FR2767323A1 - Peptides lineaires derives de peptides antibiotiques, leur preparation et leur utilisation pour vectoriser des substances actives - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne des peptides dérivés de peptides antibiotiques ou d'analogues de ceux-ci, caractérisés en ce qu'il sont dépourvus de pont disulfure. L'invention concerne également l'utilisation de ces peptides linéaires pour la vectorisation de substances chimiques ainsi que les composés chimiques formés de ces peptides couplés à au moins une substance active. L'invention concerne encore la préparation de ces peptides et de ces composés et les compositions les contenant.
Description
PEPTIDES LINÉAIRES DÉRIVÉS DE PEPTIDES
ANTIBIOTIQUES, LEUR PRÉPARATION ET LEUR UTILISATION POUR
VECTORISER DES SUBSTANCES ACTIVES.
ANTIBIOTIQUES, LEUR PRÉPARATION ET LEUR UTILISATION POUR
VECTORISER DES SUBSTANCES ACTIVES.
La présente invention concerne des peptides linéaires dérivés de peptides antibiotiques et leur utilisation pour vectoriser des substances actives. Plus particulièrement l'invention a pour objet de nouveaux composés formés d'un dérivé linéaire d'un peptide antibiotique lié à au moins une substance active, ainsi que la préparation de ces composés et les compositions les contenant.
A côté de leur système immunitaire responsable de mécanismes spécifiques de défense contre les agents infectieux, les vertébrés possèdent de nombreux peptides à activité antimicrobienne (Nicolas,
P. et al., 1995, Annual Rev. Microbiol. 49, 277-304).
P. et al., 1995, Annual Rev. Microbiol. 49, 277-304).
Ces peptides sont seulement présents chez les invertébrés à courte durée de vie et à taux de renouvellement élevé, chez lesquels un système immunitaire à mémoire, long à s'établir et à développer une réponse appropriée, serait inadapté.
Les peptides antimicrobiens des vertébrés, quelque soit leur origine, vertébrés inférieurs ou supérieurs, tissus myéloïdes ou non myéloïdes, possèdent un certain nombre de propriétés communes
- Une forte basicité due à la présence de nombreuses arginines et lysines.
- Une forte basicité due à la présence de nombreuses arginines et lysines.
- La capacité de former des structures amphipatiques. On entend par structure amphipatique des structures dans lesquelles les résidus hydrophobes sont spatialement séparés des résidus hydrophiles.
- Un très large spectre d'activité. Ils sont capables de détruire rapidement des bactéries (Gram+ et
Gram-), des champignons, quelques protozoaires, des virus à membrane et même certaines lignées de cellules cancéreuses.
Gram-), des champignons, quelques protozoaires, des virus à membrane et même certaines lignées de cellules cancéreuses.
Selon leur structure, ils peuvent être classés en trois grandes familles
- Les peptides antibiotiques à hélices a amphipatiques : cécropines et maganines (Maloy, W. L. et al., 1995, BioPolymer 37, 105-122).
- Les peptides antibiotiques à hélices a amphipatiques : cécropines et maganines (Maloy, W. L. et al., 1995, BioPolymer 37, 105-122).
- Les peptides antibiotiques à feuillets ss réunis par des ponts disulfures : défensines (Lehrer, R.
I. et al., 1991, Cell 64:229-230 ; Lehrer, R. I. et al., 1993, Ann. Rev. Immunol. 11:105-128), protégrines
(Kokryakov, V. N. et al., 1993, FEBS 337:231-236), tachyplésines (Nakamura, T. et al., 1988, J. Biol. Chem.
(Kokryakov, V. N. et al., 1993, FEBS 337:231-236), tachyplésines (Nakamura, T. et al., 1988, J. Biol. Chem.
263:16709-16713 ; Miyata, T et al., 1989, J. Biochem.
106:663-668).
- les peptides antibiotiques à chaînes déstructurées contenant de nombreux coudes liés à la présence de multiples prolines bacténécines et PR39
(Frank, R. W. et al., 1991, Eur. J. Biochem. 202, 849854).
(Frank, R. W. et al., 1991, Eur. J. Biochem. 202, 849854).
Malgré la diversité de leurs séquences, la plupart des peptides antibiotiques agissent par lyse directe de la membrane des cellules pathogènes. Leur nature basique facilite leur interaction avec les phospholipides chargés négativement, et leur caractère amphipatique leur permet ensuite de s'incorporer dans la membrane où ils s'agrègent pour former des pores par lesquels la cellule perd sa substance. I1 est généralement admis que leur sélectivité préférentielle pour les cellules procaryotes, est due à la composition particulière de leurs membranes qui contiennent davantage de phospholipides anioniques que celles d'eucaryotes. De plus, les membranes plasmiques de cellules de mammifères contiennent toutes du cholestérol, dont le rôle est d'en moduler la fluidité et qui pourrait gêner l'incorporation des peptides antibiotiques. Toutefois, la spécificité de ces derniers pour les microorganismes est faible si bien qu'ils présentent une forte cytotoxicité ce qui en limite l'utilisation.
La présence de peptides antibiotiques chez les vertébrés et plus particulièrement chez les mammifères soulève de nombreuses questions. Les immunologistes supposent que les composés à activité antimicrobienne non-spécifique que l'on rencontre au niveau des invertébrés constituent un moyen ancestral de défense qui a ensuite évolué pour conduire aux systèmes à mémoire beaucoup plus complexes. Quel est donc l'intérêt pour les mammifères, par exemple, d'avoir conservé certains peptides à activité antibiotique ? On admet que ces petites molécules toujours présentes dans les fluides biologiques, ou encore séquestrées dans certaines structures lymphocytaires, pourraient constituer une première ligne de défense en attendant que les anticorps spécifiques soient sécrétés (Nicolas,
P. et al., 1995, Annual Rev. Microbiol. 49, 277-304).
P. et al., 1995, Annual Rev. Microbiol. 49, 277-304).
Ils pourraient également participer au sein des macrophages, à la destruction des membranes plasmiques des organismes pathogénes.
Quelque soit leur rôle exact, les peptides antibiotiques ont un intérêt considérable du fait de leur large spectre d'action et de la difficulté que les microorganismes ont à mettre en place des stratégies d'inactivation. De ce fait de très nombreuses recherches sont entreprises pour essayer de trouver de nouvelles molécules et d'obtenir des analogues plus performant que les peptides parents. I1 se peut que dans l'avenir, ces peptides antibiotiques soient appelés à remplacer les antibiotiques issus de bactéries ou de champignons.
Ainsi les demandes de brevet internationales PCT publiées sous les numéros W095/03325, W096/37508 et
W097/02287 décrivent une nouvelle classe de peptides antibiotiques, désignés "protégrines", isolés de leucocytes de porcs ou encore préparés par synthèse chimique ou par génie génétique et présentant des activités antibactériennes, antivirales et antifongiques.
W097/02287 décrivent une nouvelle classe de peptides antibiotiques, désignés "protégrines", isolés de leucocytes de porcs ou encore préparés par synthèse chimique ou par génie génétique et présentant des activités antibactériennes, antivirales et antifongiques.
Actuellement, les peptides antibiotiques à feuillets ss réunis par des ponts disulfures (défensines, protégrines, tachyplésines) sont particulièrement étudiés étant donné leur puissante activité antimicrobienne (bactéries, certains virus, champignons et parasites). Dans cette famille, les protégrines et les tachyplésines sont certainement les molécules les plus prometteuses étant donné la simplicité de leur structure et la facilité relative de leur synthèse.
On désigne sous le nom de protégrines un ensemble de cinq peptides désignés PG-1, PG-2, PG-3,
PG-4 et PG-5 dont les séquences sont données ci-dessous, étroitement apparentés et isolés de leucocytes de porc (V.N. Kokryakov & col. FEBS lett. 327, 231-236)
PG-1 : RGGRLCYCRRRFCVCVGR-NH2
PG-2 : RGGRLCYCRRRFCICV..-NH2
PG-3 : RGGGLCYCRRRFCVCVGR-NH2
PG-4 : RGGRLCYCRGWICFCVGR-NH2
PG- 5 : RGGRLCYCRPRFCVCVGR-NH2
Les tachyplésines (Tamura, H. et al., 1993,
Chem. Pharm. Bul. Tokyo 41, 978-980), désignées Tl, T2 et T3 et les polyphémusines (Muta, T., 1994, CIBA
Found. Sym. 186, 160-174), désignées P1 et P2, dont les séquences sont données ci-dessous, sont des peptides homologues isolés de l'hémolymphe de deux crabes,
Tachyplesus tridentatus pour les tachyplésines T1, T2 et
T3 et Limmulus polyphemus pour les polyphémusines P1 et
P2.
PG-4 et PG-5 dont les séquences sont données ci-dessous, étroitement apparentés et isolés de leucocytes de porc (V.N. Kokryakov & col. FEBS lett. 327, 231-236)
PG-1 : RGGRLCYCRRRFCVCVGR-NH2
PG-2 : RGGRLCYCRRRFCICV..-NH2
PG-3 : RGGGLCYCRRRFCVCVGR-NH2
PG-4 : RGGRLCYCRGWICFCVGR-NH2
PG- 5 : RGGRLCYCRPRFCVCVGR-NH2
Les tachyplésines (Tamura, H. et al., 1993,
Chem. Pharm. Bul. Tokyo 41, 978-980), désignées Tl, T2 et T3 et les polyphémusines (Muta, T., 1994, CIBA
Found. Sym. 186, 160-174), désignées P1 et P2, dont les séquences sont données ci-dessous, sont des peptides homologues isolés de l'hémolymphe de deux crabes,
Tachyplesus tridentatus pour les tachyplésines T1, T2 et
T3 et Limmulus polyphemus pour les polyphémusines P1 et
P2.
P1 : RRWCFRVCYRGFCYRKCR-NH2
P2 : RRWCFRVCYKGFCYRKCR-NH2
T1 : KWCFRVCYRGICYRRCR-NH2
T2 : RWCFRVCYRGICYRKCR-NH2
T3 : KWCFRVCYRGICYKRCR-NH2
Protégrines, tachyplésines et polyphémusines contiennent une forte proportion de résidus basiques (lysines et arginines) et possédent quatre cystéines qui forment deux ponts disulfures paralléles. Ces trois familles de peptides présentent également des homologies avec certaines défensines et en particulier avec la défensine humaine NP-1 (Kokryakov, V. N. et al., 1993,
Febs Let. 327, 231-236).
P2 : RRWCFRVCYKGFCYRKCR-NH2
T1 : KWCFRVCYRGICYRRCR-NH2
T2 : RWCFRVCYRGICYRKCR-NH2
T3 : KWCFRVCYRGICYKRCR-NH2
Protégrines, tachyplésines et polyphémusines contiennent une forte proportion de résidus basiques (lysines et arginines) et possédent quatre cystéines qui forment deux ponts disulfures paralléles. Ces trois familles de peptides présentent également des homologies avec certaines défensines et en particulier avec la défensine humaine NP-1 (Kokryakov, V. N. et al., 1993,
Febs Let. 327, 231-236).
Tachyplésines et protégrines possédent une structure tridimensionnelle voisine. I1 s'agit d'un feuillet ss antiparalléle stabilisé par les deux ponts disulfures. Ces ponts jouent un rôle important dans l'activité antibactérienne des protégrines et des tachyplésines. Leur suppression, soit en protégeant les groupements SH par des acétamidométhyles, soit en remplaçant les cystéines par des alanines ou des glycines, conduit à des analogues pratiquement dénués d'activité in vivo (Lehrer, R. I. et al., 1996, Eur. J.
Biochem. 240:352-357).
Comme indiqué précédemment, les protégrines et les tachyplésines ont une importante activité lytique sur les cellules procaryotes. Les travaux de recherche réalisés par la Demanderesse sur la cytotoxicité de ces peptides sur des cellules de mammifère en culture, ont permis de mettre en évidence, avant la mort des cellules, des quantités non-négligeables de protégrines et de tachyplésines dans le cytoplasme desdites cellules. Il a été envisagé que la présence des peptides dans le cytoplasme pouvait résulter d'un transport par le biais de pores, mais ces pores ne sont perméables qu'aux ions et aux petites molécules et leur diamètre est trop petit pour permettre le passage des peptides antibiotiques. I1 semblerait que les protégrines et tachyplésines, en plus de perforer la membrane plasmique, soient capables de la traverser.
Il est connu que la cytotoxicité et l'activité antimicrobienne des protégrines et des tachyplésines sont dus à leur capacité de s'agréger à l'intérieur de la membrane pour former des canaux multimèriques (Mangoni, M. et al., 1996, Febs Let. 383, 93-98) . La Demanderesse a alors envisagé que cette agrégation soit reliée à la structure tertiaire de ces peptides antibiotiques qui comportent plusieurs résidus cystéines, et des dérivés linéaires des protégrines et des tachyplésines dans lesquels les cystéines sont remplacées par divers acides aminés naturels, ont été synthétisés. Ces peptides ont été couplés, par leur extrémité C-terminale, à une molécule fluorescente ou la biotine et la répartition de ces marqueurs à l'intérieur de la cellule a été observée par microscopie confocale.
I1 a ainsi maintenant été trouvé que ces peptides sont non-toxiques et sans activité lytique mais sont par contre capables de traverser rapidement les membranes des cellules de mammifères par un mécanisme passif.
Ces dérivés linéaires des peptides antibiotiques constituent donc un nouveau système de vectorisation de substances actives qui est non toxique.
Par système de vectorisation, on entend selon l'invention, un processus capable de transporter ladite substance active jusqu'à une cible, comme par exemple
- de faire traverser la membrane cellulaire à une substance active et de permettre la distribution de celle-ci dans le cytoplasme et/ou dans le compartiment nucléaire,
- d'amener une substance active au niveau d'un organe particulier, par exemple de faire franchir à cette substance active la barrière hémato-encéphalique,
- de forcer cette substance active à interagir spécifiquement avec un type cellulaire donné, comme par exemple les hématies.
- de faire traverser la membrane cellulaire à une substance active et de permettre la distribution de celle-ci dans le cytoplasme et/ou dans le compartiment nucléaire,
- d'amener une substance active au niveau d'un organe particulier, par exemple de faire franchir à cette substance active la barrière hémato-encéphalique,
- de forcer cette substance active à interagir spécifiquement avec un type cellulaire donné, comme par exemple les hématies.
La présente invention a donc pour objet des peptides dérivés des peptides antibiotiques ou d'analogues de ceux-ci, caractérisés en ce qu'ils sont dépourvus de pont disulfure.
L'absence de pont disulfure dans les peptides de l'invention peut être obtenue par tout moyen connu de l'homme du métier. Par exemple
- en supprimant ou en remplaçant par d'autres acides aminés les résidus de cystéine de la séquence du peptide antibiotique,
- en bloquant les groupes -SH des résidus cystéines de façon à ce qu'ils ne forment pas de pont di su fure,
dès lors bien entendu que le peptide obtenu présente les propriétés de vectorisation sans toxicité pour les cellules décrites précédemment
Ces modifications peuvent être réalisées lors de la préparation des peptides de l'invention, plus particulièrement par synthèse chimique ou par expression d'un gène codant pour ledit peptide, ou directement sur un peptide antibiotique par action d'agents chimiques permettant d'ouvrir et de bloquer les groupes -SH des résidus de cystéine.
- en supprimant ou en remplaçant par d'autres acides aminés les résidus de cystéine de la séquence du peptide antibiotique,
- en bloquant les groupes -SH des résidus cystéines de façon à ce qu'ils ne forment pas de pont di su fure,
dès lors bien entendu que le peptide obtenu présente les propriétés de vectorisation sans toxicité pour les cellules décrites précédemment
Ces modifications peuvent être réalisées lors de la préparation des peptides de l'invention, plus particulièrement par synthèse chimique ou par expression d'un gène codant pour ledit peptide, ou directement sur un peptide antibiotique par action d'agents chimiques permettant d'ouvrir et de bloquer les groupes -SH des résidus de cystéine.
Les modifications ci-dessus concernent avantageusement tous les résidus de cystéines du peptide antibiotique, mais dès lors que la présence d'un unique résidu de cystèine ne permet pas la formation de pont disulfure, les peptides de l'invention peuvent contenir une seule cystéine. Les peptides antibiotiques naturels présentent généralement 4 ou 6 résidus de cystéine capables de former deux ou trois ponts disulfures, aussi dans les peptides de l'invention, l'une seulement de ces cystéines peut être maintenue et les trois ou cinq autres sont modifiées.
Les peptides d'antibiotiques dont dérivent les peptides de l'invention peuvent être des défensines, des protégrines, des tachyplésines ou leurs analogues, dont les propriétés antibiotiques leur sont conférées par leur structure tertiaire résultant de la présence de ponts disulfures.
Des peptides préférés selon l'invention répondent à l'une des formules suivantes
BXXBXXXXBBBXXXXXXB (I)
BBXXXBXXXBXXXXBBXB (I I)
qui peuvent être aussi représentées par la formule unique (III) suivante B(XB)X(XB)X(XB)XX(XB)B(XB)(XB)X(XB)(XB)XB
dans lesquelles
- les groupes B, identiques ou différents, représentent un résidus d'acide aminé dont la chaîne latérale porte un groupement basique, et
- les groupes X, identiques ou différents, représentent un résidus d'acide aminé aliphatique ou aromatique.
BXXBXXXXBBBXXXXXXB (I)
BBXXXBXXXBXXXXBBXB (I I)
qui peuvent être aussi représentées par la formule unique (III) suivante B(XB)X(XB)X(XB)XX(XB)B(XB)(XB)X(XB)(XB)XB
dans lesquelles
- les groupes B, identiques ou différents, représentent un résidus d'acide aminé dont la chaîne latérale porte un groupement basique, et
- les groupes X, identiques ou différents, représentent un résidus d'acide aminé aliphatique ou aromatique.
B et X peuvent être des acides aminés naturels ou non, y compris des acides aminés de configuration D. On peut citer comme exemple, les significations de B et X suivantes
- B est choisi parmi l'arginine, la lysine, l'acide diaminoacétique, l'acide diaminobutyrique, 1' acide diaminopropionique, l'ornithine.
- B est choisi parmi l'arginine, la lysine, l'acide diaminoacétique, l'acide diaminobutyrique, 1' acide diaminopropionique, l'ornithine.
- X est choisi parmi la glycine, l'alanine, la valine, la norleucine, l'isoleucine, la leucine, la cystéine, la cystéineAcm, la penicillamine, la méthionine, la serine, la thréonine, l'asparagine, la glutamine, la phénylalanine, l'histidine, le tryptophane, la tyrosine, la proline, l'Abu, l'acide amino-l-cyclohexane carboxylique, l'Aib, la 2aminotétraline carboxylique, la 4-bromophénylalanine, tert-Leucine, la 4-chlorophénylalanine, la ss- cyclohexylalanine, la 3,4-dichlorophénylalanine, la 4 fluorophénylalanine, 1 'homoleucine, la B-homoleucine, l'homophénylalanine, la 4-méthylphénylalanine, la 1naphtylalanine, la 2-naphtylalanine, la 4nitrophénylalanine, la 3-nitrotyrosine, la norvaline, la phénylglycine, la 3-pyridylalanine, la [2thiényl]alanine.
L'invention concerne aussi l'utilisation des peptides ci-dessus pour la vectorisation d'une ou plusieurs substances actives tant pour des applications thérapeutiques que de diagnostic. A titre de substance active, l'invention envisage notamment des proteines ou fragments de protéines, comme des polypeptides ou peptides, des anticorps ou partie d'anticorps, des acides nucléiques et oligonucléotides ou des ribozymes, ou encore, bien entenu des molécules chimiques actives pour le traitement ou la prévention de pathologies humaines ou animales, comme par exemple et de manière non limitative des antitumoraux, des antiviraux, des agents anti-inflammatoires, des agents empêchant la dégradation d'organes et/ou de tissus, etc...
Dans le domaine du diagnostic, la substance active peut être un marqueur radioactif, un marqueur coloré, ou tout autre moyen ou substance capable de révéler un métabolisme ou une pathologie.
L'invention a donc également pour objet des composés de formule (IV) suivante, ainsi que les compositions les contenant (u tff A )( Z (1V)
dans laquelle
- A représente un peptide linéaire dérivé d'un peptide antibiotique conforme à l'invention,
- Z représente une substance active, comme défini ci-dessus,
- Y représente un agent signal,
- n est 0 et ou plus, et avantageusement 0 ou 1,
- m est 1 ou plus, et de préférence jusqu'à 10 avantageusement jusqu'à 5,
Ainsi, les composés de formule (IV) cidessus sont formés à partir d'un peptide de l'invention couplé à une ou plusieurs substances actives, identiques ou différentes, représentées par le groupe (Z) dans la formule (IV), et éventuellement un ou plusieurs agents de signal, représentés par le groupe (Y) dans la formule
(IV), ayant un rôle d'adressage du composé de formule
(IV) vers un type cellulaire, un site ou compartiment de la cellule ou un tissus particulier. Plus particulièrement, l'agent signal (Y) est un oligopeptide ou une protéine, comme un peptide signal, un signal de localisation nucléaire, un fragment d'anticorps, ou une molécule chimique ligand ou anti-ligand d'un récepteur.
dans laquelle
- A représente un peptide linéaire dérivé d'un peptide antibiotique conforme à l'invention,
- Z représente une substance active, comme défini ci-dessus,
- Y représente un agent signal,
- n est 0 et ou plus, et avantageusement 0 ou 1,
- m est 1 ou plus, et de préférence jusqu'à 10 avantageusement jusqu'à 5,
Ainsi, les composés de formule (IV) cidessus sont formés à partir d'un peptide de l'invention couplé à une ou plusieurs substances actives, identiques ou différentes, représentées par le groupe (Z) dans la formule (IV), et éventuellement un ou plusieurs agents de signal, représentés par le groupe (Y) dans la formule
(IV), ayant un rôle d'adressage du composé de formule
(IV) vers un type cellulaire, un site ou compartiment de la cellule ou un tissus particulier. Plus particulièrement, l'agent signal (Y) est un oligopeptide ou une protéine, comme un peptide signal, un signal de localisation nucléaire, un fragment d'anticorps, ou une molécule chimique ligand ou anti-ligand d'un récepteur.
Dans une forme toute particulière de réalisation des composés de formule (IV), le groupe (Y) est fixé au groupe (Z).
Le couplage, symbolisé par les traits horizontaux dans la formule (IV), peut être réalisé par tout moyen de liaison acceptable compte tenu de la nature chimique, de l'encombrement et du nombre de groupes (Z) et (Y) dans les composés de formule (IV), comme des liaisons covalentes, hydrophobes ou ioniques, clivables ou non-clivables dans les milieux physiologiques. Le couplage peut être effectué en n'importe quel site du peptide (A), dans lequel des groupements fonctionels tels que -OH, -SH, -COOH, -NH2
sont naturellement présents ou ont été introduits.
sont naturellement présents ou ont été introduits.
L'invention envisage aussi la fixation de plusieurs groupes (Z) sur un même site du peptide (A), soit directement, si ce site comporte plusieurs groupements fonctionnels, comme dans le cas d'une lysine
C- ou N-terminale, soit indirectement via un groupe
intermédiaire portant plusieurs groupements réactionnels permettant d'y fixer plusieurs groupes (Z).
C- ou N-terminale, soit indirectement via un groupe
intermédiaire portant plusieurs groupements réactionnels permettant d'y fixer plusieurs groupes (Z).
Les positions de couplage préférées pour la substance active sont au niveau de l'extrémité C
terminale ou bien au niveau des groupements amines primaires portés par les chaînes latérales des lysines du peptide (A). Dans le cas où l'on utilise l'extrémité
C-terminale du peptide (A) pour accrocher la substance active (Z), l'extrémité N-terminale est disponible pour le couplage éventuel à un agent signal (Y) permettant l'adressage du composé de l'invention soit vers le noyau, soit encore vers un type tissulaire particulier.
terminale ou bien au niveau des groupements amines primaires portés par les chaînes latérales des lysines du peptide (A). Dans le cas où l'on utilise l'extrémité
C-terminale du peptide (A) pour accrocher la substance active (Z), l'extrémité N-terminale est disponible pour le couplage éventuel à un agent signal (Y) permettant l'adressage du composé de l'invention soit vers le noyau, soit encore vers un type tissulaire particulier.
En effet, par exemple dans le cas du couplage à l'extrémité C-terminale d'un peptide linéaire de l'invention, d'une substance active constituée par un marqueur fluorescent, comme la biotine, ou une molécule médicamenteuse telle que la doxorubicine, le complexe covalent peptide-drogue après administration se répartit dans le cytoplasme de la cellule cible. I1 est possible d'amener ce complexe dans le compartiment nucléaire en couplant à l'extrémité N-terminale du peptide une courte séquence basique, par exemple d'environ 7 acides aminés, correspondant à un signal de localisation nucléaire. Dans ces conditions, la biotine ou la doxorubicine se retrouvent dans le noyau de la cellule.
De la même manière, il est possible de vectoriser une drogue vers un type cellulaire donné, en ajoutant à l'extrémité N-terminale du peptide linéaire de l'invention couplé à son extrémité C-terminale à un médicament, une séquence peptidique capable de reconnaitre spécifiquement un déterminant présent à la surface de type cellulaire. Ainsi, le pentadecapeptide aM2 (Swolapenko, G. B. et al., 1995, The Lancet 346, 1662-65) synthétique, fragment d'un anticorps monoclonal, dirigé contre un antigéne exprimé par les cellules de cancer du sein (Tumour Associated Antigen
Polymorphic Epithelial Mucin), conserve une bonne affinité pour ces cellules. I1 est donc possible en associant aM2 à un ensemble peptide linéaire-médicament, d'amener cet ensemble préférentiellement vers les cellules qui expriment la caractéristique antigénique liée au cancer mammaire.
Polymorphic Epithelial Mucin), conserve une bonne affinité pour ces cellules. I1 est donc possible en associant aM2 à un ensemble peptide linéaire-médicament, d'amener cet ensemble préférentiellement vers les cellules qui expriment la caractéristique antigénique liée au cancer mammaire.
Les composés de formule (IV) peuvent être préparés par synthèse chimique ou en utilisant des techniques de biologie moléculaire.
On peut utiliser pour les synthèses chimiques des appareils commerciaux permettant d'incorporer des acides aminés non-naturels, tels que les énantiomères D et des résidus ayant des chaînes latérales ayant des hydrophobicités et des encombrements différents de ceux de leurs homologues naturels. Au cours de la synthèse, il est évidemment possible de réaliser un large éventail de modifications, par exemple introduire sur le N-terminal un lipide (prenyl ou myristyl) de façon à pouvoir ancrer le peptide de
l'invention et donc le composé de formule (IV) à une membrane lipidique telle que celle d'un liposome constitué de lipides chargés positivement. I1 est également possible de remplacer une ou plusieurs
liaisons peptidiques (-CO-NH-) par des structures équivalentes comme -CO-N(CH3)-, -CH2-CH2-, -CO-CH2-, ou bien d'intercaller des groupes comme -CH2-, -NH-, -O-.
l'invention et donc le composé de formule (IV) à une membrane lipidique telle que celle d'un liposome constitué de lipides chargés positivement. I1 est également possible de remplacer une ou plusieurs
liaisons peptidiques (-CO-NH-) par des structures équivalentes comme -CO-N(CH3)-, -CH2-CH2-, -CO-CH2-, ou bien d'intercaller des groupes comme -CH2-, -NH-, -O-.
On peut également obtenir les composés de formule (IV) ou partie de ceux-ci de nature protéique à partir d'une séquence d'acide nucléique codant pour celui-ci. La présente invention a aussi pour objet une molécule d'acide nucléique comprenant ou constituée par une séquence nucléique codant pour un peptide linéaire dérivé de peptide antibiotique. Plus particulièrement l'invention concerne une molécule d'acide nucléique comprenant au moins une séquence codant pour un composé de formule (IV) ou une partie de celui de nature protéique. Ces séquences d'acides nucléiques peuvent être des ADN ou ARN et être associées à des séquences de contrôle et/ou être insérées dans des vecteurs. Le 'vecteur utilisé est choisi en fonction de l'hôte dans lequel il sera transféré; il peut s'agir de tout vecteur comme un plasmide. Ces acides nucléiques et vecteurs sont utiles pour produire les peptides linéaires et les composés de formule (IV) ou partie de ceux-ci de nature protéique dans un hôte cellulaire. La préparation de ces vecteurs ainsi que la production ou l'expression dans un hôte des peptides linéaires ou des composés de formule (IV) peuvent être réalisées par les techniques de biologie moléculaire et de génie génétique bien connues de l'homme du métier.
A titre d'exemple, un tel procédé de production d'un peptide selon l'invention consiste
- à transférer une molécule d'acide nucléique ou un vecteur contenant ladite molécule dans un hôte cellulaire,
- à cultiver ledit hôte cellulaire dans des conditions permettant la production du peptide,
- à isoler, par tous moyens appropriés les peptides de l'invention.
- à transférer une molécule d'acide nucléique ou un vecteur contenant ladite molécule dans un hôte cellulaire,
- à cultiver ledit hôte cellulaire dans des conditions permettant la production du peptide,
- à isoler, par tous moyens appropriés les peptides de l'invention.
L'hôte cellulaire mis en oeuvre dans ce type de procédé peut être choisi parmi les procaryotes ou les eucaryotes et notamment parmi les bactéries, les levures, les cellules de mammifères, de plantes ou d'insectes. L'invention concerne donc aussi les cellules transformées exprimant les peptides linéaires ou les composés de formule (IV) ou partie de ceux-ci de nature protéique.
L'invention se rapporte aussi
- aux compositions pharmaceutiques comprenant comme principe actif au moins un composé de formule (IV) éventuellement associé à un véhicule ou support acceptable.
- aux compositions pharmaceutiques comprenant comme principe actif au moins un composé de formule (IV) éventuellement associé à un véhicule ou support acceptable.
- aux agents de diagnostic constitués d'au moins un composé de formule (IV).
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront dans la description qui suit se rapportant à la préparation de composés de formule (IV) ainsi qu aux travaux de recherche ayant mené à la mise en évidence des propriétés de vectorisation des peptides
linéaires de l'invention dérivés de peptides
antibiotiques.
linéaires de l'invention dérivés de peptides
antibiotiques.
Exemnle 1 Fixation de la biotine et de la doxorubicine sur un analogue linéaire de la srotégrine.
1) Préparation des peptides linéaires.
Les trois peptides de séquences ci-dessous ont été synthétisés RGGRLXYXRRRFXVXVGR - NH2
RRWXFRVXYRGFXYRKXR-NH2 KWXFRVXYRG TXYRRXR- NH2
dans lesquels X représente les résidus
serine, thréonine ou alanine.
RRWXFRVXYRGFXYRKXR-NH2 KWXFRVXYRG TXYRRXR- NH2
dans lesquels X représente les résidus
serine, thréonine ou alanine.
Ces peptides dérivent repectivement des
séquences de le protégrine PG-1 de formule
RGGRLCYCRRRFCVCVGR-NH2,
de la tachyplésine 1 de formule KWCFRVCYRGICYRRCR-NH2,
de la polyphémusine de formule KWXFRVXYRGIXYRRXR-NH2.
séquences de le protégrine PG-1 de formule
RGGRLCYCRRRFCVCVGR-NH2,
de la tachyplésine 1 de formule KWCFRVCYRGICYRRCR-NH2,
de la polyphémusine de formule KWXFRVXYRGIXYRRXR-NH2.
Ces trois peptides peuvent être préparés indifféremment soit à partir d'une chimie BOC, soit à partir d'une chimie FMOC, par des procédés classiques de synthèse en phase solide ou homogène.
2) Fixation de la biotine sur les sentides linéaires.
Le peptide est synthétisé en phase solide et après incorporation de l'arginine N-terminale on ajoute l'acide 5-aminopentanoïque. Le Fmoc ou le Boc N
terminal est enlevé et on fait réagir sur le peptide toujours accroché à la résine le N-hydroxy succimido ester de la biotine dans le diméthylformamide. Après 15 heures de réaction à température ambiante, le peptide biotinilé est coupé du support par action de l'acide trifluoroacétique ou de l'acide fluorohydrique selon des protocoles bien établis dans la chimie des peptides. Le peptide est ensuite purifié par chromatographie liquide à haute pression.
terminal est enlevé et on fait réagir sur le peptide toujours accroché à la résine le N-hydroxy succimido ester de la biotine dans le diméthylformamide. Après 15 heures de réaction à température ambiante, le peptide biotinilé est coupé du support par action de l'acide trifluoroacétique ou de l'acide fluorohydrique selon des protocoles bien établis dans la chimie des peptides. Le peptide est ensuite purifié par chromatographie liquide à haute pression.
3) Fixation de la doxorubicine sur un peptide linéaire
Pour fixer la doxorubicine, on synthétise en phase solide le peptide de formule RGGRLXYXRRRFXVXVGR -NH2
Après clivage du support de purification, le peptide est traité par l'anhydre glutarique en présence de triéthylamine. Le peptide est alors purifié et le groupement -COOH porté par le glutaryl en N-terminal est activé par le mélange diisopropylcarbodiimide et 1hydroxybenzotriazole. Après deux heures de réaction à température ambiante, de la doxorubicine est ajoutée et le mélange est agité pendant 12 heures à OOC. L'ensemble peptide-doxorubicine est alors purifié par chromatographie liquide à haute pression.
Pour fixer la doxorubicine, on synthétise en phase solide le peptide de formule RGGRLXYXRRRFXVXVGR -NH2
Après clivage du support de purification, le peptide est traité par l'anhydre glutarique en présence de triéthylamine. Le peptide est alors purifié et le groupement -COOH porté par le glutaryl en N-terminal est activé par le mélange diisopropylcarbodiimide et 1hydroxybenzotriazole. Après deux heures de réaction à température ambiante, de la doxorubicine est ajoutée et le mélange est agité pendant 12 heures à OOC. L'ensemble peptide-doxorubicine est alors purifié par chromatographie liquide à haute pression.
Exemple 2 : Capacité des peptides linéaires dérivés de peptides antibioticues à sasser les membranes de cellules.
1) Modèles cellulaires.
La capacité des peptides à passer les membranes a été testée sur divers types cellulaires (MCF7, MCF7R, HL60, HL6OR, HeLa).
Les cellules sont cultivées sur RPMI 1640 (Gibco) auquel on ajoute 10% (v/v) de serum veau foetal, 2mM glutamine and 2mM penicilline/streptomycine, a 370C.
30 000 cellules sont ensemencées dans des chambres Lab
Tek et cultivées pendant 1 jour.
Tek et cultivées pendant 1 jour.
2) Traitement par les DeDtides linéairesbiotine préparés conformément à l'exemple 1 (2).
Les cellules sont incubées dans de lOpti- Mem (Gibco) pendant une heure avant d'être traitées pendant des temps variables avec les peptides marqués à la biotine.
Ces derniers sont obtenus conformément à l'exemple 1(2) en traitant 1 équivalent de peptide linéaire par 2 équivalents d'ester de Nhydroxysuccinimide de la biotine, puis purifié par chromatographie liquide à haute pression.
Les cellules sont ensuite fixées avec une solution à 3.78 de paraformaldéhyde pendant 5 minutes à 250C, puis rincées trois fois avec du PBS. Elles sont ensuite perméabilisées par du Triton 0.1% (1 min, température ambiante). Après trois rinçages au PBS, les cellules sont incubées 10 min avec 200 Fl d'anticorps
TexRed dilué au 300éme et rincées trois fois au PBS. Les lames sont enfin montées avec une solution Mowiol-Dabco et observées au photomicroscope Axiophot.
TexRed dilué au 300éme et rincées trois fois au PBS. Les lames sont enfin montées avec une solution Mowiol-Dabco et observées au photomicroscope Axiophot.
3) Traitement car les nettides linéairesdoxorubicine préparés conformément à exemple 1 (3)
Les cellules sont incubées pendant 15 minutes, puis rincées avec du PBS et ensuite la doxorubicine présente dans la cellule est dosée par chromatographie.
Les cellules sont incubées pendant 15 minutes, puis rincées avec du PBS et ensuite la doxorubicine présente dans la cellule est dosée par chromatographie.
4) Résultats.
a) Parmi les peptides étudiés, ceux qui passent le plus facilement les membranes sont ceux répondant aux formules suivantes RXXRXUXCTRRRXUXUXXR-NH2 ( V )
RRXUXRXDXRXXUXRRUR-NH2 (VI)
dans lesquelles
- U représente la sérine ou la thréonine,
- R représente l'arginine, et
- les groupes X identiques ou différents
représentent un acide aminés naturel ou non (y compris
acides aminés de configuration D) aliphatiques ou
aromatiques, comme la glycine, l'alanine, la valine, la
norleucine, l'isoleucine, la leucine, la cystéine, la cystéine , la penicillamine, la méthionine, la serine,
la thréonine, l'asparagine, la glutamine, la
phénylalanine, l'histidine, le tryptophane, la tyrosine,
la proline, 1 'au, l'acide amino-l-cyclohexane
carboxylique, 1 'Aib, la 2-aminotétraline carboxylique,
la 4-bromophénylalanine, tert-Leucine, la 4
chlorophénylalanine, la ss-cyclohexylalanine, la 3,4
dichlorophénylalanine, la 4-fluorophénylalanine,
l'homoleucine, la ss-homoleucine, l'homophénylalanine, la
4-méthylphénylalanine, la l-naphtylalanine, la 2
naphtylalanine, la
a) Parmi les peptides étudiés, ceux qui passent le plus facilement les membranes sont ceux répondant aux formules suivantes RXXRXUXCTRRRXUXUXXR-NH2 ( V )
RRXUXRXDXRXXUXRRUR-NH2 (VI)
dans lesquelles
- U représente la sérine ou la thréonine,
- R représente l'arginine, et
- les groupes X identiques ou différents
représentent un acide aminés naturel ou non (y compris
acides aminés de configuration D) aliphatiques ou
aromatiques, comme la glycine, l'alanine, la valine, la
norleucine, l'isoleucine, la leucine, la cystéine, la cystéine , la penicillamine, la méthionine, la serine,
la thréonine, l'asparagine, la glutamine, la
phénylalanine, l'histidine, le tryptophane, la tyrosine,
la proline, 1 'au, l'acide amino-l-cyclohexane
carboxylique, 1 'Aib, la 2-aminotétraline carboxylique,
la 4-bromophénylalanine, tert-Leucine, la 4
chlorophénylalanine, la ss-cyclohexylalanine, la 3,4
dichlorophénylalanine, la 4-fluorophénylalanine,
l'homoleucine, la ss-homoleucine, l'homophénylalanine, la
4-méthylphénylalanine, la l-naphtylalanine, la 2
naphtylalanine, la
- Traitement de la cellule pendant 30 minutes avec un complexe biotine-peptide linéaire de
l'invention.
l'invention.
On observe dans ces clichés que la biotine
seule ne rentre pas dans la cellule et s'accumule
faiblement autour de celle-ci. A l'inverse, avec le
complexe de l'invention, on constate que la biotine est
entraînée rapidement par le peptide linéaire de
l'invention à l'intérieur de la cellule où elle est présente dans le cytoplasme et dans le noyau de la cellule.
seule ne rentre pas dans la cellule et s'accumule
faiblement autour de celle-ci. A l'inverse, avec le
complexe de l'invention, on constate que la biotine est
entraînée rapidement par le peptide linéaire de
l'invention à l'intérieur de la cellule où elle est présente dans le cytoplasme et dans le noyau de la cellule.
Dans les séquences peptidiques rapportées
ci-dessus, les acides aminés sont représentés par leur
code à une lettre, mais ils peuvent être aussi
représentés par leur code à trois lettres selon la nomenclature ci-dessous.
ci-dessus, les acides aminés sont représentés par leur
code à une lettre, mais ils peuvent être aussi
représentés par leur code à trois lettres selon la nomenclature ci-dessous.
A Ala alanine
C Cys cystéine
D Asp acide aspartique
E Glu acide glutamique
F Phe phénylalanine
G Gly glycine
H His histidine
I Ile isoleucine
K Lys lysine
L Leu leucine
M Met méthionine
N Asn asparagine
P Pro proline
Q Gln glutamine
R Arg arginine
S Ser sérine
T Thr thréonine
V Val valine w W Trp tryptophane
Y Tyr tyrosine
C Cys cystéine
D Asp acide aspartique
E Glu acide glutamique
F Phe phénylalanine
G Gly glycine
H His histidine
I Ile isoleucine
K Lys lysine
L Leu leucine
M Met méthionine
N Asn asparagine
P Pro proline
Q Gln glutamine
R Arg arginine
S Ser sérine
T Thr thréonine
V Val valine w W Trp tryptophane
Y Tyr tyrosine
Claims (13)
1) Peptide dérivé d'un peptide antibiotique ou d'un analogue de celui-ci, caractérisé en ce qu'il est dépourvu de pont disulfure.
2) Peptide dérivé d'un peptide antibiotique ou d'un analogue de celui-ci, caractérisé en ce que tous les résidus cystéines, éventuellement sauf un, sont supprimés, remplacés par un autre résidu d'acide ou bloqués au niveau de leur groupe SH.
3) Peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 2, caractérisé en ce qu'il répond à l'une des formules suivantes
BXXBXXXXBBBXXXXXXB (I) BBXXXBXXXBXXXXBBXB (11)
dans lesquelles
- les groupes B, identiques ou différents, représentent un résidu d'acide aminé dont la chaîne latérale porte un groupement basique, et
- les groupes X, identiques ou différents, représentent un résidu d'acide aminé aliphatique ou aromatique.
4) Peptide selon la revendication 3, caractérisé en ce que les groupes B sont choisis parmi l'arginine, la lysine, l'acide diaminoacétique, l'acide diaminobutyrique, l'acide diaminopropionique, ltornithine.
5) Peptide selon l'une des revendications 3 à 4, caractérisé en ce que les groupes X sont choisis parmi la glycine, l'alanine, la valine, la norleucine, l'isoleucine, la leucine, la cystéine, la cystéineAcm, la penicillamine, la méthionine, la serine, la thréonine, l'asparagine, la glutamine, la phénylalanine, l'histidine, le tryptophane, la tyrosine, la proline, l'Abu, l'acide amino-l-cyclohexane carboxylique, 1 'Aib, la 2-aminotétraline carboxylique, la 4bromophénylalanine, tert-Leucine, la 4chlorophénylalanine, la B-cyclohexylalanine, la 3,4dichlorophénylalanine, la 4-fluorophénylalanine, l'homoleucine, la ss-homoleucine, l'homophénylalanine, la 4-méthylphénylalanine, la l-naphtylalanine, la 2naphtylalanine, la 4-nitrophénylalanine, la 3nitrotyrosine, la norvaline, la phénylglycine, la 3pyridylalanine, la [2-thiényl]alanine.
6) Peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il répond à l'une des formules suivantes RXX RXUXURRRXUXUXXR - NH 2 (V)
RRXUXRXUXRXXUXRRUR -NH2 (VI)
dans lesquelles
- U représente la sérine ou la thréonine,
- R représente l'arginine, et
- les groupes X identiques ou différents représentent un acide aminés naturel ou non (y compris acides aminés de configuration D) aliphatiques ou aromatiques, comme la glycine, l'alanine, la valine, la norleucine, l'isoleucine, la leucine, la cystéine, la cystéineAcm, la penicillamine, la méthionine, la serine, la thréonine, l'asparagine, la glutamine, la phénylalanine, l'histidine, le tryptophane, la tyrosine, la proline, l'Abu, l'acide amino-l-cyclohexane carboxylique, l'Aib, la 2-aminotétraline carboxylique, la 4-bromophénylalanine, tert-Leucine, la 4chlorophénylalanine, la ss-cyclohexylalanine, la 3,4dichlorophénylalanine, la 4-fluorophénylalanine, l'homoleucine, la ss-homoleucine, l'homophénylalanine, la 4-méthylphénylalanine, la l-naphtylalanine, la 2naphtylalanine, la 4-nitrophénylalanine, la 3 nitrotyrosine, la norvaline, la phénylglycine, la 3pyridylalanine, la [2-thiényl]alanine.
7) Utilisation d'un peptide antibiotique ou d'un analogue de celui-ci dépourvu de pont disulfure, pour vectoriser des substances actives dans un organisme.
8) Composé de formule (IV) suivante YtffAwftZ m (il)
dans laquelle
- A représente un peptide linéaire dérivé d'un peptide antibiotique conforme à l'invention,
- Z représente une substance active,
- Y représente un agent signal,
- n est 0 et ou plus, et avantageusement 0 ou 1,
- m est 1 ou plus, et de préférence jusqu'à 10, avantageusement jusqu'à 5,
9) Composé de formule (IV) telle que définie à la revendication 8, caractérisé en ce que le couplage entre le peptide linéaire (A) et le groupe (Z) ou les groupes (Z) et (Y) est réalisé par une ou plusieurs liaisons covalentes, hydrophobes ou ioniques.
10) Composé de formule (IV) telle que définie à l'une quelconque deg revendications 8 à 9, caractérisé en ce que l'une au moins des substances actives (Z) est fixée par une liaison covalente soit à l'extrémité C-terminale, soit au niveau des groupements amines primaires portés par les chaînes latérales des lysines, du peptide linéaire (A).
11) Composé de formule (IV) telle que définie à l'une quelconque des revendications 8 à 10,
11) Composé de formule (IV) telle que définie à l'une quelconque des revendications 8 à 10, caractérisé en ce qu'au moins un agent signal (Y), s'il est présent, est fixé par une liaison covalente à l'extrémité N-terminale du peptide linéaire (A).
12) Composition pharmaceutique caractérisé en ce qu'elle comprend comme principe actif au moins un composé de formule (IV) selon l'une quelconque des revendications 8 à 11.
13) Un agent de diagnostic constitué d'au moins un composé de formule (IV) selon l'une quelconque des revendications 8 à 11.
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9710297A FR2767323B1 (fr) | 1997-08-12 | 1997-08-12 | Peptides lineaires derives de peptides antibiotiques, leur preparation et leur utilisation pour vectoriser des substances actives |
| CA002298932A CA2298932A1 (fr) | 1997-08-12 | 1998-08-06 | Peptides lineaires derives de peptides antibiotiques, leur preparation et leur utilisation pour vectoriser des substances actives |
| EP98941556A EP1003771A1 (fr) | 1997-08-12 | 1998-08-06 | Peptides lineaires derives de peptides antibiotiques, leur preparation et leur utilisation pour vectoriser des substances actives |
| AU89889/98A AU754617B2 (en) | 1997-08-12 | 1998-08-06 | Linear peptides derived from antibiotic peptides, preparation and use for vectoring active substances |
| IL13429398A IL134293A0 (en) | 1997-08-12 | 1998-08-06 | Linear peptides derived from antibiotic peptides, preparation and use for vectoring active substances |
| PCT/FR1998/001757 WO1999007728A2 (fr) | 1997-08-12 | 1998-08-06 | Peptides lineaires derives de peptides antibiotiques, leur preparation et leur utilisation pour vectoriser des substances actives |
| JP2000506230A JP2001512739A (ja) | 1997-08-12 | 1998-08-06 | 抗生作用ペプチドから誘導される線状ペプチド、製法および活性物質を仲介する用途 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9710297A FR2767323B1 (fr) | 1997-08-12 | 1997-08-12 | Peptides lineaires derives de peptides antibiotiques, leur preparation et leur utilisation pour vectoriser des substances actives |
Publications (2)
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|---|---|
| FR2767323A1 true FR2767323A1 (fr) | 1999-02-19 |
| FR2767323B1 FR2767323B1 (fr) | 2001-01-05 |
Family
ID=9510249
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR9710297A Expired - Fee Related FR2767323B1 (fr) | 1997-08-12 | 1997-08-12 | Peptides lineaires derives de peptides antibiotiques, leur preparation et leur utilisation pour vectoriser des substances actives |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1003771A1 (fr) |
| JP (1) | JP2001512739A (fr) |
| AU (1) | AU754617B2 (fr) |
| CA (1) | CA2298932A1 (fr) |
| FR (1) | FR2767323B1 (fr) |
| IL (1) | IL134293A0 (fr) |
| WO (1) | WO1999007728A2 (fr) |
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| WO2003103718A3 (fr) * | 2002-06-07 | 2004-11-25 | Univ Lausanne | Administration intracellulaire d'effecteurs biologiques |
| US6960648B2 (en) | 2000-10-13 | 2005-11-01 | Universite De Lausanne | Intracellular delivery of biological effectors |
| US8183339B1 (en) | 1999-10-12 | 2012-05-22 | Xigen S.A. | Cell-permeable peptide inhibitors of the JNK signal transduction pathway |
| US10023615B2 (en) | 2008-12-22 | 2018-07-17 | Xigen Inflammation Ltd. | Efficient transport into white blood cells |
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