FR2736928A1 - Enzymes ayant une activite amidase micro-organismes susceptibles de produire de telles enzymes et procede d'hydrolyse d'amides en faisant application - Google Patents
Enzymes ayant une activite amidase micro-organismes susceptibles de produire de telles enzymes et procede d'hydrolyse d'amides en faisant application Download PDFInfo
- Publication number
- FR2736928A1 FR2736928A1 FR9508917A FR9508917A FR2736928A1 FR 2736928 A1 FR2736928 A1 FR 2736928A1 FR 9508917 A FR9508917 A FR 9508917A FR 9508917 A FR9508917 A FR 9508917A FR 2736928 A1 FR2736928 A1 FR 2736928A1
- Authority
- FR
- France
- Prior art keywords
- enzyme
- ala
- gly
- sep
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
- C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
La présente invention concerne une enzyme ayant une activité amidase, en particulier vis-à-vis de substrats du type oligomères dérivant de PA 6.6 et/ou de PA 6, caractérisée en ce quelle est constituée par au moins une des trois séquences peptidiques suivantes (1), (2) et (3) correspondant respectivement à SEQ ID NO: 1, 2 et 3 dans la liste de séquences annexée et/ou par au moins un polypeptidique homologue ou analogue à au moins l'une de ces séquences. Plus précisément, l'enzyme objet de l'invention comporte les séquences peptidiques (1), (2) et (3) suivantes: SEQ ID NO: 1: 24 résidus dont 1 non identifié (X): R G A T T M P L K P P H V V L A X L T Y D T A G SEQ ID NO: 2: 34 résidus dont 1 non identifié (X): T T N V D D Y M Q R N R T A G L L I L K G G A V A L E R Y G M G X T SEQ ID NO: 3: 30 résidus dont 2 non identifiés (X): G S A Y E Q N T I R E L X R M T S G V R X I E A Y S E T G N L'invention concerne également les micro-organismes aptes à produire cette enzyme et le procédé d'hydrolyse faisant application de cette enzyme et/ou de ces micro-organismes.
Description
De manière générale, la présente invention concerne l'hydrolyse enzymatique, d'amides notamment d'amides secondaires.
Plus précisément, I'invention est relative à des enzymes et/ou à des micro-organismes susceptibles d'être mis en oeuvre dans l'hydrolyse enzymatique de fonctions amides, de préférence sur des substrats en contenant au moins une, comme par exemple les polyamides (PA).
Dans ce domaine, SSTH R. et al. sont les auteurs d'un article paru dans "Journal of
Biomedical Materials Research (1987), vol. 21, p. 991-1003", et divulguent la mise en présence d'échantillons de polyamide 66 marqués au carbone 14, avec des enzymes du genre papaïne, trypsine et a-chymotrypsine. Ces polypeptides connus dégradent légèrement le polyamide 66. Mais l'hydrolyse n'est pas suffisamment significative pour pouvoir être exploitée sur le plan industriel.
Biomedical Materials Research (1987), vol. 21, p. 991-1003", et divulguent la mise en présence d'échantillons de polyamide 66 marqués au carbone 14, avec des enzymes du genre papaïne, trypsine et a-chymotrypsine. Ces polypeptides connus dégradent légèrement le polyamide 66. Mais l'hydrolyse n'est pas suffisamment significative pour pouvoir être exploitée sur le plan industriel.
On connaît, par ailleurs, au travers de l'article de KINOSHITA ET AL. (Eur. J. Biochem, 116, 547-551, 1981) I'aptitude de Flavobacterium sp KI 72 à produire, une première enzyme (Ei) catalysant l'hydrolyse de dimères cycliques d'acide 6-amino hexanoique, en dimères linéaires de ce même acide, ainsi qu'une deuxième enzyme (E2) apte à permettre la transformation de ce dimère linéaire en deux molécules d'acide 6-amino hexanoique ou acide amino caproique. Le cheminement enzymatique considéré est résumé ci-après.
(dimère cyclique d'acide (dimère linéaire d'acide (acide 6 aminohexanoique)
6-amino hexanoique) 6 amino hexanoique)
L'activité de l'amidase linéaire E2 est optimale pour les dimères et décroît au fur et à mesure que le degré de polymérisation augmente, pour ne plus être significative à partir des oligomères de degré de polymérisation (don) = 7.
6-amino hexanoique) 6 amino hexanoique)
L'activité de l'amidase linéaire E2 est optimale pour les dimères et décroît au fur et à mesure que le degré de polymérisation augmente, pour ne plus être significative à partir des oligomères de degré de polymérisation (don) = 7.
On connaît, également, une enzyme E3 active vis-à-vis des oligomères cycliques et linéaires d'acide 6 aminohexanoïque de DPn 2 3 (PA.6). E3 est décrite par NEGORO et al.
dans "Journal of Bacteriology, Dec. 1992, vol. 174, nO 24, p. 7948-7953. E3 provient, également, de Flavobacierium sp KI 72.
TSUCSYA ET AL. enseignent, dans leur article paru dans "Journal of Bacteriology,
June 1989, p. 3187-3191, vol. 171 n" 6", qu'il existe une grande homologie entre les enzymes El de Flavobacterium sp KI 72 et l'une de celles issues de Pseudomonas sp NK 87. Ces enzymes Eî et homologues, ainsi que les enzymes E2, et plus particulièrement ces dernières, seraient actives sur des oligomères ou des polyamides (PA 6) de formule:
avec: 2 < n < 20.
June 1989, p. 3187-3191, vol. 171 n" 6", qu'il existe une grande homologie entre les enzymes El de Flavobacterium sp KI 72 et l'une de celles issues de Pseudomonas sp NK 87. Ces enzymes Eî et homologues, ainsi que les enzymes E2, et plus particulièrement ces dernières, seraient actives sur des oligomères ou des polyamides (PA 6) de formule:
avec: 2 < n < 20.
Ces enzymes, issues de Flavobacterium ou de Pseudomonas ont l'inconvénient d'avoir des activités spécifiques vis-à-vis des oligomères relativement faibles, puisque celles-ci ne s'élèvent, au maximum, qu'à 1,05 micromoles d'acide amino-caproique produit par minute et par milligramme de protéine et à partir d'un substrat constitué par un trimère. De plus, ces enzymes sont spécifiques d'homo-oligomères.
U apparaît ainsi que l'art antérieur ne comprend pas de moyens d'hydrolyse enzymatique de fonctions amides qui soient performants, rentables et qui puissent s'appliquer à des amides, dont notamment des amides secondaires, de natures variées, en particulier du type co-oligomères et/ou homo-oligomères.
Aussi, c'est après de longues et laborieuses recherches que la Demanderesse est parvenue à isoler et à caractériser une nouvelle enzyme du genre amidase et formée par un ou plusieurs polypeptides qui peuvent, notamment, être issus de nouveaux microorganismes isolés du biotope et/ou de nouveaux micro-organismes recombinants obtenus à partir de ces micro-organismes naturels.
Il s'ensuit que la présente invention concerne une enzyme ayant une activité amidase, en particulier vis-à-vis de substrats du type (poly)amide et répondant à au moins l'une des formules suivantes:
dans laquelle: A, B sont des motifs monomères, Rl, R3 sont des radicaux divalents, identiques ou différents - de préférence différents - et
représentant un (cyclo)alkylène, linéaire ou ramifié, substitué ou non, un arylène, un
arylalkylène, les radicaux aromatiques étant éventuellement des polycondensats, les
alkylènes ayant un nombre de carbone supérieur ou égal à 4 et, de préférence, compris
entre 4 et 12.
dans laquelle: A, B sont des motifs monomères, Rl, R3 sont des radicaux divalents, identiques ou différents - de préférence différents - et
représentant un (cyclo)alkylène, linéaire ou ramifié, substitué ou non, un arylène, un
arylalkylène, les radicaux aromatiques étant éventuellement des polycondensats, les
alkylènes ayant un nombre de carbone supérieur ou égal à 4 et, de préférence, compris
entre 4 et 12.
. R2 correspond à des radicaux, identiques ou différents - de préférence identiques - et
sélectionnés parmi l'hydrogène et/ou les restes alkyles ayant, avantageusement, de 1 à 6
carbones,
X représente: * soit Xl = OH, OM, OR4 avec M choisi parmi les métaux, de préférence les métaux
alcalins et alcalino-terreux et R4 représentant un allyle linéaire ou ramifié comprenant
de 1 à 6 atomes de carbone, * soit X2 =
sélectionnés parmi l'hydrogène et/ou les restes alkyles ayant, avantageusement, de 1 à 6
carbones,
X représente: * soit Xl = OH, OM, OR4 avec M choisi parmi les métaux, de préférence les métaux
alcalins et alcalino-terreux et R4 représentant un allyle linéaire ou ramifié comprenant
de 1 à 6 atomes de carbone, * soit X2 =
avec R2, R3 tels que définis ci-dessus et R5, R6 identiques ou différents et répondant à
la même définition que celle donnée ci-dessus pour R2,
Y représente:: * soit Y' = hydrogène, * soit
la même définition que celle donnée ci-dessus pour R2,
Y représente:: * soit Y' = hydrogène, * soit
avec Rl tel que défini supra et Z correspondant à l'hydrogène, à Ml ayant la même
définition que M ou à R4,
avec les conditions suivantes: -a- Si X = Xl, alors Y = Y' ou y2, -b- si X = X2, alors Y = y2 et enfin p compris entre 1 et 4, de préférence entre 1 et 3,
définition que M ou à R4,
avec les conditions suivantes: -a- Si X = Xl, alors Y = Y' ou y2, -b- si X = X2, alors Y = y2 et enfin p compris entre 1 et 4, de préférence entre 1 et 3,
dans laquelle:
* R2, R3 sont tels que définis ci-dessus,
* U et V répondent respectivement aux mêmes définitions que celles données supra
pour X' et Y1 dans la légende de la formule (1),
* etq=1à8, ladite enzyme étant constituée::
opar au moins une des trois séquences peptidiques suivantes (1), (2) et (3)
correspondant respectivement à SEQ ID NO: 1, 2 et 3 dans la liste de séquences
annexée:
* Séquence i : 24 résidus dont 1 non identifié (X) = SEQ ID NO: 1 dans la liste
de séquence annexée:
RGATTMPLKPPHVVLAXLTYDTAG
* Séquence 2: 34 résidus dont 1 non identifié (X) SEQ ID NO : 2 dans la liste
de séquences annexée:
TTNVDDYMQRNRTAGLLILKGGAVALERYGMGXT
* Séquence 3: 30 résidus dont 2 non identifiés (X) SEQ ID NO : 3 dans la liste
de séquences annexée:
GSAYEQNTIRELXRMTSGVRXIEAYSETGN
o et/ou par au moins un polypeptidique présentant au moins 50 % d'homologie à au
moins l'une de ces séquences.
* R2, R3 sont tels que définis ci-dessus,
* U et V répondent respectivement aux mêmes définitions que celles données supra
pour X' et Y1 dans la légende de la formule (1),
* etq=1à8, ladite enzyme étant constituée::
opar au moins une des trois séquences peptidiques suivantes (1), (2) et (3)
correspondant respectivement à SEQ ID NO: 1, 2 et 3 dans la liste de séquences
annexée:
* Séquence i : 24 résidus dont 1 non identifié (X) = SEQ ID NO: 1 dans la liste
de séquence annexée:
RGATTMPLKPPHVVLAXLTYDTAG
* Séquence 2: 34 résidus dont 1 non identifié (X) SEQ ID NO : 2 dans la liste
de séquences annexée:
TTNVDDYMQRNRTAGLLILKGGAVALERYGMGXT
* Séquence 3: 30 résidus dont 2 non identifiés (X) SEQ ID NO : 3 dans la liste
de séquences annexée:
GSAYEQNTIRELXRMTSGVRXIEAYSETGN
o et/ou par au moins un polypeptidique présentant au moins 50 % d'homologie à au
moins l'une de ces séquences.
L'invention a tout d'abord procédé de l'isolement d'une souche sauvage productrice de l'enzyme, à savoir: Comamonas acidovorans N 12.
L'identification de cette souche sauvage résulte d'un travail de screening de longue haleine. Cette identification s'est faite à partir des caractères morphologiques, culturaux, biochimiques et antigéniques, qui ont pu être déterminés par référence aux critères officiels et internationaux de taxonomie microbiologique.
Le mérite de la Demanderesse ne se limite pas à l'isolement de cette souche sauvage, mais s'étend également à l'isolement de l'amidase ci-dessus définie. Le micro-organisme
Comamonas acidovorans N 12 n'est pas le précurseur biologique exclusif de cette amidase.
Comamonas acidovorans N 12 n'est pas le précurseur biologique exclusif de cette amidase.
Il faut en effet également considérer tous les recombinants et toute souche sauvage, présentant une activité enzymatique similaire.
Les micro-organismes recombinants sont ceux possédant dans leur génôme une séquence d'ADN codant pour l'amidase considérée dans la présente invention.
Conformément à un autre de ses aspects l'invention vise également un procédé d'hydrolyse enzymatique dans lequel on met en oeuvre la susdite enzyme et/ou le microorganisme sauvage visé supra et/ou au moins l'un de ses recombinants cités ci-dessus.
Conformément à l'invention, les substrats de l'enzyme et/ou de leurs précurseurs biologiques (micro-organismes/recombinants) sont des polyamides et, plus précisément, des oligomères dont la fonction de polymérisation récurrente est une fonction amide secondaire -CO-NH-
Ces oligomères ont des unités récurrentes de formule (I) et/ou (II). Les unités récurrentes (I) sont, avantageusement, formées de deux motifs monomères A et B, respectivement dicarbonyle et diamine et reliés l'un à l'autre par une fonction amine secondaire.
Ces oligomères ont des unités récurrentes de formule (I) et/ou (II). Les unités récurrentes (I) sont, avantageusement, formées de deux motifs monomères A et B, respectivement dicarbonyle et diamine et reliés l'un à l'autre par une fonction amine secondaire.
avec r compris entre 4 et 12 et, de préférence égal à 4, et le monomère B est un reste: -HN#HtNH-
avec s compris entre 4 et 12 et, de préférence égal à 6;
Ainsi, pour les substrats (I), un exemple préféré de dimère est celui formé par:
avec s compris entre 4 et 12 et, de préférence égal à 6;
Ainsi, pour les substrats (I), un exemple préféré de dimère est celui formé par:
<tb> HOOCtCH2tCOI| <SEP> NH <SEP> ( <SEP> CH2 <SEP> tNH
<tb> <SEP> A
<tb> <SEP> II <SEP> 1
<tb> <SEP> Acide <SEP> Adipique <SEP> HcxuaCthytàu <SEP> diamine
<tb>
Le polyamide correspondant est le PA 6.6.
<tb> <SEP> A
<tb> <SEP> II <SEP> 1
<tb> <SEP> Acide <SEP> Adipique <SEP> HcxuaCthytàu <SEP> diamine
<tb>
Le polyamide correspondant est le PA 6.6.
S'agissant des unités récurrentes (in), elles sont préférablement formées par des motifs monomères notés
et dans lesquels c est un squelette du genre aminoacide dont les terminaisons (i) et ) sont, respectivement, carboxylique et aminée.
et dans lesquels c est un squelette du genre aminoacide dont les terminaisons (i) et ) sont, respectivement, carboxylique et aminée.
Parmi les oligomères de type polyamide, susceptibles de convenir pour l'invention, on peut citer: - les oligomères de polyamides obtenus par polycondensation de diacides carboxyliques aliphatiques saturés ayant de 6 à 12 atomes de carbone avec des diamines primaires aliphatiques saturées ayant de 6 à 12 atomes de carbone, - les oligomères de polyaminoacides obtenus, soit par homopolycondensation directe d'acide oaminoalcanoïque comportant une chaîne hydrocarbonée ayant de 4 à 12 atomes de carbone, soit par ouverture hydrolytique et polymérisation des lactames dérivés de ces acides, - les oligomères de copolyamides obtenus à partir des monomères de départ des polyamides précités, le composant acide de ces copolyamides pouvant consister, en outre, en partie en acide aromatique, tel que l'acide téréphtalique et/ou l'acide isophtalique, - et les mélanges de ces oligomères de polyamides.
A titre d'illustration des polyamides obtenus par polycondensation de diacides et de diamines, on citera, par exemple: - le polyamide 4,6 (polymère de tétraméthylène diamine et d'acide adipique), - le polyamide 6,6 (polymère d'hexaméthylènediamine et d'acide adipique) (PA 6.6), - le polyamide 6,9 (polymère d'hexaméthylènediamine et d'acide azélaïque), - le polyamide 6,10 (polymère d'hexaméthylènediamine et d'acide sébacique), - le polyamide 6,12 (polymère d'hexaméthylènediamine et d'acide dodécanedioïque).
A titre d'illustration des polyaminoacides qui peuvent convenir, on citera: - le polyamide 4 (polymère d'acide amino-4 butanoique ou de butyrolactame), - le polyamide 5 (polymère d'acide amino-5 pentanoique ou de Samylolactame), - le polyamide 6 (polymère d'e-caprolactame), - le polyamide 7 (polymère d'acide amino-7 heptanoique), - le polyamide 8 (polymère de capryllactame), - le polyamide 9 (polymère d'acide amino-9 nonanoique), - le polyamide 10 (polymère d'acide amino-l0 décanoique), - le polyamide 11 (polymère d'acide amino-1 1 undécan6fque), - le polyamide 12 (polymère d'acide amino-12 dodécanoique ou de laurolactame).
A titre d'illustration des copolyamides, on citera, par exemple: - le polyamide 6,6/6,10 (copolymère d'hexaméthylènediamine, d'acide adipique et d'acide sébacique), - le polyamide 6,6/6 (copolymère d'hexaméthylènediamine, d'acide adipique et de caprolactame).
Sans que cela ne soit limitatif, les substrats préférés conformément à l'invention sont des oligomères de polyamides obtenus par polycondensation de diacides A et de diamines B et, en particulier, de PA 6.6.
Le nombre des monomères A et B, d'une part, ou
d'autre part, des substrats (I) et (11) selon l'invention est, avantageusement, compris entre 2 et 8, de préférence entre 2 et 6.
d'autre part, des substrats (I) et (11) selon l'invention est, avantageusement, compris entre 2 et 8, de préférence entre 2 et 6.
I1 est à noter que ce nombre de monomères A et B dans les molécules d'oligomères ou de polymères sera également dénommé DPn dans le présent exposé.
Des substrats (I) caractéristiques sont, e. g., des oligomères avantageusement hydrosolubles tels que : AB, ABA et ABAB.
n est à noter que ce nombre de monomères A et B dans les molécules d'oligomères ou de polymères sera également dénommé DPn dans le présent exposé.
Ces substrats particuliers font partie de ceux (I) et (11) que l'enzyme de l'invention et/ou ses précurseurs biologiques sont aptes à hydrolyser, car ils possèdent au moins une extrémité carboxyle.
Lorsque les substrats enzymatiques sont des oligomères contenant des monomères A et B, les produits finaux de l'hydrolyse peuvent être des monomères A et B.
Quand les substrats sont des oligomères (II) (monomères
les produits finaux de l'hydrolyse peuvent être des monomères
les produits finaux de l'hydrolyse peuvent être des monomères
L'enzyme conforme à l'invention peut également être caractérisée au travers de son activité et/ou son affinité vis-à-vis de certains des susdits substrats.
Ainsi, selon une première caractéristique avantageuse, l'amidase considérée est: - en premier lieu, active vis-à-vis d'un substrat (I) formé par un tétramère de A et de B (DPn=4 i. e. p =2, X = X1 et Y = Y1), - et, en second lieu, apte à transformer ce substrat, d'une part, en un oligomère de DPn = 3 et, d'autre part, en monomère A, avec une activité enzymatique spécifique (IJs) - exprimée en pmoles de ABAB hydrolysé.h-l.mgl de protéine et mesurée dans des conditions données, supérieures ou égales à 1000.
Une deuxième caractéristique avantageuse de cette amidase est d'être active vis-à-vis d'un substrat (I), formé par un trimère ABA et d'être apte à transformer ce trimère en un monomère A et un dimère AB, et ce avec une activité enzymatique spécifique supérieure ou égale à 1000 moles de substrat hydrolysé.h-l.mg-l de protéine.
Une troisième caractéristique avantageuse de cette amidase est d'être active vis-à-vis d'un substrat (I) formé par un dimère de type AB et d'être apte à transformer ce dimère en deux monomères A et B, avec une activité enzymatique spécifique supérieure à 1 500 llmoles de substrat hydrolysé.h-l.mg-l de protéine.
L'activité enzymatique de l'amidase pure est mesurée dans les conditions suivantes tampon phosphate, pH 6 à 8 et température = 30 OC.
L'enzyme amidase de l'invention présente au moins l'une de ces trois caractéristiques non limitatives.
Comme déjà indiqué supra, la mise en oeuvre de l'enzyme de l'invention dans l'hydrolyse enzymatique d'amides, peut consister à utiliser uniquement l'enzyme per se au lieu des précurseurs biologiques (micro-organismes sauvages ou recombinants) producteurs de celle-ci ou bien encore un mélange des deux.
A propos de producteurs d'enzyme, il est à souligner que l'enzyme objet de l'invention est également caractérisée en ce qu'elle est est produite par des micro-organismes du type
Comamonas acidovorans (N 12), de préférence du type de la souche référencée et déposée dans la collection Nationale de Cultures de Micro-organismes - Institut Pasteur PARIS sous le n" I 1522 le 4 janvier 1995, et/ou par les recombinants comme décrits supra.
Comamonas acidovorans (N 12), de préférence du type de la souche référencée et déposée dans la collection Nationale de Cultures de Micro-organismes - Institut Pasteur PARIS sous le n" I 1522 le 4 janvier 1995, et/ou par les recombinants comme décrits supra.
La présente invention concerne, également, de nouveaux micro-organismes aptes à produire l'enzyme amidase selon l'invention, telle que définie supra. De par cette aptitude, ces micro-organismes ont notamment pour caractéristiques, d'une part, une capacité d'hydrolyse des fonctions amides d'un composé polyamide, comprenant au moins une fonction amide et, en particulier, des oligomères. Plus précisément, ces micro-organismes ont une sélectivité et une activité d'hydrolyse spécifiques, vis-à-vis des substrats W et (II) définis supra. Dans le cas des substrats (I), les oligomères sont, par exemple, les hydrosolubles cités ci-dessus : ABAB et/ou ABA et/ou AB entre autres.
Plus précisément, ces micro-organismes peuvent être, de préférence, constitués par
Comamonas acidovorans sus-visé, de préférence par la souche référencée et déposée à la
Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes sous le n" I 1522 le 4 janvier 1995, ou par des recombinants de celle-ci, tels que décrits supra.
Comamonas acidovorans sus-visé, de préférence par la souche référencée et déposée à la
Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes sous le n" I 1522 le 4 janvier 1995, ou par des recombinants de celle-ci, tels que décrits supra.
Avantageusement, les micro-organismes selon l'invention sont aptes à permettre l'hydrolyse d'au moins un substrat formé par un oligomère de polyamide et, plus précisément, par un dimère AB, voué à être transformé en deux monomères A et B, les micro-organismes étant aptes à assurer l'hydrolyse.
La présente invention a également pour objet un procédé d'hydrolyse de substrats, au moins en partie formés par ceux (I) et/ou (il), tels que définis ci-dessus, caractérisé en ce qu'il consiste à mettre en oeuvre au moins une enzyme et/ou au moins l'un des microorganismes tels que présentés supra.
n peut être intéressant, conformément à l'invention, de disposer de plusieurs enzymes à spectres complémentaires. Aussi, l'une des variantes du susdit procédé peut être d'avoir recours à au moins un autre type d'enzyme et/ou à au moins l'un de ses précurseurs biologiques sauvages et/ou recombinants. Dans cette variante, les substrats sont, au moins en partie, constitués par des oligomères dont le DPn est inférieur à 40, de préférence à 20 et, plus préférentiellement encore, à 12 et qui dérivent de polyamides au moins issus de polycondensation entre des monomères diacide (A) et diamine (B).
Le procédé d'hydrolyse selon cette variante est caractérisé:
- en ce qu'il conduit à des oligomères de degré de polymérisation (don) inférieur ou
égal à 3 et, de préférence, aux monomères A et B,
- et en ce que l'on met en oeuvre:
. au moins une enzyme et/ou au moins un micro-organisme tels que définis ci
dessus,
. et au moins un autre type d'enzyme et/ou à au moins l'un de ses précurseurs
biologiques sauvages et/ou recombinants, ladite enzyme étant:
* une enzyme E3 produite sous l'égide du gène nyl-c de Flavobacterium
sp KI 72,
* et/ou une enzyme dénommée PAM I, telle que celle définie par la
séquence peptidique SEQ ID NO : 5 annexée, et dont la séquence d'ADN
correspondant est donnée par SEQ ID NO : 4 annexée,
une telle enzyme pouvant, entre autres, être produite par le micro
organisme référencé et déposé dans la Collection Nationale de Cultures de Micro
organismes - Institut Pasteur PARIS - sous le n" I 1495, le 29 novembre 1994.
- en ce qu'il conduit à des oligomères de degré de polymérisation (don) inférieur ou
égal à 3 et, de préférence, aux monomères A et B,
- et en ce que l'on met en oeuvre:
. au moins une enzyme et/ou au moins un micro-organisme tels que définis ci
dessus,
. et au moins un autre type d'enzyme et/ou à au moins l'un de ses précurseurs
biologiques sauvages et/ou recombinants, ladite enzyme étant:
* une enzyme E3 produite sous l'égide du gène nyl-c de Flavobacterium
sp KI 72,
* et/ou une enzyme dénommée PAM I, telle que celle définie par la
séquence peptidique SEQ ID NO : 5 annexée, et dont la séquence d'ADN
correspondant est donnée par SEQ ID NO : 4 annexée,
une telle enzyme pouvant, entre autres, être produite par le micro
organisme référencé et déposé dans la Collection Nationale de Cultures de Micro
organismes - Institut Pasteur PARIS - sous le n" I 1495, le 29 novembre 1994.
Pour obtenir des oligomères hydrolysables par les enzymes ci-dessus, il est possible de faire intervenir une lyse thermique et/ou chimique (acide) des fonctions de type amide.
Selon d'autres modalités avantageuses du procédé selon l'invention, on met en oeuvre, notamment des précurseurs biologiques de la (ou des) enzyme(s) et un milieu de culture comprenant, par exemple: - une source de carbone comportant, de préférence au moins un composé comprenant au moins une fonction amide, ladite source de carbone comportant éventuellement un complément choisi, avantageusement, parmi les hydrates de carbones, le saccharose étant particulièrement préféré, - et, éventuellement, un composé apte à induire la production des enzymes, sans être consommé par les precurseurs biologiques, ledit composé étant préférablement choisi parmi les amides.
Le procédé d'hydrolyse enzymatique d'amides selon l'invention peut trouver de nombreuses applications, par exemple en synthèse organique pour la fabrication de composés à partir de composés amides ou pour le traitement des matériaux contenant du polyamide.
En particulier, il pourrait être intéressant dans le cadre de la régénération des matières premières des polymères polyamides.
Les exemples qui suivent permettent d'illustrer les caractéristiques, les variantes et les avantages de la présente invention, sans toutefois en limiter la portée.
DESCRIPTION DES FIGURES ANNEXEES - La liste des séquences, est établie selon la norme ST 23 de l'OMPI et comprend:
* SEQ ID NO 1 : séquence d'acides aminés correspondant à un premier fragment de l'enzyme PAM II selon l'invention,
* SEQ ID NO : 2 : séquence d'acides aminés correspondant à un deuxième fragment de l'enzyme PAM II selon l'invention,
* SEQ ID NO : 3 : séquence d'acides aminés correspondant à un troisième fragment de enzyme PAM II selon l'invention,
* SEQ ID NO : 4: ADN (pam I) codant pour l'amidase PAM I,
* SEQ ID NO : 5 : séquence d'acides aminés correspondant à PAM I.
* SEQ ID NO 1 : séquence d'acides aminés correspondant à un premier fragment de l'enzyme PAM II selon l'invention,
* SEQ ID NO : 2 : séquence d'acides aminés correspondant à un deuxième fragment de l'enzyme PAM II selon l'invention,
* SEQ ID NO : 3 : séquence d'acides aminés correspondant à un troisième fragment de enzyme PAM II selon l'invention,
* SEQ ID NO : 4: ADN (pam I) codant pour l'amidase PAM I,
* SEQ ID NO : 5 : séquence d'acides aminés correspondant à PAM I.
- La fig. 1 représente la carte de restriction du plasmide pXL2297 contenant le gène (pam I) codant l'amidase PAM I.
- La fig. 2 représente la carte de restriction du plasmide pXL2564, contenant le gène (pam I) codant pour PAM I.
EXEMPLES
EXEMPLE 1: ISOLEMENT ET IDENTIFICATION DE LA SOUCHE SAUVAGE
Coi;4MoN4sAaDovoR4Ns N 12.
EXEMPLE 1: ISOLEMENT ET IDENTIFICATION DE LA SOUCHE SAUVAGE
Coi;4MoN4sAaDovoR4Ns N 12.
1.1 CRIBLAGE MICROBIOLOGIQUE:
Une vaste opération de criblage ou screening microbiologique a permis de sélectionner la souche Comamonas acidovorans N 12, à partir de divers biotopes.
Une vaste opération de criblage ou screening microbiologique a permis de sélectionner la souche Comamonas acidovorans N 12, à partir de divers biotopes.
1.2 SELECON-IDENTIFICACN DE CE MICRO-ORGANISME:
La sélection de ce micro-organisme a été effectuée à l'aide d'un test d'activité amidasique sur des oligomères de synthèse du PA 6.6. L'évaluation d'activité sera vue en détail ci-après.
La sélection de ce micro-organisme a été effectuée à l'aide d'un test d'activité amidasique sur des oligomères de synthèse du PA 6.6. L'évaluation d'activité sera vue en détail ci-après.
Le micro-organisme sélectionné a ensuite été identifié sur la base de ses caractères morphologiques, physiologiques et biochimiques et éventuellement antigéniques, de façon tout à fait traditionnelle, par le Laboratoire de Bactériologie de l'INsTITUT PASTEUR.
Sur la base de ces résultats et des activités d'hydrolyse sur un mélange d'oligomères
AB, ABA, BAB et ABAB, la souche naturelle sélectionnée a été soumise ensuite à une caractérisation plus poussée.
AB, ABA, BAB et ABAB, la souche naturelle sélectionnée a été soumise ensuite à une caractérisation plus poussée.
EXEMPLE 2: CARACTERISATION POUSSEE DE COMAMONAS ACIDOVORANS N 12 2.1 OPTIMISATION DES CONDITIONS DE CULTURE :
Le milieu de culture optimum est le M9YE3 présentant la composition suivante:
- KH2PO4.. 0,75 g/I
- K2HPO4.3H2O . 1,00 g/l
- Na2HP04.12H20 . 1,00 g/l
- (NH4)2SO4 . 2,50 g/l
- Extrait de levure . 3,00 g/l
- MgSO4.7H2O . 1,00 g/l
- FeSO4.7H2O.. 2,30 mg/l
- MnS04.7H20. 2,70 mg/l
- CoCl2.2H2O . 2,30 mgA
- CaCl2.2H2O .. 1,50 mg/l
- CuSO4.5H2O. 0,25 mg
- pH.. . 7,2
et additionné de sel d'acide adipique à 10 g/l.
Le milieu de culture optimum est le M9YE3 présentant la composition suivante:
- KH2PO4.. 0,75 g/I
- K2HPO4.3H2O . 1,00 g/l
- Na2HP04.12H20 . 1,00 g/l
- (NH4)2SO4 . 2,50 g/l
- Extrait de levure . 3,00 g/l
- MgSO4.7H2O . 1,00 g/l
- FeSO4.7H2O.. 2,30 mg/l
- MnS04.7H20. 2,70 mg/l
- CoCl2.2H2O . 2,30 mgA
- CaCl2.2H2O .. 1,50 mg/l
- CuSO4.5H2O. 0,25 mg
- pH.. . 7,2
et additionné de sel d'acide adipique à 10 g/l.
Les cultures sont réalisées dans des fioles Erlenmeyers remplies au 1/5ème de leur volume total. Les milieux sont incubés à 30 C et agités à 150 t/min.
La préculture se compose de 10 ml de milieu LB:
- Tryptone.. 10 g
- Extrait de levure . 5 g/l
- NaCl.. . . 10 g/l ensemencées par une colonie venant d'une boîte de Pétri contenant du milieu M9YE3 gélosé et 5 g d'un composé comprenant une fonction amide, tel que des oligomères penta aux décamères du PA 6.6.
- Tryptone.. 10 g
- Extrait de levure . 5 g/l
- NaCl.. . . 10 g/l ensemencées par une colonie venant d'une boîte de Pétri contenant du milieu M9YE3 gélosé et 5 g d'un composé comprenant une fonction amide, tel que des oligomères penta aux décamères du PA 6.6.
La culture est ensuite ensemencée à 1 % avec le milieu optimum (v/v). En fin de culture, la production cellulaire est déterminée par un extrait sec, obtenu par séchage d'une nuit à 105 C d'un culot cellulaire, obtenu après centrifugation (10 min à 12 000 g).
Pour obtenir une efficacité maximale dans l'hydrolyse, il est avantageux d'introduire, dans le milieu, un composé contenant au moins une fonction amide.
Selon une autre caractéristique préférentielle de l'invention, la source de carbone comporte, conjointement aux solubles, un complément choisi, avantageusement, parmi les hydrates de carbone, le saccharose étant particulièrement préféré.
Pour obtenir une efficacité maximale dans l'hydrolyse, il est avantageux d'introduire, dans le milieu, un composé contenant au moins une fonction amide.
2.2 HYDROLYSE ENZYMATIQUE - MESURE D'ACTIVITE DU MICRO-ORGANISME SAUVAGE:
La mesure d'activité est déterminée à 28 C dans un tampon phosphate 10,5 immola, à pH 7,5 et avec un volume final de 1 ml.
La mesure d'activité est déterminée à 28 C dans un tampon phosphate 10,5 immola, à pH 7,5 et avec un volume final de 1 ml.
Le TABLEAU 1 ci-dessous donne les résultats obtenus.
<tb> <SEP> SUBSTRATS <SEP> Comamonas <SEP> acidovorans <SEP> N <SEP> 12
<tb> co:e'tion <SEP> dans <SEP> l'essai <SEP> en
<tb> <SEP> (1,4) <SEP> AB <SEP> o <SEP> A+ <SEP> B <SEP> 280 <SEP> mg <SEP> de <SEP> A/h.g
<tb> <SEP> de <SEP> cellules <SEP> sèches
<tb> <SEP> (2,6) <SEP> ABA <SEP> # <SEP> AB <SEP> + <SEP> A <SEP> 215 <SEP> mg <SEP> de <SEP> AB/h.g
<tb> <SEP> de <SEP> cellules <SEP> sèches
<tb> <SEP> (1,4) <SEP> ABAB <SEP> BAB <SEP> + <SEP> A <SEP> 410 <SEP> mg <SEP> de <SEP> BAB/h.g
<tb> <SEP> de <SEP> cellules <SEP> sèches
<tb>
EXEMPLE 3: PURIFICATION DE LA POLYAMIDE HYDROLASE DE COMXMONAS
ACIDOVORANS N 12 SELON L'INVENTION.
<tb> co:e'tion <SEP> dans <SEP> l'essai <SEP> en
<tb> <SEP> (1,4) <SEP> AB <SEP> o <SEP> A+ <SEP> B <SEP> 280 <SEP> mg <SEP> de <SEP> A/h.g
<tb> <SEP> de <SEP> cellules <SEP> sèches
<tb> <SEP> (2,6) <SEP> ABA <SEP> # <SEP> AB <SEP> + <SEP> A <SEP> 215 <SEP> mg <SEP> de <SEP> AB/h.g
<tb> <SEP> de <SEP> cellules <SEP> sèches
<tb> <SEP> (1,4) <SEP> ABAB <SEP> BAB <SEP> + <SEP> A <SEP> 410 <SEP> mg <SEP> de <SEP> BAB/h.g
<tb> <SEP> de <SEP> cellules <SEP> sèches
<tb>
EXEMPLE 3: PURIFICATION DE LA POLYAMIDE HYDROLASE DE COMXMONAS
ACIDOVORANS N 12 SELON L'INVENTION.
Protocole type:
Le suivi de l'activité de cette enzyme (PAM II) se fait en dosant l'activité d'hydrolyse deABABenBAB+A.
Le suivi de l'activité de cette enzyme (PAM II) se fait en dosant l'activité d'hydrolyse deABABenBAB+A.
3.1. GLOSSAIRE:
DTE = 1,4 dithioerythritol,
Acide EDTA = Ethylène Diamine Tetra Acétique
CHAPS = 3 [(3 cholamidopropyl)-diméthylammonio]- i -propanesulphonate
SDS = sodium dodécyl sulphate 3.2 PREPARATION DES EXTRAITS ENZYMATIQUES:
On part de cellules issues d'une culture âgée de 20 h en flasque de 2,5 I remplis par 500 ml de milieu M9YE3 décrit dans l'exemple 2 et additionné de sel d'acide adipique à 10g/I.
DTE = 1,4 dithioerythritol,
Acide EDTA = Ethylène Diamine Tetra Acétique
CHAPS = 3 [(3 cholamidopropyl)-diméthylammonio]- i -propanesulphonate
SDS = sodium dodécyl sulphate 3.2 PREPARATION DES EXTRAITS ENZYMATIQUES:
On part de cellules issues d'une culture âgée de 20 h en flasque de 2,5 I remplis par 500 ml de milieu M9YE3 décrit dans l'exemple 2 et additionné de sel d'acide adipique à 10g/I.
PREMIERE EXTRACTION PAR TRAITEMENT AUX ULTRA-SONS:
On remet en suspension 25 g de cellules de Comamonas acidovorans dans 75 ml de tampon 100 mM Tris-HCl pH 7,5 contenant 1 mM DTE, S mM EDTA, 100 mM KCI et
15 % v/v de glycérol.
On remet en suspension 25 g de cellules de Comamonas acidovorans dans 75 ml de tampon 100 mM Tris-HCl pH 7,5 contenant 1 mM DTE, S mM EDTA, 100 mM KCI et
15 % v/v de glycérol.
On soumet ensuite la suspension à un traitement discontinu (10 % de traitement, 90 % de repos) aux ultrasons dans la glace fondante pendant 70 min.
Puis on centrifuge pendant 1 h 30 à 50 000 g (ultracentrifugeuse Beckman).
On obtient: enfin:
< d'une part 90 ml de surnageant (S1) à 21 mg/ml de protéines, soit 1 890 mg de
protéines d'activité spécifique 6 "lmoles/h/mg (11340 unités au total).
< d'une part 90 ml de surnageant (S1) à 21 mg/ml de protéines, soit 1 890 mg de
protéines d'activité spécifique 6 "lmoles/h/mg (11340 unités au total).
< d'autre part un culot (C1) qui est remis en suspension dans 30 ml de tampon
25 mM Tris-HCl pH 8 contenant 2 mM DTE, 8 mM CHAPS et 15% v/v de glycérol.
25 mM Tris-HCl pH 8 contenant 2 mM DTE, 8 mM CHAPS et 15% v/v de glycérol.
C'est ce culot qui contient également de l'activité polyamidase II qui est traité par la suite. On notera qu'il est possible après dessalage des 90 ml de surnageant dans le même tampon sans glycérol et nouvelle ultracentrifugation de purifier et de reconcentrer dans un nouveau culot trés fin l'activité polyamidase II apparemment soluble lors de la première centrifugation. En effet en diminuant la densité du tampon (par élimination du glycérol) on accélère la chute des très fines particules. Ces données sont en accord avec le fait que le premier surnageant n'est pas isolable par chromatographie, par exemple sur colonne
MonoQ, puisque l'on retrouve l'activité tout au long du gradient.
MonoQ, puisque l'on retrouve l'activité tout au long du gradient.
TRAITEMENT COMPLEMENTAIRE DU CULOT DE PREMIERE CENTRIFUGATION:
On centrifuge le culot (C1) remis en suspension pendant 30 min à 4 000g, pour faire tomber les cellules non lysées par le premier traitement aux ultra-sons.
On centrifuge le culot (C1) remis en suspension pendant 30 min à 4 000g, pour faire tomber les cellules non lysées par le premier traitement aux ultra-sons.
On recueille ensuite le surnageant (S2) et on le soumet à un traitement discontinu (10 % de traitement, 90 % de repos) aux ultra-sons dans la glace fondante pendant 20 min.
Puis, on centrifuge à nouveau 2 h à 50 000 g et on recueille le surnageant (S3).
ETAPES DE P URIFICA T'ON PAR CHROMATOGRAPHIE:
1ère Etape : Le surnageant S3 est chromatographié en trois fois sur une colonne de
MonoQ HR10/10 (Pharmacia) équilibrée dans le tampon 25 mM Tris-HCl pH 8 contenant 2 mM DTE, 8 mM CHAPS et 15 % v/v glycérol. L'élution se fait par un gradient linéaire sur 60 min de O à 0,6 M NaCI avec un débit de 3 ml/min. L'activité polyamidase II est éluée à environ 0,2 M NaCI en un pic assez large. Les fractions actives sont regroupées et concentrées à 5 ml sur Centriprep 10 (Amicon).
1ère Etape : Le surnageant S3 est chromatographié en trois fois sur une colonne de
MonoQ HR10/10 (Pharmacia) équilibrée dans le tampon 25 mM Tris-HCl pH 8 contenant 2 mM DTE, 8 mM CHAPS et 15 % v/v glycérol. L'élution se fait par un gradient linéaire sur 60 min de O à 0,6 M NaCI avec un débit de 3 ml/min. L'activité polyamidase II est éluée à environ 0,2 M NaCI en un pic assez large. Les fractions actives sont regroupées et concentrées à 5 ml sur Centriprep 10 (Amicon).
2ème Stade: Aux 5 ml recueillis précédemment sont ajoutés 5 ml de tampon 25 mM
Tris-HCl pH 8 contenant 1 mM DTE, 8 mM CHAPS, 1,5 M sulfate d'ammonium et 15 % v/v de glycérol. Puis ces 10 ml sont chromatographiés en deux fois sur une colonne de
Phenylsuperose HR10/10 (Pharmacia) équilibrée dans le tampon 25 mM Tris-HCl pH 8 contenant 2 mM DTE, 8 mM CHAPS, 1M sulfate d'ammonium et 15% v/v glycérol.
Tris-HCl pH 8 contenant 1 mM DTE, 8 mM CHAPS, 1,5 M sulfate d'ammonium et 15 % v/v de glycérol. Puis ces 10 ml sont chromatographiés en deux fois sur une colonne de
Phenylsuperose HR10/10 (Pharmacia) équilibrée dans le tampon 25 mM Tris-HCl pH 8 contenant 2 mM DTE, 8 mM CHAPS, 1M sulfate d'ammonium et 15% v/v glycérol.
L'élution se fait par un gradient linéaire sur 70 min de 1 à O M sulfate d'ammonium avec un débit de 1,25 ml/min. L'activité polyamidase est éluée à environ 0,8 M sulfate d'ammonium.
Les fractions actives sont regroupées et concentrées à 400 Ill sur Centriprep 10 (Amicon).
3ème EtaDe : Les 400 ijI précédents sont chromatographiés en deux fois sur colonne
TSK G3000 SW (Supelco) équilibrée dans le tampon 100 mM Tris-HCl pH 7,5 contenant 2 mM DTE, 8 mM CHAPS, 150 mM NaCI et 15 % v/v glycérol et éluée à 0,5 ml/min.
TSK G3000 SW (Supelco) équilibrée dans le tampon 100 mM Tris-HCl pH 7,5 contenant 2 mM DTE, 8 mM CHAPS, 150 mM NaCI et 15 % v/v glycérol et éluée à 0,5 ml/min.
L'activité est retrouvée depuis l'exclusion jusqu'à un poids moléculaire d'environ 30 kDa.
Les fractions les plus actives sont regroupées, amenées à un volume de 5 ml et déssalées sur colonnes (2,5 ml par colonne) de PD 10 Sephadex G25 (Pharmacia) équilibrées et éluées dans le tampon 25 mM Tris-HCI pH 8 contenant 2 mM DTE, 8 mM CHAPS et 15 % v/v glycérol.
4ème EtalDe : Les 7 ml issus du dessalage sur PD10 sont chromatographiés sur colonne MonoQ HR 5/5 (Pharmacia) équilibrée dans le tampon 25 mM Tris-HCI pH 8 contenant 2 mM DTE, 8 mM CHAPS et 15 % v/v glycérol. L'élution se fait par un gradient linéaire sur 30 min de O à 0,6 M NaCI avec un débit de 1 mUmin. L'activité polyamidase est éluée à environ 0,15 M NaCl en un pic assez large. Les fractions actives sont regroupées et après ajout de 0,05 % SDS sont concentrées à 200 Ill sur Centriprep 10 puis Centricon 10 (Amicon).
5ème EtaDe : Les 200 1ll recueillis sont injectés sur colonne de TSK G3000 SW équilibrée dans le tampon 40 mM sulfate de sodium, 20 mM phosphate de sodium pH 6,8 contenant 0,25 % p/v SDS et éluée à un débit de 0,25 ml/min. La polyamidase sort en un pic fin contrôlé par éléctrophorèse. Ce matériel est utilisé pour le séquençage.
DETERMINATION DU POIDSMOLECULAIRE PAR ELECTROPHORESE
Le poids moléculaire déterminé par électrophorèse sur gel de polyacrylamide varie selon le mode de préparation de l'échantillon de polyamidase 11.
Le poids moléculaire déterminé par électrophorèse sur gel de polyacrylamide varie selon le mode de préparation de l'échantillon de polyamidase 11.
En présence de 2,5 % de SDS et 5 % de mercaptoéthanol, on trouve une bande située entre 36 et 40 kDa mais le même échantillon s'il est chauffé 5 min à 90 "C ne migre plus qu'à un poids moléculaire d'environ 150 kDa. D'après son protocole de purification, ce phénomène est caractéristique de certaines protéines associées aux membranes; or la polyamidase est bien une protéine membranaire.
SEQUENÇAGE
Un lot de 60 pg environ de polyamidase préparé par le protocole type, mais en partant
de 60 g de cellules et en remplaçant l'étape de Phénylsuperose par une deuxième étape de
MonoQ HR10/10), est digéré directement par 5 'Lg d'enzyme LysC, en présence de 0,25 %
p/v SDS. Les fragments obtenus ont été purifiés sur colonne Vydac C18.
Un lot de 60 pg environ de polyamidase préparé par le protocole type, mais en partant
de 60 g de cellules et en remplaçant l'étape de Phénylsuperose par une deuxième étape de
MonoQ HR10/10), est digéré directement par 5 'Lg d'enzyme LysC, en présence de 0,25 %
p/v SDS. Les fragments obtenus ont été purifiés sur colonne Vydac C18.
Plusieurs séquences originales ont été obtenues:
Séquence 1: 24 résidus dont 1 non identifié (X) = SEQ ID NO : 1 dans la liste de
séquence annexée:
RGATTMPLKPPHVVLAXLTYDTAG
Séquence 2: 34 résidus dont 1 non identifié (X) SEQ ID NO: 2 dans la liste de séquences annexée:
TTNVDDYMQRNRTAGLLILKGGAVALERYGMGXT
Séquence 3: 30 résidus dont 2 non identifiés (X) SEQ ID NO : 3 dans la liste de
séquences annexée:
GSAYEQNTIRELXRMTSGVRXIEAYSETGN
EXEMPLE 4:HYDROLYSE ENZYMATIQUE D'OLIGOMERES FORMES PAR DES
MONOMERES A ET B RELIES LES UNS AUX AUTRES PAR DES
LIAISONS AMIDES SECONDAIRES A L'AIDE D'UN MELANGE D'ENZYMES
SELON L'INVENTION ET D'HYDROLASE PAM L
Dans le présent exemple, ce ne sont pas les enzymes pures que l'on met en oeuvre, mais leurs précurseurs biologiques, à savoir la souche Comamonas acidovorans N12 selon l'invention et une souche hébergeant le gène pam I (SEQ ID NO : 4 annexée) et produisant l'enzyme PAM I (SEQ ID NO: 5 annexée), ladite souche étant construite selon le protocole donné ci-après.
Séquence 1: 24 résidus dont 1 non identifié (X) = SEQ ID NO : 1 dans la liste de
séquence annexée:
RGATTMPLKPPHVVLAXLTYDTAG
Séquence 2: 34 résidus dont 1 non identifié (X) SEQ ID NO: 2 dans la liste de séquences annexée:
TTNVDDYMQRNRTAGLLILKGGAVALERYGMGXT
Séquence 3: 30 résidus dont 2 non identifiés (X) SEQ ID NO : 3 dans la liste de
séquences annexée:
GSAYEQNTIRELXRMTSGVRXIEAYSETGN
EXEMPLE 4:HYDROLYSE ENZYMATIQUE D'OLIGOMERES FORMES PAR DES
MONOMERES A ET B RELIES LES UNS AUX AUTRES PAR DES
LIAISONS AMIDES SECONDAIRES A L'AIDE D'UN MELANGE D'ENZYMES
SELON L'INVENTION ET D'HYDROLASE PAM L
Dans le présent exemple, ce ne sont pas les enzymes pures que l'on met en oeuvre, mais leurs précurseurs biologiques, à savoir la souche Comamonas acidovorans N12 selon l'invention et une souche hébergeant le gène pam I (SEQ ID NO : 4 annexée) et produisant l'enzyme PAM I (SEQ ID NO: 5 annexée), ladite souche étant construite selon le protocole donné ci-après.
Cette construction vise à obtenir le gènepam I (codant pour l'enzyme PAM I) qui est précédé du site de fixation des ribosomes du gène cll du page x et qui est exprimé à partir du promoteur de l'opéron tryptophane d'E. Coli. Pour ce faire, un site de restriction Ndel a été créé au codon d'initiation de pan I par la technique de la PCR en utilisant comme matrice le plasmide pXL2297 (fig. 1) hébergé par la souche I 1495 déposée à la CNCM le 29 Novembre 1994. Le fragment Ndel-Apal de 208 pb, contenant la partie 5' du gène pam I, a été amplifié par PCR en prenant soin d'introduire un site Hindlll en amont du site Ndel grâce au couple d'amorces nucléotidiques (5'- AGCAAGCTTGGAGGCCATATGAATACGAC-3')) et (5'-CACCGGTGGGCCCCTC-3').
Le fragment amplifié HindlSl-Apal a été cloné dans pUC29 (Benes et al. (1993), Gene 130:
151-152) digéré par Hindlll et Apal et le gène pam I a été reconstitué par introduction au site Apal du fragment Apal de 867 pb de pXL2297. Un site Ncol se trouve ainsi placé à une trentaine de nucléotides en aval du codon stop de pam I. Les fragments adjacents Ndel EcoRl de 500 pb et EcoRI-Ncol de 600 pb de ce plasmide ont été insérés dans pXL2158 (Brevet FR 92-09 882) digéré au site Ndel situé immédiatement en aval du promoteur trytptophane.
151-152) digéré par Hindlll et Apal et le gène pam I a été reconstitué par introduction au site Apal du fragment Apal de 867 pb de pXL2297. Un site Ncol se trouve ainsi placé à une trentaine de nucléotides en aval du codon stop de pam I. Les fragments adjacents Ndel EcoRl de 500 pb et EcoRI-Ncol de 600 pb de ce plasmide ont été insérés dans pXL2158 (Brevet FR 92-09 882) digéré au site Ndel situé immédiatement en aval du promoteur trytptophane.
Ainsi, le plasmide pXL2564 (décrit sur la fig. 2), est un dérivé de pBR322 (Sucliffe (1978), Nucleic Acid. Res. 5 2721) contenant un gène conférant la résistance à l'ampicilline et le gène pain I sous contrôle de la cassette d'expression Ptrp-RBScll.
Le plasmide pXL2564 a été introduit dans la souche d'E. Coli TG1, la sélection des micro-organismes se faisant sur LB ampicilline. Un clone contenant pXL2564 (appelée souche PAM I) a été repiqué deux fois sur boîtes gélosées et mis en culture à 37 "C en milieu M9 glucose contenant 100 llg/ml d'ampicilline selon la procédure décrite dans le brevet FR 2 694 571.
La souche Comamonas acidovorans N12 a été cultivée 19 heures dans les mêmes conditions que celles définies au paragraphe 2.1 supra.
Un lot d'oligomères, constitués par des monomères A = acide adipique et
B = HexaMéthylèneDiamine (HMD) et de DPn moyen 4 a été mis en oeuvre.
B = HexaMéthylèneDiamine (HMD) et de DPn moyen 4 a été mis en oeuvre.
25,25 g d'oligomères de DPn moyen 8 sont resuspendus dans 300 ml d'eau. 200 ml d'eau contenant les cellules (soit 3,1 g au total) sont ajoutés. Le tout est agité 18 heures sous courant d'azote.
La solution est centrifugée et le surnageant (400 ml) est récupéré. Un poids sec de 14 g/l est mesuré sur le surnageant. Une fraction est donnée pour analyse des oligomères de l'acide adipique et de l HMD.
Les résultats de cette analyse sont présentés dans le tableau 2 ci-après.
<tb> <SEP> nNEURDOSE(g/I) <SEP> I
<tb> HMD <SEP> 13,8 <SEP> I
<tb> I <SEP> Ac. <SEP> ADIPIQUE <SEP> 20 <SEP> I
<tb> AB <SEP> 1 <SEP> <SEP> I <SEP>
<tb> BAB <SEP> <SEP> 3,6 <SEP> I
<tb> ABA <SEP> 0,7 <SEP> <SEP> I <SEP>
<tb> <SEP> ABAB <SEP> 0,3
<tb>
Le rendement molaire en monomère acide adipique formé est de 66 %, tandis que celui en HMD est de 58 %.
<tb> HMD <SEP> 13,8 <SEP> I
<tb> I <SEP> Ac. <SEP> ADIPIQUE <SEP> 20 <SEP> I
<tb> AB <SEP> 1 <SEP> <SEP> I <SEP>
<tb> BAB <SEP> <SEP> 3,6 <SEP> I
<tb> ABA <SEP> 0,7 <SEP> <SEP> I <SEP>
<tb> <SEP> ABAB <SEP> 0,3
<tb>
Le rendement molaire en monomère acide adipique formé est de 66 %, tandis que celui en HMD est de 58 %.
Le rendement molaire en monomères et oligomères de Dp inférieur à 4, exprimé en moles de monomères, est de 72 %.
LISTE DE SEQUENCES (1) INFORMATION GENERALE:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: RHONE POULENC CHIMIE
(B) RUE: 25, Quai Paul Doumer
(C) VILLE: Courbevoie
(E) PAYS: France
(F) CODE POSTAL: 92400
(G) TELEPHONE: 47 68 12 34
(H) TELECOPIE: 47 68 16 56
(ii) TITRE DE L' INVENTION: Enzymes ayant une activité amidase,
micro-organismes susceptibles de produire de telles
enzymes et procédé d'hydrolyse d'amides en faisant
application
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 5
(iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.25 (OEB) (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 24 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
Arg Gly Ala Thr Thr Met Pro Leu Lys Pro Pro His Val Val Leu Ala
1 5 10 15
Xaa Leu Thr Tyr Asp Thr Ala Gly
20 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 34 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 2:
Thr Thr Asn Val Asp Asp Tyr Met Gln Arg Asn Arg Thr Ala Gly Leu
1 5 10 15
Leu Ile Leu Lys Gly Gly Ala Val Ala Leu Glu Arg Tyr Gly Met Gly
20 25 30
Xaa Thr (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 30 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
Gly Ser Ala Tyr Glu Gln Asn Thr Ile Arg Glu Leu Xaa Arg Met Thr
1 5 10 15
Ser Gly Val Arg Xaa Ile Glu Ala Tyr Ser Glu Thr Gly Asn
20 25 30 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR:na8 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE:ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT: i.."o6Z
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
ATG AAT ACG ACA CCG GTC CAC GCA CTC ACC 30
Met Asn Thr Thr Pro Val His Ala Leu Thr
1 5 10
GAC ATC GAC GGC GGG ATC GCC GTC GAT CCC GCA CCC CGG CTG GCC GGC 78
Asp Ile Asp Gly Gly Ile Ala Val Asp Pro Ala Pro Arg Leu Ala Gly
15 20 25
CCT CCG GTC TTC GGG GGT CCG GGC AAC GAC GCC TTC GAT CTC GCG CCG 126
Pro Pro Val Phe Gly Gly Pro Gly Asn Asp Ala Phe Asp Leu Ala Pro
30 35 40
GTC AGG AGC ACG GGC CGC GAG ATG CTG CGG TTC GAC TTC CCC GGG GTC 174
Val Arg Ser Thr Gly Arg Glu Met Leu Arg Phe Asp Phe Pro Gly Val
45 50 55
AGC ATC GGC GCG GCG CAC TAC GAG GAG GGG CCC ACC GGT GCG ACC GTC 222
Ser Ile Gly Ala Ala His Tyr Glu Glu Gly Pro Thr Gly Ala Thr Val
60 65 70
ATC CAC ATC CCC GCC GGC GCC CGC ACC GCG GTG GAC GCG CGG GGC GGG 270
Ile His Ile Pro Ala Gly Ala Arg Thr Ala Val Asp, Ala Arg Gly Gly
75 80 85 90
GCG GTG GGG CTC TCC GGC GGC TAC GAC TTC AAC CAC GCC ATC TGC CTG 318
Ala Val Gly Leu Ser Gly Gly Tyr Asp Phe Asn His Ala Ile Cys Leu
95 100 105
GCC GGC GGA GCC TGC TAC GGG CTC GAG GCG GGC GCC GGG GTG AGC GAC 3S3
Ala Gly Gly Ala Cys Tyr Gly Leu Glu Ala Gly Ala Gly Val Ser Asp
110 115 120
GCG CTC CTG GAA CGC CTC GAG CAT CGC ACC GGC TTC GCC GAG CTC CAG 414
Ala Leu Leu Glu Arg Leu Glu His Arg Thr Gly Phe Ala Glu Leu Gln
125 130 135
CTG GTG TCG TCG GCG GTC ATC TAC GAC TTC TCG GCG CGC TCC ACC GCG 462
Leu Val Ser Ser Ala Val île Tyr Asp Phe Ser Ala Arg Ser Thr Ala
140 145 150
GTC TAC CCC GAC AAG GCG CTC GGC Coe GCG GCG CTC OAA TTC GCC GTT
Val Tyr Pro Asp Lys Ala Leu Gly Arg Ala Ala Leu Glu Phe Ala Val 155 160 165 170
CCC GGT GAG TTC CCG CAG GGG CGG GCG GGC GCG GGC ATG AGC GCG TCC 558
Pro Gly Glu Phe Pro Gln Gly Arg Ala Gly Ala Gly Met Ser Ala Ser
175 180 185
GCG GGC AAG GTG GAC TGG GAC CGC ACC GAG ATC ACC GGG CAG GGC GCG 806
Ala Gly Lys Val Asp Trp Asp Arg Thr Glu Ile Thr Gly Gln Gly Ala
190 195 200
GCG TTC CGT CGT CTC GGC GAC GTG CGC ATC CTC GCC GTC GTC GTG CCG 654
Ala Phe Arg Arg Leu Gly Asp Val Arg Ile Leu Ala Val Val Val Pro
205 210 215
AAC CCG GTC GGT GTG ATC GTG GAC CGC GCG GGC ACG GTG GTG CGC GGC 702
Asn Pro Val Gly Val Ile Val Asp Arg Ala Gly Thr Val Val Arg Gly
220 225 230
AAC TAC GAC GCG CAG ACC GGG GTC CGG CGC CAC CCG GTG TTC GAC TAC 750
Asn Tyr Asp Ala Gln Thr Gly Val Arg Arg His Pro Val Phe Asp Tyr 235 240 245 250
CAG GAG GCG TTC GCC GAG CAG GTC CCG CCC GTC ACC GAG GCC GGC AAC 798 Gln Glu Ala Phe Ala Glu Gln Val Pro Pro Val Thr Glu Ala Gly Asn
255 260 265
ACC ACG ATC AGC GCG ATC GTC ACG AAC GTG CGG ATG AGC CCC GTC GAG 846
Thr Thr Ile Ser Ala Ile Val Thr Asn Val Arg Met Ser Pro Val Glu
270 275 280
CTG AAC CAG TTC GCC AAG CAG GTG CAC AGT TCG ATG CAC CGC GGC ATC 894
Leu Asn Gln Phe Ala Lys Gln Val His Ser Ser Met His Arg Gly Ile
285 290 295
CAG CCG TTC CAC ACC GAC ATG GAC GGC GAC ACG CTC TTC CGC GTC ACC 942 Gln Pro Phe His Thr Asp Met Asp Gly Asp Thr Leu Phe Ala Val Thr
300 305 310
ACC GAC GAG ATC GAT CTG CCG ACG ACC CCG GGG TCG TCG CGC GGG CGG 990
Thr Asp Glu Ile Asp Leu Pro Thr Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Arg 315 320 325 330
CTG TCG GTG AAC GCG ACC GCG CTC GGC GCG ATC GCC TCC GAG GTG ATG 1.038
Leu Ser Val Asn Ala Thr Ala Leu Gly Ala Ile Ala Ser Glu Val Met
335 340 345
TGG GAC GCC GTC CTC GAG GCC GGC AAG TAG 1068
Trp Asp Ala Val Leu Glu Ala Gly Lys
350 355 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 355 acides aminés
(B) TYPE: acide amine
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 5:
Met Asn Thr Thr Pro Val His Ala Leu Thr Asp Ile Asp Gly Gly Ile
1 5 10 15
Ala Val Asp Pro Ala Pro Arg Leu Ala Gly Pro Pro Val Phe Gly Gly
20 25 30
Pro Gly Asn Asp Ala Phe Asp Leu Ala Pro Val Arg Ser Thr Gly Arg
35 40 45
Glu Met Leu Arg Phe Asp Phe Pro Gly Val Ser Ile Gly Ala Ala His
50 - 55 60
Tyr Glu Glu Gly Pro Thr Gly Ala Thr Val Ile His Ile Pro Ala Gly
65 70 75 80 Ala -Arg Thr Ala Val Asp Ala Arg Gly Gly Ala Val Gly Leu Ser Gly
85 90 95
Gly Tyr Asp Phe Asn His Ala Ile Cys Leu Ala Gly Gly Ala Cys Tyr
100 105 110
Gly Leu Glu Ala Gly Ala Gly Val Ser Asp Ala Leu Leu Glu Arg Leu
115 120 125
Glu His Arg Thr Gly Phe Ala Glu Leu Gln Leu Val Ser Ser Ala Val
130 135 140
Ile Tyr Asp Phe Ser Ala Arg Ser Thr Ala Val Tyr Pro Asp Lys Ala 145 150 155 160
Leu Gly Arg Ala Ala Leu Glu Phe Ala Val Pro Gly Glu Phe Pro Gln
165 170 175
Gly Arg Ala Gly Ala Gly Met Ser Ala Ser Ala Gly Lys Val Asp Trp
180 185 190
Asp Arg Thr Glu Ile Thr Gly Gln Gly Ala Ala Phe Arg Arg Leu Gly
195 200 205
Asp Val Arg Ile Leu Ala Val Val Val Pro Asn Pro Val Gly Val Ile
210 215 220
Val Asp Arg Ala Gly Thr Val Val Arg Gly Asn Tyr Asp Ala Gln Thr 225 230 235 240
Gly Val Arg Arg His Pro Val Phe Asp Tyr Gln Glu Ala Phe Ala Glu
245 250 255 Gln Val Pro Pro Val Thr Glu Ala Gly Asn Thr Thr Ile Ser Ala Ile
260 265 270
Val Thr Asn Val Arg Met Ser Pro Val Glu Leu Asn Gln Phe Ala Lys
275 280 285 Gln Val His Ser Ser Met His Arg Gly Ile Gln Pro Phe His Thr Asp
290 295 300
Met Asp Gly Asp Thr Leu Phe Ala Val Thr Thr Asp Glu Ile Asp Leu 305 310 315 320
Pro Thr Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Arg Leu Ser Val Asn Ala Thr
325 330 335
Ala Leu Gly Ala Ile Ala Ser Glu Val Met Trp Asp Ala Val Leu Glu
340 345 350
Ala Gly Lys
355
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: RHONE POULENC CHIMIE
(B) RUE: 25, Quai Paul Doumer
(C) VILLE: Courbevoie
(E) PAYS: France
(F) CODE POSTAL: 92400
(G) TELEPHONE: 47 68 12 34
(H) TELECOPIE: 47 68 16 56
(ii) TITRE DE L' INVENTION: Enzymes ayant une activité amidase,
micro-organismes susceptibles de produire de telles
enzymes et procédé d'hydrolyse d'amides en faisant
application
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 5
(iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.25 (OEB) (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 24 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
Arg Gly Ala Thr Thr Met Pro Leu Lys Pro Pro His Val Val Leu Ala
1 5 10 15
Xaa Leu Thr Tyr Asp Thr Ala Gly
20 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 34 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 2:
Thr Thr Asn Val Asp Asp Tyr Met Gln Arg Asn Arg Thr Ala Gly Leu
1 5 10 15
Leu Ile Leu Lys Gly Gly Ala Val Ala Leu Glu Arg Tyr Gly Met Gly
20 25 30
Xaa Thr (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 30 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
Gly Ser Ala Tyr Glu Gln Asn Thr Ile Arg Glu Leu Xaa Arg Met Thr
1 5 10 15
Ser Gly Val Arg Xaa Ile Glu Ala Tyr Ser Glu Thr Gly Asn
20 25 30 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR:na8 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE:ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT: i.."o6Z
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
ATG AAT ACG ACA CCG GTC CAC GCA CTC ACC 30
Met Asn Thr Thr Pro Val His Ala Leu Thr
1 5 10
GAC ATC GAC GGC GGG ATC GCC GTC GAT CCC GCA CCC CGG CTG GCC GGC 78
Asp Ile Asp Gly Gly Ile Ala Val Asp Pro Ala Pro Arg Leu Ala Gly
15 20 25
CCT CCG GTC TTC GGG GGT CCG GGC AAC GAC GCC TTC GAT CTC GCG CCG 126
Pro Pro Val Phe Gly Gly Pro Gly Asn Asp Ala Phe Asp Leu Ala Pro
30 35 40
GTC AGG AGC ACG GGC CGC GAG ATG CTG CGG TTC GAC TTC CCC GGG GTC 174
Val Arg Ser Thr Gly Arg Glu Met Leu Arg Phe Asp Phe Pro Gly Val
45 50 55
AGC ATC GGC GCG GCG CAC TAC GAG GAG GGG CCC ACC GGT GCG ACC GTC 222
Ser Ile Gly Ala Ala His Tyr Glu Glu Gly Pro Thr Gly Ala Thr Val
60 65 70
ATC CAC ATC CCC GCC GGC GCC CGC ACC GCG GTG GAC GCG CGG GGC GGG 270
Ile His Ile Pro Ala Gly Ala Arg Thr Ala Val Asp, Ala Arg Gly Gly
75 80 85 90
GCG GTG GGG CTC TCC GGC GGC TAC GAC TTC AAC CAC GCC ATC TGC CTG 318
Ala Val Gly Leu Ser Gly Gly Tyr Asp Phe Asn His Ala Ile Cys Leu
95 100 105
GCC GGC GGA GCC TGC TAC GGG CTC GAG GCG GGC GCC GGG GTG AGC GAC 3S3
Ala Gly Gly Ala Cys Tyr Gly Leu Glu Ala Gly Ala Gly Val Ser Asp
110 115 120
GCG CTC CTG GAA CGC CTC GAG CAT CGC ACC GGC TTC GCC GAG CTC CAG 414
Ala Leu Leu Glu Arg Leu Glu His Arg Thr Gly Phe Ala Glu Leu Gln
125 130 135
CTG GTG TCG TCG GCG GTC ATC TAC GAC TTC TCG GCG CGC TCC ACC GCG 462
Leu Val Ser Ser Ala Val île Tyr Asp Phe Ser Ala Arg Ser Thr Ala
140 145 150
GTC TAC CCC GAC AAG GCG CTC GGC Coe GCG GCG CTC OAA TTC GCC GTT
Val Tyr Pro Asp Lys Ala Leu Gly Arg Ala Ala Leu Glu Phe Ala Val 155 160 165 170
CCC GGT GAG TTC CCG CAG GGG CGG GCG GGC GCG GGC ATG AGC GCG TCC 558
Pro Gly Glu Phe Pro Gln Gly Arg Ala Gly Ala Gly Met Ser Ala Ser
175 180 185
GCG GGC AAG GTG GAC TGG GAC CGC ACC GAG ATC ACC GGG CAG GGC GCG 806
Ala Gly Lys Val Asp Trp Asp Arg Thr Glu Ile Thr Gly Gln Gly Ala
190 195 200
GCG TTC CGT CGT CTC GGC GAC GTG CGC ATC CTC GCC GTC GTC GTG CCG 654
Ala Phe Arg Arg Leu Gly Asp Val Arg Ile Leu Ala Val Val Val Pro
205 210 215
AAC CCG GTC GGT GTG ATC GTG GAC CGC GCG GGC ACG GTG GTG CGC GGC 702
Asn Pro Val Gly Val Ile Val Asp Arg Ala Gly Thr Val Val Arg Gly
220 225 230
AAC TAC GAC GCG CAG ACC GGG GTC CGG CGC CAC CCG GTG TTC GAC TAC 750
Asn Tyr Asp Ala Gln Thr Gly Val Arg Arg His Pro Val Phe Asp Tyr 235 240 245 250
CAG GAG GCG TTC GCC GAG CAG GTC CCG CCC GTC ACC GAG GCC GGC AAC 798 Gln Glu Ala Phe Ala Glu Gln Val Pro Pro Val Thr Glu Ala Gly Asn
255 260 265
ACC ACG ATC AGC GCG ATC GTC ACG AAC GTG CGG ATG AGC CCC GTC GAG 846
Thr Thr Ile Ser Ala Ile Val Thr Asn Val Arg Met Ser Pro Val Glu
270 275 280
CTG AAC CAG TTC GCC AAG CAG GTG CAC AGT TCG ATG CAC CGC GGC ATC 894
Leu Asn Gln Phe Ala Lys Gln Val His Ser Ser Met His Arg Gly Ile
285 290 295
CAG CCG TTC CAC ACC GAC ATG GAC GGC GAC ACG CTC TTC CGC GTC ACC 942 Gln Pro Phe His Thr Asp Met Asp Gly Asp Thr Leu Phe Ala Val Thr
300 305 310
ACC GAC GAG ATC GAT CTG CCG ACG ACC CCG GGG TCG TCG CGC GGG CGG 990
Thr Asp Glu Ile Asp Leu Pro Thr Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Arg 315 320 325 330
CTG TCG GTG AAC GCG ACC GCG CTC GGC GCG ATC GCC TCC GAG GTG ATG 1.038
Leu Ser Val Asn Ala Thr Ala Leu Gly Ala Ile Ala Ser Glu Val Met
335 340 345
TGG GAC GCC GTC CTC GAG GCC GGC AAG TAG 1068
Trp Asp Ala Val Leu Glu Ala Gly Lys
350 355 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 355 acides aminés
(B) TYPE: acide amine
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 5:
Met Asn Thr Thr Pro Val His Ala Leu Thr Asp Ile Asp Gly Gly Ile
1 5 10 15
Ala Val Asp Pro Ala Pro Arg Leu Ala Gly Pro Pro Val Phe Gly Gly
20 25 30
Pro Gly Asn Asp Ala Phe Asp Leu Ala Pro Val Arg Ser Thr Gly Arg
35 40 45
Glu Met Leu Arg Phe Asp Phe Pro Gly Val Ser Ile Gly Ala Ala His
50 - 55 60
Tyr Glu Glu Gly Pro Thr Gly Ala Thr Val Ile His Ile Pro Ala Gly
65 70 75 80 Ala -Arg Thr Ala Val Asp Ala Arg Gly Gly Ala Val Gly Leu Ser Gly
85 90 95
Gly Tyr Asp Phe Asn His Ala Ile Cys Leu Ala Gly Gly Ala Cys Tyr
100 105 110
Gly Leu Glu Ala Gly Ala Gly Val Ser Asp Ala Leu Leu Glu Arg Leu
115 120 125
Glu His Arg Thr Gly Phe Ala Glu Leu Gln Leu Val Ser Ser Ala Val
130 135 140
Ile Tyr Asp Phe Ser Ala Arg Ser Thr Ala Val Tyr Pro Asp Lys Ala 145 150 155 160
Leu Gly Arg Ala Ala Leu Glu Phe Ala Val Pro Gly Glu Phe Pro Gln
165 170 175
Gly Arg Ala Gly Ala Gly Met Ser Ala Ser Ala Gly Lys Val Asp Trp
180 185 190
Asp Arg Thr Glu Ile Thr Gly Gln Gly Ala Ala Phe Arg Arg Leu Gly
195 200 205
Asp Val Arg Ile Leu Ala Val Val Val Pro Asn Pro Val Gly Val Ile
210 215 220
Val Asp Arg Ala Gly Thr Val Val Arg Gly Asn Tyr Asp Ala Gln Thr 225 230 235 240
Gly Val Arg Arg His Pro Val Phe Asp Tyr Gln Glu Ala Phe Ala Glu
245 250 255 Gln Val Pro Pro Val Thr Glu Ala Gly Asn Thr Thr Ile Ser Ala Ile
260 265 270
Val Thr Asn Val Arg Met Ser Pro Val Glu Leu Asn Gln Phe Ala Lys
275 280 285 Gln Val His Ser Ser Met His Arg Gly Ile Gln Pro Phe His Thr Asp
290 295 300
Met Asp Gly Asp Thr Leu Phe Ala Val Thr Thr Asp Glu Ile Asp Leu 305 310 315 320
Pro Thr Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Arg Leu Ser Val Asn Ala Thr
325 330 335
Ala Leu Gly Ala Ile Ala Ser Glu Val Met Trp Asp Ala Val Leu Glu
340 345 350
Ala Gly Lys
355
Claims (12)
- * soit X2 =de l à 6 atomes de carbone,alcalins et alcalino-terreux et R4 représentant un alkyle linéaire ou ramifié comprenant* soit Xl = OH, OM, OR4 avec M choisi parmi les métaux, de préférence les métauxcarbones, X représentesélectionnés parmi l'hydrogène et/ou les restes alkyles ayant, avantageusement, de 1 à 6entre 4 et 12, e R2 correspond à des radicaux, identiques ou différents - de préférence identiques - etaikylènes ayant un nombre de carbone supérieur ou égal à 4 et, de préférence, comprisarylalkylène, les radicaux aromatiques étant éventuellement des polycondensats, lesreprésentant un (cyclo)alkyléne, linéaire ou ramifié, substitué ou non, un arylène, undans laquelle A, B sont des motifs monoméres, Rl, R3 sont des radicaux divalents, identiques ou différents - de préférence différents - etI - Enzyme ayant une activité amidase, en particulier vis-à-vis de substrats de type (poly)amide et répondant à au moins l'une des formules suivantesREVENDICAIIONS:Y représente * soit Y' = hydrogène, * soit y2 =la même définition que celle donnée ci-dessus pour R2,avec R2, R3 tels que définis ci-dessus et R5, R6 identiques ou différents et répondant àavec les conditions suivantes -a- si X = X', alors Y = Y' ou y2, -b- si X = X27 alors Y = y2, e et enfin p compris entre 1 et 4, de préférence entre I et 3,définition que M ou à R4,avec R' tel que défini supra et Z correspondant à l'hydrogène, à Ml ayant la mêmeau moins l'une de ces séquences.< et/ou par au moins un polypeptidique présentant au moins 50 % d'homologie avecGSAYEQNTIRELXRMTSGVRXIEAYSETGNde séquences annexéeSéquence 3 : 30 résidus dont 2 non identifiés (X) SEQ ID NO : 3 dans la listeTTNVDDYMQRNRTAGLLILKGGAVALERYGMGXTde séquences annexée* Séquence 2 34 résidus dont l non identifié (X) SEQ I:D NO : 2 dans la listede séquence annexée RGATTMP LKPPHVVLAXLTYDTAG* Séquence 1: 24 résidus dont t non identifié (X) = SEQ ID NO 1 dans la listeannexée:correspondant respectivement à SEQ H) NO : 1, 2 et 3 dans la liste de séquences< par au moins une des trois séquences peptidiques suivantes (1), (2) et (3)pour X' et Y' dans la légende de la formule (I), * et q = l à 8, ladite enzyme étant constituée -* U et V répondent respectivement aux mêmes définitions que celles données supra* R2, R3 sont tels que définis ci-dessus,dans laquelle
- 2 - Enzyme selon la revendication l, caractérisée en ce qu'elle comporte les trois séquences peptidiques (1), (2) et (3).
- 3 - Enzyme selon la revendication l ou 2, caractérisée en ce qu'elle est apte à hydrolyser des substrats (I) et (II), comprenant au moins une extrémité carboxyle.
- 4 - Enzyme selon l'une quelconque des revendications l à 3, caractérisée- en ce qu'elle est active vis-à-vis d'un substrat (I) formé par un tétramère de typeABAB,- et en ce qu'elle est apte à transformer ce substrat en trimére ABA + A, avec uneactivité enzymatique spécifique (Us) - exprimée en moles de ABABhydrolysé.h-'.mg-' et mesurée dans des conditions données - supérieure ou égaleà I 000.
- 5 - Enzyme selon l'une quelconque des revendications I à 4, caractérisée- en ce qu'elle est active vis-à-vis d'un substrat (I) formé par un trimère ABA,- et en ce qu'elle est apte à transformer ce trimère en un dimére AB et unmonomère A, avec une activité enzymatique spécifique (Us) - exprimée en molesde AB hydrolysé/h.mg d'enzyme et mesurée dans des conditions donnéessupérieure ou égale à 1 000.
- 6 - Enzyme selon l'une quelconque des revendications I à 4, caractérisée- en ce qu'elle est active vis-à-vis d'un substrat (I) formé par un dimére detype AB,- et en ce qu'elle est apte à transformer ce trimère en deux monomères A et B,avec une activité enzymatique spécifique (Us) - exprimée en moles de ABhydrolysé/h.mg d'enzyme et mesurée dans des conditions données - supérieure ouégale à l 500.
- 7 - Enzyme selon l'une quelconque des revendications l à 6, caractérisée en ce qu'elle est produite par des micro-organismes du type Comamonas acidovorans (N 12), de préférence du type de la souche référencée et déposée dans la collection Nationale deCultures de Micro-organismes sous le n" I 1522 le 4 janvier 1995 et/ou par leurs recombinants.
- 8 - Micro-organisme, caractérisé en ce qu'il est apte à produire l'enzyme selon l'une quelconque des revendications I à 7.
- 9 - Micro-organisme selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il est constitué parComamonas acidovorans, de préférence par la souche référencée et déposée à la CollectionNationale de Cultures de Micro-organismes - Institut Pasteur PARIS - sous le n" I 1522 le 4 janvier 1995 ou par des recombinants de celle-ci.
- 10 - Procédé d'hydrolyse de substrats, au moins en partie formés par ceux (I) et/ou (11), tels que définis dans la revendication 1,caractérisé en ce qu'il consiste à mettre en oeuvre au moins une enzyme selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 et/ou au moins un micro-organisme selon la revendication 8 ou 9.organismes - Institut Pasteur PARIS - sous le n" I 1495, le 29 novembre 1994.organisme référencé et déposé dans la Collection National de Cultures de Micro-une telle enzyme pouvant, entre autres, être celle produite sous l'égide du microdéfinie par la SEQ ID NO 5 annexée,et/ou une enzyme dénommée PAM I, telle que celleFlavobacternum sp K 172,* une enzyme E3 produite sous l'égide du gène nyl-c deses précurseurs biologiques sauvages et/ou recombinants, ladite enzyme étantet au moins un autre type d'enzyme et/ou à au moins l'un derevendications I à 7 et/ou au moins un micro-organisme selon la revendication 8 ou 9,au moins une enzyme selon l'une quelconque des- et en ce que l'on met en oeuvreinférieur ou égal à 3 et, de préférence, à des monomères A et B,- en ce qu'il conduit à des oligomères de degré de polymérisation (DPn)caractérisé
- 11 - Procédé d'hydrolyse de substrats, au moins en partie constitués par des oligomères de DPn inférieur à 40. de préférence à 20 et, plus préférentiellement encore, à 12 et dérivant de polyamides au moins issus de polycondensation entre des monomères diacide (A) et diamine (B),
- 12 - Procédé selon la revendication 10 ou 11, caractérisé en ce qu'il comprend, outre la lyse enzymatique, une lyse thermique et/ou chimique permettant d'obtenir des substrats de DPn tel qu'ils soient hydrolysables par la voie enzymatique, telle que définie dans les revendications précédentes.
Priority Applications (8)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FR9508917A FR2736928B1 (fr) | 1995-07-18 | 1995-07-18 | Enzymes ayant une activite amidase micro-organismes susceptibles de produire de telles enzymes et procede d'hydrolyse d'amides en faisant application |
BR9611086-4A BR9611086A (pt) | 1995-07-18 | 1996-07-17 | Processo de hidrólise de (poli)amidas, enzima, microorganismo, sequência de adn que codifica uma enzima e processo de hidrólise de substratos |
PCT/FR1996/001118 WO1997004083A1 (fr) | 1995-07-18 | 1996-07-17 | Enzymes et micro-organismes a activite amidase hydrolysant les polyamides |
CN96196381A CN1193348A (zh) | 1995-07-18 | 1996-07-17 | 水解聚酰胺的具有酰胺酶活性的酶和微生物 |
JP50636097A JP3205344B2 (ja) | 1995-07-18 | 1996-07-17 | ポリアミドを加水分解するアミダーゼ活性を有する酵素および微生物 |
AU66188/96A AU6618896A (en) | 1995-07-18 | 1996-07-17 | Enzymes and micro-organisms with amidase activity which hydrolyse polyamides |
EP96925805A EP0839188A1 (fr) | 1995-07-18 | 1996-07-17 | Enzymes et micro-organismes a activite amidase hydrolysant les polyamides |
US09/000,040 US6180388B1 (en) | 1995-07-18 | 1996-07-17 | Enzymes and micro organisms with amidase activity which hydrolyze polyamides |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FR9508917A FR2736928B1 (fr) | 1995-07-18 | 1995-07-18 | Enzymes ayant une activite amidase micro-organismes susceptibles de produire de telles enzymes et procede d'hydrolyse d'amides en faisant application |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
FR2736928A1 true FR2736928A1 (fr) | 1997-01-24 |
FR2736928B1 FR2736928B1 (fr) | 1997-10-17 |
Family
ID=9481278
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
FR9508917A Expired - Fee Related FR2736928B1 (fr) | 1995-07-18 | 1995-07-18 | Enzymes ayant une activite amidase micro-organismes susceptibles de produire de telles enzymes et procede d'hydrolyse d'amides en faisant application |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US6180388B1 (fr) |
EP (1) | EP0839188A1 (fr) |
JP (1) | JP3205344B2 (fr) |
CN (1) | CN1193348A (fr) |
AU (1) | AU6618896A (fr) |
BR (1) | BR9611086A (fr) |
FR (1) | FR2736928B1 (fr) |
WO (1) | WO1997004083A1 (fr) |
Families Citing this family (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
PT103035A (pt) * | 2003-10-29 | 2005-04-29 | Univ Do Minho | Metodo para modificacao das fibras de poliacrilonitrilo com acetato de vinilo como comonomero e de poliamida, utilizando uma enzima cutinase |
CN106119112B (zh) * | 2008-03-27 | 2021-07-13 | 基因组股份公司 | 用于产生己二酸和其他化合物的微生物 |
CN102317464B (zh) * | 2008-12-12 | 2014-10-29 | 塞莱西翁有限公司 | 从α-酮酸生物合成双官能烷烃 |
US8404465B2 (en) | 2009-03-11 | 2013-03-26 | Celexion, Llc | Biological synthesis of 6-aminocaproic acid from carbohydrate feedstocks |
BRPI1011936A2 (pt) * | 2009-07-02 | 2016-05-03 | Verdezyne Inc | métodos biológicos para a preparação de ácido adípico |
US8728798B2 (en) | 2011-05-03 | 2014-05-20 | Verdezyne, Inc. | Biological methods for preparing adipic acid |
CN110983851A (zh) * | 2019-11-20 | 2020-04-10 | 山鹰华南纸业有限公司 | 一种提高纸机烘干部运行效率的方法 |
WO2024121309A1 (fr) | 2022-12-08 | 2024-06-13 | Solvay Specialty Polymers Usa, Llc | Procédé pour le recyclage d'un polyamide comprenant une étape de prétraitement |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR2700777A1 (fr) * | 1993-01-27 | 1994-07-29 | Rhone Poulenc Chimie | Polypeptides à activité amidase, outils génétiques et micro-organismes hôtes permettant leur obtention, procédé d'hydrolyse mettant en Óoeuvre lesdits polypeptides. |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5468632A (en) * | 1991-12-20 | 1995-11-21 | Eli Lilly And Company | Recombinant DNA compounds and expression vectors encoding para-nitrobenzyl esterase activity from bacillus |
US5629190A (en) * | 1992-08-10 | 1997-05-13 | Rhone-Poulenc Chimie | Polypeptides possessing a nitrilase activity and method of converting nitriles to carboxylates by means of said polypeptides |
-
1995
- 1995-07-18 FR FR9508917A patent/FR2736928B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
1996
- 1996-07-17 CN CN96196381A patent/CN1193348A/zh active Pending
- 1996-07-17 JP JP50636097A patent/JP3205344B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1996-07-17 BR BR9611086-4A patent/BR9611086A/pt not_active Application Discontinuation
- 1996-07-17 AU AU66188/96A patent/AU6618896A/en not_active Abandoned
- 1996-07-17 WO PCT/FR1996/001118 patent/WO1997004083A1/fr active Search and Examination
- 1996-07-17 US US09/000,040 patent/US6180388B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-07-17 EP EP96925805A patent/EP0839188A1/fr not_active Withdrawn
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR2700777A1 (fr) * | 1993-01-27 | 1994-07-29 | Rhone Poulenc Chimie | Polypeptides à activité amidase, outils génétiques et micro-organismes hôtes permettant leur obtention, procédé d'hydrolyse mettant en Óoeuvre lesdits polypeptides. |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
KAKUDO ET AL.: "Nylon oligomer degradation gene, nylC, om plasmid pOAD2 from Flavobacterium strain encodes endo-type 6-aminohexanoate oligomer hydrolase : purification and characterization of the nylC gene product", APPL. ENVIRON. MICROBIOL., vol. 59, no. 11, pages 3978 - 3980 * |
NEGORO ET AL.: "A new nylon oligomer degradation gene (nylC) on plasmid pOAD2 from a Flavobacterium sp.", J. BACTERIOLOGY, vol. 174, no. 24, pages 7948 - 7953 * |
NEGORO ET AL.: "The nylon oligomer biodegradation system of Flavobacterium and Pseudomonas", BIODEGRADATION, vol. 5, no. 3-4, pages 185 - 194 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0839188A1 (fr) | 1998-05-06 |
CN1193348A (zh) | 1998-09-16 |
BR9611086A (pt) | 1999-12-28 |
JPH10510436A (ja) | 1998-10-13 |
JP3205344B2 (ja) | 2001-09-04 |
WO1997004083A1 (fr) | 1997-02-06 |
AU6618896A (en) | 1997-02-18 |
FR2736928B1 (fr) | 1997-10-17 |
US6180388B1 (en) | 2001-01-30 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
FR2736927A1 (fr) | Enzymes a activite amidase, outils genetiques et microorganismes hotes permettant leur obtention et procede d'hydrolyse mettant en oeuvre lesdites enzymes | |
AU716692B2 (en) | Esterases | |
RU2103364C1 (ru) | Последовательность днк, белок и способ получения белка | |
EP0610517B1 (fr) | Adn codant pour la decarbamylase a thermostabilite accrue et utilisation de cet adn | |
EP0596812B1 (fr) | Nitrilase recombinante et son utilisation | |
JP6048850B2 (ja) | D−サクシニラーゼ、およびこれを用いたd−アミノ酸の製造方法 | |
FR2736928A1 (fr) | Enzymes ayant une activite amidase micro-organismes susceptibles de produire de telles enzymes et procede d'hydrolyse d'amides en faisant application | |
CN1121497C (zh) | D-泛酸内酯水解酶和编码该酶的基因 | |
WO1995004828A1 (fr) | Enzymes a activite nitrile-hydratase, outils genetiques et micro-organismes hotes permettant leur obtention et procede d'hydrolyse mettant en ×uvre lesdites enzymes | |
FR2728905A1 (fr) | Nouvelle acide amine amidohydrolase, sequence nuclotidique correspondant et leurs utilisations | |
KR100380804B1 (ko) | 내열성을 갖는 포스포리파제 a1의 돌연변이체 및 그의제조방법 | |
WO2005080584A1 (fr) | PROCÉDÉ SERVANT, GRÂCE À L'UTILISATION D'α-AMINO-&epsiv;-CAPROLACTAME RACÉMASE, À PRODUIRE UN MÉLANGE D'AMIDE DE D- ET DE L-AMINOACIDE, À PRODUIRE UN D- OU L-AMINOACIDE ET À PRODUIRE UN AMIDE DE D- OU L-AMINOACIDE | |
KR100449456B1 (ko) | 신규한 d-입체특이적 아미노산 아미다아제, 그의 유전자, 그의 제조방법, 이를 이용한 d-아미노산의 제조방법 | |
EP0815238A1 (fr) | Fragment d'adn codant pour une d-amino-acide-oxydydase | |
JP4502295B2 (ja) | 耐熱性d−アミノアシラーゼ | |
EP0681610A1 (fr) | Polypeptides a activite amidase, outils genetiques et micro-organismes hotes permettant leur obtention | |
JPH0822228B2 (ja) | アミノ酸アミド加水分解酵素及びその使用 | |
CN116103250A (zh) | 来源于橙色迪茨氏菌的烷烃羟化酶及其编码基因与应用 | |
FR2786500A1 (fr) | Gene codant pour une alpha-agarase et son utilisation pour la production d'enzymes de biodegradation des agars | |
FR2771752A1 (fr) | Gene d'enzyme de lyse de paroi cellulaire, plasmide le contenant et bacterie transformee par ce plasmide | |
JPH08256771A (ja) | アミダーゼ活性を有する新規タンパク質およびそれをコードする遺伝子 | |
JP2000139466A (ja) | L−アスパラギン酸の製造方法 | |
EP0800576A1 (fr) | Systeme d'expression, vecteur et cellule transformee par ce vecteur | |
JPH10313889A (ja) | L−アスパラギン酸の製造法 | |
JPH09224679A (ja) | 高度不飽和脂肪酸エステルに顕著に作用するリパーゼ遺伝子及びそれを用いるリパーゼの製造法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
ST | Notification of lapse |