FR2715665A1 - Use of the Vargula luciferase gene for the selection of transgenic embryos. - Google Patents
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Abstract
Description
UTILISATION DU GENE DE LA LUCIFERASE DE VIRGULA POUR LA
SELECTION D'EMBRYONS TRANSGENIQUES.USE OF THE VIRGULA LUCIFERASE GENE FOR
SELECTION OF TRANSGENIC EMBRYOS.
La présente Invention est relative à un procédé de sélection d'embryons transgéniques. The present invention relates to a process for selecting transgenic embryos.
La transgénèse est largement utilisée chez la souris, mais encore peu développée chez d'autres animaux, tels que les animaux de ferme. Cette situation s'explique par le coût important de cette technologie liée principalement au faible taux d'intégration d'un transgène dans le noyau transcriptionnellement actif de l'oeuf : on estime que chez la plupart des espèces domestiques, moins de 1% des embryons injectés qui se développent à terme après transfert dans une femelle receveuse sont transgéniques [MURRAY et al. (1989)], alors que ce taux est d'environ 10% chez la souris. Cette situation implique chez ces espèces de recourir à un nombre d'autant plus élevé d'embryons et de femelles receveuses. De ce fait, le coût du premier veau transgénique produit a été estimé à environ 3 millions de francs [SEIDEL, (1993)]. Transgenesis is widely used in mice, but still underdeveloped in other animals, such as farm animals. This situation is explained by the high cost of this technology, linked mainly to the low rate of integration of a transgene into the transcriptionally active nucleus of the egg: it is estimated that in most domestic species, less than 1% of embryos injected which develop over time after transfer to a recipient female are transgenic [MURRAY et al. (1989)], whereas this rate is around 10% in mice. This situation implies in these species to resort to an even higher number of embryos and recipient females. As a result, the cost of the first transgenic calf produced was estimated at around 3 million francs [SEIDEL, (1993)].
Pour diminuer ce coût, il a été proposé d'augmenter le taux d'intégration de l'ADN exogène en recherchant de nouveaux vecteurs s'intégrant plus facilement dans le génome de l'embryon. Cette approche n'a toutefois pas encore débouché actuellement sur des résultats applicables industriellement. To reduce this cost, it has been proposed to increase the rate of integration of exogenous DNA by looking for new vectors which integrate more easily into the genome of the embryo. However, this approach has not yet resulted in industrially applicable results.
Une autre voie, plus directe et potentiellement plus intéressante à court terme, consisterait à réaliser un tri des embryons transgéniques avant leur transfert. En effet, chez plusieurs espèces, ce n'est pas tant le coût de production de ces embryons qui constitue l'obstacle économique principal, que celui lié à l'accès à un grand nombre de femelles receveuses une fois l'injection réalisée : il faut par exemple chez les bovins, l'équivalent d'environ 150 receveuses pour produire un animal transgénique fondateur [HILL et al., (1992)]. Dans ces conditions, le coût technique de production de blastocystes microinjectés ne représente que seulement 10% du coût d'entretien du troupeau de receveuses. Another way, more direct and potentially more interesting in the short term, would be to sort the transgenic embryos before their transfer. In fact, in several species, it is not so much the cost of producing these embryos that constitutes the main economic obstacle, as that linked to access to a large number of recipient females once the injection has been carried out: for example, in cattle, the equivalent of about 150 recipients is needed to produce a founding transgenic animal [HILL et al., (1992)]. Under these conditions, the technical cost of producing microinjected blastocysts represents only only 10% of the cost of maintaining the recipient herd.
Le tri des embryons avant leur transfert peut remédier à cette situation et une littérature abondante est consacrée à ce sujet. Toutes les méthodes proposées à ce jour ont recours à la biopsie de morula ou de blastocystes, associée à la détection directe du transgène après amplification par PCR. Elles impliquent de manipuler les embryons individuellement plusieurs jours après les avoir microinjectés et en outre ne permettent de réaliser qu'un tri négatif en éliminant les embryons pour lesquels aucun signal n'est obtenu après amplification : ceux-ci représentent selon les auteurs 50% [HORVAT et al., (1993)] à 80% [SEIDEL, (1993), publication précitée] des blastocystes bovins issus d'oeufs microinj ectés. Sorting the embryos before their transfer can remedy this situation and an abundant literature is devoted to this subject. All the methods proposed to date use biopsy of morula or blastocysts, associated with direct detection of the transgene after amplification by PCR. They involve manipulating the embryos individually several days after having microinjected them and in addition only allow a negative sorting by eliminating the embryos for which no signal is obtained after amplification: these represent, according to the authors, 50% [ HORVAT et al., (1993)] to 80% [SEIDEL, (1993), cited above] of bovine blastocysts derived from microinjected eggs.
Le recours à une biopsie qui ne permet de réaliser un diagnostic que sur une partie des morula et blastocystes manipulés [THIBIER et NIBART, (1992)] se heurte à deux obstacles majeurs
- d'une part, il compromet les possibilités de développement après congélation [HEYMAN et CHESNE, (1988)], ce qui constitue un obstacle important à la diffusion des embryons
- d'autre part, il conduit à la détection d'embryons "faux positifs" (à cause de problèmes techniques lors de la réalisation de l'amplification) pouvant représenter jusqu'à 10% des embryons analysés [HORVAT et al., (1993), publication précitée], ainsi qu'à celle d'embryons "faux-transgéniques" [SEIDEL, (1993), publication précitée] car la plupart des méthodes ne permettent pas de distinguer véritablement 1'ADN intégré de celui qui ne l'est pas et qui sera progressivement dégradé aux stades ultérieurs de l'embryogenèse. The use of a biopsy which only allows a diagnosis to be made on part of the manipulated morula and blastocysts [THIBIER and NIBART, (1992)] comes up against two major obstacles
- on the one hand, it compromises the possibilities of development after freezing [HEYMAN and CHESNE, (1988)], which constitutes an important obstacle to the diffusion of embryos
- on the other hand, it leads to the detection of "false positive" embryos (because of technical problems during the carrying out of the amplification) which can represent up to 10% of the embryos analyzed [HORVAT et al., ( 1993), publication cited above], as well as that of "false-transgenic" embryos [SEIDEL, (1993), publication cited above] because most methods do not allow a true distinction to be made between integrated DNA and that which does not is not and which will be gradually degraded in the later stages of embryogenesis.
Chez les bovins, environ 20% des embryons microinjectés au stade "une cellule se divisent ensuite normalement en culture, et la moitié des blastocystes obtenus (soit 10% des embryons injectés) sont détectés comme positifs [ROSCHLAU et al., (1989) ; HORVAT et al., (1993), publication précitée]. Or, 20% des blastocystes (et morula) issus d'oeufs injectés sont capables de donner un veau [PURSEL et REXROAD, (1993)]. De ces données il ressort que 2% des embryons injectés sont susceptibles de donner naissance à un animal transgénique. In cattle, approximately 20% of embryos microinjected at the "one cell" stage then divide normally in culture, and half of the blastocysts obtained (ie 10% of the embryos injected) are detected as positive [ROSCHLAU et al., (1989); HORVAT et al., (1993), publication cited above. However, 20% of blastocysts (and morula) from injected eggs are capable of giving a calf [PURSEL and REXROAD, (1993)]. From these data it appears that 2% of the embryos injected are likely to give birth to a transgenic animal.
Il semble que ce pourcentage soit en réalité plus faible, de l'ordre de 0.2% [HILL et al., (1992), publication précitée] à 0.1% seulement [SEIDEL, (1993), publication précitée]. Cette différence traduit probablement le fait que pour une partie des blastocystes obtenus, 1'ADN injecté est sous forme non intégrée. La réalisation d'un tri positif permettant de repérer les embryons où 1'ADN injecté s'est effectivement intégré devient un objectif d'autant plus intéressant en pratique. It seems that this percentage is actually lower, of the order of 0.2% [HILL et al., (1992), publication cited above] to only 0.1% [SEIDEL, (1993), publication cited above]. This difference probably reflects the fact that for part of the blastocysts obtained, the DNA injected is in non-integrated form. The achievement of a positive sort making it possible to identify the embryos where the injected DNA has effectively integrated becomes an objective all the more interesting in practice.
La présente Invention se propose de lever ces deux obstacles, en permettant l'analyse des embryons au stade blastocyste (ou morula) par une méthode non invasive (qui ne fait pas appel à la micromanipulation), rapide, car permettant l'analyse de lots de blastocystes issus d'oeufs microinjectés, en ne retenant que ceux qui sont effectivement transgéniques, à un stade compatible avec leur conservation par congélation. The present invention proposes to remove these two obstacles, by allowing the analysis of embryos at the blastocyst (or morula) stage by a non-invasive method (which does not require micromanipulation), which is rapid because it allows batch analysis. blastocysts from microinjected eggs, retaining only those which are actually transgenic, at a stage compatible with their preservation by freezing.
Dans ce but, les Inventeurs ont eu l'idée d'effectuer l'injection d'un transgène simultanément avec un autre transgène rapporteur qui servirait à repérer les embryons où l'intégration s'est effectivement produite. To this end, the inventors had the idea of carrying out the injection of a transgene simultaneously with another reporter transgene which would serve to identify the embryos where integration has actually occurred.
Ceci nécessite toutefois de disposer d'un gène rapporteur s'exprimant chez l'embryon de manière aisément détectable, et de telle sorte que ni l'expression dudit gène, ni la détection de son activité ne compromettent la survie des embryons. This however requires having a reporter gene expressing itself in the embryo in an easily detectable manner, and in such a way that neither the expression of said gene nor the detection of its activity compromises the survival of the embryos.
De très nombreux gènes rapporteurs sont déjà utilisés en génie génétique pour sélectionner les cellules transformées. Parmi ceux qui sont utilisés dans des cellules eucaryotes, on citera par exemple l'alcool déshydrogénase [NIELSEN et PEDERSEN, (1991)], l'enzyme
CAT, la 5-galactosidase ou la luciférase de luciole. Pour que ces systèmes rapporteurs soient compatibles avec une analyse in situ des cellules vivantes il faut les prétraiter, soit pour perméabiliser leurs membranes soit pour limiter le bruit de fond, qui augmente rapidement lors de la mesure en présence des substrats. Ce prétraitement implique des manipulations incompatibles avec une analyse rapide et en routine. L'utilisation de gènes rapporteurs dont le produit est sécrété dans le milieu pourrait lever ces obstacles. Tel est le cas avec la phosphatase alcaline du placenta humain, dont l'activité peut être détectée dans le milieu de culture par bioluminescence. Bien que sensible, cette méthode présente plusieurs inconvénients majeurs qui la rendent difficilement applicable pour la sélection d'embryons transgéniques : elle implique de cultiver les embryons séparément, de réaliser des prélèvements répétés dans le milieu de culture ; d'autre part la détection du signal est obtenue en deux étapes, ce qui entraîne une dilution rapide du signal dans le milieu environnant, rendant en pratique la mise en oeuvre délicate.Numerous reporter genes are already used in genetic engineering to select transformed cells. Among those which are used in eukaryotic cells, one will quote for example alcohol dehydrogenase [NIELSEN and PEDERSEN, (1991)], the enzyme
CAT, 5-galactosidase or firefly luciferase. In order for these reporter systems to be compatible with an in situ analysis of living cells, they must be pretreated, either to permeabilize their membranes or to limit the background noise, which increases rapidly during the measurement in the presence of the substrates. This pretreatment involves manipulations incompatible with rapid and routine analysis. The use of reporter genes whose product is secreted in the environment could remove these obstacles. This is the case with alkaline phosphatase from the human placenta, the activity of which can be detected in the culture medium by bioluminescence. Although sensitive, this method has several major drawbacks which make it difficult to apply for the selection of transgenic embryos: it involves cultivating the embryos separately, carrying out repeated samples from the culture medium; on the other hand, the detection of the signal is obtained in two stages, which results in a rapid dilution of the signal in the surrounding medium, making in practice the implementation difficult.
Jusqu'à présent, le seul gène utilisé en tant que gène rapporteur pour le tri d'animaux transgéniques est un minigène de la tyrosinase qui transforme des souris albinos en souris pigmentées [OVERBEEK et al., (1991)], et qui a été mis en oeuvre chez la souris pour visualiser les nouveaux-nés transgéniques. Ce gène n'est toutefois pas utilisable pour une visualisation précoce avant transplantation des embryons injectés. Until now, the only gene used as a reporter gene for sorting transgenic animals is a tyrosinase minigene which transforms albino mice into pigmented mice [OVERBEEK et al., (1991)], and which has been used in mice to visualize transgenic newborns. However, this gene cannot be used for early visualization before transplanting the injected embryos.
Les Inventeurs ont maintenant sélectionné un gène rapporteur dont le produit est sécrété dans le milieu et aisément détectable : il s'agit du gène de la luciférase de Vargula (Vargula hilgendorfii) [THOMPSON et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 6567-6571, (1989)
THOMPSON et al., Gene, 199-204 (1990)].The inventors have now selected a reporter gene whose product is secreted in the medium and easily detectable: it is the gene of Vargula luciferase (Vargula hilgendorfii) [THOMPSON et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 6567-6571, (1989)
THOMPSON et al., Gene, 199-204 (1990)].
L'activité de cette luciférase est détectable qualitativement et quantitativement par mesure de la luminescence induite dans le milieu, en présence de son substrat (luciférine), et d'O2
Le turn-over de la luciférase de Vargula est beaucoup plus élevé que celui des autres luciférases connues (1600 molécules par minute alors qu'il n'est que de quelques dizaines pour la luciférase de mouche), ce qui augmente d'autant la sensibilité de détection, et constitue un avantage important en imagerie de luminescence.The activity of this luciferase is detectable qualitatively and quantitatively by measuring the luminescence induced in the medium, in the presence of its substrate (luciferin), and of O2
The turnover of Vargula luciferase is much higher than that of other known luciferases (1600 molecules per minute whereas it is only a few tens for fly luciferase), which increases the sensitivity accordingly detection, and is an important advantage in luminescence imaging.
Les Inventeurs ont en outre constaté que l'expression du gène de la luciférase de Vargula était détectable chez l'embryon dès les premiers stades du développement (stade 2 cellules), et n'interférait pas avec le développement ultérieur. The inventors have further found that the expression of the Vargula luciferase gene was detectable in the embryo from the early stages of development (stage 2 cells), and did not interfere with subsequent development.
Les Inventeurs ont en outre constaté que la détection du signal lumineux résultant de l'activité de la luciférase de Vargula pouvait être utilisée pour séparer au stade blastocyste les embryons qui expriment le transgène à l'état non-intégré (expression transitoire) de ceux où une intégration a effectivement eu lieu (embryon transgénique). The inventors have further noted that the detection of the light signal resulting from the activity of Vargula luciferase could be used to separate at the blastocyst stage the embryos which express the transgene in the non-integrated state (transient expression) from those where integration has effectively taken place (transgenic embryo).
La présente Invention a pour objet l'utilisation d'un gène codant pour la luciférase de
Vargula, placé sous contrôle d'un promoteur approprié, en tant que gène rapporteur pour la détection d'embryons transgéniques.The subject of the present invention is the use of a gene coding for luciferase from
Vargula, placed under the control of an appropriate promoter, as a reporter gene for the detection of transgenic embryos.
Un "promoteur approprié" est un promoteur fonctionnel dans les cellules eucaryotes, en particulier les cellules de mammifères ; n'importe quel type de promoteur utilisable pour l'obtention d'animaux transgéniques peut convenir ; à titre d'exemple, on citera le promoteur du cytomégalovirus, le promoteur de métallothionéine, celui de la thymidine kinase, celui du facteur d'élongation EF1. An "appropriate promoter" is a functional promoter in eukaryotic cells, in particular mammalian cells; any type of promoter which can be used for obtaining transgenic animals may be suitable; by way of example, mention may be made of the cytomegalovirus promoter, the metallothionein promoter, that of thymidine kinase, that of the elongation factor EF1.
Pour une mise en oeuvre optimale de l'objet de l'Invention, on choisira de préférence un promoteur fort, afin d'obtenir une expression importante de la luciférase, ce qui augmente la sensibilité de la méthode. For an optimal implementation of the object of the invention, a strong promoter will preferably be chosen, in order to obtain a significant expression of the luciferase, which increases the sensitivity of the method.
Les Inventeurs ont obtenu plusieurs lignées de souris transgéniques homozygotes dans lesquelles les séquences codantes du gène de la luciférase de Vargula sont placées sous la dépendance du promoteur HSP 70-1 [HUNT et CALDERWOOD, (1990)]. Cette construction sera dénommée ci-après HSP-70-1-VL. The inventors have obtained several lines of transgenic homozygous mice in which the coding sequences of the Vargula luciferase gene are placed under the dependence of the promoter HSP 70-1 [HUNT and CALDERWOOD, (1990)]. This construction will be referred to below as HSP-70-1-VL.
L'activité luciférase dans le milieu de culture de blastocystes prélevés sur des souris transgéniques possédant seulement 2 copies de la construction HSP-70-1-VL peut être directement visualisée, après simple addition du substrat de la luciférase, sous un microscope optique équipé d'une caméra. The luciferase activity in the culture medium of blastocysts taken from transgenic mice having only 2 copies of the HSP-70-1-VL construct can be directly viewed, after simple addition of the luciferase substrate, under an optical microscope equipped with 'a camera.
Cette visualisation est rapide (10 à 30 secondes d'accumulation d'image suffisent), peut être effectuée à plusieurs stades d'évolution du blastocyste et est compatible avec le criblage simultané de plusieurs embryons. This visualization is rapid (10 to 30 seconds of image accumulation is sufficient), can be carried out at several stages of evolution of the blastocyst and is compatible with the simultaneous screening of several embryos.
Les Inventeurs ont en outre constaté que lorsque l'ensemble promoteur/gène de la luciférase de
Vargula est flanqué en 5' et 3' de séquences SAR, le niveau moyen d'activité luciférase mesuré dans les milieux de culture de blastocystes portant cette construction intégrée dans le génome est augmenté de façon importante (environ 10 fois). The inventors have further found that when the promoter / gene luciferase gene of
Vargula is flanked in 5 ′ and 3 ′ of SAR sequences, the average level of luciferase activity measured in the culture media of blastocysts carrying this construction integrated into the genome is significantly increased (approximately 10 times).
Des séquences SAR (Scaffold Attached Regions) également dénommées séquences MAR (Matrix Attached
Regions) ont été mises en évidence en 5' et 3' du gène de l'interféron ss humain, [BODE et MAASS, Biochemistry, 27, 4706-4711 (1988)]. D'autres séquences SAR ont également été mises en évidence en 3' et 5' de divers gènes : [KAS
AND CHASIN, J. Mol. Biol. 198: 677-692, (1987) ; GASSER
AND LAEMMLI, Cell 46: 521-530, (1986) ; COCKERILL AND
GARRARD, Cell 44: 273-282, (1986) ; PHI-VAN AND
STRATLING, EMBO, 7: 655-664, (1988) ; JARMAN AND HIGGS,
EMBO 7: 3337-3344 (1988)].SAR sequences (Scaffold Attached Regions) also called MAR sequences (Matrix Attached
Regions) have been identified 5 'and 3' from the human interferon ss gene, [BODE and MAASS, Biochemistry, 27, 4706-4711 (1988)]. Other SAR sequences have also been demonstrated in 3 'and 5' of various genes: [KAS
AND CHASIN, J. Mol. Biol. 198: 677-692, (1987); GASS
AND LAEMMLI, Cell 46: 521-530, (1986); COCKERILL AND
GARRARD, Cell 44: 273-282, (1986); PHI-VAN AND
STRATLING, EMBO, 7: 655-664, (1988); JARMAN AND HIGGS,
EMBO 7: 3337-3344 (1988)].
I1 a été montré que ces séquences SAR augmentent, indépendamment de leur orientation, la transcription des gènes qu'elles flanquent, lorsque ceuxci sont à l'état intégré, mais en revanche répriment l'expression de ces gènes lorsque ceux-ci sont portés par une molécule d'ADN sous forme linéarisée [KLEHR et al.,
Biochemistry, 30, 1264-1270 (1991)]. I1 has been shown that these SAR sequences increase, independently of their orientation, the transcription of the genes which they flank, when these are in the integrated state, but on the other hand repress the expression of these genes when they are carried by a DNA molecule in linearized form [KLEHR et al.,
Biochemistry, 30, 1264-1270 (1991)].
D'autre part, les Inventeurs ont constaté que ces mêmes séquences SAR n'exercent pas d'effet stimulateur sur l'expression du gène qu'elles flanquent lorsque 1'ADN portant cette construction est présent à l'état non-intégré, mais sous forme super-enroulée, alors que les observations faites par KLEHR et al concernaient uniquement 1ADN linéaire déroulé. On the other hand, the inventors have found that these same SAR sequences do not exert a stimulating effect on the expression of the gene which they flank when the DNA carrying this construct is present in the non-integrated state, but in supercoiled form, while the observations made by KLEHR et al concerned only unrolled linear DNA.
La présence de séquences SAR permet donc d'augmenter l'écart entre le niveau d'activité luciférase due à l'expression transitoire, et celui dû à 1expression de 1'ADN intégré. The presence of SAR sequences therefore makes it possible to increase the difference between the level of luciferase activity due to the transient expression, and that due to the expression of the integrated DNA.
Les Inventeurs ont en outre également constaté que l'activité de stimulation de l'expression du trans gène par les séquences flanquantes SAR, qui est observée chez l'embryon, ne s'exerce plus dans les tissus différenciés des animaux transgéniques nouveaux-nés et adultes, ce qui offre l'avantage de limiter les risques d'interférence d'une production élevée de luciférase avec la physiologie des animaux. The inventors have also found that the activity of stimulating the expression of the trans gene by the flanking SAR sequences, which is observed in the embryo, no longer exerts in the differentiated tissues of newborn transgenic animals and adults, which has the advantage of limiting the risks of interference of a high production of luciferase with the physiology of animals.
Le gène hétérologue dont on souhaite détecter l'intégration peut être placé sur le même fragment d'ADN que le gène chimérique rapporteur conforme à l'Invention. The heterologous gene whose integration is to be detected can be placed on the same DNA fragment as the chimeric reporter gene according to the invention.
I1 peut également être situé sur un autre fragment d'ADN qui est alors co-injecté avec le fragment portant le gène chimérique rapporteur. On a en effet observé que la coinjection dans l'oeuf de souris d'ADN différents est compatible avec l'expression normale de chaque ADN dans l'animal adulte [EINAT et al. Genes Devel., 1, 1075-1084, (1987), OVERBECK et al., Transgenic Research, 1, 31-37, (1991)]
Le gène hétérologue peut éventuellement être placé sous contrôle du même promoteur que le gène de la luciférase ; toutefois, il est préférable qu'il soit muni de ses propres séquences de contrôle (promoteur, enhancer, etc ...)
La présente Invention a pour objet un gène chimérique, utilisable en tant que gène rapporteur pour détecter l'insertion d'un gène hétérologue, caractérisé en ce qu'il comprend
- une séquence codant pour la luciférase de
Vargula, laquelle séquence est placée sous contrôle d'un promoteur approprié
- l'ensemble étant flanqué en 5' et 3' de séquences SAR.It can also be located on another DNA fragment which is then co-injected with the fragment carrying the chimeric reporter gene. It has in fact been observed that coinjection into the egg of mice of different DNAs is compatible with the normal expression of each DNA in the adult animal [EINAT et al. Genes Devel., 1, 1075-1084, (1987), OVERBECK et al., Transgenic Research, 1, 31-37, (1991)]
The heterologous gene can optionally be placed under the control of the same promoter as the luciferase gene; however, it is preferable that it be provided with its own control sequences (promoter, enhancer, etc.)
The subject of the present invention is a chimeric gene which can be used as a reporter gene to detect the insertion of a heterologous gene, characterized in that it comprises
- a sequence coding for luciferase from
Vargula, which sequence is placed under the control of an appropriate promoter
- the assembly being flanked in 5 'and 3' of SAR sequences.
Les Inventeurs ont établi, avec différentes constructions conformes à l'Invention et comprenant des séquences SAR, plusieurs lignées de souris transgéniques. The inventors established, with different constructions in accordance with the invention and comprising SAR sequences, several lines of transgenic mice.
En quantifiant l'activité luciférase de leurs embryons, il est possible de mesurer finement l'effet de perturbations de l'environnement chromatinien sur l'activité du noyau embryonnaire à différents stades de la période préimplantatoire.By quantifying the luciferase activity of their embryos, it is possible to measure finely the effect of disturbances of the chromatin environment on the activity of the embryonic nucleus at different stages of the preimplantation period.
La présente Invention peut être mise en oeuvre pour rendre utilisable en routine chez différentes espèces animales, y compris les mammifères, mais également d'autres animaux tels que les poissons, et en particulier chez les animaux d'élevage, le tri, à différents stades du développement, des embryons effectivement transgéniques après microinjection au stade pronoyau. The present invention can be implemented to make it usable routinely in different animal species, including mammals, but also other animals such as fish, and in particular in farm animals, sorting, at different stages. of development, effectively transgenic embryos after microinjection at the pronauau stage.
Chez la souris, on sait que environ la moitié des blastocystes positifs pour la présence d'ADN exogène après injection au stade pronoyau (et détection après amplification par PCR) sont effectivement transgéniques. In mice, it is known that approximately half of the blastocysts positive for the presence of exogenous DNA after injection at the pronal stage (and detection after amplification by PCR) are effectively transgenic.
On peut utiliser cette espèce pour réaliser un calibrage des constructions en définissant lors de l'observation des embryons en microscopie de luminescence un temps seuil d'enregistrement des images obtenues, temps à partir duquel seule l'activité des morulas ou blastocystes transgéniques sera effectivement prise en compte.This species can be used to calibrate the constructs by defining, during the observation of the embryos under luminescence microscopy, a threshold time for recording the images obtained, time from which only the activity of the transgenic morulas or blastocysts will be effectively taken. into account.
La présente Invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de construction d'animaux transgéniques conformes à l'Invention, et de détection de l'activité luciférase chez les embryons de ces animaux. The present invention will be better understood with the aid of the additional description which follows, which refers to examples of construction of transgenic animals in accordance with the invention, and of detection of luciferase activity in embryos of these animals .
I1 doit être bien entendu toutefois que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'Invention dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. It should be understood, however, that these examples are given solely by way of illustration of the subject of the invention of which they do not in any way constitute a limitation.
EXEMPLE 1 - CONSTRUCTION D'UN PLASMIDE COMPRENANT LE GENE
DE LA LUCIFERASE DE VARGULA SOUS CONTROLE DU PROMOTEUR HSP70-1
Un fragment HincII de 800 pb comprenant les éléments essentiels du promoteur du gène HSP70-1 de souris [HUNT et CALDERWOOD, Gene, 87, 199-204, (1990)]., à savoir 4 éléments inductibles par choc thermique, disposés en tandem, et permettant la liaison de facteurs de transcription spécifiques du choc thermique ; une boîte CCAAT en orientation inverse; une boîte TATA en orientation inverse ; deux sites de liaison pour le facteur de transcription SP1, et un site de liaison pour le facteur de transcription AP2, a été obtenu à partir d'un fragment BglII-NcoI isolé d'un fragment EcoRI du plasmide pM2.3 de HUNT et CALDERWOOD (Gène 87, 199-204, 1990) et cloné au site HincII du plasmide pBluescript SK (STRATAGENE). Le plasmide ainsi obtenu a été dénommé pBHS
Un fragment HindIII-BamHI de 2000 pb codant pour la luciférase de Vargula a été obtenu à partir du plasmide PRSWL [THOMSON et al., Proc. Natl. Acad. Sci.EXAMPLE 1 CONSTRUCTION OF A PLASMID COMPRISING THE GENE
VARGULA LUCIFERASE UNDER CONTROL OF THE HSP70-1 PROMOTER
A 800 bp HincII fragment comprising the essential elements of the promoter of the mouse HSP70-1 gene [HUNT and CALDERWOOD, Gene, 87, 199-204, (1990)], namely 4 elements shock-inducible, arranged in tandem , and allowing the binding of specific transcription factors of thermal shock; a CCAAT box in reverse orientation; a TATA box in reverse orientation; two binding sites for the transcription factor SP1, and one binding site for the transcription factor AP2, was obtained from a BglII-NcoI fragment isolated from an EcoRI fragment of the plasmid pM2.3 from HUNT and CALDERWOOD (Gene 87, 199-204, 1990) and cloned at the HincII site of the plasmid pBluescript SK (STRATAGENE). The plasmid thus obtained was designated pBHS
A 2000 bp HindIII-BamHI fragment coding for Vargula luciferase was obtained from the plasmid PRSWL [THOMSON et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 86, 6567-6571 (1989)] et cloné entre les sites Hind
III et BamHI du vecteur pBHS. Le plasmide obtenu de la sorte a été dénommé pBHSVL.USA, 86, 6567-6571 (1989)] and cloned between Hind sites
III and BamHI of the vector pBHS. The plasmid obtained in this way was designated pBHSVL.
EXEMPLE 2 - CONSTRUCTION D'UN PLASMIDE COMPRENANT DES
SEQUENCES SAR 3' et 5'
D'autre part, des séquences SAR 5' et 3' ont été obtenues comme suit
A partir d'une banque d'ADNc humain, il est possible d'amplifier la séquence du gène codant pour l'interféron ss, en utilisant des amorces appropriées, dérivées de la séquence publiée par OHNO et TANIGUCHI, [Proc. Natl. Acad. Sci. 78, 5305-5309, (1981)]. Après purification du fragment amplifié par électrophorèse sur gel d'agarose, des sondes marquées au 32P sont obtenues par amorçage aléatoire à partir de ce fragment ; ces sondes sont alors utilisées pour cribler une banque d'ADN génomique humain, afin d'obtenir des clones génomiques comprennant les séquences flanquantes 5' et 3' du gène de l'interféron ss. EXAMPLE 2 CONSTRUCTION OF A PLASMID COMPRISING
3 'and 5' SAR SEQUENCES
On the other hand, 5 'and 3' SAR sequences were obtained as follows
From a human cDNA library, it is possible to amplify the sequence of the gene coding for interferon ss, using appropriate primers, derived from the sequence published by OHNO and TANIGUCHI, [Proc. Natl. Acad. Sci. 78, 5305-5309, (1981)]. After purification of the amplified fragment by electrophoresis on agarose gel, 32 P-labeled probes are obtained by random priming from this fragment; these probes are then used to screen a human genomic DNA library, in order to obtain genomic clones comprising the 5 'and 3' flanking sequences of the interferon ss gene.
A partir des clones génomiques obtenus, et en se basant sur la carte de restriction des régions SAR en 3' et 5' du gène de l'interféron ss qui a été publiée par
BODE et MAASS, [Biochemistry, 27: 4706-4711, (1988)], l'on procède au sous-clonage d'un fragment EcoRI de 2,2 kb qui comprend la séquence SAR 5', et d'un fragment
BglIII de 3 kb qui comprend la séquence SAR 3'.From the genomic clones obtained, and based on the restriction map of the SAR regions in 3 'and 5' of the interferon ss gene which has been published by
BODE and MAASS, [Biochemistry, 27: 4706-4711, (1988)], a 2.2 kb EcoRI fragment which comprises the 5 'SAR sequence is subcloned, and a fragment
3 kb BglIII which includes the 3 'SAR sequence.
Le fragment BglIII de 3 kb a été cloné dans le site BamHI du plasmide pBHSVL décrit ci-dessus pour donner le plasmide pSHSVL. D'autre part, le fragment
EcoRI de 2,2 kb préalablement pourvu à chacune de ses extrémités d'adaptateurs XhoI-EcoRI a été inséré dans le site XhoI de pSHSVL, en 5' du promoteur HSP70.1.The 3 kb BglIII fragment was cloned into the BamHI site of the plasmid pBHSVL described above to give the plasmid pSHSVL. On the other hand, the fragment
2.2 kb EcoRI previously provided with XhoI-EcoRI adapters at each of its ends was inserted into the XhoI site of pSHSVL, 5 ′ of the HSP70.1 promoter.
Le plasmide obtenu a été dénommé pSHSVLS
EXEMPLE 3 - OBTENTION DE SOURIS TRANSGENIQUES
Les souris transgéniques ont été obtenues à partir des deux constructions différentes, pBHSVL (SAR ) et pSHSVLS (SAR+) obtenues selon les protocoles décrits respectivement aux exemples 1 et 2.The plasmid obtained was designated pSHSVLS
EXAMPLE 3 - OBTAINING TRANSGENIC MICE
The transgenic mice were obtained from the two different constructs, pBHSVL (SAR) and pSHSVLS (SAR +) obtained according to the protocols described in Examples 1 and 2 respectively.
Les fragments KpnI-BamHI de pBHSVL et KpnI
NotI de pSHSVLS ont été purifiés à partir de gels d'agarose (kit GENE CLEAN ; BIO 101), et 1'ADN a été injecté à une concentration de 2ng/R1 dans les pronuclei d'oeufs fertilisés obtenus par croisement d'hybrides F1 (mâles et femelles) C57BL6/CDA.The KpnI-BamHI fragments of pBHSVL and KpnI
NotI of pSHSVLS were purified from agarose gels (GENE CLEAN kit; BIO 101), and DNA was injected at a concentration of 2ng / R1 into the pronuclei of fertilized eggs obtained by crossing F1 hybrids (males and females) C57BL6 / CDA.
Les fondateurs transgéniques ont été identifiés par PCR en utilisant des amorces spécifiques du gène de la luciférase de Vargula. Le nombre de copies du gène a été déterminé par analyse densitométrique de transferts de Southern réalisés de façon quantitative. The transgenic founders were identified by PCR using primers specific for the Vargula luciferase gene. The number of copies of the gene was determined by densitometric analysis of Southern blots carried out quantitatively.
Après identification des fondateurs, ceux-ci ont été croisés entre eux afin d'obtenir des animaux homozygotes pour le transgène.After identifying the founders, they were crossed with each other in order to obtain animals homozygous for the transgene.
EXEMPLE 4 - OBTENTION DES EMBRYONS ET DES TISSUS
D'ANIMAUX TRANSGENIQUES
1) Embrvons
Une surovulation a été induite chez des hybrides F1 femelles C57BL6/CBA, en injectant 10U de gonadotropine de sérum de jument gestante (PMSG
INTERVET) dans 0,1 ml de sérum physiologique, cette injection étant suivie 46 à 48 heures plus tard par l'injection de 5U de gonadotropine chorionique humaine (HCG ; INTERVET), dans 0,1 ml de la même solution. Les femelles traitées ont été accouplées avec des mâles transgéniques homozygotes pour le transgène, et des embryons au stade 1 cellule ont été récupérés dans les oviductes 21 à 23 heures après l'injection d'HCG.EXAMPLE 4 - OBTAINING EMBRYOS AND TISSUES
TRANSGENIC ANIMALS
1) Let's kiss
Over-ovulation was induced in female F1 hybrids C57BL6 / CBA, by injecting 10U of pregnant mare serum gonadotropin (PMSG
INTERVET) in 0.1 ml of physiological saline, this injection being followed 46 to 48 hours later by the injection of 5 U of human chorionic gonadotropin (HCG; INTERVET), in 0.1 ml of the same solution. Treated females were mated with transgenic males homozygous for the transgene, and 1-cell stage embryos were recovered from the oviducts 21 to 23 hours after the injection of HCG.
Les embryons ont été placés dans des gouttes de milieu M16 [HOGAN et al., Manipulating the mouse embryo : a laboratory manual. Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring harbor, N.Y. (1986)] à une densité d'environ 1 embryon/ml de milieu de culture. Les embryons ont été cultivés en incubateur, à une température de 37 C et en présence de 8% C02. The embryos were placed in drops of M16 medium [HOGAN et al., Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual. Cold spring harbor
Laboratory Press, Cold Spring harbor, NY (1986)] at a density of approximately 1 embryo / ml of culture medium. The embryos were cultured in an incubator, at a temperature of 37 C and in the presence of 8% C02.
L'expression constitutive est mesurée tout au long de la période de culture en prélevant un peu de milieu à des intervalles de temps souhaités, et en le remplaçant à chaque fois par du milieu frais. Chaque fraction prélevée est immédiatement congelée à -80'C jusqu'à la détection de l'activité luciférase. The constitutive expression is measured throughout the culture period by taking a little medium at desired time intervals, and replacing it each time with fresh medium. Each fraction removed is immediately frozen at -80 ° C until detection of luciferase activity.
Pour déterminer l'expression inductible au stade blastocyte, des boîtes de cultures contenant des blastocytes (101-112 heures après HCG) scellées au moyen d'un film d'étanchéité, ont été immergées dans un bain d'eau à 43 C pendant 30 minutes. Le film d'étanchéité a été enlevé, et les boîtes placées à nouveau dans l'incubateur à 37 C. La luciférase de Vargula commence à s'accumuler dans le milieu après environ 3 heures. On peut suivre la cinétique d'accumulation par des prélèvements successifs, ou mesurer la quantité totale accumulée à la fin de la culture. To determine the inducible expression at the blastocyte stage, culture dishes containing blastocytes (101-112 hours after HCG), sealed with a sealing film, were immersed in a water bath at 43 ° C. for 30 minutes. The sealing film was removed, and the dishes placed again in the incubator at 37 C. The Vargula luciferase begins to accumulate in the medium after approximately 3 hours. We can follow the kinetics of accumulation by successive samples, or measure the total amount accumulated at the end of the culture.
2) Tissus d'anlmaux transaéniaues
Des femelles de génération F1 de la lignée hybride C57BL6/CBA ont été accouplées avec des mâles homozygotes pour le transgène. Les gestations ont été menées à terme, et deux lots d'animaux ont été choisis pour les expérimentations : ou bien des souriceaux de 1 jour, ou des adultes de 5 semaines. Les animaux ont été sacrifiés et des échantillons de tissu prélevés. 2) Tissues of transaenial animals
F1 generation females of the hybrid C57BL6 / CBA line were mated with males homozygous for the transgene. The gestations were completed, and two batches of animals were chosen for the experiments: either mice of 1 day, or adults of 5 weeks. The animals were killed and tissue samples were taken.
EXEMPLE 5 - DETERMINATION DE L'ACTIVISTE LUCIFERASE
L'activité de la luciférase sécrétée par les embryons est analysée par deux méthodes différentes
1ère méthode
On prélève un aliquot du milieu de culture des embryons. Cet aliquot est alors dilué avec 200 mM de
Tris-HCl, pH 7,6, jusqu'à un volume de 100 ru. EXAMPLE 5 - DETERMINATION OF THE LUCIFERASE ACTIVIST
The luciferase activity secreted by embryos is analyzed by two different methods
1st method
An aliquot of the embryo culture medium is taken. This aliquot is then diluted with 200 mM of
Tris-HCl, pH 7.6, up to a volume of 100 ru.
L'échantillon ainsi dilué est placé au fond d'un tube de mesure de 5 ml (SARSTEDT) et introduit dans la chambre de mesure d'un photomètre LUMAT LB 9501 (BERTHOLD
Instruments). La luciférine, substrat de la luciférase de
Vargula, est préparée selon l'un des protocoles décrits par TSUJI [Methods Enzymol. 57, 364-372, (1978)], ou par
KISHI et al., [Tetrahedron Lett., 3445-3450, (1966)],
INOUE et al.[Tetrahedron Lett., 1609-1610, (1969)],
SUGIURA et al., [Yakugaku Zasshi, 90, 707-710 (1970]. Une solution 100 nM de luciférase dans 200 mM de tampon phosphate de sodium à pH 6,8 est placée dans un récipient de verre dans lequel on fait barboter en continu de l'argon (afin de prévenir l'auto-oxydation de la luciférine). Pour mesurer l'activité luciférase de l'échantillon, 100 1 de la solution de luciférine est injectée dans le tube comprenant l'échantillon, et l'intensité de la lumière émise est mesurée par le photomètre.The sample thus diluted is placed at the bottom of a 5 ml measuring tube (SARSTEDT) and introduced into the measuring chamber of a LUMAT LB 9501 photometer (BERTHOLD
Instruments). Luciferin, substrate for luciferase
Vargula, is prepared according to one of the protocols described by TSUJI [Methods Enzymol. 57, 364-372, (1978)], or by
KISHI et al., [Tetrahedron Lett., 3445-3450, (1966)],
INOUE et al. [Tetrahedron Lett., 1609-1610, (1969)],
SUGIURA et al., [Yakugaku Zasshi, 90, 707-710 (1970). A 100 nM solution of luciferase in 200 mM sodium phosphate buffer at pH 6.8 is placed in a glass container which is bubbled in. continuous argon (to prevent auto-oxidation of luciferin). To measure the luciferase activity of the sample, 100 l of the luciferin solution is injected into the tube comprising the sample, and the intensity of the light emitted is measured by the photometer.
2ème méthode : L'activité luciférase peut également être visualisée directement sous microscope, muni d'une caméra (Argus-50, HAMMAMATSU instruments). Des gouttes de 2 1 d'une solution 50 ÂM de luciférine dans du tampon PBS sont disposées dans la chambre de microscopie, et recouvertes d'huile. Les embryons sont introduits dans ces gouttes, et l'ensemble est placé sous un microscope à inversion muni d'une caméra. Après exposition pendant une période de 10 à 30 secondes, la luminescence émise par les embryons transgéniques qui ont intégré le gène de la luciférase est détectée, ce qui permet la sélection des embryons. 2nd method: The luciferase activity can also be viewed directly under a microscope, equipped with a camera (Argus-50, HAMMAMATSU instruments). 2 L drops of a 50 ÂM solution of luciferin in PBS buffer are placed in the microscopy chamber, and covered with oil. The embryos are introduced into these drops, and the whole is placed under an inversion microscope equipped with a camera. After exposure for a period of 10 to 30 seconds, the luminescence emitted by the transgenic embryos which have integrated the luciferase gene is detected, which allows the selection of the embryos.
RESULTATS
I1 est connu que le gène HSP70-1 s'exprime de façon constitutive chez l'embryon au stade 2-cellules et est inductible par le choc thermique au stade blastocyte [BENSAUDE et al., Nature, 305, 331-333, (1983)].RESULTS
It is known that the HSP70-1 gene is expressed constitutively in the embryo at the 2-cell stage and is inducible by heat shock at the blastocyte stage [BENSAUDE et al., Nature, 305, 331-333, (1983 )].
Le développement in vitro des embryons transgéniques contenant les constructions avec les séquences SAR, ou sans celles-ci, est le même que celles des embryons non transgéniques utilisés comme contrôle. The in vitro development of transgenic embryos containing the constructs with or without the SAR sequences is the same as that of the non-transgenic embryos used as a control.
Les lignées SAR+ montrent une expression plus élevée que les lignées SAR- aussi bien au stade 2-cellules qu'au stade blastocyte.The SAR + lines show a higher expression than the SAR- lines both at the 2-cell stage and at the blastocyte stage.
Au stade 2-cellules, toutes les lignées SARmontrent pratiquement le même niveau basal d'expression, qui n'apparaît pas dépendant du nombre de copies. En revanche, les lignées transgéniques SAR+ expriment la luciférase à des niveaux plus élevés, et l'expression est fonction du nombre de copies. En moyenne, on observe une expression 6 fois plus élevée dans le groupe SAR+ que dans le groupe SAR-. Lorsque cette expression est ramenée au nombre de copies, on observe une augmentation 2 fois et demi plus élevée dans le groupe SAR+ que dans le groupe SAR-. Au stade blastocyte, le même type d'observations a été fait : les lignées SAR- expriment la luciférase de façon indépendante du nombre de copies, alors que dans les lignées SAR+ l'expression de la luciférase est en corrélation positive avec le nombre de copies. L'expression par copie dans les lignées SAR+ est 4,1 fois plus importante que l'expression par copie dans les lignées SAR-. At the 2-cell stage, all SAR lines show practically the same basal level of expression, which does not appear to be dependent on the number of copies. In contrast, transgenic SAR + lines express luciferase at higher levels, and expression is a function of the number of copies. On average, an expression 6 times higher is observed in the SAR + group than in the SAR- group. When this expression is reduced to the number of copies, there is an increase 2.5 times greater in the SAR + group than in the SAR- group. At the blastocyte stage, the same type of observations were made: the SAR- lines express luciferase independently of the number of copies, while in SAR lines + the expression of luciferase is positively correlated with the number of copies . Copy expression in SAR + lines is 4.1 times greater than copy expression in SAR- lines.
Les résultats de l'expression dans les tissus d'animaux nouveaux-nés et d'adultes montrent qu'il n'y a plus de stimulation de l'expression du transgène par les séquences flanquantes SAR dans les tissus différenciés, à l'exception toutefois des biopsies de queue, dans lesquelles il semble que les séquences SAR confèrent encore un certain degré de stimulation de l'expression du transgène. The results of expression in the tissues of newborn animals and adults show that there is no longer stimulation of the expression of the transgene by the flanking SAR sequences in the differentiated tissues, with the exception however tail biopsies, in which it appears that the SAR sequences still confer some degree of stimulation of transgene expression.
En outre, l'expression du transgène décroît de la souris nouveau-né à la souris adulte dans le cas des lignées SAR-, alors que dans le cas des lignées SAR+ elle est sensiblement équivalente quelque soit l'âge de 1 'animal. In addition, the expression of the transgene decreases from the newborn mouse to the adult mouse in the case of the SAR- lines, whereas in the case of the SAR + lines it is substantially equivalent whatever the age of the animal.
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