FR2777188A1 - Utilisation d'une porphyrine pour la realisation d'un medicament abaissant le nombre d'eosinophiles - Google Patents

Abstract

La présente invention se rapporte au domaine de la chimie et plus particulièrement à celui de la chimie thérapeutique, humaine ou vétérinaire. Elle a pour objet l'utilisation de la Zinc-Protoporphyrine IX (ZnPP-IX) ou d'un de ses sels pour la réalisation d'un médicament destiné à réduire le nombre des éosinophiles dans les tissus. Plus particulièrement, la ZnPP-IX est utilisée pour la réalisation d'un médicament destiné à traiter les patholologies liées à une hyperéosinophilie telles que l'asthme bronchique, la dermatite atopique, la rhinite allergique, la conjonctivite allergique.

Description

UTILISATION D'UNE PORPHYRINE
POUR LA REALISATION D'UN MEDICAMENT
ABAISSANT LE NOMBRE D'EOSINOPHILES
La présente invention se rapporte au domaine de la chimie et plus particulièrement à celui de la chimie thérapeutique, humaine ou vétérinaire.

La présente invention a plus précisément pour objet l'utilisation d'une porphyrine pour la réalisation d'un médicament abaissant le nombre d'éosinophiles.

En effet, de nombreuses maladies ou pathologies sont liées à une hyperéosinophilie ; parmi celles-ci, on pourra notamment citer l'asthme bronchique.

La morbidité et la mortalité de cette maladie restent importantes. En France, le nombre de personnes touchées par l'asthme est évalué à 2,5 millions, et le nombre de décès directement imputables à l'asthme est de 2 000 par an (cf. Etude épidémiologique de l'European Community
Respiratory Health Survey). Ainsi, la fréquence de l'asthme reste préoccupante, quelle que soit la population étudiée, son âge et sa localisation géographique.

Le traitement de l'asthme chronique - en dehors des crises aiguës - est assuré essentiellement par l'utilisation de ss2-stimulants et par les corticoïdes administrés par inhalation. Les antihistaminiques ne sont plus utilisés aujourd'hui que de façon marginale.

Chaque catégorie de médicament provoque un type d'action différent: Les agents p-stimulants provoquent essentiellement la relaxation des muscles lisses
bronchiques ; ils diminuent également la libération des médiateurs. Ces substances
comprennent l'adrénaline, I'isoprotérénol ainsi que des substances plus sélectives des
récepteurs ss2 (bronches) que des récepteurs ssl 1 (coeur). Après inhalation, les ss2-stimulants
(ss2 adrénergiques) sont rapidement actifs (en quelques minutes) mais ne sont actifs que pour
quelques heures.

Le mode d'action principal de la théophylline est la relaxation du muscle lisse bronchique.

Elle inhibe la phase retardée de l'allergie et inhibe la libération de médiateurs de
l'inflammation par les mastocytes. De nombreux auteurs estiment que c'est actuellement le
traitement d'entretien le plus efficace de l'asthme. Un de ses inconvénients majeurs est
toutefois sa marge thérapeutique étroite.

Les corticostéroides inhibent la migration des granulocytes vers les sites de la réaction
allergique, et empêchent la libération des médiateurs de l'inflammation. En particulier,
lorsqu'ils sont donnés en aérosols, ils inhibent la phase retardée de l'allergie (mais pas la
phase immédiate) et l'hyperréactivité bronchique résultante. Bien qu'ils soient très efficaces,
les corticostéroides administrés de façon systémique sont réservés aux cas difficiles du fait de
leurs effets secondaires. Les stéroides inhalés sont utilisés pour le traitement d'entretien mais
pas pour les épisodes aigus de l'asthme.

Le cromoglycate de sodium et le nédocromil sont utilisés de façon prophylactique. Ils inhibent
la libération des médiateurs et diminuent l'hyperréactivité bronchique. Le cromoglygate paraît
être surtout efficace chez les enfants et seulement chez certains adultes pour le traitement
d'entretien.

La désensibilisation spécifique par voie sous-cutanée est utilisée depuis près de cent ans
cependant, ses mécanismes d'action restent mal compris. Les injections d'allergènes doivent
être effectuées sous contrôle médical. Les résultats de la désensibilisation sont discutés et ne
paraissent améliorer qu'une fraction des asthmatiques.

Les agents anti-leucotriènes constituent actuellement la voie vedette dans le domaine des
nouvelles thérapeutiques de l'asthme. Les leucotriènes sont synthétisés par les cellules de
l'inflammation. Ils jouent un rôle dans le recrutement de cellules de l'inflammation et dans la
bronchoconstriction. De nombreuses molécules capables d'inhiber l'effet des leucotriènes
sont en cours de développement. Deux d'entre elles, le zafirlukast et le pranlukast, sont des
antagonistes du récepteur des leucotriènes, mais leurs indications restent limitées aux asthmes
modérés.

L'intérêt des inhibiteurs de phosphodiestérases, dont le chef de file est la théophylline, est
actuellement redécouvert. Les drogues développées actuellement s'attachent à inhiber plus
spécifiquement la phosphodiestérase de type IV, présente de façon prépondérante dans les
cellules de l'inflammation (éosinophiles, lymphocytes) et les muscles lisses bronchiques. Ces
théophyllines de seconde génération pourraient être mieux tolérées que la théophylline elle
même dont la marge thérapeutique reste étroite.

Par ailleurs, des anticorps monoclonaux dirigés contre l'IL-5 sont développés dans le but de
contrôler l'hyperéosinophilie et l'hyperréactivité bronchique de l'asthme. De même, des
anticorps monoclonaux anti-IgE sont développés dans le but de bloquer les effets des IgE
responsables de la sensibilisation des cellules de l'allergie. Cependant, l'efficacité de ces
produits dans la maladie asthmatique humaine reste encore à démontrer.

L'asthme a été défini comme une maladie chronique inflammatoire des voies aériennes, responsable d'épisodes de sifflements, d'une réduction du VEMS volume expiratoire maximum par seconde) et de l'hyperréactivité bronchique (NIH workshop report, janvier 1995).

L'hyperréactivité bronchique est la tendance qu'ont les bronches de sujets asthmatiques à se contracter sous I'influence de nombreux stimulis irritants ou pharmacologiques qui, chez le sujet sain, sont sans effet.

La caractéristique la plus spectaculaire de l'histopathologie de l'asthme est l'infiltration très importante de la muqueuse bronchique par des éosinophiles, des macrophages et des lymphocytes. L'éosinophile apparaît être la cellule-clé responsable des lésions de la muqueuse bronchique et de l'hyperréactivité bronchique, bien que les mécanismes précis de ces phénomènes soient encore discutés.

Des études récentes ont comparé des asthmatiques avec des volontaires sains en utilisant la technique de lavage broncho-alvéolaire et en pratiquant des biopsies bronchiques. Un nombre élevé d'éosinophiles, à la fois dans la muqueuse bronchique et dans le liquide de lavage bronchoalvéolaire, est une des caractéristiques de l'asthme. L'hyperéosinophilie sanguine et la présence d'éosinophiles dans les expectorations sont caractéristiques de l'asthme ; le taux des éosinophiles sanguin est corrélé au degré d'hyperréactivité bronchique.

Après leur différenciation et leur maturation dans la moelle osseuse, les éosinophiles matures sont libérés dans la circulation sanguine et rejoignent leur localisation préférentielle que sont les tissus. Le temps de survie des éosinophiles dans les tissus n'est pas connu, mais on estime qu'il est au moins de plusieurs jours et il est très probablement fonction de la présence de cytokines telles que l'IL-5, 1'IL-3 ou le GM-CSF. Dans certains tissus (peau, poumon), les éosinophiles sont rares à l'état physiologique, mais en réponse à un stimulus approprié, ils peuvent migrer dans ces tissus où ils expriment leurs fonctions cytotoxiques et libèrent des médiateurs de l'inflammation [Teixeira et al, 1995, Tr. Pharmacol. Sc. 16:418-423].

Les éosinophiles participent à la physiopathologie de maladies allergiques, en particulier dans la peau, le poumon, les muqueuses nasales et oculaires [Corrigan et al, 1992, Immunol. Today 13:501-506].

L'accumulation tissulaire des éosinophiles au cours des maladies allergiques peut se révéler désastreuse ; en effet, les protéines granulaires des éosinophiles sont cytotoxiques pour les cellules épithéliales bronchiques et ont également un grand nombre d'effets sur les mastocytes, les cellules épithéliales, les macrophages et les cellules T. De nombreux travaux, tant chez l'homme que chez l'animal, insistent sur l'association entre le nombre des éosinophiles, leur état d'activation et la sévérité de l'asthme (Bousquet et al, 1990, N. Engl. J. Med. 323:1033-1039
Roisman et al, 1995, J. Clin. Invest. 96:12-21).

Cependant, malgré les progrès réalisés au cours de ces dernières années dans la compréhension des mécanismes de l'allergie en général et de l'asthme en particulier, les médicaments les plus utilisés actuellement appartiennent à des classes thérapeutiques disponibles depuis des décennies et les nouvelles molécules mises sur le marché continuent principalement de reposer sur des concepts anciens.

Selon la présente invention, le médicament proposé repose sur un concept différent : empêcher l'accumulation des éosinophiles dans les tissus en agissant pharmacologiquement sur leur durée de vie. En effet, avoir la possibilité de moduler pharmacologiquement la durée de vie des éosinophiles est capital puisque ceci conditionne la possibilité pour l'éosinophile de libérer des médiateurs, d'exercer sa cytotoxicité ou d'engager des coopérations fonctionnelles avec d'autres cellules. La cytokine IL-5 paraît jouer un rôle très important dans la survie in vivo de l'éosinophile. Il est par conséquent intéressant pharmacologiquement d'inhiber les effets de 1'IL5 et d'autres facteurs de survie des éosinophiles. Cette modulation pharmacologique de la durée de vie des éosinophiles n'a été que peu explorée jusqu'à présent.

Les brevets US 5,510,339 et 5,631,267 (Gleich et al) concernent l'usage de la lidocaine ainsi que d'autres anesthésiques locaux dans le traitement de l'asthme. Ces auteurs indiquent qu'in vitro la lidocame ainsi que d'autres anesthésiques locaux diminuent la survie des éosinophiles.

L'inhalation de lidocaine permettrait ainsi de diminuer la consommation de glucocorticoïdes inhalés chez des sujets asthmatiques.

En l'absence de facteurs de survie (IL-5, IL-3 ou GM-CSF...), les éosinophiles en culture in vitro meurent rapidement (en 48-72 h) par un phénomène actif de mort cellulaire programmée qui a les caractéristiques de l'apoptose. L'apoptose s'oppose à la nécrose qui résulte d'une agression massive de la cellule conduisant à une lyse cellulaire et s'accompagnant alors de phénomènes inflammatoires. Au cours de l'apoptose, au contraire, I'homéostasie cellulaire persiste et l'intégrité membranaire est maintenue. La cellule apoptotique est rapidement reconnue (du fait de l'expression de certains antigènes membranaires) et phagocytée par des macrophages ou par des cellules de l'environnement. La cellule apoptotique participe donc activement à sa propre mort ( suicide cellulaire ).

Ainsi, l'induction de la mort cellulaire programmée des éosinophiles (apoptose) ne s'accompagne pas de phénomènes inflammatoires et au contraire supprime l'inflammation liée à l'hyperéosinophilie tissulaire ; c'est pourquoi l'induction pharmacologique de la mort des éosinophiles par apoptose est un processus intéressant.

La conséquence directe de l'induction de l'apoptose des éosinophiles est la diminution du nombre des éosinophiles dans les tissus.

Cependant, les voies de signalisation intracellulaires qui conduisent à l'apoptose des cellules sont communes à de nombreuses cellules.

Ainsi, le problème qui se pose est celui d'induire spécifiquement l'apoptose des éosinophiles sans induire celles des cellules des muqueuses et épithéliums respiratoires, et par conséquent sans être toxique pour l'organisme.

De façon surprenante il a été trouvé selon la présente invention que la Zinc-Protoporphyrine IX (ZnPP-IX) présente la propriété d'induire l'apoptose des éosinophiles sans être toxique pour l'organisme.

La ZnPP-IX est une molécule naturelle présente en particulier dans les globules rouges. Ses principales caractéristiques chimiques sont les suivantes
- Aspect : rouge sombre
- Poids moléculaire : 626,1
- Formule brute : C34H32N404Zn
- Stockage : - 20"C, stable au moins 1 an - à protéger de la lumière et de l'humidité
- Solubilité : dans éthanol (10 mg/ml), DMSO (20 mg/ml), très soluble dans les
solutions aqueuses alcalines
- Formule développée:

Aucune toxicité n'a été rapportée chez l'animal en ce qui concerne la ZnPP-tX.

Le tableau I ci-dessous rapporte la toxicité de ZnPP-IX et les doses utilisées dans la littérature (études in vivo chez l'animal). On a utilisé trois espèces : rat, souris, singe. Diverses voies d'administration ont été utilisées : intraveineuse (i.v.), intrapéritonéale (i.p.) et sous-cutanée.

Aucun effet nocif n'a été relevé.

<tb>

Références <SEP> Voie <SEP> Dose <SEP> Durée <SEP> Effet <SEP> pharmacologique <SEP> Espèce
<tb> Rodgers <SEP> et <SEP> al, <SEP> 1990 <SEP> i.v. <SEP> 25 <SEP> mg/kg <SEP> 26 <SEP> h <SEP> Diminue <SEP> l'ictère <SEP> néonatal <SEP> Singes <SEP> rhésus
<tb> <SEP> (nouveaux-nés)
<tb> Kadoya <SEP> et <SEP> al, <SEP> 1995 <SEP> i.p. <SEP> 50 <SEP> mg/kg <SEP> 24 <SEP> h <SEP> Protège <SEP> de <SEP> l'ischémie <SEP> cérébrale <SEP> Rats <SEP> adultes
<tb> Rodgers <SEP> et <SEP> al, <SEP> 1996 <SEP> i.p. <SEP> 25 <SEP> mg/kg <SEP> 21 <SEP> j <SEP> Diminue <SEP> l'ictère <SEP> néonatal <SEP> Rats <SEP> nouveaux
<tb> <SEP> nés
<tb> Trakshel <SEP> et <SEP> al, <SEP> 1992 <SEP> s.c. <SEP> 31 <SEP> mg/kg <SEP> 7 <SEP> j <SEP> Pas <SEP> d'effet <SEP> sur <SEP> la <SEP> stéroldogénèse <SEP> Rats
<tb> <SEP> (2x <SEP> -4j)
<tb> Vreman <SEP> et <SEP> al, <SEP> 1990 <SEP> i.v. <SEP> 25 <SEP> mg/kg <SEP> 24 <SEP> h <SEP> Diminue <SEP> l'hyperbilirubinémie <SEP> due <SEP> Singes <SEP> rhésus
<tb> <SEP> à <SEP> un <SEP> hémolyse <SEP> iatrogène <SEP> (nouveaux-nés)
<tb> Qato <SEP> et <SEP> Maines, <SEP> 1985 <SEP> s.c. <SEP> 25 <SEP> mg/kg <SEP> 12j <SEP> Diminue <SEP> l'ictère <SEP> néonatal <SEP> Singes <SEP> rhésus <SEP> et
<tb> <SEP> cynomolgus <SEP>
<tb> Nagai <SEP> et <SEP> al, <SEP> 1992 <SEP> 30 <SEP> mg/kg <SEP> Effet <SEP> anti-inflammatoire <SEP> Rats <SEP> et <SEP> souris
<tb> <SEP> adultes
<tb> Zhao <SEP> et <SEP> al, <SEP> 1996 <SEP> i.p. <SEP> 50 <SEP> mg/kg <SEP> 24 <SEP> h <SEP> Protège <SEP> de <SEP> l'ischémie <SEP> cérébrale <SEP> Rats <SEP> adultes
<tb> Hintz <SEP> et <SEP> al, <SEP> 1990 <SEP> i.p. <SEP> 37 <SEP> mg/kg <SEP> 12 <SEP> h <SEP> Pas <SEP> d'effet <SEP> phototoxique <SEP> Rats <SEP> nouveaux
<tb> <SEP> nés
<tb> Dennery <SEP> et <SEP> al, <SEP> 1993 <SEP> i.p. <SEP> 25 <SEP> mg/kg <SEP> 3 <SEP> h <SEP> Pas <SEP> de <SEP> peroxydation <SEP> lipidique, <SEP> ni <SEP> Rats <SEP> nouveaux
<tb> <SEP> de <SEP> phototoxicité <SEP> lors <SEP> de <SEP> la <SEP> nés
<tb> <SEP> photothérapie
<tb> Vreman <SEP> et <SEP> al, <SEP> 1988 <SEP> p.o. <SEP> 25 <SEP> mg/kg <SEP> 6 <SEP> h <SEP> Pas <SEP> d'effet <SEP> inhibiteur <SEP> sur <SEP> l'même <SEP> Rats <SEP> adultes <SEP> et
<tb> <SEP> oxygénase <SEP> intestinale, <SEP> splénique <SEP> et <SEP> nouveaux-nés
<tb> <SEP> hépatique
<tb>
La présente invention a donc spécifiquement pour objet l'utilisation de la Zinc-Protoporphyrine Ix (ZnPP-IX) ou d'un de ses sels pour la réalisation d'un médicament destiné à réduire le nombre des éosinophiles dans les tissus.

La Zinc-Protoporphyrine IX (ZnPP-IX) pourra par exemple être utilisée sous forme disodique.

Parmi les pathologies liées à une hyperéosinophilie, on pourra citer l'asthme bronchique, la dermatite atopique, la rhinite allergique et la conjonctivite allergique.

En effet, la physiopathologie de la rhinite allergique et de l'asthme se confondent. I1 s'agit dans les deux cas du recrutement d'éosinophiles dans des tissus respiratoires.

La conjonctivite allergique est souvent associée à la rhinite allergique. Bien que moins étudiée sur un plan fondamental que l'asthme et la rhinite allergique, on insiste également sur l'importance du couple mastocyte-éosinophile dans la rhinite allergique.

Au cours de la dermatite topique, il existe un recrutement massif d'éosinophiles dans le derme.

Il existe des dépôts massifs de protéines cationiques des éosinophiles et relativement peu d'éosinophiles intacts (Leiferman K.M., J. Am. Acad. Dermatol. 1991, 24 :1101-1112). En effet, ceux-ci se lysent très rapidement (nécrose).

Ainsi selon l'invention, la Zinc-Protoporphyrine Ix (ZnPP-IX) est utilisée pour la réalisation d'un médicament destiné à traiter les pathologies liées à une hyperéosinophilie.

Plus particulièrement, la ZnPP-IX est utilisée selon l'invention pour la réalisation d'un médicament destiné à traiter l'asthme bronchique, la dermatite atopique, la rhinite allergique, la conjonctivite allergique.

La ZnPP-IX pourra être utilisée en association avec tout autre principe actif destiné à traiter des pathologies liées à une hyperéosinophilie.

Des exemples de tels principes actifs sont les corticoïdes, les ss2-mimétiques, les antileucotriènes....

La ZnPP-IX est utilisée en association avec des excipients ou véhicules inertes, non toxiques, pharmaceutiquement acceptables, permettant son administration par voie orale, topique, parentérale, nasale ou bronchique.

La ZnPP-IX pourra être utilisée sous la forme d'une solution ou d'une suspension aqueuse ou à l'état sec, de comprimés nus ou enrobés, de gélules, de capsules, de poudres.

Pour l'asthme, la forme d'administration préférée est l'administration par voie inhalée.

En règle générale, la teneur en ZnPP-IX pourra s'échelonner de 0,050 mg à 5000 mg par prise unitaire, et de préférence de 50 à 500 mg par prise unitaire.

PARTIE EXPERIMENTALE
EXEMPLE I
Diminution de la survie et induction de l'apoptose in vitro des éosinophiles humains par
ZnPP-IX
Expérimentalement, les cellules apoptotiques peuvent être reconnues sur un certain nombre de critères: . fragmentation de l'ADN due à l'activation d'endonucléases : ceci donne à l'électrophorèse de
l'ADN de cellules apoptotiques un aspect caractéristique en échelle ;
diminution du volume cellulaire et condensation du cytoplasme et des organites cytoplasmiques; aspect pycnotique du noyau et condensation de la chromatine ; enfin, tout au moins dans les premiers temps de l'apoptose in vitro, les cellules apoptotiques excluent le bleu trypan, contrairement aux cellules nécrosées.

1) METHODE a) Purification des éosinophiles par méthode immuno-magnétique
Une suspension riche en leucocytes est obtenue après sédimentation de sang total anticoagulé en présence de dextran T500 (4,5 %). Des aliquots de 35 ml sont ajoutés sur 15 ml de Ficoll. Après centrifugation (30 min, 1000 x g), les cellules mononuclées à l'interface sont éliminées. Le culot qui contient les neutrophiles, les éosinophiles et les hématies est lavé et soumis à un choc osmotique afin d'éliminer les hématies. Le système de séparation cellulaire magnétique (MACS;
Miltenyi Biotec) est utilisé pour purifier les éosinophiles par sélection négative [Hansel et al,
1991, J. Immunol. Meth. 145 105-110]. Des particules magnétiques anti-CD16 (1 tel/1 X 106 cellules) sont ajoutées à la suspension de neutrophiles et d'éosinophiles à 4"C et maintenues à cette température pendant 40 min avec plusieurs remises en suspension. La suspension est alors ajoutée au sommet de la colonne de séparation en présence du champ magnétique, le robinet étant ouvert à la base. On fait passer 30 ml de PBS/SVF à travers la colonne et l'effluent est récupéré. Les cellules marquées magnétiquement (neutrophiles) restent dans la colonne ; les cellules non marquées (éosinophiles) sont récupérées dans l'effluent et lavées.

PBS = Phosphate - buffered saline
SVF = serum de veau foetal b) Culture des éosinophiles en survie
Les éosinophiles fraîchement purifiés sont remis en suspension (1,5 - 3 x 105 cellules par ml) dans du RPMI 1640 (Gibco BRL) supplémenté avec 0,1mM d'acides aminés non essentiels, 100U/ml de pénicilline, 1001lg/ml de streptomycine, 10mM d'HEPES, 2mM de glutamine et 10 % de SVF. Des aliquots de 160put1 de suspension cellulaire sont déposés dans chacun des puits d'une plaque à 96-puits (Costar) contenant 200 d'IL-5 en tant que facteur de survie. Vingt Ill de la substance à étudier à concentration définie ou 20pal du milieu seul à titre de témoin sont déposés dans les puits correpondants. La viabilité cellulaire et le pourcentage d'éosinophiles apoptotiques sont dénombrés à 24 h et à 48 h à l'aide des méthodes ci-dessous. c) Mesure de la survie et de l'apoptose des éosinophiles in vitro
Bleu trvnan : permet de mesurer la viabilité cellulaire.

La suspension cellulaire est ajoutée à un volume égal de bleu trypan à 0.1 % dans du PBS. Le
nombre absolu de cellules excluant le bleu trypan (= cellules vivantes ) par unité de volume
est obtenu par comptage des cellules sur un hémocytomètre (Mallassez).

Cvtologie: permet de visualiser les modifications morphologiques des éosinophiles au cours
de 1'apoptose in vitro.

La suspension cellulaire est cytocentrifugée puis les lames sont colorées (kit RAL 555,
Prolabo). Le pourcentage de cellules apoptotiques est établi en microscopie optique d'après
leur morphologie caractéristique (noyau pycnotique avec chromatine condensée ou noyau
absent, diminution du diamètre cellulaire, condensation cytoplasmique).

Les éosinophiles fraîchement isolés du sang périphérique ont une morphologie caractéristique
en microscopie optique : un cytoplasme granuleux coloré en rouge-orangé par l'éosine et un
noyau le plus souvent bilobé.

En l'absence de facteurs de survie tels que 1'IL-5, 1'IL-3 ou le GM-CSF, les premiers signes
morphologiques de l'apoptose des éosinophiles apparaissent. La chromatine se condense et le
noyau de l'éosinophile prend un aspect pycnotique. Cet aspect pycnotique du noyau, classique
au cours de lapoptose, est toutefois rarement observé chez l'éosinophile, peut-être du fait de
sa brièveté. Un autre signe morphologique caractéristique de l'apoptose est la diminution du
volume cellulaire qui est très marquée chez l'éosinophile (Beauvais et al, 1995, J. Leukoc.

Biol. 57 : 851-855).

Après 48 h d'incubation, les structures nucléaires ont disparu dans la majorité des
éosinophiles qui apparaissent alors sous forme de vésicules anucléées.

Les éosinophiles qui ont été incubés en présence d'lnterleukine-5 ne subissent pas d'apoptose
et leur morphologie (à 48 h) est très voisine de celle des éosinophiles fraîchement prélevés.

Méthode TUNEL (fraRmentation de l'ADN in situ)
La méthode TUNEL permet de visualiser les noyaux apoptotiques contenant de l'ADN
fragmenté. Son principe repose sur la fixation enzymatique d'un marqueur fluorescent
(fluorescéine-12-dUTP) au niveau des extrémités libres de l'ADN (3'-OH ADN). Cette
technique consiste en ce que les cellules de chaque puits sont cytocentrifugées puis fixées par
une solution de formaldéhyde à 4 % (25 min à 4"C). Après lavage, les préparations sont
perméabilisées par une solution de Triton X-100 0,2 % (5 min à 200C). Les cellules sont
incubées (1 h à 37"C) en présence d'une solution contenant la fluorescéine-12-dUTP et
l'enzyme TdT (Terminal deoxynucleotidyl transférase). La réaction est stoppée dans une
solution d'arrêt. Après montage sous lamelle, la préparation est visualisée en microscopie à
fluorescence (Apoptosis Detection System Fluorescein; Promega, Madison, WI, USA).

2) RESULTATS a) Induction de l'apoptose in vitro des éosinophiles par ZnPP-IX
Afin de tester l'effet de la Zn-Protoporphyrine IX sur l'apoptose des éosinophiles, ZnPP-D( a été incubée en présence d'éosinophiles maintenus en survie par l'IL-5.

TABLEAU Il
Apoptose des éosinophiles induite par la Zn-Protoporphyrine-IX (10gM) (moyenne de 3 expériences)

<tb> <SEP> 0 <SEP> 24 <SEP> h <SEP> 48 <SEP> h
<tb> <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 23+1 <SEP> 9412 <SEP>
<tb> <SEP> ZnPP <SEP> 0 <SEP> 45 <SEP> # <SEP> 15 <SEP> <SEP> 99 <SEP> + <SEP> 1
<tb> <SEP> IL-5 <SEP> 0 <SEP> 2 <SEP> # <SEP> 2 <SEP> <SEP> 2 <SEP> # <SEP> 1
<tb> IL-5 <SEP> + <SEP> ZnPP <SEP> 0 <SEP> 3 <SEP> # <SEP> 2 <SEP> <SEP> 99 <SEP> # <SEP> 1
<tb>
Les éosinophiles sont incubés en RPMI 1640 pendant 48 h en présence ou non d'IL-5 (10 pM) et de ZnPP-IX (10pLM).

En l'absence d'IL-5, la ZnPP-IX accélère l'apoptose des éosinophiles. En présence d'IL-5 et de
ZnPP-IX, le nombre de cellules apoptotiques est très faible à 24 h mais, à 48 h, pratiquement toutes les cellules sont apoptotiques.

La figure 1 montre l'aspect des éosinophiles à 48 h selon qu'ils ont été mis (cf. B) ou non (cf. A) en présence de ZnPP-IX.

A : éosinophiles + IL-5 (lOpM) - 48 h
B : éosinophiles + IL-5 (lOpM) + ZnPP-IX (10pM) - 48 h
La figure 2 illustre l'effet dose dépendant de ZnPP-IX sur la survie et l'apoptose des éoisinophiles.

(moyenne de deux expériences représentatives) b) Noyaux des éosinophiles apoptotiques mis en évidence par la méthode TUNEL
Les éosinophiles sont maintenus en survie en présence d'IL-5 (lpM) et de ZnPP-IX (10pM) ou d'une solution témoin pendant 48 h. En présence d'IL-5 et de la solution témoin, il n'existe pas de marquage des noyaux. En revanche, en présence d'IL-5 et de ZnPP-IX, les noyaux apoptotiques, facilement reconnaissables par leur aspect pycnotique, apparaissent marqués. c) Comparaison des effets de ZnPP-IX sur l'apoptose des éosinophiles avec ceux de la dexaméthasone
La dexaméthasone est un inducteur puissant de l'apoptose des éosinophiles. La figure 3 illustre le pourcentage d'éosinophiles apoptotiques induit par la dexaméthasone en fonction de la quantité de cytokine IL-5 (pM). On constate que plus la concentration en IL-5 est élevée, moins la dexarnéthasone induit l'apoptose des éosinophiles. Ainsi, aux plus fortes concentrations d'IL-5 utilisées, la dexaméthasone est sans effet sur l'apoptose. Ce phénomène observé avec 1'IL-5 l'est également avec d'autres cytokines telles que le GM-CSF et 1'IL-3.

Ces résultats indiquent que les éosinophiles sont d'autant plus protégés des effets des glucocorticoïdes qu'ils sont dans un environnement riche en facteurs de survie, comme c'est le cas par exemple dans les sites inflammatoires. En revanche, comme nous l avons vu, la ZnPP-IX induit l'apoptose des éosinophiles aux plus fortes concentrations d'IL-5 (lOpM) et réussit donc là où la dexaméthasone échoue.

EXEMPLE II
Test de l'effet de la ZnPP-IX dans un modèle animal d'hyperéosinophilie
L'effet de la ZnPP-IX a été éudié sur l'hyperéosinophilie péritonéale chez la souris.

METHODE Hvperéosinophilie Péritonéale
On induit l'hyperéosinophilie par l'ovalbumine. a/ Immunisation et induction de I'hyperéosinophilie péritonéale:
Des souris Swiss (20 g environ) sont immunisées par voie sous cutanée deux fois (intervalle 6 jours) par 100 Zg d'ovalbumine dans 0,4 ml d'une suspension à 4 mg/ml d'Al(OH)3 dans NaCl 0,9 %. Une semaine après la deuxième injection, 0,2 ml d'une solution d'ovalbumine à 5 pg/ml d'ovalbumine sont injectés par voie intrapéritonéale. Les souris témoin sont injectées avec le véhicule seul. b/ Quantification de l'infiltrat inflammatoire:
Les souris sont sacrifiées à différents temps (overdose d'éther) et - après dissection - subissent un lavage péritonéal avec 6 ml de NaCI 0,9 % (héparinisé). Après un léger massage, le liquide de lavage est recueilli et la concentration cellulaire est mesurée sur un hémocytomètre. Des lames de cytocentrifugation sont réalisées et colorées par le colorant de Wright (kit RAL 555, Prolabo,
France). Le compte différentiel des cellules mononuclées (monocytes + macrophages + lymphocytes), des éosinophiles et des neutrophiles est réalisé à l'objectif x100 en immersion à l'huile.

Lors du lavage péritonéal d

EXEMPLE III
Exemple de réalisation d'un médicament à base de Zinc protoporphyrine IX
Poudre pour inhalation en gélule
ZnPP-IX 50 mg
Lactose
Enveloppe de la gélule : gélatine

Claims (12)

1. d'un médicament destiné à réduire le nombre des éosinophiles dans les tissus.

   REVENDICATIONS 1. Utilisation de la Zinc-Protoporphyrine IX (ZnPP-IX) ou d'un de ses sels pour la réalisation
2. 2. Utilisation de la ZnPP-IX selon la revendication 1, dans laquelle la ZnPP-IX est sous forme

   disodique.
3. 3. Utilisation de la ZnPP-IX selon la revendication 1 ou la revendication 2, pour la réalisation

   d'un médicament destiné à traiter les pathologies liées à une hyperéosinophilie.
4. 4. Utilisation de la ZnPP-IX selon l'une quelconque des revendications I à 3, dans laquelle la

   pathologie liée à une hyperéosinophilie est I'asthme bronchique.
5. 5. Utilisation de la ZnPP-IX selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans laquelle la

   pathologie liée à une hyperéosinophilie est la dermatite atopique.
6. 6. Utilisation de la ZnPP-IX selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans laquelle la

   pathologie liée à une hyperéosinophilie est la rhinite allergique.
7. 7. Utilisation de la ZnPP-IX selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans laquelle la

   pathologie liée à une hyperéosinophilie est la conjonctivite allergique.
8. 8. Utilisation de la ZnPP-IX selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans laquelle la

   ZnPP-IX est associée en outre à un ou plusieurs principe(s) actif(s) destiné(s) à traiter des

   pathologies liées à une hyperéosinophilie.
9. 9. Utilisation de la ZnPP-IX selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans laquelle la

   ZnPP-IX est associée à des excipients ou véhicules inertes, non toxiques, pharmaceutiquement

   acceptables, permettant son administration par voie orale, topique, parentérale, nasale ou

   bronchique.
10. 10.Utilisation de la ZnPP-IX selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, dans laquelle la

    ZnPP-IX se présente sous la forme d'une solution ou d'une suspension aqueuse ou à l'état sec,

    de comprimés nus ou enrobés, de gélules, de capsules, de poudres.
11. 11.Utilisation de la ZnPP-IX selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, dans laquelle la

    teneur en ZnPP-IX s'échelonne de 0,05 mg à 5000 mg par prise unitaire.
12. 12.Utilisation de la ZnPP-IX selon la revendication 11, dans laquelle la teneur en ZnPP-IX

    s'échelonne de 50 mg à 500 mg par prise unitaire.