FR2777291A1 - NOVEL MEMBRANE METALLOPROTEASE NEP II AND ITS USE FOR THE SCREENING OF INHIBITORS USEFUL IN THERAPY - Google Patents
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Abstract
Description
La présente invention a pour objet une nouvelle métalloprotéase membranaire appelée NEP II et son utilisation, notamment pour le criblage d'inhibiteurs utiles en thérapie. The present invention relates to a new membrane metalloprotease called NEP II and its use, in particular for the screening of inhibitors useful in therapy.
Les métalloprotéases membranaires telles que le néprilysine (NEP
I, EC 3.4.24.11) jouent un rôle important dans l'activation ou l'inactivation des messagers peptidiques neuronaux ou hormonaux. Leur inhibition sélective par des composés synthétiques a déjà conduit à des médicaments couramment utilisés en thérapeutique ou en cours de développement clinique, notamment dans les domaines gastroentérologique (Baumer et coll., Gut, 1992, 33 . 753758) et cardiovasculaire (Gros et coll., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, 88 4210-4214). L'isolement des ADNc de gènes de nouvelles métalloprotéases apparentées est de nature à permettre le développement de nouvelles classes d'inhibiteurs spécifiques à applications thérapeutiques prometteuses. C'est ainsi que le clonage et l'expression du gène de l'enzyme de conversion de l'endothéline (ECE) (Xu et coll., Cell, 1994, 78 : 473485) a permis la mise au point d'inhibiteurs potentiellement utiles dans certaines affections cardiovasculaires.Membrane metalloproteases such as neprilysine (NEP
I, EC 3.4.24.11) play an important role in the activation or inactivation of neuronal or hormonal peptide messengers. Their selective inhibition by synthetic compounds has already led to drugs commonly used in therapy or during clinical development, in particular in the gastroenterological (Baumer et al., Gut, 1992, 33. 753758) and cardiovascular (Gros et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, 88 4210-4214). The isolation of cDNAs from genes of new related metalloproteases is likely to allow the development of new classes of specific inhibitors with promising therapeutic applications. Thus, the cloning and expression of the gene for the endothelin converting enzyme (ECE) (Xu et al., Cell, 1994, 78: 473485) has made it possible to develop inhibitors potentially useful in certain cardiovascular conditions.
Les travaux des inventeurs ayant conduit à la présente invention ont mis en évidence une nouvelle métalloprotéase membranaire appartenant à la famille ECEINEPIKell (Lee S. et coll., 1991, PNAS 88(14):6353-57), qu'ils ont appelée NEP II. The work of the inventors which led to the present invention has revealed a new membrane metalloprotease belonging to the ECEINEPIKell family (Lee S. et al., 1991, PNAS 88 (14): 6353-57), which they have called NEP II.
La présente invention a donc pour objet un polypeptide isolé dont la séquence d'acides aminés est choisie parmi la séquence SEQ ID n"2, une séquence dérivée ou homologue de ladite séquence SEQ ID n"2, ou un fragment biologiquement actif de ladite séquence SEQ ID n"2, ledit polypeptide isolé étant désigné par NEP Il
La séquence SEQ ID n" 2 est la séquence d'acides aminés de
NEP II identifiée chez le rat.The subject of the present invention is therefore an isolated polypeptide whose amino acid sequence is chosen from the sequence SEQ ID n "2, a sequence derived from or homologous to said sequence SEQ ID n" 2, or a biologically active fragment of said sequence SEQ ID No. 2, said isolated polypeptide being designated by NEP II
The sequence SEQ ID No. 2 is the amino acid sequence of
NEP II identified in rats.
Par polypeptide "dérivé", on entend tout polypeptide résultant d'une modification de nature génétique etlou chimique de la séquence SEQ ID n" 2, c'est-à-dire par mutation, délétion, addition, substitution et/ou modification chimique d'au moins un acide aminé, ou toute isoforme ayant une séquence identique à la séquence SEQ ID n" 2 mais contenant au moins un acide aminé sous la forme D. By "derived" polypeptide is meant any polypeptide resulting from a modification of a genetic and / or chemical nature of the sequence SEQ ID No. 2, that is to say by mutation, deletion, addition, substitution and / or chemical modification d '' at least one amino acid, or any isoform having a sequence identical to the sequence SEQ ID n "2 but containing at least one amino acid in the D form.
Par polypeptide "homologue", on entend plus particulièrement tout polypeptide isolable chez d'autres espèces de mammifères que le rat, et notamment chez l'homme. The term “homologous” polypeptide means more particularly any polypeptide which can be isolated from other mammalian species than the rat, and in particular from humans.
Lesdits polypeptides homologues présentent préférentiellement une homologie de séquence supérieure à 80 %, de préférence encore supérieure à 85 %, avec la séquence SEQ ID n" 2 complète, l'homologie étant particulièrement élevée dans la partie centrale dudit polypeptide. Said homologous polypeptides preferably have a sequence homology greater than 80%, more preferably still greater than 85%, with the complete sequence SEQ ID No. 2, the homology being particularly high in the central part of said polypeptide.
Lesdits polypeptides dérivés, homologues ou les fragments polypeptidiques du polypeptide de séquence SEQ ID n" 2 sont biologiquement actifs, c'est-à-dire présentent des propriétés biologiques identiques ou similaires des propriétés biologiques du polypeptide NEP II de séquence SEQ ID n" 2, à savoir une activité métalloprotéasique. Said polypeptides derived, homologous or the polypeptide fragments of the polypeptide of sequence SEQ ID n "2 are biologically active, that is to say have biological properties identical or similar to the biological properties of the NEP II polypeptide of sequence SEQ ID n" 2 , namely a metalloprotease activity.
Les fragments polypeptidiques préférés comprennent la séquence du site actif responsable de la liaison de l'atome de zinc indispensable à la catalyse. Ce site actif a été identifié comme englobant les résidus HEX1X2H, X1 et X2 représentant des acides aminés variables. Il s'agit en particulier de la séquence HEITH (acides aminés 608 à 612 de la séquence SEQ ID n" 2) dans le polypeptide NEP II chez le rat. Preferred polypeptide fragments include the sequence of the active site responsible for binding the zinc atom essential for catalysis. This active site has been identified as including the residues HEX1X2H, X1 and X2 representing variable amino acids. It is in particular the sequence HEITH (amino acids 608 to 612 of the sequence SEQ ID No. 2) in the NEP II polypeptide in rats.
La présente invention a également pour objet une séquence nucléotidique isolée comprenant une séquence choisie parmi la séquence SEQ
ID n 1, une séquence dérivée ou homologue de ladite séquence SEQ ID n 1, ou leurs séquences complémentaires.The present invention also relates to an isolated nucleotide sequence comprising a sequence chosen from the sequence SEQ
ID no 1, a sequence derived from or homologous to said sequence SEQ ID no 1, or their complementary sequences.
La séquence SEQ ID n" 1 est la séquence d'ADNc comprenant la phase codante pour NEP II identifiée chez le rat. The sequence SEQ ID No. 1 is the cDNA sequence comprising the coding phase for NEP II identified in the rat.
Par séquence nucléotidique "dérivée", on entend toute séquence nucléotidique codant pour un polypeptide dérivé de NEP II tel que défini précédemment, c'est-à-dire une séquence résultant d'une modification de la séquence SEQ ID n" 1, notamment par mutation, délétion, addition ou substitution d'au moins un nucléotide. Sont en particulier comprises les séquences dérivées de la séquence SEQ ID n" 1 par dégénérescence du code génétique. The term "derived" nucleotide sequence means any nucleotide sequence encoding a polypeptide derived from NEP II as defined above, that is to say a sequence resulting from a modification of the sequence SEQ ID n "1, in particular by mutation, deletion, addition or substitution of at least one nucleotide. In particular, the sequences derived from the sequence SEQ ID No. 1 by degeneration of the genetic code are included.
Par séquence "homologue", on entend plus particulièrement toute séquence nucléotidique codant pour un polypeptide NEP II homologue du polypeptide NEP Il de séquence SEQ ID n" 2 chez d'autres espèces de mammifères que le rat, et notamment chez l'homme. By “homologous” sequence is meant more particularly any nucleotide sequence coding for a NEP II polypeptide homologous to the NEP II polypeptide of sequence SEQ ID No. 2 in other mammalian species than the rat, and in particular in humans.
Une telle séquence homologue présente préférentiellement une homologie supérieure à 70 %, de préférence encore supérieure à 75 %, avec la séquence SEQ ID n" 1,1'homologie étant particulièrement élevée dans la partie centrale de la séquence codant pour le polypeptide NEP II. Such a homologous sequence preferably has a homology greater than 70%, more preferably greater than 75%, with the sequence SEQ ID n "1,1 homology being particularly high in the central part of the sequence coding for the NEP II polypeptide.
Les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent être utilisées pour la production d'une protéine recombinante NEP II selon l'invention, selon des techniques de production de produits recombinants connues de l'homme du métier. The nucleotide sequences according to the invention can be used for the production of a recombinant NEP II protein according to the invention, according to techniques for the production of recombinant products known to those skilled in the art.
Un système efficace de production d'une protéine recombinante nécessite de disposer d'un vecteur, par exemple d'origine plasmidique ou virale, et d'une cellule hôte compatible. An efficient system for producing a recombinant protein requires a vector, for example of plasmid or viral origin, and a compatible host cell.
L'hôte cellulaire peut être choisi parmi des systèmes procaryotes, comme les bactéries, ou eucaryotes, comme par exemple des levures, des cellules d'insectes, de mammifères, telles que les cellules CHO (cellules d'ovaires de hamster chinois) ou tout autre système avantageusement disponible. The cellular host can be chosen from prokaryotic systems, such as bacteria, or eukaryotic systems, such as, for example, yeasts, insect or mammalian cells, such as CHO cells (Chinese hamster ovary cells) or any another system advantageously available.
Le vecteur doit comporter un promoteur, des signaux d'initiation et de terminaison de la traduction, ainsi que les régions appropriées de régulation de la transcription. II doit pouvoir être intégré dans la cellule et peut éventuellement posséder des signaux particuliers spécifiant la sécrétion de la protéine traduite. The vector must include a promoter, translation initiation and termination signals, as well as the appropriate regions for transcription regulation. It must be able to be integrated into the cell and may possibly have particular signals specifying the secretion of the translated protein.
Ces différents signaux de contrôle sont choisis en fonction de l'hôte cellulaire utilisé. A cet effet, les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent être insérées dans des vecteurs à réplication autonome au sein de l'hôte choisi, ou des vecteurs intégratifs de l'hôte choisi. De tels vecteurs seront préparés selon les méthodes couramment utilisées par l'homme du métier, et les clones en résultant peuvent être introduits dans un hôte approprié par des méthodes standard, telles que par exemple l'électroporation. These different control signals are chosen according to the cellular host used. To this end, the nucleotide sequences according to the invention can be inserted into vectors with autonomous replication within the chosen host, or integrative vectors of the chosen host. Such vectors will be prepared according to the methods commonly used by those skilled in the art, and the resulting clones can be introduced into an appropriate host by standard methods, such as for example electroporation.
Des exemples de vecteurs d'intérêt sont les plasmides pcDNA 3.1. Examples of vectors of interest are the plasmids pcDNA 3.1.
PCR2.1 (Invitrogen), ou pMbac (Stratagene).PCR2.1 (Invitrogen), or pMbac (Stratagene).
L'invention vise les vecteurs de clonage et/ou d'expression contenant une séquence nucléotidique selon l'invention, et vise en outre les cellules hôtes transfectées par ces vecteurs. Ces cellules peuvent être obtenues par l'introduction dans des cellules hôtes d'une séquence nucléotidique insérée dans un vecteur tel que défini ci-dessus, puis la mise en culture desdites cellules dans des conditions permettant la réplication et/ou l'expression de la séquence nucléotidique transfectée. The invention relates to the cloning and / or expression vectors containing a nucleotide sequence according to the invention, and further relates to the host cells transfected with these vectors. These cells can be obtained by introducing into host cells a nucleotide sequence inserted into a vector as defined above, then culturing said cells under conditions allowing replication and / or expression of the transfected nucleotide sequence.
Ces cellules sont utilisables dans une méthode de production d'un polypeptide recombinant selon l'invention. These cells can be used in a method for producing a recombinant polypeptide according to the invention.
La méthode de production d'un polypeptide de l'invention sous forme recombinante est elle-même comprise dans la présente invention, et se caractérise en ce que l'on cultive les cellules transfectées dans des conditions permettant l'expression d'un polypeptide recombinant selon l'invention, et que l'on récupère ledit polypeptide recombinant. The method for producing a polypeptide of the invention in recombinant form is itself included in the present invention, and is characterized in that the transfected cells are cultured under conditions allowing the expression of a recombinant polypeptide according to the invention, and that said recombinant polypeptide is recovered.
Les procédés de purification utilisés sont connus de l'homme du métier. Le polypeptide recombinant peut être purifié à partir de lysats et extraits cellulaires, du surnageant du milieu de culture, par des méthodes utilisées séparément ou en combinaison, telles que le fractionnement, les méthodes de chromatographie, les techniques d'immunoaffinité à l'aide d'anticorps monoclonaux ou de sérum polyclonal, etc. The purification methods used are known to those skilled in the art. The recombinant polypeptide can be purified from lysates and cell extracts, from the culture medium supernatant, by methods used separately or in combination, such as fractionation, chromatography methods, immunoaffinity techniques using monoclonal antibodies or polyclonal serum, etc.
La présente invention a également pour objet les sondes nucléotidiques, capables de s'hybrider fortement et spécifiquement avec une séquence d'acide nucléique, d'un ADN génomique ou d'un ARN messager, codant pour un polypeptide selon l'invention. Les conditions d'hybridation appropriées correspondent aux conditions de température et de force ionique usuellement utilisées par l'homme du métier (Sambrook et al., 1989), de préférence à des conditions de forte stringence, c'est-à-dire des conditions de température comprises entre (Tm moins 5 C) et (Tm moins 15 C) et de préférence encore, à des conditions de température comprises entre Tm et (Tm moins 10 C) (forte stringence), Tm étant la température théorique de fusion, définie comme étant la température à laquelle 50 % des brins appariés se séparent. The present invention also relates to nucleotide probes, capable of strongly and specifically hybridizing with a nucleic acid sequence, of a genomic DNA or of a messenger RNA, coding for a polypeptide according to the invention. The appropriate hybridization conditions correspond to the temperature and ionic strength conditions usually used by those skilled in the art (Sambrook et al., 1989), preferably to high stringency conditions, that is to say conditions of temperature between (Tm minus 5 C) and (Tm minus 15 C) and more preferably, at temperature conditions between Tm and (Tm minus 10 C) (high stringency), Tm being the theoretical melting temperature, defined as the temperature at which 50% of the paired strands separate.
Les sondes préférées sont notamment les sondes oligonucléotidiques choisies parmi les séquences :
- SEQ ID n 3;
- SEQ ID n 4 ;
- SEQ ID n 5 ;
- SEQ ID n 6 ;
- SEQ ID n 7 ;
- SEQ ID n 8 ;
- SEQ ID n 9 ;
- SEQ ID n 10 ;
- SEQ ID n 11 ;
- SEQ ID n 12 ;
- SEQ ID n 13 ;
- SEQ ID n 14 ;
- SEQ ID n 15 ;
- SEQ ID n 16 ;
- SEQ ID n 17 ;
- SEQ ID n 18 ;
- SEQ ID n 19 .The preferred probes are in particular the oligonucleotide probes chosen from the sequences:
- SEQ ID No. 3;
- SEQ ID No. 4;
- SEQ ID No. 5;
- SEQ ID No. 6;
- SEQ ID No. 7;
- SEQ ID No. 8;
- SEQ ID No. 9;
- SEQ ID No. 10;
- SEQ ID No. 11;
- SEQ ID No. 12;
- SEQ ID No. 13;
- SEQ ID No. 14;
- SEQ ID No. 15;
- SEQ ID No. 16;
- SEQ ID No. 17;
- SEQ ID No. 18;
- SEQ ID No. 19.
De telles sondes sont utiles pour des réactions de séquençage ou d'amplification spécifique selon la technique dite de PCR (réaction en chaîne par polymérase) ou toute autre variante de celle-ci. Such probes are useful for specific sequencing or amplification reactions according to the technique known as PCR (polymerase chain reaction) or any other variant thereof.
De telles sondes sont également utiles dans un procédé de détection de l'expression du polypeptide NEP II dans un échantillon cellulaire ou tissulaire ou dans des cellules ou un tissu par hybridation in situ, comprenant les étapes consistant à:
- préparer 'ARN dudit échantillon ou desdites cellules ou dudit tissu;
- mettre en contact ledit ARN obtenu avec au moins une sonde ayant une séquence nucléotidique capable de s'hybrider spécifiquement avec une séquence nucléotidique selon l'invention, ladite sonde pouvant être notamment une sonde oligonucléotidique de séquence SEQ ID n" 3 à SEQ ID n" 19;
- détecter la présence d'ARNm hybridant avec ladite sonde indicatrice de l'expression du polypeptide NEP II. Such probes are also useful in a method for detecting the expression of the NEP II polypeptide in a cell or tissue sample or in cells or tissue by in situ hybridization, comprising the steps consisting in:
- Prepare the RNA of said sample or said cells or said tissue;
- bringing said RNA obtained into contact with at least one probe having a nucleotide sequence capable of hybridizing specifically with a nucleotide sequence according to the invention, said probe possibly being in particular an oligonucleotide probe of sequence SEQ ID n "3 to SEQ ID n "19;
- detect the presence of mRNA hybridizing with said probe indicative of the expression of the NEP II polypeptide.
L'invention a également pour objet les anticorps mono- ou polyclonaux ou leurs fragments, anticorps chimériques ou immunoconjugués, caractérisés en ce qu'ils sont obtenus à partir d'un polypeptide selon l'invention administré à un animal, et sont capables de reconnaître spécifiquement un polypeptide selon l'invention. L'invention a en outre pour objet l'utilisation de ces anticorps pour la purification ou la détection d'un polypeptide NEP II dans un échantillon biologique. A subject of the invention is also the mono- or polyclonal antibodies or their fragments, chimeric or immunoconjugate antibodies, characterized in that they are obtained from a polypeptide according to the invention administered to an animal, and are capable of recognizing specifically a polypeptide according to the invention. The invention further relates to the use of these antibodies for the purification or the detection of a NEP II polypeptide in a biological sample.
Les anticorps polyclonaux peuvent être obtenus à partir du sérum d'un animal immunisé contre la protéine NEP II, produite par exemple par recombinaison génétique suivant la méthode décrite ci-dessus, selon les modes opératoires usuels. The polyclonal antibodies can be obtained from the serum of an animal immunized against the NEP II protein, produced for example by genetic recombination according to the method described above, according to the usual procedures.
Les anticorps monoclonaux peuvent être obtenus selon la méthode classique de culture d'hybridomes décrite par Kôhler et Milstein (Nature, 1975, vol. 256, pp 495-497). The monoclonal antibodies can be obtained according to the conventional method of culture of hybridomas described by Kôhler and Milstein (Nature, 1975, vol. 256, pp 495-497).
Les anticorps peuvent être des anticorps chimériques, des anticorps humanisés, des fragments Fab et F(ab')2. Ils peuvent également se présenter sous forme d'immunoconjugués ou d'anticorps marqués. The antibodies can be chimeric antibodies, humanized antibodies, Fab and F (ab ') 2 fragments. They can also be in the form of immunoconjugates or labeled antibodies.
Les anticorps selon l'invention sont particulièrement utiles pour détecter la présence de NEP II. The antibodies according to the invention are particularly useful for detecting the presence of NEP II.
La présente invention a donc pour objet un procédé de détection immunologique de NEP II dans un échantillon cellulaire ou tissulaire ou dans des cellules ou un tissu comprenant les étapes consistant à:
- mettre en contact ledit échantillon cellulaire ou tissulaire, lesdites cellules ou ledit tissu avec un anticorps détectable selon l'invention
- détecter la présence dudit anticorps, indicatrice de la présence du
polypeptide NEP II.The present invention therefore relates to a method for the immunological detection of NEP II in a cell or tissue sample or in cells or tissue comprising the steps consisting in:
- contacting said cell or tissue sample, said cells or said tissue with a detectable antibody according to the invention
- detect the presence of said antibody, indicative of the presence of
NEP II polypeptide.
Par "anticorps détectable", on entend soit un anticorps marqué par
un groupement détectable, tel qu'un groupement radioactif, enzymatique,
fluorogène ou fluorescent, etc., soit un anticorps auquel se lie un autre anticorps
lui-même marqué de manière détectable.By "detectable antibody" is meant either an antibody labeled with
a detectable group, such as a radioactive, enzymatic group,
fluorogenic or fluorescent, etc., or an antibody to which another antibody binds
itself detectably marked.
Les anticorps selon l'invention peuvent ainsi permettre d'évaluer
une surexpression du polypeptide Il, qui peut être indicatrice de cellules
tumorales neuroendocriniennes notamment.The antibodies according to the invention can thus make it possible to evaluate
overexpression of polypeptide II, which may be indicative of cells
neuroendocrine tumors in particular.
L'invention a également pour objet un procédé d'identification de
composés substrats du polypeptide NEP II tel que défini précédemment, dans
lequel on met en contact lesdits composés, éventuellement marqués, avec le
polypeptide NEP II, et on évalue la coupure desdits composés par NEP Il,
indicatrice de l'activité métalloprotéasique de NEP II envers lesdits composés substrats.The invention also relates to a method for identifying
substrate compounds of the NEP II polypeptide as defined above, in
which puts said compounds, possibly labeled, in contact with the
NEP II polypeptide, and the cleavage of said compounds is evaluated by NEP II,
indicative of the NEP II metalloprotease activity towards said substrate compounds.
De tels substrats spécifiques de NEP II peuvent être en particulier utilisés dans un procédé de détection de l'activité métalloprotéasique de NEP II dans un échantillon cellulaire ou tissulaire ou dans des cellules ou un tissu comprenant les étapes consistant à:
- mettre en contact ledit échantillon cellulaire ou tissulaire, lesdites
cellules ou ledit tissu avec un composé substrat du polypeptide NEP Il
obtenu selon l'invention, ledit composé substrat étant éventuellement
marqué;
- évaluer la coupure dudit composé substrat, indicatrice de l'activité métalloprotéasique de NEP II.Such specific NEP II substrates can in particular be used in a method for detecting the metalloprotease activity of NEP II in a cell or tissue sample or in cells or tissue comprising the steps consisting in:
- contacting said cell or tissue sample, said
cells or said tissue with a substrate compound of the NEP II polypeptide
obtained according to the invention, said substrate compound being optionally
Mark;
- Evaluate the cleavage of said substrate compound, indicative of the metalloprotease activity of NEP II.
Les cellules susceptibles d'être ainsi testées sont notamment les cellules transfectées par un polynucléotide codant pour le polypeptide NEP II tel que défini précédemment. Les extraits tissulaires susceptibles d'être testés sont en particulier les membranes de testicule, particulièrement riches en métalloprotéase NEP II. The cells capable of being thus tested are in particular cells transfected with a polynucleotide coding for the NEP II polypeptide as defined above. The tissue extracts capable of being tested are in particular the testicle membranes, which are particularly rich in NEP II metalloprotease.
L'invention a par ailleurs pour objet un procédé de criblage de composés susceptibles d'inhiber l'activité métalloprotéasique du polypeptide
NEP II selon l'invention, dans lequel on met en contact lesdits composés avec ledit polypeptide NEP Il et on évalue le taux d'inhibition de l'activité métalloprotéasique de NEP II.The subject of the invention is also a method for screening for compounds capable of inhibiting the metalloprotease activity of the polypeptide
NEP II according to the invention, in which said compounds are brought into contact with said NEP II polypeptide and the rate of inhibition of the metalloprotease activity of NEP II is evaluated.
Les composés susceptibles d'inhiber l'activité métalloprotéasique de NEP II sont de préférence des peptides courts de 2 ou 3 acides aminés naturels ou modifiés. The compounds capable of inhibiting the metalloprotease activity of NEP II are preferably short peptides of 2 or 3 natural or modified amino acids.
Les peptides synthétiques identifiés comme inhibiteurs de l'activité métalloprotéasique de NEP II par ce procédé de criblage peuvent être couplés à un groupe chélateur de zinc tels que les groupes thiol, phosphate ou acide hydroxamique, selon les techniques classiques connues de l'homme du métier. The synthetic peptides identified as inhibitors of the metalloprotease activity of NEP II by this screening method can be coupled to a zinc chelating group such as the thiol, phosphate or hydroxamic acid groups, according to the conventional techniques known to those skilled in the art. .
Le composé inhibiteur obtenu est un bon candidat en tant que principe actif d'un médicament, en association avec un véhicule pharamceutiquement acceptable.The resulting inhibitor compound is a good candidate as an active ingredient in a drug, in combination with a pharamceutically acceptable vehicle.
Ledit groupe chélateur peut éventuellement être protégé de manière transitoire, par exemple par un ester de thiol, pour améliorer la biodisponibilité dudit principe actif.Said chelating group can optionally be protected transiently, for example with a thiol ester, to improve the bioavailability of said active principle.
Le polypeptide NEP II selon l'invention est particulièrement utile pour le criblage de composés inhibiteurs de l'activité métalloprotéasique de NEP II utiles pour la fabrication de médicament destiné à traiter les troubles impliquant les transmissions peptidergiques auxquelles participe NEP II. The NEP II polypeptide according to the invention is particularly useful for the screening of compounds inhibiting the metalloprotease activity of NEP II useful for the manufacture of a medicament intended for treating disorders involving peptidergic transmissions in which NEP II participates.
Parmi les troubles en cause, on peut citer notamment les maladies cardiovasculaires, neurodégénératives, les troubles de la croissance d'origine endocrinienne, les perturbations de l'axe hypothalamo-hypophysaire et les affections endocriniennes. Among the disorders in question, mention may be made in particular of cardiovascular and neurodegenerative diseases, growth disorders of endocrine origin, disturbances of the hypothalamic-pituitary axis and endocrine affections.
Les composés substrats de NEP Il ou inhibiteurs de l'activité métalloprotéasique de NEP II obtenus selon les procédés décrits précédemment peuvent également être utiles pour détecter la protéine NEP II. The NEP II substrate compounds or inhibitors of NEP II metalloprotease activity obtained according to the methods described above can also be useful for detecting the NEP II protein.
La présente invention a donc également pour objet un procédé de détection de NEP II dans un échantillon cellulaire ou tissulaire ou dans des cellules ou un tissu comprenant les étapes consistant à:
- mettre en contact ledit échantillon cellulaire ou tissulaire, lesdites cellules ou ledit tissu avec un composé substrat du polypeptide NEP II obtenu tel que défini précédemment ou avec un composé inhibiteur de l'activité métalloprotéasique de NEP II obtenu selon le procédé de criblage tel que défini précédemment, ledit composé substrat ou ledit composé inhibiteur étant marqué;
- détecter la présence dudit composé substrat ou dudit composé inhibiteur, indicatrice de la présence du polypeptide NEP II
Par "composé substrat marqué" ou "inhibiteur marqué", on entend un composé substrat ou un composé inhibiteur marqué de manière détectable, par exemple par un groupement radioactif, enzymatique, fluorogène ou fluorescent, etc.The present invention therefore also relates to a method for detecting NEP II in a cell or tissue sample or in cells or tissue comprising the steps consisting in:
- bringing said cell or tissue sample, said cells or said tissue into contact with a substrate compound of the NEP II polypeptide obtained as defined above or with a compound inhibiting the metalloprotease activity of NEP II obtained according to the screening process as defined previously, said substrate compound or said inhibitor compound being labeled;
- detect the presence of said substrate compound or of said inhibitor compound, indicative of the presence of the NEP II polypeptide
By “labeled substrate compound” or “labeled inhibitor” is meant a substrate compound or an inhibitory compound detectably labeled, for example by a radioactive, enzymatic, fluorogenic or fluorescent group, etc.
Les exemples suivants illustrent l'invention sans la limiter. The following examples illustrate the invention without limiting it.
Exemple 1:
Clonaae de l'ADNc codant Dour NEP II
Des oligonucléotides dégénérés ont été obtenus à partir de l'alignement des séquences peptidiques des enzymes ECE, NEP I et Kell et de la délimitation des zones de forte homologie.Example 1:
Dour NEP II cDNA clonaae
Degenerate oligonucleotides were obtained from the alignment of the peptide sequences of the enzymes ECE, NEP I and Kell and from the delimitation of the zones of strong homology.
L'ARN total de différents tissus de rat (cerveau, intestin et testicules) a été soumis à une transcription inverse (RT) et amplifié par réaction en chaîne à la polymérase (PC R), à l'aide d'une paire d'oligonucléotides dégénérés sur la région N-terminale riche en résidus cystéine:
Les séquences de ces oligonucléotides dégénérés sont les suivantes:
DCYS2 CCC AAG (GTT)CG (A/G)G(AJG) CTG GTC
DCYS3 T(A/T)(CTT) GC(AIC/TIG) GG(A/T) GG(A/C) TGG
Ceci a permis d'amplifier un fragment de 420 paires de bases à partir de l'ARNt de testicule codant pour une phase ouverte de lecture qui présente une homologie de 76% avec la protéine NEP I. Cette séquence a été complétée par 3' et 5' RACE (rapid amplification of cDNA ends), à partir d'ARNt de cerveau de de testicules. Les séquences ont été confirmées par la vérification de cinq clones différents pour chaque tissu et chaque amplification. L'ADNc complet (SEQ ID n" 1) a alors été cloné dans les vecteurs PCR2.1 et pcDNA3.1 (Invitrogen). Total RNA from different rat tissues (brain, gut and testes) was reverse transcribed (RT) and amplified by polymerase chain reaction (PC R) using a pair of degenerate oligonucleotides on the N-terminal region rich in cysteine residues:
The sequences of these degenerate oligonucleotides are as follows:
DCYS2 CCC AAG (GTT) CG (A / G) G (AJG) CTG GTC
DCYS3 T (A / T) (CTT) GC (AIC / TIG) GG (A / T) GG (A / C) TGG
This made it possible to amplify a fragment of 420 base pairs from the testis tRNA coding for an open reading phase which exhibits 76% homology with the NEP I protein. This sequence was completed by 3 ′ and 5 'RACE (rapid amplification of cDNA ends), from brain tRNA and testes. The sequences were confirmed by the verification of five different clones for each tissue and each amplification. The complete cDNA (SEQ ID No. 1) was then cloned into the vectors PCR2.1 and pcDNA3.1 (Invitrogen).
Exemple 2:
Caractéristiques du polvoeptide NEP II
Le nouveau gène isolé code pour une protéine de 774 acides aminés (SEQ ID n" 2) qui, outre de fortes homologies avec les enzymes NEP I,
ECE et Kell (52%, 40% et 28% d'identité en acides aminés, respectivement) possède la séquence consensus du site actif HEXXH, une région transmembranaire (acides aminés 24 à 40 sur la séquence SEQ ID n" 2) suivie de quatre résidus cystéine caractéristiques de cette famille, et sept sites potentiels de glycosylation. Trois épissages alternatifs ont été identifiés par séquençage des RACE et par RT-PCR. Un de ces épissages alternatifs élimine un site potentiel de glycosylation et pourrait affecter le transit de la protéine à la surface de la cellule ou son activité. Chaque épissage correspond par ailleurs à un exon de la NEP I, ce qui suggère une structure de gène similaire. Ces données démontrent une appartenance de cette nouvelle enzyme à la famille des métalloprotéases ECEINEPIKell. Son homologie marquante avec NEP I a conduit à la nommer NEP II. Example 2:
Characteristics of the NEP II polvoeptide
The new isolated gene codes for a protein of 774 amino acids (SEQ ID No. 2) which, in addition to strong homologies with the enzymes NEP I,
ECE and Kell (52%, 40% and 28% amino acid identity, respectively) has the consensus sequence of the active site HEXXH, a transmembrane region (amino acids 24 to 40 on the sequence SEQ ID No. 2) followed by four cysteine residues characteristic of this family, and seven potential glycosylation sites. Three alternative splices have been identified by RACE sequencing and by RT-PCR. One of these alternative splices eliminates a potential glycosylation site and could affect the transit of the protein. on the surface of the cell or its activity. Each splicing also corresponds to a NEP I exon, which suggests a similar gene structure. These data demonstrate that this new enzyme belongs to the ECEINEPIKell family of metalloproteases. significant with NEP I led to naming it NEP II.
Exemple 3:
Exoression tissulaire de NEP II
Des études de Northern-blot et de RT-PCR montrent que NEP II est codé par un transcrit de 2,8 Kb très fortement exprimé dans les testicules de rat et, modérément, dans le coeur, le foie, le système digestif et le cerveau. Des études de RT-PCR semi-quantitatives montrent un profil d'expression similaire dans ces tissus ainsi qu'une prédominance des formes longues.Example 3:
NEP II tissue exoression
Northern-blot and RT-PCR studies show that NEP II is coded by a 2.8 Kb transcript very strongly expressed in rat testes and, moderately, in the heart, liver, digestive system and brain . Semi-quantitative RT-PCR studies show a similar expression profile in these tissues as well as a predominance of long forms.
Toutes ces caractéristiques indiquent clairement que la protéine identifiée pour la première fois est une métalloprotéase membranaire (ectoprotéase) responsable du métabolisme de peptides messagers neuronaux et/ou hormonaux. All these characteristics clearly indicate that the protein identified for the first time is a membrane metalloprotease (ectoprotease) responsible for the metabolism of neuronal and / or hormonal messenger peptides.
Le polypeptide NEP II natif est exprimé de manière hétérogène dans le système nerveux, les glandes (hypophyse, testicule), I'appareil digestif (intestin grêle notamment), l'appareil cardiovasculaire (coeur notamment). The native NEP II polypeptide is expressed heterogeneously in the nervous system, the glands (pituitary gland, testis), the digestive system (small intestine in particular), the cardiovascular system (heart in particular).
Ces localisations indiquent sa participation dans la protéolyse d'hormones et de neurotransmetteurs peptidergiques ou de leurs précurseurs émanant de ou agissant sur ces divers organes. II devient dès lors intéressant dans un but thérapeutique d'affecter les transmissions peptidergiques correspondantes en inhibitant NEP II. These localizations indicate its participation in the proteolysis of hormones and peptidergic neurotransmitters or their precursors emanating from or acting on these various organs. It therefore becomes interesting for a therapeutic purpose to affect the corresponding peptidergic transmissions by inhibiting NEP II.
LISTE DE SEQUENCES
r1) INFORMATION GENERALE:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: Institut National de la Santé et de la
Recherche Médicale
(B) RUE: 101 rue de Tolbiac
(C) VILLE: Paris
(E) PAYS: France
(F) CODE POSTAL: 75013
(ii) TITRE DE L'INVENTION: Nouvelle métalloprotéase NEPII
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 19
(iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D'EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.25 (OEB)
'2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 2765 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Rattus rattus
(ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT: 107..2428
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
GCAAAGCACT AGCTTCAGTG TGCTCAAGGC ATCCAAGCTC CAGCTGCCTC CCTCCTGGCC 60 CTGGCCCTGG GTGCTCAGCT GTGTGCCTTC CACCCAGAAC CGGCTG ATG GGG AAG 115
Met Gly Lys
1
TCG GAG AGC TCA GTG GGG ATG ATG GAG AGA GCG GAC AAC TGT GGG AGG 163
Ser Glu Ser Ser Val Gly Met Met Glu Arg Ala Asp Asn Cys Gly Arg
5 10 15
AGG CGC CTA GGC TTC GTG GAG TGT GGG CTG CTG GTA CTG CTG ACA CTG 211
Arg Arg Leu Gly Phe Val Glu Cys Gly Leu Leu Val Leu Leu Thr Leu
20 25 30 35
CTG TTG ATG GGA GCC ATA GTG ACT CTG GGT GTC TTC TAC AGC ATA GGG 259
Leu Leu Met Gly Ala Ile Val Thr Leu Gly Val Phe Tyr Ser Ile Gly
40 45 50
AAG CAG CTC CCC CTC TTA AAT AGC CTC CTG CAC CTC TCC CGG CAT GAG 307
Lys Gln Leu Pro Leu Leu Asn Ser Leu Leu His Val Ser Arg His Glu
55 60 65
AGG ACG GTT GTA AAA CGA GTC CTC AGA GAT TCA TCG CAG AAG AGT GAC 355
Arg Thr Val Val Lys Arg Val Leu Arg Asp Ser Ser Gln Lys Ser Asp
70 75 80
ATC TGT ACT ACC CCA AGC TGC GTG ATA GCA GCT GCC AGA ATC CTC CAG 403
Ile Cys Thr Thr Pro Ser Cys Val Ile Ala Ala Ala Arg Ile Leu Gln
85 90 95
AAC ATG GAC CAG TCA AAG AAA CCC GC GAC AAC TTC TAT CAG TAT GCT 451
Asn Met Asp Gln Ser Lys Lys Pro Cys Asp Asn Phe Tyr Gln Tyr Ala 100 105 110 115
TGC GGA GGC TGG CTA CGG CAC CAT GTG ATC CCC GAG ACC AAC TCC AGA 499 C7s Gly Gly Trp Leu Arg His His Val Ile Pro Glu Thr Asn Ser Arg
120 125 130
TAC AGC GTC TTT GAC ATC CTT CGG GAT GAG CTG GAG GTC ATC CTC AAA 547
Tyr Ser Val Phe Asp Ile Leu Arg Asp Glu Leu Glu Val Ile Leu Lys
135 140 145
GGG GTG CTG GAG GAT TCC TCT GTC CAG CAC CGC CCA GCT GTG GAG AAG 595
Gly Val Leu Glu Asp Ser Ser Val Gln His Arg Pro Ala Val Glu Lys
150 155 160
GCC AAC ACA CTG TAC CGC TCC TGC ATG AAC CAG AGT GTG ATA GAG AAG 643
Ala Lys Thr Leu Tyr Arg Ser Cys Met Asn Gln Ser Val Ile Glu Lys
165 170 175
AGA GAC TCT GAG CCC CTG CTG AAC GTC TTA GAT ATG ATA GGA GGT TGG 691
Arg Asp Ser Glu Pro Leu Leu Asn Val Leu Asp Met Ile Gly Gly Trp 180 185 190 195
CCT GTA GCC ATG GAC AAG TGG AAT GAG ACC ATG GGC CCC AAG TGG GAA 739
Pro Val Ala Met Asp Lys Trp Asn Glu Thr Met Gly Pro Lys Trp Glu
200 205 210
CTG GAG CGG CAG TTG GCT GTG TTG AAC TCG CAG TTC AAC AGG CGC GTC 787
Leu Glu Arg Gln Leu Ala Val Leu Asn Ser Gln Phe Asn Arg Arg Val
215 220 225
CTC ATC GAC CTC TTC ATC TGG AAT GAT GAC CAG AAC TCC AGC CGG CAC 835
Leu Ile Asp Leu Phe Ile Trp Asn Asp Asp Gln Asn Ser Ser Arg His
230 235 240
CTC ATC TAC ATA GAC CAG CCC ACC TTG GGC ATG CCC TCC CGG GAG TAC 883
Val Ile Tyr Ile Asp Gln Pro Thr Leu Gly Met Pro Ser Arg Glu Tyr
245 250 255
TAT TTC AAG GAA GAC AGC CAC CGG GTA CGG GAA GCC TAC CTG CAG TTC 931
Tyr Phe Lys Glu Asp Ser His Arg Val Arg Glu Ala Tyr Leu Gln Phe
260 265 270 275
ATG ACA TCA GTG GCC ACT ATG CTG AGG AGA GAC CTG AAC CTG CCC GGG 979
Met Thr Ser Val Ala Thr Met Leu Arg Arg Asp Leu Asn Leu Pro Gly
280 285 290
GAG ACC GAT TTG GTG CAG GAG GAA ATG GCA CAG GTG CTC CAT CTG GAG 1027
Glu Thr Asp Leu Val Gln Glu Glu Met Ala Gln Val Leu His Leu Glu
295 300 305
ACA CAT CTG GCC AAC GCC ACG GTC CCC CAG GAG AAA AGG CAT GAT GTC 1075
Thr His Leu Ala Asn Ala Thr Val Pro Gln Glu Lys Arg His Asp Val
310 315 320
ACC GCC CTG TAT CAC CGA ATG GGC CTG GAG GAG CTG CAG GAA AGG TTT 1123
Thr Ala Leu Tyr His Arg Met Gly Leu Glu Glu Leu Gln Glu Arg Phe
325 330 335
GGT CTC AAC GGG TTT AAC TGG ACT CTC TTC ATA CAA AAC GTG CTC TCT 1171
Gly Leu Lys Gly Phe Asn Trp Thr Leu Phe Ile Gln Asn Val Leu Ser 340 345 350 355
TCT GTG CAA GTT GAG CTG CTC CCG AAT GAG GAG GTG GTG GTC TAT GGC 1219
Ser Val Gln Val Glu Leu Leu Pro Asn Glu Glu Val Val Val Tyr Gly
360 365 370
ATC CCC TAC CTC GAG AAT CTT GAG GAG ATC ATT GAC CTC TTC CCA GCA 1267
Ile Pro Tyr Leu Glu Asn Leu Glu Glu Ile Ile Asp Val Phe Pro Ala
375 380 385
CAG ACC TTG CAA AAC TAC CTG GTG TGG CGC CTG GTG CTA GAT CGC ATC 1315
Gln Thr Leu Gln Asn Tyr Leu Val Trp Arg Leu Val Leu Asp Arg Ile
390 395 400
GGC AGC CTG AGC CAG AGA TTC AAA GAA GCG CGT GTG GAC TAC CGC AAG 1363
Gly Ser Leu Ser Gln Arg Phe Lys Glu Ala Arg Val Asp Tyr Arg Lys
405 410 415
GCG CTG TAC GGT ACA ACC ATG GAG GAA GTA CGC TGG CGG GAG TGT GTC 1411
Ala Leu Tyr Gly Thr Thr Met Glu Glu Val Arg Trp Arg Glu Cys Val 420 425 430 435
AGC TAT GTC AAC AGC AAC ATG GAG AGT GCC GTG GGC TCC CTC TAC ATC 1459
Ser Tyr Val Asn Ser Asn Met Glu Ser Ala Val Gly Ser Leu Tyr Ile
440 445 450
AAG CGG GCC TTC TCC AAG GAC AGC AAG AGC ATA GTC AGT GAG CTT ATC 1507
Lys Arg Ala Phe Ser Lys Asp Ser Lys Ser Ile Val Ser Glu Leu Ile
455 460 465
GAG AAG ATA CGG TCC GTG TTT GTG GAT AAC CTG GAC GAG TTG AAC TGG 1555
Glu Lys Ile Arg Ser Val Phe Val Asp Asn Leu Asp Glu Leu Asn Trp
470 475 480
ATG GAT GAG GAA TCC AAG AAA AAG GCC CAG GAA AAG GCC TTG AAT ATC 1603
Met Asp Glu Glu Ser Lys Lys Lys Ala Gln Glu Lys Ala Leu Asn Ile
485 490 495
CGG GAA CAG ATC GGC TAC CCT GAC TAC ATT TTG GAA GAC AAT AAC AGA 1651
Arg Glu Gln Ile Gly Tyr Pro Asp Tyr Ile Leu Glu Asp Asn Asn Arg 500 505 510 515
CAC CTG GAT GAG GAA TAC TCC AGT CTG ACT TTC TCA GAG GAC CTC TAT 1699
His Leu Asp Glu Glu Tyr Ser Ser Leu Thr Phe Ser Glu Asp Leu Tyr
520 525 530
TTT GAG AAC GGG CTT CAG AAC CTC AAG AAC AAT GCC CAA AGG AGC CTC 1747
Phe Glu Asn Gly Leu Gln Asn Leu Lys Asn Asn Ala Gln Arg Ser Leu
535 540 545
AAG AAA CTT CGG GAA AAG GTG GAC CAG AAT CTC TGG ATC ATT GGG GCT 1795
Lys Lys Leu Arg Glu Lys Val Asp Gln Asn Leu Trp Ile Ile Gly Ala
550 555 560
GCA GTG GTC AAT GCA TTC TAC TCC CCA AAC AGA AAC CTG ATC GTC TTT 1843
Ala Val Val Asn Ala Phe Tyr Ser Pro Asn Arg Asn Leu Ile Val Phe
565 570 575
CCA GCG GGG ATC CTC CAG CCA CCC TTC TTC AGC AAC GAC CAA CCA CAG 1891
Pro Ala Gly Ile Leu Gln Pro Pro Phe Phe Ser Lys Asp Gln Pro Gln 580 585 590 595
GCC TTG AAT TTC GGG GGC ATC GGG ATG GTG ATT GGA CAC GAG ATC ACA 1939
Ala Leu Asn Phe Gly Gly Ile Gly Met Val Ile Gly His Glu Ile Thr
600 605 610
CAC GGC TTT GAT GAT AAC GGT CGG AAC TTT GAC AAC AAT GGC AAC ATG 1987
His Gly Phe Asp Asp Asn Gly Arg Asn Phe Asp Lys Asn Gly Asn Met
615 620 625
CTG GAC TGG TGG AGC AAC TTC TCG GCC CGG CAC TTC CGA CAG CAG TCA 2035
Leu Asp Trp Trp Ser Asn Phe Ser Ala Arg His Phe Arg Gln Gln Ser
630 635 640
CAG TGT ATC ATT TAT CAG TAC AGC AAC TTC TCT TGG GAA CTA GCA GAC 2083
Gln Cys Met Ile Tyr Gln Tyr Ser Asn Phe Ser Trp Glu Leu Ala Asp
645 650 655
AAC CAG AAT GTG AAC GGA TTC AGC ACC CTC GGG GAG AAC ATC GCC GAC 2131
Asn Gln Asn Val Asn Gly Phe Ser Thr Leu Gly Glu Asn Ile Ala Asp 660 665 670 675
AAC GGC GGT GTG CGG CAG GCA TAC AAG GCT TAC CTA CAG TGG CTA GCT 2179
Asn Gly Gly Val Arg Gln Ala Tyr Lys Ala Tyr Leu Gln Trp Leu Ala
680 685 690
GAA GGC GGC AGA GAC CAG AGA CTG CCG GGA CTG AAC CTG ACC TAT GCT 2227
Glu Gly Gly Arg Asp Gln Arg Leu Pro Gly Leu Asn Leu Thr Tyr Ala
695 700 705
CAG CTT TTC TTC ATT AAC TAT GCC CAG GTG TGG TGT GGG TCC TAC AGG 2275
Gln Leu Phe Phe Ile Asn Tyr Ala Gln Val Trp Cys Gly Ser Tyr Arg
710 715 720
CCC GAG TTC GCC ATC CAG TCC ATC AAG ACA GAT GTC CAC AGT CCT CTT 2323
Pro Glu Phe Ala Ile Gln Ser Ile Lys Thr Asp Val His Ser Pro Leu
725 730 735
AAG TAC AGG GTG CTG GGC TCA CTA CAG AAC CTA CCA GGC TTC TCT GAG 2371
Lys Tyr Arg Val Leu Gly Ser Leu Gln Asn Leu Pro Gly Phe Ser Glu 740 745 750 755 CG TTC CAC TGC CCA CGA GGC AGC CCC ATG CAC CCT ATG AAT CGA TGT 2419
Ala Phe His Cys Pro
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
Met Gly Lys Ser Glu Ser Ser Val Gly Met Met Glu Arg Ala Asp Asn
1 5 10 15
Cys Gly Arg Arg Arg Leu Gly Phe Val Glu Cys Gly Leu Leu Val Leu
20 25 30
Leu Thr Leu Leu Leu Met Gly Ala Ile Val Thr Leu Gly Val Phe Tyr
35 40 45
Ser Ile Gly Lys Gln Leu Pro Leu Leu Asn Ser Leu Leu His Val Ser
50 55 60
Arg His Glu Arg Thr Val Val Lys Arg Val Leu Arg Asp Ser Ser Gln
o5 70 75 80
Lys Ser Asp Ile Cys Thr Thr Pro Ser Cys Val Ile Ala Ala Ala Arg
85 90 95
Ile Leu Gln Asn Met Asp Gln Ser Lys Lys Pro Cys Asp Asn Phe Tyr
100 105 110
Gln Tyr Ala Cys Gly Gly Trp Leu Arg His His Val Ile Pro Glu Thr
115 120 125
Asn Ser Arg Tyr Ser Val Phe Asp Ile Leu Arg Asp Glu Leu Glu Val
130 135 140
Ile Leu Lys Gly Val Leu Glu Asp Ser Ser Val Gln His Arg Pro Ala 145 150 155 160
Val Glu Lys Ala Lys Thr Leu Tyr Arg Ser Cys Met Asn Gln Ser Val
165 170 175
Ile Glu Lys Arg Asp Ser Glu Pro Leu Leu Asn Val Leu Asp Met Ile
180 185 190
Gly Gly Trp Pro Val Ala Met Asp Lys Trp Asn Glu Thr Met Gly Pro
195 200 205
Lys Trp Glu Leu Glu Arg Gln Leu Ala Val Leu Asn Ser Gln Phe Asn
210 215 220
Arg Arg Val Leu Ile Asp Leu Phe Ile Trp Asn Asp Asp Gln Asn Ser 225 230 235 240
Ser Arg His Val Ile Tyr Ile Asp Gln Pro Thr Leu Gly Met Pro Ser
245 250 255
Arg Glu Tyr Tyr Phe Lys Glu Asp Ser His Arg Val Arg Glu Ala Tyr
260 265 270
Leu Gln Phe Met Thr Ser Val Ala Thr Met Leu Arg Arg Asp Leu Asn
275 280 285
Leu Pro Gly Glu Thr Asp Leu Val Gln Glu Glu Met Ala Gln Val Leu
290 295 300
His Leu Glu Thr His Leu Ala Asn Ala Thr Val Pro Gln Glu Lys Arg 305 310 315 320
His Asp Val Thr Ala Leu Tyr His Arg Met Gly Leu Glu Glu Leu Gln
325 330 335
Glu Arg Phe Gly Leu Lys Gly Phe Asn Trp Thr Leu Phe Ile Gln Asn
340 345 350
Val Leu Ser Ser Val Gln Val Glu Leu Leu Pro Asn Glu Glu Val Val
355 360 365
Val Tyr Gly Ile Pro Tyr Leu Glu Asn Leu Glu Glu Ile Ile Asp Val
370 375 380
Phe Pro Ala Gln Thr Leu Gln Asn Tyr Leu Val Trp Arg Leu Val Leu 385 390 395 400
Asp Arg Ile Gly Ser Leu Ser Gln Arg Phe Lys Glu Ala Arg Val Asp
405 410 415
Tyr Arg Lys Ala Leu Tyr Gly Thr Thr Met Glu Glu Val Arg Trp Arg
420 425 430
Glu Cys Val Ser Tyr Val Asn Ser Asn Met Glu Ser Ala Val Gly Ser
435 440 445
Leu Tyr Ile Lys Arg Ala Phe Ser Lys Asp Ser Lys Ser Ile Val Ser
450 455 460
Glu Leu Ile Glu Lys Ile Arg Ser Val Phe Val Asp Asn Leu Asp Glu 4O5 470 475 480
Leu Asn Trp Met Asp Glu Glu Ser Lys Lys Lys Ala Gln Glu Lys Ala
485 490 495
Leu Asn Ile Arg Glu Gln Ile Gly Tyr Pro Asp Tyr Ile Leu Glu Asp
500 505 510
Asn Asn Arg His Leu Asp Glu Glu Tyr Ser Ser Leu Thr Phe Ser Glu
515 520 525
Asp Leu Tyr Phe Glu Asn Gly Leu Gln Asn Leu Lys Asn Asn Ala Gln
530 535 540
Arg Ser Leu Lys Lys Leu Arg Glu Lys Val Asp Gln Asn Leu Trp Ile 545 550 555 560
Ile Gly Ala Ala Val Val Asn Ala Phe Tyr Ser Pro Asn Arg Asn Leu
565 570 575
Ile Val Phe Pro Ala Gly Ile Leu Gln Pro Pro Phe Phe Ser Lys Asp
580 585 590
Gln Pro Gln Ala Leu Asn Phe Gly Gly Ile Gly Met Val Ile Gly His
595 600 605
Glu Ile Thr His Gly Phe Asp Asp Asn Gly Arg Asn Phe Asp Lys Asn
610 615 620
Gly Asn Met Leu Asp Trp Trp Ser Asn Phe Ser Ala Arg His Phe Arg 625 630 635 640
Gln Gln Ser Gln Cys Met Ile Tyr Gln Tyr Ser Asn Phe Ser Trp Glu
645 650 655
Leu Ala Asp Asn Gln Asn Val Asn Gly Phe Ser Thr Leu Gly Glu Asn
660 665 670
Ile Ala Asp Asn Gly Gly Val Arg Gln Ala Tyr Lys Ala Tyr Leu Gln
675 680 685
Trp Leu Ala Glu Gly Gly Arg Asp Gln Arg Leu Pro Gly Leu Asn Leu
690 695 700
Thr Tyr Ala Gln Leu Phe Phe Ile Asn Tyr Ala Gln Val Trp Cys Gly 705 710 715 720
Ser Tyr Arg Pro Glu Phe Ala Ile Gln Ser Ile Lys Thr Asp Val His
725 730 735
Ser Pro Leu Lys Tyr Arg Val Leu Gly Ser Leu Gln Asn Leu Pro Gly
740 745 750
Phe Ser Glu Ala Phe His Cys Pro Arg Gly Ser Pro Met His Pro Met
755 760 765
Asn Arg Cys Arg Ile Trp
770
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 20 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: sonde oligonucléotidique
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3: TGGAGCGGCA GTTGGCTGTG 20 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 21 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: sonde oligonucléotidique
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4 AGTTCCCACT TGGGGCCCAT G 21
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 20 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: sonde oligonucléotidique
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5: GCTGGAGGAT TCCTCTGTCC 20
'2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 19 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: sonde oligonucléotidique
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6: CGGGGATCAC ATGGTGCCG 19 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 7
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 21 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: sonde oligonucléotidique
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7
CTACCCCAAG CTGCGTGATA G 21
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 8
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 21 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: sonde oligonucléotidique
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8 CGGCACCATG TGATCCCCGA G 21
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 9
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 22 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: sonde oligonucléotidique
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 9 GCAAAGCACT AGCTTCAGTG TG 22 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 10:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 22 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: sonde oligonucléotidique
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 10:
GGTCATCATT CCAGATGAAG AG 22
n INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 11:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 20 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: sonde oligonucléotidique
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 11 : CGATGAGGAC GCGCCTGTTG 20
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 12:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 20 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: sonde oligonucléotidique
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 12: TGCAGGAAAG GTTTGGTCTG 20
'2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 13:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 20 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: sonde oligonucléotidique
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 13: GAACGCCTCA GAGAAGCCTG 20
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 14:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 20 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: sonde oligonucléotidique
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 14: ATGACCAGAA CTCCAGCCGG
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 15:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 21 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: sonde oligonucléotidique
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 15:
CATCATGCTT TTTCTCCTGG G 21
INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 16:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 21 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: sonde oligonucléotidique
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 16 CCCGAAGTTT CTTGAGGCTC C 21 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 17:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 19 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: sonde oligonucléotidique
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 17
GATCGGCTAC CCTGACTAC 19 2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 18
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 19 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: sonde oligonucléotidique
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 18 GTTCGCCATC CAGTCCATC 19 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 19
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 20 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: sonde oligonucléotidique
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 19: CGAAGCCTAG GCGCCTCCTC 20 19 LIST OF SEQUENCES
r1) GENERAL INFORMATION:
(i) DEPOSITOR:
(A) NAME: National Institute of Health and
Medical research
(B) STREET: 101 rue de Tolbiac
(C) CITY: Paris
(E) COUNTRY: France
(F) POSTAL CODE: 75013
(ii) TITLE OF THE INVENTION: New NEPII metalloprotease
(iii) NUMBER OF SEQUENCES: 19
(iv) COMPUTER-READABLE FORM:
(A) TYPE OF SUPPORT: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS / MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Release # 1.0, Version # 1.25 (EPO)
'2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 1:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 2765 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) NUMBER OF STRANDS: double
(D) CONFIGURATION: linear
(ii) TYPE OF MOLECULE: cDNA
(vi) ORIGIN:
(A) ORGANIZATION: Rattus rattus
(ix) ADDITIONAL FEATURE:
(A) NAME / KEY: CDS
(B) LOCATION: 107..2428
(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
GCAAAGCACT AGCTTCAGTG TGCTCAAGGC ATCCAAGCTC CAGCTGCCTC CCTCCTGGCC 60 CTGGCCCTGG GTGCTCAGCT GTGTGCCTTC CACCCAGAAC CGGCTG ATG GGG AAG 115
Met Gly Lys
1
TCG GAG AGC TCA GTG GGG ATG ATG GAG AGA GCG GAC AAC TGT GGG AGG 163
Ser Glu Ser Ser Val Gly Met Met Glu Arg Ala Asp Asn Cys Gly Arg
5 10 15
AGG CGC CTA GGC TTC GTG GAG TGT GGG CTG CTG GTA CTG CTG ACA CTG 211
Arg Arg Leu Gly Phe Val Glu Cys Gly Leu Leu Val Leu Leu Thr Leu
20 25 30 35
CTG TTG ATG GGA GCC ATA GTG ACT CTG GGT GTC TTC TAC AGC ATA GGG 259
Leu Leu Met Gly Ala Ile Val Thr Leu Gly Val Phe Tyr Ser Ile Gly
40 45 50
AAG CAG CTC CCC CTC TTA AAT AGC CTC CTG CAC CTC TCC CGG CAT GAG 307
Lys Gln Leu Pro Leu Leu Asn Ser Leu Leu His Val Ser Arg His Glu
55 60 65
AGG ACG GTT GTA AAA CGA GTC CTC AGA GAT TCA TCG CAG AAG AGT GAC 355
Arg Thr Val Val Lys Arg Val Leu Arg Asp Ser Ser Gln Lys Ser Asp
70 75 80
ATC TGT ACT ACC CCA AGC TGC GTG ATA GCA GCT GCC AGA ATC CTC CAG 403
Ile Cys Thr Thr Pro Ser Cys Val Ile Ala Ala Ala Arg Ile Leu Gln
85 90 95
AAC ATG GAC CAG TCA AAG AAA CCC GC GAC AAC TTC TAT CAG TAT GCT 451
Asn Met Asp Gln Ser Lys Lys Pro Cys Asp Asn Phe Tyr Gln Tyr Ala 100 105 110 115
TGC GGA GGC TGG CTA CGG CAC CAT GTG ATC CCC GAG ACC AAC TCC AGA 499 C7s Gly Gly Trp Leu Arg His His Val Ile Pro Glu Thr Asn Ser Arg
120 125 130
TAC AGC GTC TTT GAC ATC CTT CGG GAT GAG CTG GAG GTC ATC CTC AAA 547
Tyr Ser Val Phe Asp Ile Leu Arg Asp Glu Leu Glu Val Ile Leu Lys
135 140 145
GGG GTG CTG GAG GAT TCC TCT GTC CAG CAC CGC CCA GCT GTG GAG AAG 595
Gly Val Leu Glu Asp Ser Ser Val Gln His Arg Pro Ala Val Glu Lys
150 155 160
GCC AAC ACA CTG TAC CGC TCC TGC ATG AAC CAG AGT GTG ATA GAG AAG 643
Ala Lys Thr Leu Tyr Arg Ser Cys Met Asn Gln Ser Val Ile Glu Lys
165 170 175
AGA GAC TCT GAG CCC CTG CTG AAC GTC TTA GAT ATG ATA GGA GGT TGG 691
Arg Asp Ser Glu Pro Leu Leu Asn Val Leu Asp Met Ile Gly Gly Trp 180 185 190 195
CCT GTA GCC ATG GAC AAG TGG AAT GAG ACC ATG GGC CCC AAG TGG GAA 739
Pro Val Ala Met Asp Lys Trp Asn Glu Thr Met Gly Pro Lys Trp Glu
200 205 210
CTG GAG CGG CAG TTG GCT GTG TTG AAC TCG CAG TTC AAC AGG CGC GTC 787
Leu Glu Arg Gln Leu Ala Val Leu Asn Ser Gln Phe Asn Arg Arg Val
215 220 225
CTC ATC GAC CTC TTC ATC TGG AAT GAT GAC CAG AAC TCC AGC CGG CAC 835
Leu Ile Asp Leu Phe Ile Trp Asn Asp Asp Gln Asn Ser Ser Arg His
230 235 240
CTC ATC TAC ATA GAC CAG CCC ACC TTG GGC ATG CCC TCC CGG GAG TAC 883
Val Ile Tyr Ile Asp Gln Pro Thr Leu Gly Met Pro Ser Arg Glu Tyr
245 250 255
TAT TTC AAG GAA GAC AGC CAC CGG GTA CGG GAA GCC TAC CTG CAG TTC 931
Tyr Phe Lys Glu Asp Ser His Arg Val Arg Glu Ala Tyr Leu Gln Phe
260 265 270 275
ATG ACA TCA GTG GCC ACT ATG CTG AGG AGA GAC CTG AAC CTG CCC GGG 979
Met Thr Ser Val Ala Thr Met Leu Arg Arg Asp Leu Asn Leu Pro Gly
280 285 290
GAG ACC GAT TTG GTG CAG GAG GAA ATG GCA CAG GTG CTC CAT CTG GAG 1027
Glu Thr Asp Leu Val Gln Glu Glu Met Ala Gln Val Leu His Leu Glu
295,300,305
ACA CAT CTG GCC AAC GCC ACG GTC CCC CAG GAG AAA AGG CAT GAT GTC 1075
Thr His Leu Ala Asn Ala Thr Val Pro Gln Glu Lys Arg His Asp Val
310 315 320
ACC GCC CTG TAT CAC CGA ATG GGC CTG GAG GAG CTG CAG GAA AGG TTT 1123
Thr Ala Leu Tyr His Arg Met Gly Leu Glu Glu Leu Gln Glu Arg Phe
325 330 335
GGT CTC AAC GGG TTT AAC TGG ACT CTC TTC ATA CAA AAC GTG CTC TCT 1171
Gly Leu Lys Gly Phe Asn Trp Thr Leu Phe Ile Gln Asn Val Leu Ser 340 345 350 355
TCT GTG CAA GTT GAG CTG CTC CCG AAT GAG GAG GTG GTG GTC TAT GGC 1219
Ser Val Gln Val Glu Leu Leu Pro Asn Glu Glu Val Val Val Tyr Gly
360 365 370
ATC CCC TAC CTC GAG AAT CTT GAG GAG ATC ATT GAC CTC TTC CCA GCA 1267
Ile Pro Tyr Leu Glu Asn Leu Glu Glu Ile Asp Val Phe Pro Ala
375 380 385
CAG ACC TTG CAA AAC TAC CTG GTG TGG CGC CTG GTG CTA GAT CGC ATC 1315
Gln Thr Leu Gln Asn Tyr Leu Val Trp Arg Leu Val Leu Asp Arg Ile
390,395,400
GGC AGC CTG AGC CAG AGA TTC AAA GAA GCG CGT GTG GAC TAC CGC AAG 1363
Gly Ser Leu Ser Gln Arg Phe Lys Glu Ala Arg Val Asp Tyr Arg Lys
405 410 415
GCG CTG TAC GGT ACA ACC ATG GAG GAA GTA CGC TGG CGG GAG TGT GTC 1411
Ala Leu Tyr Gly Thr Thr Met Glu Glu Val Arg Trp Arg Glu Cys Val 420 425 430 435
AGC TAT GTC AAC AGC AAC ATG GAG AGT GCC GTG GGC TCC CTC TAC ATC 1459
Ser Tyr Val Asn Ser Asn Met Glu Ser Ala Val Gly Ser Leu Tyr Ile
440 445 450
AAG CGG GCC TTC TCC AAG GAC AGC AAG AGC ATA GTC AGT GAG CTT ATC 1507
Lys Arg Ala Phe Ser Lys Asp Ser Lys Ser Ile Val Ser Glu Leu Ile
455,460,465
GAG AAG ATA CGG TCC GTG TTT GTG GAT AAC CTG GAC GAG TTG AAC TGG 1555
Glu Lys Ile Arg Ser Val Phe Val Asp Asn Leu Asp Glu Leu Asn Trp
470 475 480
ATG GAT GAG GAA TCC AAG AAA AAG GCC CAG GAA AAG GCC TTG AAT ATC 1603
Met Asp Glu Glu Ser Lys Lys Lys Ala Gln Glu Lys Ala Leu Asn Ile
485 490 495
CGG GAA CAG ATC GGC TAC CCT GAC TAC ATT TTG GAA GAC AAT AAC AGA 1651
Arg Glu Gln Ile Gly Tyr Pro Asp Tyr Ile Leu Glu Asp Asn Asn Arg 500 505 510 515
CAC CTG GAT GAG GAA TAC TCC AGT CTG ACT TTC TCA GAG GAC CTC TAT 1699
His Leu Asp Glu Glu Tyr Ser Ser Leu Thr Phe Ser Glu Asp Leu Tyr
520 525 530
TTT GAG AAC GGG CTT CAG AAC CTC AAG AAC AAT GCC CAA AGG AGC CTC 1747
Phe Glu Asn Gly Leu Gln Asn Leu Lys Asn Asn Ala Gln Arg Ser Leu
535 540 545
AAG AAA CTT CGG GAA AAG GTG GAC CAG AAT CTC TGG ATC ATT GGG GCT 1795
Lys Lys Leu Arg Glu Lys Val Asp Gln Asn Leu Trp Ile Ile Gly Ala
550 555 560
GCA GTG GTC AAT GCA TTC TAC TCC CCA AAC AGA AAC CTG ATC GTC TTT 1843
Ala Val Val Asn Ala Phe Tyr Ser Pro Asn Arg Asn Leu Ile Val Phe
565,570,575
CCA GCG GGG ATC CTC CAG CCA CCC TTC TTC AGC AAC GAC CAA CCA CAG 1891
Pro Ala Gly Ile Leu Gln Pro Pro Phe Phe Ser Lys Asp Gln Pro Gln 580 585 590 595
GCC TTG AAT TTC GGG GGC ATC GGG ATG GTG ATT GGA CAC GAG ATC ACA 1939
Ala Leu Asn Phe Gly Gly Ile Gly Met Val Ile Gly His Glu Ile Thr
600 605 610
CAC GGC TTT GAT GAT AAC GGT CGG AAC TTT GAC AAC AAT GGC AAC ATG 1987
His Gly Phe Asp Asp Asn Gly Arg Asn Phe Asp Lys Asn Gly Asn Met
615 620 625
CTG GAC TGG TGG AGC AAC TTC TCG GCC CGG CAC TTC CGA CAG CAG TCA 2035
Leu Asp Trp Trp Ser Asn Phe Ser Ala Arg His Phe Arg Gln Gln Ser
630 635 640
CAG TGT ATC ATT TAT CAG TAC AGC AAC TTC TCT TGG GAA CTA GCA GAC 2083
Gln Cys Met Ile Tyr Gln Tyr Ser Asn Phe Ser Trp Glu Leu Ala Asp
645 650 655
AAC CAG AAT GTG AAC GGA TTC AGC ACC CTC GGG GAG AAC ATC GCC GAC 2131
Asn Gln Asn Val Asn Gly Phe Ser Thr Leu Gly Glu Asn Ile Ala Asp 660 665 670 675
AAC GGC GGT GTG CGG CAG GCA TAC AAG GCT TAC CTA CAG TGG CTA GCT 2179
Asn Gly Gly Val Arg Gln Ala Tyr Lys Ala Tyr Leu Gln Trp Leu Ala
680 685 690
GAA GGC GGC AGA GAC CAG AGA CTG CCG GGA CTG AAC CTG ACC TAT GCT 2227
Glu Gly Gly Arg Asp Gln Arg Leu Pro Gly Leu Asn Leu Thr Tyr Ala
695,700,705
CAG CTT TTC TTC ATT AAC TAT GCC CAG GTG TGG TGT GGG TCC TAC AGG 2275
Gln Leu Phe Phe Ile Asn Tyr Ala Gln Val Trp Cys Gly Ser Tyr Arg
710 715 720
CCC GAG TTC GCC ATC CAG TCC ATC AAG ACA GAT GTC CAC AGT CCT CTT 2323
Pro Glu Phe Ala Ile Gln Ser Ile Lys Thr Asp Val His Ser Pro Leu
725 730 735
AAG TAC AGG GTG CTG GGC TCA CTA CAG AAC CTA CCA GGC TTC TCT GAG 2371
Lys Tyr Arg Val Leu Gly Ser Leu Gln Asn Leu Pro Gly Phe Ser Glu 740 745 750 755 CG TTC CAC TGC CCA CGA GGC AGC CCC ATG CAC CCT ATG AAT CGA TGT 2419
Ala Phe His Cys Pro
(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
Met Gly Lys Ser Glu Ser Ser Val Gly Met Met Glu Arg Ala Asp Asn
1 5 10 15
Cys Gly Arg Arg Arg Leu Gly Phe Val Glu Cys Gly Leu Leu Val Leu
20 25 30
Leu Thr Leu Leu Leu Met Gly Ala Ile Val Thr Leu Gly Val Phe Tyr
35 40 45
Ser Ile Gly Lys Gln Leu Pro Leu Leu Asn Ser Leu Leu His Val Ser
50 55 60
Arg His Glu Arg Thr Val Val Lys Arg Val Leu Arg Asp Ser Ser Gln
o5 70 75 80
Lys Ser Asp Ile Cys Thr Thr Pro Ser Cys Val Ile Ala Ala Ala Arg
85 90 95
Ile Leu Gln Asn Met Asp Gln Ser Lys Lys Pro Cys Asp Asn Phe Tyr
100 105 110
Gln Tyr Ala Cys Gly Gly Trp Leu Arg His His Val Ile Pro Glu Thr
115 120 125
Asn Ser Arg Tyr Ser Val Phe Asp Ile Leu Arg Asp Glu Leu Glu Val
130 135 140
Ile Leu Lys Gly Val Leu Glu Asp Ser Ser Val Gln His Arg Pro Ala 145 150 155 160
Val Glu Lys Ala Lys Thr Leu Tyr Arg Ser Cys Met Asn Gln Ser Val
165 170 175
Ile Glu Lys Arg Asp Ser Glu Pro Leu Leu Asn Val Leu Asp Met Ile
180 185 190
Gly Gly Trp Pro Val Ala Met Asp Lys Trp Asn Glu Thr Met Gly Pro
195 200 205
Lys Trp Glu Leu Glu Arg Gln Leu Ala Val Leu Asn Ser Gln Phe Asn
210 215 220
Arg Arg Val Leu Ile Asp Leu Phe Ile Trp Asn Asp Asp Gln Asn Ser 225 230 235 240
Ser Arg His Val Ile Tyr Ile Asp Gln Pro Thr Leu Gly Met Pro Ser
245 250 255
Arg Glu Tyr Tyr Phe Lys Glu Asp Ser His Arg Val Arg Glu Ala Tyr
260 265 270
Leu Gln Phe Met Thr Ser Val Ala Thr Met Leu Arg Arg Asp Leu Asn
275 280 285
Leu Pro Gly Glu Thr Asp Leu Val Gln Glu Glu Met Ala Gln Val Leu
290 295 300
His Leu Glu Thr His Leu Ala Asn Ala Thr Val Pro Gln Glu Lys Arg 305 310 315 320
His Asp Val Thr Ala Leu Tyr His Arg Met Gly Leu Glu Glu Leu Gln
325 330 335
Glu Arg Phe Gly Leu Lys Gly Phe Asn Trp Thr Leu Phe Ile Gln Asn
340 345 350
Val Leu Ser Ser Val Gln Val Glu Leu Leu Pro Asn Glu Glu Val Val
355 360 365
Val Tyr Gly Ile Pro Tyr Leu Glu Asn Leu Glu Glu Ile Ile Asp Val
370 375 380
Phe Pro Ala Gln Thr Leu Gln Asn Tyr Leu Val Trp Arg Leu Val Leu 385 390 395 400
Asp Arg Ile Gly Ser Leu Ser Gln Arg Phe Lys Glu Ala Arg Val Asp
405 410 415
Tyr Arg Lys Ala Leu Tyr Gly Thr Thr Met Glu Glu Val Arg Trp Arg
420 425 430
Glu Cys Val Ser Tyr Val Asn Ser Asn Met Glu Ser Ala Val Gly Ser
435 440 445
Leu Tyr Ile Lys Arg Ala Phe Ser Lys Asp Ser Lys Ser Ile Val Ser
450 455 460
Glu Leu Ile Glu Lys Ile Arg Ser Val Phe Val Asp Asn Leu Asp Glu 4O5 470 475 480
Leu Asn Trp Met Asp Glu Glu Ser Lys Lys Lys Ala Gln Glu Lys Ala
485 490 495
Leu Asn Ile Arg Glu Gln Ile Gly Tyr Pro Asp Tyr Ile Leu Glu Asp
500 505 510
Asn Asn Arg His Leu Asp Glu Glu Tyr Ser Ser Leu Thr Phe Ser Glu
515 520 525
Asp Leu Tyr Phe Glu Asn Gly Leu Gln Asn Leu Lys Asn Asn Ala Gln
530 535 540
Arg Ser Leu Lys Lys Leu Arg Glu Lys Val Asp Gln Asn Leu Trp Ile 545 550 555 560
Ile Gly Ala Ala Val Val Asn Ala Phe Tyr Ser Pro Asn Arg Asn Leu
565,570,575
Ile Val Phe Pro Ala Gly Ile Leu Gln Pro Pro Phe Phe Ser Lys Asp
580 585 590
Gln Pro Gln Ala Leu Asn Phe Gly Gly Ile Gly Met Val Ile Gly His
595 600 605
Glu Ile Thr His Gly Phe Asp Asp Asn Gly Arg Asn Phe Asp Lys Asn
610 615 620
Gly Asn Met Leu Asp Trp Trp Ser Asn Phe Ser Ala Arg His Phe Arg 625 630 635 640
Gln Gln Ser Gln Cys Met Ile Tyr Gln Tyr Ser Asn Phe Ser Trp Glu
645 650 655
Leu Ala Asp Asn Gln Asn Val Asn Gly Phe Ser Thr Leu Gly Glu Asn
660 665 670
Ile Ala Asp Asn Gly Gly Val Arg Gln Ala Tyr Lys Ala Tyr Leu Gln
675 680 685
Trp Leu Ala Glu Gly Gly Arg Asp Gln Arg Leu Pro Gly Leu Asn Leu
690 695 700
Thr Tyr Ala Gln Leu Phe Phe Ile Asn Tyr Ala Gln Val Trp Cys Gly 705 710 715 720
Ser Tyr Arg Pro Glu Phe Ala Ile Gln Ser Ile Lys Thr Asp Val His
725 730 735
Ser Pro Leu Lys Tyr Arg Val Leu Gly Ser Leu Gln Asn Leu Pro Gly
740 745 750
Phe Ser Glu Ala Phe His Cys Pro Arg Gly Ser Pro Met His Pro Met
755,760,765
Asn Arg Cys Arg Ile Trp
770
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 3:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 20 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) NUMBER OF STRANDS: single
(D) CONFIGURATION: linear
(ii) TYPE OF MOLECULE: oligonucleotide probe
(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 3: TGGAGCGGCA GTTGGCTGTG 20 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 4:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 21 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) NUMBER OF STRANDS: single
(D) CONFIGURATION: linear
(ii) TYPE OF MOLECULE: oligonucleotide probe
(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 4 AGTTCCCACT TGGGGCCCAT G 21
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 5:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 20 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) NUMBER OF STRANDS: single
(D) CONFIGURATION: linear
(ii) TYPE OF MOLECULE: oligonucleotide probe
(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 5: GCTGGAGGAT TCCTCTGTCC 20
'2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 6:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 19 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) NUMBER OF STRANDS: single
(D) CONFIGURATION: linear
(ii) TYPE OF MOLECULE: oligonucleotide probe
(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 6: CGGGGATCAC ATGGTGCCG 19 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 7
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 21 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) NUMBER OF STRANDS: single
(D) CONFIGURATION: linear
(ii) TYPE OF MOLECULE: oligonucleotide probe
(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 7
CTACCCCAAG CTGCGTGATA G 21
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 8
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 21 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) NUMBER OF STRANDS: single
(D) CONFIGURATION: linear
(ii) TYPE OF MOLECULE: oligonucleotide probe
(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 8 CGGCACCATG TGATCCCCGA G 21
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 9
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 22 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) NUMBER OF STRANDS: single
(D) CONFIGURATION: linear
(ii) TYPE OF MOLECULE: oligonucleotide probe
(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 9 GCAAAGCACT AGCTTCAGTG TG 22 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 10:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 22 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) NUMBER OF STRANDS: single
(D) CONFIGURATION: linear
(ii) TYPE OF MOLECULE: oligonucleotide probe
(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 10:
GGTCATCATT CCAGATGAAG AG 22
n INFORMATION FOR SEQ ID NO: 11:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 20 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) NUMBER OF STRANDS: single
(D) CONFIGURATION: linear
(ii) TYPE OF MOLECULE: oligonucleotide probe
(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 11: CGATGAGGAC GCGCCTGTTG 20
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 12:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 20 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) NUMBER OF STRANDS: single
(D) CONFIGURATION: linear
(ii) TYPE OF MOLECULE: oligonucleotide probe
(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 12: TGCAGGAAAG GTTTGGTCTG 20
'2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 13:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 20 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) NUMBER OF STRANDS: single
(D) CONFIGURATION: linear
(ii) TYPE OF MOLECULE: oligonucleotide probe
(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 13: GAACGCCTCA GAGAAGCCTG 20
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 14:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 20 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) NUMBER OF STRANDS: single
(D) CONFIGURATION: linear
(ii) TYPE OF MOLECULE: oligonucleotide probe
(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 14: ATGACCAGAA CTCCAGCCGG
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 15:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 21 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) NUMBER OF STRANDS: single
(D) CONFIGURATION: linear
(ii) TYPE OF MOLECULE: oligonucleotide probe
(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 15:
CATCATGCTT TTTCTCCTGG G 21
INFORMATION FOR SEQ ID NO: 16:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 21 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) NUMBER OF STRANDS: single
(D) CONFIGURATION: linear
(ii) TYPE OF MOLECULE: oligonucleotide probe
(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 16 CCCGAAGTTT CTTGAGGCTC C 21 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 17:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 19 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) NUMBER OF STRANDS: single
(D) CONFIGURATION: linear
(ii) TYPE OF MOLECULE: oligonucleotide probe
(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 17
GATCGGCTAC CCTGACTAC 19 2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 18
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 19 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) NUMBER OF STRANDS: single
(D) CONFIGURATION: linear
(ii) TYPE OF MOLECULE: oligonucleotide probe
(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 18 GTTCGCCATC CAGTCCATC 19 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 19
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 20 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) NUMBER OF STRANDS: single
(D) CONFIGURATION: linear
(ii) TYPE OF MOLECULE: oligonucleotide probe
(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 19: CGAAGCCTAG GCGCCTCCTC 20 19
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