, leading to viruses defective for its replication. Several adenoviral clones were obtained after cotransfection of the 293 (E1 +) io cells with the shuttle plasmids and the truncated Ad327 genome of the ITR part. Eight of them have been tested in production trials

rétrovirale, après infection des cellules trans-complémentantes TeL- retroviral, after infection of the trans-complementing cells TeL-

FBASAF, qui expriment en stable l'enveloppe amphotrope et le vecteur NlsLacZ. Tous étaient positifs. Le clone 3 (Adgag-pol SA+) et le clone 6 (Adgag-pol SA-) ont été purifiés par quatre plaquings successifs sur les cellules 293. L'amplification finale sur 20 boîtes de culture de 150 mm a permis l'obtention de deux stocks d'adénovirus titrant indifféremment à ,0 1010 pfu/ml. La présence du site accepteur d'épissage sauvage n'a donc finalement pas d'effet négatif sur la production adénovirale. Les virus FBASAF, which express in stable the amphotropic envelope and the NlsLacZ vector. All were positive. Clone 3 (Adgag-pol SA +) and clone 6 (Adgag-pol SA-) were purified by four successive platings on 293 cells. The final amplification on 20 culture dishes of 150 mm made it possible to obtain two stocks of adenovirus titrating indifferently at .0 1010 pfu / ml. The presence of the wild-type splicing acceptor site therefore ultimately has no negative effect on adenoviral production. Viruses

seront désignés par la suite sous la forme générique Adgag-pol. will be referred to hereinafter in the generic form Adgag-pol.

(b) Production des particules rétrovirales Les tests de production de particules rétrovirales après (b) Production of retroviral particles Tests for the production of retroviral particles after

infection par Adgag-pol ont été analysés en infectant des cellules trans- Adgag-pol infection were analyzed by infecting trans-

complémentantes TelBASAF, dérivées des Te671 et exprimant en stable lI'enveloppe amphotrope et le vecteur LacZ. Les conditions optimales de production rétrovirale ont été déterminées par infection des cellules TeLBASAF avec des quantités croissantes d'Adgag-pol. Deux jours après l'infection, les niveaux d'expression de gag-pol ont été analysés par Western Blot en utilisant un anticorps dirigé contre la protéine de capside p30. L'anticorps permet également l'immuno-détection du précurseur non clivé de gag Pr65 ou des polypeptides partiellement digérés. Les niveaux de la synthèse de Pr65 dans les cellules infectées par Adgag-pol sont au complementants TelBASAF, derived from Te671 and expressing in stable the amphotropic envelope and the vector LacZ. Optimal conditions for retroviral production were determined by infecting TeLBASAF cells with increasing amounts of Adgag-pol. Two days after infection, gag-pol expression levels were analyzed by Western blotting using an antibody directed against the p30 capsid protein. The antibody also allows immunodetection of uncleaved gag precursor Pr65 or partially digested polypeptides. The levels of Pr65 synthesis in cells infected with Adgag-pol are at

moins égaux à ceux détectés dans les cellules d'empaquetage stable FLY- less equal to those detected in FLY- stable packaging cells

GALV, cellules dérivées des Te671 exprimant gag-pol et l'enveloppe du Gibbon ape leukemia virus GALV (Porter CD, C.M., Tailor CS, Parkar MH, GALV, cells derived from Te671 expressing gag-pol and the envelope of the Gibbon ape leukemia virus GALV (Porter CD, C.M., Tailor CS, Parkar MH,

Cosset FL, Weiss RA, Takeuchi Y., Hum. Gene Ther. 7, 913-919 (1996)). Cosset FL, Weiss RA, Takeuchi Y., Hum. Gene Ther. 7, 913-919 (1996)).

La synthèse de la Pr65 augmente avec la m.o.i. Iorsqu'on travaille avec de faibles quantités d'adénovirus (m.o.i. de 5 à 10). Cette observation peut o s'expliquer par un nombre croissant de cellules réellement transduites. La figure 4 représente le Westemrn Blot réalisé avec un anticorps anti-p30 sur les extraits cellulaires (105 cellules par piste). La piste (+) est un contrôle positif TeFLY-GALV. La piste (-) est un contrôle négatif TeL-FBASAF non infectées. Les pistes 5 à 50 indiquent le résultat obtenu avec TeL-FBASAF The synthesis of Pr65 increases with m.o.i. When working with small amounts of adenovirus (a.i. from 5 to 10). This observation can be explained by an increasing number of actually transduced cells. FIG. 4 represents the Westemrn blot carried out with an anti-p30 antibody on the cell extracts (105 cells per lane). The (+) lane is a TeFLY-GALV positive control. The (-) lane is an uninfected TeL-FBASAF negative control. Tracks 5 to 50 indicate the result obtained with TeL-FBASAF

infectées avec m.o.i. croissantes en Ad gag-pol. infected with m.o.i. increasing in Ad gag-pol.

Par contre, la quantité de Pr65 produite reste stable pour des m.o.i. variant jusqu'à 250. Ce résultat, indépendant de l'effet cytopathique On the other hand, the quantity of Pr65 produced remains stable for m.o.i. varying up to 250. This result, independent of the cytopathic effect

observé pour les m.o.i. plus fortes, est plus inattendu. observed for m.o.i. stronger, is more unexpected.

La production des rétrovirus par les TelFBASAF infectées par lI'Ad gag-pol a été analysée par titration des sumageants de culture selon la The production of retroviruses by TelFBASAF infected with Ad gag-pol was analyzed by titration of culture supernatants according to the

technique décrite ci-dessus dans Matériels et Méthodes. technique described above in Materials and Methods.

Le titre obtenu est approximativement de 106 Ifu/ml, pour des m.o.i. variant de 10 à 500 en adénovirus (tableau 1 ci-dessous). Il est maximal les deuxième et troisième jours après infection des producteurs (colonnes J2 et J3) quelle que soit la quantité d'Adgag-pol utilisée. Il décroît à partir du quatrième jour (colonne J4), même aux m.o.i. les plus The titer obtained is approximately 106 Ifu / ml, for m.o.i. varying from 10 to 500 in adenovirus (Table 1 below). It is maximum on the second and third days after infection of the producers (columns J2 and J3) regardless of the amount of Adgag-pol used. It decreases from the fourth day (column J4), even at m.o.i. most

faibles pour lesquelles un effet cytopathique n'est pas observé. weak for which a cytopathic effect is not observed.

Tableau 1: Production de particules rétrovirales avec l'adénovirus Ad gag-pol m.o.i. en Titre Titre Titre Titre Table 1: Production of retroviral particles with the adenovirus Ad gag-pol m.o.i. en Title Title Title Title

Adénovirus J1 p.i. J2 p.i. J3 p.i. J4 p.i. Adenovirus J1 p.i. J2 p.i. J3 p.i. J4 p.i.

Adgag-polAdgag-pol

ADN 1,7 103 9,0 102 5,2 102 3,6102DNA 1.7 103 9.0 102 5.2 102 3.6102

4,3 105O 7,5 105 2,1 106 8,6 1054.3 105O 7.5 105 2.1 106 8.6 105

1,4 106 2,0 106 2,0 106 3,1 1051.4 106 2.0 106 2.0 106 3.1 105

1,2 106 2,0 106 1,0 106 4,6 1051.2 106 2.0 106 1.0 106 4.6 105

250 1,4 106 1,2 106 9,0 105 inf 104 500 1,3 10 6 1,1 106 7,7 105 inf 104 On observe également une saturation de la production de particules rétrovirales à partir de la m.o.i. 50. Est-elle due à la saturation de la synthèse des protéines gag remarquée en Westemrn Blot, ou le système TeL-FBASAF est- il lui-même limitant ? Quel que soit le facteur responsable de la saturation, cette méthode de production transitoire augmente le titre des surnageants infectieux d'un facteur 100 à 1000 par rapport à la simple transfection du plasmide portant la cassette d'expression de gag-pol dans 250 1.4 106 1.2 106 9.0 105 inf 104 500 1.3 10 6 1.1 106 7.7 105 inf 104 We also observe a saturation of the production of retroviral particles from the m.o.i. 50. Is it due to the saturation of gag protein synthesis observed in Westemrn Blot, or is the TeL-FBASAF system itself limiting? Regardless of the factor responsible for saturation, this transient production method increases the titer of infectious supernatants by a factor of 100 to 1000 compared to the simple transfection of the plasmid carrying the gag-pol expression cassette in

les cellules complémentaires (ligne DNA). complementary cells (DNA line).

La recherche de rétrovirus compétents pour la réplication sur les surnageants TeL-FBASAF infectées n'a montré aucun événement de recombinaison entre la cassette gag-pol et l'enveloppe intégrée dans le génome cellulaire (travaux réalisés par F.L. Cossett, Lyon). Les tests ont pourtant été faits dans les conditions les plus favorables à l'émergence de virus helper: grand nombre de copies gag-pol présentes dans les cellules, et utilisation de l'enveloppe amphotrope de MLV dont la séquence nucléique chevauche avec celle de pol. De même, aucune encapsidation non spécifique de I'ARN gag-pol n'a pu être mise en évidence dans les surnageants de culture. Le système de production est donc efficace, rapide The search for replication-competent retroviruses on the infected TeL-FBASAF supernatants showed no recombination event between the gag-pol cassette and the envelope integrated into the cellular genome (work carried out by F.L. Cossett, Lyon). The tests were however carried out under the most favorable conditions for the emergence of helper virus: large number of gag-pol copies present in the cells, and use of the amphotropic envelope of MLV whose nucleic sequence overlaps with that of pol . Likewise, no non-specific encapsidation of the gag-pol RNA could be demonstrated in the culture supernatants. The production system is therefore efficient, fast

et sûr.and on.

Exemple 2Example 2

Caractérisation fonctionnelle des adénovirus portant la fonction env 1. Obtention et purification des adénovirus recombinants Functional characterization of adenoviruses carrying the env function 1. Obtaining and purification of recombinant adenoviruses

o0 Le gène codant pour l'enveloppe de GALV (fragment Sacll- o0 The gene encoding the GALV envelope (fragment SacII-

Xbal Sacll-Xbal) a été clone entre le promoteur du facteur d'élongation humain EFla (issu du plasmide pKREFhu (référence)) (Fig. 2). La production d'adénovirus recombinants permet d'obtenir des titres de l'ordre Xbal SacII-Xbal) was cloned between the promoter of the human elongation factor EFla (derived from the plasmid pKREFhu (reference)) (FIG. 2). The production of recombinant adenoviruses makes it possible to obtain titers of the order

2x10 à pfu/ml.2x10 at pfu / ml.

* La génération d'adénovirus portant la cassette d'expression de l'enveloppe GALV et le vecteur VL30-mCD2 s'étant avérée délicate, les* The generation of adenoviruses carrying the expression cassette of the GALV envelope and the vector VL30-mCD2 having proved to be delicate, the

deux fonctions ont été placées sur des vecteurs adénoviraux distincts. two functions were placed on separate adenoviral vectors.

Pour construire le vecteur porteur de mCD2 et représenté sur la figure 3, la région psi/SD+/SA+ du vecteur MFG-mCD2 a été remplacée par la région d'encapsidation et dimérisation de rétro-transposons virus-like To construct the vector carrying mCD2 and represented in FIG. 3, the psi / SD + / SA + region of the MFG-mCD2 vector was replaced by the region of packaging and dimerization of virus-like retro-transposons

VL30 (fragment Xbal-BamHA, issu du plasmide pCO6-HX (figure 3)). VL30 (Xbal-BamHA fragment, derived from the plasmid pCO6-HX (FIG. 3)).

2. Production de particules rétrovirales Des stocks d'adénovirus titrant à 2,0 1011 pfu/ml ont été obtenus. L'analyse de l'adénovirus Ad GALVenv est analogue à celle faite sur l'adénovirus Ad gag-pol. Les cellules complémentantes sont les TeLCeb6, dérivées des Te671 exprimant en stable gag-pol de MoMLV et le 2. Production of retroviral particles Stocks of adenovirus titrating 2.0 1011 pfu / ml were obtained. The analysis of the Ad GALVenv adenovirus is analogous to that performed on the Ad gag-pol adenovirus. The complementing cells are the TeLCeb6, derived from the Te671 expressing in stable gag-pol of MoMLV and the

vecteur MFG-LacZ (Cosset F.L. et ai, J. Virol. 1995, 69:7430-7436). MFG-LacZ vector (Cosset F.L. et al., J. Virol. 1995, 69: 7430-7436).

La synthèse de l'enveloppe a été étudiée par Westemrn Blot et le résultat représenté sur la figure 5 qui représente le Western Blot réalisé avec un anticorps anti-gp70 amphotrope sur des extraits cellulaires (105 cellules par piste). Dans la Figure 5A, la piste (+) est un contrôle positif TeFLY-GALV. La piste (-) est TeL-Ceb6 non infectées. Les pistes 5 à 1000 sont TeL-Ceb6 infectées avec des m.o.i. croissantes en Ad GALVenv. La Figure 5B représente l'agrandissement des pistes 250 et 500, exposition The synthesis of the envelope was studied by Westemrn Blot and the result represented in FIG. 5 which represents the Western blot carried out with an amphotropic anti-gp70 antibody on cell extracts (105 cells per lane). In Figure 5A, the (+) lane is a TeFLY-GALV positive control. The track (-) is uninfected TeL-Ceb6. Lanes 5 to 1000 are TeL-Ceb6 infected with m.o.i. increasing in Ad GALVenv. Figure 5B shows the enlargement of tracks 250 and 500, exposure

du film réduite.reduced film.

Un anticorps dirigé contre la partie N-terminale de l'enveloppe amphotrope (sous-unité SU) a été utilisé puisqu'aucun anticorps dirigé contre le pseudotype GALV n'est disponible. Cette étude n'est pas An antibody directed against the N-terminal part of the amphotropic envelope (SU subunit) was used since no antibody directed against the GALV pseudotype is available. This study is not

optimale, car la réaction croisée avec l'antigène de singe est assez faible. optimal, because the cross-reaction with the monkey antigen is quite low.

C'est pourquoi la protéine n'est pas détectée dans un extrait cellulaire de producteurs stables FLY GALV (figure 5A). Par contre, le Western Blot montre une synthèse forte et croissante de la protéine d'enveloppe dans les cellules infectées par l'adénovirus Ad GALVenv. Malgré son intensité inattendue, le signal observé est spécifique de la pg70. Il n'est pas dû à une réaction croisée de l'anticorps avec une protéine adénovirale apportée par l'infection, puisqu'il n'est pas retrouvé avec des extraits cellulaires de TeLCeb6 infectées par un adénovirus contrôle' CMV-LacZ. Les deux bandes rapprochées observées par Western Blot pourraient correspondre au peptide précurseur Pr85 et à la forme mature gp70 (figure 5B). Ceci plaide en faveur d'un adressage correct de l'enveloppe à la surface de membranes plasmique, puisque le clivage SU/TM sensé libérer le domaine de fusion est nécessaire à la translocation du polypeptide (Zhu N.L. et al, This is why the protein is not detected in a cell extract of stable producers FLY GALV (FIG. 5A). On the other hand, the Western blot shows a strong and increasing synthesis of the envelope protein in cells infected with the adenovirus Ad GALVenv. Despite its unexpected intensity, the signal observed is specific for pg70. It is not due to a cross reaction of the antibody with an adenoviral protein provided by the infection, since it is not found with cell extracts of TeLCeb6 infected with a control adenovirus' CMV-LacZ. The two closely spaced bands observed by Western blotting could correspond to the precursor peptide Pr85 and to the mature form gp70 (FIG. 5B). This argues in favor of a correct addressing of the envelope on the surface of plasma membranes, since the SU / TM cleavage supposed to release the fusion domain is necessary for the translocation of the polypeptide (Zhu N.L. et al,

J. Virol. 1998, 72:1632-1639).J. Virol. 1998, 72: 1632-1639).

L'analyse de la production rétrovirale montre une saturation du système TeLCeb6. Le titre maximal en particules LacZ infectieuses est Analysis of retroviral production shows saturation of the TeLCeb6 system. The maximum titer of infectious LacZ particles is

obtenu pour les faibles m.o.i. en Ad GALVenv (tableau 2 ci-dessous). obtained for low m.o.i. in Ad GALVenv (Table 2 below).

Tableau 2: Production de particules rétrovirales avec I'adénovirus Ad GALVenv m.o.i. en Adénovirus Titre en lU/ml Ad GALVenv (deux jours post-infection) Table 2: Production of retroviral particles with the adenovirus Ad GALVenv m.o.i. in Adenovirus Title in lU / ml Ad GALVenv (two days post-infection)

ADN 4,0 104DNA 4.0 104

4,7 1064.7 106

5,0 1 065.0 1 06

3,4 1 063.4 1 06

1,0 1061.0 106

250 9,0 105250 9.0 105

Plasmide 4 104Plasmid 4,104

TG18 4,6 106TG18 4.6 106

Alors que la transfection des cellules TeLCeb6 avec un plasmide codant pour l'enveloppe de GALV donne des surnageants titrant à 4 x 104 lU/ml, des titres de 4 à 5 106 lU/ml ont été obtenus deux jours après l'infection adénovirale avec des m.o.i. entre 10 et 50. Un tel système transitoire permet d'obtenir une produçtion rétrovirale équivalente à la While transfection of TeLCeb6 cells with a plasmid encoding the GALV envelope yielded supernatants assaying 4 x 10 4 lU / ml, titers of 4 to 5 106 lU / ml were obtained two days after adenoviral infection with me between 10 and 50. Such a transient system makes it possible to obtain a retroviral production equivalent to the

io lignée stable productrice TG18.io stable producer line TG18.

Pour des m.o.i. supérieures, les titres décroissent en proportion d'un effet cytopathique, qui peut être sans doute corrélé à l'expression de protéine adénovirale précoce et tardive détectée par immunocytochimie. Là encore, aucun rétrovirus compétent pour la réplication n'a For m.o.i. higher, the titers decrease in proportion to a cytopathic effect, which can undoubtedly be correlated with the expression of early and late adenoviral protein detected by immunocytochemistry. Again, no replication competent retrovirus has

pu être détecté par les tests LacZ. could be detected by the LacZ tests.

Exemple 3Example 3

Production de particules rétrovirales par co-infection avec les adénovirus gag-pol et env Les conditions optimales de production ont été déterminées en infectant les cellules TeLacZ trans-complémentantes, dérivant de Te671 et exprimant de façon stable le vecteur rétroviral (COSSET, F.L., et al., 1995, 69, 7430-7436). Deux jours après l'infection des cellules TeLacZ, des titres supérieurs à 106 lU/ml ont été obtenus quand les deux m.o.i. se situent entre 50 et 100. Bien qu'il n'y ait pas de corrélation évidente entre la Production of retroviral particles by co-infection with the gag-pol and env adenoviruses Optimal production conditions were determined by infecting trans-complementing TeLacZ cells, derived from Te671 and stably expressing the retroviral vector (COSSET, FL, et al. al., 1995, 69, 7430-7436). Two days after infection of the TeLacZ cells, titers greater than 106 lU / ml were obtained when both m.o.i. are between 50 and 100. Although there is no obvious correlation between

0 production de rétrovirus et les rapports entre les deux adénovirus Aggag- 0 production of retroviruses and the relationship between the two Aggag- adenoviruses

pol; et Ad env, I'analyse de la production de rétrovirus au cours du temps a pol; and Ad env, the analysis of the production of retroviruses over time.

été réalisée avec des m.o.i. égales pour les deux virus. was carried out with m.o.i. equal for both viruses.

Le tableau 4 ci-dessous indique la production de rétrovirus en fonction de la multiplicité d'infection des deux adénovirus Adgag-pol et Ad Table 4 below indicates the production of retroviruses as a function of the multiplicity of infection of the two adenoviruses Adgag-pol and Ad

env.approx.

Tableau 4: rétrovirus les 2ème, 3ème et 4ème jours après l'infection adénovirale m.o.i. Titres rétroviraux (lU/ml) les jours suivants AdGALVenv et l'infection adériovirale Adag- pol Table 4: retroviruses on the 2nd, 3rd and 4th days after m.o.i. adenoviral infection. Retroviral titers (lU / ml) on days following AdGALVenv and aderoviral infection Adag- pol

2 3 42 3 4

/5 4,8 x 105 1,1 x 10ob 1,6 x 104 /10 9,6 x 105 7,9 x 105 1,0 x 105 /50 3,2 x 106 2,3 x 106 6,4 x 105 /100 1,3 x 106 9,5 x 105 1,4 x 105 TG18 2,2 x 10b 2,9 x 10b 3,0 x 10b Les titres rétroviraux diminuent au cours du temps, et ceci indépendamment des m.o.i. des adénoviraux et en l'absence des faits cytopathiques. Néanmoins, I'infection de cellules productrices avec des / 5 4.8 x 105 1.1 x 10ob 1.6 x 104/10 9.6 x 105 7.9 x 105 1.0 x 105/50 3.2 x 106 2.3 x 106 6.4 x 105/100 1.3 x 106 9.5 x 105 1.4 x 105 TG18 2.2 x 10b 2.9 x 10b 3.0 x 10b The retroviral titers decrease over time, and this independently of the moi adenovirals and in the absence of cytopathic facts. However, infection of producer cells with

m.o.i. de 50 conduit à des titres de 2 x 106 lU/ml pendant deux jours. I. of 50 results in titers of 2 x 106 lU / ml for two days.

Aucun rétrovirus compétent pour la réplication n'a pu être détecté dans les surnageants de cultures cellulaires récoltées deux et trois No replication competent retrovirus could be detected in cell culture supernatants harvested two and three

jours après l'infectioExemple 4days after infection Example 4

Caractérisation fonctionnelle de l'adénovirus Ad-MCD2 1. Obtention des adénovirus recombinants Ad VL30mCD2 et Ad MFG-mCD2 représentés dans la Figure 3 Un vecteur rétroviral MFG codant pour l'antigène de surface CD2 murin a été décrit (Champsex et al, 1996...). Le vecteur a donc été inséré dans le génome adénoviral délété de la région El, et des stocks de Functional characterization of the Ad-MCD2 adenovirus 1. Obtaining the recombinant adenoviruses Ad VL30mCD2 and Ad MFG-mCD2 represented in FIG. 3 An MFG retroviral vector encoding the murine CD2 surface antigen has been described (Champsex et al, 1996. ..). The vector was therefore inserted into the adenoviral genome deleted from the El region, and stocks of

virus Ad MFG-mCD2 a été amplifié, titrant à 2 1010 pfu/ml. Ad virus MFG-mCD2 was amplified, assaying 21010 pfu / ml.

2. Production de particules rétrovirales avec Ad MFG- 2. Production of retroviral particles with Ad MFG-

mCD2 Les Te-FLYA ont été infectées avec des m.o.i. croissantes en Ad MFG-mCD2 purifié. Dès la m.o.i. de 5, la population est globale mCD2 positive (Figure 6A) contrairement à ce qu'indique les clones producteurs contrôle (Figure 6B). Elle devient plus homogène avec des charges plus élevées en adénovirus, mais les cellules présentent un effet cytopathique mCD2 Te-FLYA were infected with m.o.i. increasing in purified Ad MFG-mCD2. From the m.o.i. of 5, the population is overall mCD2 positive (FIG. 6A), contrary to what the control producer clones indicate (FIG. 6B). It becomes more homogeneous with higher loads of adenovirus, but the cells exhibit a cytopathic effect.

précoce pour des m.o.i. supérieures à 50. early for m.o.i. greater than 50.

L'analyse des cibles montre une transduction de 3 à 9 % des cellules, (Tableau 4 ci-dessous). Le contrôle des FLYA transfectées avec le The analysis of the targets shows a transduction of 3 to 9% of the cells, (Table 4 below). The control of FLYA transfected with

plasmide portant le vecteur ne donne pas de transduction décelable. plasmid carrying the vector gave no detectable transduction.

Tableau 5: Production rétrovirale par les Te-FLYA infectées avec l'Ad MFG-mCD2 m.o.i. en Adénovirus % de Cellules Cibles Effet cytopathique Ad MFG-mCD2 mCD2+ (deux jours post- infection) Table 5: Retroviral production by Te-FLYA infected with Ad MFG-mCD2 m.o.i. in Adenovirus% of Target Cells Cytopathic effect Ad MFG-mCD2 mCD2 + (two days post-infection)

DNA 0.03 -DNA 0.03 -

3.5 -3.5 -

5.4 -5.4 -

7.3 -7.3 -

8.1 +8.1 +

9.7 ++9.7 ++

250 N.D.+++250 N.D. +++

De façon surprenante, alors que les clones producteurs infectés à des m.o.i. jusqu'à 50 expriment des niveaux élevés de mCD2, Surprisingly, while the producer clones infected with m.o.i. up to 50 express high levels of mCD2,

les cellules transduites n'excèdent pas 10 % de la population totale. transduced cells do not exceed 10% of the total population.

Cependant, une augmentation de la multiplicité d'infection des adénovirus conduit à une transduction plus efficace allant jusqu'à 24 % des cellules positives. En revanche, aucun transfert de gènes mCD2 n'a pu être détecté However, an increase in the multiplicity of adenovirus infection leads to more efficient transduction of up to 24% of positive cells. On the other hand, no transfer of mCD2 genes could be detected.

]o avec les cellules productrices TeFLY-GALV transfectées. ] o with transfected TeFLY-GALV producer cells.

Exemple 5Example 5

Production de particules rétrovirales avec Ad gag-pol, Ad GALVenv et Ad mCD2 Les Te671 ont été infectées avec les trois adénovirus simultanément, avec des m.o.i. de 10 ou 50 pour les fonctions de packaging, et des m.o.i. de 10, 25 et 50 pour le vecteur. On retrouve des niveaux de transduction de 8-10 % comparables à ceux obtenus sur les producteurs stables Te-FLYGALV (Tableau 6, les deux dernières lignes) ou Production of retroviral particles with Ad gag-pol, Ad GALVenv and Ad mCD2 Te671 were infected with all three adenoviruses simultaneously, with m.o.i. 10 or 50 for packaging functions, and m.o.i. of 10, 25 and 50 for the vector. We find transduction levels of 8-10% comparable to those obtained on the stable producers Te-FLYGALV (Table 6, the last two lines) or

Te-FLYA (Tableau 5) infectés avec l'adénovirus Ad MFGmCD2 seul. Te-FLYA (Table 5) infected with Ad MFGmCD2 adenovirus alone.

Tableau 6 Production rétrovirale par le Te671 infectées les trois adénovirus m.o.i. en Ad gag-pol m.o.i. en % de Cellules cibles et Ad GALVenv Ad MFG-mCD2 mCD2+ Table 6 Retroviral production by Te671 infected with the three m.o.i. in Ad gag-pol m.o.i. in% of Target cells and Ad GALVenv Ad MFG-mCD2 mCD2 +

/10 10 8/ 10 10 8

/10 50 4,4/ 10 50 4.4

/25 10 8,7/ 25 10 8.7

/25 50 8,9/ 25 50 8.9

/50 10 8,2/ 50 10 8.2

/50 50 10,6/ 50 50 10.6

-- 10 3,5- 10 3.5

-- 50 9,4- 50 9.4

L'analyse en cytométrie de flux des Te671 cibles maintenues en culture dix jours après l'infection rétrovirale montre une expression constante de mCD2 (données non présentées). La population cellulaire garde 10-11 % de cibles exprimant le transgène. Ce résultat indique que le transfert du gène est stable, et n'est pas le fait d'une contamination des Flow cytometric analysis of the Te671 targets maintained in culture ten days after retroviral infection shows constant expression of mCD2 (data not shown). The cell population keeps 10-11% of targets expressing the transgene. This result indicates that the transfer of the gene is stable, and is not the result of contamination of

surnageants rétroviraux par les adénovirus Ad MFGmCD2. Retroviral supernatants with Ad MFGmCD2 adenoviruses.

Exemple 6Example 6

Screening des lignées cellulaires combinant la permissivité à l'infection adénovirale et des hauts titres de production rétrovirale La production rétrovirale in vitro a été analysée par l'infection simultanée des cellules avec les trois adénovirus recombinants. Afin de comparer cette production à celle obtenue avec les cellules TeFLY-GALV infectées par AdmCD2, dans le même contexte cellulaire, les cellules Te671 ont d'abord été infectées avec des m.o.i. croissantes de Adgag-pol, AdGALV env et AdmCD2. Deux jours après l'infection, les cellules cibles sont incubées avec les surnageants de cultures infectieux, en présence d'anticorps bloquant les adénovirus. Là encore, bien que les cellules productrices exprimant l'antigène CD2, quelle que soit la multiplicité d'infection adénovirale, ont été utilisées, la transduction apparaît être dépendante de la multiplicité d'infection. La fraction des cellules cibles positives exprimant le marqueur se situe entre 1,5 et 24,3 % de la population totale (Figure 7A). Les cellules infectées par le surnageant sont maintenues en culture pendant trois semaines de plus et analysées quant à l'expression de l'antigène mCD2 à long terme. Des populations cellulaires positives sont toujours détectées, confirmant qu'e l'induction de mCD2 résulte de la transduction rétrovirale et non de la transduction adénovirale Screening of cell lines combining permissiveness to adenoviral infection and high titers of retroviral production. Retroviral production in vitro was analyzed by the simultaneous infection of cells with the three recombinant adenoviruses. In order to compare this production with that obtained with the TeFLY-GALV cells infected with AdmCD2, in the same cellular context, the Te671 cells were first infected with m.o.i. increasing amounts of Adgag-pol, AdGALV env and AdmCD2. Two days after infection, the target cells are incubated with the infectious culture supernatants, in the presence of antibodies blocking the adenoviruses. Again, although producer cells expressing the CD2 antigen, regardless of the multiplicity of adenoviral infection, were used, transduction appears to be dependent on the multiplicity of infection. The fraction of positive target cells expressing the marker is between 1.5 and 24.3% of the total population (Figure 7A). Cells infected with the supernatant are maintained in culture for an additional three weeks and analyzed for long-term mCD2 antigen expression. Positive cell populations are still detected, confirming that the induction of mCD2 results from retroviral transduction and not from adenoviral transduction.

(Figure 7B).(Figure 7B).

Il faut souligner que les niveaux de mobilisation de mCD2 It should be noted that the levels of mobilization of mCD2

sont comparables à ceux obtenus après l'infection des cellules TeFLY- are comparable to those obtained after infection of TeFLY- cells

GALV avec AdmCD2 seul. Il a été précédemment observé que l'augmentation, tant des fonctions gag-pol que env ou de l'expression du vecteur, n'augmente pas les titres rétroviraux, comparé à ce qui se passe dans les lignées productrices stables. Dans le procédé mis en oeuvre ici, la surexpression des fonctions d'empaquetage et du vecteur rétroviral n'est pas suffisante pour surmonter le phénomène de saturation. Si la cause d'une telle limite reste non déterminée, la flexibilité de notre système de production transitoire nous a permis de sélectionner différentes lignées GALV with AdmCD2 alone. It has previously been observed that the increase in both gag-pol and env functions or in vector expression does not increase retroviral titers, compared to what occurs in stable producer lines. In the method implemented here, the overexpression of the packaging functions and of the retroviral vector is not sufficient to overcome the phenomenon of saturation. While the cause of such a limit remains undetermined, the flexibility of our transient production system has allowed us to select different lines.

cellulaires avec les conditions expérimentales décrites ci-dessus. cells with the experimental conditions described above.

Les lignées cellulaires humaines ont été testées préférentiellement, car les particules produites à partir de telles lignées présentent une sensibilité réduite au complément du sérum. Des lignées A549 infectées par l'adénovirus sont des mauvais candidats, car elles présentent une production faible avec environ 3 % des cellules cibles Human cell lines have been tested preferentially because the particles produced from such lines exhibit reduced sensitivity to serum complement. A549 lines infected with adenovirus are poor candidates because they show low production with about 3% of the target cells

transduites (Figure 7B).transduced (Figure 7B).

En revanche, les cellules HeLa et surtout les cellules d'hépatocarcinomes HuH7 apparaissent être de bons ou même d'excellents producteurs, dans la mesure o 37,6 % et 61,9 % de cellules positives pour mCD2 ont été détectées respectivement dans ces deux On the other hand, HeLa cells and especially HuH7 hepatocarcinoma cells appear to be good or even excellent producers, insofar as 37.6% and 61.9% of mCD2 positive cells were detected respectively in these two.

lignées après incubation avec les surnageants infectieux. lines after incubation with infectious supernatants.

Tant pour les cellules HeLa que pour les cellules HuH7, les populations transduites restent stables après 21 jours de culture in vitro, confirmant que le transfert de gènes mCD2 n'a eu lieu que par le biais de la transduction rétrovirale. Les hauts titres de production de rétrovirus ne semblent pas être reliés à une quelconque permissivité cellulaire particulière à l'infection adénovirale, puisque les essais de production utilisant les cellules Vero hautement productives ne permettent pas d'cbtenir une transduction améliorée du rétrovirus. Au contraire, moins de For both HeLa cells and HuH7 cells, the transduced populations remained stable after 21 days of in vitro culture, confirming that mCD2 gene transfer only took place through retroviral transduction. The high titers of retrovirus production do not appear to be related to any particular cellular permissiveness to adenoviral infection, since production assays using the highly productive Vero cells do not provide improved transduction of the retrovirus. On the contrary, less than

8 % de cellules positives ont été détectées avec les cellules Vero. 8% of positive cells were detected with Vero cells.

Claims (35)

REVENDICATIONS 1. Procédé pour l'établissement d'une lignée cellulaire apte à produire des particules rétrovirales, à un titre supérieur à 106 UI/ml et comprenant les étapes de: (a) sélection d'une lignée cellulaire eucaryote susceptible à l'infection virale, (b) transfection par un vecteur rétroviral porteur d'un transgène sous le contrôle de séquences régulatrices rétrovirales et porteur de la séquence d'encapsidation, et dépourvue des gènes de structure du rétrovirus, ou infection par une particule rétrovirale dont le génome est porteur des séquences équivalentes, (c) infection de ladite lignée par au moins un virus recombinant dépourvu de séquence d'encapsidation et porteur de séquences rétrovirales gag-pol et env, gag-pol et env étant de préférence issues de rétrovirus différents, ou transfection par au moins un vecteur adénoviral porteur des mêmes séquences (d) criblage des lignées productrices au titre recherché, - soit sur la base du titre rétroviral obtenu dans le surnageant cellulaire, - soit sur la base de l'absence de virus helper dans le surnageant. 1. Method for establishing a cell line capable of producing retroviral particles, at a titer greater than 106 IU / ml and comprising the steps of: (a) selecting a eukaryotic cell line susceptible to viral infection , (b) transfection with a retroviral vector carrying a transgene under the control of retroviral regulatory sequences and carrying the packaging sequence, and devoid of the structural genes of the retrovirus, or infection by a retroviral particle of which the genome is a carrier equivalent sequences, (c) infection of said line by at least one recombinant virus lacking an encapsidation sequence and carrying retroviral sequences gag-pol and env, gag-pol and env preferably originating from different retroviruses, or transfection by at least one adenoviral vector carrying the same sequences (d) screening for the lines producing the desired titre, - either on the basis of the retroviral titre obtained in the cell supernatant, - so it based on the absence of helper virus in the supernatant. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce2. Method according to claim 1, characterized in that que la lignée cellulaire est d'origine hépatique ou embryonnaire. whether the cell line is of hepatic or embryonic origin. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce 3. Method according to claim 1, characterized in that que le transgène est un gène rapporteur. that the transgene is a reporter gene. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, 4. Method according to one of claims 1 or 2, caractérisé en ce que dans l'étape (c) gag-pol et env sont portés par deux characterized in that in step (c) gag-pol and env are carried by two vecteurs différents ou deux constructions virales différentes. different vectors or two different viral constructs. 5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le ou les vecteurs viraux ou les virus sont d'origine adénovirale ou baculovirale. 5. Method according to claim 1, characterized in that the viral vector (s) or viruses are of adenoviral or baculoviral origin. 6. Procédé de production de rétrovirus recombinants o0 porteurs de gènes d'intérêt à un titre égal ou supérieur à 106 UI/ml, comprenant: (a) sélection d'une lignée cellulaire eucaryote susceptible à l'infection virale, (b) transfection par un vecteur porteur d'un gène d'intérêt sous le contrôle de séquences régulatrices rétrovirales et porteur de la séquence d'encapsidation, et dépourvue des gènes de structure du rétrovirus, ou infection par une particule rétrovirale dont le génome est porteur des mêmes séquences que ledit vecteur, (c) infection de ladite lignée par au moins un virus recombinant dépourvu de séquence psi et porteur de séquences rétrovirales gag-pol et env, gag-pol et env étant de préférence issues de rétrovirus différents, ou transfection par au moins un vecteur adénoviral porteur des mêmes séquences, (d) la culture de ces cellules dans un milieu approprié à la6. Process for the production of recombinant retroviruses carrying genes of interest at a titre equal to or greater than 106 IU / ml, comprising: (a) selection of a eukaryotic cell line susceptible to viral infection, (b) transfection by a vector carrying a gene of interest under the control of retroviral regulatory sequences and carrying the packaging sequence, and devoid of the structural genes of the retrovirus, or infection by a retroviral particle whose genome carries the same sequences that said vector, (c) infection of said line by at least one recombinant virus devoid of psi sequence and carrying retroviral sequences gag-pol and env, gag-pol and env preferably originating from different retroviruses, or transfection by at least an adenoviral vector carrying the same sequences, (d) culturing these cells in a medium suitable for the récolte des particules rétrovirales porteuses du transgène. harvesting of the retroviral particles carrying the transgene. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce 7. Method according to claim 6, characterized in that que les étapes (b) et (c) sont successives. that steps (b) and (c) are successive. 8. Procçédé selon la revendication 6, caractérisé en ce 8. Method according to claim 6, characterized in that que les étapes (b) et (c) sont simultanées. that steps (b) and (c) are simultaneous. 9. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le vecteur en (b) est un vecteur adénoviral ou baculoviral. 9. The method of claim 6, characterized in that the vector in (b) is an adenoviral or baculoviral vector. 10. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce10. The method of claim 6, characterized in that que le vecteur en (b) est un vecteur rétroviral. that the vector in (b) is a retroviral vector. 11. Procédé selon l'une des revendications 6 à 10, 11. Method according to one of claims 6 to 10, caractérisé en ce que le vecteur non rétroviral en (c) est un vecteur adénoviral. characterized in that the non-retroviral vector in (c) is an adenoviral vector. 12. Procédé selon l'une des revendications 6 à 10, 12. Method according to one of claims 6 to 10, caractérisé en ce que le vecteur non rétroviral en (c) est un baculovirus. characterized in that the non-retroviral vector in (c) is a baculovirus. 13. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que les séquences rétrovirales gag-pol et env sont portées par deux 13. The method of claim 6, characterized in that the retroviral sequences gag-pol and env are carried by two vecteurs distincts.distinct vectors. 14. Procédé selon l'une des revendications 6 à 13, 14. Method according to one of claims 6 to 13, caractérisé en ce que gag-pol est issu du MoMLV et est sous le contrôle du characterized in that gag-pol is derived from MoMLV and is under the control of promoteur du CMV.promoter of CMV. 15. Procédé selon l'une des revendications 6 à 14, 15. Method according to one of claims 6 to 14, caractérisé en ce que env est issu du GaLV et est sous le contrôle du characterized in that env is from GaLV and is under the control of promoteur EF1.promoter EF1. 16. Procédé selon l'une des revendications 6 à 14, 16. Method according to one of claims 6 to 14, caractérisé en ce que le transgène est sous le contrôle d'un LTR rétroviral. characterized in that the transgene is under the control of a retroviral LTR. 17. Procédé selon l'une des revendications 6 à 14, 17. Method according to one of claims 6 to 14, caractérisé en ce que le transgène est sous le contrôle d'un promoteur interne. characterized in that the transgene is under the control of an internal promoter. 18. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce18. The method of claim 6, characterized in that que les cellules eucaryotes sont des cellules hépatiques. that eukaryotic cells are liver cells. 19. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce 19. The method of claim 6, characterized in that que les cellules eucaryotes sont des cellules embryonnaires. that eukaryotic cells are embryonic cells. 20. Procédé selon la revendication 18, caractérisé en ce 20. The method of claim 18, characterized in that que les cellules sont des cellules HuH7. that the cells are HuH7 cells. 21. Lignée cellulaire hépatique HuH7 dans laquelle ont été transférées par transfection ou infection des fonctions rétrovirales d'encapsidation, des fonctions rétrovirales de régulation, et des sites de 21. HuH7 hepatic cell line into which were transferred by transfection or infection retroviral packaging functions, retroviral regulatory functions, and sites of. restriction permettant l'insertion d'un transgène. restriction allowing the insertion of a transgene. 22. Trousse pour la production de particules rétrovirales porteuses d'un transgène comprenant au moins: (a) un récipient contenant un virus non rétroviral ou un plasmide porteur d'un gène gag-pol, (b) un ou plusieurs récipients contenant un virus non rétroviral ou un plasmide viral porteur d'un gène env, (c) un ou plusieurs récipients contenant un plasmide porteur d'un vecteur rétroviral, ou un rétrovirus défectif ou contenant un virus non rétroviral contenant au moins la séquence d'encapsidation, les séquences régulatrices, et des sites multiples de restriction permettant l'insertion d'un transgène, (d) le cas échéant, un récipient contenant un plasmide contrôle porteur d'un vecteur rétroviral, contenant au moins un gène rapporteur. 22. Kit for the production of retroviral particles carrying a transgene comprising at least: (a) a container containing a non-retroviral virus or a plasmid carrying a gag-pol gene, (b) one or more containers containing a virus non-retroviral or a viral plasmid carrying an env gene, (c) one or more receptacles containing a plasmid carrying a retroviral vector, or a defective retrovirus or containing a non-retroviral virus containing at least the packaging sequence, the regulatory sequences, and multiple restriction sites allowing the insertion of a transgene, (d) where appropriate, a container containing a control plasmid carrying a retroviral vector, containing at least one reporter gene. 23. Trousse selon la revendication 22, caractérisée en ce23. Kit according to claim 22, characterized in that que les virus ou plasmides en (a), (b), (c) et (d) sont sous forme congelée. that the viruses or plasmids in (a), (b), (c) and (d) are in frozen form. 24. Trousse selon la revendication 22 ou 23, caractérisée en ce que en (a), gag-pol est issu du MoMLV et est sous le contrôle du 24. Kit according to claim 22 or 23, characterized in that in (a), gag-pol is derived from MoMLV and is under the control of promoteur du CMV.promoter of CMV. 25. Trousse selon l'une des revendications 22 à 24, 25. Kit according to one of claims 22 to 24, caractérisée en ce que en (b), env est issu du GaLV et est sous le contrôle characterized in that in (b), env is from GaLV and is under the control du promoteur EF1.of the EF1 promoter. 26. Trousse selon l'une des revendications 22 à 25, 26. Kit according to one of claims 22 to 25, caractérisée en ce que en (c), LTR et la séquence'psi issues de rétrovirus murins. characterized in that in (c), LTR and the psi sequence derived from murine retroviruses. 27. Trousse selon l'une des revendications 22 à 26, 27. Kit according to one of claims 22 to 26, caractérisée en ce que en (c), le plasmide portant le vecteur rétroviral characterized in that in (c), the plasmid carrying the retroviral vector contient en outre un marqueur de sélection. additionally contains a selection marker. 28. Trousse selon l'une des revendications précédentes, 28. Kit according to one of the preceding claims, caractérisée en ce que le virus en a) ou en b) est un adénovirus. characterized in that the virus in a) or in b) is an adenovirus. 29. Trousse selon l'une des revendications précédentes, 29. Kit according to one of the preceding claims, caractérisée en ce que le virus en a) ou en b) est un baculovirus. characterized in that the virus in a) or in b) is a baculovirus. 30. Trousse pour l'établissement d'une lignée productrice de particules rétrovirales à un titre égal ou supérieur à 106 UI/ml, comprenant au moins: (a) un récipient contenant un virus non rétroviral ou un plasmide porteur d'un gène gag-pol, (b) un ou plusieurs récipients contenant un virus non retroviral ou un plasmide porteur d'un gène env, (c) un ou plusieurs récipients contenant un plasmide porteur d'un vecteur rétroviral, ou un rétrovirus défectif ou un virus non rétroviral contenant au moins la séquence d'encapsidation, les séquences 30. Kit for the establishment of a line producing retroviral particles at a titre equal to or greater than 106 IU / ml, comprising at least: (a) a container containing a non-retroviral virus or a plasmid carrying a gag gene -pol, (b) one or more receptacles containing a non-retroviral virus or a plasmid carrying an env gene, (c) one or more receptacles containing a plasmid carrying a retroviral vector, or a defective retrovirus or a non-viral virus. retroviral containing at least the packaging sequence, the sequences régulatrices, et un gène reporteur. regulators, and a reporter gene. 31. Trousse selon la revendication 30, caractérisée en ce que 31. Kit according to claim 30, characterized in that le virus est un adénovirus ou un baculovirus. the virus is an adenovirus or a baculovirus. 32. Trousse selon la revendication 30, caractérisée en ce 32. Kit according to claim 30, characterized in that que les virus ou plasmides en (a), (b), (c) sont sous forme congelée. that the viruses or plasmids in (a), (b), (c) are in frozen form. 33. Trousse selon l'une des revendications 30 à 32, 33. Kit according to one of claims 30 to 32, caractérisée en ce que en (a), gag-pol est issu du MoMLV et est sous le characterized in that in (a), gag-pol is derived from MoMLV and is under the contrôle du promoteur du CMV.control of the CMV promoter. 34. Trousse selon l'une des revendications 30 à 33, 34. Kit according to one of claims 30 to 33, caractérisée en ce que en (b), env est issu du GaLV et est sous le contrôle characterized in that in (b), env is from GaLV and is under the control du promoteur EF1.of the EF1 promoter. 35. Trousse selon l'une des revendications 30 à 33, 35. Kit according to one of claims 30 to 33, caractérisée en ce que en (c), le plasmide portant le vecteur rétroviral characterized in that in (c), the plasmid carrying the retroviral vector contient en outre un marqueur de sélection. additionally contains a selection marker.