FR2736358A1 - Recombinant myxomatosis virus encoding non-myxomatosis antigen - for dual vaccination of rabbits and hares e.g. against myxomatosis and rabbit viral haemorrhagic disease - Google Patents
Recombinant myxomatosis virus encoding non-myxomatosis antigen - for dual vaccination of rabbits and hares e.g. against myxomatosis and rabbit viral haemorrhagic disease Download PDFInfo
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Abstract
Description
La présente invention concerne un virus myxomateux recombinant vivant atténué, son utilisation pour la fabrication d'un vaccin, ainsi qu'un tel vaccin. The present invention relates to a live attenuated recombinant myxomatous virus, its use for the manufacture of a vaccine, as well as such a vaccine.
La présente invention concerne en particulier un vaccin recombinant myxomatose/maladie hémorragique virale des lapins utilisable pour vacciner simultanément les léporidés contre ces deux maladies. The present invention relates in particular to a recombinant myxomatosis / viral hemorrhagic rabbit disease vaccine which can be used to simultaneously vaccinate leporidae against these two diseases.
Le virus myxomateux, étant un léporipoxvirus, présente des caractéristiques qui sont communes à tous les poxviridae. En effet, les poxviridae font partie d'une famille de virus à ADN double brin, qui se répliquent dans le cytoplasme de cellules eucaryotes hôtes. La partie centrale du génome du virus myxomateux comprend des gènes nécessaires à la transcription, à la réplication et à la maturation virales. The myxomatous virus, being a leporipoxvirus, has characteristics which are common to all poxviridae. In fact, poxviridae are part of a family of double-stranded DNA viruses, which replicate in the cytoplasm of eukaryotic host cells. The central part of the myxomatous virus genome contains genes necessary for viral transcription, replication and maturation.
Aux extrémités de ce génome figurent des gènes non essentiels au cycle viral codant pour des protéines déterminant notamment la virulence du virus. At the ends of this genome are genes which are not essential to the viral cycle, coding for proteins determining in particular the virulence of the virus.
De façon connue, la myxomatose représente toujours une des pathologies virales majeures des léporidés, notamment du lapin de garenne, du lapin d'élevage. Le lièvre étant, quant à lui réceptif au virus, mais peu sensible. In known manner, myxomatosis always represents one of the major viral pathologies of leporidae, in particular of rabbits, wild rabbits. The hare being receptive to the virus, but not very sensitive.
Après infection et 3 à 5 jours d'incubation de la maladie, on observe notamment l'apparition de lésions cutanées pseudotumorales (les myxomes), une vive inflammation des paupières ou blépharite, et un écoulement purulent (conjonctivite et rhinite), aboutissant en quelques jours à la mort du léporidé. After infection and 3 to 5 days of incubation of the disease, there is in particular the appearance of pseudotumoral skin lesions (myxomas), a sharp inflammation of the eyelids or blepharitis, and a purulent discharge (conjunctivitis and rhinitis), resulting in a few days after the leporidae's death.
La prophylaxie sanitaire de la myxomatose est très difficile à mettre en oeuvre en raison de ses particularités épidémiologiques (transmission essentiellement par des arthropodes vecteurs, principalement des puces et des moustiques). Seule une prophylaxie médicale généralisée permet de limiter sa progression et la mortalité des lapins. The sanitary prophylaxis of myxomatosis is very difficult to implement because of its epidemiological peculiarities (transmission mainly by vector arthropods, mainly fleas and mosquitoes). Only generalized medical prophylaxis can limit its progression and the mortality of rabbits.
Mais, celle-ci est d'autant plus compliquée à mettre en oeuvre que les pratiques d'élevage actuelles (production sous hangar...) ne favorisent pas cette prophylaxie sanitaire. However, this is all the more complicated to implement since current breeding practices (production under hangar, etc.) do not favor this sanitary prophylaxis.
Les nombreuses recherches menées dans ce domaine depuis des années ont permis de mettre au point des techniques de vaccination plus ou moins efficaces contre cette maladie. The numerous researches carried out in this field for years have made it possible to develop more or less effective vaccination techniques against this disease.
Ainsi, en France, a été développée une technique de vaccination reposant sur l'utilisation en primovaccination, d'un léporipoxvirus proche du virus myxomateux, le virus du
Fibrome de Shope, et, pour les injections de rappel, d'une souche de virus myxomateux atténuée par passages en série sur culture cellulaire, notamment la souche SG33.Thus, in France, a vaccination technique was developed based on the use in primary vaccination, of a leporipox virus close to the myxomatous virus, the virus of
Shope fibroma, and, for booster injections, of a myxomatous virus strain attenuated by serial passages on cell culture, in particular the strain SG33.
Bien que le virus SG33 s'avère être un virus très stable, on s'est aperçu que celui-ci est peu utilisable chez les jeunes animaux et dans les élevages à haut risque en raison d'un pouvoir immunodépresseur résiduel. Although the SG33 virus turns out to be a very stable virus, it has been found that it is not very usable in young animals and in high-risk farms because of a residual immunosuppressive power.
Toutefois, la myxomatose n'est pas la seule pathologie touchant les léporidés. En effet, ceux-ci sont aussi particulièrement sensibles à d'autres agents pathogènes, non seulement d'origine virale, mais aussi d'origines bactérienne ou parasitaire. However, myxomatosis is not the only pathology affecting leporidae. Indeed, these are also particularly sensitive to other pathogens, not only of viral origin, but also of bacterial or parasitic origins.
Ainsi, peuvent être cités à titre d'exemples non limitatifs : la maladie hémorragique virale des lapins ou RVHD (pour Rabbit Viral Haemorrhagic Disease), le EBHS (pour
European Brown Hare Syndrome), les pathologies dûes aux rotavirus, la tularémie dûe à Francisella tularensis, la coccidiose, les entérites dûes notamment à E. Coli ou à des
Clostridies, la maladie de Tyzzer dûe à "Bacillus piliformis", l'encéphalitozoonose, la pasteurellose, la staphylococcie.Thus, non-limiting examples can be cited: rabbit viral hemorrhagic disease or RVHD (for Rabbit Viral Haemorrhagic Disease), EBHS (for
European Brown Hare Syndrome), pathologies due to rotaviruses, tularemia due to Francisella tularensis, coccidiosis, enteritis due in particular to E. Coli or to
Clostridia, Tyzzer's disease due to "Bacillus piliformis", encephalitozoonosis, pasteurellosis, staphylococcal disease.
Afin de lutter contre les divers agents responsables de ces pathologies, des recherches variées ont bien sûr été menées, mais celles-ci n'ont abouti qu'à des résultats très médiocres ou alors difficiles à mettre en oeuvre d'un point de vue industriel. In order to fight against the various agents responsible for these pathologies, various researches have of course been carried out, but these have resulted only in very poor results or then difficult to implement from an industrial point of view. .
A titre d'exemple non limitatif, on peut citer celles menées sur la maladie hémorragique virale des lapins ou RVHD, qui est également une des pathologies virales majeures des léporidés. By way of nonlimiting example, mention may be made of those carried out on the viral hemorrhagic disease of rabbits or RVHD, which is also one of the major viral pathologies of leporidae.
Le virus de la RVHD est principalement véhiculé par le biais de la nourriture et/ou de la boisson. The RVHD virus is mainly spread through food and / or drink.
Dans la forme aigüe, la mort du lapin intervient 48 à 72 heures après infection. In the acute form, rabbit death occurs 48 to 72 hours after infection.
Après autopsie, on constate de nombreuses hémorragies internes, ainsi que des lésions importantes du foie, de la trachée et des poumons de l'animal. After autopsy, there are numerous internal haemorrhages, as well as significant lesions of the liver, trachea and lungs of the animal.
Actuellement, la prophylaxie médicale anti RVHD est fondée sur l'utilisation d'un vaccin adjuvé à virus inactivé extrait au préalable de foies d'animaux inoculés. Currently, anti-HDRV medical prophylaxis is based on the use of an adjuvanted vaccine with inactivated virus previously extracted from the livers of inoculated animals.
On comprend aisément que cette technique présente un inconvénient majeur. En effet, ce procédé, fondé sur une extraction de virus de foies d'animaux inoculés, est lourd. It is easy to understand that this technique has a major drawback. Indeed, this process, based on an extraction of viruses from the livers of inoculated animals, is cumbersome.
Cependant, il est un des seuls connus jusqu'à présent puisque le RHDV (Rabbit Haemorrhagic Disease Virus) reste impossible à cultiver sur systèmes cellulaires.However, it is one of the only known so far since RHDV (Rabbit Haemorrhagic Disease Virus) remains impossible to cultivate on cellular systems.
En résumé, les prophylaxies actuelles contre la myxomatose et les autres pathologies des léporidés présentent les problèmes et inconvénients suivants - elles sont parfois difficiles à mettre en oeuvre car elles reposent sur des techniques "lourdes" ; - elles ne sont pas toujours efficaces et présentent parfois des effets secondaires indésirables ; - elles ne permettent pas de lutter simultanément contre plusieurs maladies - elles ne sont que très difficilement applicables à l'échelle industrielle. In summary, the current prophylaxis against myxomatosis and other leporid pathologies present the following problems and drawbacks - they are sometimes difficult to implement because they are based on "heavy" techniques; - they are not always effective and sometimes have undesirable side effects; - they do not make it possible to combat several diseases simultaneously - they are only very difficult to apply on an industrial scale.
Afin de pallier les problèmes techniques et les inconvénients de l'art antérieur, les inventeurs de la présente invention se sont fixé pour objectif la mise au point d'un virus myxomateux recombinant et un vaccin à base d'un tel virus recombinant permettant de vacciner efficacement et simultanément les léporidés contre la myxomatose et une autre pathologie, qui soit facile à mettre en oeuvre tout en étant très spécifique. In order to overcome the technical problems and the drawbacks of the prior art, the inventors of the present invention set themselves the objective of developing a recombinant myxomatous virus and a vaccine based on such a recombinant virus making it possible to vaccinate effectively and simultaneously leporidae against myxomatosis and another pathology, which is easy to implement while being very specific.
Pour ce faire, les inventeurs de la présente invention ont eu l'idée d'altérer les gènes non essentiels présents sur le génome du virus myxomateux, qui sont notamment le gène TK codant pour la thymidine kinase et les gènes MllL et MGF impliqués dans le pouvoir pathogène afin d'obtenir de nouveaux virus recombinants délétés et atténués utilisables pour la réalisation d'un vaccin anti-myxomatose et exprimant également des antigènes étrangers. To do this, the inventors of the present invention had the idea of altering the nonessential genes present on the genome of the myxomatous virus, which are in particular the TK gene coding for thymidine kinase and the MllL and MGF genes involved in the pathogenic power in order to obtain new deleted and attenuated recombinant viruses usable for the production of an anti-myxomatosis vaccine and also expressing foreign antigens.
De telles recombinaisons entre le génôme d'un virus myxomateux et un ou des gènes codant pour des antigènes présents sur différents agents pathogènes permettent une vaccination des léporidés non seulement contre la myxomatose, mais aussi contre la (les) maladie(s) ciblée(s). Such recombinations between the genome of a myxomatous virus and one or more genes coding for antigens present on different pathogens allow vaccination of leporidae not only against myxomatosis, but also against the targeted disease (s) ).
La présente invention se propose donc de résoudre les inconvénients et de combler les lacunes de l'art antérieur grâce à un virus myxomateux recombinant vivant atténué, comprenant au moins une séquence nucléotidique codant pour, et exprimant, un polypeptide antigénique sous la dépendance d' un promoteur insérés dans l'un des gènes non essentiel à la réplication dudit virus, par exemple un gène de virulence. The present invention therefore proposes to solve the drawbacks and to fill the gaps in the prior art thanks to a live attenuated recombinant myxomatous virus, comprising at least one nucleotide sequence coding for, and expressing, an antigenic polypeptide under the dependence of a promoter inserted into one of the genes not essential for the replication of said virus, for example a virulence gene.
De façon avantageuse, ladite séquence nucléotidique code pour un immunogène viral, bactérien ou parasitaire des léporidés. Advantageously, said nucleotide sequence codes for a viral, bacterial or parasitic immunogen of leporidae.
Préférentiellement, ladite séquence nucléotidique code pour une protéine antigénique, notamment de capside, de membrane ou d'enveloppe d'un agent pathogène choisi dans le groupe formé par : le virus de la RVHD, le virus de 1'EBHS, les rotavirus, le protozoaire responsable de l'encéphalitozoonose, les entérobactéries notamment E. Coli et les clostridies, "Bacillus piliformis", les coccidies, les Pasteurella,
Francisella tularensis, les staphylocoques.Preferably, said nucleotide sequence codes for an antigenic protein, in particular of capsid, membrane or envelope of a pathogenic agent chosen from the group formed by: the RVHD virus, the EBHS virus, the rotaviruses, the protozoan responsible for encephalitozoonosis, enterobacteria including E. coli and clostridia, "Bacillus piliformis", coccidia, Pasteurella,
Francisella tularensis, staphylococci.
Avantageusement, le virus myxomateux est issu d'une souche de léporipoxvirus choisie dans le groupe formé par les souches : SG 33, LEON 162, HONGROIS, FINISTERE, R 801,
TOULOUSE 1, LAUSANNE.Advantageously, the myxomatous virus comes from a strain of leporipoxvirus chosen from the group formed by the strains: SG 33, LEON 162, HUNGROIS, FINISTERE, R 801,
TOULOUSE 1, LAUSANNE.
Ces différentes souches ont fait l'objet d'un dépôt auprès de la Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes (C.N.C.M.) et ont été référencées comme suit - SG 33 : CNCM n0 I-1594 - LEON 162 (L162) : CNCM n" I-1595 - HONGROIS (HG) : CNCM n" I-1593 - FINISTERE (F9) : CNCM n" I-1596 - R 801 : CNCM n" I-1598 - TOULOUSE 1 (T1) : CNCM n" I-1592 - LAUSANNE (Laus) :: CNCM n" I-1597
I1 est à noter que la souche 801 est une souche de type respiratoire c'est-à-dire qu'elle induit une pathologie respiratoire chez le lapin mais sans myxomes, et que les souches TOULOUSE 1 et LAUSANNE sont des souches classiques virulentes mais pouvant être atténuées par déletion.These different strains have been deposited with the National Collection of Cultures of Microorganisms (CNCM) and have been referenced as follows - SG 33: CNCM n0 I-1594 - LEON 162 (L162): CNCM n "I-1595 - HUNGARIAN (HG): CNCM n" I-1593 - FINISTERE (F9): CNCM n "I-1596 - R 801: CNCM n" I-1598 - TOULOUSE 1 (T1): CNCM n "I- 1592 - LAUSANNE (Laus) :: CNCM n "I-1597
It should be noted that the 801 strain is a respiratory type, that is to say that it induces respiratory pathology in rabbits but without myxomas, and that the TOULOUSE 1 and LAUSANNE strains are conventional virulent strains but which can be attenuated by deletion.
Ces différentes souches présentent les propriétés et caractéristiques habituelles en ce qui concerne leur culture. These different strains have the usual properties and characteristics with regard to their culture.
Préférentiellement, ladite séquence nucléotidique et ledit promoteur sont insérés dans les gènes MllL-MGF ou TK dudit virus myxomateux. Preferably, said nucleotide sequence and said promoter are inserted into the M11L-MGF or TK genes of said myxomatous virus.
La présente invention concerne également l'utilisation d'un virus recombinant vivant atténué tel que décrit précédemment pour la fabrication d'un vaccin destiné à vacciner efficacement les léporidés simultanément contre la myxomatose et une autre pathologie. The present invention also relates to the use of a live attenuated recombinant virus as described above for the manufacture of a vaccine intended to effectively vaccinate leporidae simultaneously against myxomatosis and another pathology.
De façon avantageuse, le vaccin selon l'invention comprend comme vecteur le virus myxomateux recombiné vivant atténué tel que décrit précédemment. Advantageously, the vaccine according to the invention comprises as vector the live attenuated recombinant myxomatous virus as described above.
Avantageusement, ledit vaccin comprend une dose vaccinale efficace de virus myxomateux recombiné. Advantageously, said vaccine comprises an effective vaccine dose of recombinant myxomatous virus.
Selon un mode de réalisation préférentiel, l'invention concerne un vaccin recombinant permettant de vacciner simultanément les léporidés contre la myxomatose et la maladie hémorragique virale des lapins (RVHD), caractérisé en ce qu'il comprend comme vecteur le virus myxomateux vivant atténué comprenant une séquence nucléotidique codant pour, et exprimant, un polypeptide antigénique du virus de la maladie hémorragique virale des lapins, sous la dépendance d'un promoteur. According to a preferred embodiment, the invention relates to a recombinant vaccine making it possible to simultaneously vaccinate leporidae against myxomatosis and viral hemorrhagic disease of rabbits (RVHD), characterized in that it comprises as vector the live attenuated myxomatous virus comprising a nucleotide sequence coding for, and expressing, an antigenic polypeptide of the rabbit viral hemorrhagic disease virus, under the control of a promoter.
Préférentiellement, ladite séquence nucléotidique code pour et exprime, la protéine de capside VP60 ou VP60+VP12 dudit virus de la maladie hémorragique virale des lapins. Preferably, said nucleotide sequence codes for and expresses, the capsid protein VP60 or VP60 + VP12 of said virus of rabbit viral hemorrhagic disease.
Avantageusement, ledit promoteur de ladite séquence nucléotidique est le promoteur de vaccine précoce/tardif P7,5. Advantageously, said promoter of said nucleotide sequence is the early / late vaccinia promoter P7.5.
De façon avantageuse, la quantité efficace de virus recombinant par dose vaccinale est comprise entre 102 et équivalents pfu (unités formant plaques ou "plaque forming units" en anglais), et pour la voie intradermique, de préférence entre 103 à 106 équivalents pfu. Advantageously, the effective amount of recombinant virus per vaccine dose is between 102 and pfu equivalents (units forming plaques or "plaque forming units" in English), and for the intradermal route, preferably between 103 to 106 pfu equivalents.
Avantageusement, le vaccin est formulé en vue d'une administration parentérale, de préférence intradermique, ou orale. Advantageously, the vaccine is formulated for parenteral, preferably intradermal, or oral administration.
Dans le cas de la maladie hémorragique virale des lapins (RVHD), les inventeurs ont réalisé un virus recombinant myxomatose-RHDV à partir d'un seul et même virus vivant atténué issu de la souche SG33, dans lequel a été cloné un gène de capside du RHDV codant pour la protéine VP60. In the case of rabbit viral hemorrhagic disease (RVHD), the inventors produced a recombinant myxomatosis-RHDV virus from a single live attenuated virus derived from the strain SG33, in which a capsid gene was cloned RHDV coding for the protein VP60.
Un tel recombinant myxomatose-RHDV permet une double vaccination anti-myxomatose et anti-RVHD (Rabbit Viral
Haemorrhagic Disease), résolvant ainsi le(s) problème(s) posé(s) par ces deux agents pathogènes en élevage de lapins.Such a recombinant myxomatosis-RHDV allows a double vaccination against myxomatosis and anti-RVHD (Rabbit Viral
Haemorrhagic Disease), thus solving the problem (s) posed by these two pathogens in rabbit farming.
D'autres caractérisques et avantages de l'invention apparaîtront dans la description suivante du protocole expérimental suivi, non limitatif, illustrant un mode de réalisation de l'invention, à savoir la réalisation d'un virus recombinant myxomatose-RHDV, en référence aux figures parmi lesquelles - la figure 1 représente des schémas illustrant la construction des plasmides pSMl et pSM2 à partir du plasmide psCll-(VP6o+VPl2) et des gènes MllL-MGF et TK du virus de la souche SG33 - la figure 2A représente un southern blot après migration en
PFGE et hybridation par une sonde totale SG33 - la figure 2B représente un southern blot après migration en
PFGE et hybridation par une sonde VP60 - les figures 3A et 3B représentent les gels d'électrophorèse obtenus après immunoprécipitation des virus SG33, RecIA122 et RecB2111 ; - la figure 4 représente les courbes de titrage en anticorps anti VP60 (c'est-à-dire anti RVHD) obtenues par test ELISA après vaccination de lapins avec les virus RecA et RecB - la figure 5 représente les courbes de titrage en anticorps anti myxomatose obtenues par test ELISA après vaccination de lapins avec les virus SG33, Rec A et Rec B - la figure 6 représente les courbes de titrage en anticorps anti-myxomatose obtenues par séroneutralisation après vaccination de lapins avec les virus SG33, Rec A et Rec B.Other characteristics and advantages of the invention will appear in the following description of the experimental protocol followed, without limitation, illustrating an embodiment of the invention, namely the production of a recombinant myxomatosis-RHDV virus, with reference to the figures. among which - FIG. 1 represents diagrams illustrating the construction of the plasmids pSMl and pSM2 from the plasmid psCll- (VP6o + VPl2) and the MllL-MGF and TK genes of the virus of the strain SG33 - FIG. 2A represents a southern blot after migration in
PFGE and hybridization by a total probe SG33 - FIG. 2B represents a southern blot after migration in
PFGE and hybridization with a VP60 probe - Figures 3A and 3B represent the electrophoresis gels obtained after immunoprecipitation of the viruses SG33, RecIA122 and RecB2111; - Figure 4 represents the anti-VP60 (ie anti RVHD) antibody titration curves obtained by ELISA test after vaccination of rabbits with the RecA and RecB viruses - Figure 5 represents the anti-antibody titration curves myxomatosis obtained by ELISA test after vaccination of rabbits with the SG33, Rec A and Rec B viruses - Figure 6 represents the anti-myxomatosis antibody titration curves obtained by seroneutralization after vaccination of rabbits with the SG33, Rec A and Rec B viruses .
Tout d'abord, le virus myxomateux SG33 (souche vaccinale) est cultivé sur cellules RK13 à 370C en présence de milieu
OptiMEM à 2% SVF (Sérum de Veau Foetal).First of all, the myxomatous virus SG33 (vaccine strain) is cultured on RK13 cells at 370C in the presence of medium
OptiMEM at 2% SVF (Fetal Calf Serum).
Le génome viral comprend les gènes MîlL et MGF qui sont situés à son extrémité gauche. Ces deux gènes sont placés en tandem, la partie 3' de MllL chevauchant la partie 5' de MGF (2 cadres de lecture). The viral genome includes the MîlL and MGF genes which are located at its left end. These two genes are placed in tandem, the 3 'part of MllL overlapping the 5' part of MGF (2 reading frames).
Une séquence de 1063 pb comprenant les 2 cadres de lecture plus les zones promotrices a été amplifiée par la réaction de
PCR (polymerase Chain Reaction).A 1063 bp sequence comprising the 2 reading frames plus the promoter zones was amplified by the reaction of
PCR (Chain Reaction polymerase).
Les amorces utilisées sont les suivantes
-GTAGGATCCGTAACAAGTGTAAATATA (SEQ ID 1)
-CCCGGGATGTTTTCGCGATGTGA (SEQ ID 2)
L'amplification a été réalisée en présence d'une unité de
Taq polymérase sur un appareil Perkin-Elmer en utilisant le programme suivant sur 30 cycles
50"C pendant 1 mn, 72" C pendant 1 mn et 95"C pendant 1 mn.The primers used are as follows
-GTAGGATCCGTAACAAGTGTAAATATA (SEQ ID 1)
-CCCGGGATGTTTTCGCGATGTGA (SEQ ID 2)
The amplification was carried out in the presence of a
Taq polymerase on a Perkin-Elmer device using the following program over 30 cycles
50 "C for 1 min, 72" C for 1 min and 95 "C for 1 min.
Le produit obtenu a ensuite été visualisé sur gel d'agarose à 0,7 % après coloration au BET. The product obtained was then visualized on 0.7% agarose gel after coloring with BET.
On procède également à une amplification du gène de la TK du virus SG33 dans les mêmes conditions, grâce aux amorces suivantes (séquence de la souche LAUSANNE)
-GGTGTTGGATAAGGAAGTTACG (SEQ ID 3)
-GAGGTCGCTGTCGGAGACG (SEQ ID 4)
Le produit obtenu, de 700 pb, comprend le cadre ouvert de lecture plus les séquences régulatrices.The TK gene of the SG33 virus is also amplified under the same conditions, using the following primers (sequence of the LAUSANNE strain)
-GGTGTTGGATAAGGAAGTTACG (SEQ ID 3)
-GAGGTCGCTGTCGGAGACG (SEQ ID 4)
The product obtained, 700 bp, includes the open reading frame plus the regulatory sequences.
Les amplicons obtenus ont été clonés dans le plasmide PGEMT (Promega). La séquence MllL-MGF a été ensuite sous clonée dans pSK+(Stratagène), aux sites Apal et Spel. The amplicons obtained were cloned into the plasmid PGEMT (Promega). The M11L-MGF sequence was then subcloned into pSK + (Stratagene), at the Apal and Spel sites.
Par ailleurs, le gène de la VP60, avec ses séquences promotrices, suivies de la séquence VP12 en 3' a été cloné sous forme de cDNA dans pSK+. La protéine VP60 est la seule protéine de capside du RHDV. Furthermore, the VP60 gene, with its promoter sequences, followed by the VP12 sequence in 3 ′ was cloned as cDNA in pSK +. The VP60 protein is the only RHDV capsid protein.
Après digestion par SacI et SmaI puis polissage par le fragment de Klenow de la DNA pol I, un fragment de 2,2 Kb comprenant 1'ORF de la VP60 et la VP12 est cloné au site Smal du plasmide PSCll donnant le plasmide pSCll-VP60+VP12. After digestion with SacI and SmaI then polishing with the Klenow fragment of DNA pol I, a 2.2 Kb fragment comprising the ORF of VP60 and VP12 is cloned at the Smal site of the plasmid PSCll giving the plasmid pSCll-VP60 + VP12.
Le plasmide pSCll-VP60+VP12 est digéré par NotI en 3' et subit une digestion partielle par PstI en 5', dégageant ainsi un fragment de 5,6 kb (fragment A) comprenant le gène de la 8gal, sous la dépendance du promoteur de vaccine tardif PîlK et les gènes de la VP60+VP12 en aval du promoteur de vaccine précoce/tardif P7,5. The plasmid pSCll-VP60 + VP12 is digested with NotI in 3 'and undergoes a partial digestion with PstI in 5', thus releasing a 5.6 kb fragment (fragment A) comprising the 8gal gene, under the dependence of the promoter late vaccinia P12K and the VP60 + VP12 genes downstream of the early / late vaccinia promoter P7.5.
Cet ensemble est sous cloné dans pSK+ aux sites NotI et
PstI (pSK±A).This set is subcloned in pSK + at NotI and
PstI (pSK ± A).
Après amplification par PCR des gènes TK et MllL-MGF de la souche SG33, les amplicons obtenus ont été clonés dans pGEMT, puis sous-clonés dans le plasmide pSK+ pour MllL-MGF. After PCR amplification of the TK and MllL-MGF genes of the strain SG33, the amplicons obtained were cloned in pGEMT, then subcloned in the plasmid pSK + for MllL-MGF.
Le plasmide pGEMT-TK a été digéré par EcoRV et, après digestion par NotI et KpnI, le fragment A est intégré dans pGEMT-TK au site EcoRV donnant le plasmide pSM2 dont la bonne orientation (le gène de la VP60 vers l'extrémité 3' de TK) est vérifiée par PCR et profil de restriction. The plasmid pGEMT-TK was digested with EcoRV and, after digestion with NotI and KpnI, the fragment A is integrated in pGEMT-TK at the EcoRV site giving the plasmid pSM2 whose good orientation (the gene of VP60 towards the end 3 'of TK) is verified by PCR and restriction profile.
En ce qui concerne pSK+(MllL-MGF), les digestions par
HincII et BsaBI ont permis de déléter les ORF des gènes MllL et MGF de 356 pb et d'insérer auxdits sites HincII et BsaBI un fragment plus petit de 5,3 Kb (fragment B) issu de la digestion par Hindîli de pSK+(A) et ne comprenant pas la séquence VP12, donnant ainsi pSMl.With regard to pSK + (MllL-MGF), digestions by
HincII and BsaBI made it possible to delete the ORFs of the MllL and MGF genes of 356 bp and to insert at said HincII and BsaBI sites a smaller fragment of 5.3 Kb (fragment B) resulting from the HindIII digestion of pSK + (A) and not comprising the sequence VP12, thus giving pSM1.
La bonne orientation (VP60 vers l'extrémité 3' de MGF) est vérifiée par PCR et profil de restriction. The correct orientation (VP60 towards the 3 'end of MGF) is verified by PCR and restriction profile.
Pour chaque plasmide, l'orientation correcte est celle où le sens de transcription du gène de la VP60 correspond à celui du gène TK ou des gènes MllL-MGF. Ceci est vérifié par profil de restriction et amplification par PCR en utilisant une amorce externe sur les séquences TK ou MllL-MGF et une amorce interne sur la séquence Bgal ou la séquence VP60. For each plasmid, the correct orientation is that in which the direction of transcription of the VP60 gene corresponds to that of the TK gene or of the M11L-MGF genes. This is verified by restriction profile and PCR amplification using an external primer on the TK or M11L-MGF sequences and an internal primer on the Bgal sequence or the VP60 sequence.
Les virus recombinants ont été construits en suivant une procédure modifiée de la méthode standard d'obtention des mutants poxvirus. The recombinant viruses were constructed following a modified procedure of the standard method for obtaining poxvirus mutants.
Des cellules RK13 de 24 heures, à 90 % de confluence ont été infectées par 0,03 à 0,04 pfu/cellule de virus SG33. 24 hour RK13 cells, at 90% confluence, were infected with 0.03 to 0.04 pfu / cell of virus SG33.
Après 2 heures à 37 C, l'inoculum viral est éliminé et les cellules lavées deux fois avec de l'OptiMEMSS (sans sérum). Le mélange de transfection additionné de 3 ml d'optiMEMSS est alors ajouté aux cellules. Ce mélange de transfection comprend 10 g de pSMl ou pSM2, préalablement mixé pendant 20 mn à 40 Zg de lipofectamine. After 2 hours at 37 ° C., the viral inoculum is eliminated and the cells washed twice with OptiMEMSS (without serum). The transfection mixture added with 3 ml of optiMEMSS is then added to the cells. This transfection mixture comprises 10 g of pSM1 or pSM2, previously mixed for 20 min with 40 μg of lipofectamine.
L'ensemble est laissé à 37"C pendant 5h30, puis complété par 3 ml d'OptiMEM à 4 % de sérum de veau foetal (SVF), et remis à l'étuve (370) Après 48 heures, les produits de recombinaison subissent 3 cycles de congélation-décongélation et 20 secondes de sonication (puissance maximale, sonicateur
B15 Branson) puis sont étalés sur des cellules RK13 de 24 heures, en OptiMEM 2 % SVF.The whole is left at 37 "C for 5 h 30 min, then completed with 3 ml of OptiMEM at 4% fetal calf serum (SVF), and returned to the oven (370) After 48 hours, the recombination products undergo 3 freeze-thaw cycles and 20 seconds of sonication (maximum power, sonicator
B15 Branson) then are spread on RK13 cells of 24 hours, in OptiMEM 2% SVF.
48 heures plus tard, le milieu liquide est remplacé par un milieu gélosé (M.E.M.E 2 X, agarose LM (Low Melting) 1 % et
SVF 2,5 %) qui, après 48 heures, est recouvert d'une surcouche d'agarose permettant la détection des virus recombinants (MEME. 2 X, LM 1 %, RN (Rouge Neutre) 1 % et Xgal 330 pg/ml). Chaque plage bleue signalant la présence de virus recombinant est prélevée et diluée dans du DMEM à 2,5% SVF afin d'être réétalée, après congélation-décongélation et sonication, sur cellules RK13. Après 5 cycles de purification sous agarose LM à 1 %, les virus recombinants sont amplifiés sur cellules RK13. 48 hours later, the liquid medium is replaced by an agar medium (MEME 2 X, agarose LM (Low Melting) 1% and
2.5% SVF) which, after 48 hours, is covered with an agarose overlay allowing the detection of recombinant viruses (MEME. 2 X, LM 1%, RN (Neutral Red) 1% and Xgal 330 pg / ml ). Each blue area signaling the presence of recombinant virus is taken and diluted in DMEM at 2.5% FCS in order to be re-spread, after freezing-thawing and sonication, on RK13 cells. After 5 cycles of purification under 1% LM agarose, the recombinant viruses are amplified on RK13 cells.
La structure génomique des virus recombinants a été confirmée par réaction de PCR (données non montrées), puis analysée par Southern-Blot. Le virus recombinant Myx.( MllL-
MGF) (VP60) est appelé RecB2111 (Rec B) et le virus recombinant Myx.[TK-(VP6O+VPl2)] est appelé RecIA122 (Rec A)
Comme cela a été décrit ci-avant, les virus recombinants RecIA122 et RecB2111 ont été obtenus par une méthode classique dans laquelle la sélection de virus mutants est réalisée grâce à la coloration bleue issue de la dégradation du Xgal par la B galactosidase.The genomic structure of the recombinant viruses was confirmed by PCR reaction (data not shown), then analyzed by Southern-Blot. The recombinant Myx virus (MllL-
MGF) (VP60) is called RecB2111 (Rec B) and the recombinant Myx virus. [TK- (VP6O + VPl2)] is called RecIA122 (Rec A)
As described above, the recombinant viruses RecIA122 and RecB2111 were obtained by a conventional method in which the selection of mutant viruses is carried out by virtue of the blue coloration resulting from the degradation of Xgal by B galactosidase.
Les "foyers de lyse" produits par RecIA122 (Rec A) et le virus SG33 sont de taille et d'aspect équivalents. En revanche, pour RecB2111 (Rec B), les foyers sont plus petits, sans que cela nuise à la production virale. The "lysis foci" produced by RecIA122 (Rec A) and the SG33 virus are of equivalent size and appearance. On the other hand, for RecB2111 (Rec B), the outbreaks are smaller, without this adversely affecting viral production.
D'abord vérifiés par PCR (données non fournies), les virus candidats sont analysés par southern-blot après une migration par la technique d'électrophorèse en champs pulsés (PFGE). First checked by PCR (data not provided), the candidate viruses are analyzed by southern blot after migration by the pulsed field electrophoresis technique (PFGE).
Ainsi, peut-on observer un polymorphisme de restriction entre les virus recombinants et le SG33. Thus, can we observe a restriction polymorphism between the recombinant viruses and SG33.
Les étapes de l'analyse électrophorétique sont exposés ciaprès. The steps of the electrophoretic analysis are described below.
Des inserts d'agarose à 0,75 % contenant l'extrait oytoplasmique de l'équivalent de 106 cellules RK13 infectées par un virus recombinant ou du virus SG33 sont préincubés dans du tampon 1 X de digestion pendant 15 mn à 4"C. Puis, 80 U d'enzyme de restriction (HindIII ou PstI) sont ajoutées et l'ensemble est mis à incuber 12 heures à 37-C. 0.75% agarose inserts containing the oytoplasmic extract of the equivalent of 106 RK13 cells infected with a recombinant virus or the SG33 virus are preincubated in 1 × digestion buffer for 15 min at 4 "C. Then , 80 U of restriction enzyme (HindIII or PstI) are added and the whole is incubated for 12 hours at 37 ° C.
Les inserts ainsi préparés sont déposés sur un gel d'agarose à 1 8 où ils subissent une migration électrophorétique en champs pulsés (alternance 1,5 s) dans un tampon TBE 0,5 X , à 275 V pendant 7 heures. Les profils obtenus sont visualisés après coloration au BET. The inserts thus prepared are deposited on a 1 8 agarose gel where they undergo electrophoretic migration in pulsed fields (alternation 1.5 s) in a 0.5 X TBE buffer, at 275 V for 7 hours. The profiles obtained are visualized after coloring with BET.
En vue de compléter l'analyse de la structure génomique, on utilise la technique de Southern-Blot. Les gels d'électrophorèse en champs pulsés précédents ont été transférés sur membrane de nylon. Un fragment d'ADN de 830 pb correspondant aux sites internes ClaI-ClaI du gène de la VP60, et de 1'ADN total du virus SG33, ont été marqués à la digoxigénine par "Random-Priming". Après hybridation une nuit avec l'une ou l'autre des deux sondes, la détection se fait par réaction chemiluminescente suite à la dégradation d'un substrat par la phosphatase alkaline couplée à un anticorps anti digoxigénine. In order to complete the analysis of the genomic structure, the Southern-Blot technique is used. The previous pulsed field electrophoresis gels were transferred to a nylon membrane. An 830 bp DNA fragment corresponding to the internal ClaI-ClaI sites of the VP60 gene, and of the total DNA of the virus SG33, were labeled with digoxigenin by "Random-Priming". After overnight hybridization with one or the other of the two probes, the detection is done by chemiluminescent reaction following the degradation of a substrate by alkaline phosphatase coupled to an anti-digoxigenin antibody.
En coloration au BET, et après hybridation avec une sonde
SG33 totale, des différences nettes apparaissent entre les profils de digestion des virus-recombinants et ceux du virus
SG33. Ces profils de restriction sont représentés sur la figure 2.In BET staining, and after hybridization with a probe
Total SG33, clear differences appear between the digestion profiles of the virus-recombinants and those of the virus
SG33. These restriction profiles are shown in Figure 2.
A partir des profils de restriction par Hindîli et PstI du virus myxomateux de souche Lausanne, les fragments de DNA comprenant les gènes TK et MllL-MGF ont été identifiés. From the Hindli and PstI restriction profiles of the myxomatous virus of the Lausanne strain, the DNA fragments comprising the TK and M11L-MGF genes were identified.
I1 est à noter que le fragment de 5,6 Kb (fragment A) ajoute 2 sites HindIII et PstI à ceux déjà existant sur le génome du SG33. It should be noted that the 5.6 Kb fragment (fragment A) adds 2 HindIII and PstI sites to those already existing on the genome of SG33.
Ceci est illustré également par la figure 2 ou :
Piste 1 : DNA de virus SG33 digéré par PstI
Piste 2 : DNA de virus RecIA122 digéré par PstI
Piste 3 : DNA de virus RecB2111 digéré par PstI
Piste 4 : DNA de virus RecB2111 digéré par HindIII
Piste 5 : DNA de virus RecIA122 digéré par HindIII
Piste 6 : DNA de virus SG33 digéré par Hindîli. This is also illustrated in Figure 2 where:
Lane 1: DNA of virus SG33 digested with PstI
Lane 2: DNA of RecIA122 virus digested by PstI
Lane 3: DNA of RecB2111 virus digested with PstI
Lane 4: DNA of RecB2111 virus digested with HindIII
Lane 5: DNA from RecIA122 virus digested with HindIII
Lane 6: DNA of virus SG33 digested with Hindli.
En effet, sur la figure 2, on voit disparaître, sur les profils, une bande d'environ 32 kb pour le virus RecIA122 au profit de deux de 25 kb et 7 kb environ (fig. 2A, pistes 5 et 6), et une bande de 60 kb au profit d'une de 30 kb environ (pistes 1 et 2). In fact, in FIG. 2, we see disappearing, on the profiles, a band of approximately 32 kb for the RecIA122 virus in favor of two of approximately 25 kb and 7 kb (fig. 2A, tracks 5 and 6), and a band of 60 kb in favor of one of around 30 kb (tracks 1 and 2).
De même, le fragment de 5,3 kb ajoute, quant à lui, deux sites PstI et un site HindIII, provoquant la disparition d'une bande de 23 kb (fig. 2A, piste 3) d'une part, et d'autre part l'apparition de deux bandes de 13 kb et 8 kb (fig. 2A, piste 4) environ sur les profils obtenus avec le virus RecB2111. Similarly, the 5.3 kb fragment adds two PstI sites and a HindIII site, causing the disappearance of a 23 kb band (FIG. 2A, track 3) on the one hand, and on the other hand, the appearance of two bands of 13 kb and 8 kb (fig. 2A, track 4) approximately on the profiles obtained with the RecB2111 virus.
D'autre part, l'hybridation avec une sonde interne (Cla I - ClaI)VP60, de 830 pb confirme la présence d'un seul insert sur le génome myxomateux pour chaque virus recombinant, comme on peut le constater sur la figure 2B où:
Piste 1 : DNA de virus RecIA122 digéré par PstI
Piste 2 : DNA de virus RecB2111 digéré par PstI
Piste 3 : DNA de virus RecB2111 digéré par HindIII
Piste 4 : DNA de virus RecIA122 digéré par HindIII.On the other hand, hybridization with an internal probe (Cla I - ClaI) VP60, of 830 bp confirms the presence of a single insert on the myxomatous genome for each recombinant virus, as can be seen in FIG. 2B where :
Lane 1: DNA of RecIA122 virus digested by PstI
Lane 2: DNA of RecB2111 virus digested with PstI
Lane 3: DNA from RecB2111 virus digested with HindIII
Lane 4: DNA from RecIA122 virus digested with HindIII.
L'expression de la VP60 en culture cellulaire a été vérifiée par immunoprécipitation et immunofluorescence. The expression of VP60 in cell culture was verified by immunoprecipitation and immunofluorescence.
Des cellules RK13 de 24 h, confluentes, infectées par 30 pfu/cellule de virus recombinants, soit RecB2111, soit RecIA122, sont marquées à la méthionine 35S (100 Mci/ml) pendant 5 h 30 min. 24 hr RK13 cells, confluent, infected with 30 pfu / cell of recombinant viruses, either RecB2111 or RecIA122, are labeled with 35S methionine (100 Mci / ml) for 5 h 30 min.
A l'issue de ce marquage, les cellules sont récoltées, lysées et les cytosols sont précipités en présence de protéine
A sépharose, soit avec un sérum immun anti Myxomatose et RVHD, soit avec un anticorps polyclonal anti RVHD, soit avec 2 anticorps monoclonaux anti VP60, 61A47 et 4E3.At the end of this labeling, the cells are harvested, lysed and the cytosols are precipitated in the presence of protein
With sepharose, either with an anti Myxomatosis and RVHD immune serum, or with a polyclonal anti RVHD antibody, or with 2 monoclonal antibodies against VP60, 61A47 and 4E3.
Les protéines ainsi marquées et précipitées subissent une électrophorèse en gel SDS-PAGE à 10% (figures 3A et 3B). The proteins thus labeled and precipitated undergo a 10% SDS-PAGE gel electrophoresis (FIGS. 3A and 3B).
La protéine VP60 est visualisée sur cellules RK13 infectées, par immunofluorescence indirecte. Pour cela, les cellules infectées avec l'un ou l'autre des virus recombinants sont fixées 20 heures post-infection avec une solution à 50 % d'éthanol/50 % d'acétone avant d'être mises en présence d'anticorps anti VP60, soit polyclonaux, soit monoclonaux. La révélation est réalisée par un anticorps anti lapin ou anti souris FITC. The VP60 protein is visualized on infected RK13 cells, by indirect immunofluorescence. For this, the cells infected with one or the other of the recombinant viruses are fixed 20 hours post-infection with a 50% ethanol / 50% acetone solution before being put in the presence of anti VP60, either polyclonal or monoclonal. The revelation is carried out by an anti rabbit or anti mouse FITC antibody.
Après immunoprécipitation, pour les deux virus, apparaît clairement en SDS-page une bande protéique à environ 60 kDa, signalant la présence de la protéine VP60. After immunoprecipitation, for both viruses, a protein band at approximately 60 kDa clearly appears on SDS-page, signaling the presence of the protein VP60.
Les gels obtenus après immunoprécipitation sur cellules
RK13 et électrophorèse sont représentés sur les figures 3A et 3B.The gels obtained after immunoprecipitation on cells
RK13 and electrophoresis are shown in Figures 3A and 3B.
Le gel d'électrophorèse représenté sur la figure 3A a été réalisée selon le protocole suivant - piste 1 : protéines de cellules RK13 infectées par le
virus SG33, - piste 2 : protéines de cellules RK13 infectées par le
virus RecIA122, - piste 3 : protéines de cellules non infectées, - PM : marqueur de poids moléculaire, - Serie a : précipitation par un sérum immun antimyxomatose
et anti RVHD, - Série b : précipitation par un sérum immun anti RVHD, - Série c : précipitation par un anticorps monoclonal anti
VP60 (61A47), - Série d : précipitation par un anticorps monoclonal anti
VP60 (4E3).The electrophoresis gel represented in FIG. 3A was carried out according to the following protocol - lane 1: proteins of RK13 cells infected with the
SG33 virus, lane 2: proteins of RK13 cells infected with
RecIA122 virus, - lane 3: proteins of uninfected cells, - PM: molecular weight marker, - Serie a: precipitation with an antimyxomatosis immune serum
and anti RVHD, - Series b: precipitation by an anti RVHD immune serum, - Series c: precipitation by an anti monoclonal antibody
VP60 (61A47), - Series d: precipitation by an anti-monoclonal antibody
VP60 (4E3).
De même, le gel d'électrophorèse représenté sur la figure 3B a été réalisé selon le protocole suivant - piste 1 : protéines de cellules RK13 infectées par SG33, - piste 2 : protéines de cellules RK13 infectées par Rec B
2111, - piste 3 : protéines de cellules RK13 non infectées, - PM : marqueur de poids moléculaire, - Série a : précipitation par un sérum immun anti
myxomatose, - Série b : précipitation par un sérum immun anti RVHD, - Série c : précipitation par un anticorps monoclonal anti
VP60 (61A47).Similarly, the electrophoresis gel represented in FIG. 3B was produced according to the following protocol - lane 1: proteins of RK13 cells infected with SG33, - lane 2: proteins of RK13 cells infected with Rec B
2111, - lane 3: proteins from uninfected RK13 cells, - PM: molecular weight marker, - Series a: precipitation with an anti immune serum
myxomatosis, - Series b: precipitation with an anti RVHD immune serum, - Series c: precipitation with an anti monoclonal antibody
VP60 (61A47).
En immunofluorescence sur cellules RK13, la fluorescence cytoplasmique obtenue grâce à des anticorps anti VP60 ne laisse aucun doute quant à l'expression de la VP60 par les deux virus recombinants. In immunofluorescence on RK13 cells, the cytoplasmic fluorescence obtained using anti VP60 antibodies leaves no doubt as to the expression of VP60 by the two recombinant viruses.
Après vérification de la bonne expression in vitro de la
VP60, des lapereaux de 5 semaines ont subi une seule injection par voie ID (intradermique) de 5.103 pfu de virus recombinants.After verification of the correct in vitro expression of the
VP60, 5-week-old rabbits underwent a single ID injection (intradermal) of 5,103 pfu of recombinant viruses.
I1 faut rappeler ici, que dans le cas de jeunes animaux à peine sevrés, les protocoles classiques préconisés par les industriels, d'une part associent deux injections successives de vaccins à virus inactivés, et d'autre part conseillent une primo vaccination anti myxomatose avec du virus de fibrome de
Shope, suivie d'un rappel au SG33.It should be remembered here that in the case of young animals that have barely been weaned, the conventional protocols recommended by industry, on the one hand combine two successive injections of inactivated virus vaccines, and on the other hand recommend a primary anti myxomatosis vaccination fibroid virus
Shope, followed by a call back to SG33.
Donc, dans le but d'améliorer les systèmes existants en élaborant des virus recombinants myxomatose-RHDV exprimant de la sorte la protéine VP60, le protocole décrit ci-après a été suivi. Therefore, in order to improve existing systems by developing recombinant myxomatosis-RHDV viruses thus expressing the protein VP60, the protocol described below was followed.
- pour la Valence RVHD
Les expérimentations permettant d'explorer la valence RVHD ont été menées sur des lapereaux de 5 semaines.- for Valence RVHD
Experiments to explore the RVHD valence were carried out on 5-week-old rabbits.
Après prise de sang sur chaque individu, 54 lapins ont été vaccinés, soit avec une préparation commerciale ("lapinject" de Sanofi) (18 animaux), soit avec un des deux virus recombinants (18 animaux pour chacun). After taking blood from each individual, 54 rabbits were vaccinated, either with a commercial preparation ("lapinject" from Sanofi) (18 animals), or with one of the two recombinant viruses (18 animals for each).
Le vaccin "lapinject" de SANOFI est une préparation de virus RHDV inactivé et adjuvé. La moitié de chaque lot, et 5 témoins, ont subi une épreuve virulente 5 jours plus tard (J5), tandis que l'autre moitié et 5 nouveaux témoins sont éprouvés à J15 par 1000 DL50 de virus RHDV. SANOFI's "lapinject" vaccine is a preparation of inactivated and adjuvanted RHDV virus. Half of each batch, and 5 controls, underwent a virulent test 5 days later (D5), while the other half and 5 new controls are tested on D15 by 1000 LD50 of RHDV virus.
Les épreuves virulentes réalisées à 5 et 15 jours postinoculation ont mis en évidence la complète protection des lapereaux vis à vis d'une injection en intra-musculaire de 1000 DL50 de virus RHDV sauvage. En effet, contrairement aux lots témoins, aucun animal vacciné, et ce quelle que soit l'injection réalisée, n'a montré le moindre signe clinique, et tous ont survécu après l'inoculation à J5 ou J15. The virulent tests carried out at 5 and 15 days postinoculation demonstrated the complete protection of young rabbits against an intramuscular injection of 1000 LD50 of wild RHDV virus. In fact, unlike the control batches, no animal vaccinated, regardless of the injection, showed the slightest clinical sign, and all of them survived after the inoculation on D5 or D15.
Le tableau 1 ci-après expose non seulement quelques détails du protocole d'inoculation des différents virus, mais aussi les résultats obtenus après épreuves virulentes par 1000 DL50 de virus RHDV, lors de l'exploration de la valence RVHD. Table 1 below shows not only some details of the inoculation protocol for the various viruses, but also the results obtained after virulent tests with 1000 LD50 of RHDV virus, during the exploration of the RVHD valence.
TABLEAU 1
lot vaccin voie inoculum/ morts/ morts/
utilisé d'inocu- sujet total total
lation J5 J15
1 RecA ID 5.103 pfu 0/9 0/9
2 RecB ID 5.103 pfu 0/9 0/9
3 Lapinject SC 1 ml 0/9 0/9
T Témoins / / 5/5 5/5 - Pour la valence myxomatose :
Les virus RecIA122 et RecB2111 ont été étudiés selon le protocole décrit ci-après et les résultats sont consignés dans le tableau 2. TABLE 1
inoculum vaccine batch / dead / dead /
used inocu- subject total total
lation J5 J15
1 RecA ID 5.103 pfu 0/9 0/9
2 RecB ID 5.103 pfu 0/9 0/9
3 Lapinject SC 1 ml 0/9 0/9
T Witnesses / / 5/5 5/5 - For the myxomatosis valence:
The RecIA122 and RecB2111 viruses were studied according to the protocol described below and the results are shown in Table 2.
Afin de tester le virus RecIA122, 24 lapins mâles de 5 semaines ont subi une seule inoculation par voie ID sur la face externe de l'oreille avec 5.103 pfu de virus en un seul point d'injection (12 avec du virus SG33 et 12 avec RecIA122). In order to test the RecIA122 virus, 24 5-week-old male rabbits underwent a single ID inoculation on the external surface of the ear with 5.103 pfu of virus at a single injection site (12 with SG33 virus and 12 with RecIA122).
En même temps, 6 lapins témoins du même âge, non inoculés, sont élevés dans les mêmes conditions. At the same time, 6 control rabbits of the same age, not inoculated, are reared under the same conditions.
Chaque lapin subit une prise de sang à JO, J10, J20, J30 et
J44 afin de réaliser des sérologies pour les deux valences.Each rabbit undergoes a blood test on OJ, D10, D20, D30 and
D44 to perform serologies for the two valences.
Un examen clinique minutieux est effectué quotidiennement de JO à J15 afin de vérifier l'apparition de symptômes locaux ou généraux. A careful clinical examination is carried out daily from OJ to D15 to check for the appearance of local or general symptoms.
A l'issue de cette surveillance, les lapins sont éprouvés à
J44 par injection ID de 5. 103 pfu de virus myxomateux T1 (souche virulente TOULOUSE 1) et les signes cliniques sont observés pour chacun pendant une dizaine de jours.At the end of this surveillance, the rabbits are tested at
D44 by ID injection of 5. 103 pfu of T1 myxomatous virus (virulent strain TOULOUSE 1) and the clinical signs are observed for each for ten days.
Le même protocole a été appliqué dans un deuxième temps au virus RecB2111 avec, cette fois, 15 lapins dans chaque lot. The same protocol was subsequently applied to the RecB2111 virus, this time with 15 rabbits in each batch.
Ce protocole a permis de vérifier la totale innocuité de ces deux virus pour les jeunes lapins. En effet, seule une réaction locale au point d'inoculation équivalente à celle obtenue avec le virus SG33 a été observée. This protocol made it possible to verify the total safety of these two viruses for young rabbits. In fact, only a local reaction at the point of inoculation equivalent to that obtained with the SG33 virus was observed.
Une cinétique de production d'anticorps anti myxomateux a été réalisée pour les virus recombinants et pour SG33, toujours sur 44 jours. Les réponses obtenues mesurées par la méthode ELISA sont présentees à la figure 5. I1 apparaît que pour les virus SG33 et RecIA122, les cinétiques sont tout à fait comparables, avec un titre maximum à J30. Pour le virus RecB2111, les titres en anticorps plafonnent dès J21 et sont bien inférieurs à J30 et J44 à ceux obtenus pour les deux autres virus. Les résultats de tests de séroneutralisation effectués sur les trois virus confirment cette tendance : les titres en anticorps sénoneutralisants sont stables de J30 à
J44, mais là encore, restent plus faibles pour le virus RecB2111, comme cela est représenté sur la figure 6.Kinetics of production of anti myxomatous antibodies was performed for the recombinant viruses and for SG33, always over 44 days. The responses obtained measured by the ELISA method are presented in FIG. 5. It appears that for the SG33 and RecIA122 viruses, the kinetics are quite comparable, with a maximum titer at D30. For the RecB2111 virus, the antibody titers peak as of D21 and are much lower at D30 and D44 than those obtained for the other two viruses. The results of seroneutralization tests carried out on the three viruses confirm this trend: the titers of senoneutralizing antibodies are stable from D30 to
J44, but again, remain weaker for the RecB2111 virus, as shown in Figure 6.
Le tableau 2 ci-après expose le protocole d'inoculation des différents virus en vue de l'exploration de la valence myxomatose
TABLEAU 2
lot vaccin voie inoculum/ nombre de lapins
utilisé d'inocu- sujet
lation
1 RecA ID 5.103 pfu 12
2 RecB ID 5.103 pfu 15
3 SG33 ID 5.103 pfu 22
T Témoins 12
L'épreuve virulente réalisée à J44 avec un virus myxomateux de souche T1 (5.103 pfu) confirme l'équivalence du pouvoir protecteur entre la souche vaccinale SG33 et les virus recombinants. Cette protection, bien que partielle, est très satisfaisante puisqu'on constate la mort de seulement trois lapins dans les lots SG33, d'un lapin dans le lot RecIA122, et de trois lapins dans le lot RecB2111 après un tableau clinique de myxomatose grave généralisée (tableau 3).Table 2 below sets out the inoculation protocol for the various viruses with a view to exploring the myxomatosis valence
TABLE 2
inoculum vaccine batch / number of rabbits
used inocu- subject
lation
1 RecA ID 5.103 pfu 12
2 RecB ID 5.103 pfu 15
3 SG33 ID 5.103 pfu 22
T Witnesses 12
The virulent test carried out on D44 with a myxomatous virus of strain T1 (5.103 pfu) confirms the equivalence of the protective power between the vaccine strain SG33 and the recombinant viruses. This protection, although partial, is very satisfactory since we note the death of only three rabbits in lots SG33, one rabbit in lot RecIA122, and three rabbits in lot RecB2111 after a clinical picture of generalized severe myxomatosis (table 3).
Dans le tableau 3, sont consignés les résultats obtenus après épreuve virulente par la souche T1 à une concentration de 5.103 pfu injectée par voie intradermique. In Table 3, the results obtained after a virulent test with the strain T1 are recorded at a concentration of 5.103 pfu injected intradermally.
TABLEAU 3
lot myxome myxomes généralisa- morts/total
primaire seul secondai- tion avec
res sans altération
altération de l'état
de 1'EG général
1 6 2 4 1/12
2 1 7 7 3/15
3 6 7 9 3/22
T O 0 12 12/12
Par ailleurs, les titres en anticorps anti-myxomatose et anti-RVHD ont été déterminés par tests ELISA et séroneutralisation.TABLE 3
lot myxoma general myxomas - dead / total
primary only secondary with
res without alteration
altered state
of the general EG
1 6 2 4 1/12
2 1 7 7 3/15
3 6 7 9 3/22
TO 0 12 12/12
Furthermore, the anti-myxomatosis and anti-RVHD antibody titers were determined by ELISA and seroneutralization tests.
- Tests ELISA : Pour la valence myxomatose, des plaques à 96 puits (type Probind Falcon) ont été tapissées par contact durant une nuit à 37"C avec une suspension de virus myxomateux semi purifié sur coussin de saccharose dans du tampon PBS à raison de 800 ng à 1 g/cupule. - ELISA tests: For the myxomatosis valence, 96-well plates (Probind Falcon type) were coated by contact overnight at 37 "C with a suspension of semi-purified myxomatous virus on a sucrose cushion in PBS buffer at a rate of 800 ng to 1 g / well.
Pour la valence RVHD, les puits ont été recouverts dans les mêmes conditions, par la même quantité de protéine recombinante VP60 purifiée produite par un système Baculovirus en tampon PIPES à pH 6,5. For the RVHD valence, the wells were covered under the same conditions, with the same quantity of purified recombinant protein VP60 produced by a Baculovirus system in PIPES buffer at pH 6.5.
Les puits sont ensuite saturés pendant 1 h à 370C par de la gélatine à 15 mg/ml diluée dans du PBS. The wells are then saturated for 1 h at 370C with gelatin at 15 mg / ml diluted in PBS.
Après lavages, les échantillons de sérum à tester sont dilués de 2 en 2 dans du PBS à 0,1 t de Tween 20, la réaction antigène-anticorps ayant ensuite lieu à 37"C pendant 1 heure. After washing, the serum samples to be tested are diluted 2 in 2 in PBS to 0.1 t of Tween 20, the antigen-antibody reaction then taking place at 37 "C for 1 hour.
Après lavages, les puits sont incubés avec un conjugué anti lapin phosphatase alkaline, à 37"C pendant 1 h. Enfin, après lavages, le substrat (PNPP dans du tampon diéthanolamine) est ajouté à température ambiante.After washing, the wells are incubated with an anti-rabbit alkaline phosphatase conjugate, at 37 ° C. for 1 h. Finally, after washing, the substrate (PNPP in diethanolamine buffer) is added at room temperature.
Après 12 à 15 minutes, la lecture est effectuée au spectrophotomètre à une DO de 405 nm. Le titre en anticorps est égal à l'inverse de la dilution dont la DO est supérieure
Qu égale à trois fois celle du témoin négatif interne.After 12 to 15 minutes, the reading is carried out with a spectrophotometer at an OD of 405 nm. The antibody titer is equal to the inverse of the dilution with a higher OD
Qu equal to three times that of the internal negative control.
Les résultats obtenus sont schématisés par les figures 4 et 5. The results obtained are shown diagrammatically in FIGS. 4 and 5.
En considérant la cinétique de production d'anticorps anti
VP60 par test ELISA sur 44 jours après inoculation du virus recombinant RecIA122 à 12 lapereaux et du virus RecB2111 à 15 sujets dans des conditions identiques, il apparait nettement que les taux d'anticorps anti VP60 obtenus sont beaucoup plus importants après injection du virus RecB2111, et ce dès J21 (figure 4). De plus, à J44 il semble que les titres en anticorps ne soient pas encore à leur maximum.Considering the kinetics of anti-antibody production
VP60 by ELISA test over 44 days after inoculation of the RecIA122 recombinant virus at 12 rabbits and the RecB2111 virus in 15 subjects under identical conditions, it clearly appears that the levels of anti VP60 antibodies obtained are much higher after injection of the RecB2111 virus, and this from D21 (Figure 4). In addition, at D44 it seems that the antibody titers are not yet at their maximum.
Néanmoins, à partir des deux virus recombinants atténués la production d'anticorps anti VP60 est précoce, elle s'accroit de façon constante et elle permet la protection totale dès J5 contre un virus RHDV virulent. However, from the two attenuated recombinant viruses, the production of anti VP60 antibodies is early, it increases steadily and it allows total protection from D5 against a virulent RHDV virus.
- Séroneutralisation : Cette technique n'est utilisable que pour la valence myxomatose puisque le virus de la RVHD n'est pas adapté à la culture cellulaire. Les sérums à tester sont dilués en série avec de l'OptiMEM en plaques à 96 puits sous un volume de 50 p1. On ajoute alors 750 pfu de suspension virale par puits sous 50 p1 d'OptiMEM et le tout est incubé 60 minutes à 37"C puis 60 autres minutes à 4 C. Des cellules RK13 sont ensuite distribuées à raison de 1 à 2.104/puits sous 50 1 d'OptiMEM en présence de SVF à une concentration finale de 5 t. Après 3 à 4 jours d'incubation à 37"C, la lecture est effectuée quand l'effet cytopathogène est total dans les puits témoins sans anticorps. - Seroneutralization: This technique can only be used for myxomatosis valence since the RVHD virus is not adapted to cell culture. The test sera are diluted in series with OptiMEM in 96-well plates in a volume of 50 μl. 750 pfu of viral suspension is then added per well under 50 p1 of OptiMEM and the whole is incubated for 60 minutes at 37 "C and then another 60 minutes at 4 C. RK13 cells are then distributed at a rate of 1 to 2.104 / well under 50 1 of OptiMEM in the presence of FCS at a final concentration of 5 t After 3 to 4 days of incubation at 37 "C, the reading is carried out when the cytopathogenic effect is complete in the control wells without antibodies.
Le titre neutralisant est exprimé par l'inverse de la dilution finale de sérum capable de protéger 75 % du tapis cellulaire (un sérum positif de référence est inclus dans chaque expérience). The neutralizing titer is expressed by the inverse of the final dilution of serum capable of protecting 75% of the cell layer (a positive reference serum is included in each experiment).
Les résultats obtenus sont représentés par la figure 6. The results obtained are shown in Figure 6.
En considérant tous les résultats précédents, on peut conclure que le vaccin selon la présente invention présente une innocuité et une efficacité tout à fait remarquable - d'une part, aucun des virus utilisés dans cette étude n'a révélé de pathogénicité résiduelle pour les lapereaux, - d'autre part, la protection totale et parfaite contre la
RVHD est observée dès le cinquième jour après la vaccination avec l'un ou l'autre des virus recombinants et ceci malgré les modestes taux en anticorps mesurés alors.Considering all the previous results, it can be concluded that the vaccine according to the present invention has a quite remarkable safety and efficacy - on the one hand, none of the viruses used in this study revealed any residual pathogenicity for rabbits , - on the other hand, total and perfect protection against
RVHD is observed from the fifth day after vaccination with one or the other of the recombinant viruses and this despite the modest levels of antibodies measured then.
La présence ou non de la VP12 n'a aucune influence sur le pouvoir protecteur de la VP60 exprimée par le vecteur myxomateux. Ces résutats, particulièrement intéressants puisque obtenus après vaccination avec des virus vivants, encouragent l'utilisation de nouveaux vaccins et allègent significativement les procédés de fabrication de vaccins anti
RVHD.The presence or absence of VP12 has no influence on the protective power of VP60 expressed by the myxomatous vector. These results, which are particularly interesting since they are obtained after vaccination with live viruses, encourage the use of new vaccines and significantly lighten the manufacturing processes for anti vaccines.
RVHD.
De plus, dans des conditions d'élevage, contrairement aux recommandations actuelles concernant le vaccin classique anti
RVHD, le même résultat pourrait être obtenu avec une seule injection sur des lapereaux de moins de deux mois indépendamment de la présence ou non d'anticorps maternels anti RVHD résiduels. In addition, under farming conditions, contrary to the current recommendations concerning the conventional anti-vaccine
RVHD, the same result could be obtained with a single injection on young rabbits of less than two months regardless of the presence or not of residual anti-RVHD maternal antibodies.
La protection imparfaite observée après une épreuve par un virus myxomateux de type T1, tant avec le virus SG33 (3 morts sur 22) qu'avec les virus RecIA122 (1 mort sur 12) ou RecB2111 (3 morts sur 15), va dans le sens des précédents travaux. En effet, sur des animaux aussi jeunes, la protection conférée par une seule injection de virus vaccinal de type SG33 est très hétérogène et explique le protocole en deux injections préconisé par les fabricants. Cependant, tous les lapins présentant une forte séroconversion ont résisté sans dommage à l'épreuve virulente0 En revanche, ceux ayant succombé faisaient partie d'une population à taux d'anticorps (dont les anticorps neutralisants) plus faibles. D'autre part, malgré des titres en anticorps moins élevés, les lapins vaccinés avec du virus RecB2111 ont, dans l'ensemble, bien résisté à 1 'épreuve. The imperfect protection observed after a test with a T1 type myxomatous virus, both with the SG33 virus (3 dead out of 22) and with the RecIA122 virus (1 dead out of 12) or RecB2111 (3 dead out of 15), goes into the meaning of previous work. In fact, on such young animals, the protection conferred by a single injection of SG33 type vaccine virus is very heterogeneous and explains the two-injection protocol recommended by the manufacturers. However, all rabbits with high seroconversion withstood the viral test without damage. On the other hand, those who died were in a population with lower antibody levels (including neutralizing antibodies). On the other hand, despite lower antibody titers, the rabbits vaccinated with the RecB2111 virus generally resisted the test well.
I1 est à noter que c'est la première fois que la souche
SG33 fait l'objet d'une délétion ou d'une atténuation par recombinaison.It should be noted that this is the first time that the strain
SG33 is subject to deletion or mitigation by recombination.
Une autre originalité de l'invention est que le virus vecteur est aussi le pathogène contre lequel on désire vacciner. Another originality of the invention is that the vector virus is also the pathogen against which it is desired to vaccinate.
Enfin, un avantage non négligeable de l'utilisation d'un vecteur comme le virus myxomateux est que sa spécificité est si étroite qu'il n'est pathogène que pour les léporidés. Finally, a non-negligible advantage of using a vector like the myxomatous virus is that its specificity is so narrow that it is pathogenic only for leporidae.
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Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0972840A2 (en) * | 1998-06-10 | 2000-01-19 | Fundacion Para el Estudio y Defensa de la Naturaleza y de la Caza | New attenuated myxoma recombinant virus and its use in the preparation of mixed vaccines against myxomatosis and rabbit hemorrhagic disease |
| WO2002072852A2 (en) * | 2001-03-08 | 2002-09-19 | Akzo Nobel N.V. | Leporipox-based vector vaccines |
| WO2010143160A1 (en) * | 2009-06-11 | 2010-12-16 | Institut National De La Recherche Agronomique | Attenuated strain of myxoma virus for use as an oncolytic drug |
| WO2017037523A1 (en) | 2015-06-19 | 2017-03-09 | Sillajen, Inc. | Compositions and methods for viral embolization |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995003070A1 (en) * | 1993-07-22 | 1995-02-02 | Syntro Corporation | Recombinant swinepox virus |
-
1995
- 1995-07-05 FR FR9508128A patent/FR2736358B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-07-05 IT IT96TO000578A patent/IT1286307B1/en active IP Right Grant
- 1996-07-05 DE DE19627193A patent/DE19627193B4/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-05 ES ES09601551A patent/ES2113322B1/en not_active Expired - Fee Related
-
2011
- 2011-11-15 FR FR11C0050C patent/FR11C0050I2/en active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995003070A1 (en) * | 1993-07-22 | 1995-02-02 | Syntro Corporation | Recombinant swinepox virus |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| JACKSON RJ ET AL: "A myxoma virus intergenic transient dominant selection vector.", J GEN VIROL, DEC 1992, 73 ( PT 12) P3241-5, ENGLAND, XP002002210 * |
| LAURENT S ET AL: "Recombinant rabbit hemorrhagic disease virus capsid protein expressed in baculovirus self-assembles into viruslike particles and induces protection.", J VIROL, OCT 1994, 68 (10) P6794-8, UNITED STATES, XP002002209 * |
| OPGENORTH A ET AL: "Deletion analysis of two tandemly arranged virulence genes in myxoma virus, M11L and myxoma growth factor.", J VIROL, AUG 1992, 66 (8) P4720-31, UNITED STATES, XP000568466 * |
| PERKUS ME ET AL: "Live attenuated vaccinia and other poxviruses as delivery systems: public health issues.", ANN N Y ACAD SCI, MAY 31 1995, 754 P222-33, UNITED STATES, XP000568457 * |
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0972840A2 (en) * | 1998-06-10 | 2000-01-19 | Fundacion Para el Estudio y Defensa de la Naturaleza y de la Caza | New attenuated myxoma recombinant virus and its use in the preparation of mixed vaccines against myxomatosis and rabbit hemorrhagic disease |
| ES2153284A1 (en) * | 1998-06-10 | 2001-02-16 | Fundacion Para El Estudio Y De | New attenuated myxoma recombinant virus and its use in the preparation of mixed vaccines against myxomatosis and rabbit hemorrhagic disease |
| EP0972840A3 (en) * | 1998-06-10 | 2001-09-26 | Fundacion Para el Estudio y Defensa de la Naturaleza y de la Caza | New attenuated myxoma recombinant virus and its use in the preparation of mixed vaccines against myxomatosis and rabbit hemorrhagic disease |
| WO2002072852A2 (en) * | 2001-03-08 | 2002-09-19 | Akzo Nobel N.V. | Leporipox-based vector vaccines |
| WO2002072852A3 (en) * | 2001-03-08 | 2002-12-27 | Akzo Nobel Nv | Leporipox-based vector vaccines |
| US6942864B2 (en) | 2001-03-08 | 2005-09-13 | Akzo Nobel N.V. | Leporipox-based vector vaccines |
| WO2010143160A1 (en) * | 2009-06-11 | 2010-12-16 | Institut National De La Recherche Agronomique | Attenuated strain of myxoma virus for use as an oncolytic drug |
| FR2946536A1 (en) * | 2009-06-11 | 2010-12-17 | Agronomique Inst Nat Rech | USE OF AN ATXURATED STRAIN OF MYXOMA VIRUS AS AN ONCOLYTIC |
| US8613915B2 (en) | 2009-06-11 | 2013-12-24 | Institute National De La Recherche Agronomique | Attenuated strain of myxoma virus for use as an oncolytic drug |
| WO2017037523A1 (en) | 2015-06-19 | 2017-03-09 | Sillajen, Inc. | Compositions and methods for viral embolization |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR11C0050I1 (en) | 2011-12-16 |
| FR11C0050I2 (en) | 2012-06-22 |
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