FR2765582A1 - New alkyl-di:hydro-pyrido:indolone derivatives - Google Patents

Abstract

3-Alkyl-1,9-dihydro-2H-pyrido 2,3-b indol-2-one derivatives of formula (I), in the form of pure optical isomers or isomer mixtures, are new. X = H, Me, OH, OMe or phenylmethoxy; R1,R2 = H or Me; R3 = 1-10C alkyl, 3-6C cycloalkyl or (3-6C) cycloalkyl-(1-3C) alkyl.

Description

La présente invention a pour objet des dérivés de 3-alkyl-The subject of the present invention is 3-alkyl-derivatives.

1,9-dihydro-2H-pyrido[2,3-b]indol-2-one, leur préparation et  1,9-dihydro-2H-pyrido [2,3-b] indol-2-one, their preparation and

leur application en thérapeutique.their application in therapeutics.

Les composés de l'invention répondent à la formule générale (I) R3  The compounds of the invention correspond to the general formula (I) R 3

_; (I)_; (I)

K\NOK \ NO

NNOT

I R2I R2

R2 dans laquelle X représente un atome d'hydrogène ou un groupe méthyle, hydroxy, méthoxy ou phénylméthoxy, R1 représente un atome d'hydrogène ou un groupe méthyle, R2 représente un atome d'hydrogène ou un groupe méthyle, et R3 représente un groupe (C1-Cl0)alkyle linéaire ou ramifié,  Wherein X is hydrogen, methyl, hydroxy, methoxy or phenylmethoxy, R1 is hydrogen or methyl, R2 is hydrogen or methyl, and R3 is a group; (C1-C10) linear or branched alkyl,

un groupe (C3-C6)cycloalkyle ou un groupe (C3-C6)cycloalkyl-  a (C3-C6) cycloalkyl group or a (C3-C6) cycloalkyl group

(Cl-C3)alkyle.(Cl-C3) alkyl.

Lorsque R3 contient un atome de carbone chiral, les composés correspondants peuvent se présenter sous forme d'isomères  When R3 contains a chiral carbon atom, the corresponding compounds can be in the form of isomers

optiques purs ou en mélanges.optical pure or in mixtures.

Des composés particulièrement intéressants sont ceux dans la formule générale desquels X représente un atome d'hydrogène,  Particularly interesting compounds are those in the general formula of which X represents a hydrogen atom,

R1 et R2 représentent chacun un groupe méthyle, et R3 repré-  R1 and R2 each represent a methyl group, and R3 represents

sente un groupe (Cl-C4)alkyle.a (Cl-C4) alkyl group.

Conformément à l'invention, on peut préparer les composés de formule générale (I) par un procédé en une étape illustré par  According to the invention, the compounds of general formula (I) can be prepared by a one-step process illustrated by

le schéma qui suit.the following diagram.

On fait réagir un dérivé de 2-aminoindole de formule générale  A 2-aminoindole derivative of general formula is reacted

(II), dans laquelle X, R1 et R2 sont tels que définis ci-  (II), wherein X, R1 and R2 are as defined above.

dessus, avec un ester de formule générale (III), dans laquelle R3 est tel que défini ci-dessus et R4 représente un groupe (C1-C4)alkyle, dans un solvant aprotique, polaire et Schéma  above, with an ester of general formula (III), wherein R3 is as defined above and R4 represents a (C1-C4) alkyl group, in an aprotic solvent, polar and Scheme

X I NH ()NHX I NH () NH

< X > (II)<X> (II)

N R,N R,

Ri OHRi OH

R3 O (III)R3 O (III)

R3 O t R4 R3R3 O t R4 R3

N NN N

I R2I R2

R1 basique, par exemple la pyridine, à une température comprise  Basic R1, for example pyridine, at a temperature of

entre 20 C et la température de reflux.  between 20 C and the reflux temperature.

Les 2-aminoindoles de formule générale (II) peuvent être préparés par des méthodes telles que celles décrites dans Khim. Geterosikl. Soedin. (1973) 5 647-652 et dans  The 2-aminoindoles of the general formula (II) can be prepared by methods such as those described in Khim. Geterosikl. Soedin. (1973) 5 647-652 and in

J. Heterocyclic. Chem. (1975) 12 135-138.  J. Heterocyclic. Chem. (1975) 12135-138.

Les esters de formule générale (III) peuvent être préparés par des méthodes telles que celles décrites dans J. Org. Chem. (1984) 49(22) 4290-4293 et dans J. Org. Chem. (1975)  The esters of general formula (III) can be prepared by methods such as those described in J. Org. Chem. (1984) 49 (22) 4290-4293 and in J. Org. Chem. (1975)

(11) 1588-1592.(11) 1588-1592.

Les exemples suivants illustrent en détail la préparation de  The following examples illustrate in detail the preparation of

quelques composés selon l'invention. Les microanalyses élé-  some compounds according to the invention. Microanalyses

mentaires et les spectres IR et RMN confirment les structures  and the IR and NMR spectra confirm the structures

des composés obtenus.compounds obtained.

Les numéros des composés indiqués entre parenthèses dans les  The numbers of the compounds indicated in parentheses in the

titres correspondent à ceux du tableau donné plus loin.  The titles correspond to those in the table given below.

Dans les noms des composés, le tiret "-" fait partie du mot, et le tiret " " ne sert que pour la coupure en fin de ligne; il est à supprimer en l'absence de coupure, et ne doit être  In the names of the compounds, the hyphen "-" is part of the word, and the hyphen "" is only used for the cut at the end of the line; it is to be deleted in the absence of a break, and must not be

remplacé ni par un tiret normal ni par un espace.  replaced by a normal hyphen or space.

Exemple 1 (Composé N 3).Example 1 (Compound N 3).

1,9-Diméthyl-3-propyl-1,9-dihydro-2H-pyrido[2,3-b]indol-2-  1,9-Dimethyl-3-propyl-1,9-dihydro-2H-pyrido [2,3-b] indol-2-

one. Dans un ballon de 50 ml on mélange 1,2 g (6,1 mmoles) de chlorhydrate de N,l-diméthylindole-2-amine et 2 g (12,6 mmoles)de 2propyl-2-formylacétate d'éthyle en solution dans ml de pyridine, et on chauffe au reflux pendant 15 h. On évapore le solvant sous pression réduite, on reprend le résidu solide avec 100 ml d'acétate d'éthyle, on lave la solution avec de l'eau puis avec de l'acide chlorhydrique 1 N. on la sèche sur sulfate de sodium, on la filtre, on évapore le solvant sous pression réduite et on purifie le résidu par chromatographie sur colonne de gel de silice en éluant avec un mélange 2/1 à 1/0 d'acétate d'éthyle et de cyclohexane. Après recristallisation dans l'acétate d'éthyle on obtient  one. 1.2 g (6.1 mmol) of N, 1-dimethylindole-2-amine hydrochloride and 2 g (12.6 mmol) of ethyl 2-propyl-2-formylacetate in solution are mixed in a 50 ml flask. in ml of pyridine, and heated at reflux for 15 h. The solvent is evaporated off under reduced pressure, the solid residue is taken up in 100 ml of ethyl acetate, the solution is washed with water and then with 1N hydrochloric acid and dried over sodium sulphate. it is filtered, the solvent is evaporated off under reduced pressure and the residue is purified by chromatography on a column of silica gel, eluting with a 2/1 to 1/0 mixture of ethyl acetate and cyclohexane. After recrystallization from ethyl acetate,

0,65 g de solide blanc.0.65 g of white solid.

Point de fusion: 170-172 C.Melting point: 170-172C.

Exemple 2 (Composé N 6).Example 2 (Compound N 6).

1,9-Diméthyl-3-(1-méthyléthyl)-1,9-dihydro-2H-pyrido [2,3-b]indol-2-one. Dans un ballon de 100 ml on mélange 3,90 g (19,7 mmoles) de chlorhydrate de N,l-diméthylindole-2-amine et 6,42 g ((39,4 mmoles) de 2(1-méthyléthyl)-2-formylacétate d'éthyle en solution dans 60 ml de pyridine et on chauffe au reflux pendant 18 h. On évapore le solvant sous pression réduite, et on purifie le  1,9-Dimethyl-3- (1-methylethyl) -1,9-dihydro-2H-pyrido [2,3-b] indol-2-one. In a 100 ml flask, 3.90 g (19.7 mmol) of N, 1-dimethylindole-2-amine hydrochloride and 6.42 g ((39.4 mmol) of 2 (1-methylethyl) - Ethyl 2-formylacetate dissolved in 60 ml of pyridine and heated at reflux for 18 h The solvent is evaporated under reduced pressure and the residue is purified

résidu comme indiqué dans l'exemple précédent.  residue as shown in the previous example.

On obtient 3,17 g de solide blanc.3.17 g of white solid are obtained.

Point de fusion: 175,5-176,5 C.Melting point: 175.5-176.5 C.

Exemple 3 (Composé N 16).Example 3 (Compound N 16).

3-Cyclopropyl-l,9-diméthyl-1,6-dihydro-2H-pyrido[2,3-b]indol-  3-Cyclopropyl-l, 9-dimethyl-1,6-dihydro-2H-pyrido [2,3-b] indol

2-one. Dans un ballon de 50 ml on mélange 0,7 g (3,52 mmoles) de chlorhydrate de N,1-diméthylindole-2-amine et 1 g (7,04 mmoles)de 2cyclopropyl-2-formylacétate d'éthyle en solution dans 10 ml de pyridine, et on chauffe au reflux pendant 12 h. On évapore le solvant sous pression réduite, et on purifie le résidu comme indiqué dans l'exemple 1, en effectuant toute- fois la chromatographie avec un mélange 6/4 à 1/0 d'acétate  2-one. In a 50 ml flask, 0.7 g (3.52 mmol) of N, 1-dimethylindole-2-amine hydrochloride and 1 g (7.04 mmol) of 2-cyclopropyl-2-formyl ethyl acetate in solution are mixed in solution. in 10 ml of pyridine, and heated under reflux for 12 hours. The solvent was evaporated under reduced pressure, and the residue was purified as in Example 1, chromatographing with a 6/4 to 1/0 mixture of acetate.

d'éthyle et de cyclohexane.of ethyl and cyclohexane.

On obtient 0,3 g de solide blanc.0.3 g of white solid is obtained.

Point de fusion: 138-140 C.Melting point: 138-140C.

Exemple 4 (Composé N 10).Example 4 (Compound N 10).

1-Méthyl-3-(1-méthyléthyl)-l,9-dihydro-2H-pyrido[2,3-b]indol-  1-Methyl-3- (1-methylethyl) -l, 9-dihydro-2H-pyrido [2,3-b] indol

2-one. Dans un ballon de 100 ml on mélange 1,17 g (6,94 mmoles) de chlorhydrate de N-méthylindole-2-amine et 1,58 g (10 mmoles) de 2-(1méthyléthyl)-2-formylacétate d'éthyle en solution dans 8 ml de pyridine et on chauffe au reflux pendant 6 h. On évapore le solvant sous pression réduite, on dissout le résidu dans 400 ml de dichlorométhane, on lave la solution avec de l'acide chlorhydrique 0,1 N puis avec de l'eau, on la sèche sur sulfate de sodium, on évapore les solvants sous pression réduite, et on purifie le résidu par chromatographie sur colonne de gel de silice en éluant avec un mélange 98/2 à 80/20 de dichlorométhane et d'acétate d'éthyle, puis avec un  2-one. In a 100 ml flask, 1.17 g (6.94 mmol) of N-methylindole-2-amine hydrochloride and 1.58 g (10 mmol) of ethyl 2- (1-methylethyl) -2-formylacetate are mixed together. dissolved in 8 ml of pyridine and refluxed for 6 h. The solvent is evaporated off under reduced pressure, the residue is dissolved in 400 ml of dichloromethane, the solution is washed with 0.1N hydrochloric acid and then with water, dried over sodium sulphate and the solvents are evaporated. solvents under reduced pressure, and the residue is purified by chromatography on a column of silica gel, eluting with a 98/2 to 80/20 mixture of dichloromethane and ethyl acetate, and then with a

mélange 95/5 à 80/20 de dichlorométhane et de méthanol.  95/5 to 80/20 mixture of dichloromethane and methanol.

Après recristallisation dans un mélange de dichlorométhane, méthanol et acétonitrile on obtient finalement 0,71 g de  After recrystallization from a mixture of dichloromethane, methanol and acetonitrile, 0.71 g of

solide blanc.white solid.

Point de fusion: 265,5-267,5 C.Melting point: 265.5-267.5 C.

Le tableau qui suit illustre les structures chimiques et les  The following table illustrates the chemical structures and

propriétés physiques de quelques composés de l'invention.  physical properties of some compounds of the invention.

TableauBoard

R3 xR3 x

I R2I R2

N( RR 2 NO X R, R2 R3 k F ( C)_N (RR 2 NO X R, R 2 R 3 k F (C))

1 H CH3 CH3 CH3 204-2071 H CH3 CH3 CH3 204-207

2 H CH3 CH3 CH2CH3 165-1672H CH3 CH3 CH2CH3 165-167

3 H CH3 CH3 (CH2)2CH3 170-1723H CH3 CH3 (CH2) 2 CH3 170-172

4 H CH3 CH3 (CH2)3CH3 132-1344H CH3 CH3 (CH2) 3CH3 132-134

H CH3 CH3 (CH2)4CH3 113-115H CH3 CH3 (CH2) 4CH3 113-115

6 H CH3 CH3 CH(CH3)2 175,5-176,56H CH3 CH3 CH (CH3) 2 175.5-176.5

7 6-OH CH3 CH3 CH(CH3)2 263-2657 6-OH CH 3 CH 3 CH (CH 3) 2 263-265

8 6-OCH3 CH3 CH3 CH(CH3)2 179-1818 6-OCH 3 CH 3 CH 3 CH (CH 3) 2 179-181

9 6-OCH2C6H5 CH3 CH3 CH (CH3)2 168-170  9 6-OCH 2 C 6 H 5 CH 3 CH 3 CH (CH 3) 2 168-170

H H CH3 CH(CH3)2 265,5-267,5H H CH 3 CH (CH 3) 2 265.5-267.5

11 H CH3 CH3 CH(CH2CH3)2 179-18211H CH3 CH3 CH (CH2CH3) 2 179-182

12 H CH3 CH3 CH((CH2)2CH3) 2 129-130  12 H CH3 CH3 CH ((CH2) 2CH3) 2 129-130

13 H CH3 CH3 CH ( (CH2)3CH3)2 97-9813H CH3 CH3 CH ((CH2) 3CH3) 2 97-98

14 H CH3 CH3 CH(CH3)CH2CH3 197-19914H CH3 CH3 CH (CH3) CH2CH3 197-199

H CH3 CH3 cC6H11 177-178 16 H CH3 CH3 cC3H5 138-140  H CH3 CH3 cC6H11 177-178 16H CH3 CH3 cC3H5 138-140

17 H CH3 CH3 C(CH3)3 215-21717H CH3 CH3 C (CH3) 3 215-217

18 H CH3 H CH(CH3)2 234-23618H CH3H CH (CH3) 2,234-236

19 7-CH3 CH3 CH3 (CH2)2CH3 210-21219 7-CH3 CH3 CH3 (CH2) 2CH3 210-212

6-OCH3 CH3 CH3 (CH2)2CH3 138-1406-OCH3 CH3 CH3 (CH2) 2CH3 138-140

Note: dans la colonne R3, "cC3H5 désigne un groupe  Note: in column R3, "cC3H5 denotes a group

cyclopropyle et cC6H1l désigne un groupe cyclohexyle.  cyclopropyl and cC6H1l denotes a cyclohexyl group.

Les composés de l'invention ont été soumis à des essais pharmacologiques qui ont mis en évidence leur intérêt comme  The compounds of the invention have been subjected to pharmacological tests which have highlighted their interest as

substances à activités thérapeutiques.  substances with therapeutic activities.

Etude des liaisons membranaires vis-à-vis des sites modulateurs e1 (benzodiazépiniques de type I) associés aux  Study of Membrane Binding Versus Modulating E1 (Benzodiazepine Type I) Sites Associated with

récepteurs GABAA contenant la sous-unité a1.  GABAA receptors containing the a1 subunit.

L'affinité des composés pour les sites modulateurs 1 du cervelet a été déterminée selon une variante de la méthode  The affinity of the compounds for the modulator sites 1 of the cerebellum was determined according to a variant of the method.

décrite par S.Z. Langer et S. Arbilla dans Fund. Clin. Phar-  described by S.Z. Langer and S. Arbilla in Fund. Clin. Pharmacia

macol. (1988) 2 159-170, avec utilisation de [3H]flumazénil  Macol. (1988) 2 159-170, using [3H] flumazenil

au lieu de [3H]diazépam comme radioligand.  instead of [3H] diazepam as radioligand.

On homogénéise le tissu du cervelet pendant 60 s dans 120 volumes de tampon glacé (50 mM Tris/HCl, pH 7,4, NaCl 120 mM, KCl 5 mM) puis, après dilution à 1/3, on fait incuber la suspension avec du [3H]flumazénil (activité spécifique: -87 Ci/mmole; New England Nuclear) à une concentration de 1 nM et avec les composés de l'invention, à différentes concentrations, dans un volume final de 525 Ml. Après 30 min d'incubation à 0 C on filtre les échantillons sous vide sur des filtres Whatman GF/BTM et on les lave immédiatement avec du tampon glacé. La liaison spécifique du [3H]flumazénil est  The cerebellar tissue is homogenized for 60 seconds in 120 volumes of ice-cold buffer (50 mM Tris / HCl, pH 7.4, 120 mM NaCl, 5 mM KCl) and, after dilution to 1/3, the suspension is incubated with [3H] flumazenil (specific activity: -87 Ci / mmol, New England Nuclear) at a concentration of 1 nM and with the compounds of the invention, at different concentrations, in a final volume of 525 Ml. After incubation for 30 min at 0 ° C., the samples were filtered under vacuum on Whatman GF / BTM filters and washed immediately with ice-cold buffer. The specific binding of [3H] flumazenil is

déterminée en présence de diazépam 1 jM non marqué. On ana-  determined in the presence of unlabeled 1 M diazepam. We analyzed

lyse les données selon les méthodes usuelles et on calcule la CI50, concentration qui inhibe 50 % de la liaison du [3H]flumazénil.  The data are lysed according to the usual methods and the IC50, which inhibits 50% of [3 H] flumazenil binding, is calculated.

Les CI50 des composés les plus actifs vont de 0,1 à 1 MM.  The IC 50's of the most active compounds range from 0.1 to 1 MM.

Etude des liaisons membranaires vis-à-vis des sites modula-  Study of membrane bonds vis-à-vis modulators

teurs w2 (benzodiazépiniques de type II) associés aux récepteurs GABAA contenant majoritairement les sous-unités 2  w2 (benzodiazepine type II) receptors associated with GABAA receptors predominantly containing subunits 2

et c3.and c3.

L'affinité des composés pour les sites modulateurs c2 de la moelle épinière a été déterminée selon une variante de la  The affinity of the compounds for c2 modulator sites of the spinal cord was determined according to a variant of the

méthode décrite par S.Z. Langer et S. Arbilla dans Fund.  method described by S.Z. Langer and S. Arbilla in Fund.

Clin. Pharmacol. (1988) 2 159-170, avec utilisation de  Clin. Pharmacol. (1988) 2 159-170, with use of

[3H]flumazénil au lieu de [3H]diazépam comme radioligand.  [3H] flumazenil instead of [3H] diazepam as radioligand.

On homogénéise le tissu de la moëlle épinière pendant 60 s dans 30 volumes de tampon glacé (50 mM Tris/HC1, pH 7,4, NaCl -7 mM, KCl 5 mM) puis, après dilution à 1/3, on fait incuber la suspension avec du [3H]flumazénil (activité spécifique: -87 Ci/mmole; New England Nuclear) à une concentration de 1 nM et avec les composés de l'invention, à différentes concentrations, dans un volume final de 525 4l. Après 30 min d'incubation à 0 C on filtre les échantillons sous vide sur des filtres Whatman GF/BM et on les lave immédiatement avec du tampon glacé. La liaison spécifique du [3H]flumazénil est  The tissue of the spinal cord is homogenized for 60 seconds in 30 volumes of ice-cold buffer (50 mM Tris / HCl, pH 7.4, NaCl-7 mM, KCl 5 mM) and, after dilution to 1/3, incubated the suspension with [3H] flumazenil (specific activity: -87 Ci / mmol, New England Nuclear) at a concentration of 1 nM and with the compounds of the invention, at different concentrations, in a final volume of 525 4l. After incubation for 30 min at 0 ° C., the samples were filtered under vacuum on Whatman GF / BM filters and washed immediately with ice-cold buffer. The specific binding of [3H] flumazenil is

déterminée en présence de diazépam 1 jM non marqué. On ana-  determined in the presence of unlabeled 1 M diazepam. We analyzed

lyse les données selon les méthodes usuelles et on calcule la CI50, concentration qui inhibe 50 % de la liaison du [3H]flumazénil.  The data are lysed according to the usual methods and the IC50, which inhibits 50% of [3 H] flumazenil binding, is calculated.

Les CI50 des composés les plus actifs vont de 0,3 à 1 MM.  The IC 50's of the most active compounds range from 0.3 to 1 MM.

Etude de la liaison membranaire vis-à-vis d'une population de sites modulateurs w (benzodiazépiniques) associés aux  Study of the membrane binding with respect to a population of w (benzodiazepine) modulator sites associated with

récepteurs GABAA contenant la sous-unité -5.  GABAA receptors containing the -5 subunit.

Ces récepteurs peuvent être marqués sélectivement dans des membranes d'hippocampe de rat incubées en présence de [3H]flumazénil et de zolpidem 5 MM (afin de masquer les  These receptors may be selectively labeled in rat hippocampal membranes incubated in the presence of [3H] flumazenil and 5M zolpidem (to mask the

autres sous-types de récepteurs ).  other receptor subtypes).

Les composés ont fait l'objet d'une étude in vitro quant à  The compounds were the subject of an in vitro study as to

leur affinité pour ces récepteurs marqués par le [3H]fluma-  their affinity for these receptors marked by [3H] fluma-

zénil. Les animaux utilisés sont des rats mâles OFA (Iffa Credo) de à 250 g. Après décapitation on prélève l'hippocampe et on le broie au moyen d'un appareil Ultra-TurraxM ou PolytronTM pendant 20 s à 6/10 de la vitesse maximale dans 80 volumes de  Zenil. The animals used are male OFA rats (Iffa Credo) of 250 g. After decapitation, the hippocampus is removed and crushed using an Ultra-TurraxM or PolytronTM device for 20 seconds at 6/10 of the maximum speed in 80 volumes of

tampon Tris 50 mM à un pH ajusté à 7,4 avec de l'acide chlor-  50 mM Tris buffer at a pH adjusted to 7.4 with chlorinated acid.

hydrique, et contenant 120 mM de chlorure de sodium et 5 mM  hydric, and containing 120 mM sodium chloride and 5 mM

de chlorure de potassium.of potassium chloride.

La liaison avec le [3H]flumazénil (1 nM; activité spéci-  Binding with [3H] flumazenil (1 nM;

fique: 70-87 Ci/mmole; Du Pont de Nemours / New England  70-87 Ci / mmole; Du Pont de Nemours / New England

Nuclear) est déterminée par incubation de 200 pl de sus-  Nuclear) is determined by incubating 200 μl of sus-

pension de membranes dans un volume final de 1 ml de tampon contenant 5 AM de zolpidem et le composé à tester. Après une incubation de 45 min à 0 C on récupère les membranes par filtration sur filtres Whatman GF/BM qu'on lave deux fois  membrane host in a final volume of 1 ml of buffer containing 5 am of zolpidem and the test compound. After a 45 min incubation at 0 ° C., the membranes are recovered by filtration on Whatman GF / BM filters which are washed twice.

avec 5 ml de tampon glacé. On mesure la quantité de radio-  with 5 ml ice-cold buffer. We measure the amount of radio-

activité retenue par le filtre par scintigraphie liquide. La liaison spécifique du [3H]flumazénil est définie comme la quantité de radioactivité retenue sur les filtres et pouvant  activity retained by the filter by liquid scintigraphy. The specific binding of [3H] flumazenil is defined as the amount of radioactivity retained on the filters and

être inhibée par co-incubation avec le flunitrazépam 1 jM.  be inhibited by co-incubation with 1 M flunitrazepam.

Pour chaque concentration de composé étudiée on détermine le pourcentage d'inhibition de la liaison du [3H]flumazénil, puis la concentration CI50, concentration qui inhibe 50 % de  For each concentration of test compound, the percent inhibition of [3 H] flumazenil binding is determined, followed by the IC 50 concentration, which inhibits 50% of

la liaison spécifique.the specific link.

Les CI50 des composés les plus actifs vont de 0,4 à 1 MM.  The IC 50s of the most active compounds range from 0.4 to 1 MM.

Etude des liaisons membranaires du [3Hlflumazénil vis-à-vis des cellules transfectées stables exprimant le sous-type de  Study of Membrane Binding of [3H1 Flumazenil Versus Stable Transfected Cells Expressing the Subtype of

récepteur GABAA recombinant O352V2-  recombinant GABAA receptor O352V2-

L'affinité des composés pour le récepteur GABAA contenant les sous- unités C352y2 est étudiée après expression stable de  The affinity of the compounds for the GABAA receptor containing the C352y2 subunits is studied after stable expression of

celui-ci dans des cellules HEK 293.this one in HEK 293 cells.

Une préparation membranaire de ces cellules est obtenue par homogénéisation pendant 60 s dans un tampon glacé (K2HPO4 / KH2PO4 10 mM, pH 7,2) puis centrifugation pendant 10 min à 43000 g. Le culot est ensuite repris par homogénéisation dans un tampon d'incubation glacé (K2HPO4/KH2PO4 10 mM, KCl  A membrane preparation of these cells is obtained by homogenization for 60 s in an ice-cold buffer (10 mM K2HPO4 / KH2PO4, pH 7.2) and then centrifugation for 10 min at 43000 g. The pellet is then taken up by homogenization in an ice-cold incubation buffer (10 mM K2HPO4 / KH2PO4, KCl

mM, pH 7,2).mM, pH 7.2).

On fait incuber cette préparation membranaire, à raison  This membrane preparation is incubated, with good reason

d'environ 150 jg de protéine, avec du [3H]flumazénil (acti-  about 150 μg of protein, with [3H] flumazenil (activated

vité spécifique: 70-87 Ci/mmole; New England Nuclear) à une concentration de 1 nM et avec les composés de l'invention, à  Specificity: 70-87 Ci / mmole; New England Nuclear) at a concentration of 1 nM and with the compounds of the invention,

différentes concentrations, dans un volume final de 1000 Ml.  different concentrations, in a final volume of 1000 Ml.

Après 90 min d'incubation à 0 C on filtre les échantillons  After 90 minutes of incubation at 0 ° C., the samples are filtered.

sous vide sur des filtres Whatman GF/BM et on les lave immé-  under vacuum on Whatman GF / BM filters and wash them immediately

diatement avec du tampon glacé. La liaison spécifique du [3H]flumazénil est déterminée en présence de diazépam 10 pM non marqué. On analyse les données selon les méthodes usuelles et on calcule la CI50, concentration qui inhibe 50 %  diatement with ice-cold buffer. The specific binding of [3H] flumazenil is determined in the presence of unlabeled 10 μM diazepam. The data are analyzed according to the usual methods and the IC50, concentration which inhibits 50% is calculated.

de la liaison du [3H]flumazénil.[3H] flumazenil binding.

Les CI50 des composés les plus actifs vont de 0,01 à 1 iM.  The IC 50's of the most active compounds range from 0.01 to 1 μM.

Evaluation de l'activité intrinsèque par la méthode dite du "'patchclamp" sur des cellules embryonnaires rénales humaines 293 (HEK 293) transfectées exprimant les sous-types de récepteurs GABAA recombinants 1E2Y2, O5s2V2 et S3E2V2  Evaluation of intrinsic activity by the so-called "patchclamp" method on transfected human kidney embryonic cells 293 (HEK 293) expressing the recombinant GABAA receptor subtypes 1E2Y2, O5s2V2 and S3E2V2

1. Transfection des cellules HEK 293.  1. Transfection of HEK 293 cells.

Les vecteurs d'expression pCDM8 contenant les ADN codant pour  PCDM8 expression vectors containing the DNAs coding for

les sous-unités c1, q3, O5, X2 et Y2 sont préparés individuel-  the subunits c1, q3, O5, X2 and Y2 are individually prepared

lement après amplification dans les bactéries E. Coli, puis sont précipités par la méthode de précipitation au phosphate de calcium à la surface des cellules rénales en culture  After amplification in E. Coli bacteria, they are precipitated by the calcium phosphate precipitation method on the surface of renal cells in culture.

HEL 293 à demi-confluence (Faure-Halley et coll., Eur. J. Pharmacol. (1993) 246 283-287). Les vecteurs d'expression sont mélangés dans un rapport de 1/4/0,2 pour ax, 52 et Y215 respectivement. Les cellules sont incubées pendant 24 h puis prélevées pour les expériences de patch-clamp.  HEL 293 at half confluence (Faure-Halley et al., Eur J. Pharmacol (1993) 246-283-287). The expression vectors are mixed in a ratio of 1/4 / 0.2 for ax, 52 and Y215 respectively. The cells are incubated for 24 hours and then removed for patch-clamp experiments.

2. Electrophysiologie. On utilise la méthode de patch-clamp en configuration "whole cell" décrite par Hamill et coll. (Pfluegers Archives (1981) 391 85-100) avec un milieu intrapipette contenant du chlorure de césium pour bloquer les courants potassiques et tamponné en Ca2+ (pCa=10'8M; pH=7,2). Le potentiel des cellules étant fixé à -20 mV, l'application de GABA à la concentration de 1 AM provoque un courant entrant porté par les ions Cl- dont l'amplitude peut être modulée par les composés étudiés. Les effets des composés sont évalués par le rapport entre le courant GABA-dépendant observé en présence de composé testé  2. Electrophysiology. The "whole cell" patch clamp method described by Hamill et al. (Pfluegers Archives (1981) 391 85-100) with an intrapipette medium containing cesium chloride to block potassium currents and buffered with Ca2 + (pCa = 10'8M, pH = 7.2). Since the cell potential is set at -20 mV, the application of GABA at the concentration of 1 AM causes an inward current carried by the Cl- ions whose amplitude can be modulated by the compounds studied. The effects of the compounds are evaluated by the ratio of the GABA-dependent current observed in the presence of tested compound

et le courant observé en présence de GABA seul.  and the current observed in the presence of GABA alone.

On observe ainsi que les composés de l'invention font dimi-  It is thus observed that the compounds of the invention reduce

nuer le courant chlorure induit par le GABA, à des concen-  to reduce the chloride current induced by GABA to

trations de 0,1 à 10 MM.from 0.1 to 10 MM.

Les résultats des essais effectués sur les composés de l'invention montrent que, in vitro, ils déplacent le [3H]flumazénil de ses sites de liaison membranaires vis-à-vis d'une population de sites modulateurs X (benzodiazépiniques) associés aux récepteurs GABAA contenant la sousunité q3, comparativement aux sous-types de récepteurs w1 associés aux  The results of the tests carried out on the compounds of the invention show that, in vitro, they displace [3H] flumazenil from its membrane binding sites with respect to a population of X-linked (benzodiazepine) receptor-associated sites. GABAA containing subunit q3, compared to w1 receptor subtypes associated with

récepteurs GABAA contenant les sous-unités a1 et comparati-  GABAA receptors containing the a1 and comparative subunits

vement à une population de récepteurs w5 associés aux récep- teurs GABAA contenant les sous-unités a5.  to a population of w5 receptors associated with GABAA receptors containing the a5 subunits.

En d'autres termes, les composés ont une affinité  In other words, the compounds have an affinity

- forte pour les sites de liaison membranaire du [3H]fluma-  - strong for the membrane binding sites of [3H] fluma-

zénil vis-à-vis d'une population de sites modulateurs X (benzodiazépiniques) associée aux récepteurs GABAA contenant la sousunité O3; - moyenne ou faible pour les sous-types de récepteurs el (benzodiazépiniques de type I) associés aux récepteurs GABAA contenant la sous-unité a,; - moyenne ou faible pour une population de récepteurs e5 (benzodiazépiniques de type II) associée aux récepteurs GABAA  zenil vis-à-vis a population of X (benzodiazepine) modulator sites associated with GABAA receptors containing the O3 subunit; - medium or low for the el (benzodiazepine type I) receptor subtypes associated with GABAA receptors containing the α subunit; - medium or low for a population of e5 receptors (benzodiazepine type II) associated with GABAA receptors

contenant majoritairement la sous-unité a5.  containing mainly the a5 subunit.

Par ailleurs le test du patch-clamp montre que les composés de l'invention ont, in vitro, des propriétés agonistes  In addition, the patch-clamp test shows that the compounds of the invention have, in vitro, agonist properties.

inverses vis-à-vis des sous-types de récepteurs GABAergiques.  opposite to GABAergic receptor subtypes.

La sélectivité, représentée par le rapport (CI50 è cervelet/ CI50 récepteur recombinant c352Y2) est comprise entre 10 et 30. Les composés de l'invention peuvent être utilisés pour le  The selectivity represented by the ratio (IC50 to cerebellum / recombinant receptor IC50 c352Y2) is between 10 and 30. The compounds of the invention can be used for

traitement d'affections liées aux désordres de la trans-  treatment of conditions related to disorders of trans-

mission GABAergique associés aux sous-types de récepteurs GABAA contenant respectivement les sous-unités a,, C2, a3 et a5, tels que l'anxiété, les troubles du sommeil, l'épilepsie, la spasticité, les contractures musculaires, les troubles cognitifs, les troubles de la vigilance, les troubles du sevrage d'alcool, de tabac ou de stupéfiants, les troubles de l'olfaction, les troubles hormonaux liés au dysfonctionnement de l'hypothalamus, certains troubles émotionnels et de  GABAergic mission associated with subtypes of GABAA receptors containing a, C2, a3 and a5 subunits, such as anxiety, sleep disorders, epilepsy, spasticity, muscle contractures, cognitive disorders , disorders of alertness, alcohol, tobacco or narcotic withdrawal disorders, olfactory disorders, hormonal disorders related to hypothalamus dysfunction, certain emotional disorders and

perception de la douleur.perception of pain.

La distribution préférentielle des récepteurs X associés à la sous-unité a3 du complexe récepteur GABAA d'une part dans les  The preferential distribution of the X receptors associated with the a3 subunit of the GABAA receptor complex on the one hand in the

structures cérébrales contenant les corps cellulaires nor-  brain structures containing normal cellular bodies

1l adrénergiques et sérotoninergiques, et d'autre part dans la moëlle épinière, suggère que les composés de l'invention peuvent également être utilisés spécifiquement dans le traitement des maladies associées à un mauvais fonctionnement S de ces systèmes, comme la dépression, l'anxiété, les troubles  Both adrenergic and serotoninergic, and on the other hand in the spinal cord, suggests that the compounds of the invention can also be used specifically in the treatment of diseases associated with a malfunction of these systems, such as depression, anxiety , the troubles

cognitifs, la spasticité et les contractures musculaires.  cognitive, spasticity and muscle contractures.

A cet effet, les composés de l'invention peuvent être présentés sous toutes formes galéniques, associés à des excipients appropriés, pour l'administration entérale ou parentérale, par exemple sous forme de comprimés, dragées, gélules, capsules, solutions ou suspensions buvables ou injectables, timbres transdermiques, suppositoires, etc, dosés pour permettre une administration journalière de 1 à  For this purpose, the compounds of the invention may be presented in all galenic forms, combined with appropriate excipients, for enteral or parenteral administration, for example in the form of tablets, dragees, capsules, capsules, solutions or suspensions drinkable or injectables, transdermal patches, suppositories, etc., dosed to allow daily administration of 1 to

1000 mg de substance active.1000 mg of active substance.

Claims (5)

Revendicationsclaims 1. Composé, éventuellement sous forme d'isomère optique pur ou de mélange d'isomères, répondant à la formule générale (I) R3 x N  Compound, optionally in the form of a pure optical isomer or a mixture of isomers, corresponding to the general formula (I) R 3 x N J R2J R2 Ri dans laquelle X représente un atome d'hydrogène ou un groupe méthyle, hydroxy, méthoxy ou phénylméthoxy,15 R1 représente un atome d'hydrogène ou un groupe méthyle, R2 représente un atome d'hydrogène ou un groupe méthyle, et  Wherein X represents a hydrogen atom or a methyl, hydroxy, methoxy or phenylmethoxy group, R1 represents a hydrogen atom or a methyl group, R2 represents a hydrogen atom or a methyl group, and R3 représente un groupe (C1-C10)alkyle linéaire ou ramifié, un groupe (C3-C6)cycloalkyle ou un groupe (C3-C6)cycloalkyl- (C1-C3)alkyle.  R3 represents a linear or branched (C1-C10) alkyl group, a (C3-C6) cycloalkyl group or a (C3-C6) cycloalkyl- (C1-C3) alkyl group. 2. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que X représente un atome d'hydrogène, R1 et R2 représentent chacun  2. Compound according to claim 1, characterized in that X represents a hydrogen atom, R1 and R2 represent each un groupe méthyle, et R3 représente un groupe (C1-C4)alkyle.  a methyl group, and R3 represents a (C1-C4) alkyl group. 3. Procédé de préparation de composés selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on fait réagir un dérivé de 2-aminoindole de formule générale (II)  3. Process for the preparation of compounds according to claim 1, characterized in that a 2-aminoindole derivative of general formula (II) is reacted. X NH(II)X NH (II) N R2N R2 R1 dans laquelle X, R1 et R2 sont tels que définis dans la revendication 1, avec un ester de formule générale (III) OH (III) R3 <O Os R R4 dans laquelle R3 est tel que défini dans la revendication 1  Wherein X, R 1 and R 2 are as defined in claim 1, with an ester of the general formula (III) wherein R 3 is as defined in claim 1 et R4 représente un groupe (C1-C4)alkyle.  and R4 represents a (C1-C4) alkyl group. 4. Médicament caractérisé en ce qu'il consiste en un composé  4. Drug characterized in that it consists of a compound selon la revendication 1.according to claim 1. 5. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle contient un composé selon la revendication 1, associé à un  5. A pharmaceutical composition characterized in that it contains a compound according to claim 1, associated with a excipient.excipient.