FR2710916A1 - Compounds of peptide nature having a serotoninergic response-modulating activity, diagnostic and therapeutic applications - Google Patents
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Abstract
Description
La présente invention a pour objet des composés de nature peptidique possédant la propriété de modifier la transmission sérotoninergique ainsi que les applications diagnostiques et thérapeutiques de ces composés. The subject of the present invention is compounds of peptide nature having the property of modifying serotonergic transmission as well as the diagnostic and therapeutic applications of these compounds.
Le système sérotoninergique cérébral est un système de neurotransmission cérébral et périphérique, qui met en oeuvre la sérotonine ou 5-hydroxytryptamine (5-HT) découverte dans les années 1949-50. The cerebral serotonergic system is a cerebral and peripheral neurotransmission system, which uses the serotonin or 5-hydroxytryptamine (5-HT) discovered in the years 1949-50.
Au niveau central, ce système est particulier, dans la mesure où il est extrêmement centralisé (tous les corps cellulaires sont localisés dans la région postérieure du cerveau, le raphé) et où il se projette dans pratiquement toutes les régions du cerveau. Il est caractérisé par un nombre extrêmement élevé de varicosités (ou équivalent de terminaisons neuronales) le long des axones ; cette disposition multiplie ses points d'interactions avec les autres systèmes neuronaux cérébraux. De plus, une très grande partie de ces varicosités ne présente pas de profil synaptique, c'està-dire que la 5-HT libérée par ces "terminaisons" va diffuser et atteindre les cibles (récepteurs) situées à une certaine distance ; ce mécanisme nécessite la mise en oeuvre de récepteurs particuliers possédant une affinité élevée pour l'amine. Cette disposition structurale est tout à fait favorable à une fonction de contrôle de l'ensemble des cellules neuronales du cerveau, et par là à un rôle essentiel dans le maintien de l'homéostasie du système nerveux central. At the central level, this system is particular, insofar as it is extremely centralized (all the cellular bodies are located in the posterior region of the brain, the raphe) and where it projects in practically all regions of the brain. It is characterized by an extremely high number of spider veins (or equivalent of neuronal endings) along the axons; this arrangement multiplies its points of interaction with other cerebral neural systems. In addition, a very large part of these spider veins does not have a synaptic profile, that is to say that the 5-HT released by these "endings" will diffuse and reach the targets (receptors) located at a certain distance; this mechanism requires the use of particular receptors having a high affinity for the amine. This structural arrangement is entirely favorable to a function of control of all the neuronal cells of the brain, and thereby to an essential role in the maintenance of homeostasis of the central nervous system.
Pour exercer ce contrôle, le système 5-HT met en oeuvre une grande variété de récepteurs spécifiques. To exercise this control, the 5-HT system uses a wide variety of specific receptors.
Il s'agit en effet de plusieurs familles dont certaines sont bien caractérisées (5-HT1, 5-HT2, 5-HT3, 5-HT4) et d'autres mises en évidence plus récemment sont encore peu connues (5-HT5, 5-HT6, 5-HT). Certaines d'entre elles sont représentées par de nombreux sous-types ; c'est le cas en particulier de la famille 5-HT1, caractérisée par une affinité nanomolaire de la 5-HT pour ces sites, et qui comporte les sous-types S-HT1A,,D.E,. These are indeed several families, some of which are well characterized (5-HT1, 5-HT2, 5-HT3, 5-HT4) and others highlighted more recently are still little known (5-HT5, 5 -HT6, 5-HT). Some of them are represented by many subtypes; this is the case in particular of the 5-HT1 family, characterized by a nanomolar affinity of 5-HT for these sites, and which comprises the subtypes S-HT1A ,, D.E ,.
Les récepteurs de type 5-HT1B et 5-HT iD sont localisés sur les terminaisons sérotoninergiques et nonsérotoninergiques, où ils modulent la libération du neurotransmetteur contenu dans ces terminaisons, en particulier ils peuvent réguler la libération de la 5-HT elle-même (autorécepteurs) et jouer alors un rôle déterminant dans l'activité de la neurotransmission sérotoninergique. The 5-HT1B and 5-HT iD type receptors are located on the serotonergic and nonserotonergic terminations, where they modulate the release of the neurotransmitter contained in these terminations, in particular they can regulate the release of 5-HT itself (autoreceptors ) and then play a decisive role in the activity of serotonergic neurotransmission.
D'un point de vue fondamental, le système sérotoninergique est impliqué dans de très nombreuses fonctions physiologiques et dans de nombreuses pathologies, et notamment dans le syndrome dépressif. From a fundamental point of view, the serotonergic system is involved in many physiological functions and in many pathologies, and in particular in depressive syndrome.
La dépression est un désordre psychiatrique encore mal connu malgré les très nombreuses études qui lui ont été consacrées. Cependant, il est maintenant assez clair qu'une très grande partie sinon la totalité des dépressions implique le système sérotoninergique et notamment, il est généralement accepté qu'il existe une relation entre un déficit sérotoninergique et le suicide. Depression is a psychiatric disorder still poorly understood despite the very many studies that have been devoted to it. However, it is now fairly clear that a very large part if not all of the depressions involve the serotonergic system and in particular, it is generally accepted that there is a relationship between a serotonergic deficit and suicide.
En outre, les médicaments antidépresseurs interagissent pour un grand nombre d'entre eux avec le système sérotoninergique et les plus récents, qui sont les plus efficaces et qui possèdent le moins d'effets indésirables, sont le plus souvent de type "sérotoninergique". Ces substances aboutissent toutes, par des mécanismes divers, à faciliter la transmission sérotoninergique (inhibiteurs de monoamine oxydases, inhibiteurs de recapture, agonistes 5-HT,,). Mais d'une part, leur efficacité est limitée, et d'autre part, ils possèdent encore pour nombre d'entre eux des effets secondaires importants, et enfin, leur délai d'action est important ( > 2 semaines). In addition, many of the antidepressant drugs interact with the serotonergic system and the most recent, which are the most effective and have the least number of side effects, are most often of the "serotonergic" type. These substances all lead, by various mechanisms, to facilitate serotonergic transmission (monoamine oxidase inhibitors, reuptake inhibitors, 5-HT agonists,). But on the one hand, their effectiveness is limited, and on the other hand, they still have significant side effects for many of them, and finally, their time of action is important (> 2 weeks).
Les résultats récents de la littérature et des inventeurs indiquent que les récepteurs 5-HT,,/,, pourraient jouer un rôle important dans le syndrome dépressif et dans le mécanisme d'action des antidépresseurs. Il a en effet été montré que non seulement ils modulent la libération d'acétylcholine, mais ils modulent aussi celle de la 5-HT elle-même, et par là même régulent de façon efficace la transmission sérotoninergique dont on sait l'importance dans le syndrome dépressif. De plus, ils sont la cible des antidépresseurs qui interagissent de façon vraisemblablement non compétitive ; autrement dit, les antidépresseurs reconnaîtraient un site distinct des récepteurs 5-HT1B/lD, mais étroitement interactif avec ces derniers. Recent results from the literature and the inventors indicate that the 5-HT receptors ,, / ,, could play an important role in the depressive syndrome and in the mechanism of action of antidepressants. It has indeed been shown that not only do they modulate the release of acetylcholine, but they also modulate that of 5-HT itself, and thereby effectively regulate serotonergic transmission, the importance of which is known in the depressive syndrome. In addition, they are the target of antidepressants which interact in a likely non-competitive manner; in other words, antidepressants would recognize a site distinct from, but closely interactive with, the 5-HT1B / lD receptors.
Les travaux des inventeurs ont permis la mise en évidence d'un composé endogène cérébral reconnaissant un site récepteur capable d'interagir avec le fonctionnement de certains récepteurs 5-HT, en particulier les récepteurs 5-HT,,/,, qui modulent la libération de la 5-HT elle-même. The work of the inventors has made it possible to demonstrate an endogenous cerebral compound recognizing a receptor site capable of interacting with the functioning of certain 5-HT receptors, in particular the 5-HT receptors ,, / ,, which modulate the release. of 5-HT itself.
Le composé endogène cérébral comprend deux fractions peptidiques RET1 (Ala-Leu) et RET2 (Leu-Ser) qui sont toutes deux actives. Il est cependant vraisemblable que ces fractions correspondent à un seul peptide (Ala-Leu-Ser) qui aurait été clivé au cours du processus d'extraction, cela d'autant plus que ce tripeptide s'est avéré actif sur le fonctionnement des récepteur 5-HT1B/lD. The brain endogenous compound comprises two peptide moieties RET1 (Ala-Leu) and RET2 (Leu-Ser) which are both active. It is however likely that these fractions correspond to a single peptide (Ala-Leu-Ser) which would have been cleaved during the extraction process, all the more since this tripeptide has been shown to be active on the functioning of receptors 5 -HT1B / lD.
Les peptides caractérisés possèdent la propriété de modifier la transmission sérotoninergique par leurs interactions avec les autorécepteurs (et aussi les hétérorécepteurs) et devraient jouer un rôle clef dans diverses pathologies psychiatriques où le système 5-HT est notoirement mis en jeu (stress, anxiété, dépression, obsessions compulsives, troubles de l'appétit, du sommeil, troubles du comportement, agressivité, etc...). The characterized peptides have the property of modifying serotonergic transmission by their interactions with autoreceptors (and also heteroreceptors) and should play a key role in various psychiatric pathologies where the 5-HT system is notoriously involved (stress, anxiety, depression , compulsive obsessions, appetite disorders, sleep disorders, behavioral disorders, aggression, etc ...).
L'invention a ainsi pour objet un composé de séquence peptidique
X Leu Y dans laquelle X représente H ou Ala, Y représente OH ou
Ser, sous réserve que X et Y ne représentent pas simultanément
H et OH, respectivement ainsi que les composés correspondants dans lesquels le groupe de liaison peptidique -CO-NH- est remplacé par un groupe de liaison résistant à la dégradation enzymatique des protéases, ou dans lesquels le squelette peptidique comporte un ou plusieurs groupes intercalés rendant la liaison peptidique résistante à la dégradation enzymatique.The subject of the invention is therefore a compound of peptide sequence
X Leu Y in which X represents H or Ala, Y represents OH or
Ser, provided that X and Y do not represent simultaneously
H and OH, respectively as well as the corresponding compounds in which the peptide linking group -CO-NH- is replaced by a linking group resistant to the enzymatic degradation of the proteases, or in which the peptide backbone comprises one or more intercalated groups rendering the peptide bond resistant to enzymatic degradation.
Ainsi, le groupe de liaison peptidique (-CO
NH-) est avantageusement remplacé par un groupe de liaison -CO-NR'-, -CR1R2-CR3R4-, -CO-CR1R2-, R1, R2, R3 et
R4, identiques ou différents, représentant H ou un groupe alkyle en C1-C6, notamment un groupe méthyle, et R' représentant un groupe alkyle en C,-C6.So the peptide linkage group (-CO
NH-) is advantageously replaced by a linking group -CO-NR'-, -CR1R2-CR3R4-, -CO-CR1R2-, R1, R2, R3 and
R4, identical or different, representing H or a C1-C6 alkyl group, in particular a methyl group, and R 'representing a C, -C6 alkyl group.
Parmi les groupes pouvant être intercalés dans le squelette peptidique, on peut citer les groupes suivants -CR1R2-, -NRl- et -O-, R1 et R2 étant définis comme précédemment. Among the groups which can be intercalated in the peptide backbone, mention may be made of the following groups -CR1R2-, -NRl- and -O-, R1 and R2 being defined as above.
Les composés selon l'invention comprennent ainsi les peptides de séquence suivante
Ala - Leu,
Leu - Ser,
Ala - Leu - Ser ainsi que les composés analogues dans lesquels la liaison peptidique est remplacée par une liaison telle que définie ci-dessus, ou dont le squelette comprend un groupe intercalé tel que défini ci-dessus.The compounds according to the invention thus comprise the peptides of the following sequence
Ala - Leu,
Leu - Ser,
Ala - Leu - Ser as well as analogous compounds in which the peptide bond is replaced by a bond as defined above, or the backbone of which comprises an intercalated group as defined above.
Les composés les plus actifs sont ceux dont les aminoacides constitutifs sont sous la forme L, c'està-dire la forme naturelle pour les structures peptidiques définies ci-dessus. The most active compounds are those whose constituent amino acids are in the L form, that is to say the natural form for the peptide structures defined above.
Les composés selon l'invention sont préparés par extraction à partir de cerveau lyophilisé comme décrit ci-après ou plus avantageusement par synthèse peptidique classique, par exemple par la méthode en phase solide de MERRIFIELD lorsqu'ils sont de nature exclusivement peptidique, ou encore par modification des groupes terminaux des aminoacides et condensation des résidus ainsi obtenus, les fonctions réactives autres que celles engagées dans la liaison entre les résidus successifs ayant été préalablement protégées à l'aide des groupes protecteurs bien connus de l'homme du métier. The compounds according to the invention are prepared by extraction from lyophilized brain as described below or more advantageously by conventional peptide synthesis, for example by the solid phase method of MERRIFIELD when they are of an exclusively peptide nature, or also by modification of the amino acid terminal groups and condensation of the residues thus obtained, the reactive functions other than those engaged in the connection between the successive residues having been previously protected using protective groups well known to those skilled in the art.
Selon un exemple de préparation d'un peptide selon l'invention, on fixe sur une résine, par l'intermédiaire de son groupe carboxylique, le résidu Ser dont la fonction amine est protégée par un groupe terbutyloxycarbonyle, puis, après avoir déprotégé la fonction amino en lavant la résine avec de l'acide trifluoroacétique dans du dichlorométhane, on couple dans le diméthylformamide le second résidu d'acide aminé dont la fonction amino est protégée comme précédemment, on fixe ainsi les uns après les autres les résidus aminoacides qui vont constituer la portion du peptide selon l'invention. Après déprotection, la fonction amino du résidu N-terminal peut être acétylée par action d'un excès d'anhydride acétique en présence de diisopropyléthylamine. According to an example of preparation of a peptide according to the invention, the residue Ser, the amine function of which is protected by a terbutyloxycarbonyl group, is fixed on a resin, via its carboxylic group, then, after deprotecting the function amino by washing the resin with trifluoroacetic acid in dichloromethane, we couple in dimethylformamide the second amino acid residue whose amino function is protected as above, we thus fix one after the other the amino acid residues which will constitute the portion of the peptide according to the invention. After deprotection, the amino function of the N-terminal residue can be acetylated by the action of an excess of acetic anhydride in the presence of diisopropylethylamine.
La chaîne latérale de la sérine peut être protégée par exemple par un groupe benzyle. The side chain of the serine can be protected for example by a benzyl group.
Après avoir éliminé le groupe protecteur,le peptide selon l'invention est libéré du support solide, par exemple avec de l'acide fluorhydrique. Le produit brut est lyophilisé et soumis à une chromatographie en phase liquide à moyenne pression, permettant d'obtenir un produit pratiquement pur ; celui-ci est alors caractérisé par chromatographie en phase liquide à haute pression ainsi que par l'analyse de sa composition en aminoacides et par spectrométrie de masse. After removing the protective group, the peptide according to the invention is released from the solid support, for example with hydrofluoric acid. The crude product is lyophilized and subjected to liquid pressure chromatography at medium pressure, making it possible to obtain a practically pure product; this is then characterized by high pressure liquid phase chromatography as well as by analysis of its amino acid composition and by mass spectrometry.
L'invention a également pour objet une composition thérapeutique comprenant un composé tel que défini ci-dessus, capable de traverser la barrière hématoencéphalique. The subject of the invention is also a therapeutic composition comprising a compound as defined above, capable of crossing the blood-brain barrier.
Pour traverser la barrière hématoencéphalique, le peptide est de préférence administré sous la forme d'une pro-drogue de type glycosyl-phospho-triester dans laquelle le peptide est lié par exemple par la sérine au groupe phosphate, comme décrit dans J. MED. To cross the blood-brain barrier, the peptide is preferably administered in the form of a glycosyl-phospho-triester type prodrug in which the peptide is linked, for example, by serine to the phosphate group, as described in J. MED.
CHEM. 92, Vol. 35, p. 30-39.CHEM. 92, Vol. 35, p. 30-39.
La composition thérapeutique est utilisée avantageusement dans des pathologies dans lesquelles est impliqué le système sérotoninergique, notamment dans les pathologies liées à une déficience de la transmission sérotoninergique. The therapeutic composition is advantageously used in pathologies in which the serotonergic system is involved, in particular in pathologies linked to a deficiency in serotonergic transmission.
Ainsi, la composition selon l'invention peut être utilisée en particulier dans le traitement de la dépression, mais également dans toutes les indications actuellement couvertes par les antidépresseurs, comme les troubles obsessionnels compulsifs, 1 'anxiété généralisée, la crise de panique, les troubles de l'appétit, du sommeil, l'impulsivité, les troubles sexuels, l'agressivité, et plus généralement celles des composés facilitant la transmission sérotoninergique. Thus, the composition according to the invention can be used in particular in the treatment of depression, but also in all the indications currently covered by antidepressants, such as obsessive-compulsive disorder, generalized anxiety, panic attack, disorders appetite, sleep, impulsivity, sexual disorders, aggressiveness, and more generally those of compounds facilitating serotonergic transmission.
La composition selon l'invention se présente avantageusement sous forme injectable ou orale, ou sous toute autre forme pharmaceutique connue. The composition according to the invention is advantageously in injectable or oral form, or in any other known pharmaceutical form.
La dose thérapeutique efficace est aisément déterminée par l'homme du métier en fonction de la nature et de la gravité de la pathologie à traiter, ainsi que du poids et de l'âge du patient. Les composés selon l'invention ne sont pas toxiques. Ils sont ajoutés à un véhicule pharmaceutiquement acceptable ou à un excipient bien connu de l'homme du métier. The effective therapeutic dose is easily determined by those skilled in the art depending on the nature and severity of the pathology to be treated, as well as the weight and age of the patient. The compounds according to the invention are not toxic. They are added to a pharmaceutically acceptable vehicle or to an excipient well known to those skilled in the art.
L'invention a également pour objet un procédé de diagnostic in vitro d'une affection liée au système sérotoninergique chez un patient, caractérisé en ce que l'on effectue un dosage dans un fluide biologique du patient d'un peptide de séquence
X Leu Y dans laquelle X représente H ou Ala,
Y représente OH ou Ser, sous réserve que X et Y ne représentent pas simultanément
H et OH, respectivement
Le dosage est effectué notamment par une méthode immunologique comprenant la mise en présence d'un prélèvement biologique avec un anticorps spécifiquement dirigé contre un peptide selon l'invention et la mise en évidence du complexe antigène-anticorps ainsi formé.The invention also relates to a method of in vitro diagnosis of a condition linked to the serotonergic system in a patient, characterized in that an assay is carried out in a biological fluid of the patient of a peptide of sequence
X Leu Y in which X represents H or Ala,
Y represents OH or Ser, provided that X and Y do not simultaneously represent
H and OH, respectively
The assay is carried out in particular by an immunological method comprising bringing a biological sample in the presence of an antibody specifically directed against a peptide according to the invention and demonstrating the antigen-antibody complex thus formed.
Ces procédés peuvent être basés sur une méthode radioimmunologique de type RIA, RIPA ou IRMA, ou sur une méthode immunoenzymatique, par exemple de type
ELISA.These methods can be based on a radioimmunological method of the RIA, RIPA or IRMA type, or on an immunoenzymatic method, for example of the
ELISA.
Le fluide biologique peut être le sang, l'urine ou le liquide céphalo-rachidien. The biological fluid can be blood, urine or cerebrospinal fluid.
Les anticorps peuvent être monoclonaux ou polyclonaux et constituent, ainsi que leurs fragments
Fab, Fab', F(ab')2 et Fc, un autre objet de l'invention.The antibodies can be monoclonal or polyclonal and constitute, as well as their fragments
Fab, Fab ', F (ab') 2 and Fc, another object of the invention.
Les anticorps sont obtenus par couplage d'un peptide selon l'invention sur un peptide ou une protéine porteurs immunogènes. The antibodies are obtained by coupling a peptide according to the invention to an immunogenic carrier peptide or protein.
L'invention a également pour objet un kit de diagnostic pour le dosage d'un peptide selon l'invention dans un fluide corporel d'un patient chez lequel on suspecte une pathologie liée à une déficience de la transmission sérotoninergique, notamment une dépression masquée, comprenant au moins un anticorps tel que défini ci-dessus et éventuellement les réactifs pour la mise en oeuvre du dosage. The subject of the invention is also a diagnostic kit for assaying a peptide according to the invention in a body fluid of a patient in whom a pathology linked to a deficiency in serotonergic transmission is suspected, in particular masked depression, comprising at least one antibody as defined above and optionally the reagents for carrying out the assay.
Les peptides de l'invention se sont révélés inactifs sur le site de recapture de la 5-HT. The peptides of the invention have been shown to be inactive at the 5-HT reuptake site.
L'existence d'un facteur endogène cérébral non actif sur le site de recapture constitue un standard de référence en terme d'activité et permet ainsi d'envisager un procédé de sélection de substances antidépressives, consistant à discriminer entre l'effet de recapture et l'effet d'interaction sur le site 5-HTlB/lD. The existence of a non-active cerebral endogenous factor on the reuptake site constitutes a reference standard in terms of activity and thus makes it possible to envisage a process for the selection of antidepressant substances, consisting in discriminating between the reuptake effect and the interaction effect on the 5-HTlB / lD site.
Ce procédé s'applique aux antidépresseurs connus et permet également la mise au point de médicaments nouveaux. This process applies to known antidepressants and also allows the development of new drugs.
En pratique, la discrimination entre l'effet de recapture et l'effet sur le site 5-HTl8XlD peut être effectuée en réalisant des essais de compétition entre d'une part l'activité de quantités croissantes d'antidépresseurs et la capture de la 5-HT dans les synaptosomes, la 5-HT étant radiomarquée et d'autre part en réalisant des essais de même type sur le récepteur 5-HTlB/lD en faisant varier la quantité d'antidépresseurs en présence d'un ligand radiomarqué spécifique de ces récepteurs, et en déterminant les Ki respectifs ou de façon plus générale les CI50. In practice, the discrimination between the reuptake effect and the effect on the 5-HT18XlD site can be carried out by performing competition tests between on the one hand the activity of increasing amounts of antidepressants and the capture of the 5 -HT in synaptosomes, 5-HT being radiolabelled and on the other hand by carrying out tests of the same type on the 5-HTlB / lD receptor by varying the quantity of antidepressants in the presence of a radiolabeled ligand specific for these receptors, and by determining the respective Ki or more generally the IC50.
Le choix d'antidépresseurs ayant une activité sélective sur le site 5-HTlBXlD sera dicté par les substances présentant un Ki élevé ou une CIso faible dans l'essai de recapture et inversement un Ki faible ou une
CI50 élevée dans l'essai de liaison sur le site 5-HTlB/lD. The choice of antidepressants with selective activity on the 5-HTlBXlD site will be dictated by the substances having a high Ki or a low IC 50 in the reuptake test and conversely a low Ki or a
High IC50 in the 5-HTlB / lD site binding assay.
On peut également et plus aisément utiliser le peptide radiomarqué (iode-125 ou tritium) pour identifier et caractériser le site spécifique de reconnaissance du peptide, et ainsi directement étudier les capacités de diverses substances à déplacer (compétition) ce peptide en mesurant leur Ki et en comparant ce dernier aux valeurs de Ki obtenues pour ces mêmes substances pour inhiber la capture de la 5-HT (ou déplacer un inhibiteur de recapture (3H paroxetine par exemple).One can also and more easily use the radiolabelled peptide (iodine-125 or tritium) to identify and characterize the specific site of recognition of the peptide, and thus directly to study the capacities of various substances to move (competition) this peptide by measuring their Ki and by comparing the latter to the Ki values obtained for these same substances to inhibit the capture of 5-HT (or displace a reuptake inhibitor (3H paroxetine for example).
On décrira ci-après l'isolement et la caractérisation des peptides Ala-Leu et Leu-Ser selon l'invention, ainsi que les propriétés de liaison et les activités pharmacologiques sur les récepteurs 5-HT,,,,, des peptides Ala-Leu, Leu-Ser et Ala-Leu-Ser en se reportant aux figures annexées sur lesquelles
- la fig. 1 représente l'effet du dipeptide
Leu-Ser (dipeptide 2) sur la liaison 5-HT1 > dans l'hippocampe de rat;
- la fig. 2 représente les interactions du dipeptide 2 et du tripeptide Ala-Leu-Ser (A3S) avec la liaison 5-HT1 nonA dans l'hippoeampe de rat;
- la fig. 3 représente les interactions des dipeptides 1 (Ala-Leu) et 2 et du tripeptide A3S avec la liaison 5-HT1 > dans l'hippocampe de rat;
- la fig. 4 représente la spécificité d'interaction du peptide 2 avec divers récepteurs.The isolation and characterization of the Ala-Leu and Leu-Ser peptides according to the invention, as well as the binding properties and the pharmacological activities on the 5-HT receptors,,, of the Ala- peptides will be described below. Leu, Leu-Ser and Ala-Leu-Ser with reference to the appended figures in which
- fig. 1 represents the effect of the dipeptide
Leu-Ser (dipeptide 2) on the 5-HT1 linkage> in the rat hippocampus;
- fig. 2 represents the interactions of dipeptide 2 and the tripeptide Ala-Leu-Ser (A3S) with the 5-HT1 nonA bond in the rat hippoeampe;
- fig. 3 represents the interactions of dipeptides 1 (Ala-Leu) and 2 and of the tripeptide A3S with the 5-HT1> bond in the rat hippocampus;
- fig. 4 represents the specificity of interaction of peptide 2 with various receptors.
1. Isolerent et Purification de peptides Ala
Leu (dinentide 1) et Leu - Ser (dineptide 2)
En utilisant comme critère de discrimination la capacité d'un facteur potentiel à interagir avec la reconnaissance de la 5-HT par le récepteur 5-HTlB/lD, comme décrit dans FR-2 657 784, un composé actif a été purifié à partir d'extraits de cerveaux de bovins et de chevaux.1. Isolate and Purify Ala Peptides
Leu (dinentide 1) and Leu - Ser (dineptide 2)
Using as a discrimination criterion the ability of a potential factor to interact with the recognition of 5-HT by the 5-HT1B / 1D receptor, as described in FR-2 657 784, an active compound was purified from from bovine and horse brains.
La méthodologie de purification a fait appel à des séparations par perméation sur gel, des phases normales ou inversées ou encore des échanges ioniques.
a) Séparation des fractions actives correspondant aux dipeptides 1 et 2
Le matériel de départ était constitué par des cerveaux de bovins lyophilisés (poids sec = 65 g).The purification methodology used separations by gel permeation, normal or reversed phases or even ion exchanges.
a) Separation of the active fractions corresponding to dipeptides 1 and 2
The starting material consisted of freeze-dried bovine brains (dry weight = 65 g).
Le lyophilisat était repris dans 20 ml d'acétate d'ammonium 50 mM pH 5. Après filtration à 0,22 pm, l'extrait était déposé au sommet d'une colonne de gel perméation (600 x 26 mm) (TSK HW 40S, domaine de fractionnement : 10 000 à 1000 daltons) préalablement équilibrée avec le même tampon. L'élution était réalisée à un débit de 2 ml.min-l et 60 fractions de 5 minutes étaient collectées. La fraction F1 était obtenue par regroupement et lyophilisation des fractions 12 à 24. The lyophilisate was taken up in 20 ml of 50 mM ammonium acetate pH 5. After filtration at 0.22 pm, the extract was deposited on top of a permeation gel column (600 × 26 mm) (TSK HW 40S , fractionation range: 10,000 to 1,000 daltons) previously balanced with the same buffer. The elution was carried out at a flow rate of 2 ml.min-1 and 60 fractions of 5 minutes were collected. The F1 fraction was obtained by regrouping and lyophilization of fractions 12 to 24.
La fraction F1 était resuspendue dans 10 ml d'acétate d'ammonium 50 mM pH 5 et injectée sur une colonne de phase inverse (C 18 ultrabase, SFCC, 250 x 10 mm) à raison de 1 ml par analyse. L'élution était réalisée à 4 ml.min~l en utilisant le gradient d'acétonitrile suivant - phase 1 : 3 min en acétate d'ammonium - phase 2 : 12 min de O à 12% d'acétonitrile - phase 3 : 5 min en 50% d'acétonitrile. The F1 fraction was resuspended in 10 ml of 50 mM ammonium acetate pH 5 and injected on a reverse phase column (C 18 ultrabase, SFCC, 250 x 10 mm) at a rate of 1 ml per analysis. Elution was carried out at 4 ml.min ~ l using the following acetonitrile gradient - phase 1: 3 min in ammonium acetate - phase 2: 12 min of O at 12% acetonitrile - phase 3: 5 min in 50% acetonitrile.
Les fractions de T R = 9 min 30 (dipeptide 1) et 13 min 30 (dipeptide 2) étaient collectées.
b) Purification du dipeptide 1
1. Gel perméation (G25)
La fraction de T R = 9 min 30 était déposée au sommet d'une colonne de G25 (45 x 1,6 cm) préalablement équilibrée avec de l'acétate d'ammonium 10 mM pH 5. Le débit était de 0,3 mol. min et l'enregistrement du chromatogramme était réalisé à 230 nm.The fractions of TR = 9:30 (dipeptide 1) and 13:30 (dipeptide 2) were collected.
b) Purification of dipeptide 1
1. Permeation gel (G25)
The fraction of TR = 9 min 30 was deposited at the top of a column of G25 (45 x 1.6 cm) previously equilibrated with 10 mM ammonium acetate pH 5. The flow rate was 0.3 mol. min and the chromatogram was recorded at 230 nm.
La fraction de Te = 320 minutes était récupérée. The fraction of Te = 320 minutes was recovered.
2. Chromatoaraphie en phase inverse
Le tampon utilisé était de l'acétate d'ammonium 50 mM pH 5. La colonne était une C18 ultrabase de 250 x 10 mm. L'élution était réalisée par un gradient d'acétonitrile tel que décrit en a) à un débit de 4 ml.min~1. L'enregistrement du chromatogramme était effectué à 230 nm et des fractions de 1 minute étaient collectées.2. Reverse phase chromatography
The buffer used was 50 mM ammonium acetate pH 5. The column was a C18 ultrabase of 250 x 10 mm. Elution was carried out with an acetonitrile gradient as described in a) at a flow rate of 4 ml.min ~ 1. Chromatogram recording was performed at 230 nm and 1 minute fractions were collected.
L'activité était retrouvée dans une zone de gradient correspondant à des produits de rétention (TR) moyen est de 9 min 30. The activity was found in a gradient zone corresponding to retention products (TR) mean is 9 min 30.
3. Chromatographie sur colonne carbone
La colonne utilisée était une colonne
Hypercarb (Shandon) (100 x 3 mm). Les conditions chromatographiques étaient analogues aux précédentes excepté le débit fixé à 1 ml.min~1. 3. Chromatography on a carbon column
The column used was a column
Hypercarb (Shandon) (100 x 3 mm). The chromatographic conditions were similar to the previous ones except the flow rate set at 1 ml.min ~ 1.
L'activité inhibitrice était retrouvée sur une fraction faiblement retenue de TR = 1,98 minute. The inhibitory activity was found on a weakly retained fraction of TR = 1.98 minutes.
L'achèvement de la purification de cette fraction était réalisée par deux autres passages successifs sur la colonne Hypercarb en utilisant une élut ion isocratique en acétate d'ammonium (pic de T R = 1,60 min.).
c) Purification du dipeptide 2
1. Gel perméation (G25)
La fraction de T R = 13 min 30 était déposée au sommet d'une colonne de G25 (45 x 1,6 cm) préalable ment équilibrée avec de l'acétate d'ammonium 10 mM pH 5.The completion of the purification of this fraction was carried out by two other successive passages on the Hypercarb column using an isocratic ion elution in ammonium acetate (peak of TR = 1.60 min.).
c) Purification of dipeptide 2
1. Permeation gel (G25)
The fraction of TR = 13 min 30 was deposited at the top of a column of G25 (45 x 1.6 cm) previously equilibrated with 10 mM ammonium acetate pH 5.
Le débit était de 0,3 ml.min~1 et l'enregistrement du chromatogramme était réalisé à 230 nm.The flow rate was 0.3 ml.min ~ 1 and the chromatogram was recorded at 230 nm.
La fraction de Te = 290 minutes était récupérée. The fraction of Te = 290 minutes was recovered.
2. ChromatoQraDhie en phase inverse
Le tampon utilisé était de l'acétate d'ammonium 50 mM pH 5. La colonne était une C18 ultrabase de 250 x 10 mm. L'élution était réalisée par un gradient d'acétonitrile tel que décrit précédemment à un débit de 4 ml .min-l. L'enregistrement du chromatogramme était effectué à 230 nm et des fractions de 1 minute étaient collectées.2. Reverse phase ChromatoQraDhie
The buffer used was 50 mM ammonium acetate pH 5. The column was a C18 ultrabase of 250 x 10 mm. The elution was carried out with an acetonitrile gradient as described above at a flow rate of 4 ml .min-l. Chromatogram recording was performed at 230 nm and 1 minute fractions were collected.
Les fractions de TR comprises entre 14 et 21 minutes étaient récupérées. TR fractions between 14 and 21 minutes were collected.
La re-chromatographie sur la même colonne de la zone active, en utilisant un gradient d'acétonitrile de pente plus faible, permettait d'obtenir une fraction étroite de TR = 17 minutes et contenant la totalité de l'activité inhibitrice. The re-chromatography on the same column of the active zone, using a lower gradient acetonitrile gradient, made it possible to obtain a narrow fraction of TR = 17 minutes and containing all of the inhibitory activity.
3. Chromatoaraphie sur colonne carbone
La colonne utilisée était une colonne
Hypercarb (Shandon) (100 x 3 mm). Les conditions chromatographiques étaient analogues aux précédentes excepté le débit fixé à 1 ml.min-l. 3. Chromatoaraphy on carbon column
The column used was a column
Hypercarb (Shandon) (100 x 3 mm). The chromatographic conditions were similar to the previous ones except the flow rate set at 1 ml.min-l.
L'activité était localisée sur une fraction faiblement retenue sur cette colonne (TR = 0,84 minute). The activity was localized on a fraction weakly retained on this column (TR = 0.84 minute).
Sa re-chromatographie sur la même colonne en condition isocratique et à un débit de 0,5 ml.min1 permettait d'isoler trois pics d'adsorption. L'activité était retrouvée sur le pic le plus retenu par la colonne (TR = 1,76 minutes).Its re-chromatography on the same column under isocratic conditions and at a flow rate of 0.5 ml.min1 made it possible to isolate three adsorption peaks. The activity was found on the peak most retained by the column (TR = 1.76 minutes).
2. Caractérisation des PePtides
La caractérisation des fractions obtenues a été réalisée essentiellement sur la base d'analyses par
RMN qui a permis d'identifier dans RET1 les acides aminés
Ala-Leu et dans la fraction RET2 les acides aminés Leu
Ser.2. Characterization of PePtides
The characterization of the fractions obtained was carried out essentially on the basis of analyzes by
NMR which made it possible to identify amino acids in RET1
Ala-Leu and in the RET2 fraction the amino acids Leu
Ser.
Ces résultats ont été confirmés par l'analyse d'acides aminés. These results were confirmed by the analysis of amino acids.
3. Interactions des peptides identifiés avec les récepteurs 5-HtlB/lD
a) Interactions de liaison (fig. 1 à 3)
La liaison de la (3H)5-HT ou de (125îicyano- pindolol sur les récepteurs de type 5-HTlBXlD est inhibée par les peptides suivants avec les CI50 correspondantes - Ala - Leu CI50 = 10-13 M - Leu- Ser CI50 = 10-1l M - Ala - Leu - Ser CI50 = 10.12 M
A titre comparatif, le peptide Ala - Leu
Leu - Ser s'est montré inactif dans le seul essai réalisé.3. Interactions of identified peptides with 5-HtlB / lD receptors
a) Linking interactions (fig. 1 to 3)
The binding of (3H) 5-HT or (125îicyano-pindolol to receptors of the 5-HTlBXlD type is inhibited by the following peptides with the corresponding IC50s - Ala - Leu CI50 = 10-13 M - Leu- Ser CI50 = 10-1l M - Ala - Leu - Ser CI50 = 10.12 M
For comparison, the Ala - Leu peptide
Leu - Ser was inactive in the only trial performed.
Le peptide Ala - Leu est actif dans sa forme L (forme naturelle) et ne présente quasiment pas d'activité dans sa forme D. The peptide Ala - Leu is active in its L form (natural form) and shows almost no activity in its D form.
L'interaction de liaison n'est pas michaelienne, elle apparaît de type non-compétitif.
b) SpéCifiCité de l'interaction
Les fractions RET1 et RET2 isolées du cerveau de mammifères ont une grande spécificité d'interaction, puisque leur effet inhibiteur de liaison ne s'exerce que sur les sous-types 5-HT1 des récepteurs 5-HT et plus particulièrement sur le sous-type 5-HTlB/lD ; dans les conditions expérimentales utilisées, elles n'apparaissent pas affecter les récepteurs 5-HT2 et 5-HT3 ni les récepteurs a adrénergiques, ss adrénergiques, dopaminergiques, teurs a adrénergiques, ss adrénergiques, dopaminergiques, muscariniques, histaminergiques, récepteurs aux benzodia zéines et récepteurs aux opiacés (fig. 4). Ces peptides sont également dépourvus d'activité de déplacement du marqueur des sites de transport (3H paroxetine) et ne sont pas inhibiteurs de recapture de la 5-HT.
c) Interactions sur la fonction cellulaire liée aux récepteurs 5-HTlB/lD
L'activité du peptide Ala - Leu a été mesurée dans des essais préliminaires sur la fonction inhibitrice des récepteurs 5-HTlB/1D sur la libération évoquée d'acétylcholine.The binding interaction is not Michaelian, it appears to be non-competitive.
b) Specificity of the interaction
The RET1 and RET2 fractions isolated from the mammalian brain have a great specificity of interaction, since their binding inhibiting effect is exerted only on the 5-HT1 subtypes of the 5-HT receptors and more particularly on the subtype 5-HTlB / lD; under the experimental conditions used, they do not appear to affect the 5-HT2 and 5-HT3 receptors nor the adrenergic, ss adrenergic, dopaminergic, adrenergic, ss adrenergic, dopaminergic, muscarinic, histaminergic, benzodiazine receptors and opioid receptors (Fig. 4). These peptides also lack the displacement activity of the marker for transport sites (3H paroxetine) and are not inhibitors of 5-HT reuptake.
c) Interactions on cellular function linked to 5-HTlB / lD receptors
The activity of the Ala-Leu peptide was measured in preliminary tests on the inhibitory function of the 5-HT1B / 1D receptors on the evoked release of acetylcholine.
En accord avec les résultats des études de liaison indiquant une interaction avec les récepteurs 5
HT1B/1D, il a été montré que ce peptide antagonisait l'activité modulatrice des récepteurs 5-HTlB/lD à très faible concentration et potentialisait au contraire l'effet d'un agoniste 5-HT1 > à concentration plus élevée.Consistent with the results of linkage studies indicating interaction with receptors 5
HT1B / 1D, it has been shown that this peptide antagonizes the modulating activity of 5-HT1B / lD receptors at very low concentration and, on the contrary, potentiates the effect of a 5-HT1> agonist at higher concentration.
Ces résultats suggèrent que le peptide étudié pourrait jouer le rôle d'un modulateur allostérique du récepteur 5-HT1B/1D.These results suggest that the peptide studied could play the role of an allosteric modulator of the 5-HT1B / 1D receptor.
Ce peptide permet donc de réguler l'activité modulatrice sérotoninergique. This peptide therefore makes it possible to regulate the serotonergic modulating activity.
4. Cosparaison de l'activité du peptide et des antidépresseurs
4.1 Activité du peptide et des antidépresseurs sur la liaison 5-HT1B/1D
Les inventeurs avaient précédemment montré que les antidépresseurs interagissaient (de façon complexe, vraisemblablement non-compétitive) avec les récepteurs 5-HT1. Cependant, le fait qu'à cette époque les divers sous-types 5-HT1 (5-HT1A, 5-HT1 > , 5-HT1C, 5-HTlDt 5-HT1E, 5-HT1F) n'avaient pas été identifiés et caractérisés, rendait l'interprétation des résultats difficile. 4. Comparison of the activity of the peptide and of the antidepressants
4.1 Activity of the peptide and of the antidepressants on the 5-HT1B / 1D bond
The inventors had previously shown that antidepressants interact (in a complex, probably non-competitive manner) with 5-HT1 receptors. However, the fact that at that time the various 5-HT1 subtypes (5-HT1A, 5-HT1>, 5-HT1C, 5-HTlDt 5-HT1E, 5-HT1F) had not been identified and characterized , made interpretation of the results difficult.
Actuellement, l'observation de la seule population 5 HTlBlD marquée par le [l2sI]CYN-Pindolol permet de mettre clairement en évidence l'interaction des antidépresseurs avec ce récepteur. L'étude pharmacologique montre que les antidépresseurs de type "sérotoninergiques" (paroxétine, fluoxétine) sont beaucoup plus actifs que les antidépresseurs "noradrénergiques" (nomifensine).Currently, the observation of the only 5 HT1BlD population marked with [12sI] CYN-Pindolol makes it possible to clearly demonstrate the interaction of antidepressants with this receptor. The pharmacological study shows that "serotonergic" antidepressants (paroxetine, fluoxetine) are much more active than "noradrenergic" antidepressants (nomifensine).
Les peptides identifiés miment l'effet des antidépresseurs sur la liaison de (3H]5-HT ou de (125I1
CYN-Pindolol aux récepteurs 5-HT1B/1D.The peptides identified mimic the effect of antidepressants on the binding of (3H] 5-HT or of (125I1
CYN-Pindolol to 5-HT1B / 1D receptors.
4.2 Activité sur les effets cellulaires des récepteurs 5 5-HTlB/lD
Les antidépresseurs (citalopram en particulier) antagonisent l'activité inhibitrice des récepteurs 5-HTlB/lD sur la libération des neurotransmetteurs.4.2 Activity on the cellular effects of 5 5-HTlB / lD receptors
Antidepressants (citalopram in particular) antagonize the inhibitory activity of 5-HTlB / lD receptors on the release of neurotransmitters.
4.3 Activité sur un modèle comportemental in vivo
Le test de la nage forcée (Porsolt) est un test simple qui ne peut en aucun cas être assimilé à un modèle de "dépression". I1 a cependant le mérite de discriminer un bon nombre de substances antidépressives.4.3 Activity on an in vivo behavioral model
The forced swimming test (Porsolt) is a simple test which cannot in any case be compared to a model of "depression". It has the merit, however, of discriminating against a good number of antidepressant substances.
I1 faut cependant remarquer que quelques antidépresseurs ne sont pas actifs dans ce test et certaines substances non antidépressives y sont actives. It should however be noted that some antidepressants are not active in this test and certain non-antidepressant substances are active there.
Dans des conditions expérimentales où l'on mesure l'activité d'antidépresseurs dans ce test, il a été montré que le peptide Ala - Leu injecté par voie ip à forte concentration, mais aussi i.c.v. (intra cérébroventriculaire) à faible concentration, réduit légèrement mais significativement le temps d'immobilité des souris les antidépresseurs de type noradrénergique (nomifensine) sont beaucoup plus efficaces que le peptide dans ce test, mais les antidépresseurs sérotoninergiques ont également une activité faible. Under experimental conditions where the activity of antidepressants is measured in this test, it has been shown that the peptide Ala - Leu injected ip at high concentration, but also i.c.v. (intra cerebroventricular) at low concentration, slightly but significantly reduces the immobility time of mice noradrenergic antidepressants (nomifensine) are much more effective than the peptide in this test, but serotonergic antidepressants also have low activity.
La mesure de l'activité locomotrice horizontale a été réalisée dans un appareil d'activométrie. Le peptide a un effet stimulant. Au cours de ce test, une forte augmentation des défécations (signe lié à l'anxiété) a été notée chez des animaux qui ont reçu le peptide. The measurement of horizontal locomotor activity was carried out in an activometry device. The peptide has a stimulating effect. During this test, a sharp increase in bowel movements (a sign of anxiety) was noted in animals that received the peptide.
Cependant, dans tous ces essais, il semble que l'état de "stress" initial des animaux joue un rôle dans l'amplitude des phénomènes observés. However, in all these tests, it seems that the initial state of "stress" of the animals plays a role in the amplitude of the phenomena observed.
Diverses séries d'essais ont été réalisées sur les effets du dipeptide Ala - Leu sur l'appétit. Des administrations i.c.v. de 7 à 30 ug du peptide ont des effets très significatifs sur la prise de nourriture chez la souris, puisqu'elles entraînent sur 24 heures une diminution de près de la moitié de la consommation alimentaire des animaux, ainsi qu'une perte de poids également significative. Various series of tests have been carried out on the effects of the dipeptide Ala - Leu on appetite. I.c.v. from 7 to 30 ug of the peptide have very significant effects on food intake in mice, since they lead over 24 hours to a reduction of almost half of the food consumption of animals, as well as a weight loss also significant.
Ces dernières observations sont bien en accord avec le fait que les antidépresseurs sérotoninergiques ont le plus souvent des effets importants sur la prise alimentaire, certains favorisant, d'autres réduisant le poids chez les patients traités, et que leur activité est mise à profit dans les cas de boulimie ou d'anorexie qui souvent accompagnent la dépression. These last observations are in good agreement with the fact that serotonergic antidepressants most often have significant effects on food intake, some favoring, others reducing weight in treated patients, and that their activity is used in bulimia or anorexia which often accompany depression.
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| ER | Errata listed in the french official journal (bopi) |
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| ST | Notification of lapse |