FR2734839A1 - Nucleic acid encoding delta-5,7 sterol delta-7 reductase - Google Patents

Abstract

A DNA or RNA sequence coding for a delta-5,7 sterol delta-7 reductase (DSDR) protein is new.

Description

Séquence d'ADN codant pour une protéine d'A. thaliana ayant une activité delta-5,7 stérol,delta-7 réductase, protéine delta-7Red, procédé de production, souches de levures transformées, applications. DNA sequence encoding an A protein. thaliana having delta-5,7 sterol, delta-7 reductase activity, delta-7Red protein, production method, transformed yeast strains, applications.

La présente invention concerne une séquence d'ADN codant pour une protéine d'A. thaliana ayant une activité delta-5,7 stérol,delta-7 réductase, la protéine delta-7Red, leur procédé de production, les souches de levures transformées et leurs applications. The present invention relates to a DNA sequence encoding an A protein. thaliana having delta-5,7 sterol, delta-7 reductase activity, delta-7Red protein, process for their production, transformed yeast strains and their applications.

La delta-5,7 stérol,delta-7 réductase (E.C.1.3.1.21) est une enzyme microsomale dont la présence a été mise en évidence par son activité dans des homogénats de foie de rat (M. E. Dempsey et al., Methods Enzymol., 15, 501-514, 1969) ainsi que dans des préparations de plants de Zea mays (M. Taton et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 181, 465473, 1991). Cette réductase est dépendante du NADPH et réduit in vitro le 7-déhydrocholestérol en cholestérol. Delta-5,7 sterol, delta-7 reductase (EC1.3.1.21) is a microsomal enzyme whose presence has been demonstrated by its activity in rat liver homogenates (ME Dempsey et al., Methods Enzymol. 15, 501-514, 1969) as well as in plant preparations of Zea mays (M. Taton et al., Biochem Biophys Res Commun, 181, 465473, 1991). This reductase is dependent on NADPH and reduces in vitro 7-dehydrocholesterol to cholesterol.

Les stérols sont les constituants principaux des membranes chez les eucaryotes mais présentent des différences de structure selon les espèces. Dans les cellules d'eucaryotes tels que les levures, le stérol principal est l'ergostérol qui contient une double insaturation en C-S et C-7, une chaine latérale ramifiée en C-24 et une insaturation en C-22 tandis que chez les mammifères le cholestérol est caractérisé par une insaturation en C-S et une chaine latérale saturée. Sterols are the main constituents of membranes in eukaryotes but show differences in structure depending on the species. In eukaryotic cells such as yeasts, the main sterol is ergosterol which contains a double unsaturation at CS and C-7, a branched chain at C-24 and unsaturation at C-22 while in mammals cholesterol is characterized by unsaturation in CS and a saturated side chain.

Le sitostérol, le stigmastérol et le campestérol, qui représentent les stérols les plus communs chez les plantes, ont une chaîne latérale ramifiée mais saturée et, comme les stérols des vertébrés, n'ont pas une insaturation en C-7.Sitosterol, stigmasterol and campesterol, which are the most common sterols in plants, have a branched but saturated side chain and, like vertebrate sterols, do not have C-7 unsaturation.

L'enzyme responsable de cette différence de structure du noyau stérol est la delta-5,7 stérol,delta-7 réductase.The enzyme responsible for this structural difference of the sterol nucleus is delta-5,7 sterol, delta-7 reductase.

La delta-5,7 stérol,delta-7 réductase n'a jamais été purifiée à homogénéité et une purification partielle a été seulement décrite (M. E. Dempsey et al. ; M. Taton et al., déjà cité). La protéine n'a pas été caractérisée par ses propriétés physico-chimiques. Aucune information sur la séquence de la protéine et aucun anticorps dirigé contre celle-ci n'ont été décrits. Par ailleurs, une apparente déficience en 7-déhydrocholestérol réductase a été décrite chez l'homme associée au syndrome RSH/Smith-Lemli-Opitz (SLO) (J. M. Opitz et al., Am. J. Med. Genet., 50, 326-338, 1994). The delta-5,7 sterol, delta-7 reductase has never been purified to homogeneity and partial purification has only been described (M. E. Dempsey et al., M. Taton et al., Already cited). The protein has not been characterized by its physicochemical properties. No information on the sequence of the protein and no antibodies directed against it have been described. Moreover, an apparent deficiency of 7-dehydrocholesterol reductase has been described in humans associated with RSH / Smith-Lemli-Opitz syndrome (SLO) (JM Opitz et al., Am. J. Med. Genet., 50, 326). -338, 1994).

Le clonage d'un ADNc codant pour la delta-5,7 stérol, delta-7 réductase, qui peut permettre d'identifier la séquence de la protéine correspondante ainsi que la caractérisation du gène humain ou la mise en évidence d'une déficience congénitale de celui-ci, n'est donc pas réalisable avec les méthodes connues qui font l'usage par exemple des techniques d'hybridation ou/et de détection immunologique. The cloning of a cDNA coding for the delta-5,7 sterol, delta-7 reductase, which can make it possible to identify the sequence of the corresponding protein as well as the characterization of the human gene or the demonstration of a congenital deficiency of it, is not feasible with known methods that make use of eg hybridization techniques and / or immunological detection.

L'obtention de méthodes de criblage inventives permettant de réaliser le clonage, notamment en absence d'informations sur la protéine, est donc particulièrement recherchée.Obtaining inventive screening methods to achieve cloning, especially in the absence of information on the protein, is therefore particularly sought.

L'ergostérol, principal stérol des membranes des champignons, contient une paire de double liaisons conjuguées en
C-5,7 qui confère une activité antimycotique aux composés de la famille des polyènes tel que la nystatine (R. Bittman et al., J. Biol. Chem., 260, 2884-2889, 1985). La forte dépendance de l'action de la nystatine à la concentration membranaire en stérols insaturés en C-5,7 a permis de sélectionner chez S. cerevisiae des souches de mutants vis-à-vis des stérols accumulés (S. W. Molzahn et al., J. Gen. Microbiol., 72, 339-348, 1972). Ainsi les mutants erg2 et erg3 accumulent des stérols qui n'ont pas les doubles liaisons conjuguées en C-5,7 en raison d'une déficience en stérol delta-8,7 isomérase (W. Ashman et al., Lipids, 26, 628, 1991) et en stérol delta-5 deshydrogénase (B.Arthinton et al., Gene, 102, 39, 1991) respectivement. De tels mutants sont viables parce que l'ergostérol, le stérol naturel principal de la levure, peut être remplacé dans certaines conditions par différents stérols de substitution incluant le cholestérol.Ergosterol, the main sterol of fungal membranes, contains a pair of conjugated double bonds in
C-5,7 which confers antimycotic activity on compounds of the polyene family such as nystatin (R. Bittman et al., J. Biol Chem., 260, 2884-2889, 1985). The strong dependence of the action of nystatin on the membrane concentration of C-5,7 unsaturated sterols has made it possible to select S. cerevisiae from mutant strains with respect to accumulated sterols (SW Molzahn et al. J. Gen. Microbiol., 72, 339-348, 1972). Thus the erg2 and erg3 mutants accumulate sterols which do not have C-5,7 conjugated double bonds due to sterol delta-8.7 isomerase deficiency (W. Ashman et al., Lipids, 26, 628, 1991) and sterol delta-5 dehydrogenase (B.Arthinton et al., Gene, 102, 39, 1991) respectively. Such mutants are viable because ergosterol, the main natural sterol of yeast, can be replaced under certain conditions by different sterol substitution including cholesterol.

L'avantage de l'accroissement de la résistance à la nystatine de souches de levure enrichies en stérols n'ayant pas la double insaturation en C-5,7 a été perçu par les inventeurs pour cloner un ADNc codant une protéine hétérologue ayant une activité delta-S,7 stérol,delta-7 réductase avec une méthode de criblage utilisant une interférence métabolique dans S. cerevisiae. Le succès de cette approche qui offre l'avantage d'être indépendante de la connaissance de séquences de l'ADN ou de la protéine ainsi que d'une détection seulement basée sur l'activité enzymatique, n'est cependant pas prévisible en raison de nombreuses difficultés techniques à surmonter. The advantage of increasing the nystatin resistance of sterol-enriched yeast strains not having the double C-5,7 unsaturation was perceived by the inventors to clone a cDNA encoding a heterologous protein having an activity. delta-S, sterol 7, delta-7 reductase with a screening method using metabolic interference in S. cerevisiae. The success of this approach, which offers the advantage of being independent of the knowledge of DNA or protein sequences as well as detection based only on enzyme activity, is not predictable because of many technical difficulties to overcome.

Une première limitation vient du fait que le mode d'action de la nystatine n'est pas entièrement élucidé (L. W. A first limitation comes from the fact that the mode of action of nystatin is not fully elucidated (L.

Parks et al., CRC Critical Reviews in Microbiology, 301-304, 1978). Par exemple, la faible spécificité de la sélection par la nystatine est prévisible en raison de la nature indirecte de celle-ci conduisant chez la levure à la sélection de mutations génomiques spontanées telles que les mutants erg (S. W.Parks et al., CRC Critical Reviews in Microbiology, 301-304, 1978). For example, the low specificity of selection by nystatin is predictable due to the indirect nature of this selection leading in yeast to the selection of spontaneous genomic mutations such as erg mutants (S.W.

Molzahn et al. déjà cité) ou des mutations génomiques entrainant des résistances indépendantes de la voie des stérols. De même, les cellules transformées par une banque peuvent exprimer des gènes hétérologues conférant une résistance à la nystatine sans relation avec la voie des stérols.Molzahn et al. already cited) or genomic mutations resulting in resistance independent of the sterol pathway. Similarly, the cells transformed by a library can express heterologous genes conferring resistance to nystatin unrelated to the sterol pathway.

Un autre exemple de limitation attendue concerne le fait que la protéine hétérologue puisse être faiblement active dans la cellule, conduisant à l'absence ou à une faible résistance à la nystatine par exemple pour l'une des raisons suivantes : 1) le gène codant pour la delta-S,7 stérol,delta7 réductase est faiblement exprimé ; 2) la protéine est peu ou pas active parce que mal repliée ou résultant d'un adressage subcellulaire incorrect ; 3) la protéine de plante ne reconnait pas les stérols propres de la levure comme substrats ou 4) les stérols qui peuvent être des substrats sont sous forme estérifiée ou stockés dans des vésicules et ne sont pas au contact de l'enzyme.Il peut donc être prévu que les stérols ainsi accumulés échappent à l'action de la delta5,7 stérol,delta-7 réductase qui, dans les eucaryotes, est réputée localisée dans les microsomes. Another example of the expected limitation relates to the fact that the heterologous protein may be weakly active in the cell, leading to the absence or low resistance to nystatin for example for one of the following reasons: 1) the gene coding for delta-S, sterol, delta7 reductase is weakly expressed; 2) the protein is little or not active because misfolded or resulting from incorrect subcellular addressing; 3) the plant protein does not recognize the yeast's own sterols as substrates or 4) the sterols that may be substrates are in esterified form or stored in vesicles and are not in contact with the enzyme.It can therefore It is expected that the sterols so accumulated will escape the action of delta5,7 sterol, delta-7 reductase, which in eukaryotes is known to be localized in microsomes.

La présente invention concerne le clonage d'un ADNc d'A. thaliana codant pour une protéine ayant une activité delta-S,7 stérol,delta-7 réductase, désignée delta-7Red, selon un procédé de clonage réalisé dans une levure par interférence métabolique basée sur la résistance à la nystatine. La protéine delta-7Red permet de réduire des stérols ayant une insaturation en C-7 par un procédé de réduction biologique qui fournit de plus une solution avantageuse au problème de la réduction sélective en C-7 de stérols ou de stéroïdes ayant une double insaturation en C-5,7 que les méthodes de réduction par voie chimique ne permettent pas. The present invention relates to the cloning of an A cDNA. thaliana coding for a protein having delta-S activity, 7 sterol, delta-7 reductase, designated delta-7Red, according to a cloning method performed in yeast by metabolic interference based on nystatin resistance. The delta-7Red protein reduces sterols having C-7 unsaturation by a biological reduction method which further provides an advantageous solution to the problem of selective C-7 reduction of sterols or steroids having a double unsaturation in C-7. C-5.7 that chemical reduction methods do not allow.

L'invention concerne également des cellules de levure transformées exprimant la delta-7Red qui, de façon surprenante, accumulent des produits saturés en C-7 et éventuellement saturés en C-22 qui, contrairement à l'ergostérol, sont des substrats de l'enzyme de clivage de la chaîne latérale du cholestérol, c'est-à-dire le cytochrome P450SCC. The invention also relates to transformed yeast cells expressing delta-7Red which, surprisingly, accumulate saturated products at C-7 and optionally saturated with C-22 which, unlike ergosterol, are substrates of the Cholesterol side chain cleaving enzyme, i.e., cytochrome P450SCC.

Ces propriétés inattendues permettent une utilisation des levures transformées de l'invention dans un procédé de préparation de stérols ou de stéroïdes ayant un intérêt industriel et/ou pharmacologique, en particulier la préparation de pregnénolone par oxydation biologique des stérols endogènes de levure, réduits en C-7, par le cytochrome P450
SCC (P450SCC) en présence d'adrénodoxine réductase (ADR) et d'adrénodoxine (ADX). Les levures transformées de l'invention peuvent être aussi utilisées dans un procédé de préparation des stéroïdes intermédiaires de la voie de métabolisation du cholestérol en hydrocortisone chez les mammifères et autres vertébrés.Cette utilisation présente l'avantage de permettre la préparation de l'hydrocortisone ou de ses intermédiaires dans un procédé d'oxydation biologique ne nécessitant pas l'emploi d'un stérol exogène tel que le cholestérol comme substrat initial et de contourner ainsi le problème de la pénétration d'un stérol dans la levure dont l'imperméabilité aux stérols exogènes sous des conditions d'aérobiose a été décrite (R. T. Lorentz et al., J. Bacteriology, 981-985, 1986).These unexpected properties allow a use of the transformed yeasts of the invention in a process for the preparation of sterols or steroids of industrial and / or pharmacological interest, in particular the preparation of pregnenolone by biological oxidation of endogenous yeast sterols, reduced to C -7, by cytochrome P450
SCC (P450SCC) in the presence of adrenodoxin reductase (ADR) and adrenodoxin (ADX). The transformed yeasts of the invention may also be used in a process for the preparation of steroids intermediate the pathway of metabolizing cholesterol to hydrocortisone in mammals and other vertebrates. This use has the advantage of allowing the preparation of hydrocortisone or of its intermediates in a biological oxidation process that does not require the use of an exogenous sterol such as cholesterol as the initial substrate and thus bypass the problem of the penetration of a sterol into the yeast whose impermeability to sterols exogenous under aerobic conditions has been described (RT Lorentz et al., J. Bacteriology, 981-985, 1986).

L'invention concerne aussi l'utilisation des séquences nucléiques obtenues à l'aide du procédé de clonage de l'invention. Une séquence ARN ou ADN codant pour la delta-5,7 stérol,delta-7 réductase peut être utilisée pour le diagnostic ou le traitement d'affections impliquant le produit du gène de la delta-S,7 stérol,delta-7 réductase. Par exemple, une déficience en delta-5,7 stérol,delta-7 réductase qui convertit le 7-déhydro cholestérol en cholestérol est présumée impliquée dans le syndrome RSH/SLO. Ainsi une séquence d'ADN humain peut être utilisée comme sonde pour diagnostiquer une déficience en delta-5,7 stérol,delta-7 réductase et peut être aussi utilisée en thérapie génique pour corriger une telle déficience. The invention also relates to the use of the nucleic sequences obtained using the cloning method of the invention. An RNA or DNA sequence encoding delta-5,7 sterol, delta-7 reductase can be used for the diagnosis or treatment of disorders involving the delta-S gene product, 7 sterol, delta-7 reductase. For example, a delta-5.7 sterol, delta-7 reductase deficiency that converts 7-dehydro-cholesterol into cholesterol is presumed to be involved in RSH / SLO syndrome. Thus a human DNA sequence can be used as a probe to diagnose a delta-5,7 sterol, delta-7 reductase deficiency and can also be used in gene therapy to correct such deficiency.

La présente invention a donc pour objet une séquence d'acide nucléique contenant une séquence codant pour une protéine ayant une activité delta-S,7 stérol,delta-7 réductase, ledit acide nucléique étant un ADN ou un ARN et particulièrement étant un ADNc. The subject of the present invention is therefore a nucleic acid sequence containing a sequence coding for a protein having a delta-S activity, 7 sterol, delta-7 reductase, said nucleic acid being a DNA or an RNA and particularly being a cDNA.

L'activité delta-S,7 stérol,delta-7 réductase peut être mise en évidence par exemple à l'aide d'un test enzymatique in vitro décrit plus loin dans la partie expérimentale. The delta-S, sterol, delta-7 reductase activity can be demonstrated for example by means of an enzymatic test in vitro described later in the experimental part.

L'invention a plus particulièrement pour objet une séquence d'ADNc dans laquelle la séquence codante code pour une protéine d'A. thaliana ayant une activité delta-5,7 stérol,delta-7 réductase et ayant la séquence nucléotidique de la séquence SEQ ID NO 1
GTGTGAGTAA TTTAGGTCAA CACAGATCAG AATCTGAGGC TTTGGCCGAG ACGAAGAGAA 60
AAGCAGAAGA AGAAA ATG GCG GAG ACT GTA CAT TCT CCG ATC GTT ACT TAC 111
Met Ala Glu Thr Val His Ser Pro Ile Val Thr Tyr
1 5 10
GCA TCG ATG TTA TCG CTT CTC GCC TTC TGT CCA CCT TTC GTC ATT CTC 159
Ala Ser Met Leu Ser Leu Leu Ala Phe Cye Pro Pro Phe Val Ile Leu
15 20 25
CTA TGG TAC ACA ATG GTT CAT CAG GAT GGT TCT GTT ACT CAG ACC TTT 207
Leu Trp Tyr Thr Met Val His Gln Asp Gly Ser Val Thr Gln Thr Phe
30 35 40
GGC TTC TTT TGG GAG AAT GGA GTT CAA GGA CTT ATC AAC ATA TGG CCA 255
Gly Phe Phe Trp Glu Asn Gly Val Gln Gly Leu Ile Asn Ile Trp Pro
45 50 55 60
AGA CCC ACT TTG ATT GCT TGG AAA ATT ATA TTT TGC TAT GGA GCA TTT 303
Arg Pro Thr Leu Ile Ala Trp Lys Ile Ile Phe Cys Tyr Gly Ala Phe
65 70 75
GAA GCT ATT CTT CAG CTG CTT CTG CCT GGT AAA AGA GTT GAG GGT CCA 351
Glu Ala Ile Leu Gln Leu Leu Leu Pro Gly Lys Arg Val Glu Gly Pro
80 85 90
ATA TCT CCA GCC GGA AAC CGA CCA GTT TAC AAG GCC AAT GGT CTG GCT 399
Ile Ser Pro Ala Gly Asn Arg Pro Val Tyr Lys Ala Asn Gly Leu Ala
95 100 105
GCT TAC TTT GTG ACA CTA GCA ACC CAT CTT GGT CTT TGG TGG TTT GGA 447
Ala Tyr Phe Val Thr Leu Ala Thr His Leu Gly Leu Trp Trp Phe Gly
110 115 120
ATC TTC AAC CCT GCA ATT GTC TAT GAT CAC TTG GGT GAA ATA TTT TCG 495
Ile Phe Asn Pro Ala Ile Val Tyr Asp His Leu Gly Glu Ile Phe Ser 125 130 135 140
GCA CTA ATA TTC GGA AGC TTC ATA TTT TGT GTT TTG TTG TAC ATA AAA 543
Ala Leu Ile Phe Gly Ser Phe Ile Phe Cys Val Leu Leu Tyr Ile Lys
145 150 155
GGC CAT GTT GCA CCT TCA TCA AGT GAC TCT GGT TCA TGT GGT AAC CTA 591
Gly His Val Ala Pro Ser Ser Ser Asp Ser Gly Ser Cys Gly Asn Leu
160 165 170
ATA ATT GAC TTC TAT TGG GGC ATG GAG TTG TAC CCT CGA ATT GGT AAG 639
Ile Ile Asp Phe Tyr Trp Gly Met Glu Leu Tyr Pro Arg Ile Gly Lys
175 180 185
AGC TTT GAC ATC AAG GTG TTT ACT AAT TGC AGA TTC GGA ATG ATG TCT 687
Ser Phe Asp Ile Lys Val Phe Thr Asn Cys Arg Phe Gly Met Met Ser
190 195 200
TGG GCA GTT CTT GCA GTC ACG TAC TGC ATA AAA CAG TAT GAA ATA AAT 735
Trp Ala Val Leu Ala Val Thr Tyr Cys Ile Lys Gln Tyr Glu Ile Asn 205 210 215 220
GGC AAA GTA TCT GAT TCA ATG CTG GTG AAC ACC ATC CTG ATG CTG GTG 783
Gly Lys Val Ser Asp Ser Met Leu Val Asn Thr Ile Leu Met Leu Val
225 230 235
TAT GTC ACA AAA TTC TTC TGG TGG GAA GCT GGT TAT TGG AAC ACC ATG 831
Tyr Val Thr Lys Phe Phe Trp Trp Glu Ala Gly Tyr Trp Asn Thr Met
240 245 250
GAC ATT GCA CAT GAC CGA GCT GGA TTC TAT ATA TGC TGG GGT TGT CTA 879
Asp Ile Ala His Asp Arg Ala Gly Phe Tyr Ile Cys Trp Gly Cys Leu
255 260 265
GTG TGG GTG CCT TCT GTC TAC ACT TCT CCA GGC ATG TAC CTT GTG AAC 927
Val Trp Val Pro Ser Val Tyr Thr Ser Pro Gly Met Tyr Leu Val Asn
270 275 280
CAC CCC GTC GAA CTC GGA ACT CAG TTG GCA ATA TAC ATT CTC GTT GCA 975
His Pro Val Glu Leu Gly Thr Gln Leu Ala Ile Tyr Ile Leu Val Ala 285 290 295 300
GGA ATT CTG TGC ATT TAC ATA AAG TAT GAC TGT GAT AGA CAA AGG CAA 1023
Gly Ile Leu Cys Ile Tyr Ile Lys Tyr Asp Cys Asp Arg Gln Arg Gln
305 310 315
GAG TTC AGG AGG ACA AAC GGG AAA TGT TTG GTT TGG GGA AGA GCC CCG 1071
Glu Phe Arg Arg Thr Asn Gly Lys Cys Leu Val Trp Gly Arg Ala Pro
320 325 330
TCA AAG ATT GTG GCG TCG TAT ACT ACA ACA TCT GGT GAA ACT AAA ACT 1119
Ser Lys Ile Val Ala Ser Tyr Thr Thr Thr Ser Gly Glu Thr Lys Thr
335 340 345
AGT CTT CTC TTA ACG TCT GGA TGG TGG GGA TTG GCT CGT CAT TTC CAT 1167
Ser Leu Leu Leu Thr Ser Gly Trp Trp Gly Leu Ala Arg His Phe His
350 355 360
TAT GTT CCT GAG ATC TTA AGT GCT TTC TTC TGG ACC GTA CCG GCT CTC 1215
Tyr Val Pro Glu Ile Leu Ser Ala Phe Phe Trp Thr Val Pro Ala Leu 365 370 375 380
TTC GAT AAC TTC TTG GCA TAC TTC TAC GTC CTC ACC CTT CTT CTC TTT 1263
Phe Asp Asn Phe Leu Ala Tyr Phe Tyr Val Leu Thr Leu Leu Leu Phe
385 390 395
GAT CGA GCC AAG AGA GAC GAT GAC CGA TGC CGA TCA AAG TAT GGG AAA 1311
Asp Arg Ala Lys Arg Asp Asp Asp Arg Cys Arg Ser Lys Tyr Gly Lys
400 405 410
TAT TGG AAG CTG TAT TGT GAG AAA GTC AAA TAC AGG ATC ATT CCG GGA 1359
Tyr Trp Lys Leu Tyr Cys Glu Lys Val Lys Tyr Arg Ile Ile Pro Gly
415 420 425
ATT TAT TGATTGTAAC GAAGTCTGTT GTTCTCATTT TCTACTTATT ACGTTAATTC 1415 lie Tyr
430
GAACGTTGGA ATCATCAAAA GACCGAGCCA AAACAAAAAT GCAAATTGAT GCGATAGACA 1475
TTCTTTTGCT GAAAAAAAAA A 1496 ainsi que les variants alléliques de cette séquence.The invention more particularly relates to a cDNA sequence in which the coding sequence codes for an A protein. thaliana having a delta-5,7 sterol, delta-7 reductase activity and having the nucleotide sequence of the sequence SEQ ID No. 1
GTGTGAGTAA TTTAGGTCAA CACAGATCAG AATCTGAGGC TTTGGCCGAG ACGAAGAGAA 60
AAGCAGAAGA AGAAA ATG GCG ACT ACT GTA CAT TCT CCG ATC ACT ACT TAC 111
Met Ala Thr Glu Thr His Ser Pro Val Thr Tyr Island
1 5 10
GCA TCG ATG TTA TCG CTT CTC GCC TTC TGT CCA CTC TTC GTC ATT CTC 159
Ala Ser Met Leu Ser Leu Al Leu Phe Cye Pro Pro Phe Val Ile Leu
15 20 25
CTA TGG TAC ACA ATG GTT CAG CAT GAT GGT TCT ACT ACT CAG ACC TTT 207
Leu Trp Tyr Thr Met Val His Gln Asp Gly Ser Val Thr Gln Thr Phe
30 35 40
GGC TTC TT TGG GAG AAT GGA GTT CAA GGA CTT ATC AAC ATA TGG CCA 255
Gly Phe Phe Trp Glu Asn Gly Gln Val Gly Leu Ile Asn Ile Trp Pro
45 50 55 60
AGA CCC ACT TTG ATT GCT TGG AAA ATT ATA TT TGC TAT GGA GCA TT 303
Arg Pro Thr Leu Ile Ala Trp Lys Island Isle Phe Cys Tyr Gly Ala Phe
65 70 75
GAA GCT ATT CTT CAG CTG CTT CTG CCT GGT AAA AGM GTT GAG GGT CCA 351
Glu Ala Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Gly Lys Arg Val Glu Gly Pro
80 85 90
ATA TCT CCA GCC GGA AAC CGA CCA GTT TAC AAG GCC AAT GGT CTG GCT 399
Ser Ser Pro Ala Gly Asn Arg Pro Val Tyr Lys Ala Asn Gly Leu Ala
95 100 105
GCT TAC TT GTG ACA CTA GCA ACC CTT CAT GGT CTT TGG TGG TT GGA 447
Ala Tyr Phe Val Thr Ala Thr Leu Leu Gly Leu Trp Trp Phe Gly
110 115 120
ATC TTC AAC CCT GCA ATT GTC TAT GAT CAC TTG GGT GAA ATA TTT TCG 495
Ile Phe Asn Pro Ala Val Tyr Island Asp His Leu Gly Glu Ile Phe Ser 125 130 135 140
GCA CTA ATA TTC GGA AGC TTC ATA TT TGT GTT TTG TTG TAC ATA AAA 543
Ala Leu Ile Phe Gly Ser Phe Ile Phe Cys Val Leu Leu Tire Ile Lys
145 150 155
GGC CAT GTT GCA CCT TCA TCA AGT GAC TCT GGT TCA TGT GGT AAC CTA 591
Gly His Val Ser Ser Ser Ser Ser Asp Ser Ser Gly Ser Gly Asn Leu
160,165 170
ATA ATT GAC TTC TAT TGG ATG GGG GG TTG TAC CCT CGA ATT GGT AAG 639
Isle Ile Asp Phe Tyr Trp Gly Met Glu Leu Tyr Pro Arg Ile Gly Lys
175 180 185
AGC TTT GAC ATC AAG GTG TTT ACT AAT TGC AGA TTC GGA ATG ATG TCT 687
Ser Phe Asp Lys Val Phe Thr Asn Cys Arg Phe Gly Met Met Ser
190 195 200
TGG GCA GTT CTT GCA GTC ACG TAC TGC ATA AAA CAG TAT GAA ATA AAT 735
Trp Ala Valley Leu Ala Val Thr Tyr Cys Island Lys Gln Tyr Glu Island Asn 205 210 215 220
GGC AAA GTA TCT GAT TCA ATG CTG GTG ACC AAC ATC CTG ATG CTG GTG 783
Gly Lys Val Ser Asp Ser Met Leu Val Asn Thr Ile Leu Met Leu Val
225 230 235
TAT GTC ACA AAA TTC TTC TGG TGG GAA GCT TGG TAT TGG AAC ACC ATG 831
Tyr Val Thr Phe Phe Phe Trp Trp Glu Ala Gly Tire Trp Asn Thr Metr
240,245 250
GAC ATT GCA CAT GAC CGA GCT GGA TTC TAT ATA TGC TGG GGT TGT CTA 879
Asp Ala Asp His Asp Arg Ala Gly Phe Tyr Ile Cys Trp Gly Cys Leu
255,260,265
GTG TGG GTG CCT TCT GTC TAC ACT TCT CCA GGC ATG TAC CTT GTG AAC 927
Val Trp Val Pro Ser Val Tyr Ser Ser Pro Gly Met Tyr Leu Val Asn
270 275 280
CAC CCC GTC GAA CTC GGA ACT CAG TTG GCA ATA TAC ATT CTC GTT GCA 975
His Pro Val Glu Leu Gly Thr Gln Leu Ala Tire Island Ile Leu Val Ala 285 290 295 300
GGA ATT CTG TGC ATT TAC ATA TAG TAT GAC TGA GAT AGA CAA AGG CAA 1023
Gly Island Leu Cys Island Tyr Island Lys Tyr Asp Asp Cys Asp Arg Gln Arg Gln
305 310 315
GAG TTC AGG AGG ACA AAC GGG AAA TGT TTG TGT TGG GGA AGA GCC CCG 1071
Glu Phe Arg Arg Thr Asn Gly Lys Cys Leu Val Trp Gly Arg Ala Pro
320 325 330
TCA AAG ATT GTG GCG TCG ACT TAT ACT ACA TCT GGT GAA ACT AAA ACT 1119
Ser Lys Val Ala Ser Ser Ser Thr Thr Thr Ser Ser Gly Glu Thr Lys Thr
335,340,345
AGT CTT CTC TTA ACG TCT GGA TGG TGG GGA TTG GCT CGT CAT TTC CAT 1167
Ser Leu Leu Leu Ser Ser Gly Trp Trp Gly Leu Ala Arg His Phe His
350,355 360
TAT GTT CCT GAG ATC TTA AGT GCT TTC TTC TGG ACC GTA CCG GCT CTC 1215
Tyr Val Pro Glu Island Leu Ser Ala Phe Phe Thr Trp Pro Val Val Ala Leu 365 370 375 380
TTC GAT AAC TTC TTG GCA TAC TTC TAC GTC CTC ACC CTT CTT CTC TT 1263
Phe Asp Asn Phe Leu Ala Tire Phe Tyr Val Leu Leu Leu Leu Leu Phe
385 390 395
GAT CGA GCC AAG AGA GAC GAT GAC CGA TGC CGA TCA AAG TAT GGG AAA 1311
Asp Arg Ala Lys Asp Arg Asp Asp Arg Arg Cys Arg Ser Lys Tyr Gly Lys
400 405 410
TAT TGG AAG CTG TAT TGT GAG AAA GTC AAA TAC AGG ATC ATT CCG GGA 1359
Tyr Trp Lys Leu Tyr Cys Glu Lily Val Lys Tyr Arg Ile Ile Pro Gly
415,420,425
ATT TAT TGATTGTAAC GAAGTCTGTT GTTCTCATTT TCTACTTATT ACGTTAATTC 1415 binds Tire
430
GAACGTTGGA ATCATCAAAA GACCGAGCCA AAACAAAAAT GCAAATTGAT GCGATAGACA 1475
TTCTTTTGCT GAAAAAAAAA A 1496 as well as the allelic variants of this sequence.

La séquence d'ADNc ci-dessus qui code pour une protéine ayant 430 acides aminés correspondant à la séquence montrée à la figure 3 (SEQ ID NO 2) est une séquence d'ADNc qui peut être obtenue par exemple par clonage dans une levure, à partir d'une banque d'expression d'A. thaliana, en utilisant une méthode de criblage fondée sur l'apparition d'une résistance de la levure à la nystatine, selon des conditions opératoires dont une description détaillée est donnée plus loin. The above cDNA sequence which encodes a protein having 430 amino acids corresponding to the sequence shown in Figure 3 (SEQ ID NO 2) is a cDNA sequence which can be obtained for example by cloning in yeast, from an expression library of A. thaliana, using a screening method based on the appearance of yeast resistance to nystatin, according to operating conditions, a detailed description of which is given below.

La connaissance de la séquence nucléotidique SEQ ID NO 1 ci-dessus permet de reproduire la présente invention par des méthodes connues de l'homme du métier, par exemple par synthèse chimique ou par criblage d'une banque génomique ou d'une banque d'ADNc à l'aide de sondes d'oligonucléotides de synthèse par les techniques d'hybridation ou par amplification par PCR. The knowledge of the nucleotide sequence SEQ ID No. 1 above makes it possible to reproduce the present invention by methods known to those skilled in the art, for example by chemical synthesis or by screening a genomic library or a library. CDNA using synthetic oligonucleotide probes by hybridization or PCR amplification techniques.

L'invention a aussi pour objet une séquence d'ADN codant pour une protéine ayant une activité delta-S,7 stérol, delta-7 réductase et qui hybride à la séquence nucléotidique
SEQ ID NO 1 dans des conditions de stringence moyenne ou élevée ou qui présente une identité de séquence d'environ 60 % et plus avec cette séquence.The subject of the invention is also a DNA sequence coding for a protein having a delta-S, 7 sterol, delta-7 reductase activity and which hybridizes to the nucleotide sequence
SEQ ID NO 1 under medium or high stringency conditions or having sequence identity of about 60% or more with this sequence.

Les séquences qui hybrident de façon détectable à la séquence SEQ ID NO 1 hybrident dans des conditions standards de stringence moyenne, par exemple une hybridation à 420C, pendant 12 heures dans une solution 50 % formamide, SSCX6 suivie de lavages ou de stringence moins élevée, par exemple une hybridation à 420C pendant 24 heures dans une solution 20 % formamide, SSCX6 suivie de lavages dans les conditions standards connues (T. Maniatis et al., Molecular cloning,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).Sequences which detectably hybridize to the SEQ ID NO 1 sequence hybridize under standard conditions of medium stringency, e.g., 420C hybridization, for 12 hours in a 50% formamide solution, SSCX6 followed by washes or lower stringency, for example a hybridization at 420C for 24 hours in a 20% formamide solution, SSCX6 followed by washes under the known standard conditions (T. Maniatis et al., Molecular cloning,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).

Le pourcentage d'identité de séquence nucléotidique peut être déterminé en utilisant par exemple le programme BLAST "basic local alignment search tool" (S. F. Altschul et al.,
J. Mol. Biol., 215, 403-410, 1990) sur le serveur NCBI.The percentage of nucleotide sequence identity can be determined using, for example, the BLAST program "basic local alignment search tool" (SF Altschul et al.
J. Mol. Biol., 215, 403-410, 1990) on the NCBI server.

L'invention concerne aussi une séquence d'ADN codant pour une protéine ayant une activité delta-5,7 stérol,delta-7 réductase et amplifiable par la technique de PCR en utilisant comme amorces des oligonucléotides codant pour une séquence consensus ayant la séquence en acides aminés SEQ ID NO 3
Leu Leu Xaa Xaa Gly Trp Xaa Gly Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Tyr 1 5 10 15 dans laquelle Xaa en position 7 est Trp ou Tyr et Xaa en position 12 est His ou Lys.The invention also relates to a DNA sequence encoding a protein having a delta-5,7 sterol, delta-7 reductase activity and amplifiable by the PCR technique using as primers oligonucleotides encoding a consensus sequence having the sequence amino acids SEQ ID NO 3
Leu Leu Xaa Xaa Gly Trp Xaa Gly Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Tyr 1 5 10 15 wherein Xaa at position 7 is Trp or Tyr and Xaa at position 12 is His or Lys.

La séquence SEQ ID NO 3 ci-dessus correspond à une séquence consensus nouvelle qui a été définie par alignement d'identité de séquences en acides aminés entre la séquence nouvelle SEQ ID NO 2, déduite de la séquence nucléotidique
SEQ ID NO 1, et des séquences connues soit d'autres stérol réductases ayant une spécificité d'action à une position autre que la position C-7, soit de récepteurs à la lamin B, comme cela est détaillé plus loin dans la partie expérimentale.A partir de l'information donnée par la séquence en acides aminés SEQ ID NO 3, une amorce constituée d'au plus 45 nucléotides peut être définie et synthétisée qui, associée à une deuxième amorce oligodT (17 nucléotides) comme séquence de rebond, permettra à l'aide d'une trousse PCR du commerce (par exemple Stratagène) d'amplifier un ADN codant pour une protéine ayant l'activité delta-5,7 stérol,delta-7 réductase.The sequence SEQ ID No. 3 above corresponds to a new consensus sequence which has been defined by amino acid sequence identity alignment between the new SEQ ID NO 2 sequence deduced from the nucleotide sequence.
SEQ ID No. 1, and known sequences other sterol reductases having a specificity of action at a position other than the C-7 position, or receivers to the lamin B, as detailed later in the experimental part From the information given by the amino acid sequence SEQ ID NO 3, a primer consisting of at most 45 nucleotides can be defined and synthesized which, combined with a second oligodT primer (17 nucleotides) as a rebound sequence, will allow using a commercial PCR kit (eg Stratagene) to amplify a DNA encoding a protein with delta-5,7 sterol, delta-7 reductase activity.

L'invention concerne aussi une protéine d'A. thaliana ayant une activité delta-S,7 stérol,delta-7 réductase et ayant la séquence en acides aminés SEQ ID NO 2
Met Ala Glu Thr Val His Ser Pro Ile Val Thr Tyr Ala Ser Met Leu
1 5 10 15
Ser Leu Leu Ala Phe Cys Pro Pro Phe Val Ile Leu Leu Trp Tyr Thr
20 25 30
Met Val His Gln Asp Gly Ser Val Thr Gln Thr Phe Gly Phe Phe Trp
35 40 45
Glu Asn Gly Val Gln Gly Leu Ile Asn Ile Trp Pro Arg Pro Thr Leu
50 55 60
Ile Ala Trp Lys Ile Ile Phe Cys Tyr Gly Ala Phe Glu Ala Ile Leu
65 70 75 80
Gln Leu Leu Leu Pro Gly Lys Arg Val Glu Gly Pro Ile Ser Pro Ala
85 90 95
Gly Asn Arg Pro Val Tyr Lys Ala Asn Gly Leu Ala Ala Tyr Phe Val
100 105 110
Thr Leu Ala Thr His Leu Gly Leu Trp Trp Phe Gly Ile Phe Asn Pro
115 120 125
Ala Ile Val Tyr Asp His Leu Gly Glu Ile Phe Ser Ala Leu lie Phe
130 135 140
Gly Ser Phe Ile Phe Cys Val Leu Leu Tyr Ile Lys Gly His Val Ala 145 150 155 160
Pro Ser Ser Ser Asp Ser Gly Ser Cys Gly Asn Leu Ile Ile Asp Phe
165 170 175
Tyr Trp Gly Met Glu Leu Tyr Pro Arg Ile Gly Lys Ser Phe Asp Ile
180 185 190
Lys Val Phe Thr Asn Cys Arg Phe Gly Met Met Ser Trp Ala Val Leu
195 200 205
Ala Val Thr Tyr Cys Ile Lys Gln Tyr Glu Ile Asn Gly Lys Val Ser
210 215 220
Asp Ser Met Leu Val Asn Thr Ile Leu Met Leu Val Tyr Val Thr Lys 225 230 235 240
Phe Phe Trp Trp Glu Ala Gly Tyr Trp Asn Thr Met Asp Ile Ala His
245 250 255
Asp Arg Ala Gly Phe Tyr Ile Cys Trp Gly Cys Leu Val Trp Val Pro
260 265 270
Ser Val Tyr Thr Ser Pro Gly Met Tyr Leu Val Asn His Pro Val Glu
275 280 285
Leu Gly Thr Gln Leu Ala Ile Tyr Ile Leu Val Ala Gly Ile Leu Cys
290 295 300
Ile Tyr Ile Lys Tyr Asp Cys Asp Arg Gln Arg Gln Glu Phe Arg Arg 305 310 315 320
Thr Asn Gly Lys Cys Leu Val Trp Gly Arg Ala Pro Ser Lys Ile Val
325 330 335
Ala Ser Tyr Thr Thr Thr Ser Gly Glu Thr Lys Thr Ser Leu Leu Leu
340 345 350
Thr Ser Gly Trp Trp Gly Leu Ala Arg His Phe His Tyr Val Pro Glu
355 360 365
Ile Leu Ser Ala Phe Phe Trp Thr Val Pro Ala Leu Phe Asp Asn Phe
370 375 380
Leu Ala Tyr Phe Tyr Val Leu Thr Leu Leu Leu Phe Asp Arg Ala Lys 385 390 395 400
Arg Asp Asp Asp Arg Cys Arg Ser Lys Tyr Gly Lys Tyr Trp Lys Leu
405 410 415
Tyr Cys Glu Lys Val Lys Tyr Arg Ile Ile Pro Gly Ile Tyr
420 425 430 ainsi que les variants alléliques et les analogues de cette séquence.The invention also relates to an A protein. thaliana having a delta-S activity, 7 sterol, delta-7 reductase and having the amino acid sequence SEQ ID NO 2
Met Ala Glu Thr Val His Ser Pro Val Thr Island Tyr Ala Ser Met Leu
1 5 10 15
Ser Leu Leu Ala Phe Cys Pro Pro Phe Val Ile Leu Leu Trp Tyr Thr
20 25 30
Met Val His Gln Asp Gly Ser Val Thr Gln Thr Phe Gly Phe Phe Trp
35 40 45
Glu Asn Gly Val Gln Gly Leu Ile Asn Ile Trp Pro Arg Pro Thr Leu
50 55 60
Ile Ala Trp Lys Island Ile Phe Cys Tire Gly Ala Phe Glu Ala Ile Leu
65 70 75 80
Gln Leu Leu Pro Leu Gly Lys Arg Val Pro Glu Gly Pro Pro Ser Ala
85 90 95
Gly Asn Arg Pro Val Tyr Ala Asn Gly Ala Ala Ala Tyr Phe Val
100 105 110
Thr Leu Ala Thr His Leu Gly Leu Trp Trp Phe Gly Ile Phe Asn Pro
115 120 125
Ala Val Tyr Island Asp His Leu Gly Glu Phe Ser Ala Leu Leu Phe
130 135 140
Gly Ser Phe Ile Phe Cys Val Leu Leu Tyr Ile Lys Gly His Val Ala 145 150 155 160
Ser Ser Ser Ser Asp Ser Gly ser Cys Gly Asn Ile Ile Ile Asp Phe
165 170 175
Tyr Trp Gly Met Glu Leu Tyr Pro Arg Island Gly Lys Ser Phe Asp Ile
180 185 190
Lys Val Phe Thr Asn Cys Arg Phe Gly Met Met Ser Trp Ala Val Leu
195 200 205
Ala Val Thr Tyr Cys Island Lys Gln Tyr Glu Island Asn Gly Lys Val Ser
210 215 220
Asp Ser Met Leu Val Asn Thr Ile Leu Met Leu Val Tyr Val Thr Lys 225 230 235 240
Phe Phe Trp Trp Glu Ala Gly Tire Trp Asn Thr Met Asp Ala Island His
245 250 255
Asp Arg Ala Gly Phe Tire Island Cys Trp Gly Cys Val Val Val Val Pro
260,265,270
Ser Val Tyr Ser Ser Pro Gly Met Tyr Val Leu Asn His Pro Val Glu
275 280 285
Leu Gly Thr Gln Leu Ala Ile Tire Ile Leu Val Ala Gly Ile Leu Cys
290,295,300
Tyr Island Lys Tyr Asp Asp Asp Arg Arg Gln Arg Gln Glu Phe Arg Arg 305 310 315 320
Thr Asn Gly Lys Cys Leu Val Trp Gly Arg Ala Ser Ser Val Val
325 330 335
Ala Ser Tyr Thr Thr Thr Ser Gly Glu Thr Lys Thr Ser Leu Leu Leu Leu
340,345,350
Thr Ser Gly Trp Trp Gly Leu Ala Arg His Phe His Tyr Val Pro Glu
355 360 365
Ile Leu Ser Ala Phe Phe Thr Trp Pro Val Ala Leu Phe Asp Asn Phe
370,375,380
Leu Ala Tyr Phe Tyr Val Leu Leu Leu Leu Leu Phe Asp Arg Ala Lys 385 390 395 400
Arg Asp Asp Asp Arg Arg Cys Arg Ser Tyr Tyr Gly Lys Tyr Trp Leu Lys
405 410 415
Tyr Cys Glu Lys Val Lys Tyr Arg Island Ile Pro Gly Ile Tyr
420,425,430 as well as the allelic variants and analogs of this sequence.

Par allèles et analogues, on inclut les séquences modifiées par substitution, délétion ou addition d'un ou plusieurs acides aminés pour autant que ces produits conservent la même fonction. Les séquences modifiées peuvent être par exemple préparées en utilisant la technique de mutagénèse dirigée connue de l'homme du métier. Alleles and analogs include sequences modified by substitution, deletion or addition of one or more amino acids provided that these products retain the same function. The modified sequences may for example be prepared using the technique of site-specific mutagenesis known to those skilled in the art.

L'invention a spécialement pour objet une protéine d'A. thaliana ayant une activité delta-S,7 stérol,delta-7 réductase et ayant la séquence en acides aminés SEQ ID NO 2 ci-dessus et désignée delta-7Red. The subject of the invention is especially a protein of A. thaliana having a delta-S activity, 7 sterol, delta-7 reductase and having the amino acid sequence SEQ ID NO 2 above and designated delta-7Red.

L'invention concerne aussi une protéine ayant une activité delta-5,7 stérol,delta-7 réductase ayant une séquence en acides aminés présentant une identité de séquence d'environ 60 % et plus avec la séquence SEQ ID NO 2. The invention also relates to a protein having a delta-5,7 sterol, delta-7 reductase activity having an amino acid sequence having a sequence identity of about 60% or more with the sequence SEQ ID NO 2.

Le pourcentage d'identité peut être déterminé par exemple en utilisant le programme BLAST indiqué ci-dessus. The percentage of identity can be determined for example using the BLAST program indicated above.

L'invention concerne également une protéine ayant une activité delta-5,7 stérol,delta-7 réductase et ayant une réactivité immunologique croisée avec la protéine d'A. thaliana delta-7Red définie ci-dessus. The invention also relates to a protein having delta-5,7 sterol, delta-7 reductase activity and having immunological cross-reactivity with A protein. thaliana delta-7Red defined above.

La protéine peut être détectée par exemple par immunoprécipitation à l'aide d'un anti-sérum dirigé contre la protéine delta-7Red, préparé selon des méthodes connues. The protein can be detected for example by immunoprecipitation using an anti-serum directed against the delta-7Red protein prepared according to known methods.

Un des aspects de l'invention concerne une protéine ayant une activité delta 5,-7 stérol,delta-7 réductase telle qu'obtenue par expression dans une cellule hôte contenant une séquence d'ADN définie précédemment et concerne spécialement une protéine d'A. thaliana telle qu'obtenue par expression dans une cellule hôte contenant une séquence d'ADN codant pour la séquence en acides aminés SEQ ID NO 2 ci-dessus. One aspect of the invention relates to a protein having a delta 5, -7 sterol, delta-7 reductase activity as obtained by expression in a host cell containing a previously defined DNA sequence and especially relates to an A protein. . thaliana as obtained by expression in a host cell containing a DNA sequence coding for the amino acid sequence SEQ ID NO 2 above.

Lorsque la protéine de l'invention est obtenue par expression dans une cellule hôte, celle-ci est réalisée selon les méthodes de génie génétique et de culture cellulaire connues de l'homme du métier. When the protein of the invention is obtained by expression in a host cell, this is carried out according to genetic engineering and cell culture methods known to those skilled in the art.

L'expression peut être réalisée dans une cellule hôte procaryote, par exemple E. coli ou dans une cellule hôte eucaryote, par exemple une cellule de mammifère, une cellule d'insecte ou une levure contenant la séquence codant pour la delta-7 Red de l'invention précédée d'un promoteur convenable. The expression can be carried out in a prokaryotic host cell, for example E. coli or in a eukaryotic host cell, for example a mammalian cell, an insect cell or a yeast containing the sequence coding for the delta-7 Red of the invention preceded by a suitable promoter.

La protéine recombinante obtenue peut être glycosylée ou non glycosylée. The recombinant protein obtained can be glycosylated or non-glycosylated.

L'invention concerne notamment une protéine selon l'invention telle qu'obtenue par expression dans une levure. The invention relates in particular to a protein according to the invention as obtained by expression in a yeast.

L'invention concerne aussi un anticorps dirigé contre une protéine ayant une activité delta-S,7 stérol,delta-7 réductase définie précédemment. L'anticorps peut être un anticorps polyclonal ou un anticorps monoclonal préparé selon les méthodes connues de l'homme du métier. The invention also relates to an antibody directed against a protein having delta-S, 7 sterol, delta-7 reductase activity defined above. The antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody prepared according to methods known to those skilled in the art.

L'invention concerne aussi un vecteur d'expression contenant une séquence d'ADN définie précédemment ainsi qu'une cellule hôte transformée par ce vecteur. The invention also relates to an expression vector containing a previously defined DNA sequence and a host cell transformed with this vector.

Les vecteurs d'expression sont des vecteurs connus permettant l'expression de la protéine sous le contrôle d'un promoteur convenable. Pour les cellules procaryotes, le promoteur peut être par exemple le promoteur lac, le promoteur trp, le promoteur tac, le promoteur B-lactamase ou le promoteur PL. Pour les cellules de mammifères, le promoteur peut être le promoteur SV40 ou les promoteurs de l'adénovirus. Des vecteurs type Baculovirus peuvent être aussi utilisés pour l'expression dans des cellules d'insectes. Pour les cellules de levure, le promoteur peut être par exemple le promoteur PGK, le promoteur ADH, le promoteur CYC1 ou le promoteur GAL1O/CYC1. Expression vectors are known vectors for the expression of the protein under the control of a suitable promoter. For prokaryotic cells, the promoter may be for example the lac promoter, the trp promoter, the tac promoter, the β-lactamase promoter or the PL promoter. For mammalian cells, the promoter may be the SV40 promoter or the adenovirus promoters. Baculovirus-like vectors may also be used for expression in insect cells. For yeast cells, the promoter may be for example the PGK promoter, the ADH promoter, the CYC1 promoter or the GAL1O / CYC1 promoter.

Les cellules hôtes peuvent être des cellules procaryotes ou des cellules eucaryotes. Les cellules procaryotes sont par exemple E. coli, Bacillus ou Streptomyces. Les cellules hôtes eucaryotes comprennent des levures et des champignons filamenteux ainsi que des cellules d'organismes supérieurs, par exemple des cellules de mammifères ou des cellules d'insec- tes. Les cellules de mammifères peuvent être des cellules CHO de hamster ou des cellules Cos de singe. Les cellules d'in- sectes sont par exemple des cellules SF9. Les cellules de levure peuvent être par exemple Saccharomyces cerevisiae,
Schizosaccharomyces pombe ou Kluyveromyces lactis.The host cells can be prokaryotic cells or eukaryotic cells. Prokaryotic cells are for example E. coli, Bacillus or Streptomyces. Eukaryotic host cells include yeasts and filamentous fungi as well as cells of higher organisms, e.g., mammalian cells or insect cells. Mammalian cells may be hamster CHO cells or monkey Cos cells. The insect cells are, for example, SF9 cells. The yeast cells may be, for example, Saccharomyces cerevisiae,
Schizosaccharomyces pombe or Kluyveromyces lactis.

L'invention a aussi pour objet un procédé de clonage d'un acide nucléique codant pour une protéine ayant une activité delta-5,7 stérol,delta-7 réductase dans un microorganisme comprenant une méthode de criblage choisie parmi - la résistance du microorganisme à la nystatine ou à un composé analogue dont la toxicité dépend de la présence de stérols portant une insaturation en position C-7, - l'hybridation de l'acide nucléique avec la séquence nucléotidique de la séquence SEQ ID NO 1 ci-dessus, - l'identification de l'acide nucléique par voie informatique parmi des séquences d'ADN isolées au hasard, - l'expression directe de la protéine suivie d'immunodétection à l'aide d'anticorps dirigés contre la protéine ayant la séquence en acides aminés SEQ ID NO 2 ci-dessus. The invention also relates to a method for cloning a nucleic acid encoding a protein having a delta-5,7 sterol, delta-7 reductase activity in a microorganism comprising a screening method chosen from - the resistance of the microorganism to nystatin or an analogous compound whose toxicity depends on the presence of sterols bearing unsaturation at the C-7 position, - the hybridization of the nucleic acid with the nucleotide sequence of the sequence SEQ ID No. 1 above, computer nucleic acid identification among randomly isolated DNA sequences; direct expression of the protein followed by immunodetection using antibodies directed against the protein having the amino acid sequence SEQ ID NO 2 above.

Par microorganisme, on entend une levure telle que par exemple S. cerevisiae, S. pombe ou K. lactis. By microorganism is meant a yeast such as for example S. cerevisiae, S. pombe or K. lactis.

Les composé analogues à la nystatine comprennent par exemple l'amphotéricine B ou la filipine. Nystatin-like compounds include, for example, amphotericin B or filipine.

Par hybridation, on entend une hybridation dans des conditions de stringence moyenne ou élevée selon les conditions standards connues (T. Maniatis et al., déjà cité). By hybridization is meant hybridization under medium or high stringency conditions according to known standard conditions (T. Maniatis et al., Already cited).

L'identification par voie informatique peut être réalisée par exemple selon le programme BLAST indiqué ci-dessus. The identification by computer can be performed for example according to the BLAST program indicated above.

Un exemple de procédé de clonage ci-dessus dans lequel la méthode de criblage utilise la résistance à la nystatine dans une levure est décrit plus loin dans la partie expérimentale. An example of the above cloning method in which the screening method utilizes nystatin resistance in yeast is described later in the experimental section.

L'invention a aussi pour objet une séquence d'acide nucléique, ADN ou ARN, tel qu'obtenu par le procédé de clonage ci-dessus. La séquence d'acide nucléique peut être d'origine procaryote ou eucaryote selon le matériel à partir duquel est réalisé le clonage, par exemple d'origine humaine. The invention also relates to a nucleic acid sequence, DNA or RNA, as obtained by the cloning method above. The nucleic acid sequence may be of prokaryotic or eukaryotic origin depending on the material from which cloning is performed, for example of human origin.

L'invention a aussi pour objet une cellule hôte transformée par un vecteur contenant une séquence d'ADN tel qu'obtenu par le procédé de clonage ci-dessus. La cellule hôte peut être une cellule procaryote ou une cellule eucaryote. Des exemples de cellules hôtes et de vecteurs ont été indiqués précédemment. The subject of the invention is also a host cell transformed with a vector containing a DNA sequence as obtained by the above cloning method. The host cell may be a prokaryotic cell or a eukaryotic cell. Examples of host cells and vectors have been indicated previously.

L'invention a spécialement pour objet une cellule hôte, choisie parmi une levure ou un champignon filamenteux, transformée par un vecteur contenant une séquence d'ADN de l'invention définie précédemment ou une séquence d'ADN tel qu'obtenue par le procédé de clonage ci-dessus. The subject of the invention is especially a host cell, chosen from yeast or a filamentous fungus, transformed with a vector containing a DNA sequence of the invention defined above or a DNA sequence as obtained by the method of cloning above.

L'un des objets de l'invention concerne aussi un procédé de préparation d'une protéine ayant une activité delta-5,7 stérol,delta-7 réductase dans lequel on cultive une cellule hôte transformée de l'invention et on isole la protéine exprimée et concerne particulièrement un procédé dans lequel la cellule hôte est une levure transformée dans laquelle la séquence d'ADN codante est placée sous le contrôle d'un promoteur de levure. One of the objects of the invention also relates to a process for the preparation of a protein having a delta-5,7 sterol, delta-7 reductase activity in which a transformed host cell of the invention is cultured and the protein is isolated. expressed and particularly relates to a method wherein the host cell is a transformed yeast in which the coding DNA sequence is under the control of a yeast promoter.

L'un des objets de l'invention concerne aussi un procédé de réduction in vitro d'un stérol insaturé en position C-7 dans lequel on incube le stérol à réduire avec la protéine obtenue par le procédé ci-dessus et on isole éventuellement le stérol réduit obtenu. One of the objects of the invention also relates to a process for the in vitro reduction of an unsaturated sterol in the C-7 position in which the sterol is incubated with the protein obtained by the above process and the reduced sterol obtained.

L'un des objets de l'invention concerne aussi un procédé de réduction in vivo d'un stérol exogène insaturé en position
C-7 dans lequel on incube le stérol avec une cellule hôte transformée de l'invention et on isole éventuellement le stérol réduit obtenu. La cellule hôte peut être une cellule procaryote ou une cellule eucaryote, en particulier une levure ou un champignon filamenteux.One of the objects of the invention also relates to a process for the in vivo reduction of an exogenous sterol that is unsaturated in position
C-7 wherein the sterol is incubated with a transformed host cell of the invention and the resulting reduced sterol is optionally isolated. The host cell may be a prokaryotic cell or a eukaryotic cell, particularly a yeast or filamentous fungus.

L'un des objets de l'invention concerne aussi un procédé de réduction in vivo d'un stérol endogène insaturé en position C-7 dans lequel on cultive une souche hôte transformée de l'invention choisie parmi une levure ou un champignon filamenteux et on isole éventuellement le stérol réduit accumulé. One of the objects of the invention also relates to a process for the in vivo reduction of a C-7 unsaturated endogenous sterol in which a transformed host strain of the invention is cultured, selected from a yeast or a filamentous fungus, and optionally isolates the accumulated reduced sterol.

L'invention concerne particulièrement un procédé de réduction in vitro ou in vivo défini ci-dessus dans lequel le stérol réduit obtenu est un substrat de l'enzyme de clivage de la chaîne latérale du cholestérol (P450SCC) et concerne tout particulièrement un procédé de réduction in vivo dans lequel le stérol endogène à réduire est l'ergosta 5,7 diène 3-ol, l'ergosta 5,7,24(28) triène 3-ol ou l'ergosta 5,7,22 triène 3-ol ou un mélange de ceux-ci. The invention particularly relates to an in vitro or in vivo reduction method defined above wherein the reduced sterol obtained is a substrate of the cholesterol side chain cleaving enzyme (P450SCC) and is particularly concerned with a reduction method. in vivo in which the endogenous sterol to be reduced is ergosta 5,7-diene 3-ol, ergosta 5,7,24 (28) triene 3-ol or ergosta 5,7,22 triene 3-ol or a mixture of these.

L'invention a aussi pour objet un procédé de production de pregnénolone dans lequel on cultive une cellule hôte transformée de l'invention choisie parmi une levure ou un champignon filamenteux, on isole éventuellement le ou les stérols endogènes réduits en position C-7 accumulés, on incube les stérols réduits en présence de P450SCC, et éventuellement en présence d'adrénodoxine réductase (ADR) et d'adrénodoxine (ADX), et on isole éventuellement la pregnéno lone obtenue. The subject of the invention is also a process for the production of pregnenolone in which a transformed host cell of the invention is cultured selected from yeast or filamentous fungus, or the accumulated C-7 reduced endogenous sterol (s) is optionally isolated. the reduced sterols are incubated in the presence of P450SCC, and optionally in the presence of adrenodoxin reductase (ADR) and adrenodoxin (ADX), and the resulting pregnenolone is optionally isolated.

L'invention a particulièrement pour objet un procédé de production de la pregnénolone défini ci-dessus dans lequel la cellule hôte est une levure. The invention particularly relates to a process for producing pregnenolone defined above in which the host cell is a yeast.

L'invention concerne aussi un procédé de production de pregnénolone dans lequel on cultive une levure transformée par un ou plusieurs vecteurs permettant la coexpression d'une protéine ayant l'activité delta-S,7 stérol,delta-7 réductase et de P450SCC et éventuellement de l'ADR et de l'ADX et on isole éventuellement la pregnénolone libre ou estérifiée. The invention also relates to a process for the production of pregnenolone in which a yeast transformed by one or more vectors is used which allows the coexpression of a protein having the delta-S, sterol, delta-7 reductase and P450SCC activity and optionally ADR and ADX, and the free or esterified pregnenolone is optionally isolated.

L'invention concerne particulièrement le procédé cidessus dans lequel on cultive une levure transformée coexprimant une protéine ayant l'activité delta-S,7 stérol delta-7 réductase, le P450SCC, 1'ADR et l'ADX, tout particulièrement le procédé ci-dessus dans lequel la protéine ayant l'activité delta-S,7 stérol delta-7 réductase est la protéine d'A. The invention particularly relates to the above process in which a transformed yeast coexpressing a protein having delta-S activity, 7 sterol delta-7 reductase, P450SCC, ADR and ADX, especially the method above in which the protein having the delta-S activity, 7 sterol delta-7 reductase is the protein of A.

thaliana delta-7Red et spécialement le procédé ci-dessus dans lequel la souche de levure est la souche ECOl/pCD63.delta-7Red thaliana and especially the above process wherein the yeast strain is strain ECO1 / pCD63.

Des exemples de production de pregnénolone selon l'invention sont donnés plus loin dans la partie expérimentale. Examples of pregnenolone production according to the invention are given later in the experimental section.

La levure transformée utilisée pour la réalisation du procédé de production de pregnénolone ci-dessus peut être par exemple une levure co-transformée par un vecteur d'expression de l'invention contenant une séquence d'ADN codant pour une protéine ayant une activité delta-5,7 stérol,delta-7 réductase et un vecteur d'expression du cytochrome P450SCC et éventuellement de l'ADX et de l'ADR. Des vecteurs d'expression du cytochrome P450SCC et/ou de l'ADX sont connus et des préparations sont décrites par exemple dans la demande de brevet européen EP 0340878 ainsi que plus loin dans la partie expérimentale. The transformed yeast used for carrying out the above pregnenolone production process can be, for example, a yeast co-transformed with an expression vector of the invention containing a DNA sequence coding for a protein having a delta-activating activity. 5.7 sterol, delta-7 reductase and a cytochrome P450SCC expression vector and optionally ADX and ADR. Expression vectors of cytochrome P450SCC and / or ADX are known and preparations are described for example in the European patent application EP 0340878 as well as later in the experimental part.

La levure transformée utilisée peut être également une levure dans laquelle la séquence d'ADN codant pour la protéine ayant l'activité delta-5,7 stérol,delta-7 réductase est intégrée dans un locus particulier du génome, par exemple au locus ADE2 et dans laquelle l'ergostérol n'est plus le stérol majoritaire dans les conditions d'expression de la delta-7 réductase. La levure "intégrée" obtenue peut être ensuite transformée par des cassettes d'expression intégratives ou par des vecteurs d'expression contenant une séquence d'ADN codant pour le cytochrome P450SCC et éventuellement pour 1'ADX et l'ADR. The transformed yeast used may also be a yeast in which the DNA sequence coding for the protein having delta-5,7 sterol, delta-7 reductase activity is integrated into a particular locus of the genome, for example at the ADE2 locus and in which ergosterol is no longer the major sterol in the expression conditions of delta-7 reductase. The "integrated" yeast obtained can then be transformed by integrative expression cassettes or by expression vectors containing a DNA sequence coding for cytochrome P450SCC and possibly for ADX and ADR.

Un exemple de construction de souches de levure produisant in vivo la pregnénolone ou son ester acétique est donné plus loin dans la partie expérimentale. An example of construction of yeast strains producing in vivo pregnenolone or its acetic ester is given later in the experimental part.

L'invention a donc également pour objet une souche de levure transformée coexprimant une protéine ayant l'activité delta-5,7 stérol delta-7 réductase, le P450SCC, 1'ADR et l'ADX et accumulant de la pregnénolone libre ou estérifiée, particulièrement une souche de levure ci-dessus dans laquelle la protéine ayant l'activité delta-5,7 stérol delta-7 réductase est la protéine d'A. thaliana delta-7Red et spécialement une souche de levure dénommée ECOl/pCD63 dont la construction détaillée est donnée plus loin dans la partie expérimentale. The invention therefore also relates to a transformed yeast strain coexpressing a protein having delta-5,7 sterol delta-7 reductase activity, P450SCC, ADR and ADX and accumulating free or esterified pregnenolone, particularly a yeast strain above wherein the protein having the delta-5,7 sterol delta-7 reductase activity is the A protein. thaliana delta-7Red and especially a yeast strain called ECOl / pCD63 whose detailed construction is given later in the experimental part.

L'invention s'étend aussi à une séquence d'ADN humain tel qu'obtenu selon le procédé de clonage défini ci-dessus, utilisée comme sonde pour diagnostiquer une déficience congénitale en delta-5,7 stérol,delta-7 réductase. La déficience en delta-S,7 stérol delta-7 réductase comprend par exemple la déficience en 7-déhydrocholestérol réductase responsable de taux anormalement bas en cholestérol dans le plasma. The invention also extends to a human DNA sequence as obtained according to the cloning method defined above, used as a probe to diagnose congenital deficiency in delta-5,7 sterol, delta-7 reductase. The delta-S, sterol delta-7 reductase deficiency includes, for example, the deficiency of 7-dehydrocholesterol reductase responsible for abnormally low levels of cholesterol in the plasma.

L'invention concerne également une méthode de détection de la déficience en delta-S,7 stérol,delta-7 réductase qui comprend l'incubation d'un échantillon contenant de l'ADN génomique humain avec la sonde définie ci-dessus dans des conditions d'hybridation standards et la mise en évidence de la fixation ou de l'absence de fixation de la sonde à 1'ADN génomique, l'absence de fixation ou la réduction de celle-ci indiquant une déficience congénitale en delta-S,7 stérol, delta-7 réductase. The invention also relates to a method for detecting delta-S, sterol, delta-7 reductase deficiency which comprises incubating a sample containing human genomic DNA with the probe defined above under conditions standard hybridization and the demonstration of the fixation or lack of attachment of the probe to the genomic DNA, the absence of fixation or the reduction thereof indicating a congenital delta-S deficiency, 7 sterol, delta-7 reductase.

La méthode de l'invention peut permettre par exemple de détecter une déficience congénitale en delta-5,7 stérol, delta-7 réductase prénatale ou chez le nouveau-né ainsi que chez les patients atteints d'affections variées et notamment chez les patients ayant les manifestations cliniques du syndrome RSH/SLO. The method of the invention can, for example, make it possible to detect a congenital deficiency in delta-5,7 sterol, prenatal delta-7 reductase or in the newborn as well as in patients with various conditions, and in particular in patients having clinical manifestations of RSH / SLO syndrome.

Les figures ci-annexées illustrent certains aspects de l'invention
La figure 1 représente le profil en stérols totaux extraits à partir du clone F22 résistant à la nystatine obtenu par criblage de la banque d'A. thaliana dans la levure FY 1679. L'analyse est faite par RP-HPLC à 205 nm ou à 285 nm (figure 1A) ou par CPG comparativement à la levure FY1679 non transformée (figure 1B). The attached figures illustrate certain aspects of the invention
Figure 1 shows the profile of total sterols extracted from the nystatin-resistant clone F22 obtained by screening the A library. thaliana in yeast FY 1679. The analysis is made by RP-HPLC at 205 nm or at 285 nm (FIG. 1A) or by GPC compared to untransformed yeast FY1679 (FIG. 1B).

La figure 2 représente une carte de restriction du fragment Not I du plasmide pF22 et la stratégie de séquençage. Figure 2 shows a restriction map of the NotI fragment of plasmid pF22 and the sequencing strategy.

La figure 3 représente la séquence nucléotidique de l'ADNc delta-7Red (SEQ ID NO 1) et la séquence en acides aminés correspondante (SEQ ID NO 2). Figure 3 shows the nucleotide sequence of the delta-7Red cDNA (SEQ ID NO 1) and the corresponding amino acid sequence (SEQ ID NO 2).

La figure 4 illustre la mesure in vitro de l'activité delta-5,7 stérol,delta-7 réductase d'une fraction microsomale de FY1679 transformée avec le vecteur d'expression inductible "delta-7/V8". L'analyse est faite par CPG et montre la transformation du substrat 7-déhydrocholestérol (TR=16,528) en cholestérol (TR=15,887) en présence des stérols endogènes ergosta 5,22 diène 3-ol (TR=16,682) ; ergostérol (TR = 17,249) ; ergosta 5-ène3-ol (TR=17,664).  Figure 4 illustrates the in vitro measurement of the delta-5,7 sterol, delta-7 reductase activity of a microsomal fraction of FY1679 transformed with the inducible "delta-7 / V8" expression vector. The analysis is done by GPC and shows the transformation of the 7-dehydrocholesterol substrate (TR = 16.528) into cholesterol (TR = 15.887) in the presence of endogenous ergosta 5.22 diene 3-ol sterols (TR = 16.682); ergosterol (TR = 17.249); ergosta 5-ene-ol (TR = 17.664).

La figure 5 illustre la production de pregnénolone in vitro par clivage d'ergosta 5-ène 3-ol (fig. 5A) ; d'ergosta 5,24(28) diène 3-ol (5B) ou d'ergosta 5,22 diène 3-ol (5C) purifié à partir d'une levure transformée exprimant la delta7Red, puis incubé avec P450SCC, ADX et ADR. L'analyse est faite par CPG comparativement à un clivage témoin de cholestérol (trait plein). Figure 5 illustrates the production of pregnenolone in vitro by cleavage of ergosta-5-ene-3-ol (Figure 5A); of ergosta 5.24 (28) diene 3-ol (5B) or ergosta 5.22 diene 3-ol (5C) purified from a transformed yeast expressing delta7Red, then incubated with P450SCC, ADX and ADR . The analysis is done by GPC compared to a control cleavage of cholesterol (solid line).

La figure 6 illustre la construction du plasmide intégratif pADA7 permettant l'intégration de l'ADNc codant pour la delta-7Red (stérol A7 réductase) au locus ADE2. Figure 6 illustrates the construction of the integrative plasmid pADA7 allowing integration of the cDNA coding for delta-7Red (sterol A7 reductase) at the ADE2 locus.

La figure 7 représente l'analyse par CPG des stérols totaux extraits par saponification alcaline de la souche
FY1679 et de la souche intégrée ELRO1 cultivées en présence de galactose.Figure 7 shows GPC analysis of total sterols extracted by alkaline saponification of the strain
FY1679 and the integrated strain ELRO1 grown in the presence of galactose.

La figure 8 schématise la construction du vecteur navette E. coli-S. cerevisiae V13 contenant un site unique
SalI (Sa) dans le site de clonage multiple.Figure 8 schematizes the construction of the E. coli-S shuttle vector. cerevisiae V13 containing a single site
SalI (Sa) in the multiple cloning site.

La figure 9 représente les étapes de la construction des plasmides intégratifs pCD62-1 et pCD62-2 qui permettent d'insérer la cassette d'expression ADR dans la région intergénique des gènes leu2 et sella.  FIG. 9 represents the steps of the construction of the integrative plasmids pCD62-1 and pCD62-2 which make it possible to insert the ADR expression cassette into the intergenic region of the leu2 and sella genes.

SCM1 et SCM2 : sites de clonage multiples.SCM1 and SCM2: multiple cloning sites.

La figure 10 représente la stratégie de la construction de la souche CDRO1.  Figure 10 represents the strategy of the construction of strain CDRO1.

La figure 11 représente les étapes de la construction du plasmide d'expression pCD63 contenant les deux cassettes d'expression ADX et P450SCC. Figure 11 shows the steps of constructing the expression plasmid pCD63 containing the two ADX and P450SCC expression cassettes.

La figure 12 représente l'analyse par CPG des stérols extraits à partir des cellules (lysat cellulaire) ou du milieu de culture (milieu) isolés à partir de la souche
ECOl/pCD63 après une induction par le galactose de 9 h (figure 12a) ou de 24 h (figure 12b).Figure 12 shows GPC analysis of sterols extracted from cells (cell lysate) or culture medium (medium) isolated from the strain.
ECO1 / pCD63 after galactose induction of 9 h (Figure 12a) or 24 h (Figure 12b).

La figure 13 représente la structure du plasmide pTG 7457.Figure 13 shows the structure of plasmid pTG 7457.

La figure 14 représente la structure du plasmide pTG 7453.Figure 14 shows the structure of plasmid pTG 7453.

La figure 15 représente la structure du plasmide pTG 10014.Figure 15 shows the structure of plasmid pTG 10014.

La figure 16 représente la structure du plasmide pTG 10004.Figure 16 shows the structure of plasmid pTG 10004.

La figure 17 représente la structure du plasmide pTG 10031.Figure 17 shows the structure of plasmid pTG 10031.

Ia figure 18 représente la structure du plasmide pTG 10033. Figure 18 shows the structure of plasmid pTG 10033.

Les exemples suivants illustrent l'invention sans la limiter. The following examples illustrate the invention without limiting it.

EXEMPLE 1 : Clonage d'ADNc codant pour la delta-5,7 stérol, delta-7 réductase (delta-7Red) d'A. thaliana
A - Criblage de la banque d'expression d'A. thaliana dans la levure
La banque d'expression d'ADNc de départ est la banque décrite par M. Minet et al. (Plant J., 2, 417-422, 1992) qui a été préparée à partir d'ARNm d'A. thaliana au stade de germination au stade à deux feuilles et dont les ADNc bordés par le site Not I ont été insérés au site Bst XI de la cassette d'expression du vecteur navette E. coli/S. cerevisiae pFL61. Cette cassette contient les séquences du promoteur et du terminateur du gène de la phosphoglycérate kinase (PGK).EXAMPLE 1 Cloning of cDNA coding for the delta-5,7 sterol, delta-7 reductase (delta-7Red) of A. thaliana
A - Screening of A's expression library thaliana in yeast
The starting cDNA expression library is the library described by M. Minet et al. (Plant J., 2, 417-422, 1992) which was prepared from A mRNA. thaliana at the two-leaf stage of germination and whose cDNAs bounded by the Not I site were inserted at the Bst XI site of the E. coli / S shuttle vector expression cassette. cerevisiae pFL61. This cassette contains the promoter and terminator sequences of the phosphoglycerate kinase (PGK) gene.

L'origine de réplication de la levure dérivée de la séquence 2 et un marqueur de sélection URA3 assurent la propagation du vecteur dans la levure. La propagation du vecteur dans
E. coli est dérivée du plasmide pUCl9.The origin of replication of yeast derived from sequence 2 and a selection marker URA3 ensure the propagation of the vector in yeast. The propagation of the vector in
E. coli is derived from plasmid pUC19.

La souche de levure FY 1679 (Mata), qui est une souche isogénique de la souche S288C décrite par A. Thierry et al. Yeast strain FY 1679 (Mata), which is an isogenic strain of strain S288C described by A. Thierry et al.

(Yeast, 6, 521-534, 1990), a été transformée par la banque d'ADNc en utilisant la méthode à l'acétate de lithium décrite par D. Gietz et al. (Nucleic Acids Res., 20, 1425, 1992).(Yeast, 6, 521-534, 1990), was transformed by the cDNA library using the lithium acetate method described by D. Gietz et al. (Nucleic Acids Res., 20, 1425, 1992).

Les cellules ont été étalées sur un milieu synthétique
SGI contenant 7 g/l de "yeast nitrogen base" (Difco), 1 g/l de bactocasaminoacides (Difco), 20 g/l de glucose, 20 mg/l de tryptophane et qui est dépourvu d'uracile. 105 transformants prototrophes pour l'uracile ont été obtenus puis groupés et étalés à nouveau sur le même milieu synthétique dépourvu d'uracile et contenant 2 ou 5 ssg/ml de nystatine à raison de 5x104 cellules par boite. 106 cellules pour chaque concentration en nystatine ont été ainsi criblées.Après 3 jours d'incubation à 280C, environ 100 clones, qui ont poussé à la concentration de 2 Zg/ml en nystatine, ont été récupérés en constituant des groupes de 5 clones dont la composition en stérols a été analysée par chromatographie liquide à haute performance en phase inversée (noté RP-HPLC dans ce qui suit) alors qu'ut seul clone résistant, dénommé F22, a été obtenu à la concentration de 5 ssg/ml en nystatine.The cells were plated on a synthetic medium
SGI containing 7 g / l yeast nitrogen base (Difco), 1 g / l bactocasamino acids (Difco), 20 g / l glucose, 20 mg / l tryptophan and which is devoid of uracil. 105 prototrophic transformants for uracil were obtained then grouped and spread again on the same synthetic medium lacking uracil and containing 2 or 5 ssg / ml of nystatin at the rate of 5x104 cells per dish. 106 cells for each nystatin concentration were thus screened.After 3 days of incubation at 280C, about 100 clones, which grew at the concentration of 2 Zg / ml in nystatin, were recovered by forming groups of 5 clones of which the sterol composition was analyzed by reversed-phase high performance liquid chromatography (hereinafter referred to as RP-HPLC) while the only resistant clone, called F22, was obtained at a concentration of 5 μg / ml in nystatin .

B - Analyse des stérols accumulés dans le clone F22
Les stérols totaux de la levure sont préparés selon la méthode de saponification alcaline décrite par L. Parks et al. (Methods in Enzymol., 111, 333-346, 1985), puis analysés par RP-HPLC ou/et par chromatographie en phase gazeuse (noté
CPG).B - Analysis of accumulated sterols in clone F22
The total sterols of the yeast are prepared according to the method of alkaline saponification described by L. Parks et al. (Methods in Enzymol., 111, 333-346, 1985), then analyzed by RP-HPLC or / and by gas chromatography (noted
CPG).

Le résidu de stérols obtenu est dissout dans le mélange éthanol-tétrahydrofurane-eau (65:10:25 v/v) puis analysé par
RP-HPLC sur une colonne de silice greffée C18 Applied Biosystems (100 x 2,1 mm) au débit de 1 ml/mn et à 550C à l'aide d'un gradient linéaire de méthanol dans de l'eau (50 % à 100 % sur 18 mn) et une détection photométrique à 205 nm et 285 nm comparativement à des standards d'ergostérol, campestérol et cholestérol.The sterol residue obtained is dissolved in the mixture ethanol-tetrahydrofuran-water (65:10:25 v / v) and analyzed by
RP-HPLC on an Applied Biosystems C18 grafted silica column (100 x 2.1 mm) at a flow rate of 1 ml / min and at 550 ° C. using a linear gradient of methanol in water (50% to 100% over 18 min) and photometric detection at 205 nm and 285 nm compared to ergosterol, campesterol and cholesterol standards.

La composition en stérols est aussi analysée par CPG sur une colonne capillaire SE-30 Alltech (30 m x 0,32 mm) avec de l'hélium comme gaz porteur, une température de 2800C et 3100C pour l'injecteur et le détecteur respectivement, avec une augmentation initiale de la température de 110C à 2450C à la vitesse de 450C/mn, puis de 30C/mn pour atteindre 2800C. The sterol composition is also analyzed by GC on an SE-30 Alltech capillary column (30 mx 0.32 mm) with helium as a carrier gas, a temperature of 2800C and 3100C for the injector and the detector respectively, with an initial increase in temperature from 110C to 2450C at a speed of 450C / min, then 30C / min to reach 2800C.

L'analyse par RP-HPLC (figure 1A) et l'analyse par CPG (figure 1B) montrent le profil des stérols accumulés dans le clone F22 obtenu ci-dessus caractérisé par la disparition presque complète de l'ergostérol, stérol majoritaire de la souche non transformée FY 1679, et son remplacement par deux stérols majeurs et en quantité analogue qui n'absorbent pas à 285 nm et ne possèdent donc plus une double insaturation conjuguée selon l'analyse par RP-HPLC. Analysis by RP-HPLC (FIG. 1A) and GC analysis (FIG. 1B) show the profile of the sterols accumulated in the F22 clone obtained above, characterized by the almost complete disappearance of ergosterol, the majority sterol of the untransformed strain FY 1679, and its replacement with two major sterols and in a similar amount that do not absorb at 285 nm and thus no longer have double conjugated unsaturation according to RP-HPLC analysis.

A la figure 1A, le campestérol (Sigma) (24-R-ergosta 5ène 3-ol) contient environ 35 % de dihydrobrassicastérol (24 S-ergosta 5-ène 3-ol). In FIG. 1A, campesterol (Sigma) (24-R-ergosta-5-en-3-ol) contains about 35% dihydrobrassicasterol (24 S-ergosta 5-ene 3-ol).

C - Clonage de 1'ADNc delta-7Red
Les plasmides provenant du clone F22 ont été amplifiés dans E. coli selon la méthode décrite par J. N. Strathern et al. (Methods in Enzymol., 194, 319-329, 1991), puis digérés par Not I. Un fragment de 600 paires de bases (bp) environ et un fragment de 3,6 kbp ont été obtenus. La souche FY1679 a été transformée avec chacun des fragments ci-dessus respectivement. La composition en stérols de chaque clone de levure transformée a été analysée comme indiqué ci-dessus et a permis de distinguer le plasmide portant le gène responsable du profil modifié en stérols. Le plasmide ainsi identifié a été dénommé pF22.C - Cloning delta-7Red cDNA
Plasmids from clone F22 were amplified in E. coli according to the method described by JN Strathern et al. (Methods in Enzymol., 194, 319-329, 1991), then digested with Not I. A fragment of about 600 base pairs (bp) and a fragment of 3.6 kbp were obtained. Strain FY1679 was transformed with each of the above fragments respectively. The sterol composition of each transformed yeast clone was analyzed as indicated above and made it possible to distinguish the plasmid carrying the gene responsible for the modified sterol profile. The plasmid thus identified was called pF22.

D - Détermination de la séquence de l'ADNc delta-7Red
L'insert ADNc de pF22 a été sous-cloné au site Not I du vecteur pUC9N dérivé de pUC9 (Pharmacia) dans lequel le site
Eco RI du site multiple de clonage est remplacé par insertion d'un site de restriction Not I tout en conservant la phase de lecture du gène LacZ. Une carte de restriction a été ensuite déterminée (figure 2).D - Determination of the delta-7Red cDNA sequence
The cDNA insert of pF22 was subcloned at the Not I site of the pUC9-derived vector pUC9N (Pharmacia) in which the site
Eco RI of the multiple cloning site is replaced by insertion of a Not I restriction site while retaining the reading phase of the LacZ gene. A restriction map was then determined (Figure 2).

Des fragments de restriction ayant le site externe Not I et les sites internes EcoRI, PvuII ou HindIII respectivement ont été sous-clonés dans le plasmide pBluescript (Stratagène).  Restriction fragments having the NotI external site and the internal EcoRI, PvuII or HindIII sites respectively were subcloned into the plasmid pBluescript (Stratagene).

La séquence nucléotidique a été déterminée par la méthode de
Sanger avec 1'ADN polymérase Sequenase (kit Stratagène) sur les deux brins en utilisant les amorces directe et inverse de pUC9, T3 et T7 de pBluescript ou des amorces spécifiques déduites de la séquence nucléotidique de l'ADNc.The nucleotide sequence was determined by the method of
Sanger with Sequenase DNA polymerase (Stratagene kit) on both strands using pB9, T3 and T7 forward and reverse primers of pBluescript or specific primers deduced from the nucleotide sequence of the cDNA.

La compilation de l'ensemble des séquences obtenues donne la séquence nucléotidique de 1'ADNc delta-7Red d'A. thaliana (SEQ ID NO 1) représentée à la figure 3. Elle comporte 1496 nucléotides se terminant par une séquence de polyadénylation. Elle présente une phase de lecture ouverte débutant par une méthionine initiatrice au nucléotide 76 et se terminant par un codon de terminaison au nucléotide 1366. The compilation of all the sequences obtained gives the nucleotide sequence of the delta-7Red cDNA of A. thaliana (SEQ ID No. 1) shown in Figure 3. It comprises 1496 nucleotides ending in a polyadenylation sequence. It presents an open reading phase starting with a methionine initiator at nucleotide 76 and ending with a termination codon at nucleotide 1366.

I1 en résulte une phase de lecture ouverte de 1290 nucléotides codant pour une protéine de 430 acides aminés. La région codante de l'ADNc delta-7Red code pour la protéine delta-7Red dont la séquence déduite en acides aminés (SEQ ID NO 2) est montrée à la figure 3. La séquence de la protéine comprend 430 acides aminés ayant une masse moléculaire calculée de 49,286 kDa. This results in an open reading phase of 1290 nucleotides encoding a protein of 430 amino acids. The coding region of the delta-7Red cDNA encodes the delta-7Red protein whose deduced amino acid sequence (SEQ ID NO 2) is shown in Figure 3. The protein sequence comprises 430 amino acids having a molecular weight calculated at 49.286 kDa.

Un échantillon de souche E. coli DH5-1 contenant l'ADNc delta-7Red dans le vecteur pUC9N (désigné ADNc delta7red/ pUC9N) a été déposé à la CNCM le 10 février 1995 sous le numéro I-1535.  A sample of E. coli strain DH5-1 containing the delta-7Red cDNA in the pUC9N vector (designated delta7red / pUC9N cDNA) was deposited at the CNCM on February 10, 1995 under the number I-1535.

E - Détermination de la séquence consensus 8EQ ID NO 3
Par recherche informatisée dans les bases de séquences (Genbank et EMBL), il a été mis en évidence que la séquence de la protéine delta-7Red d'A. thaliana présente certaines similarités de séquence avec d'autres stérol réductases, en particulier la stérol C-14 réductase et la stérol C-24(28) réductase de S. cerevisiae décrites par R. T. Lorentz et al.E - Determination of the consensus sequence 8EQ ID NO 3
By computerized search in the bases of sequences (Genbank and EMBL), it has been demonstrated that the sequence of the delta-7Red protein of A. thaliana has some sequence similarities with other sterol reductases, particularly sterol C-14 reductase and S. cerevisiae sterol C-24 (28) reductase described by RT Lorentz et al.

(DNA Cell Biol., 11, 685-692, 1992) et W. Chen et al. (Yeast, 7, 305-308, 1991) respectivement ainsi que le produit du gène sts 1+ de S. pombe décrit par M. Shimanuki et al. (Mol. Biol.(DNA Cell Biol., 11, 685-692, 1992) and W. Chen et al. (Yeast, 7, 305-308, 1991) as well as the S. pombe sts 1+ gene product described by M. Shimanuki et al. (Mol Biol.

Cell, 3, 263-273, 1992) et de la stérol C-14 réductase de
Neurospora crassa (NO X77955 dans la base EMBL). De plus, la protéine delta-7Red montre une similarité avec les 400 acides aminés de l'extrémité C-terminale du récepteur de la lamine B de poulet et avec celle du récepteur humain correspondant décrits par H. J. Worman et al. (J. Cell Biol., 111, 15351542, 1990) et E. Schuler et al. (J. Biol. Chem., 269, 1131211317, 1994).Cell, 3, 263-273, 1992) and sterol C-14 reductase
Neurospora crassa (NO X77955 in the EMBL database). In addition, the delta-7Red protein shows a similarity to the 400 amino acids of the C-terminal end of the chicken Lamin B receptor and the corresponding human receptor described by HJ Worman et al. (J. Cell Biol., 111, 15351542, 1990) and E. Schuler et al. (J. Biol Chem., 269, 1131211317, 1994).

Des alignements d'identité de séquence ont été établis entre la séquence en acides aminés SEQ ID NO 2 déduite de l'ADNc delta-7Red obtenu ci-dessus et celles des trois stérol réductases de levure et des deux récepteurs de lamine B, puis une séquence consensus nouvelle ayant la séquence en acides aminés (SEQ ID NO 3)
Leu Leu Xaa Xaa Gly Trp Xaa Gly Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Tyr 1 5 10 15 dans laquelle Xaa en position 7 est Trp ou Tyr et Xaa en position 12 est His ou Lys, a été définie pour préparer des oligonucléotides utilisables comme amorces pour amplifier par PCR de nouvelles séquences d'ADN génomique ou d'ADNc codant pour une protéine ayant une activité delta-5,7 stérol,delta-7 réductase.Sequence identity alignments were established between the amino acid sequence SEQ ID NO 2 deduced from the delta-7Red cDNA obtained above and those of the three yeast sterol reductases and the two laminin B receptors, followed by new consensus sequence having the amino acid sequence (SEQ ID NO 3)
Leu Leu Xaa Xaa Gly Trp Xaa Gly Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Tyr 1 5 10 15 wherein Xaa at position 7 is Trp or Tyr and Xaa at position 12 is His or Lys, has been defined to prepare oligonucleotides useful as primers for PCR amplification of new genomic DNA or cDNA sequences encoding a protein having delta-5,7 sterol, delta-7 reductase activity.

F - Expression de la protéine delta-7Red dans la levure.F - Expression of the delta-7Red protein in yeast.

a) construction du vecteur d'expression delta-7/V8 inductible dans la levure
La délétion des régions non codantes de 1'ADNc de pF22 a été effectuée par la technique d'amplification PCR en utilisant les oligonucléotides spécifiques suivants 5'CGCGGATCCA TGGCGGAGAC TGTACATTC 3' (SEQ ID NO 4) et 5'CAGGGTACCT CAATAAATTC CCGGAATG 3' (SEQ ID NO 5) qui ont été définis pour introduire un site de restriction
BamH I immédiatement en amont du codon d'initiation et un site Kpn I immédiatement en aval du codon stop.a) construction of the inducible delta-7 / V8 expression vector in yeast
The deletion of the non-coding regions of cFNA from pF22 was performed by the PCR amplification technique using the following specific oligonucleotides 5'CGCGGATCCA TGGCGGAGAC TGTACATTC 3 '(SEQ ID NO 4) and 5'CAGGGTACCT CAATAAATTC CCGGAATG 3' ( SEQ ID NO 5) which have been defined to introduce a restriction site
BamH I immediately upstream of the initiation codon and a Kpn I site immediately downstream of the stop codon.

L'ADNc a été amplifié à partir de 1 ng de plasmide "ADNc delta7red/pUC9N" en présence de 2 unités de Pfu DNA polymérase et 0,2 ssM de chacune des amorces ci-dessus en utilisant les conditions d'amplification suivantes : 94"C, 10s ; 520C, 50s ; 740C, 90s ; 33 cycles avec la trousse PCR de
Stratagène.The cDNA was amplified from 1 ng of plasmid "delta7red cDNA / pUC9N" in the presence of 2 units of Pfu DNA polymerase and 0.2 ssM of each of the above primers using the following amplification conditions: "C, 10s; 520C, 50s; 740C, 90s; 33 cycles with the PCR kit of
Stratagene.

Un fragment de 1300 bp environ a été obtenu, puis digéré par les enzymes de restriction BamH I et Kpn I et inséré aux sites BamH I et Kpn I du vecteur navette E. coli/S. cerevisiae pYeDPl/8-2 (dénommé V8) décrit par C. Cullin et al. A fragment of about 1300 bp was obtained, then digested with restriction enzymes BamH I and Kpn I and inserted at the BamHI and Kpn I sites of the E. coli / S shuttle vector. cerevisiae pYeDP1 / 8-2 (designated V8) described by C. Cullin et al.

(Gene, 65, 203-217, 1988). V8 porte le marqueur de sélection
URA3 et contient une cassette d'expression dans la levure contenant le promoteur GAL1O/CYC1 et la séquence terminateur du gène PGK. Le vecteur ainsi obtenu, dénommé delta-7/V8, permet l'expression inductible par le galactose de la protéine delta-7Red.(Gene, 65, 203-217, 1988). V8 carries the selection marker
URA3 and contains a yeast expression cassette containing the GAL1O / CYC1 promoter and the terminator sequence of the PGK gene. The vector thus obtained, called delta-7 / V8, allows the galactose-inducible expression of the delta-7Red protein.

b) Production de la protéine delta-7red
La souche de levure FY 1679 (Mata) a été transformée avec le plasmide delta-7/V8 obtenu ci-dessus en utilisant la méthode à l'acétate de lithium décrite par D. Gietz et al.b) Production of the delta-7red protein
The yeast strain FY 1679 (Mata) was transformed with the delta-7 / V8 plasmid obtained above using the lithium acetate method described by D. Gietz et al.

(déjà cité).(already cited).

La levure transformée a été cultivée à 270C, en milieu sélectif SGI décrit ci-dessus mais dans lequel la concentration en glucose est de 5 g/l, jusqu'à l'obtention d'une saturation de densité cellulaire (D06oonm=12). La culture est ensuite diluée par addition d'un volume de milieu complet YP (10 g/l en extrait de levure (Difco) et 10 g/l en bactopeptone (Difco)), puis addition d'éthanol (1,5 % v/v) comme source de carbone. Quand la croissance a permis d'atteindre une concentration cellulaire d'au moins 7x107 cellules/ml, l'expression de la delta-7Red a été induite par addition de galactose à la concentration de 20 g/l. The transformed yeast was cultured at 270 ° C., in SGI selective medium described above but in which the glucose concentration was 5 g / l, until a saturation of cell density (OD 6 O 12 = 12) was obtained. The culture is then diluted by addition of a volume of complete YP medium (10 g / l of yeast extract (Difco) and 10 g / l of bactopeptone (Difco)), then addition of ethanol (1.5% v / v) as a carbon source. When growth achieved a cell concentration of at least 7x107 cells / ml, delta-7Red expression was induced by addition of galactose at a concentration of 20 g / l.

L'induction a été aussi réalisée en milieu minimum sélectif SLI, qui correspond au milieu SGI dans lequel le glucose est remplacé par le galactose (20 g/l), jusqu'à l'obtention d'une concentration cellulaire de 2 x 107 cellules/ml. Induction was also performed in SLI selective minimal medium, which corresponds to SGI medium in which glucose is replaced by galactose (20 g / l), until a cell concentration of 2 × 10 7 cells is obtained. / ml.

c) Test enzymatique in vitro de l'activité delta-5,7 stérol, delta-7 réductase
L'expression de la protéine delta-7Red a été mise en évidence en utilisant un test enzymatique décrit par M. Taton et al. (Biochem. Bioph. Res. Commun., 181, 465-473, 1991) mais sans système de régénération du NADPH, avec des préparations cellulaires microsomales ou cytosoliques de la levure induite ci-dessus.c) Enzymatic test in vitro delta-5,7 sterol, delta-7 reductase activity
Expression of the delta-7Red protein was demonstrated using an enzyme assay described by M. Taton et al. (Biochem Bioph., Res., Commun., 181, 465-473, 1991) but without NADPH regeneration system, with microsomal or cytosolic cell preparations of yeast induced above.

Les fractions cellulaires ont été obtenues par cassage mécanique de cellules induites et isolement des fractions par ultracentrifugation selon la méthode décrite par P. Urban et al. (Eur. J. Biochem., 222, 843-850, 1994). Les cellules sont collectées puis lavées deux fois avec le tampon TE-KC1 (Tris HC1 50mM, pH 7,4 ; EDTA lmM, KC1 0,1 M) et remises en suspension dans le tampon de lyse TE-sorbitol 0,6 M. Des billes de verre de 0,45-0,5 mm de diamètre (Braun) sont ajoutées jusqu'à affleurer la surface de la suspension cellulaire que l'on agite ensuite pendant 5 mn à 40C. Le lysat cellulaire en surface est récupéré et les billes de verre sont lavées trois fois avec le tampon de lyse.Le lysat et les lavages sont réunis puis centrifugés à 20.000 g pendant 13 mn à 40C de façon à éliminer les fractions mitochondriales. Le surnageant recueilli est centrifugé pendant 1 h à 100.000 g et à 40C. Le culot qui contient la fraction microsomale et le surnageant qui représente la fraction cytosolique sont recueillis séparément. The cell fractions were obtained by mechanically breaking induced cells and isolating the fractions by ultracentrifugation according to the method described by P. Urban et al. (Eur J. Biochem., 222, 843-850, 1994). The cells are collected and then washed twice with TE-KC1 buffer (50 mM Tris HCl, pH 7.4, 1 mM EDTA, 0.1 M KCl) and resuspended in 0.6 M TE-sorbitol lysis buffer. Glass beads 0.45-0.5 mm in diameter (Braun) are added until flush with the surface of the cell suspension which is then stirred for 5 minutes at 40C. The cell lysate at the surface is recovered and the glass beads are washed three times with the lysis buffer. The lysate and the washes are combined and then centrifuged at 20,000 g for 13 minutes at 40 ° C. in order to eliminate the mitochondrial fractions. The collected supernatant is centrifuged for 1 h at 100,000 g and 40C. The pellet that contains the microsomal fraction and the supernatant that represents the cytosolic fraction are collected separately.

La fraction microsomale ou la fraction cytosolique obtenues sont respectivement incubées pendant 90 mn à 370C dans du tampon Tris/HCl 100 mM à pH 7,3 contenant comme substrat du 7-déhydrocholestérol 150 ssM émulsifié avec du tween 80 (1,5 g/l) et en présence de NADPH 2 mM. Les stérols sont extraits par addition de 3 volumes de mélange méthanoldichlorométhane (50:50, v/v) puis analysés en CPG comparativement aux produits standards. The microsomal fraction or the cytosolic fraction obtained are respectively incubated for 90 min at 370 ° C. in 100 mM Tris / HCl buffer at pH 7.3 containing as substrate 150 μM 7-dehydrocholesterol emulsified with tween 80 (1.5 g / l). ) and in the presence of 2 mM NADPH. The sterols are extracted by adding 3 volumes of methanoldichloromethane (50:50, v / v) and then analyzed by GC compared to standard products.

La formation de cholestérol (TR = 15,887 mn) à partir de 7-déhydrocholestérol (TR = 16,528 mn) est montrée à la figure 4 avec une fraction microsomale (3,5 mg/ml en protéine) obtenue ci-dessus à partir de la levure FY 1679 transformée avec le vecteur delta-7/V8, induite pendant 3 h et dont les stérols endogènes ont des temps de rétention supérieurs (TR = 16,682 mn pour l'ergosta 5-22 diéne 3-ol
TR = 17,249 mn pour l'ergostérol et TR = 17,664 mn pour l'ergosta 5-ène 3-ol).The formation of cholesterol (TR = 15.887 min) from 7-dehydrocholesterol (TR = 16.528 min) is shown in FIG. 4 with a microsomal fraction (3.5 mg / ml protein) obtained above from FIG. yeast FY 1679 transformed with the vector delta-7 / V8, induced for 3 h and whose endogenous sterols have higher retention times (TR = 16.682 min for ergosta 5-22 dienes 3-ol
TR = 17.249 min for ergosterol and TR = 17.664 min for ergosta 5-ene 3-ol).

Ces résultats montrent que la protéine delta-7Red, d'une part est exprimée dans la levure transformée, d'autre part possède une activité delta-S,7 stérol,delta-7 réductase. These results show that delta-7Red protein, on the one hand, is expressed in transformed yeast, on the other hand possesses delta-S, sterol, delta-7 reductase activity.

EXEMPLE 2 : Réduction in vivo de stérols endogènes de levure insaturés en position C-7
Des souches de levure dont les stérols majoritaires ont une double liaison en position C-5,7 ont été transformées avec le vecteur delta-7/V8 obtenu à l'exemple 1, puis cultivées et induites comme indiqué à l'exemple 1. Les stérols endogènes, dont le profil est analysé par CPG, ont été extraits et purifiés par RP-HPLC comme indiqué à l'exemple 1 en utilisant une colonne C18 préparative (100 X 4,6 mm), puis identifiés par IR, W, SM et RMN. Les trois souches suivantes ont été respectivement utilisées - La souche FY1679 décrite à l'exemple 1 - La souche mutant erg5, dénommée PLC 1051, caractérisée par une déficience en stérol C-22 désaturase, qui a été construite par croisement entre la souche FY1679 et la souche originale pol5 décrite par S. W. Molzahn et al. (J. Gen.EXAMPLE 2 In vivo reduction of endogenous yeast sterol unsaturated at position C-7
Yeast strains whose major sterols have a double bond at the C-5.7 position were transformed with the delta-7 / V8 vector obtained in Example 1, and then cultured and induced as indicated in Example 1. The Endogenous sterols, whose profile is analyzed by GC, were extracted and purified by RP-HPLC as indicated in Example 1 using a preparative C18 column (100 X 4.6 mm), then identified by IR, W, SM and NMR. The following three strains were respectively used - the strain FY1679 described in Example 1 - The mutant strain erg5, called PLC 1051, characterized by a sterol deficiency C-22 desaturase, which was constructed by crossing between the strain FY1679 and the original pol5 strain described by SW Molzahn et al. (J. Gen.

Microbiol., 72, 339-348, 1972) et qui accumule de l'ergosta 5,7-diène 3-ol.Microbiol., 72, 339-348, 1972) and which accumulates ergosta 5,7-diene 3-ol.

- La souche double mutant erg4,5, dénommée PLC 1451, caractérisée par une déficience en stérol C-22 désaturase (erg5) et stérol C-24(28) réductase (erg4), a été obtenue par croisement entre la souche FY1679 et une souche pol5 décrite par
S. W. Molzahn et al. (déjà cité) ayant acquis une résistance spontanée à la nystatine au cours d'un criblage systématique de levures à la recherche de mutants de stérols et qui accumule de l'ergosta 5,7,24(28) triène 3-ol. La souche haploïde résultante, qui porte la double mutation erg4, erg5, croît en présence de galactose et de substrat non fermentable et est auxotrophe pour l'uracile, le tryptophane et l'histi- dine. Les souches PLC 1051 et PLC 1451 ont été déposées à la
CNCM le 10 février 1995 sous les numéros I-1536 et I-1537 respectivement.The erg4.5 double mutant strain, called PLC 1451, characterized by a sterol deficiency C-22 desaturase (erg5) and sterol C-24 (28) reductase (erg4), was obtained by crossing between the strain FY1679 and a strain pol5 described by
SW Molzahn et al. (already cited) having acquired spontaneous resistance to nystatin during a systematic screening of yeasts for sterol mutants and which accumulates ergosta 5,7,24 (28) triene 3-ol. The resulting haploid strain, which carries the erg4 double mutation, erg5, grows in the presence of galactose and non-fermentable substrate and is auxotrophic for uracil, tryptophan and histidine. Strains PLC 1051 and PLC 1451 were deposited at the
CNCM February 10, 1995 under the numbers I-1536 and I-1537 respectively.

Les stérols réduits majeurs identifiés respectivement à partir des trois souches transformées ci-dessus sont indiqués dans le tableau suivant
Souche Stérol endogène Stérol endogène initiale majeur initial majeur réduit en C-7
FY 1679 ergosta 5,7,22 triène 3-ol ergosta 5-ène 3-ol
(ergostérol) (dihydrobrassicastérol)
ergosta 5,22 diène 3-ol
(brassicastérol) erg5 ergosta 5,7 diène 3-ol ergosta 5-ène-3-ol
PLC 1051 erg4,5 ergosta 5,7,24(28)triène- ergosta 5,24(28) diène
PLC 1451 3-ol 3-ol (ostréastérol)
EXEMPLE 3 : Production de pregnénolone in vitro par clivage de stérols endogènes de levure réduits en C-7
La production de pregnénolone est réalisée en utilisant le test enzymatique de clivage de la chaîne latérale du cholestérol in vitro décrit par Wada et al. (Arch. Biochem.The major reduced sterols identified respectively from the three strains transformed above are shown in the following table.
Endogenous Sterol strain Endogenous Stol major endogenous initial major major reduced to C-7
FY 1679 ergosta 5,7,22 triene 3-ol ergosta 5-ene 3-ol
(ergosterol) (dihydrobrassicasterol)
ergosta 5,22 diene 3-ol
(brassicasterol) erg5 ergosta 5,7 diene 3-ol ergosta 5-en-3-ol
PLC 1051 erg4,5 ergosta 5,7,24 (28) triene-ergosta 5,24 (28) diene
PLC 1451 3-ol 3-ol (ostreasterol)
EXAMPLE 3 Production of pregnenolone in vitro by cleavage of endogenous sterols of yeasts reduced to C-7
Pregnenolone production is performed using the in vitro cholesterol side chain cleavage enzymatic assay described by Wada et al. (Arch Biochem.

Biophys., 290, 376-380, 1991) dans lequel 260 pM d'un stérol réduit en C-7 obtenu à l'exemple 2 sont incubés dans 150 1 de tampon phosphate 10 mM, pH 7,4, NaCl 100 mM, tween 20 0,3 % en présence de 140 nM d'adrénodoxine réductase, de 1,16 MM d'adrénodoxine et de 0,68 M de cytochrome P450SCC d'origine bovine obtenus à partir de glandes surrénales par exemple selon D. W. Seybert et al., J. Biol. Chem., 254, 12088-12098, 1979.Biophys., 290, 376-380, 1991) in which 260 μM of a reduced C-7 sterol obtained in Example 2 are incubated in 150 l of 10 mM phosphate buffer, pH 7.4, 100 mM NaCl, 0.3% in the presence of 140 nM adrenodoxine reductase, 1.16 MM adrenodoxin and 0.68 M cytochrome P450SCC of bovine origin obtained from the adrenal glands, for example according to DW Seybert et al. J. Biol. Chem., 254, 12088-12098, 1979.

La réaction est déclenchée par addition de 150 UM de
NADPH. Après une incubation de 80 mn à 370C, la réaction est arrêtée par addition d'un volume de mélange méthanol-dichlorométhane (50:50 v/v). Les stérols sont extraits et analysés par CPG comme indiqué à l'exemple 1.The reaction is triggered by addition of 150 UM of
NADPH. After incubation for 80 min at 370 ° C., the reaction is stopped by addition of a volume of methanol-dichloromethane (50:50 v / v). The sterols are extracted and analyzed by GPC as shown in Example 1.

La figure 5 montre respectivement que l'ergosta 5-ène 3-ol (fig. 5A), l'ergosta 5,24(28) diène 3-ol (fig. 5B) ou l'ergosta 5,22 diène 3-ol (fig. 5C) est substrat du cytochrome P450SCC et conduit à un produit ayant un TR identique à celui de la pregnénolone obtenue dans les mêmes conditions par clivage du cholestérol.  Figure 5 shows ergosta 5-ene 3-ol (Figure 5A), ergosta 5,24 (28) diene 3-ol (Figure 5B) or Ergosta 5,22 diene 3-ol, respectively. (Fig. 5C) is a substrate of cytochrome P450SCC and leads to a product having a TR identical to that of pregnenolone obtained under the same conditions by cleavage of cholesterol.

Les résultats obtenus montrent qu'une levure transformée exprimant la delta-7Red accumule des stérols utilisables directement pour préparer de la pregnénolone par oxydation biologique in vitro. The results obtained show that a transformed yeast expressing the delta-7Red accumulates sterols that can be used directly to prepare pregnenolone by biological oxidation in vitro.

EXEMPLE 4 : Construction de souches de levure produisant in vivo la pregnénolone ou son ester acétique
A - Construction de la souche ELRO1 contenant une cassette d'expression pour la delta-7Red d'A. thaliana intégrée dans le locus ADE2 de la souche haploïde FY1679 mating type a (FY1679 Mata) a) Construction du plasmide intégratif pADdelta-7 (pADA7) :
La construction du plasmide pADA7 a été menée comme décrit à la figure 6. Le fragment BglII (2244pb) contenant le gène ADE2 de S. cerevisiae a été isolé du plasmide pASZ 11 (A. Stotz et al., Gene, 95, 91, 1990) et inséré dans le vecteur pBluescriptII KS+ (Stratagène) au site BamHI du site de clonage multiple.EXAMPLE 4 Construction of yeast strains producing in vivo pregnenolone or its acetic ester
A - Construction of strain ELRO1 containing an expression cassette for A-delta-7Red. thaliana integrated in the ADE2 locus of the haploid strain FY1679 mating type a (FY1679 Mata) a) Construction of the integrative plasmid pADdelta-7 (pADA7):
The construction of the plasmid pADA7 was carried out as described in FIG. 6. The BglII fragment (2244bp) containing the S. cerevisiae ADE2 gene was isolated from the plasmid pASZ 11 (A. Stotz et al., Gene, 95, 91, 1990) and inserted into the pBluescriptII KS + vector (Stratagene) at the BamHI site of the multiple cloning site.

Le plasmide obtenu, dénommé pBS-ADE2, a été ensuite linéarisé à son site Stu I unique et déphosphorylé. The resulting plasmid, called pBS-ADE2, was then linearized at its unique Stu I site and dephosphorylated.

Un fragment de 2,44 kb environ contenant le promoteur GAL10/CYC1, la phase codante de la delta-7Red (stérol A7 réductase) et le terminateur PGK (tPGK) a été obtenu à partir du plasmide delta-7/V8, obtenu à l'exemple 1F par la technique de PCR en utilisant comme amorces les oligonucléotides suivants 5' GATTACGCCA AGCTTTTCGA AAC 3' (SEQ ID NO 6) et 5' AGATCTTGAG AAGATGCGGC CAGCAAAAC 3' (SEQ ID NO 7) qui ont été définis pour s'apparier respectivement avec l'extrémité 3' de tPGK et l'extrémité 3' du gène URA3. On a utilisé le plasmide delta-7/V8 comme matrice (80 ng), les oligonucléotides ci-dessus (0,5 pM chacun), la Pfu DNA polymérase native (1 unité dans le tampon recommandé par Stratagène) et les conditions d'amplification suivantes : 35 cycles ; 1 min à 950C ; 5s à 950C ; 30s à 560C ; 4 min 30s à 700C). Le fragment d'amplification obtenu a ensuite été cloné à bouts francs dans le plasmide pBS-ADE2 linéarisé ci-dessus pour donner le plasmide pADA7 dans lequel le fragment NotI
PstI de 4720 pb environ porte le gène ADE2 interrompu par la cassette d'expression de la delta-7Red.A fragment of about 2.44 kb containing the GAL10 / CYC1 promoter, the coding phase of delta-7Red (sterol A7 reductase) and the PGK terminator (tPGK) was obtained from plasmid delta-7 / V8, obtained at Example 1F by the PCR technique using as primers the following oligonucleotides 'GATTACGCCA AGCTTTTCGA AAC 3' (SEQ ID NO 6) and 5 'AGATCTTGAG AAGATGCGGC CAGCAAAAC 3' (SEQ ID NO 7) which have been defined for match respectively with the 3 'end of tPGK and the 3' end of the URA3 gene. The delta-7 / V8 plasmid was used as a template (80 ng), the above oligonucleotides (0.5 μM each), the native Pfu DNA polymerase (1 unit in the Stratagene-recommended buffer) and the conditions of amplification: 35 cycles; 1 min at 950C; 5s at 950C; 30s to 560C; 4 min 30s to 700C). The amplification fragment obtained was then blunt-ended in the plasmid pBS-ADE2 linearized above to give the plasmid pADA7 in which the NotI fragment
Approximately 4720 bp PstI carries the ADE2 gene interrupted by the delta-7Red expression cassette.

b) Intégration chromosomique dans la souche de levure FY1679 Mata :
Le fragment NotI-PstI( 4720 bp), isolé à partir du plasmide pADA7 digéré avec les enzymes de restriction NotI et
PstI, a été introduit dans la levure FY1679 Mata par transformation en utilisant la méthode à l'acétate de lithium décrite par D. Gietz et al. (déjà cité).b) Chromosomal integration in yeast strain FY1679 Mata:
The NotI-PstI fragment (4720 bp), isolated from plasmid pADA7 digested with NotI restriction enzymes and
PstI, was introduced into yeast FY1679 Mata by transformation using the lithium acetate method described by D. Gietz et al. (already cited).

Les transformants ayant intégré ce fragment par recombinaison homologue ont été sélectionnés par leur résistance à la nystatine, ce phénotype étant dû à l'expression de la delta-7Red qui convertit les delta-S,7 stérols de la levure en delta-5 stérols. Transformants that integrated this fragment by homologous recombination were selected by their resistance to nystatin, this phenotype being due to the expression of delta-7Red which converts the delta-S, 7 sterol of yeast into delta-5 sterols.

Les cellules transformées ont été incubées à 280C pendant 4 heures en milieu complet YP décrit à l'exemple 1F contenant du glucose (20 g/l) et supplémenté en adénine (20 mg/l). Elles ont été ensuite concentrées puis étalées sur un milieu minimum SLI-agar (lg/l de bactocasaminoacides ; 7 g/l de "yeast nitrogen base" ; 20 g/l de galactose ; 20 mg/l d'adénine ; 20 g/l d'agar) et incubées pendant une nuit à 280C pour induire l'expression du gène de la delta7Red. L'absence de complémentation en uracile permet de limiter la croissance des cellules.Les clones ont été récupérés, groupés puis étalés sur des boîtes sur un milieu complet YP contenant du galactose (20 g/l), supplémenté en adénine (20 mg/l) et en présence de concentrations croissantes de nystatine (0 pg/ml, 1 pg/ml, 2 ssg/ml, 5 pg/ml, 20 Zg/ml respectivement). Au 4ème jour, une vingtaine de clones ayant poussé à la concentration de 5 ssg/ml en nystatine ont été obtenus. Douze de ces clones ont été repiqués sur des boites en milieu minimum W0 (7g/l de "yeast nitrogen base" sans acides aminés, 20 g/l de glucose) enrichi en uracile, leucine, tryptophane, histidine et adénine (20 mg/l chacun).  Transformed cells were incubated at 280C for 4 hours in complete YP medium described in Example 1F containing glucose (20 g / l) and supplemented with adenine (20 mg / l). They were then concentrated and then spread on a minimum medium SLI-agar (1 g / l of bactocasamino acids, 7 g / l of "yeast nitrogen base", 20 g / l of galactose, 20 mg / l of adenine, 20 g / l of 1 agar) and incubated overnight at 280C to induce expression of the delta7Red gene. The absence of complementation with uracil makes it possible to limit the growth of the cells. The clones were recovered, grouped and then spread on plates on a complete YP medium containing galactose (20 g / l), supplemented with adenine (20 mg / l). ) and in the presence of increasing concentrations of nystatin (0 μg / ml, 1 μg / ml, 2 μg / ml, 5 μg / ml, 20 μg / ml respectively). On day 4, twenty or so clones having grown to a concentration of 5 μg / ml of nystatin were obtained. Twelve of these clones were transplanted to boxes in a minimum medium W0 (7 g / l of "yeast nitrogen base" without amino acids, 20 g / l of glucose) enriched with uracil, leucine, tryptophan, histidine and adenine (20 mg / ml). l each).

L'auxotrophie pour l'adénine due à la disruption du gène
ADE2 a été ensuite confirmée en observant l'absence de croissance sur le milieu minimum W0 décrit ci-dessus enrichi en uracile, leucine, tryptophane, histidine mais dépourvu d'adénine.Auxotrophy for adenine due to gene disruption
ADE2 was then confirmed by observing the absence of growth on the W0 minimum medium described above enriched with uracil, leucine, tryptophan, histidine but devoid of adenine.

La présence de la cassette d'expression dans le génome de la levure a été contrôlée par amplification par PCR à partir de 1'ADN génomique des clones obtenus et en utilisant les amorces ayant les séquences SEQ ID NO 6 et SEQ ID NO 7 ci-dessus. The presence of the expression cassette in the genome of the yeast was monitored by PCR amplification from the genomic DNA of the clones obtained and by using the primers having the sequences SEQ ID No. 6 and SEQ ID No. 7 above. above.

La fonctionnalité du gène delta-7Red intégré a été confirmée par l'analyse par CPG de la composition en stérols accumulés dans la levure et extraits par saponification alcaline selon le mode opératoire décrit à l'exemple 1B avec une colonne capillaire SE 30 de cinq mètres (Alltech). L'analyse montre un profil modifié comprenant des stérols saturés en C-7 lorsque les clones sont cultivés en présence de galactose. La souche obtenue,dénommée ELR0î, accumule de l'ergosta 5 ène 3-ol et de l'ergosta 5,22 diène 3-ol au lieu d'ergosta 5, 7, 22 triène 3-ol (ergostérol),stérol majoritaire de la souche FY1679 initiale comme cela est montré à la figure 7. The functionality of the integrated delta-7Red gene was confirmed by GC analysis of the sterol composition accumulated in yeast and extracted by alkaline saponification according to the procedure described in Example 1B with a capillary column SE 30 of five meters. (Alltech). The analysis shows a modified profile comprising C-7 saturated sterols when the clones are cultured in the presence of galactose. The strain obtained, called ELR01, accumulates ergosta 5 ene 3-ol and ergosta 5,22 diene 3-ol instead of ergosta 5, 7, 22 triene 3-ol (ergosterol), the majority sterol of the original FY1679 strain as shown in Figure 7.

La souche ELR0l ainsi construite exprime le gène de la delta-7Red lorsqu'elle est cultivée en présence de galactose du fait du contrôle transcriptionnel par le promoteur
GAL10/CYC1. Bien que l'unité d'expression pour la delta-7Red ait le même sens de transcription que le gène ADE2, aucune expression de la delta-7Red n'est détectable par analyse de la composition en stérols par CPG lorsque la culture est effectuée en présence de glucose, par suite de la répression du promoteur GAL10/CYC1.The strain ELR01 thus constructed expresses the delta-7Red gene when it is cultured in the presence of galactose because of the transcriptional control by the promoter
GAL10 / CYC1. Although the expression unit for delta-7Red has the same sense of transcription as the ADE2 gene, no expression of delta-7Red is detectable by analysis of the GPC sterol composition when the culture is carried out. presence of glucose, as a result of repression of the GAL10 / CYC1 promoter.

B - Construction de la souche CDRO1 contenant une cassette d'expression pour la forme mature de l'adrénodoxine réductase bovine (ADRm) intégrée entre les loci LEU2 et SPL1 de la souche haploïde FY1679 mating type alpha (mat alpha). B - Construction of the strain CDRO1 containing an expression cassette for the mature form of bovine adrenodoxine reductase (ADRm) integrated between the LEU2 and SPL1 loci of the haploid strain FY1679 mating type alpha (alpha mat).

a) Construction du vecteur navette E. coli-8. cerevisiae V13
Le vecteur V13 correspond au vecteur V8 (C. Cullin et al., déjà cité) qui porte le marqueur de sélection URA3 et une cassette d'expression dans la levure contenant le promo teur GAL10/CYC1 (pG/C) et dans lequel un site SalI (Sa) supplémentaire a été introduit dans le site de clonage multiple, selon le schéma de construction donné à la figure 8.a) Construction of the E. coli-8 shuttle vector. cerevisiae V13
The vector V13 corresponds to the vector V8 (C. Cullin et al., Cited above) which carries the selection marker URA3 and an expression cassette in the yeast containing the promoter GAL10 / CYC1 (pG / C) and in which a Additional SalI (Sa) site was introduced into the multiple cloning site, according to the scheme of construction given in Figure 8.

Le vecteur V8 a été digéré par les enzymes de restriction HindIII et BamHI et le fragment BamHI-HindIII obtenu (1722 pb) contenant le gène URA3 et le promoteur GAL10/CYC1 (noté plus loin "ura-gal"), a été sous-cloné entre les sites correspondants du vecteur pUC18 (Pharmacia) digéré par les enzymes de restriction HindIII et BamHI. The vector V8 was digested with the restriction enzymes HindIII and BamHI and the BamHI-HindIII fragment obtained (1722 bp) containing the URA3 gene and the GAL10 / CYC1 promoter (hereinafter referred to as "ura-gal"), was sub- cloned between the corresponding sites of the vector pUC18 (Pharmacia) digested with restriction enzymes HindIII and BamHI.

Le fragment "ura-gal" a été ensuite amplifié par PCR à partir de 30 ng du plasmide obtenu pUC18/"ura-gal" dénaturé pendant 30s à 950C en utilisant les conditions suivantes : 30 cycles ; 5s à 860C ; 10s à 950C ; 40s à 380C ; 5s à 550C et 2 min à 740C), 2 unités de Taq DNA polymérase (Boehringer) dans le tampon du fabricant et 1ssM de chacune des amorces ayant les séquences nucléotidiques suivantes 5' GGGGATCCGT GGTCGACGTA ATTTAGTGTG TGTATTTGTG TTTGCG 3'
(SEQ ID NO 8) et 5' GTAAAACGAC GGCCAGT 3' (SEQ ID NO 9)
L'amorce SEQ ID NO 8 contient un site BamHI GGATCC identique à celui du fragment "ura-gal", 3 nucléotides consécutifs au site BamHI ne s'hybridant pas à la matrice, un site SalI
GTCGAC et une séquence homologue à celle du promoteur
GAL10/CYC1. L'amorce SEQ ID NO 9 s'apparie à la séquence précédant le site Hind III du site de clonage multiple de pUC18. Le fragment HindIII-BamHI de 1722 pb obtenu après amplification a été digéré par XhoI et Bam HI libérant un fragment de 254 pb contenant le promoteur GAL1O/CYC1 (pG/C) qui a été ensuite sous-cloné dans le vecteur V8 digéré par les enzymes de restriction BamHI et XhoI.The "ura-gal" fragment was then amplified by PCR from 30 ng of the resulting plasmid pUC18 / "ura-gal" denatured for 30s at 950C using the following conditions: 30 cycles; 5s to 860C; 10s to 950C; 40s to 380C; 5s at 550C and 2 min at 740C), 2 units of Taq DNA polymerase (Boehringer) in the manufacturer's buffer and 1ssM of each of the primers having the following nucleotide sequences 5 'GGGGATCCGT GGTCGACGTA ATTTAGTGTG TGTATTTGTG TTTGCG 3'
(SEQ ID NO 8) and 5 'GTAAAACGAC GGCCAGT 3' (SEQ ID NO 9)
The primer SEQ ID No. 8 contains a BamHI GGATCC site identical to that of the "ura-gal" fragment, 3 consecutive nucleotides at the BamHI site not hybridizing to the template, a SalI site.
GTCGAC and a sequence homologous to that of the promoter
GAL10 / CYC1. The primer SEQ ID NO 9 is similar to the sequence preceding the Hind III site of the multiple cloning site of pUC18. The 1722 bp HindIII-BamHI fragment obtained after amplification was digested with XhoI and Bam HI releasing a 254 bp fragment containing the GAL1O / CYC1 promoter (pG / C) which was then subcloned into the vector digested V8 vector. BamHI and XhoI restriction enzymes.

Le vecteur V13 résultant contient les sites de restriction permettant de sous-cloner aisément les ADNc codant pour l'adrénodoxine réductase bovine mature (ADRm), l'adrénodoxine bovine mature(ADXm) et le cytochrome P450SCC bovin. The resulting V13 vector contains the restriction sites for easily subcloning the cDNAs encoding mature bovine adrenodoxine reductase (MBRDA), mature bovine adrenodoxine (ADXm) and bovine cytochrome P450SCC.

A partir du vecteur V13,le vecteur V13-ADR,le vecteur
V13-ADX et le vecteur V13-SCC10 ont été respectivement préparés de la façon suivante
a) Construction du vecteur V13-ADR
Un fragment SalI-KpnI de 1478 pb portant l'ADNc codant pour ADRm a été isolé du plasmide pGBADR-2 décrit à l'exemple 25 de la demande de brevet européen EP 340878 et sous-cloné dans les sites correspondants du vecteur V13 pour donner le vecteur V13-ADR.From the vector V13, the vector V13-ADR, the vector
V13-ADX and the V13-SCC10 vector were respectively prepared as follows
a) Construction of the vector V13-ADR
A 1478 bp SalI-KpnI fragment carrying the cDNA encoding ADRm was isolated from the plasmid pGBADR-2 described in Example 25 of the European Patent Application EP 340878 and subcloned into the corresponding sites of the vector V13 to give the vector V13-ADR.

s > Construction du vecteur V13-ADX
Un fragment SalI BamHI de 390 pb portant l'ADNc codant pour ADXm a été isolé du plasmide pGBADX-1 décrit à l'exemple 23 de la demande de brevet européen EP 340878 et sous cloné dans les sites correspondants du vecteur V13 pour donner le vecteur V13-ADX.s> Vector V13-ADX construction
A 390 bp SalI BamHI fragment carrying the cDNA encoding ADXm was isolated from the plasmid pGBADX-1 described in Example 23 of the European Patent Application EP 340878 and subcloned into the corresponding sites of the vector V13 to give the vector V13-ADX.

y) Construction du vecteur V13-8CC10
Un fragment SalI-EcoRI de 1554 pb portant l'ADNc codant pour P450SCC a été isolé du plamide pGBSCC-10 décrit à l'exemple 6 de la demande de brevet européen EP 340878 et sous-cloné dans les sites correspondants du vecteur V13 pour donner le vecteur V13-SCC10.y) Vector Construction V13-8CC10
A 1554 bp SalI-EcoRI fragment carrying the cDNA encoding P450SCC was isolated from the pGBSCC-10 plam described in Example 6 of the European Patent Application EP 340878 and subcloned into the corresponding sites of the V13 vector to give the vector V13-SCC10.

b) Construction des plasmides intégratifs pCD62-1 et pCD62-2
La construction des plasmides pCD62-1 et pCD62-2 a été menée comme décrit à la figure 9.b) Construction of the Integrative Plasmids pCD62-1 and pCD62-2
The construction of the plasmids pCD62-1 and pCD62-2 was conducted as described in FIG. 9.

a) Construction du plasmide pFL26CD
Un site NotI a été introduit dans le plasmide pFL26 (N.a) Construction of plasmid pFL26CD
A NotI site was introduced into plasmid pFL26 (N.

Bonneaud et al., Yeast, 7, 609-615, 1991), dans la région intergénique séparant le gène leu2 de l'extrémité 5' du gène spll (notée spllA)(C. Kolman et al., J. Bacteriol., 175, 1433, 1993) selon le mode opératoire suivant
Deux fragments d'ADN de 704 pb et 347 pb portant respectivement l'extrémité 5' de leu2 et l'extrémité 3' de Sella ont été synthétisés par PCR à l'aide des amorces ayant les séquences nucléotidiques suivantes 5' TTGAAGGTTC AACATCAATT GATTG 3' (SEQ ID NO 10) et 5' GTGTGGCGGC CGCCTCCTTG TCAATATTAA TGTTAAAG 3'
(SEQ ID NO 11) pour l'amplification du fragment de 704 pb et les séquences nucléotidiques 5' CAAGGAGGCG GCCGCCACAC AAAAAGTTAG GTGT 3' (SEQ ID NO 12) et 5' TCTGCTTCCC TAGAACCTTC TTATG 3' (SEQ ID NO 13) pour l'amplification du fragment de 347 pb.Bonneaud et al., Yeast, 7, 609-615, 1991), in the intergenic region separating the leu2 gene from the 5 'end of the spll gene (denoted spllA) (C. Kolman et al., J. Bacteriol. 175, 1433, 1993) according to the following procedure
Two DNA fragments of 704 bp and 347 bp respectively carrying the 5 'end of leu2 and the 3' end of Sella were synthesized by PCR using primers having the following nucleotide sequences: TTGAAGGTTC AACATCAATT GATTG 3 (SEQ ID NO: 10) and 5 'GTGTGGCGGC CGCCTCCTTG TCAATATTAA TGTTAAAG 3'
(SEQ ID No. 11) for amplification of the 704 bp fragment and the 5 'CAAGGAGGCG GCCGCCACAC AAAAAGTTAG GTGT 3' nucleotide sequences (SEQ ID NO: 12) and TCTGCTTCCC TAGAACCTTC TTATG 3 '(SEQ ID NO: 13) for the amplification of the 347 bp fragment.

Les amorces SEQ ID NO 11 et SEQ ID NO 12 possèdent une séquence GGCGGCCG qui correspond à un site NotI et dans laquelle 3 bases ne s'apparient pas avec la matrice. L'amorce
SEQ ID NO 10 s'apparie à une séquence située 536 pb en amont du codon stop de leu2 et l'amorce SEQ ID NO 13 à une séquence située 194 pb en amont de celui de sella. The primers SEQ ID NO 11 and SEQ ID NO 12 have a sequence GGCGGCCG which corresponds to a NotI site and in which 3 bases do not match the matrix. The primer
SEQ ID NO 10 is related to a sequence located 536 bp upstream of the stop codon of leu2 and the primer SEQ ID NO 13 to a sequence located 194 bp upstream of that of sella.

Les fragments de 704 pb et de 347 pb sont d'abord amplifiés par PCR en utilisant comme matrice le plasmide pFL26 et comme enzyme la Pfu DNA polymérase dans les conditions standards décrites par le fournisseur (Stratagène). The 704 bp and 347 bp fragments are first amplified by PCR using the plasmid pFL26 as template and the Pfu DNA polymerase as enzyme under the standard conditions described by the supplier (Stratagene).

Les deux fragments amplifiés obtenus s'apparient sur 20 pb au niveau des extrémités générées par l'amorce SEQ ID
N 11 (fragment 704 pb) et l'amorce SEQ ID N 12 (fragment 347 pb) à partir de l'extrémité 5' ; ces 20 pb correspondent respectivement aux 20 premiers nucléotides de chacune de ces amorces.The two amplified fragments obtained are paired on 20 bp at the ends generated by the SEQ ID primer.
N 11 (704 bp fragment) and primer SEQ ID N 12 (347 bp fragment) from the 5 'end; these 20 bp correspond respectively to the first 20 nucleotides of each of these primers.

Le produit résultant de l'appariement des fragments d'ADN de 704 pb (1 ng) et de 347 pb (2 ng) a été amplifié en utilisant les amorces SEQ ID N 10 et SEQ ID N 13 et les conditions suivantes : 30 cycles de 10s à 950C, 5s à 600C, 1 min à 450C, 5s à 650C et 2 min à 720C suivis d'un cycle de 7 min à 720C ; 50 pmol de chaque amorce et 1 unité de Pfu DNA polymerase dans 50 p1 de tampon de réaction (Stratagène). Un fragment amplifié de 1031 pb contenant un site de coupure
NotI a été obtenu. Ce fragment a été ensuite digéré par les enzymes BstXI et NsiI et le fragment de 920 pb obtenu, contenant le site NotI, a été inséré à la place du fragment
BstXI-NsiI initial de pFL26 pour donner le plasmide pFL26CD, dont la carte est représentée à la figure 9a.The product resulting from the pairing of the 704 bp (1 ng) and 347 bp (2 ng) DNA fragments was amplified using the primers SEQ ID N 10 and SEQ ID N 13 and the following conditions: 30 cycles from 10s to 950C, 5s to 600C, 1min to 450C, 5s to 650C and 2min to 720C followed by a cycle of 7 min at 720C; 50 pmol of each primer and 1 unit of Pfu DNA polymerase in 50 μl of reaction buffer (Stratagene). An amplified fragment of 1031 bp containing a cleavage site
NotI was obtained. This fragment was then digested with the enzymes BstXI and NsiI and the 920 bp fragment obtained, containing the NotI site, was inserted in place of the fragment.
Initial BstXI-NsiI pFL26 to give the plasmid pFL26CD, whose map is shown in Figure 9a.

p) Construction du plasmide pCD60 - Préparation du plasmide pDP10036
Un fragment SalI-BamHI de 390 pb portant l'ADNc codant pour l'adrénodoxine bovine mature (ADXm) a été isolé du plasmide V13-ADX puis sous-cloné dans les sites SalI-BglII du site de clonage multiple du plasmide pTG10033 qui est flanqué du promoteur inductible GAL10/CYC1 et du terminateur ter PGK.p) Construction of the plasmid pCD60 - Preparation of the plasmid pDP10036
A 390 bp SalI-BamHI fragment carrying the cDNA coding for mature bovine adrenodoxin (ADXm) was isolated from plasmid V13-ADX and then subcloned into the SalI-BglII sites of the multiple cloning site of plasmid pTG10033 which is flanked by the GAL10 / CYC1 inducible promoter and ter ter PGK.

Le plasmide pTG10033, dont la carte est représentée à la figure 18 et qui correspond au vecteur d'expression pTG10031 (figure 17), contenant le promoteur CYC1 et terPGK, dans lequel le promoteur CYC1 a été remplacé par le promoteur
GAL10/CYC1 a été préparé selon le mode opératoire décrit plus loin.The plasmid pTG10033, whose map is shown in FIG. 18 and which corresponds to the expression vector pTG10031 (FIG. 17), containing the CYC1 and terPGK promoter, in which the CYC1 promoter has been replaced by the promoter.
GAL10 / CYC1 was prepared according to the procedure described later.

Le plasmide ainsi obtenu, dénommé pDP10034, porte la cassette d'expression ADX, c'est-à-dire le gène codant pour
ADXm sous le contrôle transcriptionnel de GAL10/CYC1 et terPGK. Par la suite, le terme "cassette d'expression" sera employé pour tout gène sous la dépendance transcriptionnelle de GAL1O/CYC1 et terPGK.The plasmid thus obtained, called pDP10034, carries the expression cassette ADX, that is to say the gene coding for
ADXm under the transcriptional control of GAL10 / CYC1 and terPGK. Subsequently, the term "expression cassette" will be used for any gene under the transcriptional dependence of GAL1O / CYC1 and terPGK.

Un fragment HindIII de 3593 pb portant le marqueur de sélection URA3 et la cassette d'expression ADR a été isolé à partir du plasmide V13-ADR digéré par l'enzyme de restriction Hindili puis inséré dans le site correspondant du plasmide pDP10034 digéré par l'enzyme de restriction HindIII. Le plasmide obtenu, dénommé pDP10036, contient les cassettes d'expression ADX et ADR séparées l'une de l'autre par le marqueur URA3 (figure 9b). A 3593 bp HindIII fragment carrying the selection marker URA3 and the ADR expression cassette was isolated from plasmid V13-ADR digested with HindIII restriction enzyme and then inserted into the corresponding site of plasmid pDP10034 digested with HindIII restriction enzyme. The resulting plasmid, designated pDP10036, contains the ADX and ADR expression cassettes separated from each other by the URA3 marker (FIG. 9b).

- Préparation du plasmide pCD60 :
Le fragment AflIII-AccI de 2770 pb portant la cassette
ADR a été isolé par digestion partielle du plasmide pDP10036 avec les enzymes de restriction AflIII et AccI, rendu bouts francs par traitement avec le fragment de klenow de 1'ADN polymérase I et sous-cloné après ligation à bouts-francs dans le site SmaI du plasmide pBlue-Script KS+ (Stratagène). Dans le plasmide obtenu, dénommé pCD60, la cassette d'expression
ADR est encadrée de part et d'autre d'un site NotI, l'un se situant à 209 pb en amont du site de ligation AflIII/SmaI et provenant du fragment sous-cloné et l'autre provenant du site de clonage multiple (SCM1) de pBlue-Script KS+ (figure 9b).Preparation of plasmid pCD60
The 2770 bp AflIII-AccI fragment carrying the cassette
ADR was isolated by partial digestion of plasmid pDP10036 with restriction enzymes AflIII and AccI, blunted by treatment with the Klenow fragment of DNA polymerase I and subcloned after blunt-end ligation into the SmaI site of the plasmid. plasmid pBlue-Script KS + (Stratagene). In the plasmid obtained, called pCD60, the expression cassette
ADR is framed on either side of a NotI site, one 209 bp upstream from the AflIII / SmaI ligation site and from the subcloned fragment and the other from the multiple cloning site ( SCM1) of pBlue-Script KS + (Figure 9b).

y) Construction des plasmides pCD62-1 et pCD62-2
Le fragment NotI de 2558 pb, isolé à partir du plasmide pCD60 digéré par l'enzyme de restriction NotI, a ensuite été sous-cloné dans le site unique NotI du plasmide pFL26CD.y) Construction of Plasmids pCD62-1 and pCD62-2
The 2558 bp NotI fragment, isolated from the NotI restriction enzyme digested plasmid pCD60, was then subcloned into the unique NotI site of plasmid pFL26CD.

Selon le sens de l'insertion du fragment, deux plasmides ont été obtenus, dénommés pCD62-1 et pCD62-2 (figure 9c).Depending on the direction of insertion of the fragment, two plasmids were obtained, called pCD62-1 and pCD62-2 (Figure 9c).

Dans le plasmide pCD62-1, la cassette d'expression ADR est orientée dans le sens de la transcription du gène leu2 alors que cette orientation est inversée dans le plasmide pCD62-2. In plasmid pCD62-1, the ADR expression cassette is oriented in the direction of transcription of the leu2 gene while this orientation is reversed in the plasmid pCD62-2.

Le plasmide pCD62-1 a été retenu pour les constructions ultérieures. Plasmid pCD62-1 was retained for subsequent constructs.

c) Intégration chromosomique dans la souche de levure FY1679 (Matalpha)
Le plasmide pCD62-1 contient des régions homologues à un locus chromosomique de la souche FY1679. Ces régions correspondent respectivement aux fragments BglII-ClaI de 1060 pb (A), EcoRI-NotI de 707 pb(B) et NotI-BglII de 602 pb (C) indiqués sur la figure 10.c) Chromosomal integration in the yeast strain FY1679 (Matalpha)
Plasmid pCD62-1 contains homologous regions at a chromosomal locus of strain FY1679. These regions correspond respectively to the BglII-ClaI fragments of 1060 bp (A), EcoRI-NotI of 707 bp (B) and NotI-BglII of 602 bp (C) indicated in FIG.

La région correspondant au fragment ClaI-EcoRI de 486 pb du plasmide pCD62-1 a été délétée dans la souche FY1679, impliquant une auxotrophie de cette souche vis-à-vis de la leucine (souche LEU2 )(R. S. Sikorski et al., Genetics, 122, 19, 1989). The region corresponding to the 486 bp ClaI-EcoRI fragment of plasmid pCD62-1 was deleted in strain FY1679, implicating an auxotrophy of this strain with respect to leucine (strain LEU2) (RS Sikorski et al., Genetics , 122, 19, 1989).

Le plasmide pCD62-1 a été linéarisé par digestion avec l'enzyme de restriction XbaI dont le site de coupure est situé à l'extérieur des régions homologues,puis a été introduit par transformation dans la souche FY1679 (Matalpha) en utilisant la méthode à l'acétate de lithium (D. Gietz et al., déjà cité). The plasmid pCD62-1 was linearized by digestion with the restriction enzyme XbaI, whose cleavage site is located outside the homologous regions, and was then introduced by transformation into the strain FY1679 (Matalpha) using the method lithium acetate (D. Gietz et al., already cited).

La capacité de réparation cellulaire de 1'ADN par la levure ("gap repair") et la sélection de recombinants ayant le phénotype LEU2+ ont permis de sélectionner dans un premier temps deux types de recombinants : le ler type est obtenu après recombinaisons homologues au niveau des fragments A et
B, le 2ème type est obtenu après recombinaisons homologues au niveau des fragments A et C. Seul ce dernier type de recombinaison a permis l'intégration de la cassette d'expression ADR en plus de la restauration du phénotype LEU2+.The cell repair capacity of DNA by yeast ("gap repair") and the selection of recombinants having the LEU2 + phenotype made it possible to initially select two types of recombinants: the first type is obtained after homologous recombinations at the level of fragments A and
B, the second type is obtained after homologous recombinations at fragments A and C. Only the latter type of recombination allowed the integration of the expression cassette ADR in addition to the restoration of the phenotype LEU2 +.

Pour sélectionner ce 2ème type de clone, un criblage par
PCR a été réalisé en utilisant l'amorce SEQ ID NO 10 cidessus et l'amorce ayant la séquence nucléotidique suivante 5' TACATTAGGT CCTTTGTAGC 3' (SEQ ID NO 14) de façon à confirmer à la fois la présence et la localisation correcte de la cassette d'expression ADR dans le génome de la souche FY1679 (Matalpha).To select this 2nd type of clone, a screening by
PCR was carried out using the primer SEQ ID No. 10 above and the primer having the following nucleotide sequence 5 'TACATTAGGT CCTTTGTAGC 3' (SEQ ID NO 14) so as to confirm both the presence and the correct location of the ADR expression cassette in the genome of strain FY1679 (Matalpha).

Dans ce criblage, l'amorce SEQ ID NO 14 s'apparie exclusivement à la séquence codante pour ADRm et l'amorce SEQ ID NO 10 s'apparie à une séquence chromosomique (figure 10). In this screening, the primer SEQ ID NO 14 is exclusively related to the coding sequence for ADRm and the primer SEQ ID NO 10 is similar to a chromosomal sequence (FIG. 10).

La réaction d'amplification a été réalisée en utilisant comme matrice 1'ADN génomique (20 ng) isolé de la souche
FY1679 (Matalpha) (C. Hoffman et al., Gene, 57, 267, 1987), la Taq DNA polymérase (1U, Boehringer), 50 pmol de chaque amorce et 30 cycles de PCR (lOs à 950C, 1 min à 550C, 3 min à 720C) dans les conditions standards décrites par le fournisseur.The amplification reaction was performed using as template genomic DNA (20 ng) isolated from the strain
FY1679 (Matalpha) (C.Hoffman et al., Gene, 57, 267, 1987), Taq DNA polymerase (1U, Boehringer), 50 pmol of each primer and 30 cycles of PCR (10s at 950C, 1 min at 550C , 3 min at 720C) under the standard conditions described by the supplier.

L'amplification a conduit à l'isolement d'un fragment de 2,9 kb correspondant au cas où la cassette d'expression a été intégrée. Dans le cas contraire, aucun produit d'amplification n'a été détecté. The amplification led to the isolation of a 2.9 kb fragment corresponding to the case where the expression cassette was integrated. Otherwise, no amplification product has been detected.

La souche FY1679 (Matalpha) ainsi sélectionnée contenant la cassette d'expression ADR intégrée a été dénommée CDRO1.  The strain FY1679 (Matalpha) thus selected containing the integrated ADR expression cassette was named CDRO1.

L'expression d'ADR par cette souche a été mise en évidence à partir de fractions cellulaires cytosoliques préparées selon le protocole décrit à l'exemple 1F, par immunodétection de la protéine reconnue par des anticorps anti-ADR. The expression of ADR by this strain was demonstrated from cytosolic cell fractions prepared according to the protocol described in Example 1F, by immunodetection of the protein recognized by anti-ADR antibodies.

La fonctionnalité de 1'ADR exprimée par la souche CDRO1 a été confirmée dans le test de clivage enzymatique de la chaîne latérale du cholestérol in vitro décrit à l'exemple 3 et dans lequel 1'ADR purifiée (0,28 pmol) a été remplacée par une fraction cellulaire cytosolique de la souche CDRO1 conte nant 100 Mg de protéines totales. Un taux de bioconversion du cholestérol en pregnénolone d'environ 25 % a été observé, comparable à celui obtenu avec 1'ADR purifié. The functionality of the ADR expressed by strain CDRO1 was confirmed in the in vitro cholesterol side chain enzymatic cleavage test described in Example 3 and in which the purified ADR (0.28 pmol) was replaced by a cytosolic cell fraction of the CDRO1 strain containing 100 μg of total proteins. A pregnenolone cholesterol bioconversion rate of about 25% was observed, comparable to that obtained with purified ADR.

C - Construction de la souche diploïde ECO1 coexprimant la delta-7Red d'A. Thaliana et l'ADRm.C - Construction of diploid ECO1 strain coexpressing A-delta-7Red. Thaliana and the ADRm.

La souche diploïde ECO1 a été obtenue par croisement des souches haploïdes CDRO1 et ELRO1 obtenues ci-dessus selon le protocole décrit par G. Sprague et al. (Methods in Enzymology, 194, 77, 1991)
Une première sélection sur milieu minimum WO décrit précédemment, enrichi en uracile, tryptophane et histidine (20 mg/l chacun) mais dépourvu en leucine, a permis d'isoler des clones diploïdes LEU2+ (caractère de prototrophie qui témoigne de la présence de la cassette d'expression ADR). Ces clones ont ensuite été testés pour leur résistance à la nystatine à 5 ssg/ml (caractère de résistance qui témoigne de la présence de la cassette d'expression de la delta-7Red) sur le milieu synthétique solide SLI-agar décrit précédemment.The diploid strain ECO1 was obtained by crossing the haploid strains CDRO1 and ELRO1 obtained above according to the protocol described by G. Sprague et al. (Methods in Enzymology, 194, 77, 1991)
A first selection on minimum medium WO described above, enriched with uracil, tryptophan and histidine (20 mg / l each) but lacking in leucine, made it possible to isolate diploid clones LEU2 + (character of prototrophy which testifies to the presence of the cassette ADR expression). These clones were then tested for their resistance to nystatin at 5 μg / ml (resistance character which testifies to the presence of the delta-7Red expression cassette) on the SLI-agar solid synthetic medium described above.

Une souche, dénommée ECO1, a été ainsi isolée arbitrairement parmi les clones résistants à la nystatine. A strain, called ECO1, was thus arbitrarily isolated from the nystatin-resistant clones.

D - Construction de la souche ECO1/pCD63 productrice de pregnénolone et de pregnénolone 3-acétate.D - Construction of the ECO1 / pCD63 strain producing pregnenolone and pregnenolone 3-acetate.

a) Construction du plasmide d'expression pCD63
La construction du plasmide pCD63 a été menée comme décrit à la figure 11.a) Construction of the expression plasmid pCD63
The construction of the plasmid pCD63 was carried out as described in FIG. 11.

Le fragment NotI de 4961 pb contenant la cassette d'expression ADX, le marqueur de sélection URA3 et la cassette d'expression ADR a été isolé à partir du plasmide pDP10036 préparé ci-dessus et digéré avec l'enzyme de restriction NotI, puis cloné dans le site NotI du site de clonage multiple du plasmide pFL45L (N. Bonneaud et al.,
Yeast, 7, 609, 1991). Le vecteur ainsi obtenu, dénommé pDP10037 est représenté à la figure 11.The 4961 bp NotI fragment containing the ADX expression cassette, the URA3 selection marker and the ADR expression cassette was isolated from the plasmid pDP10036 prepared above and digested with the NotI restriction enzyme, and then cloned. in the NotI site of the multiple cloning site of plasmid pFL45L (N. Bonneaud et al.,
Yeast, 7, 609, 1991). The vector thus obtained, called pDP10037, is represented in FIG.

D'une part, le plasmide pDP10037 a été linéarisé par digestion avec l'enzyme TthlllI dont le site de coupure se situe dans le gène codant pour ADRm. On the one hand, the plasmid pDP10037 was linearized by digestion with the enzyme TthlllI whose cleavage site is in the gene coding for ADRm.

D'autre part, un fragment PvuII-EcoRV de 3476 pb contenant la cassette d'expression P450SCC et l'extrémité 5' du marqueur URA3 a été purifié à partir du plasmide V13-SCC10 obtenu précédemment et digéré avec les enzymes de restriction
PvuII et EcoRV.On the other hand, a 3476 bp PvuII-EcoRV fragment containing the P450SCC expression cassette and the 5 'end of the URA3 label was purified from the previously obtained plasmid V13-SCC10 and digested with the restriction enzymes.
PvuII and EcoRV.

Les deux ADN linéaires respectivement obtenus ont des régions homologues qui correspondent d'une part à l'extrémité 5' du gène URA3 et à GAL10/CYC1, d'autre part à ter PGK comme cela est représenté à la figure lla.  The two linear DNAs respectively obtained have homologous regions which correspond on the one hand to the 5 'end of the URA3 gene and to GAL10 / CYC1, on the other hand to ter PGK as shown in FIG.

Ces deux fragments ont été ensuite introduits dans la souche de levure FY1679 (Mata) par co-transformation par la méthode à l'acétate de lithium (D. Gietz et al., déjà cité). These two fragments were then introduced into the yeast strain FY1679 (Mata) by co-transformation by the lithium acetate method (Gietz et al., Cited above).

La sélection suivante de recombinants prototrophes pour l'uracile et le tryptophane (URA3+, TRPî+), a permis d'isoler des clones dans lesquels la cassure double brin générée par digestion par l'enzyme de restriction TthlllI a été réparée par suite de l'intégration de la cassette d'expression
P450SCC par recombinaison homologue.The following selection of prototrophic recombinants for uracil and tryptophan (URA3 +, TRP1 +), isolated clones in which the double-strand break generated by restriction enzyme digestion TthIII was repaired as a result of integration of the expression cassette
P450SCC by homologous recombination.

La sélection des recombinants (URA3 +, TRP1+) a été réalisée sur le milieu minimum WO enrichi en leucine, histidine et leucine (20 mg/l chacun) mais dépourvu d'uracile et de tryptophane. A partir de 50 clones réunis, 1'ADN total a été extrait par la méthode décrite par C. Hoffman et al., (Gene, 57, 267, 1987), puis introduit par électroporation dans la souche d'E. coli XL1-Blue (Stratagène). Les clones transformés par le plasmide généré par "gap repair" ont été sélectionnés sur le milieu riche LB (tryptone 1 %, extrait de levure 0,5 %, NaCl 1 %) contenant 50 mg/l d'ampicilline. A partir d'un des clones sélectionnés, le plasmide, dénommé pCD63, a été extrait selon la méthode décrite par J. Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, 1989.Le plasmide pCD63 obtenu contient les cassettes d'expression ADX et P450SCC séparées par le marqueur de sélection URA3, comme cela est représenté à la figure îlb. The selection of the recombinants (URA3 +, TRP1 +) was carried out on the minimum medium WO enriched in leucine, histidine and leucine (20 mg / l each) but devoid of uracil and tryptophan. From 50 clones combined, the total DNA was extracted by the method described by C. Hoffman et al., (Gene, 57, 267, 1987), then introduced by electroporation into the E. coli strain. XL1-Blue coli (Stratagene). The clones transformed with the gap repair-generated plasmid were selected on LB rich medium (tryptone 1%, yeast extract 0.5%, NaCl 1%) containing 50 mg / l of ampicillin. From one of the selected clones, the plasmid, called pCD63, was extracted according to the method described by J. Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, 1989. The resulting plasmid pCD63 contains the ADX and P450SCC expression cassettes separated by the selection marker URA3, as shown in Figure 11b.

b) Transformation de la souche ECO1 par le plasmide pCD63
Le plasmide pCD63 a été introduit dans la souche ECO1 obtenue ci-dessus par transformation par la méthode à l'acétate de lithium (D. Gietz et al., déjà décrit). La levure transformée a été ensuite cultivée sur le milieu minimum WO décrit précédemment et dépourvu d'uracile, de tryptophane, d'adénine et de leucine mais supplémenté en histidine (20 mg/l).b) Transformation of the strain ECO1 by the plasmid pCD63
The plasmid pCD63 was introduced into the strain ECO1 obtained above by transformation by the lithium acetate method (Gietz, D. et al., Already described). The transformed yeast was then cultured on the minimum medium WO described above and devoid of uracil, tryptophan, adenine and leucine but supplemented with histidine (20 mg / l).

La souche, dénommée ECOl/pCD63, a été ainsi isolée. Un échantillon de la souche, sous la référence ECOl/pCD63, a été déposé à la CNCM le 10 février 1995 sous le numéro I-1538.  The strain, called ECO1 / pCD63, was thus isolated. A sample of the strain, under the reference ECO1 / pCD63, was deposited at the CNCM on February 10, 1995 under the number I-1538.

c) Production in vivo de pregnénolone et de pregnénolone 3acétate.c) In vivo production of pregnenolone and pregnenolone 3 acetate.

La souche ECOl/pCD63 a été cultivée à 280C en aérobiose (130 t/min) dans un Erlenmeyer de 3 litres jusqu'à ce qu'elle atteigne la phase stationnaire de croissance (D0600 = 12 à 13) dans le milieu sélectif SGI décrit à l'exemple 1A et dans lequel la concentration en glucose est de 5 g/l. La culture est ensuite diluée par addition d'un volume du milieu complet
YP décrit ci-dessus, puis addition d'éthanol (0,5 % v/v) comme source de carbone. Quand une nouvelle phase stationnaire de croissance a été atteinte (D0600 = 12 à 13), du galactose (20 g/l) est ajouté à la culture, sous forme de solution concentrée (500 g/l), de façon à induire simultanément l'expression des gènes codant pour ADXm, ADRm, P450SCC et delta-7 Red qui sont respectivement sous le contrôle du promoteur GAL10/CYC1.The ECO1 / pCD63 strain was grown aerobically at 280C (130 rpm) in a 3 liter Erlenmeyer flask until it reached the stationary growth phase (OD600 = 12-13) in the SGI selective medium described. in Example 1A and in which the glucose concentration is 5 g / l. The culture is then diluted by adding a volume of the complete medium
YP described above, then addition of ethanol (0.5% v / v) as a carbon source. When a new stationary phase of growth has been reached (D0600 = 12 to 13), galactose (20 g / l) is added to the culture as a concentrated solution (500 g / l), so as to simultaneously induce expression of the genes encoding ADXm, ADRm, P450SCC and delta-7 Red which are respectively under the control of the GAL10 / CYC1 promoter.

La co-expression des quatre gènes a été mise en évidence par analyse des stérols accumulés respectivement dans les cellules et dans le surnageant de la culture selon le mode opératoire suivant
Des échantillons de 50 ml de culture sont récoltés après 9 h et 24 h d'induction. Chaque échantillon est centrifugé (4000 g, 10 min, 40C) de façon à séparer les cellules du milieu de culture.The coexpression of the four genes was demonstrated by analysis of the sterols accumulated respectively in the cells and in the supernatant of the culture according to the following procedure.
Samples of 50 ml of culture are harvested after 9 h and 24 h of induction. Each sample is centrifuged (4000 g, 10 min, 40C) so as to separate the cells from the culture medium.

D'une part, les cellules sont lysées par cassage mécanique en présence de billes de verre selon la méthode indiquée à l'exemple 1F. A partir du lysat ainsi obtenu, les stérols intracellulaires sont ensuite extraits par addition d'un volume d'hexane. On the one hand, the cells are lysed by mechanical breaking in the presence of glass beads according to the method indicated in Example 1F. From the lysate thus obtained, the intracellular sterols are then extracted by adding a volume of hexane.

D'autre part, les stérols présents dans le milieu de culture sont extraits directement par addition d'un volume d'hexane. On the other hand, the sterols present in the culture medium are extracted directly by adding a volume of hexane.

La composition en stérols extraits est analysée par CPG comme indiqué à l'exemple 1, comparativement à des produits standards. The extracted sterol composition is analyzed by GC as indicated in Example 1, compared with standard products.

Les résultats obtenus après 9 heures ou après 24 heures d'induction sont montrés respectivement à la figure 12a et à la figure 12b. The results obtained after 9 hours or after 24 hours of induction are shown respectively in Figure 12a and Figure 12b.

Après 9 heures d'induction, la figure 12a montre - dans le lysat cellulaire, la présence d'un composé majoritaire ayant un temps de rétention identique à celui de l'acétate de pregnénolone standard (TR = 11,8 mn) alors qu'un pic seulement très faible est présent au temps de rétention de la pregnénolone (TR = 9,9 mn). De faibles quantités de stérols endogènes de la levure réduits en C-7 (ergosta 5-ène 3-ol et ergosta 5,22 diène 3-ol) sont identifiés respectivement à
TR = 18 mn et TR = 17 mn. La saponification alcaline du lysat cellulaire avant l'analyse conduit à la présence d'un composé majoritaire co-migrant avec la pregnénolone. Ceci permet de confirmer que le composé accumulé ayant un TR de 11,8 mn correspond à l'acétate de pregnénolone.After 9 hours of induction, FIG. 12a shows, in the cell lysate, the presence of a major compound having a retention time identical to that of standard pregnenolone acetate (TR = 11.8 min) while only a very small peak is present at the retention time of pregnenolone (TR = 9.9 min). Small amounts of endogenous yeast sterols reduced to C-7 (ergosta 5-ene 3-ol and ergosta 5,22 diene 3-ol) are identified respectively in
TR = 18 min and TR = 17 min. The alkaline saponification of the cell lysate prior to analysis leads to the presence of a major compound co-migrating with pregnenolone. This confirms that the accumulated compound having a TR of 11.8 minutes corresponds to the pregnenolone acetate.

- dans le milieu de culture, l'absence significative de pregnénolone ou de son acétate.in the culture medium, the significant absence of pregnenolone or its acetate.

Après 24 heures d'induction, la figure 12b montre - dans le lysat cellulaire, la présence de faibles quantités de pregnénolone (TR = 10,2 mn) et d'acétate de pregnénolone (TR = 12 mn) ainsi que de stérols endogènes de la levure réduits (TR = 17 mn et TR = 18 mn). Le cholestérol (TR = 16,2 min) est un standard interne ajouté avant l'extraction.After 24 hours of induction, FIG. 12b shows - in the cell lysate, the presence of small amounts of pregnenolone (TR = 10.2 min) and pregnenolone acetate (TR = 12 min) as well as endogenous sterols of reduced yeast (TR = 17 min and TR = 18 min). Cholesterol (TR = 16.2 min) is an internal standard added before extraction.

- dans le milieu de culture, la présence majoritaire d'acétate de pregnénolone et d'une quantité mineure de pregnénolone.in the culture medium, the majority presence of pregnenolone acetate and a minor amount of pregnenolone.

Des expériences réalisées en parallèle avec la souche
ECO1 transformée par un plasmide contrôle tel que pFL45L déjà cité, n'ont montré aucun pic correspondant à la pregnénolone libre ou sous forme acétate.Experiments carried out in parallel with the strain
ECO1 transformed with a control plasmid such as pFL45L already mentioned, showed no peak corresponding to free pregnenolone or in acetate form.

L'identification des stérols ainsi réalisée montre que la souche de levure ECOl/pCD63 a accumulé de la pregnénolone et de l'acétate de pregnénolone en absence de toute source de stérols exogènes, après induction en présence de galactose avec une production majeure après une induction de 9 heures.  The identification of the sterols thus carried out shows that the yeast strain ECO1 / pCD63 has accumulated pregnenolone and pregnenolone acetate in the absence of any source of exogenous sterols, after induction in the presence of galactose with a major production after induction. 9 hours.

Ces résultats démontrent d'une part la mobilisation efficace des stérols endogènes réduits en position C-7 de la souche ECO1, d'autre part l'extrême efficacité de couplage de la réaction de coupure de la chaîne latérale des stérols endogènes.  These results demonstrate, on the one hand, the effective mobilization of the endogenous sterols reduced at the C-7 position of the ECO1 strain, and, on the other hand, the extreme coupling efficiency of the side-chain cut-off reaction of the endogenous sterols.

TABLEAU RECAPITULATIF DES SOUCHES INTEGREES.

SUMMARY TABLE OF INTEGRATED STRAINS.

Souches <SEP> Locus <SEP> Gène <SEP> Plasmide <SEP> Marqueur <SEP> Gène(s) <SEP> sur <SEP> Marqueurs <SEP> de
<tb> d'intégration <SEP> intégré <SEP> transformant <SEP> plasmidique <SEP> plasmide <SEP> sélection
<tb> CDR01 <SEP> intergénique <SEP> ADRm <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> HIS3, <SEP> URA3,
<tb> (Mata) <SEP> LEU2-SPL1 <SEP> TRP1
<tb> ELR01 <SEP> ADE2 <SEP> delta- <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> ADE2, <SEP> URA3,
<tb> (Mata) <SEP> 7Red <SEP> LEU2, <SEP> HIS3,
<tb> TRP1
<tb> intergénique <SEP> ADRm <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> HIS3, <SEP> URA3,
<tb> EC01 <SEP> LEU2-SPL1 <SEP> delta- <SEP> TRP1
<tb> (diploïde) <SEP> + <SEP> 7Red
<tb> ADE2
<tb> intergénique <SEP> ADRm <SEP> pCD63 <SEP> URA3 <SEP> ADXm <SEP> HIS3
<tb> EC01/ <SEP> LEU2-SPL1 <SEP> delta- <SEP> TRP1 <SEP> P450SCC
<tb> pCD63 <SEP> + <SEP> 7RED
<tb> ADE2
<tb> Prgparation de l'exemple 4 : construction du plasmide pTG10033 1. Dérivé de pUC19 ayant un nouveau site de clonage
multiple
Le vecteur de clonage M13mpl9 (C. Yanish-Peron et al.,
Gene, 33, 103, 1985) a été mutagénisé en utilisant l'oligonu- cléotide suivant 5' GCGCTCAGCG GCCGCTTTCC AGTCG 3' SEQ ID NO 15 pour introduire un site NotI dans la séquence du gène lacI tronqué et donner le plasmide M13TG724.Strains <SEP> Locus <SEP> Gene <SEP> Plasmid <SEP> Marker <SEP> Gene (s) <SEP> on <SEP> Markers <SEP> of
integration <SEP> integration <SEP> transforming <SEP> plasmid <SEP> plasmid <SEP> selection
<tb> intergenic CDR01 <SEP><SEP> ADRm <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> HIS3, <SEP> URA3,
<tb> (Mata) <SEP> LEU2-SPL1 <SEP> TRP1
<tb> ELR01 <SEP> ADE2 <SEP> delta- <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> ADE2, <SEP> URA3,
<tb> (Mata) <SEP> 7Red <SEP> LEU2, <SEP> HIS3,
<tb> TRP1
<tb> Intergenic <SEP> ADRm <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> HIS3, <SEP> URA3,
<tb> EC01 <SEP> LEU2-SPL1 <SEP> delta- <SEP> TRP1
<tb> (diploid) <SEP> + <SEP> 7Red
<tb> ADE2
<tb> Intergenic <SEP> ADRm <SEP> pCD63 <SEP> URA3 <SEP> ADXm <SEP> HIS3
<tb> EC01 / <SEP> LEU2-SPL1 <SEP> delta- <SEP> TRP1 <SEP> P450SCC
<tb> pCD63 <SEP> + <SEP> 7RED
<tb> ADE2
<tb> Preparation of Example 4: Construction of Plasmid pTG10033 1. Derived from pUC19 Having a New Cloning Site
multiple
The cloning vector M13mp19 (C. Yanish-Peron et al.,
Gene, 33, 103, 1985) was mutagenized using the following oligonucleotide 5 'GCGCTCAGCG GCCGCTTTCC AGTCG 3' SEQ ID NO 15 to introduce a NotI site into the truncated lacI gene sequence and yield the plasmid M13TG724.

Un "polylinker" contenant les sites EcoRI, SnaBI et NotI a été ensuite introduit dans le site EcoRI du plasmide
M13TG724 en utilisant les oligonucléotides suivants 5' AATTGCGGCC GCGTACGTAT G 3' SEQ ID NO 16 et 5' AATTCATACG TACGCGGCCG C 3' SEQ ID NO 17 pour donner le plasmide M13TG7244 dans lequel une modification de l'insert a été observée pendant le stade d'amplification. L'insert du plasmide M13TG7244 a la séquence nucléotidique suivante GAATTCATACGTACGCGGCCGCAATTGCGGCCGGTACGTATAATTCACTGGCCGT dans laquelle les sites EcoRI, SnaBI et SstI sont soulignés et la séquence lacZ de pUCl9 est en italique.A "polylinker" containing the EcoRI, SnaBI and NotI sites was then introduced into the EcoRI site of the plasmid
M13TG724 using the following oligonucleotides AATTGCGGCC GCGTACGTAT G 3 'SEQ ID NO 16 and 5' AATTCATACG TACGCGGCCG C 3 'SEQ ID NO 17 to give the plasmid M13TG7244 in which a modification of the insert was observed during the stage of amplification. The insert of plasmid M13TG7244 has the following nucleotide sequence GAATTCATACGTACGCGGCCGCAATTGCGGCCGGTACGTATAATTCACTGGCCGT in which the EcoRI, SnaBI and SstI sites are underlined and the lacZ sequence of pUC19 is italicized.

Après digestion du plasmide M13TG7244 par les enzymes de restriction EcoRI et SstI, un "polylinker" contenant les sites MluI et AvrII a été introduit en utilisant les oligonucléotides suivants 5' CAACGCGTCC TAGG 3' SEQ ID NO 18 et 5' AATTCCTAGG ACGCGTTGAG CT 3' SEQ ID NO 19. After digestion of the plasmid M13TG7244 with the restriction enzymes EcoRI and SstI, a "polylinker" containing the MluI and AvrII sites was introduced using the following oligonucleotides: CAACGCGTCC TAGG 3 'SEQ ID NO 18 and 5' AATTCCTAGG ACGCGTTGAG CT 3 ' SEQ ID NO 19.

Après digestion avec l'enzyme PvuII, le fragment PvuII obtenu a été sous-cloné dans pUC19 (C. Yanish-Perron et al. After digestion with the enzyme PvuII, the PvuII fragment obtained was subcloned into pUC19 (C. Yanish-Perron et al.

déjà cité) pour donner le plasmide pTG7457 (figure 13).already cited) to give the plasmid pTG7457 (FIG. 13).

2. Sous-clonage du terminateur PGK
pUC19 a été digéré avec les enzymes de restriction BamHI et EcoRI et un nouveau "polylinker" BamHI SstI a été introduit en utilisant les oligonucléotides suivants 5' GATCCGCAGA TATCATCTAG ATCCCGGGTA GAT 3' SEQ ID NO 20, 5 AGAGCTCAAG ATCTACCCGG GATCTAGATG ATATCTGCG 3'
SEQ ID NO 21, 5' CTTGAGCTCT ACGCAGCTGG TCGACACCTA GGAG 3' SEQ ID NO 22 et 5' AATTCTCCTA GGTGTCGACC AGCTGCGT 3' SEQ ID NO 23.2. Subcloning the PGK Terminator
pUC19 was digested with BamHI and EcoRI restriction enzymes and a new BamHI SstI "polylinker" was introduced using the following oligonucleotides: GATCCGCAGA TATCATCTAG ATCCCGGGTA GAT 3 'SEQ ID NO 20, AGAGCTCAAG ATCTACCCGG GATCTAGATG ATATCTGCG 3'
SEQ ID NO: 21, 5 'CTTGAGCTCT ACGCAGCTGG TCGACACCTA GGAG 3' SEQ ID NO 22 and 5 'AATTCTCCTA GGTGTCGACC AGCTGCGT 3' SEQ ID NO 23.

Le plasmide pTG7453 a été ainsi obtenu (figure 14) puis a ensuite été digéré par les enzymes de restriction BamHI et
SstI. Les sites du '2polylinker" entre BamHI et SstI ont été introduits dans un dérivé du plasmide pTG7457 obtenu cidessus et digéré par les enzymes de restriction BamHI et
SstI. Le nouveau plasmide obtenu contient les sites PvuII, HindIII, BamHI, EcoRI, XbaI, SmaI, BglII, SstI (=SacI), MluI,
AvrII, EcoRI, SnaBI, NotI, SnaBI, PvuI.The plasmid pTG7453 was thus obtained (FIG. 14) and then was digested with the BamHI restriction enzymes and
SstI. The "2polylinker" sites between BamHI and SstI were introduced into a derivative of the plasmid pTG7457 obtained above and digested with the BamHI restriction enzymes and
SstI. The new plasmid obtained contains the sites PvuII, HindIII, BamHI, EcoRI, XbaI, SmaI, BglII, SstI (= SacI), MluI,
AvrII, EcoRI, SnaBI, NotI, SnaBI, PvuI.

Ce nouveau plasmide a été digéré par les enzymes de restriction BglII et HindIII et un fragment BglII-HindIII contenant le promoteur PGK (R. A. Hitzeman et al., Nucleic
Acids Res., 10, 7791, 1982 ; G. Loison et al., Yeast, 5, 497, 1989) a été inséré dans celui-ci pour donner le plasmide pTG10014 (figure 15).This new plasmid was digested with the restriction enzymes BglII and HindIII and a BglII-HindIII fragment containing the PGK promoter (RA Hitzeman et al., Nucleic
Acids Res., 10, 7791, 1982; G. Loison et al., Yeast, 5, 497, 1989) was inserted therein to give plasmid pTG10014 (FIG. 15).

3. Sous-clonage de promoteurs a) le promoteur CYC1
Les sites du "polylinker" entre BamHI et SstI du plasmide pTG7453 ont été introduits dans un dérivé du plasmide pTG7457 comme indiqué ci-dessus. Le nouveau plasmide obtenu a été clivé par l'enzyme de restriction SnaBI, puis le fragment RsaI-DraI de 456bp du plasmide pEMBL8 (L. Dente et al., Nucleic Acid Res., 11, 1645, 1983) contenant l'origine de réplication du phage fl a été introduit pour donner le plasmide pTG7503.3. Subcloning promoters a) the CYC1 promoter
The "polylinker" sites between BamHI and SstI of plasmid pTG7453 were introduced into a derivative of plasmid pTG7457 as indicated above. The new plasmid obtained was cleaved with the restriction enzyme SnaBI and then the 456bp RsaI-DraI fragment of the plasmid pEMBL8 (L. Dente et al., Nucleic Acid Res., 11, 1645, 1983) containing the origin of replication of the phage fl was introduced to give the plasmid pTG7503.

Le fragment BamHI HindIII de 0,78 kb du plasmide pGBSCC9, préparé dans l'exemple 6 de la demande de brevet européen
EP 0340378 et contenant le promoteur CYC1 de S. cerevisiae, un "polylinker" et le terminateur lactase de K.lactis, a été sous-cloné dans le plasmide pTG7503 digéré avec les enzymes de restriction HindîlI et BamHI pour donner le plasmide pTG10004 (figure 16).The BamHI HindIII fragment of 0.78 kb of the plasmid pGBSCC9, prepared in Example 6 of the European patent application
EP 0340378 and containing the S. cerevisiae CYC1 promoter, a "polylinker" and the lactase terminator of K. lactis, was subcloned into plasmid pTG7503 digested with restriction enzymes HindIII and BamHI to give the plasmid pTG10004 (FIG. 16).

Les sites XhoI et MluI du promoteur CYC1 ont été ensuite éliminés par mutagénèse dirigée de 1'ADN double brin du plasmide pTG10004 en utilisant l'oligonucléotide suivant 5' GCGGATCTGC TCGAAGATTG CCTGCGCGTT GGGCTTGATC 3'
SEQ ID NO 24.The XhoI and MluI sites of the CYC1 promoter were then removed by site-directed mutagenesis of the double-stranded DNA of plasmid pTG10004 using the following oligonucleotide 5 'GCGGATCTGC TCGAAGATTG CCTGCGCGTT GGGCTTGATC 3'
SEQ ID NO 24.

Le plasmide pTG10005 ainsi obtenu a ensuite été digéré par les enzymes de restriction SalI et XhoI puis un site MluI a été introduit en utilisant les oligonucléotides suivants 5' TCGACGGACG CGTGG 3' SEQ ID NO 25 et 5' TCGACCACGC GTCC 3' SEQ ID NO 26 pour donner le plasmide pTG10006. The plasmid pTG10005 thus obtained was then digested with the SalI and XhoI restriction enzymes and then a MluI site was introduced using the following oligonucleotides: TCGACGGACG CGTGG 3 SEQ ID NO 25 and TCGACCACGC GTCC 3 SEQ ID NO 26 to give the plasmid pTG10006.

b) le promoteur GAL1O/CYC1
Le plasmide pYeDPl/8-2 (C. Cullin et al., Gene, 203, 1988) a été ouvert avec l'enzyme de restriction XhoI. Les extrémités cohésives créées ont été remplies à l'aide du fragment de Klenow de 1'ADN polymérase puis le plasmide a été religaturé. Le plasmide pTG10010 ainsi obtenu dans lequel le promoteur GAL1O/CYC1 ne contient plus de site XhoI est utilisé comme matrice pour une amplification par PCR.b) the GAL1O / CYC1 promoter
Plasmid pYeDP1 / 8-2 (Cullin, C. et al., Gene, 203, 1988) was opened with XhoI restriction enzyme. The created sticky ends were filled with the Klenow fragment of DNA polymerase and then the plasmid was religated. The plasmid pTG10010 thus obtained in which the GAL1O / CYC1 promoter no longer contains an XhoI site is used as a template for PCR amplification.

4. Construction du vecteur d'expression pTG10031
La partie restante de la séquence codante de lacZ a été éliminée dans le plasmide pTG7503 par mutagénèse dirigée en utilisant ltoligonucléotide suivant 5' TGGCCGTCGT TTTACTCCTG CGCCTGATGC GGTAT 3' SEQ ID NO 27 pour donner le plasmide pTG7549.4. Construction of the expression vector pTG10031
The remainder of the lacZ coding sequence was removed in plasmid pTG7503 by site-directed mutagenesis using the oligonucleotide according to TGGCCGTCGT TTTACTCCTG CGCCTGATGC GGTAT 3 'SEQ ID NO 27 to give plasmid pTG7549.

Le promoteur LacZ présent dans le plasmide pTG7549 a été ensuite délété en utilisant les oligonucléotides suivants 5' GGCCGCAAAA CCAAA 3' SEQ ID NO 28 et 5' AGCTTTTGGT TTTGC 3' SEQ ID NO 29 qui sont insérés dans le plasmide préalablement digéré par les enzymes de restriction NotI et HindIII et qui restaurent les deux sites pour donner le plasmide pTG7553. The LacZ promoter present in the plasmid pTG7549 was then deleted using the following oligonucleotides: GGCCGCAAAA CCAAA 3 'SEQ ID NO 28 and 5' AGCTTTTGGT TTTGC 3 'SEQ ID NO 29 which are inserted into the plasmid previously digested with the enzymes of restriction NotI and HindIII and which restore the two sites to give the plasmid pTG7553.

Un fragment BamHI MluI contenant le promoteur CYC1 a été obtenu à partir du plasmide pTG10006 digéré par les enzymes de restriction BamHI et MluI et un fragment MluI HindIII contenant le promoteur PGK a été isolé à partir du plasmide pTG10015 digéré par les enzymes de restriction MluI et Hindili. Ces deux fragments ont été ligaturés et le produit de ligature obtenu a été inséré dans le plasmide pTG7553 préalablement digéré par les enzymes de restriction MluI et HindIII.  A BamHI MluI fragment containing the CYC1 promoter was obtained from plasmid pTG10006 digested with BamHI and MluI restriction enzymes and a HindIII fragment containing the PGK promoter was isolated from plasmid pTG10015 digested with MluI restriction enzymes and Hindili. These two fragments were ligated and the ligation product obtained was inserted into the plasmid pTG7553 previously digested with the restriction enzymes MluI and HindIII.

L'oligonucléotide suivant 5' GATCTATCGA TGCGGCCGCG 3' SEQ ID NO 30 hybridé avec l'oligonucléotide suivant 5' CGCGCGCGGC CGCATCGATA 3' SEQ ID NO 31. The following oligonucleotide 5 'GATCTATCGA TGCGGCCGCG 3' SEQ ID NO 30 hybridized with the following oligonucleotide 5 'CGCGCGCGGC CGCATCGATA 3' SEQ ID NO 31.

qui constitue un "linker" BamHI MluI contenant des sites ClaI et NotI, a été ajouté et ligaturé pour donner le vecteur d'expression pTG 10031 (figure 17).which constitutes a BamHI MluI linker containing ClaI and NotI sites, was added and ligated to give the pTG 10031 expression vector (FIG. 17).

Le fragment amplifié par PCR obtenu ci-dessus à partir du plasmide pYeDP1/8-2 a été digéré avec les enzymes de restriction ClaI et SalI puis a été introduit dans le plasmide pTG10031 préalablement digéré avec les mêmes enzymes de restriction pour donner le plasmide pTG10033 (figure 18).  The PCR amplified fragment obtained above from the plasmid pYeDP1 / 8-2 was digested with the restriction enzymes ClaI and SalI and was then introduced into the plasmid pTG10031 previously digested with the same restriction enzymes to give the plasmid pTG10033 (Figure 18).

LISTE DE SEQUENCES (1) INFORMATIONS GENERALES:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: ROUSSEL UCLAF
(B) RUE: 102, Route de Noisy
(C) VILLE: ROMAINVILLE
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 93230
(G) TELEPHONE: 49.91.49.91
(H) TELECOPIE: 49.91.46.10
(ii) TITRE DE L'INVENTION: Sequence d'ADN codant pour une proteine
d'A. thaliana ayant une activite delta-5,7 sterol,delta-7
reductase, proteine delta-7Red, procede de production,
souches de levures transformees, applications.SEQUENCE LIST (1) GENERAL INFORMATION:
(i) DEPOSITOR:
(A) NAME: ROUSSEL UCLAF
(B) STREET: 102, Route de Noisy
(C) CITY: ROMAINVILLE
(E) COUNTRY: FRANCE
(F) POSTAL CODE: 93230
(G) TELEPHONE: 49.91.49.91
(H) FAX: 49.91.46.10
(ii) TITLE OF THE INVENTION: Sequence of DNA encoding a protein
A.. thaliana having a delta-5.7 sterol activity, delta-7
reductase, delta-7Red protein, production method,
transformed yeast strains, applications.

(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 31
(iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release &num;1.0, Version r1.30 (OEB) (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1496 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Arabidopsis thaliana
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:76..1365
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 1:
GTGTGAGTAA TTTAGGTCAA CACAGATCAG AATCTGAGGC TTTGGCCGAG ACGAAGAGAA 60
AAGCAGAAGA AGAAA ATG GCG GAG ACT GTA CAT TCT CCG ATC GTT ACT TAC 111
Met Ala Glu Thr Val His Ser Pro Ile Val Thr Tyr
1 5 10
GCA TCG ATG TTA TCG CTT CTC GCC TTC TGT CCA CCT TTC GTC ATT CTC 159
Ala Ser Met Leu Ser Leu Leu Ala Phe Cys Pro Pro Phe Val Ile Leu
15 20 25
CTA TGG TAC ACA ATG GTT CAT CAG GAT GGT TCT GTT ACT CAG ACC TTT 207
Leu Trp Tyr Thr Met Val His Gln Asp Gly Ser Val Thr Gln Thr Phe
30 35 40
GGC TTC TTT TGG GAG AAT GGA GTT CAA GGA CTT ATC AAC ATA TGG CCA 255
Gly Phe Phe Trp Glu Asn Gly Val Gln Gly Leu Ile Asn Ile Trp Pro
45 50 55 60
AGA CCC ACT TTG ATT GCT TGG AAA ATT ATA TTT TGC TAT GGA GCA TTT 303
Arg Pro Thr Leu Ile Ala Trp Lys Ile Ile Phe Cys Tyr Gly Ala Phe
65 70 75
GAA GCT ATT CTT CAG CTG CTT CTG CCT GGT AAA AGA GTT GAG GGT CCA 351
Glu Ala Ile Leu Gln Leu Leu Leu Pro Gly Lys Arg Val Glu Gly Pro
80 85 90
ATA TCT CCA GCC GGA AAC CGA CCA GTT TAC AAG GCC AAT GGT CTG GCT 399
Ile Ser Pro Ala Gly Asn Arg Pro Val Tyr Lys Ala Asn Gly Leu Ala
95 100 105
GCT TAC TTT GTG ACA CTA GCA ACC CAT CTT GGT CTT TGG TGG TTT GGA 447
Ala Tyr Phe Val Thr Leu Ala Thr His Leu Gly Leu Trp Trp Phe Gly
110 115 120
ATC TTC AAC CCT GCA ATT GTC TAT GAT CAC TTG GGT GAA ATA TTT TCG 495
Ile Phe Asn Pro Ala Ile Val Tyr Asp His Leu Gly Glu Ile Phe Ser 125 130 135 140
GCA CTA ATA TTC GGA AGC TTC ATA TTT TGT GTT TTG TTG TAC ATA AAA 543
Ala Leu Ile Phe Gly Ser Phe Ile Phe Cys Val Leu Leu Tyr Ile Lys
145 150 155
GGC CAT GTT GCA CCT TCA TCA AGT GAC TCT GGT TCA TGT GGT AAC CTA 591
Gly His Val Ala Pro Ser Ser Ser Asp Ser Gly Ser Cys Gly Asn Leu
160 165 170
ATA ATT GAC TTC TAT TGG GGC ATG GAG TTG TAC CCT CGA ATT GGT AAG 639
Ile Ile Asp Phe Tyr Trp Gly Met Glu Leu Tyr Pro Arg Ile Gly Lys
175 180 185
AGC TTT GAC ATC AAG GTG TTT ACT AAT TGC AGA TTC GGA ATG ATG TCT 687
Ser Phe Asp Ile Lys Val Phe Thr Asn Cys Arg Phe Gly Met Met Ser
190 195 200
TGG GCA GTT CTT GCA GTC ACG TAC TGC ATA AAA CAG TAT GAA ATA AAT 735
Trp Ala Val Leu Ala Val Thr Tyr Cys Ile Lys Gln Tyr Glu Ile Asn 205 210 215 220
GGC AAA GTA TCT GAT TCA ATG CTG GTG AAC ACC ATC CTG ATG CTG GTG 783
Gly Lys Val Ser Asp Ser Met Leu Val Asn Thr Ile Leu Met Leu Val
225 230 235
TAT GTC ACA AAA TTC TTC TGG TGG GAA GCT GGT TAT TGG AAC ACC ATG 831
Tyr Val Thr Lys Phe Phe Trp Trp Glu Ala Gly Tyr Trp Asn Thr Met
240 245 250
GAC ATT GCA CAT GAC CGA GCT GGA TTC TAT ATA TGC TGG GGT TGT CTA 879
Asp Ile Ala His Asp Arg Ala Gly Phe Tyr Ile Cys Trp Gly Cys Leu
255 260 265
GTG TGG GTG CCT TCT GTC TAC ACT TCT CCA GGC ATG TAC CTT GTG AAC 927
Val Trp Val Pro Ser Val Tyr Thr Ser Pro Gly Met Tyr Leu Val Asn
270 275 280
CAC CCC GTC GAA CTC GGA ACT CAG TTG GCA ATA TAC ATT CTC GTT GCA 975
His Pro Val Glu Leu Gly Thr Gln Leu Ala Ile Tyr Ile Leu Val Ala 285 290 295 300
GGA ATT CTG TGC ATT TAC ATA AAG TAT GAC TGT GAT AGA CAA AGG CAA 1023
Gly Ile Leu Cys Ile Tyr Ile Lys Tyr Asp Cys Asp Arg Gln Arg Gln
305 310 315
GAG TTC AGG AGG ACA AAC GGG AAA TGT TTG GTT TGG GGA AGA GCC CCG 1071
Glu Phe Arg Arg Thr Asn Gly Lys Cys Leu Val Trp Gly Arg Ala Pro
320 325 330
TCA AAG ATT GTG GCG TCG TAT ACT ACA ACA TCT GGT GAA ACT AAA ACT 1119
Ser Lys Ile Val Ala Ser Tyr Thr Thr Thr Ser Gly Glu Thr Lys Thr
335 340 345
AGT CTT CTC TTA ACG TCT GGA TGG TGG GGA TTG GCT CGT CAT TTC CAT 1167
Ser Leu Leu Leu Thr Ser Gly Trp Trp Gly Leu Ala Arg His Phe His
350 355 360
TAT GTT CCT GAG ATC TTA AGT GCT TTC TTC TGG ACC GTA CCG GCT CTC 1215
Tyr Val Pro Glu Ile Leu Ser Ala Phe Phe Trp Thr Val Pro Ala Leu 365 370 375 380
TTC GAT AAC TTC TTG GCA TAC TTC TAC GTC CTC ACC CTT CTT CTC TTT 1263
Phe Asp Asn Phe Leu Ala Tyr Phe Tyr Val Leu Thr Leu Leu Leu Phe
385 390 395
GAT CGA GCC AAG AGA GAC GAT GAC CGA TGC CGA TCA AAG TAT GGG AAA 1311
Asp Arg Ala Lys Arg Asp Asp Asp Arg Cys Arg Ser Lys Tyr Gly Lys
400 405 410
TAT TGG AAG CTG TAT TGT GAG AAA GTC AAA TAC AGG ATC ATT CCG GGA 1359
Tyr Trp Lys Leu Tyr Cys Glu Lys Val Lys Tyr Arg Ile Ile Pro Gly
415 420 425
ATT TAT TGATTGTAAC GAAGTCTGTT GTTCTCATTT TCTACTTATT ACGTTAATTC 1415
Ile Tyr
430 GAACGTTGGA ATCATCAAAA GACCGAGCCA AAACAAAAAT GCAAATTGAT GCGATAGACA 1475
TTCTTTTGCT GARAARAAAA A 1496 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 430 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 2:
Met Ala Glu Thr Val His Ser Pro Ile Val Thr Tyr Ala Ser Met Leu
1 5 10 15
Ser Leu Leu Ala Phe Cys Pro Pro Phe Val Ile Leu Leu Trp Tyr Thr
20 25 30
Met Val His Gln Asp Gly Ser Val Thr Gln Thr Phe Gly Phe Phe Trp
35 40 45
Glu Asn Gly Val Gln Gly Leu Ile Asn Ile Trp Pro Arg Pro Thr Leu
50 55 60
Ile Ala Trp Lys lie lie Phe Cys Tyr Gly Ala Phe Glu Ala Ile Leu
65 70 75 80
Gln Leu Leu Leu Pro Gly Lys Arg Val Glu Gly Pro Ile Ser Pro Ala
85 90 95
Gly Asn Arg Pro Val Tyr Lys Ala Asn Gly Leu Ala Ala Tyr Phe Val
100 105 110
Thr Leu Ala Thr His Leu Gly Leu Trp Trp Phe Gly Ile Phe Asn Pro
115 120 125
Ala Ile Val Tyr Asp His Leu Gly Glu Ile Phe Ser Ala Leu Ile Phe
130 135 140
Gly Ser Phe Ile Phe Cys Val Leu Leu Tyr Ile Lys Gly His Val Ala 145 150 155 160
Pro Ser Ser Ser Asp Ser Gly Ser Cys Gly Asn Leu Ile Ile Asp Phe
165 170 175
Tyr Trp Gly Met Glu Leu Tyr Pro Arg Ile Gly Lys Ser Phe Asp Ile
180 185 190
Lys Val Phe Thr Asn Cys Arg Phe Gly Met Met Ser Trp Ala Val Leu
195 200 205
Ala Val Thr Tyr Cys Ile Lys Gin Tyr Glu Ile Asn Gly Lys Val Ser
210 215 220
Asp Ser Met Leu Val Asn Thr Ile Leu Met Leu Val Tyr Val Thr Lys 225 230 235 240
Phe Phe Trp Trp Glu Ala Gly Tyr Trp Asn Thr Met Asp Ile Ala His
245 250 255
Asp Arg Ala Gly Phe Tyr Ile Cys Trp Gly Cys Leu Val Trp Val Pro
260 265 270
Ser Val Tyr Thr Ser Pro Gly Met Tyr Leu Val Asn His Pro Val Glu
275 280 285
Leu Gly Thr Gln Leu Ala Ile Tyr Ile Leu Val Ala Gly Ile Leu Cys
290 295 300
Ile Tyr Ile Lys Tyr Asp Cys Asp Arg Gln Arg Gln Glu Phe Arg Arg 305 310 315 320
Thr Asn Gly Lys Cys Leu Val Trp Gly Arg Ala Pro Ser Lys Ile Val
325 330 335
Ala Ser Tyr Thr Thr Thr Ser Gly Glu Thr Lys Thr Ser Leu Leu Leu
340 345 350
Thr Ser Gly Trp Trp Gly Leu Ala Arg His Phe His Tyr Val Pro Glu
355 360 365
Ile Leu Ser Ala Phe Phe Trp Thr Val Pro Ala Leu Phe Asp Asn Phe
370 375 380
Leu Ala Tyr Phe Tyr Val Leu Thr Leu Leu Leu Phe Asp Arg Ala Lys 385 390 395 400
Arg Asp Asp Asp Arg Cys Arg Ser Lys Tyr Giy Lys Tyr Trp Lys Leu
405 410 415
Tyr Cys Glu Lys Val Lys Tyr Arg Ile Ile Pro Gly Ile Tyr
420 425 430 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 15 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE:Peptide
(B) EMPLACEMENT:7
(D) AUTRES INFORMATIONS:/note= "residu 7 = Trp ou Tyr"
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: Peptide
(B) EMPLACEMENT:12
(D) AUTRES INFORMATIONS:/note= "residu 12 = His ou Lys"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
Leu Leu Xaa Xaa Gly Trp Xaa Gly Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Tyr
1 5 10 15 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 29 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique
(A) DESCRIPTION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDE"
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: misc feature
(B) EMPLACEMENT:10..29
(D) AUTRES INFORMATIONS:/note= "SEQUENCE ID No 1 DE 76 A
95"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 4:
CGCGGATCCA TGGCGGAGAC TGTACATTC 29 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 28 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique
(A) DESCRIPTION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDE"
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: misc~feature
(B) EMPLACEMENT:complement (10..28)
(D) AUTRES INFORMATIONS:/note= "SEQUENCE ID No 1
COMPLEMENTAIRE DE 1350 A 1368"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:
CAGGGTACCT CAATAAATTC CCGGAATG 28 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 23 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique
(A) DESCRIPTION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDE"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:
GATTACGCCA AGCTTTTCGA AAC 23 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 7:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 29 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique
(A) DESCRIPTION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDE"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7:
AGATCTTGAG ARGATGCGGC CAGCAAAAC 29 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 8:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 46 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique
(A) DESCRIPTION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDE"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 8:
GGGGATCCGT GGTCGACGTA ATTTAGTGTG TGTATTTGTG TTTGCG 46 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 9:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 17 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique
(A) DESCRIPTION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDE"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 9: GTAAAACGAC GGCCAGT 17 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 10:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 25 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique
(A) DESCRIPTION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDE"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 10: TTGAAGGTTC AACATCAATT GATTG 25 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 11:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 38 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique
(A) DESCRIPTION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDE"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 11:
GTGTGGCGGC CGCCTCCTTG TCAATATTAA TGTTAAAG 38 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 12:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 34 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique
(A) DESCRIPTION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDE"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 12: CAAGGAGGCG GCCGCCACAC AAAAAGTTAG GTGT 34 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 13:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 25 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique
(A) DESCRIPTION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDE"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 13:
TCTGCTTCCC TAGAACCTTC TTATG 25 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 14:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 20 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique
(A) DESCRIPTION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDE"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 14:
TACATTAGGT CCTTTGTAGC 20 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 15:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 25 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique
(A) DESCRIPTION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDE"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 15:
GCGCTCAGCG GCCGCTTTCC AGTCG 25 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 16:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 21 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique
(A) DESCRIPTION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDE"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 16: AATTGCGGCC GCGTACGTAT G 21 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 17:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 21 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique
(A) DESCRIPTION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDE"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 17: AATTCATACG TACGCGGCCG C 21 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 18:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 14 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique
(A) DESCRIPTION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDE"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 18: CAACGCGTCC TAGG 14 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 19:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 22 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique
(A) DESCRIPTION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDE"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 19: AATTCCTAGG ACGCGTTGAG CT 22 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 20:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 33 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique
(A) DESCRIPTION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDE"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 20:
GATCCGCAGA TATCATCTAG ATCCCGGGTA GAT 33 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 21:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 39 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique
(A) DESCRIPTION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDE"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 21: AGAGCTCAAG ATCTACCCGG GATCTAGATG ATATCTGCG 39 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 22:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 34 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique
(A) DESCRIPTION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDE"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 22:
CTTGAGCTCT ACGCAGCTGG TCGACACCTA GGAG 34 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 23:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 28 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique
(A) DESCRIPTION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDE"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 23: AATTCTCCTA GGTGTCGACC AGCTGCGT 28 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 24:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 40 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique
(A) DESCRIPTION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDE"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 24:
GCGGATCTGC TCGAAGATTG CCTGCGCGTT GGGCTTGATC 40 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 25:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 15 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique
(A) DESCRIPTION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDE"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 25:
TCGACGGACG CGTGG 15 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 26:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 14 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique
(A) DESCRIPTION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDE"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 26:
TCGACCACGC GTCC 14 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 27:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 35 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique
(A) DESCRIPTION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDE"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 27:
TGGCCGTCGT TTTACTCCTG CGCCTGATGC GGTAT 35 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 28:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 15 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique
(A) DESCRIPTION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDE"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 28: GGCCGCAAAA CCAAA 15 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 29:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 15 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique
(A) DESCRIPTION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDE"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 29:
AGCTTTTGGT TTTGC 15 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 30:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 20 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique
(A) DESCRIPTION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDE"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 30:
GATCTATCGA TGCGGCCGCG 20 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 31:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 20 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique
(A) DESCRIPTION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDE" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 31:
CGCGCGCGGC CGCATCGATA 20 (iii) NUMBER OF SEQUENCES: 31
(iv) COMPUTER-DEPENDABLE FORM:
(A) SUPPORT TYPE: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS / MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Release &num; 1.0, Version r1.30 (EPO) (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 1:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 1496 base pairs
(B) TYPE: nucleotide
(C) NUMBER OF BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linear
(ii) TYPE OF MOLECULE: cDNA
(vi) ORIGIN:
(A) ORGANISM: Arabidopsis thaliana
(ix) CHARACTERISTIC:
(A) NAME / KEY: CDS
(B) LOCATION: 76..1365
(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
GTGTGAGTAA TTTAGGTCAA CACAGATCAG AATCTGAGGC TTTGGCCGAG ACGAAGAGAA 60
AAGCAGAAGA AGAAA ATG GCG ACT ACT GTA CAT TCT CCG ATC ACT ACT TAC 111
Met Ala Thr Glu Thr His Ser Pro Val Thr Tyr Island
1 5 10
GCA TCG ATG TTA TCG CTT CTC GCC TTC TGT CCA CTC TTC GTC ATT CTC 159
Ala Ser Leu Leu Leu Leu Ala Phe Cys Pro Pro Leu Val Ile Leu
15 20 25
CTA TGG TAC ACA ATG GTT CAG CAT GAT GGT TCT ACT ACT CAG ACC TTT 207
Leu Trp Tyr Thr Met Val His Gln Asp Gly Ser Val Thr Gln Thr Phe
30 35 40
GGC TTC TT TGG GAG AAT GGA GTT CAA GGA CTT ATC AAC ATA TGG CCA 255
Gly Phe Phe Trp Glu Asn Gly Gln Val Gly Leu Ile Asn Ile Trp Pro
45 50 55 60
AGA CCC ACT TTG ATT GCT TGG AAA ATT ATA TT TGC TAT GGA GCA TT 303
Arg Pro Thr Leu Ile Ala Trp Lys Island Isle Phe Cys Tyr Gly Ala Phe
65 70 75
GAA GCT ATT CTT CAG CTG CTT CTG CCT GGT AAA AGM GTT GAG GGT CCA 351
Glu Ala Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Gly Lys Arg Val Glu Gly Pro
80 85 90
ATA TCT CCA GCC GGA AAC CGA CCA GTT TAC AAG GCC AAT GGT CTG GCT 399
Ser Ser Pro Ala Gly Asn Arg Pro Val Tyr Lys Ala Asn Gly Leu Ala
95 100 105
GCT TAC TT GTG ACA CTA GCA ACC CTT CAT GGT CTT TGG TGG TT GGA 447
Ala Tyr Phe Val Thr Ala Thr Leu Leu Gly Leu Trp Trp Phe Gly
110 115 120
ATC TTC AAC CCT GCA ATT GTC TAT GAT CAC TTG GGT GAA ATA TTT TCG 495
Ile Phe Asn Pro Ala Val Tyr Island Asp His Leu Gly Glu Ile Phe Ser 125 130 135 140
GCA CTA ATA TTC GGA AGC TTC ATA TT TGT GTT TTG TTG TAC ATA AAA 543
Ala Leu Ile Phe Gly Ser Phe Ile Phe Cys Val Leu Leu Tire Ile Lys
145 150 155
GGC CAT GTT GCA CCT TCA TCA AGT GAC TCT GGT TCA TGT GGT AAC CTA 591
Gly His Val Ser Ser Ser Ser Ser Asp Ser Ser Gly Ser Gly Asn Leu
160,165 170
ATA ATT GAC TTC TAT TGG ATG GGG GG TTG TAC CCT CGA ATT GGT AAG 639
Isle Ile Asp Phe Tyr Trp Gly Met Glu Leu Tyr Pro Arg Ile Gly Lys
175 180 185
AGC TTT GAC ATC AAG GTG TTT ACT AAT TGC AGA TTC GGA ATG ATG TCT 687
Ser Phe Asp Lys Val Phe Thr Asn Cys Arg Phe Gly Met Met Ser
190 195 200
TGG GCA GTT CTT GCA GTC ACG TAC TGC ATA AAA CAG TAT GAA ATA AAT 735
Trp Ala Valley Leu Ala Val Thr Tyr Cys Island Lys Gln Tyr Glu Island Asn 205 210 215 220
GGC AAA GTA TCT GAT TCA ATG CTG GTG ACC AAC ATC CTG ATG CTG GTG 783
Gly Lys Val Ser Asp Ser Met Leu Val Asn Thr Ile Leu Met Leu Val
225 230 235
TAT GTC ACA AAA TTC TTC TGG TGG GAA GCT TGG TAT TGG AAC ACC ATG 831
Tyr Val Thr Phe Phe Phe Trp Trp Glu Ala Gly Tire Trp Asn Thr Metr
240,245 250
GAC ATT GCA CAT GAC CGA GCT GGA TTC TAT ATA TGC TGG GGT TGT CTA 879
Asp Ala Asp His Asp Arg Ala Gly Phe Tyr Ile Cys Trp Gly Cys Leu
255,260,265
GTG TGG GTG CCT TCT GTC TAC ACT TCT CCA GGC ATG TAC CTT GTG AAC 927
Val Trp Val Pro Ser Val Tyr Ser Ser Pro Gly Met Tyr Leu Val Asn
270 275 280
CAC CCC GTC GAA CTC GGA ACT CAG TTG GCA ATA TAC ATT CTC GTT GCA 975
His Pro Val Glu Leu Gly Thr Gln Leu Ala Tire Island Ile Leu Val Ala 285 290 295 300
GGA ATT CTG TGC ATT TAC ATA TAG TAT GAC TGA GAT AGA CAA AGG CAA 1023
Gly Island Leu Cys Island Tyr Island Lys Tyr Asp Asp Cys Asp Arg Gln Arg Gln
305 310 315
GAG TTC AGG AGG ACA AAC GGG AAA TGT TTG TGT TGG GGA AGA GCC CCG 1071
Glu Phe Arg Arg Thr Asn Gly Lys Cys Leu Val Trp Gly Arg Ala Pro
320 325 330
TCA AAG ATT GTG GCG TCG ACT TAT ACT ACA TCT GGT GAA ACT AAA ACT 1119
Ser Lys Val Ala Ser Ser Ser Thr Thr Thr Ser Ser Gly Glu Thr Lys Thr
335,340,345
AGT CTT CTC TTA ACG TCT GGA TGG TGG GGA TTG GCT CGT CAT TTC CAT 1167
Ser Leu Leu Leu Ser Ser Gly Trp Trp Gly Leu Ala Arg His Phe His
350,355 360
TAT GTT CCT GAG ATC TTA AGT GCT TTC TTC TGG ACC GTA CCG GCT CTC 1215
Tyr Val Pro Glu Island Leu Ser Ala Phe Phe Thr Trp Pro Val Val Ala Leu 365 370 375 380
TTC GAT AAC TTC TTG GCA TAC TTC TAC GTC CTC ACC CTT CTT CTC TT 1263
Phe Asp Asn Phe Leu Ala Tire Phe Tyr Val Leu Leu Leu Leu Leu Phe
385 390 395
GAT CGA GCC AAG AGA GAC GAT GAC CGA TGC CGA TCA AAG TAT GGG AAA 1311
Asp Arg Ala Lys Asp Arg Asp Asp Arg Arg Cys Arg Ser Lys Tyr Gly Lys
400 405 410
TAT TGG AAG CTG TAT TGT GAG AAA GTC AAA TAC AGG ATC ATT CCG GGA 1359
Tyr Trp Lys Leu Tyr Cys Glu Lily Val Lys Tyr Arg Ile Ile Pro Gly
415,420,425
ATT TAT TGATTGTAAC GAAGTCTGTT GTTCTCATTT TCTACTTATT ACGTTAATTC 1415
Tire Island
430 GAACGTTGGA ATCATCAAAA GACCGAGCCA AAACAAAAAT GCAAATTGAT GCGATAGACA 1475
TTCTTTTGCT GARAARAAAA A 1496 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 2:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 430 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) CONFIGURATION: linear
(ii) TYPE OF MOLECULE: protein
(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
Met Ala Glu Thr Val His Ser Pro Val Thr Island Tyr Ala Ser Met Leu
1 5 10 15
Ser Leu Leu Ala Phe Cys Pro Pro Phe Val Ile Leu Leu Trp Tyr Thr
20 25 30
Met Val His Gln Asp Gly Ser Val Thr Gln Thr Phe Gly Phe Phe Trp
35 40 45
Glu Asn Gly Val Gln Gly Leu Ile Asn Ile Trp Pro Arg Pro Thr Leu
50 55 60
Ile Ala Trp Lily binds Phe Cys Tyr Gly Ala Phe Glu Ala Ile Leu
65 70 75 80
Gln Leu Leu Pro Leu Gly Lys Arg Val Pro Glu Gly Pro Pro Ser Ala
85 90 95
Gly Asn Arg Pro Val Tyr Ala Asn Gly Ala Ala Ala Tyr Phe Val
100 105 110
Thr Leu Ala Thr His Leu Gly Leu Trp Trp Phe Gly Ile Phe Asn Pro
115 120 125
Ala Val Tyr Island Asp His Leu Gly Glu Isle Phe Ser Ala Leu Ile Phe
130 135 140
Gly Ser Phe Ile Phe Cys Val Leu Leu Tyr Ile Lys Gly His Val Ala 145 150 155 160
Ser Ser Ser Ser Asp Ser Gly ser Cys Gly Asn Ile Ile Ile Asp Phe
165 170 175
Tyr Trp Gly Met Glu Leu Tyr Pro Arg Island Gly Lys Ser Phe Asp Ile
180 185 190
Lys Val Phe Thr Asn Cys Arg Phe Gly Met Met Ser Trp Ala Val Leu
195 200 205
Ala Val Thr Tyr Cys Island Lys Gin Tyr Glu Island Asn Gly Lys Val Ser
210 215 220
Asp Ser Met Leu Val Asn Thr Ile Leu Met Leu Val Tyr Val Thr Lys 225 230 235 240
Phe Phe Trp Trp Glu Ala Gly Tire Trp Asn Thr Met Asp Ala Island His
245 250 255
Asp Arg Ala Gly Phe Tire Island Cys Trp Gly Cys Val Val Val Val Pro
260,265,270
Ser Val Tyr Ser Ser Pro Gly Met Tyr Val Leu Asn His Pro Val Glu
275 280 285
Leu Gly Thr Gln Leu Ala Ile Tire Ile Leu Val Ala Gly Ile Leu Cys
290,295,300
Tyr Island Lys Tyr Asp Asp Asp Arg Arg Gln Arg Gln Glu Phe Arg Arg 305 310 315 320
Thr Asn Gly Lys Cys Leu Val Trp Gly Arg Ala Ser Ser Val Val
325 330 335
Ala Ser Tyr Thr Thr Thr Ser Gly Glu Thr Lys Thr Ser Leu Leu Leu Leu
340,345,350
Thr Ser Gly Trp Trp Gly Leu Ala Arg His Phe His Tyr Val Pro Glu
355 360 365
Ile Leu Ser Ala Phe Phe Thr Trp Pro Val Ala Leu Phe Asp Asn Phe
370,375,380
Leu Ala Tyr Phe Tyr Val Leu Leu Leu Leu Leu Phe Asp Arg Ala Lys 385 390 395 400
Arg Asp Asp Arg Asp Arg Cys Arg Ser Tyr Lys Tyr Giy Lys Tyr Trp Leu Lys
405 410 415
Tyr Cys Glu Lys Val Lys Tyr Arg Island Ile Pro Gly Ile Tyr
420 425 430 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 3:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 15 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(C) NUMBER OF BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linear
(ii) TYPE OF MOLECULE: peptide
(ix) CHARACTERISTIC:
(A) NAME / KEY: Peptide
(B) LOCATION: 7
(D) OTHER INFORMATION: / note = "residu 7 = Trp or Tyr"
(ix) CHARACTERISTIC:
(A) NAME / KEY: Peptide
(B) LOCATION: 12
(D) OTHER INFORMATION: / note = "residu 12 = His or Lys"
(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
Leu Leu Xaa Xaa Xaa Gly Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 4:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 29 base pairs
(B) TYPE: nucleotide
(C) NUMBER OF BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linear
(ii) MOLECULE TYPE: Other nucleic acid
(A) DESCRIPTION: / desc = "OLIGONUCLEOTIDE"
(ix) CHARACTERISTIC:
(A) NAME / KEY: misc feature
(B) LOCATION: 10..29
(D) OTHER INFORMATION: / note = "SEQUENCE ID NO. 1 OF 76 A
95 "
(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
CGCGGATCCA TGGCGGAGAC TGTACATTC 29 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 5:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 28 base pairs
(B) TYPE: nucleotide
(C) NUMBER OF BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linear
(ii) MOLECULE TYPE: Other nucleic acid
(A) DESCRIPTION: / desc = "OLIGONUCLEOTIDE"
(ix) CHARACTERISTIC:
(A) NAME / KEY: misc ~ feature
(B) LOCATION: complement (10..28)
(D) OTHER INFORMATION: / note = "SEQUENCE ID No 1
SUPPLEMENTARY FROM 1350 TO 1368 "
(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:
CAGGGTACCT CAATAAATTC CCGGAATG 28 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 6:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 23 base pairs
(B) TYPE: nucleotide
(C) NUMBER OF BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linear
(ii) MOLECULE TYPE: Other nucleic acid
(A) DESCRIPTION: / desc = "OLIGONUCLEOTIDE"
(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:
GATTACGCCA AGCTTTTCGA AAC 23 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 7:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 29 base pairs
(B) TYPE: nucleotide
(C) NUMBER OF BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linear
(ii) MOLECULE TYPE: Other nucleic acid
(A) DESCRIPTION: / desc = "OLIGONUCLEOTIDE"
(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 7:
AGATCTTGAG ARGATGCGGC CAGCAAAAC 29 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 8:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 46 base pairs
(B) TYPE: nucleotide
(C) NUMBER OF BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linear
(ii) MOLECULE TYPE: Other nucleic acid
(A) DESCRIPTION: / desc = "OLIGONUCLEOTIDE"
(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 8:
GGGGATCCGT GGTCGACGTA ATTTAGTGTG TGTATTTGTG TTTGCG 46 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 9:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 17 base pairs
(B) TYPE: nucleotide
(C) NUMBER OF BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linear
(ii) MOLECULE TYPE: Other nucleic acid
(A) DESCRIPTION: / desc = "OLIGONUCLEOTIDE"
(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 9: GTAAAACGAC GGCCAGT 17 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 10:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 25 base pairs
(B) TYPE: nucleotide
(C) NUMBER OF BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linear
(ii) MOLECULE TYPE: Other nucleic acid
(A) DESCRIPTION: / desc = "OLIGONUCLEOTIDE"
(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 10: TTGAAGGTTC AACATCAATT GATTG 25 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 11:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 38 base pairs
(B) TYPE: nucleotide
(C) NUMBER OF BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linear
(ii) MOLECULE TYPE: Other nucleic acid
(A) DESCRIPTION: / desc = "OLIGONUCLEOTIDE"
(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 11:
GTGTGGCGGC CGCCTCCTTG TCAATATTAA TGTTAAAG 38 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 12:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 34 base pairs
(B) TYPE: nucleotide
(C) NUMBER OF BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linear
(ii) MOLECULE TYPE: Other nucleic acid
(A) DESCRIPTION: / desc = "OLIGONUCLEOTIDE"
(xi) DESCRIPTION OF SEQUENCE: SEQ ID NO: 12: CAAGGAGGCG GCCGCCACAC AAAAAGTTAG GTGT 34 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 13:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 25 base pairs
(B) TYPE: nucleotide
(C) NUMBER OF BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linear
(ii) MOLECULE TYPE: Other nucleic acid
(A) DESCRIPTION: / desc = "OLIGONUCLEOTIDE"
(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 13:
TCTGCTTCCC TAGAACCTTC TTATG 25 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 14:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 20 base pairs
(B) TYPE: nucleotide
(C) NUMBER OF BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linear
(ii) MOLECULE TYPE: Other nucleic acid
(A) DESCRIPTION: / desc = "OLIGONUCLEOTIDE"
(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 14:
TACATTAGGT CCTTTGTAGC 20 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 15:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 25 base pairs
(B) TYPE: nucleotide
(C) NUMBER OF BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linear
(ii) MOLECULE TYPE: Other nucleic acid
(A) DESCRIPTION: / desc = "OLIGONUCLEOTIDE"
(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 15:
GCGCTCAGCG GCCGCTTTCC AGTCG 25 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 16:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 21 base pairs
(B) TYPE: nucleotide
(C) NUMBER OF BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linear
(ii) MOLECULE TYPE: Other nucleic acid
(A) DESCRIPTION: / desc = "OLIGONUCLEOTIDE"
(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 16: AATTGCGGCC GCGTACGTAT G 21 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 17:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 21 base pairs
(B) TYPE: nucleotide
(C) NUMBER OF BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linear
(ii) MOLECULE TYPE: Other nucleic acid
(A) DESCRIPTION: / desc = "OLIGONUCLEOTIDE"
(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 17: AATTCATACG TACGCGGCCG C 21 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 18:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 14 base pairs
(B) TYPE: nucleotide
(C) NUMBER OF BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linear
(ii) MOLECULE TYPE: Other nucleic acid
(A) DESCRIPTION: / desc = "OLIGONUCLEOTIDE"
(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 18: CAACGCGTCC TAGG 14 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 19:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 22 base pairs
(B) TYPE: nucleotide
(C) NUMBER OF BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linear
(ii) MOLECULE TYPE: Other nucleic acid
(A) DESCRIPTION: / desc = "OLIGONUCLEOTIDE"
(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 19: AATTCCTAGG ACGCGTTGAG CT 22 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 20:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 33 base pairs
(B) TYPE: nucleotide
(C) NUMBER OF BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linear
(ii) MOLECULE TYPE: Other nucleic acid
(A) DESCRIPTION: / desc = "OLIGONUCLEOTIDE"
(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 20:
GATCCGCAGA TATCATCTAG ATCCCGGGTA GAT 33 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 21:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 39 base pairs
(B) TYPE: nucleotide
(C) NUMBER OF BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linear
(ii) MOLECULE TYPE: Other nucleic acid
(A) DESCRIPTION: / desc = "OLIGONUCLEOTIDE"
(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 21: AGAGCTCAAG ATCTACCCGG GATCTAGATG ATATCTGCG 39 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 22:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 34 base pairs
(B) TYPE: nucleotide
(C) NUMBER OF BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linear
(ii) MOLECULE TYPE: Other nucleic acid
(A) DESCRIPTION: / desc = "OLIGONUCLEOTIDE"
(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 22:
CTTGAGCTCT ACGCAGCTGG TCGACACCTA GGAG 34 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 23:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 28 base pairs
(B) TYPE: nucleotide
(C) NUMBER OF BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linear
(ii) MOLECULE TYPE: Other nucleic acid
(A) DESCRIPTION: / desc = "OLIGONUCLEOTIDE"
(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 23: AATTCTCCTA GGTGTCGACC AGCTGCGT 28 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 24:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 40 base pairs
(B) TYPE: nucleotide
(C) NUMBER OF BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linear
(ii) MOLECULE TYPE: Other nucleic acid
(A) DESCRIPTION: / desc = "OLIGONUCLEOTIDE"
(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 24:
GCGGATCTGC TCGAAGATTG CCTGCGCGTT GGGCTTGATC 40 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 25:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 15 base pairs
(B) TYPE: nucleotide
(C) NUMBER OF BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linear
(ii) MOLECULE TYPE: Other nucleic acid
(A) DESCRIPTION: / desc = "OLIGONUCLEOTIDE"
(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 25:
TCGACGGACG CGTGG 15 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 26:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 14 base pairs
(B) TYPE: nucleotide
(C) NUMBER OF BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linear
(ii) MOLECULE TYPE: Other nucleic acid
(A) DESCRIPTION: / desc = "OLIGONUCLEOTIDE"
(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 26:
TCGACCACGC GTCC 14 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 27:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 35 base pairs
(B) TYPE: nucleotide
(C) NUMBER OF BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linear
(ii) MOLECULE TYPE: Other nucleic acid
(A) DESCRIPTION: / desc = "OLIGONUCLEOTIDE"
(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 27:
TGGCCGTCGT TTTACTCCTG CGCCTGATGC GGTAT 35 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 28:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 15 base pairs
(B) TYPE: nucleotide
(C) NUMBER OF BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linear
(ii) MOLECULE TYPE: Other nucleic acid
(A) DESCRIPTION: / desc = "OLIGONUCLEOTIDE"
(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 28: GGCCGCAAAA CCAAA 15 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 29:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 15 base pairs
(B) TYPE: nucleotide
(C) NUMBER OF BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linear
(ii) MOLECULE TYPE: Other nucleic acid
(A) DESCRIPTION: / desc = "OLIGONUCLEOTIDE"
(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 29:
AGCTTTTGGT TTTGC 15 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 30:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 20 base pairs
(B) TYPE: nucleotide
(C) NUMBER OF BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linear
(ii) MOLECULE TYPE: Other nucleic acid
(A) DESCRIPTION: / desc = "OLIGONUCLEOTIDE"
(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 30:
GATCTATCGA TGCGGCCGCG 20 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 31:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 20 base pairs
(B) TYPE: nucleotide
(C) NUMBER OF BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linear (ii) MOLECULE TYPE: Other nucleic acid
(A) DESCRIPTION: / desc = "OLIGONUCLEOTIDE" (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 31:
CGCGCGCGGC CGCATCGATA 20

Claims (37)

REVENDICATIONS 1) Séquence d'acide nucléique contenant une séquence codant pour une protéine ayant une activité delta-5,7 stérol,delta-7 réductase, ledit acide nucléique étant un ADN ou un ARN. 1. A nucleic acid sequence containing a sequence encoding a protein having a delta-5,7 sterol, delta-7 reductase activity, said nucleic acid being a DNA or an RNA. 2) Séquence d'acide nucléique selon la revendication 1 dans laquelle l'acide nucléique est un ADNc.The nucleic acid sequence of claim 1 wherein the nucleic acid is a cDNA. 3) Séquence d'ADNc selon la revendication 2 dans laquelle la séquence codante code pour une protéine d'A. thaliana ayant une activité delta-5,7 stérol,delta-7 réductase et ayant la séquence nucléotidique de la séquence SEQ ID NO 13) cDNA sequence according to claim 2 wherein the coding sequence codes for an A protein. thaliana having a delta-5,7 sterol, delta-7 reductase activity and having the nucleotide sequence of the sequence SEQ ID No. 1 GTGTGAGTAA TTTAGGTCAA CACAGATCAG AATCTGAGGC TTTGGCCGAG ACGAAGAGAA 60GTGTGAGTAA TTTAGGTCAA CACAGATCAG AATCTGAGGC TTTGGCCGAG ACGAAGAGAA 60 AAGCAGAAGA AGAAA ATG GCG GAG ACT GTA CAT TCT CCG ATC GTT ACT TAC 111AAGCAGAAGA AGAAA ATG GCG ACT ACT GTA CAT TCT CCG ATC ACT ACT TAC 111 Met Ala Glu Thr Val His Ser Pro Ile Val Thr Tyr Met Ala Thr Glu Thr His Ser Pro Val Thr Tyr Island 1 5 10 1 5 10 GCA TCG ATG TTA TCG CTT CTC GCC TTC TGT CCA CCT TTC GTC ATT CTC 159GCA TCG ATG TTA TCG CTT CTC GCC TTC TGT CCA CTC TTC GTC ATT CTC 159 Ala Ser Met Leu Ser Leu Leu Ala Phe Cys Pro Pro Phe Val Ile LeuAla Ser Leu Leu Leu Leu Ala Phe Cys Pro Pro Leu Val Ile Leu 15 20 25 15 20 25 CTA TGG TAC ACA ATG GTT CAT CAG GAT GGT TCT GTT ACT CAG ACC TTT 207CTA TGG TAC ACA ATG GTT CAG CAT GAT GGT TCT ACT ACT CAG ACC TTT 207 Leu Trp Tyr Thr Met Val His Gln Asp Gly Ser Val Thr Gln Thr PheLeu Trp Tyr Thr Met Val His Gln Asp Gly Ser Val Thr Gln Thr Phe 30 35 40 30 35 40 GGC TTC TTT TGG GAG AAT GGA GTT CAA GGA CTT ATC AAC ATA TGG CCA 255GGC TTC TT TGG GAG AAT GGA GTT CAA GGA CTT ATC AAC ATA TGG CCA 255 Gly Phe Phe Trp Glu Asn Gly Val Gln Gly Leu Ile Asn Ile Trp ProGly Phe Phe Trp Glu Asn Gly Gln Val Gly Leu Ile Asn Ile Trp Pro 45 50 55 60 45 50 55 60 AGA CCC ACT TTG ATT GCT TGG AAA ATT ATA TTT TGC TAT GGA GCA TTT 303AGA CCC ACT TTG ATT GCT TGG AAA ATT ATA TT TGC TAT GGA GCA TT 303 Arg Pro Thr Leu Ile Ala Trp Lys Ile Ile Phe Cys Tyr Gly Ala PheArg Pro Thr Leu Ile Ala Trp Lys Island Isle Phe Cys Tyr Gly Ala Phe 65 70 75 65 70 75 GAA GCT ATT CTT CAG CTG CTT CTG CCT GGT AAA AGA GTT GAG GGT CCA 351GAA GCT ATT CTT CAG CTG CTT CTG CCT GGT AAA AGM GTT GAG GGT CCA 351 Glu Ala Ile Leu Gln Leu Leu Leu Pro Gly Lys Arg Val Glu Gly ProGlu Ala Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Gly Lys Arg Val Glu Gly Pro 80 85 90 80 85 90 ATA TCT CCA GCC GGA AAC CGA CCA GTT TAC AAG GCC AAT GGT CTG GCT 399ATA TCT CCA GCC GGA AAC CGA CCA GTT TAC AAG GCC AAT GGT CTG GCT 399 Ile Ser Pro Ala Gly Asn Arg Pro Val Tyr Lys Ala Asn Gly Leu AlaSer Ser Pro Ala Gly Asn Arg Pro Val Tyr Lys Ala Asn Gly Leu Ala 95 100 105  95 100 105 GCT TAC TTT GTG ACA CTA GCA ACC CAT CTT GGT CTT TGG TGG TTT GGA 447GCT TAC TT GTG ACA CTA GCA ACC CTT CAT GGT CTT TGG TGG TT GGA 447 Ala Tyr Phe Val Thr Leu Ala Thr His Leu Gly Leu Trp Trp Phe GlyAla Tyr Phe Val Thr Ala Thr Leu Leu Gly Leu Trp Trp Phe Gly 110 115 120 110 115 120 ATC TTC AAC CCT GCA ATT GTC TAT GAT CAC TTG GGT GAA ATA TTT TCG 495 île Phe Asn Pro Ala Ile Val Tyr Asp His Leu Gly Glu Ile Phe Ser 125 130 135 140ATC TTC AAC CCT GCA ATT GTC TAT GAT CAC GGT GAA TT TT TT TCG 495 Phe Asn Island Pro Ala Val Tyr Asp Asp Island Leu Gly Glu Ile Phe Ser 125 130 135 140 GCA CTA ATA TTC GGA AGC TTC ATA TTT TGT GTT TTG TTG TAC ATA AAA 543GCA CTA ATA TTC GGA AGC TTC ATA TT TGT GTT TTG TTG TAC ATA AAA 543 Ala Leu Ile Phe Gly Ser Phe Ile Phe Cys Val Leu Leu Tyr Ile LysAla Leu Ile Phe Gly Ser Phe Ile Phe Cys Val Leu Leu Tire Ile Lys 145 150 155 145 150 155 GGC CAT GTT GCA CCT TCA TCA AGT GAC TCT GGT TCA TGT GGT AAC CTA 591GGC CAT GTT GCA CCT TCA TCA AGT GAC TCT GGT TCA TGT GGT AAC CTA 591 Gly His Val Ala Pro Ser Ser Ser Asp Ser Gly Ser Cys Gly Asn LeuGly His Val Ser Ser Ser Ser Ser Asp Ser Ser Gly Ser Gly Asn Leu 160 165 170 160,165 170 ATA ATT GAC TTC TAT TGG GGC ATG GAG TTG TAC CCT CGA ATT GGT AAG 639ATA ATT GAC TTC TAT TGG ATG GGG GG TTG TAC CCT CGA ATT GGT AAG 639 Ile Ile Asp Phe Tyr Trp Gly Met Glu Leu Tyr Pro Arg Ile Gly LysIsle Ile Asp Phe Tyr Trp Gly Met Glu Leu Tyr Pro Arg Ile Gly Lys 175 180 185 175 180 185 AGC TTT GAC ATC AAG GTG TTT ACT AAT TGC AGA TTC GGA ATG ATG TCT 687AGC TTT GAC ATC AAG GTG TTT ACT AAT TGC AGA TTC GGA ATG ATG TCT 687 Ser Phe Asp Ile Lys Val Phe Thr Asn Cys Arg Phe Gly Met Met SerSer Phe Asp Lys Val Phe Thr Asn Cys Arg Phe Gly Met Met Ser 190 195 200 190 195 200 TGG GCA GTT CTT GCA GTC ACG TAC TGC ATA AAA CAG TAT GAA ATA AAT 735TGG GCA GTT CTT GCA GTC ACG TAC TGC ATA AAA CAG TAT GAA ATA AAT 735 Trp Ala Val Leu Ala Val Thr Tyr Cys Ile Lys Gln Tyr Glu Ile Asn 205 210 215 220Trp Ala Valley Leu Ala Val Thr Tyr Cys Island Lys Gln Tyr Glu Island Asn 205 210 215 220 GGC AAA GTA TCT GAT TCA ATG CTG GTG AAC ACC ATC CTG ATG CTG GTG 783GGC AAA GTA TCT GAT TCA ATG CTG GTG ACC AAC ATC CTG ATG CTG GTG 783 Gly Lys Val Ser Asp Ser Met Leu Val Asn Thr Ile Leu Met Leu ValGly Lys Val Ser Asp Ser Met Leu Val Asn Thr Ile Leu Met Leu Val 225 230 235 225 230 235 TAT GTC ACA AAA TTC TTC TGG TGG GAA GCT GGT TAT TGG AAC ACC ATG 831TAT GTC ACA AAA TTC TTC TGG TGG GAA GCT TGG TAT TGG AAC ACC ATG 831 Tyr Val Thr Lys Phe Phe Trp Trp Glu Ala Gly Tyr Trp Asn Thr MetTyr Val Thr Phe Phe Phe Trp Trp Glu Ala Gly Tire Trp Asn Thr Metr 240 245 250 240,245 250 GAC ATT GCA CAT GAC CGA GCT GGA TTC TAT ATA TGC TGG GGT TGT CTA 879GAC ATT GCA CAT GAC CGA GCT GGA TTC TAT ATA TGC TGG GGT TGT CTA 879 Asp Ile Ala His Asp Arg Ala Gly Phe Tyr Ile Cys Trp Gly Cys LeuAsp Ala Asp His Asp Arg Ala Gly Phe Tyr Ile Cys Trp Gly Cys Leu 255 260 265 255,260,265 GTG TGG GTG CCT TCT GTC TAC ACT TCT CCA GGC ATG TAC CTT GTG AAC 927GTG TGG GTG CCT TCT GTC TAC ACT TCT CCA GGC ATG TAC CTT GTG AAC 927 Val Trp Val Pro Ser Val Tyr Thr Ser Pro Gly Met Tyr Leu Val AsnVal Trp Val Pro Ser Val Tyr Ser Ser Pro Gly Met Tyr Leu Val Asn 270 275 280  270 275 280 CAC CCC GTC GAA CTC GGA ACT CAG TTG GCA ATA TAC ATT CTC GTT GCA 975CAC CCC GTC GAA CTC GGA ACT CAG TTG GCA ATA TAC ATT CTC GTT GCA 975 His Pro Val Glu Leu Gly Thr Gln Leu Ala Ile Tyr Ile Leu Val Ala 285 290 295 300His Pro Val Glu Leu Gly Thr Gln Leu Ala Tire Island Ile Leu Val Ala 285 290 295 300 GGA ATT CTG TGC ATT TAC ATA AAG TAT GAC TGT GAT AGA CAA AGG CAA 1023GGA ATT CTG TGC ATT TAC ATA TAG TAT GAC TGA GAT AGA CAA AGG CAA 1023 Gly Ile Leu Cys Ile Tyr Ile Lys Tyr Asp Cys Asp Arg Gln Arg Gln Gly Island Leu Cys Island Tyr Island Lys Tyr Asp Asp Cys Asp Arg Gln Arg Gln 305 310 315 305 310 315 GAG TTC AGG AGG ACA AAC GGG AAA TGT TTG GTT TGG GGA AGA GCC CCG 1071GAG TTC AGG AGG ACA AAC GGG AAA TGT TTG TGT TGG GGA AGA GCC CCG 1071 Glu Phe Arg Arg Thr Asn Gly Lys Cys Leu Val Trp Gly Arg Ala ProGlu Phe Arg Arg Thr Asn Gly Lys Cys Leu Val Trp Gly Arg Ala Pro 320 325 330 320 325 330 TCA AAG ATT GTG GCG TCG TAT ACT ACA ACA TCT GGT GAA ACT AAA ACT 1119TCA AAG ATT GTG GCG TCG ACT TAT ACT ACA TCT GGT GAA ACT AAA ACT 1119 Ser Lys Ile Val Ala Ser Tyr Thr Thr Thr Ser Gly Glu Thr Lys ThrSer Lys Val Ala Ser Ser Ser Thr Thr Thr Ser Ser Gly Glu Thr Lys Thr 335 340 345 335,340,345 AGT CTT CTC TTA ACG TCT GGA TGG TGG GGA TTG GCT CGT CAT TTC CAT 1167AGT CTT CTC TTA ACG TCT GGA TGG TGG GGA TTG GCT CGT CAT TTC CAT 1167 Ser Leu Leu Leu Thr Ser Gly Trp Trp Gly Leu Ala Arg His Phe HisSer Leu Leu Leu Ser Ser Gly Trp Trp Gly Leu Ala Arg His Phe His 350 355 360 350,355 360 TAT GTT CCT GAG ATC TTA AGT GCT TTC TTC TGG ACC GTA CCG GCT CTC 1215TAT GTT CCT GAG ATC TTA AGT GCT TTC TTC TGG ACC GTA CCG GCT CTC 1215 Tyr Val Pro Glu Ile Leu Ser Ala Phe Phe Trp Thr Val Pro Ala Leu 365 370 375 380Tyr Val Pro Glu Island Leu Ser Ala Phe Phe Thr Trp Pro Val Val Ala Leu 365 370 375 380 TTC GAT AAC TTC TTG GCA TAC TTC TAC GTC CTC ACC CTT CTT CTC TTT 1263TTC GAT AAC TTC TTG GCA TAC TTC TAC GTC CTC ACC CTT CTT CTC TT 1263 Phe Asp Asn Phe Leu Ala Tyr Phe Tyr Val Leu Thr Leu Leu Leu PhePhe Asp Asn Phe Leu Ala Tire Phe Tyr Val Leu Leu Leu Leu Leu Phe 385 390 395 385 390 395 GAT CGA GCC AAG AGA GAC GAT GAC CGA TGC CGA TCA AAG TAT GGG AAA 1311GAT CGA GCC AAG AGA GAC GAT GAC CGA TGC CGA TCA AAG TAT GGG AAA 1311 Asp Arg Ala Lys Arg Asp Asp Asp Arg Cys Arg Ser Lys Tyr Gly LysAsp Arg Ala Lys Asp Arg Asp Asp Arg Arg Cys Arg Ser Lys Tyr Gly Lys 400 405 410 400 405 410 TAT TCG AAG CTG TAT TGT GAG AAA GTC AAA TAC AGG ATC ATT CCG GGA 1359TAT TCG AAG CTG TAT TGT GAG AAA GTC AAA TAC AGG ATC ATT CCG GGA 1359 Tyr Trp Lys Leu Tyr Cys Glu Lys Val Lys Tyr Arg Ile Ile Pro GlyTyr Trp Lys Leu Tyr Cys Glu Lily Val Lys Tyr Arg Ile Ile Pro Gly 415 420 425 415,420,425 ATT TAT TGATTGTAAC GAAGTCTGTT GTTCTCATTT TCTACTTATT ACGTTAATTC 1415ATT TAT TGATTGTAAC GAAGTCTGTT GTTCTCATTT TCTACTTATT ACGTTAATTC 1415 Ile TyrTire Island 430 GAACGTTGGA ATCATCAAAA GACCGAGCCA AAACAAAAAT GCARATTGAT GCGATAGACA 1475 430 GAACGTTGGA ATCATCAAAA GACCGAGCCA AAACAAAAAT GCARATTGAT GCGATAGACA 1475 TTCTTTTGCT GAAAAAAAAA A 1496 ainsi que les variants alléliques de cette séquenCe. TTCTTTTGCT GAAAAAAAAA A 1496 as well as the allelic variants of this sequence. 4) Séquence d'ADN codant pour une protéine ayant une activité delta-5,7 stérol,delta-7 réductase et qui hybride à la séquence définie à la revendication 3 dans des conditions de stringence moyenne ou élevée ou qui présente une identité de séquence d'environ 60 % et plus avec cette séquence.4) A DNA sequence coding for a protein having a delta-5,7 sterol, delta-7 reductase activity and which hybridizes to the sequence defined in claim 3 under conditions of medium or high stringency or which has a sequence identity about 60% and more with this sequence. 5) Séquence d'ADN codant pour une protéine ayant une activité delta-5,7 stérol,delta-7 réductase et amplifiable par la technique de PCR en utilisant comme amorces des oligonucléotides codant pour une séquence consensus ayant la séquence en acides aminés SEQ ID NO 35) DNA sequence coding for a protein having delta-5,7 sterol, delta-7 reductase activity and amplifiable by the PCR technique using, as primers, oligonucleotides encoding a consensus sequence having the amino acid sequence SEQ ID NO 3 Leu Leu Xaa Xaa Gly Trp Xaa Gly Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Tyr 1 5 10 15 dans laquelle Xaa en position 7 est Trp ou Tyr et Xaa en position 12 est His ou Lys.Leu Leu Xaa Xaa Gly Trp Xaa Gly Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Tyr 1 5 10 15 wherein Xaa at position 7 is Trp or Tyr and Xaa at position 12 is His or Lys. 6) Protéine d'A. thaliana ayant une activité delta-5,7 stérol,delta-7 réductase et ayant la séquence en acides aminés SEQ ID NO 26) Protein of A. thaliana having a delta-5,7 sterol, delta-7 reductase activity and having the amino acid sequence SEQ ID NO 2 Met Ala Glu Thr Val His Ser Pro Ile Val Thr Tyr Ala Ser Met LeuMet Ala Glu Thr Val His Ser Pro Val Thr Island Tyr Ala Ser Met Leu 1 5 10 15 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ala Phe Cys Pro Pro Phe Val Ile Leu Leu Trp Tyr ThrSer Leu Leu Ala Phe Cys Pro Pro Phe Val Ile Leu Leu Trp Tyr Thr 20 25 30 20 25 30 Met Val His Gln Asp Gly Ser Val Thr Gln Thr Phe Gly Phe Phe TrpMet Val His Gln Asp Gly Ser Val Thr Gln Thr Phe Gly Phe Phe Trp 35 40 45 35 40 45 Glu Asn Gly Val Gln Gly Leu Ile Asn Ile Trp Pro Arg Pro Thr LeuGlu Asn Gly Val Gln Gly Leu Ile Asn Ile Trp Pro Arg Pro Thr Leu 50 55 60 50 55 60 Ile Ala Trp Lys Ile Ile Phe Cys Tyr Gly Ala Phe Glu Ala île LeuIle Ala Trp Lys Ile Ile Phe Cys Tire Gly Ala Phe Glu Ala Ile Leu 65 70 75 80 Gln Leu Leu Leu Pro Gly Lys Arg Val Glu Gly Pro Ile Ser Pro Ala 65 70 75 80 Gln Leu Leu Leu Pro Gly Lys Arg Val Glu Pro Gly Pro Ser Pro Ala 85 90 95 85 90 95 Gly Asn Arg Pro Val Tyr Lys Ala Asn Gly Leu Ala Ala Tyr Phe ValGly Asn Arg Pro Val Tyr Ala Asn Gly Ala Ala Ala Tyr Phe Val 100 105 110  100 105 110 Thr Leu Ala Thr His Leu Gly Leu Trp Trp Phe Gly Ile Phe Asn ProThr Leu Ala Thr His Leu Gly Leu Trp Trp Phe Gly Ile Phe Asn Pro 115 120 125 115 120 125 Ala Ile Val Tyr Asp His Leu Gly Glu Ile Phe Ser Ala Leu Ile PheAla Val Tyr Island Asp His Leu Gly Glu Isle Phe Ser Ala Leu Ile Phe 130 135 140 130 135 140 Gly Ser Phe Ile Phe Cys Val Leu Leu Tyr Ile Lys Gly His Val Ala 145 150 155 160Gly Ser Phe Ile Phe Cys Val Leu Leu Tyr Ile Lys Gly His Val Ala 145 150 155 160 Pro Ser Ser Ser Asp Ser Gly Ser Cys Gly Asn Leu Ile Ile Asp PheSer Ser Ser Ser Asp Ser Gly ser Cys Gly Asn Ile Ile Ile Asp Phe 165 170 175 165 170 175 Tyr Trp Gly Met Glu Leu Tyr Pro Arg Ile Gly Lys Ser Phe Asp IleTyr Trp Gly Met Glu Leu Tyr Pro Arg Island Gly Lys Ser Phe Asp Ile 180 185 190 180 185 190 Lys Val Phe Thr Asn Cys Arg Phe Gly Met Met Ser Trp Ala Val LeuLys Val Phe Thr Asn Cys Arg Phe Gly Met Met Ser Trp Ala Val Leu 195 200 205 195 200 205 Ala Val Thr Tyr Cys Ile Lys Gln Tyr Glu Ile Asn Gly Lys Val SerAla Val Thr Tyr Cys Island Lys Gln Tyr Glu Island Asn Gly Lys Val Ser 210 215 220 210 215 220 Asp Ser Met Leu Val Asn Thr Ile Leu Met Leu Val Tyr Val Thr Lys 225 230 235 240Asp Ser Met Leu Val Asn Thr Ile Leu Met Leu Val Tyr Val Thr Lys 225 230 235 240 Phe Phe Trp Trp Glu Ala Gly Tyr Trp Asn Thr Met Asp Ile Ala HisPhe Phe Trp Trp Glu Ala Gly Tire Trp Asn Thr Met Asp Ala Island His 245 250 255 245 250 255 Asp Arg Ala Gly Phe Tyr Ile Cys Trp Gly Cys Leu Val Trp Val ProAsp Arg Ala Gly Phe Tire Island Cys Trp Gly Cys Val Val Val Val Pro 260 265 270 260,265,270 Ser Val Tyr Thr Ser Pro Gly Met Tyr Leu Val Asn His Pro Val GluSer Val Tyr Ser Ser Pro Gly Met Tyr Val Leu Asn His Pro Val Glu 275 280 285 275 280 285 Leu Gly Thr Gln Leu Ala Ile Tyr Ile Leu Val Ala Gly Ile Leu CysLeu Gly Thr Gln Leu Ala Ile Tire Ile Leu Val Ala Gly Ile Leu Cys 290 295 300 290,295,300 Ile Tyr Ile Lys Tyr Asp Cys Asp Arg Gln Arg Gln Glu Phe Arg Arg 305 310 315 320Tyr Island Lys Tyr Asp Asp Asp Arg Arg Gln Arg Gln Glu Phe Arg Arg 305 310 315 320 Thr Asn Gly Lys Cys Leu Val Trp Gly Arg Ala Pro Ser Lys Ile ValThr Asn Gly Lys Cys Leu Val Trp Gly Arg Ala Ser Ser Val Val 325 330 335 325 330 335 Ala Ser Tyr Thr Thr Thr Ser Gly Glu Thr Lys Thr Ser Leu Leu LeuAla Ser Tyr Thr Thr Thr Ser Gly Glu Thr Lys Thr Ser Leu Leu Leu Leu 340 345 350 340,345,350 Thr Ser Gly Trp Trp Gly Leu Ala Arg His Phe His Tyr Val Pro GluThr Ser Gly Trp Trp Gly Leu Ala Arg His Phe His Tyr Val Pro Glu 355 360 365  355 360 365 Ile Leu Ser Ala Phe Phe Trp Thr Val Pro Ala Leu Phe Asp Asn PheIle Leu Ser Ala Phe Phe Thr Trp Pro Val Ala Leu Phe Asp Asn Phe 370 375 380 370,375,380 Leu Ala Tyr Phe Tyr Val Leu Thr Leu Leu Leu Phe Asp Arg Ala Lys 385 390 395 400Leu Ala Tyr Phe Tyr Val Leu Leu Leu Leu Leu Phe Asp Arg Ala Lys 385 390 395 400 Arg Asp Asp Asp Arg Cys Arg Ser Lys Tyr Gly Lys Tyr Trp Lys LeuArg Asp Asp Asp Arg Arg Cys Arg Ser Tyr Tyr Gly Lys Tyr Trp Leu Lys 405 410 415 405 410 415 Tyr Cys Glu Lys Val Lys Tyr Arg Ile Ile Pro Gly Ile TyrTyr Cys Glu Lys Val Lys Tyr Arg Island Ile Pro Gly Ile Tyr 420 425 430 ainsi que les variants alléliques et les analogues de cette séquence. 420,425,430 as well as the allelic variants and analogs of this sequence. 7) Protéine d'A. thaliana ayant une activité delta-5,7 stérol,delta-7 réductase et ayant la séquence en acides aminés SEQ ID NO 2 et désignée delta-7Red.7) Protein of A. thaliana having a delta-5,7 sterol, delta-7 reductase activity and having the amino acid sequence SEQ ID NO 2 and designated delta-7Red. 8) Protéine ayant une activité delta-5,7 stérol,delta-7 réductase ayant une séquence en acides aminés présentant une identité de séquence d'environ 60 % et plus avec la séquence8) Protein having a delta-5,7 sterol, delta-7 reductase activity having an amino acid sequence having a sequence identity of about 60% or more with the sequence SEQ ID NO 2 définie à la revendication 7.SEQ ID NO 2 defined in claim 7. 9) Protéine ayant une activité delta-5,7 stérol,delta-7 réductase et ayant une réactivité immunologique croisée avec la protéine d'A. thaliana delta-7Red définie à la revendication 7.9) Protein having delta-5,7 sterol, delta-7 reductase activity and having immunological cross-reactivity with A protein. delta-7Red thaliana defined in claim 7. 10) Protéine ayant une activité delta-5,7 stérol,delta-7 réductase telle qu'obtenue par expression dans une cellule hôte contenant une séquence d'ADN selon l'une quelconque des revendications 1 à 5.10) Protein having a delta-5,7 sterol, delta-7 reductase activity as obtained by expression in a host cell containing a DNA sequence according to any one of claims 1 to 5. 11) Protéine d'A. thaliana ayant une activité delta-5,7 stérol,delta-7 réductase telle qu'obtenue par expression dans une cellule hôte contenant une séquence d'ADN codant pour la séquence en acides aminés SEQ ID NO 2.11) Protein of A. thaliana having a delta-5,7 sterol, delta-7 reductase activity as obtained by expression in a host cell containing a DNA sequence coding for the amino acid sequence SEQ ID NO 2. 12) Protéine selon la revendication 10 ou la revendication 11 dans laquelle la cellule hôte est une levure.The protein of claim 10 or claim 11 wherein the host cell is a yeast. 13) Anticorps dirigé contre une protéine ayant une activité delta-5,7 stérol,delta-7 réductase selon l'une quelconque des revendications 6 à 12.13) An antibody directed against a protein having a delta-5,7 sterol, delta-7 reductase activity according to any one of claims 6 to 12. 14) Vecteur d'expression contenant une séquence d'ADN selon l'une quelconque des revendications 1 à 5.14) An expression vector containing a DNA sequence according to any one of claims 1 to 5. 15) Cellule hôte transformée par un vecteur selon la revendication 14.15) Host cell transformed with a vector according to claim 14. 16) Procédé de clonage d'un acide nucléique codant pour une protéine ayant une activité delta-5,7 stérol,delta-7 réductase dans un microorganisme comprenant une méthode de criblage choisie parmi - la résistance du microorganisme à la nystatine ou à un composé analogue dont la toxicité dépend de la présence de stérols portant une insaturation en position C-7, - l'hybridation de l'acide nucléique avec la séquence nucléotidique de la séquence SEQ ID NO 1, - l'identification de l'acide nucléique par voie informatique parmi des séquences d'ADN isolé(es) au hasard, - l'expression directe de la protéine suivie d'immunodétec- tion à l'aide d'anticorps dirigés contre la protéine ayant la séquence en acides aminés SEQ ID NO 2.A method of cloning a nucleic acid encoding a protein having a delta-5,7 sterol, delta-7 reductase activity in a microorganism comprising a screening method selected from: - the resistance of the microorganism to nystatin or a compound analog whose toxicity depends on the presence of sterols bearing unsaturation at the C-7 position, - the hybridization of the nucleic acid with the nucleotide sequence of the sequence SEQ ID No. 1, - the identification of the nucleic acid by computer route among randomly isolated DNA sequences; direct expression of the protein followed by immunodetection with antibodies directed against the protein having the amino acid sequence SEQ ID NO 2 . 17) Séquence d'acide nucléique, ADN ou ARN, tel qu'obtenu par le procédé défini à la revendication 16.17) Sequence of nucleic acid, DNA or RNA, as obtained by the method defined in claim 16. 18) Cellule hôte transformée par un vecteur contenant une séquence d'ADN selon la revendication 17.18) Host cell transformed with a vector containing a DNA sequence according to claim 17. 19) Cellule hôte transformée selon la revendication 15 ou la revendication 18 dans laquelle l'hôte est une levure ou un champignon filamenteux.The transformed host cell of claim 15 or claim 18 wherein the host is a yeast or filamentous fungus. 20) Procédé de préparation d'une protéine ayant une activité delta-5,7 stérol,delta-7 réductase dans lequel on cultive une cellule hôte transformée selon l'une quelconque des revendications 15, 18 ou 19 et isole la protéine exprimée.20) A process for preparing a protein having delta-5,7 sterol, delta-7 reductase activity in which a transformed host cell is cultured according to any one of claims 15, 18 or 19 and isolates the expressed protein. 21) Procédé selon la revendication 20 dans lequel la cellule hôte est une levure transformée dans laquelle la séquence d'ADN codante est placée sous le contrôle d'un promoteur de levure.The method of claim 20 wherein the host cell is a transformed yeast in which the coding DNA sequence is under the control of a yeast promoter. 22) Procédé de réduction in vitro d'un stérol insaturé en position C-7 dans lequel on incube le stérol à réduire avec la protéine obtenue selon la revendication 20 ou la revendication 21 et on isole éventuellement le stérol réduit obtenu.22) A method of in vitro reduction of a sterol unsaturated C-7 position in which the sterol is incubated to reduce with the protein obtained according to claim 20 or claim 21 and optionally isolated reduced sterol obtained. 23) Procédé de réduction in vivo d'un stérol exogène insaturé en position C-7 dans lequel on incube le stérol avec une cellule hôte transformée selon l'une quelconque des revendications 15, 18 ou 19 et on isole éventuellement le stérol réduit obtenu.23) A method of in vivo reduction of an exogenous sterol unsaturated sterol C-7 in which the sterol is incubated with a transformed host cell according to any one of claims 15, 18 or 19 and optionally isolated reduced sterol obtained. 24) Procédé de réduction in vivo d'un stérol endogène insaturé en position C-7 dans lequel on cultive une souche hôte transformée selon la revendication 19 et on isole éventuellement le stérol réduit accumulé.24) A method for in vivo reduction of a C-7 unsaturated endogenous sterol in which a transformed host strain is cultured according to claim 19 and the accumulated reduced sterol is optionally isolated. 25) Procédé de réduction in vitro ou in vivo selon l'une quelconque des revendications 22 à 24 dans lequel le stérol réduit obtenu est un substrat de l'enzyme de clivage de la chaîne latérale du cholestérol (P450SCC).25) In vitro or in vivo reduction method according to any one of claims 22 to 24 wherein the reduced sterol obtained is a substrate of the cholesterol side chain cleaving enzyme (P450SCC). 26) Procédé de réduction in vivo selon la revendication 25 dans lequel le stérol endogène à réduire est 1'ergosta 5,7 diène 3-ol, l'ergosta 5,7,24(28) triène 3-ol ou l'ergosta 5,7,22 triène 3-01 ou un mélange de ceux-ci.26. In vivo reduction method according to claim 25 wherein the endogenous sterol to be reduced is ergosta 5,7-diene 3-ol, ergosta 5,7,24 (28) triene 3-ol or ergosta 5 , 7.22 triene 3-01 or a mixture thereof. 27) Procédé de production de pregnénolone dans lequel on cultive une cellule hôte transformée selon la revendication 19, on isole éventuellement le ou les stérols endogènes réduits en position C-7 accumulés, on incube les stérols réduit en présence de P450SCC, et éventuellement d'adrénodoxine réductase (ADR) et d'adrénodoxine (ADX), et on isole éventuellement la pregnénolone obtenue.27) A process for the production of pregnenolone in which a transformed host cell is cultured according to claim 19, the accumulated C-7 endogenous sterol (s) is optionally isolated, the reduced sterols are incubated in the presence of P450SCC, and optionally adrenodoxin reductase (ADR) and adrenodoxin (ADX), and the resulting pregnenolone is optionally isolated. 28) Procédé selon la revendication 27 dans lequel la cellule hôte est une levure.28. The method of claim 27 wherein the host cell is a yeast. 29) Procédé de production de pregnénolone dans lequel on cultive une levure transformée par un ou plusieurs vecteurs permettant la coexpression d'une protéine ayant l'activité delta-5,7 stérol,delta-7 réductase et de P450SCC, et éventuellement de 1'ADR et de 1'ADX, et on isole éventuellement la pregnénolone libre ou estérifiée.29) A process for the production of pregnenolone in which a yeast transformed by one or more vectors allowing the coexpression of a protein having the delta-5,7 sterol, delta-7 reductase and P450SCC activity, and optionally 1 ', is cultured. ADR and ADX, and optionally free or esterified pregnenolone is isolated. 30) Procédé de production de pregnénolone selon la revendication 29 dans lequel on cultive une levure transformée coexprimant une protéine ayant l'activité delta-5,7 stérol delta-7 réductase, le P450SCC, 1'ADR et 1'ADX. 30) A method of producing pregnenolone according to claim 29 wherein a transformed yeast coexpressing a protein having delta-5,7 sterol delta-7 reductase activity, P450SCC, ADR and ADX is cultured. 31) Procédé selon la revendication 30 dans lequel la protéine ayant l'activité delta-5,7 stérol delta-7 réductase est la protéine d'A. thaliana delta-7Red.31. The method of claim 30 wherein the protein having delta-5,7 sterol delta-7 reductase activity is A protein. thaliana delta-7Red. 32) Procédé selon la revendication 31 dans lequel la souche de levure est la souche ECOl/pCD63. 32) The method of claim 31 wherein the yeast strain is strain ECO1 / pCD63. 33) Souche de levure transformée coexprimant une protéine ayant l'activité delta-5,7 stérol delta-7 réductase, le33) Transformed yeast strain coexpressing a protein having delta-5,7 sterol delta-7 reductase activity, the P450SCC, 1'ADR et 1'ADX et accumulant de la pregnénolone libre ou estérifiée.P450SCC, ADR and ADX and accumulating free or esterified pregnenolone. 34) Souche de levure selon la revendication 33 dans laquelle la protéine ayant l'activité delta-5,7 stérol delta-7 réductase est la protéine d'A. thaliana delta-7Red.The yeast strain of claim 33 wherein the protein having delta-5,7 sterol delta-7 reductase activity is A protein. thaliana delta-7Red. 35) Souche de levure selon la revendication 34 dénommée35) yeast strain according to claim 34 called ECOl/pCD63.ECOL / pCD63. 36) Séquence d'ADN humain selon la revendication 17 utilisée comme sonde pour diagnostiquer une déficience congénitale en delta-5,7 stérol,delta-7 réductase.36) Sequence of human DNA according to claim 17 used as a probe for diagnosing congenital deficiency in delta-5,7 sterol, delta-7 reductase. 37) Méthode de détection de la déficience en delta-5,7 stérol,delta-7 réductase qui comprend l'incubation d'un échantillon contenant de 1'ADN génomique humain avec la sonde selon la revendication 36 dans des conditions d'hybridation standards et la mise en évidence de la fixation ou de l'absence de fixation de la sonde à 1'ADN génomique, l'absence de fixation ou la réduction de celle-ci indiquant une déficience congénitale en delta-5,7 stérol,delta-7 réductase. 37) A method for detecting delta-5,7 sterol delta-7 reductase deficiency which comprises incubating a sample containing human genomic DNA with the probe of claim 36 under standard hybridization conditions and demonstrating the binding or lack of attachment of the probe to the genomic DNA, the absence of fixation or reduction thereof indicating congenital delta-5,7 deficiency sterol, delta- 7 reductase.