FR2746804A1 - Homo- and hetero- polymerisation of proteins containing free thiol groups or containing di:sulphide bridges - Google Patents

Abstract

Homo- or hetero polymerisation of proteins containing free thiol groups or disulphide bridges or proteins grafted with thiol groups, comprises subjecting the proteins to a pressure treatment to cause the breaking of internal bonds, in the presence of a reducing agent (I) which is able to cause the formation of intermolecular bonds of the disulphide bridge type, and subsequently stopping the reaction by depressurisation.

Description

La présente invention concerne un procédé d'homo ou d'hétéro polymérisation de protéines dotées de groupements thiols libres ou appariés en ponts disulfures, en particulier les protéines contenant des cystéines libres ou des cystines. The present invention relates to a process for homo or heteropolymerization of proteins with free or disulfide-linked thiol groups, in particular proteins containing free cysteines or cysteines.

De nombreuses propriétés fonctionnelles des protéines s'expriment dans leur capacité de polymérisation (gélification et après séchage fabrication des colles par exemple) ou d'agrégation (viscosité, fabrication de mousses par exemple). Dans de nombreux cas, il est nécessaire qu'il y ait une formation de réseaux de polymères, soit comme dans le cas des gélatines, des soies ou des kératines, soit sous forme de réseaux moléculaires stabilisés par les interactions hydrophobes, ioniques ou les liaisons covalentes. Many functional properties of proteins are expressed in their ability to polymerize (gelation and after drying manufacture of glues for example) or aggregation (viscosity, foam production for example). In many cases, it is necessary that there is a formation of polymer networks, either as in the case of gelatins, bristles or keratins, or in the form of molecular networks stabilized by hydrophobic interactions, ionic or bonds covalent.

Pour aboutir à cette polymérisation, il est fréquemment nécessaire de dénaturer les protéines. I1 est connu d'y parvenir soit par la dénaturation thermique, soit en utilisant tout autre dénaturant chimique (sels, solvants, etc...), soit encore par l'intervention de réactifs chimiques tels que le formol, le glyoxal, etc... To achieve this polymerization, it is frequently necessary to denature the proteins. It is known to achieve this either by thermal denaturation, or by using any other chemical denaturant (salts, solvents, etc.), or again by the intervention of chemical reagents such as formalin, glyoxal, etc. ..

(polymérisation médiée par des réactifs bi ou polyfonctionnels).(polymerization mediated by bi or polyfunctional reagents).

Les inconvénients majeurs de ces différentes techniques résident dans leur insuffisance, dans leur complexité et surtout par le fait qu'elles ne sont pas bien contrôlées. The major drawbacks of these different techniques lie in their insufficiency, in their complexity and especially in the fact that they are not well controlled.

En outre, l'utilisation de réactifs chimiques entratne généralement la structuration de produits secondaires non comestibles qui ne permettent pas l'utilisation des technologies concernées dans le domaine alimentaire.In addition, the use of chemical reagents generally results in the structuring of non-edible by-products that do not allow the use of the relevant technologies in the food field.

La présente invention propose un nouveau procédé permettant d'oligomériser, de polymériser ou d'agréger des protéines identiques ou différentes, contenant des groupements thiols ou substitués avec des groupements thiols, et ceci d'une façon relativement simple et contrôlée. The present invention provides a novel method for oligomerizing, polymerizing or aggregating identical or different proteins containing thiol or substituted groups with thiol groups in a relatively simple and controlled manner.

Un autre but de l'invention est de proposer une technologie de polymérisation écologiquement acceptable et inoffensive d'un point de vue alimentaire.Another object of the invention is to provide a polymerization technology which is ecologically acceptable and harmless from a food point of view.

Ce procédé s'adresse plus particulièrement aux peptides ou aux protéines dotées de cystines (ponts disulfures) et, éventuellement, de cystéines. This method is more particularly for peptides or proteins with cystines (disulfide bridges) and possibly cysteines.

Le procédé conforme à la présente invention consiste à soumettre les protéines à une dénaturation par la pression, en présence d'un agent réducteur. The process according to the present invention consists in subjecting the proteins to denaturation by pressure, in the presence of a reducing agent.

Le traitement sous pression réalise un dépliage de la structure des protéines ; il rend possible la levée des interactions hydrophobes et ioniques stabilisant les structures quaternaires, tertiaires et secondaires des protéines qui doivent le reste de leur cohésion aux ponts disulfures uniquement.The pressure treatment unfolds the protein structure; it makes possible the removal of the hydrophobic and ionic interactions stabilizing the quaternary, tertiary and secondary structures of the proteins which owe the rest of their cohesion to the disulfide bridges only.

L'agent réducteur permet d'induire la création de liaisons intermoléculaires du type ponts disulfures, pour l'obtention d'homo ou d'hétéro oligo/polymères, en fonction des protéines de base et des conditions de traitement appliquées.The reducing agent makes it possible to induce the creation of intermolecular bonds of the disulfide bond type, for obtaining homo or hetero oligo / polymers, as a function of the basic proteins and the treatment conditions applied.

En fait, la présence de l'agent réducteur rend possible l'rechange bien contrôlé des liaisons covalentes (ponts disulfures) intramoléculaires, et la création de liaisons disulfures intermoléculaires pour aboutir à la création de structures supramoléculaires. In fact, the presence of the reducing agent makes possible the well-controlled replacement of intramolecular covalent bonds (disulfide bonds), and the creation of intermolecular disulfide bonds to result in the creation of supramolecular structures.

L'addition d'agent(s) réducteur(s) dans des quantités catalytiques ou dans des quantités stoechiométriques aux protéines ou à leur mélange pressurisé, permet de réduire et d'échanger les ponts disulfures desdites protéines, soit en engageant des cystéines de la liaison native ou originelle dans les liaisons avec d'autres partenaires thiols, soit en les réduisant. The addition of reducing agent (s) in catalytic amounts or in stoichiometric amounts to the proteins or to their pressurized mixture makes it possible to reduce and exchange the disulfide bonds of said proteins, either by introducing cysteines of the native or original link in the links with other thiol partners, either by reducing them.

Cette addition permet ainsi de libérer les channes polypeptidiques des protéines dénaturées et de transformer toute protéine à ponts disulfures en pelote statistique.This addition thus makes it possible to release the polypeptide radicals from the denatured proteins and to convert any disulfide-bonded protein into a statistical ball.

Un échange et une oxydation des cystéines à ce stade permettent une production d'homo ou d'hétéro oligo/polymères aux compositions variées. Exchange and oxidation of the cysteines at this stage allow the production of homo or hetero oligo / polymers with varied compositions.

La réaction est stoppée par dépressurisation. Le repliage des protéines polymérisées est naturellement discontinu avec des séparations locales des domaines hydrophobes et hydrophiles. Néanmoins, il est maintenu par un réseau de liaisons covalentes formées par les ponts disulfures et par la recomposition des hétérodomaines intercaténaires et/ou intermoléculaires. The reaction is stopped by depressurization. Folding of the polymerized proteins is naturally discontinuous with local separations of the hydrophobic and hydrophilic domains. Nevertheless, it is maintained by a network of covalent bonds formed by the disulfide bridges and by the recomposition of the intercatenary and / or intermolecular heterodomains.

Les ponts disulfures inter et intramoléculaires nouvellement formés confèrent une structuration originale aux oligomères ou aux polymères obtenus par le procédé, qui peut avoir une influence sur les propriétés des produits obtenus. En effet, l'arrangement des ponts disulfures (cystines) constitue une très importante contrainte structurale définissant en grande partie le repliage protéique et les propriétés fonctionnelles d'une protéine ou de son agrégat. The newly formed inter and intramolecular disulfide bridges confer an original patterning on the oligomers or polymers obtained by the process, which may have an influence on the properties of the products obtained. Indeed, the arrangement of the disulfide bridges (cystines) constitutes a very important structural constraint defining largely the protein folding and the functional properties of a protein or its aggregate.

Très souvent, il suffit de connaître la disposition des cystéines dans les chalnes polypeptidiques d'une protéine pour pouvoir prédire sa structure tridimensionnelle.Very often, it is sufficient to know the disposition of cysteines in the polypeptide chains of a protein in order to predict its three-dimensional structure.

Oxydées sous forme de cystines, elles constituent les points initiaux de la renaturation et la dirigent, en grande partie, vers un mode de repliage intramoléculaire.Oxidized in the form of cystines, they constitute the initial points of renaturation and largely direct it towards an intramolecular folding mode.

Le substrat protéique de base
Comme cela a été évoqué ci-avant, le procédé conforme à la présente invention s'applique à tout peptide ou toute protéine doté(e) de groupements thiols libres ou appariés en ponts disulfures. Ces groupements thiols peuvent être présents naturellement ou rapportés par substitution (greffage).The basic protein substrate
As has been mentioned above, the method according to the present invention applies to any peptide or protein endowed with thiol groups free or paired disulfide bridges. These thiol groups can be present naturally or reported by substitution (grafting).

Il s'adresse en particulier aux protéines dotées de cystéines ou de cystines ; il peut s'agir de protéines d'un même type ou d'un mélange.It is particularly intended for proteins with cysteines or cystines; it can be proteins of the same type or a mixture.

Le substrat protéique peut se présenter en solution ou en suspension, dans l'eau ou dans tout autre milieu approprié.The protein substrate may be in solution or suspension, in water or in any other suitable medium.

L'aqent réducteur
Tout type d'agent réducteur peut être utilisé.The reducing agent
Any type of reducing agent can be used.

De préférence il sera doté d'au moins un groupement thiol et de façon encore préférée il comprendra au moins une cystéine libre.Preferably it will be provided with at least one thiol group and more preferably it will comprise at least one free cysteine.

L'utilisation d'un agent réducteur admis du point de vue alimentaire sera particulièrement intéressante. A ce titre, on pourra faire intervenir des acides aminés comme la cystéine, des peptides alimentaires tels le glutation ou certaines protéines alimentaires à cystéines non appariées < A titre d'exemple : bêta-lactoglobuline, albumine sérique, protéines d'oeuf, gliadines ...).The use of a food-friendly reducing agent will be particularly interesting. As such, it may be possible to use amino acids such as cysteine, dietary peptides such as glutinous or certain unmatched cysteine food proteins. For example: beta-lactoglobulin, serum albumin, egg proteins, gliadins. ..).

L'agent réducteur est utilisé dans des quantités catalytiques et/ou dans des quantités stoechiométriques aux protéines dénaturées par la haute pression.The reducing agent is used in catalytic amounts and / or stoichiometric amounts to denatured proteins by high pressure.

Le traitement sous pression
Le traitement sous pression qui est appliqué est adapté pour obtenir une dénaturation (dépliage) de la protéine ou du mélange de protéines.Pressure treatment
The pressure treatment that is applied is suitable for denaturing (unfolding) the protein or protein mixture.

Cet objectif est atteint par les hautes pressions, en particulier à des valeurs supérieures à 200 MPa. La valeur de pression appliquée est fonction de la stabilité des protéines en présence.This objective is achieved by high pressures, especially at values above 200 MPa. The pressure value applied depends on the stability of the proteins present.

On peut par exemple travailler sous une pression voisine de 1000 MPa pour être sûr de travailler dans une zone de dénaturation efficace.One can for example work under a pressure close to 1000 MPa to be sure to work in an effective denaturation zone.

Le temps d'application du traitement par la pression est également adapté au substrat protéique de base et en fonction du taux de polymérisation désiré.The application time of the pressure treatment is also adapted to the basic protein substrate and according to the desired degree of polymerization.

Le degré de la réticulation, agrégation, oligomérisation ou polymérisation peut être modulé et contrôlé par la pression appliquée, par le temps d'application de cette pression et par les concentrations des différents produits et substrats mis en oeuvre (rapport réducteur/oxydant, rapport réducteur/substrat protéique ...). La température, le pH, la force ionique et éventuellement les concentrations d'autres additifs n'intervenant pas directement dans la réaction, peuvent aussi avoir une influence ; ils peuvent également être utilisés pour le contrôle de la réaction de polymérisation.  The degree of the crosslinking, aggregation, oligomerization or polymerization can be modulated and controlled by the applied pressure, by the time of application of this pressure and by the concentrations of the various products and substrates used (reducing / oxidizing ratio, reducing ratio / protein substrate ...). The temperature, the pH, the ionic strength and possibly the concentrations of other additives not directly involved in the reaction may also have an influence; they can also be used for the control of the polymerization reaction.

En fonction du degré de polymérisation on peut obtenir des viscosités différentes, ainsi que des gels ou des masses solides. Le caractère varié des réseaux créés par le réarrangement des ponts bisulfures peut permettre une co/oligo/polymérisation de substances tiers, soit hydrophobes, soit hydrophiles. Depending on the degree of polymerization, it is possible to obtain different viscosities as well as gels or solid masses. The varied nature of the networks created by the rearrangement of the disulfide bridges may allow co / oligo / polymerization of third substances, either hydrophobic or hydrophilic.

APPLICATIONS
Cette nouvelle méthodologie d'homo ou d'hétéro polymérisation peut donner source à l'élaboration de technologies nouvelles qui ont jusqu'à maintenant en grande partie fait abstraction du contrôle rigoureux des conditions oxydoréductrices du milieu pendant les process technologiques.APPLICATIONS
This new homo or heteropolymerization methodology can give rise to the development of new technologies that have so far largely ignored the rigorous control of the oxidoreductive conditions of the environment during technological processes.

Les applications d'un tel procédé peuvent être très diverses. The applications of such a process can be very diverse.

Il pourra être utilisé comme une solution alternative pour la précipitation des protéines dont l'élimination de la solution est difficile, par exemple pour la diminution de la charge en matière organique des effluents de l'industrie agroalimentaire (industrie laitière : récupération des protéines du lactosérum telles que l'alpha-lactalbumine et la bêta-lactoglobuline amidonnerie, glutennerie : récupération des protéines solubles du blé...). It can be used as an alternative solution for the precipitation of proteins whose elimination of the solution is difficult, for example for the reduction of the organic matter load of the effluents of the food industry (dairy industry: recovery of whey proteins such as alpha-lactalbumin and beta-lactoglobulin starch, glutennerie: recovery of wheat soluble protein ...).

Ce procédé pourra également trouver des applications intéressantes dans le domaine alimentaire si l'on utilise des agents réducteurs admissibles du point de vue alimentaire. This method may also find interesting applications in the food field if using food-friendly reducing agents.

Ainsi, les oligomères/polymères obtenus peuvent trouver application comme agents gélifiants, épaississants, émulsifiants ou moussants. Ils peuvent également constituer des collodiums comestibles et faciles à incorporer dans d'autres produits alimentaires.Thus, the oligomers / polymers obtained can be used as gelling agents, thickeners, emulsifiers or foaming agents. They can also be collodium edible and easy to incorporate into other food products.

En particulier, les protéines du lactosérum sont peu exploitées jusqu'à présent car elles ne peuvent pas être incluses dans les coagulats de caséines lors des procédés laitiers, en raison de leur grande solubilité. In particular, whey proteins are little exploited so far because they can not be included in the casein coagulates in dairy processes, because of their high solubility.

Provoquer des phénomènes d'agrégation permet d'obtenir des molécules de haut poids moléculaire, plus facilement utilisables.Provoking aggregation phenomena makes it possible to obtain molecules of high molecular weight which are more easily usable.

Les réseaux d'oligomères et de polymères protéiques interconnectés par liaisons covalentes disulfures peuvent être utilisés pour piéger d'autres polymères, soit alimentaires (comme par exemple des polyglucides), soit non alimentaires. The networks of oligomers and protein polymers interconnected by covalent disulfide bonds can be used to trap other polymers, either food (for example polyglucides) or non-food.

Egalement, des composés d'intérêt alimentaire, nutritionnel (colorants, aromatisants, vitamines ...) ou non alimentaire de moindre taille moléculaire peuvent être incorporés et piégés dans les agrégats ainsi formulés, sans perte de couleur, arôme ou activité biologique. Also, compounds of nutritional interest, nutritional (dyes, flavoring, vitamins ...) or non-food of less molecular size can be incorporated and trapped in the aggregates thus formulated, without loss of color, aroma or biological activity.

Le traitement conforme à la présente invention peut également être utilisé pour faire disparaître l'odeur soufrée d'origine protéique sans induire la disparition d'autres odeurs ou arômes. The treatment according to the present invention can also be used to remove the sulfur odor of protein origin without inducing the disappearance of other odors or aromas.

La stabilisation par ponts disulfures intercaténaires peut rendre le polymère protéique plus résistant ou plus sensible à l'hydrolyse. Puisque l'on utilise des méthodes d'oxydoréduction douce, une partie des oligo/polymères produits peut se révéler comestible. Interchain disulfide bridge stabilization can make the protein polymer more resistant or more sensitive to hydrolysis. Since mild redox methods are used, some of the oligo / polymers produced may be edible.

Des réseaux biocomposites avec l'incorporation de polysaccarides, d'amphiphiles, ou de gommes modifiant l'élasticité de ces structures supramoléculaires peuvent être créés. Biocomposite networks with the incorporation of polysaccharides, amphiphiles, or elasticity-modifying gums of these supramolecular structures can be created.

Ce procédé peut aussi contribuer à réduire les allergénicités en modifiant la présentation des épitopes allergènes de certaines protéines alimentaires. This method can also help reduce allergenicity by modifying the presentation of allergenic epitopes of certain dietary proteins.

EXEMPLES ET RESULTATS
L'étude du mécanisme de polymérisation sous haute pression a été réalisée sur l'alpha-lactalbumine et la bêta-lactoglobuline, constituants majeurs du lactosérum.

EXAMPLES AND RESULTS
The study of the mechanism of polymerization under high pressure was carried out on alpha-lactalbumin and beta-lactoglobulin, major constituents of whey.

<tb> /Matériels <SEP> et <SEP> méthodes/
<tb>
A. PREPARATION DE L'ALPHA-LACTALBUMINE ET DE LA BETA
LACTOGLOBULINE
Les protéines ont été isolées à partir de lait de vache suivant la méthode de MAILLART P. et RIBADEAU
DUMAS B. ("Préparation of bêta-lactoglobulin and bêtalactoglobulin-free proteins from whey retentate by NaCl salting out at low pH" - (1988) Journal of food science, 53(3), 743-752). Il est nécessaire de purifier l'alphalactalbumine par chromatographie sur colonne échangeuse d'ions avec un gradient en sel. La pureté des protéines est, au final, supérieure à 98 % (Chromatographie liquide de haute performance (HPLC)).<tb> / Hardware <SEP> and <SEP> methods /
<Tb>
A. PREPARATION OF ALPHA-LACTALBUMIN AND BETA
lactoglobulin
The proteins were isolated from cow's milk according to the method of MAILLART P. and RIBADEAU
DUMAS B. ("Preparation of beta-lactoglobulin and beta-lactoglobulin-free proteins from whey retentate by NaCl salting out at low pH" - (1988) Journal of Food Science, 53 (3), 743-752). It is necessary to purify alphalactalbumin by ion exchange column chromatography with a salt gradient. The purity of the proteins is, in the end, greater than 98% (high performance liquid chromatography (HPLC)).

B. SOLUBILITE
La proportion de protéine précipitée d'une solution est estimée par la différence de densité optique à 280 nm entre la solution avant et après une centrifugation à 15000 g pendant 12 minutes.B. SOLUBILITY
The proportion of protein precipitated from a solution is estimated by the difference in optical density at 280 nm between the solution before and after centrifugation at 15,000 g for 12 minutes.

C. EXPERIENCE DE HAUTE PRESSION
L'appareil de haute pression est un modèle LCP 30 de la Société UNIPRESSEQUIPMENT, VARSOVIE-POLOGNE; il est utilisé sous le mode "presse". La pression est engendrée par l'avancement d'un piston dans une chambre de compression cylindrique (430 mm x 118 mm) en acier inoxydable. Son déplacement est réalisé avec une pompe à main. Les solutions à comprimer sont introduites dans des cellules en verre d'une contenance de 3 ml, de forme ellipsoidale, avec un orifice d'un millimètre de diamètre non obstrué pendant l'expérience. Ces cellules sont disposées dans la chambre de compression, dans de l'hexane.C. HIGH PRESSURE EXPERIENCE
The high pressure apparatus is a LCP 30 model of UNIPRESSEQUIPMENT, WARSAW-POLAND; it is used in the "press" mode. The pressure is generated by the advancement of a piston in a cylindrical compression chamber (430 mm x 118 mm) made of stainless steel. Its displacement is achieved with a hand pump. The solutions to be compressed are introduced into 3 ml glass cells, of ellipsoidal shape, with an orifice of one millimeter in diameter unobstructed during the experiment. These cells are arranged in the compression chamber in hexane.

Les traitements de haute pression ont été réalisés à la pression maximum de l'appareil : 1000 MPa. La durée du traitement a été de 30 minutes. Le décompte du temps commence quand la pression de 1000 MPa est effectivement atteinte et il s'arrête lorsque l'on commence à décompresser l'enceinte. La montée en pression dure une demi-heure ; le retour à la pression atmosphérique dure 20 minutes. The high pressure treatments were carried out at the maximum pressure of the apparatus: 1000 MPa. The duration of the treatment was 30 minutes. The countdown starts when the 1000 MPa pressure is actually reached and it stops when you start decompressing the speaker. The rise in pressure lasts half an hour; the return to atmospheric pressure lasts 20 minutes.

D. ELECTROPHORESE
Les puits sont chargés avec 5 microlitres d'échantillons préparés à la concentration de 0,14 mM, à l'aide du tampon de dissolution (Tris 0,5 M pH 6,8 2,5 ml ; glycérol 2 ml ; SDS 10 % 4 ml ; H20 qsp 1L) et plongés 2 minutes dans l'eau bouillante. L'électrophorèse a été effectuée à 30 mA pendant 3 heures, dans du tampon de migration (Tris 6 g ; glycine 28,8 g; SDS 1 g ; H20 qsp 1 L). Les gels ont été révélés au bleu de Coomassie.D. ELECTROPHORESIS
The wells are loaded with 5 microliters of samples prepared at the concentration of 0.14 mM, using the dissolution buffer (0.5 M Tris pH 6.8 2.5 ml, 2 ml glycerol, 10% SDS 4 ml, H20 qsp 1L) and immersed for 2 minutes in boiling water. Electrophoresis was carried out at 30 mA for 3 hours, in migration buffer (Tris 6 g, glycine 28.8 g, SDS 1 g, H2O qs 1 L). The gels were revealed in Coomassie blue.

Le terme abrégé Tris ci-dessus correspond à du
Tris (hydroxyméthyl) aminométhane et le terme SDS à du dodecyle sulfate de sodium.The abbreviated term Tris above corresponds to
Tris (hydroxymethyl) aminomethane and the term SDS to sodium dodecyl sulfate.

Pour une meilleure compréhension des résultats, les électrophorèses ont été présentées sous forme d'histogrammes. For a better understanding of the results, the electrophoreses were presented in the form of histograms.

E. GEL-FILTRATION SUR HPLC
On a utilisé la colonne de gel-filtration référencée
TSK-G4000SWXL (7,8 mm x 30 cm) de la Société TOSOHAAS
JAPON. Elle est utilisable à un pH compris entre 2 et 8. Sa calibration est donnée par le Tableau 1 ci-dessous.E. GEL-FILTRATION ON HPLC
The referenced gel-filtration column was used
TSK-G4000SWXL (7.8 mm x 30 cm) from TOSOHAAS Company
JAPAN. It is usable at a pH of between 2 and 8. Its calibration is given in Table 1 below.

Tableau 1

Table 1

<tb> Protéines <SEP> Poids <SEP> Illoleculilirc <SEP> (kD) <SEP> Temps <SEP> de <SEP> rétention <SEP> (nli')) <SEP>
<tb> a-Lactalbumine <SEP> 14,2 <SEP> 2X,30
<tb> Albumine <SEP> de <SEP> plasma <SEP> bovin <SEP> 67 <SEP> 25,53
<tb> Alcool <SEP> déshydrogènase <SEP> 158 <SEP> 25,20
<tb> ss-Amylase <SEP> 20() <SEP> 24.25 <SEP>
<tb> Ferritine <SEP> 440 <SEP> 22,60
<tb> Thyroglobuline <SEP> 669 <SEP> 2(),33
<tb> Bleu <SEP> dextran <SEP> 200() <SEP> 13,90 <SEP>
<tb>
Les échantillons ont été préparés à une concentration de 0,14 mM et filtrés avec un filtre en cellulose de diamètre de pore de 0,45 micromètres.<tb> Proteins <SEP> Weight <SEP> Illoleculilirc <SEP> (kD) <SEP> Time <SEP> of <SEP> retention <SEP> (nli ')) <SEP>
<tb> a-Lactalbumin <SEP> 14.2 <SEQ> 2X, 30
<tb> Albumin <SEP> of <SEP> Plasma <SEP> Bovine <SEP> 67 <SEP> 25.53
<tb> Alcohol <SEP> dehydrogenase <SEP> 158 <SEP> 25.20
<tb> ss-Amylase <SEP> 20 () <SEP> 24.25 <SEP>
<tb> Ferritin <SEP> 440 <SEP> 22.60
<tb> Thyroglobulin <SEP> 669 <SEP> 2 (), 33
<tb> Blue <SEP> dextran <SEP> 200 () <SE> 13.90 <SEP>
<Tb>
The samples were prepared at a concentration of 0.14 mM and filtered with a 0.45 micrometer pore size cellulose filter.

L'injection est de 20 microlitres. L'analyse dure 30 minutes à débit de 0,4 ml/min. L'élution a été faite avec le tampon Tris 1 M, pH = 7,5, dégazé.

The injection is 20 microliters. The analysis lasts 30 minutes at a rate of 0.4 ml / min. Elution was made with 1 M Tris buffer, pH = 7.5, degassed.

<tb> /RESULTATS/
<tb> <tb> / RESULTS /
<Tb>

A. AGREGATION INDUITE PAR LA PRESSION EN PRESENCE D'AGENTS
REDUCTEURS 1) Mise en évidence d'aqréqats
La haute pression ne permet pas, à elle seule, de dénaturer irréversiblement l'alpha-lactalbumine et encore moins de provoquer son agrégation. Néanmoins, associée à l'addition de petites quantités d'agents réducteurs, elle permet effectivement d'accentuer un phénomène d'agrégation négligeable à pression atmosphérique.A. AGGREGATION INDUCED BY PRESSURE IN THE PRESENCE OF AGENTS
REDUCERS 1) Highlighting aqreqats
High pressure alone does not allow to irreversibly denature alpha-lactalbumin and even less to cause its aggregation. Nevertheless, combined with the addition of small amounts of reducing agents, it actually makes it possible to accentuate a negligible aggregation phenomenon at atmospheric pressure.

1.1 - Une série d'expériences à été réalisée : Des solutions d'alpha-lactalbumine à une concentration de 50 mg/ml, additionnées d'agents réducteurs (dithiotréitol (DTT), bêta-mercaptoéthanol (2ME), cystéine (Cys)) dans une proportion stoechiométrique précise par rapport à la protéine (respectivement : 1, 2 et 4) ont été exposées une demi-heure à une pression de 1000 MPa. Le rapport stoechiométrique est différent selon le réducteur pour tenir compte le mieux possible de leur différence de réactivité observée vis-à-vis des lysosymes (HAYAKAWA,
S. and NAKAMURA, P. "Optimization approaches to thermally induced egg white lysosyme gel" (1986) Agric. Biol. Chem.1.1 - A series of experiments was carried out: Solutions of alpha-lactalbumin at a concentration of 50 mg / ml, added with reducing agents (dithiotreitol (DTT), beta-mercaptoethanol (2ME), cysteine (Cys)) in a precise stoichiometric proportion relative to the protein (respectively: 1, 2 and 4) were exposed for half an hour at a pressure of 1000 MPa. The stoichiometric ratio is different according to the reducer to take into account as much as possible of their difference in reactivity observed vis-à-vis the lysosymes (HAYAKAWA,
S. and Nakamura, P. "Optimization approaches to thermally induced egg white lysosyme gel" (1986) Agric. Biol. Chem.

50(8), 2039-2046).50 (8), 2039-2046).

La figure 1 montre les mesures densitométriques d'une électrophorèse SDS-PAGE des différents échantillons. Figure 1 shows the densitometric measurements of SDS-PAGE electrophoresis of the different samples.

La numérotation sur la figure correspond à ce qui suit: 1 - Bande à l'entrée du gel de concentration (Particules à la limite de la solubilité) 2 - Bande à l'entrée du gel principal (polymères de poids moléculaire supérieur à 500 KD) 3 - Bande de la bêta-lactoglobuline dimérique (dimères de poids moléculaire voisin de 36 KD) 4 - Bande de la bêta-lactoglobuline monomérique (monomères de poids moléculaire voisin de 18 KD) 5 - Bande de l'alpha-lactalbumine monomérique (monomères de poids moléculaire voisin de 14 KD)
Les échantillons diffèrent par le type de réducteur additionné à la solution a-DTT ( LDTT = [alpha-lactalbumine]) b-2ME ( [2ME] = 2 x[alpha-lactalbumine)] c-Cys ( [Cys] = 4 x [alpha-lactalbumine])
Les électrophorèses SDS-PAGE de ces échantillons avant le traitement de haute pression (P = 0,1 MPa histogrammes blancs) possèdent excepté avec le DTT, une seule bande, caractéristique de l'alpha-lactalbumine monomère. En revanche, après pression (histogrammes gris), d'autres bandes apparaissent, localisées à l'entrée du gel principal et à l'entrée du gel de concentration.The numbering in the figure corresponds to the following: 1 - Band at the entry of the concentration gel (Particles at the limit of the solubility) 2 - Band at the entrance of the main gel (polymers of molecular weight greater than 500 KD 3 - Band of dimeric beta-lactoglobulin (dimers with a molecular weight of around 36 KD) 4 - Band of monomeric beta-lactoglobulin (monomers with a molecular weight of approximately 18 KD) 5 - Band of monomeric alpha-lactalbumin ( monomers with a molecular weight of approximately 14 KD)
The samples differ in the type of reductant added to the a-DTT solution (LDTT = [alpha-lactalbumin]) b-2ME ([2ME] = 2 x [alpha-lactalbumin]] c-Cys ([Cys] = 4 x [alpha-lactalbumin])
The SDS-PAGE electrophoresis of these samples before the treatment of high pressure (P = 0.1 MPa white histograms) possess except with the DTT, a single band, characteristic of alpha-lactalbumin monomer. On the other hand, after pressure (gray histograms), other bands appear, located at the entry of the main gel and at the entry of the concentration gel.

L'apparition de ces bandes met en évidence la formation d'agrégats de nature covalente, de poids moléculaire supérieur approximativement à 500 KD (bandes 1 et 2).The appearance of these bands demonstrates the formation of covalent aggregates of molecular weight greater than approximately 500 KD (lanes 1 and 2).

1.2 - La figure 2 montre la répartition de la taille des agrégats déterminée par gel-filtration. Sur cette figure, la numérotation correspond à 1-DTT ( [DTT] = Ealpha-lactalbumine 2-2ME ( [2ME) = 2 xalpha-lactalbumine 3-Cys ( Cys] = 4 x[alpha-lactalbumine] ) 4-témoin (alpha-lactalbumine seule)
Une perte de la quantité globale de protéines a été mesurée. Sa cause a été attribuée à l'étampe de filtration précédant l'injection sur filtre de 450 nm de diamètre de pore. L'estimation de cette perte a été directement utilisée pour comptabiliser le pourcentage d'agrégats de diamètre moyen supérieur à 450 nm présents dans la solution. La proportion d'agrégats de diamètre inférieur à 450 nm a été estimée par intégration des pics de temps de rétention inférieurs à celui de l'alphalactalbumine monomérique. 1.2 - Figure 2 shows the size distribution of aggregates determined by gel-filtration. In this figure, the numbering corresponds to 1-DTT ([DTT] = Ealpha-lactalbumin 2-2ME ([2ME) = 2 xalpha-lactalbumin 3-Cys (Cys) = 4 x [alpha-lactalbumin]) 4-control ( alpha-lactalbumin alone)
A loss of the overall amount of protein was measured. Its cause was attributed to the filtration stamp preceding the filter injection of 450 nm pore diameter. The estimate of this loss was directly used to account for the percentage of aggregates of mean diameter greater than 450 nm present in the solution. The proportion of aggregates with a diameter of less than 450 nm was estimated by integrating retention time peaks lower than that of monomeric alphalactalbumin.

L'histogramme a concerne les agrégats dont la taille est supérieure à 450 nm et l'histogramme b concerne les agrégats dont la taille est inférieure à 450 nm (données en pourcentage). Histogram a is for aggregates larger than 450 nm and histogram b for aggregates smaller than 450 nm (percent data).

Les analyses de gel-filtration par HPLC confirment le résultat précédent à savoir la formation de grands agrégats. The gel-filtration analyzes by HPLC confirm the previous result namely the formation of large aggregates.

1.3 - La figure 3 montre une gel-filtration par HPLC d'un échantillon d'alpha-lactalbumine à une concentration de 50 mg/ml additionné de cystéine avec une stoechiométrie de 2 par rapport à la protéine.1.3 - Figure 3 shows gel-filtration by HPLC of a sample of alpha-lactalbumin at a concentration of 50 mg / ml supplemented with cysteine with a stoichiometry of 2 relative to the protein.

a est le chromatogramme avant le traitement haute pression; b est le chromatogramme après le traitement haute pression (1000 MPa, 1/2 heure).a is the chromatogram before the high pressure treatment; b is the chromatogram after the high pressure treatment (1000 MPa, 1/2 hour).

Les profils des échantillons avant le traitement de haute pression montrent que l'alpha-lactalbumine est pure à plus de 90 %. Les profils des échantillons après le traitement révèlent non seulement une perte d'intensité du pic caractéristique de la forme monomère de l'alphalactalbumine, mais également, l'apparition de pics étalés et mal séparés avec un temps de rétention compris entre 13 et 26 minutes. C'est la preuve que les agrégats ont des tailles très variées, partant de 80 KD, et dépassant les 2000 KD. Cela correspond à des oligomères de 6 à 140 unités et plus. The sample profiles before the high pressure treatment show that alpha-lactalbumin is more than 90% pure. The profiles of the samples after the treatment reveal not only a peak intensity loss characteristic of the monomeric form of alphalactalbumin, but also the appearance of sparse and poorly separated peaks with a retention time of between 13 and 26 minutes. . This is proof that the aggregates have very varied sizes, starting from 80 KD, and exceeding 2000 KD. This corresponds to oligomers of 6 to 140 units and more.

2) Ponts disulfures intermoléculaires 2.1 - Différents échantillons d'alpha-lactalbumine ont été soumis à une pression de 1000 MPa pendant une demiheure, à une concentration protéique de 50 mg/ml dans un tampon Tris 50 mM, pH-8,5 en présence d'agents réducteurs (DTT, 2ME, Cys) dans les proportions stoechiométriques suivantes par rapport à la protéine: - alpha-lactalbumine, DTT ( Ealpha-lactalbuminej / [DTT] =1) - alpha-lactalbumine, 2ME ( [2ME] / [alpha-lactalbuminej = 2) - alpha-lactalbumine, cystéine - ( [cystéine] / Ealpha- lactalbumine] = 4) - alpha-lactalbumine, cystéine ( E,cysteinej / Ealpha- lactalbumini = 2)
Il a été montré qu'en présence de bêtamercaptoéthanol (2ME), l'electrophorese SDS-PAGE est typiquement celle de l'alpha-lactalbumine sous sa forme monomère. Le traitement par le bêta-mercaptoéthanol (2ME) dissocie donc tous les agrégats formés en monomères. 2) Intermolecular disulfide bridges 2.1 - Different samples of alpha-lactalbumin were subjected to a pressure of 1000 MPa for half an hour, at a protein concentration of 50 mg / ml in a 50 mM Tris buffer, pH-8.5 in the presence of reducing agents (DTT, 2ME, Cys) in the following stoichiometric proportions with respect to the protein: - alpha-lactalbumin, DTT (Ealpha-lactalbumin / / (DTT) = 1) - alpha-lactalbumin, 2ME ([2ME] / [alpha-lactalbumin = 2) - alpha-lactalbumin, cysteine - ([cysteine] / Ealpha-lactalbumin] = 4) - alpha-lactalbumin, cysteine (E, cysteine / Ealpha-lactalbumini = 2)
It has been shown that in the presence of betamercaptoethanol (2ME), SDS-PAGE electrophoresis is typically that of alpha-lactalbumin in its monomeric form. Treatment with beta-mercaptoethanol (2ME) therefore dissociates all the aggregates formed into monomers.

2.2 - Ces résultats sont à confronter avec les électrophorèses SDS-PAGE sans bêta-mercaptoéthanol, figure 4, qui présentent des bandes caractéristiques de molécules de haut poids moléculaire.2.2 - These results are to be compared with electrophoresis SDS-PAGE without beta-mercaptoethanol, FIG. 4, which has characteristic bands of molecules of high molecular weight.

La figure 4 correspond en effet aux mesures densitométriques d'une électrophorèse SDS-PAGE. La numérotation correspond à ce qui suit 1 - Bande à l'entrée du gel de séparation (polymères ou particules) 2 - Bande à l'entrée du gel principal (intermédiaires, poids moléculaire supérieur à 500 KD) 3 - Bande caractéristique de la forme monomérique de 1 'alpha-lactalbumine.  Figure 4 corresponds to the densitometric measurements of SDS-PAGE electrophoresis. The numbering corresponds to the following 1 - Band at the entrance of the separation gel (polymers or particles) 2 - Band at the entry of the main gel (intermediates, molecular weight greater than 500 KD) 3 - Characteristic band of the form monomeric alpha-lactalbumin.

Les échantillons analysés ont été soumis à une pression de 1000 MPa pendant une demi-heure, à une concentration de 50 mg/ml en présence de cystéine dans les proportions suivantes a- rCys7 = galpha-lactalbumini b- CCyi = 2 x [alpha-lactalbumini c- (Cys] = 4 x Ealpha-lactalbumine
Les histogrammes blancs correspondent aux résultats sans traitement de haute pression (P = 0,1 MPa) ; les histogrammes gris correspondent aux résultats après la traitement de haute pression (P = 1000 MPa).The analyzed samples were subjected to a pressure of 1000 MPa for half an hour, at a concentration of 50 mg / ml in the presence of cysteine in the following proportions α-Cys7 = galpha-lactalbumini b-CCyi = 2 x [alpha- lactalbumini c- (Cys) = 4 x Ealpha-lactalbumin
The white histograms correspond to the results without high pressure treatment (P = 0.1 MPa); the gray histograms correspond to the results after the high pressure treatment (P = 1000 MPa).

Ces résultats signifient que les agrégats obtenus ne sont pas dissociés par le SDS, mais le sont par le bêta-mercaptoéthanol. These results mean that the aggregates obtained are not dissociated by the SDS, but are by the beta-mercaptoethanol.

Ces faits prouvent donc que l'agrégation est assurée par des ponts disulfures intermoléculaires. Le mécanisme d'agrégation incriminé est une réaction en chaîne d'échanges de ponts disulfures.These facts prove that aggregation is ensured by intermolecular disulfide bridges. The incriminated aggregation mechanism is a chain disulfide bond exchange reaction.

A priori, ces échanges de ponts disulfures peuvent être, soit intramoléculaires, soit intermoléculaires. A priori, these exchanges of disulfide bridges can be either intramolecular or intermolecular.

Lorsque ce sont des échanges intermoléculaires, les premières entités formées sont des dimères. Viennent ensuite les trimères, les tétramères, puis, si le phénomène d'association se prolonge, des oligomères. Lorsque les échanges sont intramoléculaires, des molécules d'alphalactalbumine possédant des ponts disulfures non natifs peuvent être engendrées.When they are intermolecular exchanges, the first entities formed are dimers. Next come the trimers, the tetramers, then, if the phenomenon of association is prolonged, oligomers. When the exchanges are intramolecular, alphalactalbumin molecules having non-native disulfide bridges can be generated.

Dans les conditions citées ci-dessus, divers degrés d'agrégation dont le diamètre, le trimère et le tétramère ont été mis en évidence. Ces résultats confirment la responsabilité des échanges thiol-disulfure dans le processus d'agrégation. D'autre part, ils indiquent que la haute pression favorise l'agrégation, en dénaturant la protéine. En effet, de cette manière, ses ponts disulfures deviennent plus accessibles aux réducteurs libres et leur réactivité s' accroît. Under the conditions mentioned above, various degrees of aggregation whose diameter, trimer and tetramer have been demonstrated. These results confirm the responsibility for thiol-disulfide exchanges in the aggregation process. On the other hand, they indicate that high pressure promotes aggregation, by denaturing the protein. Indeed, in this way, its disulfide bridges become more accessible to free reducers and their reactivity increases.

D'autre part, les différences entre a) et b) de la figure 4 montrent l'influence de la concentration sur la formation des polymères. On the other hand, the differences between a) and b) of Figure 4 show the influence of the concentration on the formation of polymers.

3) Influence de la quantité et de la nature des agents réducteurs 3.1 - L'électrophorèse SDS-PAGE de la figure 1 souligne les différences de comportement des différents traitements réducteurs - le DTT ( [DTT] = 1 x Calpha-lactalbuminei ) a une action aussi efficace à pression atmosphérique qu'à 1000 MPa.3) Influence of the quantity and nature of the reducing agents 3.1 - The SDS-PAGE electrophoresis of Figure 1 underlines the differences in the behavior of the different reducing treatments - the DTT ([DTT] = 1 x Calpha-lactalbuminei) has a action as effective at atmospheric pressure as at 1000 MPa.

Dans les deux cas, 40 % de l'alpha-lactalbumine est sous forme agrégée.In both cases, 40% of alpha-lactalbumin is in aggregate form.

- le 2ME ( [2ME] = 2 x Calpha-lactalbumini ), par contre, voit son action nettement amplifiée grâce à la haute pression. Alors qu'à pression atmosphérique la forme monomerique représente 85 % de l'alpha-lactalbumine, elle nten représente plus que 40 % après le traitement de haute pression.- the 2ME ([2ME] = 2 x Calpha-lactalbumini), on the other hand, sees its action clearly amplified thanks to the high pressure. Whereas at atmospheric pressure the monomeric form represents 85% of alpha-lactalbumin, it is only 40% after the high pressure treatment.

- la cystéine ( [CYSg = 4 xEalpha-lactalbumine ) est l'agent réducteur qui apparaît le plus efficace. Comme le 2ME, elle est inactive à pression atmosphérique. A haute pression, elle provoque une agrégation plus importante que le 2ME. La forme monomérique n'est plus que de 35 %. La proportion d'agrégats à l'entrée du gel de séparation est plus importante (30 %) que dans le cas du 2ME (15
Un échantillon témoin ne contenant que de l'alphalactalbumine montre que la présence d'agent réducteur est indispensable pour que l'agrégation ait lieu.cysteine ([CYSg = 4 xEalpha-lactalbumin) is the reducing agent that appears most effective. Like 2ME, it is inactive at atmospheric pressure. At high pressure, it causes more aggregation than 2ME. The monomeric form is only 35%. The proportion of aggregates at the inlet of the separation gel is larger (30%) than in the case of 2ME (15%).
A control sample containing only alphalactalbumin shows that the presence of reducing agent is essential for the aggregation to take place.

3.2 - Ces résultats ont été croisés avec les analyses de gel-filtration par HPLC de la figure 2.3.2 - These results were cross-checked with the gel-filtration analysis by HPLC of FIG.

Ces analyses montrent qu'un équivalent de DTT ne produit que des agrégats de diamètre inférieur à 450 nm. These analyzes show that an equivalent of DTT produces only aggregates with a diameter of less than 450 nm.

Le 2ME (2 équivalents) et la cystéine (4 équivalents), par contre, ne produisent que des agrégats de taille supérieure à 450 nm.2ME (2 equivalents) and cysteine (4 equivalents), however, only produce aggregates larger than 450 nm.

Cette série d'expériences a permis de montrer que le traitement combinant haute pression et cystéine en concentration 4 fois supérieure à celle de la protéine est le traitement le plus efficace parmi ceux étudiés.This series of experiments made it possible to show that the treatment combining high pressure and cysteine in concentration 4 times higher than that of the protein is the most effective treatment among those studied.

4) Quantité optimum d'agents réducteurs
Plusieurs études ont rapporté que chaque agent réducteur a une quantité optimum d'activité (HAYAKAWA,
S. and NAKAMURA, P. "Optimization approaches to thermally induced egg white lysosyme gel" (1986) Agric. Biol. Chem.4) Optimum amount of reducing agents
Several studies have reported that each reducing agent has an optimum amount of activity (HAYAKAWA,
S. and Nakamura, P. "Optimization approaches to thermally induced egg white lysosyme gel" (1986) Agric. Biol. Chem.

50(8), 2039-2046). En trop petite quantité, le nombre de thiols initialement présents dans la solution est insuffisant pour déclencher la réaction en chaîne d'échange thiol-disulfure intermoléculaire.50 (8), 2039-2046). Too little, the number of thiols initially present in the solution is insufficient to trigger the intermolecular thiol-disulfide exchange chain reaction.

De même, en trop grande quantité, les groupes thiols détruisent les ponts disulfures intermoléculaires nouvellement formés.Likewise, too much thiol groups destroy the newly formed intermolecular disulfide bridges.

Etant donné que le traitement avec la cystéine est le plus puissant des trois, on a déterminé sa quantité optimale d'action. Pour cela l'effet de traitements utilisant la cystéine en concentration 4 fois, 2 fois et 1 fois supérieure à la concentration de l'alphalactalbumine a été analysé. Since cysteine treatment is the most potent of the three, its optimal amount of action has been determined. For this purpose, the effect of treatments using cysteine in concentrations 4 times, 2 times and 1 time higher than the concentration of alphalactalbumin was analyzed.

Les résultats apparaissent sur les figures 4 et.5. The results appear in Figures 4 and 5.

La figure 4 correspond à des mesures densitométriques d'une électrophorèse SDS-PAGE qui a été décrite précédemment (Voir A-2.2).Figure 4 corresponds to densitometric measurements of SDS-PAGE electrophoresis which has been previously described (see A-2.2).

La figure 5 est une estimation du pourcentage d'alphalactalbumine agrégée, par gel-filtration par HPLC. Figure 5 is an estimate of the percentage of aggregated alphalactalbumin by gel-filtration by HPLC.

Les échantillons analysés ont été soumis à une pression de 1000 MPa pendant une demi-heure, à une concentration protéique de 50 mg/ml en présence de cystéine dans différentes proportions 1 -ECys= 1 équivalent 2 -ECys= 2 équivalents 3 -ECysj= 4 équivalents
Les histogrammes blancs correspondent aux résultats sans traitement de haute pression (P = 0,1 MPa) ; les histogrammes gris correspondent aux résultats après le traitement de haute pression (P = 1000 MPa).The analyzed samples were subjected to a pressure of 1000 MPa for half an hour, at a protein concentration of 50 mg / ml in the presence of cysteine in different proportions 1 -ECys = 1 equivalent 2 -ECys = 2 equivalents 3 -ECysj = 4 equivalents
The white histograms correspond to the results without high pressure treatment (P = 0.1 MPa); the gray histograms correspond to the results after the high pressure treatment (P = 1000 MPa).

Comme on peut le voir sur les résultats d'électrophorèse et de gel filtration, c'est lorsque la concentration en cystéine est 2 fois supérieure à la protéine que le traitement de haute pression donne le plus fort pourcentage d'agrégats de taille inférieure à 450 nm, tandis que 4 équivalents de cystéine favorisent clairement l'apparition de polymères plus grands. As can be seen from the results of electrophoresis and gel filtration, it is when the concentration of cysteine is 2 times higher than the protein that the high pressure treatment gives the highest percentage of aggregates less than 450 nm, while 4 equivalents of cysteine clearly favor the appearance of larger polymers.

B. LA BETA-LACTOGLOBULINE COMME AGENT REDUCTEUR
La figure 6 montre le profil de gel filtration par HPLC comparant des échantillons ayant été soumis à un traitement de haute pression de 1000 MPa, à une concentration de 50 mg/ml en protéine, pendant une demiheure, dans du tampon Tris 50 mM à pH = 8,5 avec des témoins.B. BETA-LACTOGLOBULIN AS REDUCING AGENT
FIG. 6 shows the HPLC filtration gel profile comparing samples having been subjected to a high pressure treatment of 1000 MPa, at a concentration of 50 mg / ml of protein, for half an hour, in 50 mM Tris buffer at pH = 8.5 with witnesses.

Sur la figure 6 a représente le profil de la bêta-lactoglobuline avant compression.Figure 6a shows the profile of beta-lactoglobulin before compression.

b représente le profil de la bêta-lactoglobuline après compression.b represents the profile of beta-lactoglobulin after compression.

c représente le profil d'un mélange alphalactalbumine/bêta-lactoglobuline, 50/50 avant compression.c represents the profile of a mixture of alphalactalbumin / beta-lactoglobulin, 50/50 before compression.

d représente le profil du mélange alpha-lactalbumine/bêtalactoglobuline, 50/50 après compression.d represents the profile of the alpha-lactalbumin / beta-lactoglobulin mixture, 50/50 after compression.

La figure 7 est un graphique tiré de données d'électrophorèses qui montre la quantité de protéines (alpha-lactalbumine et bêta-lactoglobuline) monomériques, agrégée en fonction de la proportion de bêta-lactoglobuline ajoutée. Figure 7 is a graph taken from electrophoresis data which shows the amount of monomeric proteins (alpha-lactalbumin and beta-lactoglobulin) aggregated as a function of the proportion of beta-lactoglobulin added.

La gel-filtration de la figure 6 et les électrophorèses de la figure 7 montrent qu'une agrégation à lieu en présence d'alpha-lactalbumine et de bêtalactoglobuline. The gel-filtration of FIG. 6 and the electrophoreses of FIG. 7 show that aggregation takes place in the presence of alpha-lactalbumin and beta-lactoglobulin.

La bêta-lactoglobuline s'avère être un agent réducteur aussi efficace que les autres. Son pouvoir réducteur est attribué à sa cystéine libre (119 ou 121). Cette particularité lui donne la capacité de s'autoagréger, durant le traitement de haute pression, sans addition de réducteur (figure 6).Beta-lactoglobulin proves to be a reducing agent as effective as the others. Its reducing power is attributed to its free cysteine (119 or 121). This feature gives it the ability to self-aggregate, during the high pressure treatment, without addition of reducer (Figure 6).

La figure 7 montre que la quantité d'alphalactalbumine et de beta-lac
C. GELIFICATION
A pH = 8,5, l'obtention de gel n'a pas été rendu possible par le seul traitement sous pression.Figure 7 shows that the amount of alphalactalbumin and beta-lake
C. GELIFICATION
At pH = 8.5, obtaining gel was not made possible by the sole pressure treatment.

Pour contraindre les particules à se rencontrer, les échantillons ont été congelés ; en effet, la cristallisation des molécules d'eau tend à confiner les protéines dans le volume réduit de l'eau liquide résiduelle. Un gel a été obtenu pour les échantillons contenant de la cystéine comme agent réducteur et ayant été soumis à un traitement de haute pression.To constrain the particles to meet, the samples were frozen; indeed, the crystallization of water molecules tends to confine the proteins in the reduced volume of the residual liquid water. A gel was obtained for samples containing cysteine as a reducing agent and having been subjected to a high pressure treatment.

Les résultats des essais réalisés sont consignés dans le tableau 2 ci-dessous
Tableau 2

The results of the tests carried out are shown in Table 2 below.
Table 2

<tb> pH <SEP> Rducteur <SEP> [réducteurjJ <SEP> Traitement <SEP> Congélation <SEP> Type <SEP> de <SEP> gel
<tb> <SEP> 30 <SEP> 30 <SEP> min, <SEP> 12 <SEP> I <SEP> I, <SEP> -20 C <SEP>
<tb> <SEP> lactalbumine] <SEP> 1000 <SEP> MPa
<tb> 8,5 <SEP> Cystéine <SEP> 4 <SEP> oui <SEP> oui <SEP> en <SEP> masse
<tb> <SEP> 8,5 <SEP> 2-mercaptoéthanol <SEP> 2 <SEP> oui <SEP> oui <SEP> en <SEP> masse
<tb> <SEP> 8,5 <SEP> Cystéine <SEP> 2 <SEP> oui <SEP> oui <SEP> en
<tb> <SEP> 6,5 <SEP> Cystéine <SEP> 2 <SEP> oui <SEP> non <SEP> 3 <SEP> <SEP> arborescent
<tb> <SEP> 5,5 <SEP> C <SEP> stéine <SEP> 2 <SEP> oui <SEP> non <SEP> arborescent
<tb>
L'ensemble des gels formés a été soumis à un simple test : ils ne se dissolvent pas dans une solution à 10 % en dodecyle sulfate de sodium (SDS) mais se dissolvent parfaitement dans une solution de bêta-mercaptoéthanol (2ME). Cela signifie que ces gels doivent leur existence à des ponts disulfures intermoléculaires.<tb> pH <SEP> Reducer <SEP> [reducer] <SEP> Treatment <SEP> Freezing <SEP> Type <SEP> of <SEP> gel
<tb><SEP> 30 <SEP> 30 <SEP> min, <SEP> 12 <SEP> I <SEP> I, <SEP> -20 C <SEP>
<tb><SEP> lactalbumin] <SEP> 1000 <SEP> MPa
<tb> 8.5 <SEP> Cysteine <SEP> 4 <SEP> yes <SEP> yes <SEP> in <SEP> mass
<tb><SEP> 8.5 <SEP> 2-mercaptoethanol <SEP> 2 <SEP> yes <SEP> yes <SEP> in <SEP> mass
<tb><SEP> 8.5 <SEP> Cysteine <SEP> 2 <SEP> yes <SEP> yes <SEP> in
<tb><SEP> 6.5 <SEP> Cysteine <SEP> 2 <SEP> yes <SEP> no <SEP> 3 <SEP><SEP> arborescent
<tb><SEP> 5.5 <SEP> C <SEP> stearin <SEP> 2 <SEP> yes <SEP> no <SEP> arborescent
<Tb>
All the gels formed were subjected to a simple test: they do not dissolve in a 10% solution of sodium dodecyl sulphate (SDS) but dissolve perfectly in a solution of beta-mercaptoethanol (2ME). This means that these gels owe their existence to intermolecular disulfide bridges.

Les gels les plus homogènes, prenant en masse l'ensemble de la solution, n'ont pu être obtenus qu'après congélation. Le pH (pH = 8,5) de ces expériences est le pH utilisé auquel la forme thiolate est maximale. Ces gels en masse évoluent au cours du temps. Probablement fortement hydratés, le gel a tendance à se ratatiner; une phase surnageante apparaît peu à peu. The most homogeneous gels, taking in mass the whole of the solution, could be obtained only after freezing. The pH (pH = 8.5) of these experiments is the pH used at which the thiolate form is maximal. These bulk gels evolve over time. Probably highly hydrated, the gel tends to shrivel; a supernatant phase appears little by little.

Ceci semble indiquer que la rétention d'eau par le réseau protéique pourrait être accrue par ce traitement.  This suggests that water retention by the protein network may be increased by this treatment.

Claims (10)

- REVENDICATIONS- Claims 1.- Procédé d'homo ou d'hétéro polymérisation de protéines dotées de groupements thiols libres ou appariés en ponts disulfures ou de protéines greffées avec des groupements thiols, caractérisé en ce que qu'il consiste: - à soumettre lesdites protéines à un traitement par la pression adapté pour obtenir leur dépliage, ce traitement sous pression étant conduit en présence d'un agent réducteur apte à induire la création de liaisons du type ponts disulfures intermoléculaires, puis - à stopper la réaction par dépressurisation. 1.- Process for homo or heteropolymerization of proteins having free or paired thiol groups in disulfide bridges or of grafted proteins with thiol groups, characterized in that it consists in: - subjecting said proteins to a treatment by the pressure adapted to obtain their unfolding, this pressure treatment being conducted in the presence of a reducing agent capable of inducing the creation of bonds of the intermolecular disulfide bond type, then - to stop the reaction by depressurization. 2.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste à utiliser un agent réducteur apte à induire l'rechange et/ou la création de ponts disulfures intramoléculaires simultanément à la création des ponts disulfures intermoléculaires, leurs proportions étant fonction de la concentration en produits utilisés. 2. A process according to claim 1, characterized in that it consists in using a reducing agent capable of inducing the replacement and / or the creation of intramolecular disulfide bridges simultaneously with the creation of intermolecular disulfide bridges, their proportions being a function of the concentration of products used. 3.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le traitement sous pression est réalisé à des valeurs supérieures à 200 MPa. 3. A process according to any one of claims 1 or 2, characterized in that the pressure treatment is carried out at values greater than 200 MPa. 4.- Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il consiste à effectuer un traitement sous pression voisin de 1000 MPa. 4. A process according to claim 3, characterized in that it consists in carrying out a pressure treatment close to 1000 MPa. 5.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il consiste à utiliser un agent réducteur doté d'au moins un groupement thiol. 5. A process according to any one of claims 1 to 4, characterized in that it consists in using a reducing agent having at least one thiol group. 6.- Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il consiste à utiliser la cystéine à titre d'agent réducteur. 6. A process according to claim 5, characterized in that it consists in using cysteine as reducing agent. 7.- Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il consiste à appliquer le traitement de haute pression sur de l'alpha-lactalbumine en présence de deux équivalents de cystéine. 7. A process according to claim 6, characterized in that it consists in applying the high pressure treatment on alpha-lactalbumin in the presence of two equivalents of cysteine. 8.- Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'agent réducteur utilisé est une cystéine libre présente dans la ou l'une des protéines du substrat protéique de base. 8. A process according to claim 5, characterized in that the reducing agent used is a free cysteine present in the one or one of the proteins of the basic protein substrate. 9.- Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il consiste à appliquer le traitement de haute pression sur la bêta-lactoglobuline seule ou en présence d'un autre type de protéine dotée de groupements thiols libres ou appariés en ponts disulfures, par exemple 1 'alpha-lactalbumine.  9. A process according to claim 8, characterized in that it consists in applying the high pressure treatment on beta-lactoglobulin alone or in the presence of another type of protein with free thiol groups or disulfide-bridged pairs, for example alpha-lactalbumin. 10.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'il consiste à effectuer une opération complémentaire de congélation pour obtenir une gélification du substrat protéique polymérisé.  10. A process according to any one of claims 1 to 9, characterized in that it consists in performing a complementary freezing operation to obtain a gelation of the polymerized protein substrate.