FR2732346A1 - Proteines mutees, codees par un gene env mute de lentivirus, fragments peptidiques inclus dans lesdites proteines, vecteurs d'expression exprimant lesdites proteines mutees et leurs applications - Google Patents
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Abstract
Protéines mutées, codées par un gène env muté de lentivirus, et notamment VIF, VIH ou CAEV, fragments peptidiques inclus dans lesdites protéines mutées, vecteurs d'expression exprimant lesdites protéines mutées ainsi que leurs applications. Lesdits fragments peptidiques sont inclus dans le domaine immuno-dominant principal (DIP) de la protéine transmembranaire (TM) des lentivirus et notamment du virus de l'immunodéficience féline (VIF), du virus de l'immunodéficience humaine (VIH-1 et VIH-2) et du virus de l'arthrite et de l'encéphalite caprine (CAEV), et sont aptes à modifier les propriétés immunogéniques du DIP et de la protéine Env de lentivirus les contenant. Ces fragments présentent l'une des séquences suivantes: SEQ ID No1: CNQNQWLCK, SEQ ID No2: CNQNQFLCK, SEQ ID No3: CNQNQLWCK, SEQ ID No4: CNQNQPFCK, SEQ ID No5: CEHQHFFCK, SEQ ID No6: CSMGTFFCK, SEQ ID No7: CLTDSFFCK, SEQ ID No8: CELKNFFCK, SEQ ID No9: CRPAAFFCK, SEQ ID No10: ELGCSGKLICKIP.
Description
La présente invention est relative à des protéines mutées, codées par un gène env muté de lentivirus, et notamment VIF, VIH ou CAEV, à des fragments peptidiques inclus dans lesdites protéines mutées, à des vecteurs d'expression exprimant lesdites protéines mutées ainsi qu'à leurs applications.
L'immunodéficience féline est due à un lentivirus, le virus de l'immunodéficience féline (VIF), qui présente une structure génétique similaire à celle des lentivirus des primates (VIH et VIS).
Un certain nombre de fragments ont été sélectionnés et ont permis la mise au point de tests sensibles et spécifiques pour la détection des animaux séropositifs, comme décrits dans les Demandes de Brevets européens n" 0 564477 du 20 novembre 1991, n" 0 577 458 du 16 juin 1993, et français n" 94 07062 du 9 juin 1994, au nom de la Demanderesse, et sont issus, pour la plupart de la protéine Env de VIF, comprenant 854 aminoacides, dont la séquence est décrite dans la Demande européenne 0 577 458, qui fournit après clivage 2 fragments glycoprotéiques dénommés SU (glycoprotéine de surface) et TM (glycoprotéine transmembranaire).
En particulier, la protéine TM inclut plusieurs fragments intéressants, à savoir:
- un fragment incluant un segment de 51 aminoacides, dénommé TMl, qui correspond aux positions 595-647 de la protéine Env de VIF,
- un fragment incluant un segment de 31 aminoacides, dénommé
TM2, qui correspond aux positions 681-711 de la protéine Env de VIF, lequel fragment contient un épitope incluant la séquence: Cys697-Asn-Gln-Asn-Gln-Phe-Phe-Cys-
Lys705 (peptide dénommé P237),
- un fragment incluant un segment de 45 aminoacides, dénommé
TM3, qui correspond aux positions 744-788 de la protéine Env de VIF, et
- un fragment incluant un segment de 29 aminoacides, dénommé
TM4, qui correspond aux positions 826-854 de la protéine Env de VIF.
- un fragment incluant un segment de 51 aminoacides, dénommé TMl, qui correspond aux positions 595-647 de la protéine Env de VIF,
- un fragment incluant un segment de 31 aminoacides, dénommé
TM2, qui correspond aux positions 681-711 de la protéine Env de VIF, lequel fragment contient un épitope incluant la séquence: Cys697-Asn-Gln-Asn-Gln-Phe-Phe-Cys-
Lys705 (peptide dénommé P237),
- un fragment incluant un segment de 45 aminoacides, dénommé
TM3, qui correspond aux positions 744-788 de la protéine Env de VIF, et
- un fragment incluant un segment de 29 aminoacides, dénommé
TM4, qui correspond aux positions 826-854 de la protéine Env de VIF.
Alors que dans le domaine de la détection, I'on dispose maintenant d'un ensemble de réactifs pour la détection du VIF, dans le domaine de l'immunoprotection, il est apparu que le domaine immunodominant principal (DIP) de la protéine d'enveloppe du VIF, comprenant le peptide P23 7 précité, peut entraîner la formation d'anticorps facilitant l'infection virale, dont l'action a un effet délétère et contraire à celle des anticorps protecteurs engendrés par la vaccination par la protéine
Env (J.R. MASCOLA et al., AIDS Research & Human Retroviruses, 1993 9 12, 1175-1184).
Env (J.R. MASCOLA et al., AIDS Research & Human Retroviruses, 1993 9 12, 1175-1184).
En outre, une protéine d'enveloppe complète et mature, sous sa forme oligomérique, est préférable pour induire la formation d'anticorps dirigés contre des épitopes conformationnels, parmi lesquels des anticorps neutralisants (C.C.
BRODER et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 11699-11703).
Il est apparu que l'élimination ou le remplacement des résidus Cys du
DIP entraîne un défaut de maturation de l'enveloppe qui n'est plus présentée sous sa forme mature, à la surface des cellules infectées (SYU W.J. et al., 1991, J. Virol., 65, 6349-6352, DEDERA et al., J. Virol., 1992, 66, 1207-1209).
DIP entraîne un défaut de maturation de l'enveloppe qui n'est plus présentée sous sa forme mature, à la surface des cellules infectées (SYU W.J. et al., 1991, J. Virol., 65, 6349-6352, DEDERA et al., J. Virol., 1992, 66, 1207-1209).
Les deux résidus cystéines voisins du peptide P237, conservés dans l'ectodomaine de la TM, chez la plupart des rétrovirus, définissent une structure en boucle qui est le constituant majeur du DIP. La séquence en aminoacides entre les deux résidus cystéine est hautement conservée dans une même espèce de lentivirus, telle que
VIF ou VIH; dans ce dernier, même pour des isolats, par ailleurs très divergents, tels que, par exemple, VIH-1LAI et VIH-1MAL. Par contre, lorsque l'on compare les différentes espèces de lentivirus, par exemple VIII- 1 et VIF, bien que les deux résidus cystéines soient conservés, les séquences en aminoacides situées entre ces deux résidus, ne présentent aucune homologie (figure 1A).
VIF ou VIH; dans ce dernier, même pour des isolats, par ailleurs très divergents, tels que, par exemple, VIH-1LAI et VIH-1MAL. Par contre, lorsque l'on compare les différentes espèces de lentivirus, par exemple VIII- 1 et VIF, bien que les deux résidus cystéines soient conservés, les séquences en aminoacides situées entre ces deux résidus, ne présentent aucune homologie (figure 1A).
En conséquence, la Demanderesse s'est donné pour but de pourvoir à des protéines Env mutées au niveau dudit domaine immunodominant principal de la glycoprotéine transmembranaire de lentivirus et notamment du virus de l'immunodéficience féline ou du virus de l'immunodéficience humaine, qui présentent une réactivité significativement différente de celle de la protéine Env sauvage, notamment en ce qu'elles n'induisent pas la formation d'anticorps délétères, notamment facilitants contre le DIP sauvage, tout en conservant la capacité à produire une réponse immune protectrice, incluant notamment des anticorps neutralisants.
La présente Invention a, en conséquence, pour objet des fragments peptidiques, caractérisés en ce qu'ils sont inclus dans le domaine immunodominant principal (DIP) de la protéine transmembranaire (TM) des lentivirus et notamment du virus de l'immunodéficience féline (VIF), du virus de l'immunodéficience humaine (VIH-1 et VIII-2) et du virus de l'arthrite et de l'encéphalite caprine (CAEV), et en ce qu'ils sont aptes à modifier les propriétés immunogéniques du DIP et de la protéine
Env de lentivirus les contenant.
Env de lentivirus les contenant.
Parmi lesdits fragments, on peut citer:
- le fragment CNQNQWLCK, dénommé ss, (SEQ ID NI1),
- le fragment CNQNQFLCK, dénommé fd, (SEQ ID NI2),
- le fragment CNQNQLWCK, dénommé fh, (SEQ ID NI3),
- le fragment CNQNQPFC dénommé fin, (SEQ ID N04),
- le fragment CEHQHFFCK, dénommé n14, (SEQ ID NI5),
- le fragment CSMGTFFCY dénommé n19, (SEQ ID NI6),
- le fragment CLTDSFFCK, dénommé n67, (SEQ ID NI7),
- le fragment CELKNFFCK, dénommé n73, (SEQ ID NI8),
- le fragment CRPAAFFCK, dénommé n92, (SEQ ID N09),
- le fragment ELGCSGKLICKIP, dénommé M5, (SEQ ID NI10).
- le fragment CNQNQWLCK, dénommé ss, (SEQ ID NI1),
- le fragment CNQNQFLCK, dénommé fd, (SEQ ID NI2),
- le fragment CNQNQLWCK, dénommé fh, (SEQ ID NI3),
- le fragment CNQNQPFC dénommé fin, (SEQ ID N04),
- le fragment CEHQHFFCK, dénommé n14, (SEQ ID NI5),
- le fragment CSMGTFFCY dénommé n19, (SEQ ID NI6),
- le fragment CLTDSFFCK, dénommé n67, (SEQ ID NI7),
- le fragment CELKNFFCK, dénommé n73, (SEQ ID NI8),
- le fragment CRPAAFFCK, dénommé n92, (SEQ ID N09),
- le fragment ELGCSGKLICKIP, dénommé M5, (SEQ ID NI10).
Ces séquences ID N"1 à ID N"10 sont des mutants fonctionnels du
DIP du VIF ; en particulier, la séquence ID N"10 contient la séquence du DIP de VIII- 1, dans le contexte du VIF.
DIP du VIF ; en particulier, la séquence ID N"10 contient la séquence du DIP de VIII- 1, dans le contexte du VIF.
La présente Invention a, également, pour objet des protéines Env, caractérisées en ce qu'elles sont mutées au niveau du domaine immunodominant principal (DIP) de la protéine transmembranaire (TM) des lentivirus et notamment du virus de l'immunodéficience féline (VIF), du virus de l'immunodéficience humaine (vrH-1 et
VIH-2) et du virus de l'arthrite et de l'encéphalite caprine (CAEV), et en ce qu'elles comprennent l'un des fragments tels que définis ci-dessus, au niveau du DIP, lesquelles protéines n'entraînent pas la production d'anticorps délétères, notamment d'anticorps facilitants, contre le DIP sauvage, mais conservent une conformation adéquate pour la production d'une réponse immune protectrice, incluant notamment la production d'anticorps neutralisants pour une application vaccinale protectrice.
VIH-2) et du virus de l'arthrite et de l'encéphalite caprine (CAEV), et en ce qu'elles comprennent l'un des fragments tels que définis ci-dessus, au niveau du DIP, lesquelles protéines n'entraînent pas la production d'anticorps délétères, notamment d'anticorps facilitants, contre le DIP sauvage, mais conservent une conformation adéquate pour la production d'une réponse immune protectrice, incluant notamment la production d'anticorps neutralisants pour une application vaccinale protectrice.
La présente invention a également pour objet des vecteurs d'expression de protéines Env de lentivirus, caractérisés en ce qu'ils comprennent au moins un fragment d'acide nucléique muté codant pour une protéine Env mutée telle que définie ci-dessus.
De manière surprenante, de tels vecteurs permettent l'expression d'une enveloppe virale fonctionnelle, mais dont la réactivité immunologique est significativement modifiée, par rapport à celle de la protéine Env sauvage. En effet, la protéine mutée et exprimée n'entraîne pas la production d'anticorps facilitants contre le
DIP sauvage, alors qu'elle conserve la capacité à produire des anticorps neutralisants.
DIP sauvage, alors qu'elle conserve la capacité à produire des anticorps neutralisants.
Selon un mode de réalisation avantageux dudit vecteur d'expression, il est constitué par un vecteur d'expression, comprenant une séquence codant pour une protéine Env de VIF, dans laquelle la séquence codant pour le DIP (séquence 20772115, en référence à la séquence de formule I de la Demande EP 0 577 458), est remplacée par une séquence codant pour l'un quelconque des fragments peptidiques tels que définis ci-dessus.
Ledit vecteur peut être avantageusement construit à partir d'un vecteur tel que décrit dans G. PANCINO et al., Virology, 1995, 206, 796-806.
De manière préférée, lesdites séquences codant pour le DIP sont sélectionnées parmi les séquences suivantes:
- séquence codant pour la séquence ID N 1: TGT AAT CAA AAT
CAA TGG CTT TGC AAA, pour l'obtention du vecteur pu8520,
- séquence codant pour la séquence ID N 2 : TGT AAT CAA AAT
CAA TTT TTA TGC AAA, pour l'obtention du vecteur pfdA20,
- séquence codant pour la séquence ID N 3 : TGT AAT CAA AAT
CAA TTG TGG TGC AAA, pour l'obtention du vecteur pfhA20,
- séquence codant pour la séquence ID N 4 :TGT AAT CAA AAT
CAA CCT TTT TGC AAA, pour l'obtention du vecteur pfmA20,
- séquence codant pour la séquence ID N 5 : TGT GAA CAT CAG
CAT TTT TTC TGC AAA, pour l'obtention du vecteur pn14A20,
- séquence codant pour la séquence ID N 6 : TGT AGT ATG GGG ACG TTT TTC TGC AAA, pour l'obtention du vecteur pn19A20,
- séquence codant pour la séquence ID N 7 ::TGT TTG ACA GAT TCG TTT TTC TGC AAA, pour l'obtention du vecteur pn67A20,
- séquence codant pour la séquence ID N" 8 : TGT GAA CTC AAA AAC TTT TTC TGC AAA, pour l'obtention du vecteur pn73A20, - séquence codant pour la séquence Lez N" 9 : TOT CGC CCA GCT GCT TTT TTC TGC AAq pour l'obtention du vecteur pu92520,
- séquence codant pour la séquence ID N" 10 . GAG CTC GGA TGT TCT GGA AAA CTC ATT TGC AAA ATC CCT, pour l'obtention du vecteur pM5A20.
- séquence codant pour la séquence ID N 1: TGT AAT CAA AAT
CAA TGG CTT TGC AAA, pour l'obtention du vecteur pu8520,
- séquence codant pour la séquence ID N 2 : TGT AAT CAA AAT
CAA TTT TTA TGC AAA, pour l'obtention du vecteur pfdA20,
- séquence codant pour la séquence ID N 3 : TGT AAT CAA AAT
CAA TTG TGG TGC AAA, pour l'obtention du vecteur pfhA20,
- séquence codant pour la séquence ID N 4 :TGT AAT CAA AAT
CAA CCT TTT TGC AAA, pour l'obtention du vecteur pfmA20,
- séquence codant pour la séquence ID N 5 : TGT GAA CAT CAG
CAT TTT TTC TGC AAA, pour l'obtention du vecteur pn14A20,
- séquence codant pour la séquence ID N 6 : TGT AGT ATG GGG ACG TTT TTC TGC AAA, pour l'obtention du vecteur pn19A20,
- séquence codant pour la séquence ID N 7 ::TGT TTG ACA GAT TCG TTT TTC TGC AAA, pour l'obtention du vecteur pn67A20,
- séquence codant pour la séquence ID N" 8 : TGT GAA CTC AAA AAC TTT TTC TGC AAA, pour l'obtention du vecteur pn73A20, - séquence codant pour la séquence Lez N" 9 : TOT CGC CCA GCT GCT TTT TTC TGC AAq pour l'obtention du vecteur pu92520,
- séquence codant pour la séquence ID N" 10 . GAG CTC GGA TGT TCT GGA AAA CTC ATT TGC AAA ATC CCT, pour l'obtention du vecteur pM5A20.
La présente invention a également pour objet des clones moléculaires infectieux de lentivirus mutés, caractérisés en ce qu'ils incluent une séquence codant pour une protéine Env mutée, telle que définie ci-dessus.
De manière préférée, lesdits clones mutés sont obtenus par introduction dans un clone moléculaire infectieux de VIF, de préférence dans le clone moléculaire infectieux p34TF10, d'un fragment contenant les mutations précitées au niveau des séquences codant pour le DIP, à la place des séquences sauvages correspondantes.
Selon la séquence mutée introduite, on obtient les clones suivants: pTf8, pTfd, pTfh, pTnl4, pTnî9, pTn67, pTn73, pTn92 et pTM5.
De tels clones sont notamment obtenus par incorporation dans le génome de VIF p34TF10, de fragments SpeI- BstBI 8287-8918 dudit génome de VIF p34TF10 contenant les mutations précitées, à la place des séquences sauvages correspondantes.
De tels clones ont l'avantage de pouvoir être directement utilisés en tant que vaccin vivant atténué.
La présente invention a également pour objet des compositions vaccinales, caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins une protéine Env mutée et/ou au moins un vecteur d'expression et/ou au moins un clone muté, tels que définis ci-dessus.
La présente invention a, en outre, pour objet un procédé de surveillance d'une vaccination anti-lentivirus et/ou de différenciation entre une vaccination anti-lentivirus et une infection par un lentivirus, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en contact d'un fragment peptidique selon l'invention avec un échantillon biologique (sang, notamment) et la détection du complexe antigène (fragment peptidique) anticorps (produits lors de la vaccination ou lors de l'infection) formé, par tout moyen approprié.
Dans un tel procédé, le DIP muté sert avantageusement de séquence marqueur; en effet, les anticorps produits contre le DIP seront différents en cas de vaccination (DIP muté) et en cas d'infection (DIP sauvage). Dans un tel contexte, si une infection virale intervient pendant la vaccination, on pourra effectivement la distinguer, les deux réponses immunologiques étant différentes, du fait de la présence du
DIP muté et de l'absence du DIP sauvage, dans la composition vaccinale.
DIP muté et de l'absence du DIP sauvage, dans la composition vaccinale.
On peut, pour le DIP sauvage, utiliser les systèmes de détection tels que ceux décrits dans les Demandes de Brevets européens n" 0 564477 du 20 novembre 1991, nO 0 577 458 du 16 juin 1993, et français nO 94 07062 du 9 juin 1994; pour détecter les DIP mutés, on peut utiliser des systèmes de détection analogues, mettant en oeuvre les peptides du DIP muté tels que définis ci-dessus, comme réactifs, au lieu du DIP sauvage (voir Exemple 1).
Outre les dispositions qui précèdent, I'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention, ainsi qu'aux dessins annexés, dans lesquels:
- la figure 1 représente l'alignement des séquences des DIP de TM de différents lentivirus,
- la figure 2 représente le vecteur d'expression d'enveloppe pT/v20,
- la figure 3 représente le résultat des tests de fusion avec le vecteur contenant la séquence M5.
- la figure 1 représente l'alignement des séquences des DIP de TM de différents lentivirus,
- la figure 2 représente le vecteur d'expression d'enveloppe pT/v20,
- la figure 3 représente le résultat des tests de fusion avec le vecteur contenant la séquence M5.
n doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
Exemple 1 : Construction des mutants.
La séquence codant pour la protéine Env de VIF est modifiée, de manière à ce que les séquences codant pour les fragments peptidiques selon l'invention tels que définis ci-dessus, soient insérées, à la place de la séquence codant pour le peptide P237 précité (positions 2077-2115 de la séquence codant pour la protéine Env, telle que décrite dans la Demande de Brevet Européen n" 0 577 458 , lesdites séquences codant pour une protéine Env ainsi modifiées (séquences env mutantes) sont insérées dans un vecteur dénommé pua20, qui comporte une délétion du nucléotide 923 au nucléotide 5410 dans le gène VIF (gènes gag et pot).
L'obtention du vecteur pTA20 est décrite dans G. PANCINO et ai.,
Virology, 1995, 206, 796-806.
Virology, 1995, 206, 796-806.
Le vecteur d'expression Env pTA20 (figure 2) est dérivé du clone moléculaire infectieux de VIF p34TF10, par délétion des gènes gag etpol.
Des fragments SpeI-BstBI 8287-8918 du gène génome de VIF p34TF10, contenant les mutations précitées sont introduites dans le vecteur d'expression, à la place des fragments correspondants contenant la séquence sauvage.
Pour produire le vecteur d'expression env du VIF pour l'utiliser dans les cellules félines, une délétion des gènes gag et pol, est réalisée dans le provirus p34TF10 (TALBOTT et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 5743-5747) par digestion Tthl 1 l-EcoRV et religature après un traitement avec l'enzyme de Klenow.
Un clone, dénommé pTA20, qui comporte une délétion plus large, du nucléotide 923 au nucléotide 5410 exprime effectivement ladite protéine Env, après transfection dans les cellules CrFK (Virology, 1995, 206, 796-806)
Exemole 2: Peptides mutés obtenus et protéines Env les contenant: fonctionnalité et réactivité.
Exemole 2: Peptides mutés obtenus et protéines Env les contenant: fonctionnalité et réactivité.
* Méthode:
- Pour tester la fonctionnalité des enveloppes mutées, les vecteurs d'expression précités (pu8520, pfdA20, pfhA20, pfinA20, pn14A20, pn19A20, pu67520, pn73A20, pn92A20, pu5520,) produisant des protéines Env mutées conformes à l'invention sont transfectés dans des cellules CrFK et analysés pour leur capacité à induire la fusion des membranes cellulaires (formation de syncytia).
- Pour tester la fonctionnalité des enveloppes mutées, les vecteurs d'expression précités (pu8520, pfdA20, pfhA20, pfinA20, pn14A20, pn19A20, pu67520, pn73A20, pn92A20, pu5520,) produisant des protéines Env mutées conformes à l'invention sont transfectés dans des cellules CrFK et analysés pour leur capacité à induire la fusion des membranes cellulaires (formation de syncytia).
Pour réaliser ce test, il est nécessaire de transfecter lesdits 10 vecteurs d'expression, contenant les enveloppes mutées, dans des fibroblastes félins CrFK, conformément au protocole suivant:
Une lignée cellulaire de fibroblastes félins CrFK-H06T1/2 (OSBORNE et al., J. Gen. Virol., 1994, 75, 3641-3645) est cultivée dans un milieu Eagle modifié Dulbecco complémenté avec du sérum de veau à 10 %.
Une lignée cellulaire de fibroblastes félins CrFK-H06T1/2 (OSBORNE et al., J. Gen. Virol., 1994, 75, 3641-3645) est cultivée dans un milieu Eagle modifié Dulbecco complémenté avec du sérum de veau à 10 %.
Les plasmides sont purifiés en utilisant le système maxiprep Promega, puis sont extraits au phénol-chloroforme. La transfection est réalisée en utilisant la méthode de précipitation au phosphate de calcium.
Les conditions de transfection sont optimisées et standardisées en utilisant des plasmides exprimant les gènes reporters ss-galactosidase ou luciférase.
- Pour tester la réactivité des domaines mutés avec des sérums de chats infectés par un VIF, un ELISA avec les peptides selon l'invention est réalisé. Les plaques de microtitration, contenant 96 puits (Immunolon 2), sont recouvertes avec lesdits peptides, dans un tampon carbonate 0,1 M, pH 9,6 (5 llg/ml), à 4"C pendant une nuit.
Après blocage avec de la sérum albumine bovine à 3 %, des sérums félins dilués dans du PBS, de la sérum albumine bovine à 1 % et du Tween 20 à 0,1 %, sont ajoutés et incubés pendant 2 heures.
Après 5 lavages avec du PBS Tween 20 1 %, des anticorps anti-chat conjugués à de la peroxydase sont incubés pendant 1 heure. Après 5 lavages, la réaction est révélée en utilisant de l'ABTS à 0,4 mg/ml et en lisant la densité optique 30 min après.
De la même manière, on peut tester la réactivité des domaines mutés avec des sérums humains infectés par le VIII- 1. Dans ce cas, le protocole est le même, à l'exception de l'utilisation de sérum de veau foetal à 5 %, à la place de la sérum albumine bovine.
Résultats:
- Formation de syncytia:
Les vecteurs mutés contenant les séquences ID N"1 à NI10, produisent des syncytia, comme illustré dans le Tableau I ci-après:
TABLEAU I
- Formation de syncytia:
Les vecteurs mutés contenant les séquences ID N"1 à NI10, produisent des syncytia, comme illustré dans le Tableau I ci-après:
TABLEAU I
<tb> <SEP> N <SEP> syncytia <SEP> N <SEP> syncytia <SEP> ELISA <SEP> ELISA
<tb> <SEP> Peptides <SEP> (n" <SEP> noyaux) <SEP> (n <SEP> noyaux) <SEP> > 25 <SEP> % <SEP> TM2 <SEP> > 25 <SEP> % <SEP> TM2
<tb> <SEP> (0,5 <SEP> Ag) <SEP> <SEP> (2 <SEP> g) <SEP> expériment. <SEP> naturel.
<tb>
<tb> <SEP> Peptides <SEP> (n" <SEP> noyaux) <SEP> (n <SEP> noyaux) <SEP> > 25 <SEP> % <SEP> TM2 <SEP> > 25 <SEP> % <SEP> TM2
<tb> <SEP> (0,5 <SEP> Ag) <SEP> <SEP> (2 <SEP> g) <SEP> expériment. <SEP> naturel.
<tb>
TM2 <SEP> CNQNQFFCK <SEP> 991(5-100) <SEP> 1900 <SEP> (15-150)
<tb> 18 <SEP> CNQNQWLCK <SEP> 522 <SEP> (5-100) <SEP> 1280 <SEP> (5-100) <SEP> 1/8 <SEP> 1/11
<tb> fd <SEP> CNQNQFLCK <SEP> NDOO <SEP> ++ <SEP> <SEP> 5/8 <SEP> 9/11
<tb> fh <SEP> CNQNQLWCK <SEP> 200(5-70) <SEP> 415 <SEP> (5-70) <SEP> 4/8 <SEP> 3/11
<tb> fin <SEP> CNQNQPFCK <SEP> 108 <SEP> (5-50) <SEP> 170 <SEP> (5-50) <SEP> 1/8 <SEP> 2/11
<tb> n14 <SEP> CEHQHFFCK <SEP> 187 <SEP> (5-20) <SEP> 754 <SEP> (5-50) <SEP> 0/8 <SEP> 2/11
<tb> n19 <SEP> CSMGTFFCK <SEP> 156 <SEP> (5-30) <SEP> 408 <SEP> (5-80) <SEP> 0/8 <SEP> 1/11
<tb> n67 <SEP> CLTDSFFCK <SEP> + <SEP> ++ <SEP> 0/8 <SEP> 0/11
<tb> n73 <SEP> CELKNFFCK <SEP> 160 <SEP> (5-20) <SEP> 700 <SEP> (540) <SEP> 0/8 <SEP> 1/11
<tb> n92 <SEP> CRPAAFFCK <SEP> 114(5-30) <SEP> 200 <SEP> (5-30) <SEP> NI# <SEP> NI#
<tb> 0 <SEP> 3 <SEP> (5-7) <SEP> 4 <SEP> (5-7)
<tb> * > > 100 loosyncytiaipuits
OOND : non effectué #NI: non interprétable dans l'ELISA-peptide. 9 cause du bruit de fond dans la réaction du peptide n92 avec des sénuns témoins de chats non infectés. L'e.xistence d'une réaction croisée du peptide n92 avec le peptide TM2 a été toutefois écartée par des expériences de compétition entre les deux peptides.
<tb> 18 <SEP> CNQNQWLCK <SEP> 522 <SEP> (5-100) <SEP> 1280 <SEP> (5-100) <SEP> 1/8 <SEP> 1/11
<tb> fd <SEP> CNQNQFLCK <SEP> NDOO <SEP> ++ <SEP> <SEP> 5/8 <SEP> 9/11
<tb> fh <SEP> CNQNQLWCK <SEP> 200(5-70) <SEP> 415 <SEP> (5-70) <SEP> 4/8 <SEP> 3/11
<tb> fin <SEP> CNQNQPFCK <SEP> 108 <SEP> (5-50) <SEP> 170 <SEP> (5-50) <SEP> 1/8 <SEP> 2/11
<tb> n14 <SEP> CEHQHFFCK <SEP> 187 <SEP> (5-20) <SEP> 754 <SEP> (5-50) <SEP> 0/8 <SEP> 2/11
<tb> n19 <SEP> CSMGTFFCK <SEP> 156 <SEP> (5-30) <SEP> 408 <SEP> (5-80) <SEP> 0/8 <SEP> 1/11
<tb> n67 <SEP> CLTDSFFCK <SEP> + <SEP> ++ <SEP> 0/8 <SEP> 0/11
<tb> n73 <SEP> CELKNFFCK <SEP> 160 <SEP> (5-20) <SEP> 700 <SEP> (540) <SEP> 0/8 <SEP> 1/11
<tb> n92 <SEP> CRPAAFFCK <SEP> 114(5-30) <SEP> 200 <SEP> (5-30) <SEP> NI# <SEP> NI#
<tb> 0 <SEP> 3 <SEP> (5-7) <SEP> 4 <SEP> (5-7)
<tb> * > > 100 loosyncytiaipuits
OOND : non effectué #NI: non interprétable dans l'ELISA-peptide. 9 cause du bruit de fond dans la réaction du peptide n92 avec des sénuns témoins de chats non infectés. L'e.xistence d'une réaction croisée du peptide n92 avec le peptide TM2 a été toutefois écartée par des expériences de compétition entre les deux peptides.
Le vecteur muté pM5A20, contenant un fragment muté du DIP de VIII a été testé dans une autre expérience et a également montré la formation de syncytia.
La figure 3 illustre les résultats obtenus avec le vecteur M5 (en comparaison avec le type sauvage W).
Les chimères VIHIVIF M5 sont capables d'induire la formation de syncytia (figure 3), plus petits en taille (5-20 noyaux, 48 heures après la transfection) que ceux induits par le type sauvage (W).
La taille et le nombre de syncytia induits par M5 augmentent avec le temps jusqu'à 72 heures.
- Réactivité immunologique:
Les modifications produites dans les propriétés immunologiques des
DIP par les mutations qui conservent la capacité fusogénique des enveloppes mutantes sont testées par ELISA peptide .
Les modifications produites dans les propriétés immunologiques des
DIP par les mutations qui conservent la capacité fusogénique des enveloppes mutantes sont testées par ELISA peptide .
Les peptides correspondant au DIP muté (Tableau I) sont synthétisés et utilisés pour recouvrir des microplaques ELISA. 8 sérums de chats, expérimentalement infectés avec 4 isolats différents de VIF et 11 sérums provenant de chats naturellement infectés sont testés pour évaluer la réactivité de ces peptides.
Les valeurs de densité optique obtenues avec les peptides DIP mutants sont comparées avec les valeurs obtenues avec le peptide DIP sauvage (TM2) comprenant le peptide P237.
Une réduction importante de la réactivité de la plupart des mutants est mise en valeur par rapport au peptide TM2.
Le Tableau I ci-dessus montre pour chaque peptide, le nombre de sérums qui ont montré une réactivité de plus de 25 % par rapport à la réactivité du peptide TM2.
Dans certains cas, avec les sérums qui montrent une réactivité avec les peptides mutants, des essais par compétition ont été réalisés entre le peptide TM2 et les peptides mutés.
Dans aucun cas, un peptide muté inhibe la réactivité du sérum vis-àvis du peptide rM2, tandis que le peptide TM2 inhibe complètement la réactivité des sérums de chats infectés par les protéines mutées.
Ces résultats montrent que les mutations introduites dans le DIP de
VIF modifient profondément sa reconnaissance par des sérums de chats infectés par un
VIF (immunoréactivité significativement modifiée).
VIF modifient profondément sa reconnaissance par des sérums de chats infectés par un
VIF (immunoréactivité significativement modifiée).
* Réactivité croisée entre les DIP de VIF et de VIH-1
Deux ELISA ont été mis au point pour tester soit la réactivité du DIP de VIF avec du sérum humain infecté par VIH-1, soit la réactivité du DIP de VIH-1 i avec du sérum de chat infecté par le VIF.
Deux ELISA ont été mis au point pour tester soit la réactivité du DIP de VIF avec du sérum humain infecté par VIH-1, soit la réactivité du DIP de VIH-1 i avec du sérum de chat infecté par le VIF.
La réactivité des sérums de 8 patients infectés par le VIH-1 et de 10 chats naturellement infectés par le VIF avec les peptides correspondants aux DIP soit de VIH-1 ou VIF, a été testée avec un ELISA.
Les peptides p237 et SP89029 (Catalogue ANRS, 1994) correspon dant aux séquences de VIF et de VIII- i (DIP) respectivement et 2 peptides chimique- ment cyclisés entre les deux cystéines (Y-15-Vc (YQELGCNQNQFFCLV) et L-15-Tc (LLGIWOCSOKLICTT) respectivement pour le VIF et le VIH-1), de manière à mimer le repliement naturel, ont été utilisés pour recouvrir des plaques de microtitration.
Les sérums d'individus infectés par le VIH-1 réagissent fortement avec les peptides contenant un DIP issu de VIF'- 1 (SP89029 et L-15-Tc), mais pas avec les peptides VIF, c'est-à-dire les peptides contenant un DIP issu du VIF (P237 et
Y-15-Vc) et, de manière correspondante, les sérums de chats infectés par le VIF reconnaissent les peptides VIF, mais pas les peptides VIII- 1.
Y-15-Vc) et, de manière correspondante, les sérums de chats infectés par le VIF reconnaissent les peptides VIF, mais pas les peptides VIII- 1.
Ainsi, aucune réaction croisée ne peut être détectée entre les deux
DIP. Ceci permet l'utilisation d'un ELISA peptide adapté, pour suivre les protocoles de vaccination anti-VIH-l, basés sur des enveloppes chimères contenant la séquence de
DIP du VIF dans le contexte VIII-1 ou d'autres mutations qui modifient les propriétés antigéniques du DIP de VIII- 1.
DIP. Ceci permet l'utilisation d'un ELISA peptide adapté, pour suivre les protocoles de vaccination anti-VIH-l, basés sur des enveloppes chimères contenant la séquence de
DIP du VIF dans le contexte VIII-1 ou d'autres mutations qui modifient les propriétés antigéniques du DIP de VIII- 1.
Une approche réciproque est également possible dans le cas de la vaccination contre le VIF, en utilisant un DIP VIH-1 ou d'autres séquences mutées de l'enveloppe de VIF.
Exemple 3: Vaccination génique
L'administration des produits de gène env de VIF tels que définis cidessus, par injection d'ADN brut a été étudiée, de manière à permettre un protocole vaccinal qui permettrait l'analyse de la réponse immune des protéines d'enveloppe sauvage, en comparaison avec les enveloppes mutées dans la région DIP.
L'administration des produits de gène env de VIF tels que définis cidessus, par injection d'ADN brut a été étudiée, de manière à permettre un protocole vaccinal qui permettrait l'analyse de la réponse immune des protéines d'enveloppe sauvage, en comparaison avec les enveloppes mutées dans la région DIP.
Le vecteur d'expression Env pTA20, dérivé du clone moléculaire infectieux de VIF p34TF10, par délétion des gènes gag et pol, est utilisé pour vacciner des chats.
On injecte du vecteur pTA20 en intra-musculaire à 4 chats (4 injections de 200400 g d'ADN). La réponse en anticorps est analysée en utilisant 4 peptides différents correspondant aux épitopes des cellules B linéaires (SU2, SU3, TM2 et
TM4) par ELISA et par immunoprécipitation des glycoprotéines Env, à partir des lysats d'une lignée cellulaire FL4, infectés avec du VIF, après marquage 35S.
TM4) par ELISA et par immunoprécipitation des glycoprotéines Env, à partir des lysats d'une lignée cellulaire FL4, infectés avec du VIF, après marquage 35S.
3 des 4 chats montrent une réponse faible au moins à 2 peptides. Un sérum est également capable de précipiter les glycoprotéines d'enveloppe (dernière dilution testée 1:320) à partir des cellules FL4. Ces résultats indiquent que
I'immunisation basée sur le gène env entraîne bien une réponse immune et donc son utilisation dans les vaccins avec les protéines Env mutées.
I'immunisation basée sur le gène env entraîne bien une réponse immune et donc son utilisation dans les vaccins avec les protéines Env mutées.
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, I'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée de la présente invention.
Claims (11)
1") Fragments peptidiques, caractérisés en ce qu'ils sont inclus dans le domaine immunodominant principal (DIP) de la protéine transmembranaire (TM) des lentivirus et notamment du virus de l'immunodéficience féline (VIF), du virus de l'immunodéficience humaine (VIH-1 et VIH-2) et du virus de l'arthrite et de l'encéphalite caprine (CAEV), et en ce qu'ils sont aptes à modifier les propriétés immunogéniques du DIP et de la protéine Env de lentivirus les contenant.
- SEQ ID NI10: ELGCSGKLICKIP.
- SEQ ID N 9: CRPAAFFCK,
- SEQ ID N"8 : CELKNFFCK,
- SEQ ID N"7 : CLTDSFFCK,
- SEQ ID N"6 : CSMGTFFCK,
- SEQ ID N"5 : CEHQHFFCK,
- SEQ ID N"4 : CNQNQPFCK,
- SEQ ID N"3 : CNQNQLWCK,
- SEQ ID N"2 : CNQNQFLCK,
- SEQ ID N"1 : CNQNQWLCK,
2") Fragments selon la revendication 1, caractérisés en ce qu'ils présentent l'une des séquences suivantes:
3 ) Protéines Env caractérisées en ce qu'elles sont mutées au niveau du domaine immunodominant principal (DIP) de la protéine transmembranaire (TM) des lentivirus et notamment du virus de l'immunodéficience féline (VIF), du virus de l'immunodéficience humaine (VIH-1 et VIH-2) et du virus de l'arthrite et de l'encéphalite caprine (CAEV), et en ce qu'elles comprennent l'un des fragments selon la revendication 1 ou la revendication 2, lesquelles protéines n'entraînent pas la production d'anticorps délétères contre le DIP sauvage, mais conservent une conformation adéquate à la production d'une réponse immune protectrice, incluant notamment des anticorps neutralisants.
4 ) Vecteur d'expression de protéines Env de lentivirus, caractérisé en ce qu'il est constitué par un vecteur d'expression, comprenant une séquence codant pour une protéine Env de lentivirus, dans laquelle la séquence codant pour le DIP est remplacée par une séquence codant pour l'un quelconque des fragments peptidiques selon la revendication 1 ou la revendication 2.
TGT TCT GGA AAA CTC ATT TGC AAA ATC CCT, pour l'obtention du vecteur pM5#20.
- séquence codant pour la séquence ID N" 10 GAG CTC GGA
GCT TTT TTC TGC AAA, pour l'obtention du vecteur pn92A20,
- séquence codant pour la séquence ID N" 9 :TGT CGC CCA GCT
AAC TTT TTC TGC AAA, pour l'obtention du vecteur pn73A20,
- séquence codant pour la séquence ID N 7 :TGT TTG ACA GAT TCG TTT TTC TGC AAA, pour l'obtention du vecteur pn67520, - séquence codant pour la séquence ID N 8 : TGT GAA CTC AAA
- séquence codant pour la séquence ID N 6 : TGT AGT ATG GGG ACG TTT TTC TGC AAA, pour l'obtention du vecteur pn19A20,
CAT TTT TTC TGC AAA, pour l'obtention du vecteur pn14A20,
- séquence codant pour la séquence ID N 5 : TGT GAA CAT CAG
- séquence codant pour la séquence ID N 4 :TGT AAT CAA AAT CAA CCT TTT TGC AAA, pour l'obtention du vecteur point20,
CAA TTG TGG TGC AAA, pour l'obtention du vecteur pfhA20,
- séquence codant pour la séquence ID N 3 : TGT AAT CAA AAT
- séquence codant pour la séquence ID NO 2 : TGT AAT CAA AAT CAA TTT TTA TGC AAA, pour l'obtention du vecteur pfdA20,
- séquence codant pour la séquence ID N0 1: TOT AAT CAA AAT CAA TGG CTT TGC AAA, pour l'obtention du vecteur pf8A20,
5 ) Vecteur selon la revendication 4, caractérisé en ce que lesdites séquences codant pour le DIP sont sélectionnées parmi les séquences suivantes:
6 ) Clones moléculaires infectieux de lentivirus mutés, caractérisés en ce qu'ils incluent une séquence codant pour une protéine Env mutée, selon la revendication 3.
7 ) Clones selon la revendication 6, caractérisés en ce qu'ils sont obtenus par introduction dans un clone moléculaire infectieux de VIF, de préférence dans le clone moléculaire infectieux p34TF10, d'un fragment contenant les mutations précitées au niveau des séquences codant pour le DIP, à la place des séquences sauvages correspondantes.
8 ) Clones selon la revendication 6 ou la revendication 7, caractérisés en ce qu'ils sont sélectionnés parmi pTf8, pTfd, pTffr pTnl4, pTnl9, pTn67, pTn73, pTn92 et pTM5, selon la séquence mutée introduite.
9 ) Compositions vaccinales, caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins une protéine Env mutée selon la revendication 3 et/ou au moins un vecteur d'expression selon l'une quelconque des revendications 4 à 5 et/ ou un clone selon l'une quelconque des revendications 6 à 8.
10 ) Procédé de surveillance d'une vaccination anti-lentivirus et/ou de différenciation entre une vaccination anti-lentivirus et une infection par un lentivirus, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en contact d'un fragment peptidique selon l'invention avec un échantillon biologique (sang, notamment) et la détection du complexe antigène (fragment peptidique)-anticorps (produits lors de la vaccination ou lors de l'infection) formé, par tout moyen approprié.
11 ) Réactif de diagnotic, caractérisé en ce qu'il est constitué par un fragment peptidique selon la revendication 1 ou la revendication 2.
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