FR2703561A1 - Plantes transgéniques incluant un transgène constitué par une séquence d'acide nucléique hybride, comportant au moins un fragment de gêne mitochondrial non édité de végétaux supérieurs et préparation. - Google Patents

Abstract

Séquences d'acide nucléique hybrides, comportant au moins la région codante d'un gène mitochondrial non édité de végétaux supérieurs et permettant le contrôle de la fertilité mâle des plantes contenant lesdites séquences, plantes transgéniques possédant de telles séquences, ainsi que méthode de production de plantes transgéniques mâle-stériles et méthode de restauration de plantes mâle-fertiles. Ces plantes transgéniques possèdent dans leurs noyaux, une séquence hybride exprimable (transgène), comprenant au moins une région codante d'un gène mitochondrial non édité de végétaux supérieurs et une séquence susceptible de transférer la protéine exprimée par ladite région codante, vers la mitochondrie, laquelle séquence hybride est apte à modifier la fertilité mâle des plantes ayant incorporé ledit transgène, tout en ne modifiant pas les autres caractéristiques phénotypiques desdites plantes.

Description

La présente invention est relative à des sé-

quences d'acide nucléique hybrides, comportant au moins la région codante d'un gène mitochondrial non édité de

végétaux supérieurs et permettant le contrôle de la fer-

tilité mâle des plantes contenant lesdites séquences, aux plantes transgéniques possédant de telles séquences,

ainsi qu'à une méthode de production de plantes trans-

géniques mâle-stériles et à une méthode de restauration

de plantes mâle-fertiles.

Le contrôle de la fertilité mâle chez les

plantes est un des problèmes clés pour l'obtention d'hy-

brides, et plus particulièrement de lignées mâle-stériles

qui présentent un intérêt sur le plan agronomique, notam-

ment pour le contrôle et l'amélioration des semences En effet, la production de semences hybrides à grande échelle, à caractéristiques contrôlées, est une véritable gageure parce que beaucoup de cultures présentent à la fois les organes reproducteurs mâle et femelle (étamines

et pistils) Ceci entraîne un taux important d'auto-

pollinisation et rend difficile le contrôle des croise-

ments entre lignées, pour l'obtention des hybrides recherchés. Pour permettre l'obtention de croisements non consanguins qui permettent de produire des semences hybrides, présentant des propriétés intéressantes, les

Inventeurs ont mis au point de nouvelles plantes transgé-

niques mâle-stériles, aptes à être restaurées et qui

facilitent le développement de cultures hybrides.

La stérilité mâle cytoplasmique (SMC) se ca-

ractérise par un avortement du pollen après la méiose.

Dans les systèmes alloplasmiques, la SMC est due à une incompatibilité noyau-cytoplasme, qui peut se produire à plusieurs niveaux: réplication de l'ADN,

transcription des gènes, maturation des transcrits, tra-

duction ou assemblage des complexes multiprotéiques.

Des observations réalisées chez le maïs et le pétunia (Dewey R E et ai, Cell, 1986, 44, 439; Young E.G et ai, Cell, 1987, 50, 41), émerge l'hypothèse que

la SMC est due à une déficience de la machinerie bioéner-

gétique mitochondriale En effet, la SMC se manifeste par une réduction du taux d'ATP et de NADP Au niveau cellu-

laire, cette déficience est corrélée avec une dégénéres-

cence des cellules du tapis de l'anthère, tout en n'ayant

pas d'effet sur le développement de la plante.

Un certain nombre de méthodes ont été propo-

sées, dans l'Art antérieur, pour obtenir des plantes mâle-stériles. On peut citer notamment les rétrocroisements, qui conduisent à la substitution du génome nucléaire

d'une espèce par un autre génome et ce, dans l'environne-

ment cytoplasmique de la première espèce (alloplasmie); cette substitution peut également apparaître spontanément dans les cultures en champ La SMC peut également être

obtenue par fusion de protoplastes (Lonsdale D M, Gene-

tic Engineering, 1987, 6, 47).

Dans toutes ces situations, les résultats ne sont pas fiables, ni reproductibles; de plus, dans tous les cas, les manipulations sont longues, fastidieuses et

souvent difficiles à contrôler.

Des plantes mâle-stériles ont également été obtenues par transgénose, à l'aide d'un gène codant pour

une RN Ase, sous le contrôle d'un promoteur anthère-spéci-

fique (Mariani C et al, Nature, 1990, 347, 737) Ce transgène, lorsqu'il s'exprime, a un effet toxique sur la

cellule dans la mesure o les AR Ns endogènes sont dégra-

dés, provoquant ainsi la mort cellulaire.

Un autre système, introduisant également une

nouvelle fonction artificielle et destructrice, a été dé-

crit par Worrall D et al, (The Plant Cell, 1992, 4,

759-771) (système callase) et présente les mêmes inconvé-

nients que le système RN Ase.

D'autres méthodologies ont également proposées 3 pour obtenir des plantes mâle-stérile; on peut notamment citer les techniques qui tirent profit de la perturbation de certaines voies métaboliques (Van de Meer I M et al, The Plant Cell, 1992, 4, 253-262) (expression d'un gène 5 anti-sens chalcone-synthase) ou les techniques qui font appel à l'hybridation somatique asymétrique (Melchers G. et al, Proc Natl Acad Sci USA, 1992, 89, 6832-6836)

pour mettre en présence, comme dans les lignées mâle-sté-

riles alloplasmiques, le cytoplasme d'un individu donneur et le noyau d'un partenaire receveur Ces deux derniers procédés présentent l'inconvénient majeur d'être très aléatoires quant à l'objectif visé, à savoir l'obtention de plantes mâle-stériles, permettant le contrôle de la reproduction de ces plantes.15 La Demanderesse s'est, en conséquence, donné

pour but de résoudre le problème de l'obtention contrô-

lée, fiable et reproductible de plantes transgéniques mâle-stériles, pouvant être utilisées dans des programmes

agronomiques d'amélioration de semences.

La présente invention a pour objet des plantes transgéniques, caractérisées en ce qu'elles possèdent dans leurs noyaux, une séquence hybride exprimable (transgène), comprenant au moins une région codante d'un gène mitochondrial non édité de végétaux supérieurs et une séquence susceptible de transférer la protéine expri- mée par ladite région codante, vers la mitochondrie,

laquelle séquence hybride est apte à modifier la ferti- lité mâle des plantes ayant incorporé ledit transgène, tout en ne modifiant pas les autres caractéristiques30 phénotypiques desdites plantes.

Les plantes ayant incorporé le transgène conforme à l'invention (plantes transgéniques) sont, de

manière générale, sélectionnées parmi les plantes présen-

tant un intérêt agronomique, médical ou industriel De

manière plus précise, toute plante transformable et régé-

nérable peut constituer la matière première pour l'obten-

tion d'une plante transgénique conforme à l'invention.

Au sens de la présente invention, on entend par transformable, toute plante ayant la possibilité d'intégrer un gène au niveau nucléaire, de façon stable et transmissible, à sa descendance directe. Egalement au sens de la présente invention, on entend par régénérable, toute plante ayant l'aptitude de

produire des plantes néoformées (néoformation ou micro-

propagation).

De manière non limitative, les plantes sui-

vantes peuvent faire l'objet d'une transformation conforme à l'invention: tabac, colza, tournesol, soja, tomate, pomme de terre, melon, carotte, piment, endive, trèfle, lupin, haricot, pois, maïs, blé, seigle, avoine, orge, riz,

millet, agrumes, coton.

Les plantes, à partir desquelles sont obtenus les gènes mitochondriaux non édités, sont sélectionnées de manière à ce que les changements de nucléotides (processus appelé editing) entre la séquence non éditée et la séquence éditée soient importants: au moins 8 codons modifiés, et de préférence au moins 10 codons modifiés. De manière préférée, les gènes mitochondriaux non édités sont obtenus, de manière non limitative, à partir du blé, du tabac, du pétunia ou de la pomme de terre. Conformément à l'invention, la plante à partir de laquelle est obtenu ledit gène mitochondrial non édité et la plante ayant incorporé le transgène peuvent être

identiques ou différentes.

Des pré-séquences de levures sont, en particu-

lier, fonctionnelles pour l'importation de protéines vers

la mitochondrie, chez les plantes.

Conformément à l'invention, de telles séquences (ou préséquences) de transfert sont notamment choisies, et ce de manière non limitative, dans le groupe constitué par la tryptophanyl AR Nt synthétase de levure (SCHMITZ, U K et al, 1989, The Plant Cell, 1, 783- 791), la sous-unité 5 de l'AT Pase de Nicotiana plumbaginifolia (BOUTRY et al, 1987, Nature, 328:340-342), le transloca- teur ATP/ADP de mais (BATHGATE et al, 1989, Eur J.

Biochem, 183:303-310) et la sous-unité IV de la cyto-

chrome oxydase de levure (MAARSE et al, 1984, EMBO J,

3, 2831-2837).

Selon un autre mode de réalisation avantageux desdites plantes transgéniques, ladite séquence d'acide nucléique hybride comprend au moins la région codante d'un gène mitochondrial non édité intervenant dans la

chaîne respiratoire ou dans la synthèse de i'ATP.

Les gènes mitochondriaux non édités peuvent notamment être choisis, et ce de manière non limitative, parmi: les gènes codant pour une protéine du complexe ATP synthase (ATP 9; ATP 6), les sous-unités 1 à 7 de la NAD déshydrogénase, l'apocytochrome b et les sous-unités

I, II ou III de la cytochrome-oxydase.

Selon une disposition préférée de ce mode de réalisation, ladite séquence d'acide nucléique hybride comprend la région codante du gène codant pour la forme non éditée de l'ATP 9, à laquelle est associée en tant que séquence de transfert, la pré-séquence de la sous-unité

IV de la cytochrome-oxydase (cox IV) de levure.

De manière surprenante, les plantes transfor- mées par une telle séquence présentent, chez au moins 50 % d'entre elles, un phénotype mâle-stérile, tout en ne présentant pas d'autres perturbations, en ce qui concerne

le développement de la plante.

Egalement de manière surprenante, de telles plantes transgéniques permettent de contrôler, de manière fiable et reproductible, le processus naturel de la SMC,

notamment en évitant l'auto-pollinisation, sans intro-

duire dans ces dernières de fonctions nouvelles, artifi-

cielles et destructrices, comme cela est le cas notamment dans les systèmes décrits par Mariani et al (système

RN Ase) ou par WORRALL D et al (système callase).

La présente invention a également pour objet une séquence d'acide nucléique hybride, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins la région codante d'un gène mitochondrial non édité de végétaux supérieurs, à

laquelle est associée une séquence susceptible de trans-

férer la protéine exprimée par la région codante dudit

gène mitochondrial vers la mitochondrie.

Conformément à l'invention, de telles séquences (ou préséquences) de transfert sont notamment

choisies comme précisé ci-dessus, dans le groupe consti-

tué par la tryptophanyl AR Nt synthétase de levure, la sous-unité f de l'AT Pase de Nicotiana plumbaginifolia, le translocateur ATP/ADP de maïs, la sous-unité IV de la

cytochrome oxydase de levure.

Selon un mode de réalisation avantageux de ladite séquence d'acide nucléique hybride, elle comprend au moins la région codante d'un gène mitochondrial non édité intervenant dans la chaîne respiratoire ou dans la

synthèse de l'ATP.

Les gènes mitochondriaux qui peuvent notamment

être choisis sont ceux qui ont été précisés ci-dessus.

Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ladite séquence d'acide nucléique hybride est apte à exprimer la forme non éditée d'une protéine du

complexe ATP synthase.

Selon une modalité préférée de cette disposi-

tion, ladite séquence d'acide nucléique hybride comprend la région codante du gène codant pour la forme non éditée de l'ATP 9, à laquelle est associée en tant que séquence de transfert, la pré-séquence de la sous-unité IV de la

cytochrome-oxydase (cox IV) de levure.

La présente invention a également pour objet, un plasmide, caractérisé en ce qu'il inclut la séquence d'acide nucléique hybride conforme à l'invention associée à un promoteur choisi parmi les promoteurs s'exprimant constitutivement et les promoteurs s'exprimant au niveau des anthères et à un terminateur convenable. Selon un mode de réalisation avantageux dudit plasmide, il comprend le promoteur 35 S et le terminateur

du gène VI du Ca MV.

Selon un autre mode de réalisation avantageux dudit plasmide, il comprend en outre au moins un gène marqueur, notamment, et ce de manière non limitative, un gène de résistance à un antibiotique et de préférence, le

gène de résistance à l'hygromycine.

Conformément à l'invention, les plantes trans-

géniques, telles que définies ci-dessus, sont suscep-

tibles d'être obtenues à l'aide d'un procédé de produc-

tion de plantes transgéniques qui comprend, pour la

transformation du végétal supérieur sélectionné, l'intro-

duction d'au moins une copie de la séquence nucléique hybride telle - que définie ci-dessus, dans une plante réceptrice, à l'aide d'un plasmide contenant ladite

séquence, tel que défini ci-dessus.

Une telle transformation peut avantageusement

être obtenue par l'une des méthodes suivantes: transfor-

mation de protoplastes, agrotransformation, microinjec-

tion, biolistique.

La présente invention a également pour objet un procédé d'inhibition de la production de pollen, chez les végétaux supérieurs, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: (a) insertion d'une séquence d'acide nucléique hybride, telle que définie ci-dessus, chez les végétaux sélectionnés, par tout moyen approprié; (b) régénération et culture des végétaux transgéniques obtenus en (a); et (c) mesure de la production et de la viabilité

du pollen (test de germination, notamment).

Egalement de manière surprenante, on peut restaurer la fonction mâle desdites plantes transgéniques mâle-stériles, conformes à l'invention, en croisant lesdites plantes transgéniques male- stériles avec des plantes transgéniques comprenant dans leurs noyaux une

séquence d'acide nucléique hybride dite anti-sens, c'est-

à-dire incluant au moins la même région codante de gène mitochondrial non édité de végétaux que celle incluse dans lesdites plantes transgéniques mâle-stérile, dans le

sens inverse.

La présente invention a également pour objet un procédé de restauration de plantes mâle-fertiles, à partir de plantes transgéniques mâle- stériles, conformes à l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes:

( 1) transformation du végétal supérieur sélec-

tionné par l'introduction d'au moins une copie de la séquence nucléique hybride telle que définie ci-dessus,

dans une plante réceptrice, à l'aide d'un plasmide conte-

nant ladite séquence, pour l'obtention de plantes trans-

géniques mâle-stériles (PTMS); ( 2) transformation du même végétal supérieur qu'en ( 1), par l'introduction d'au moins une copie d'une séquence nucléique hybride anti-sens, incluant au moins la même région codante de gène mitochondrial non édité de

végétaux que celle incluse dans lesdites plantes trans-

géniques mâle-stérile obtenues en ( 1), dans une plante réceptrice, à l'aide d'un plasmide contenant ladite

séquence, pour l'obtention de plantes transgéniques male-

fertiles (PTMF);

( 3) croisement des plantes transgéniques mâle-

stériles obtenues en ( 1) et des plantes mâle-fertiles ob-

tenues en ( 2), pour l'obtention d'hybrides vigoureux, restaurés dans leur fertilité mâle et présentant des

caractéristiques présélectionnées.

La présente invention a également pour objet des plasmides incluant une séquence hybride anti-sens, telle que définie ci-dessus, associée à un promoteur

choisi parmi les promoteurs constitutifs et les promo-

teurs spécifiques des anthères et également associée à un

terminateur convenable.

Outre les dispositions qui précèdent, l'inven-

tion comprend encore d'autres dispositions, qui ressorti-

ront de la description qui va suivre, qui se réfère à des

exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la pré-

sente invention.

Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune

manière une limitation.

EXEMPLE 1: Construction du gène chimérique.

Les séquences codant pour l'ATP 9 sont obtenues à partir d'un AD Nc correspondant aux formes éditées et

non éditées d'AR Nm mitochondrial de blé.

L'ATP 9 est fusionné à un fragment Eco RI/Kpn I de 303 paires de base à partir d'un plasmide dénommé 19 4 (MAARSE et al, EMBO J, 1984, 3, 28312837), incluant les codons 1 à 62 de la sous-unité IV (cox IV) de la

cytochrome oxydase de levure.

Le fragment résultant, obtenu après digestion par l'enzyme Hinc II est ligaturé au niveau du site de restriction Sma I du plasmide p DH 51 (PIETRZAK et al, 1986, Nucleic Acids Res, 14:5857-5868) Le gène de résistance à l'hygromycine est inséré au niveau du site

Hind III du plasmide p DH 51, du plasmide p EA 903 (forme édi-

tée de l'ATP 9, figure 1) et du plasmide p EA 904 (forme non

éditée de l'ATP 9, figure 2) donnant naissance respective-

ment aux plasmides p Hl (figure 3), p H 5 (figure 4) et p H 2 (figure 5) Le plasmide p H 4 (figure 6) est constitué du plasmide p EA 904 dans lequel la partie codante cox IV/ATP 9 est placée en orientation inverse par comparaison avec le

plasmide p H 2.

Les séquences cox IV-ATP 9 non-édité et cox IV-

ATP 9 édité sont représentées aux figures 12 et 13.

Tous ces gènes sont sous le contrôle du promo-

teur Ca MV 35 S et du terminateur de gène VI de Ca MV. Les séquences conformes à l'invention peuvent

spécifiquement être amplifiées à l'aide des amorces oli-

gonucléotidiques suivantes: (a) 5 '-CACTACGTCAATCTATAAG-3 ', s'étendant du codon 3 au codon 9 de la pré-séquence de la sous-unité 4 de la cytochrome oxydase de levure et (b) 5 '-TATGCTCAACACATGAGCG-3 ', localisée au niveau du terminateur du gène VI du Ca MV ( 45 paires de

base en amont du signal de polyadénylation).

L'AR Nm d'ATP 9 chez le blé subit des change- ments de nucléotides C-+ U (processus appelé editing), au

niveau de 8 codons Ces modifications ont pour consé- quence le changement de 5 aminoacides dans la protéine correspondante (protéine éditée) et la perte, par rapport20 à la séquence déduite du gène, de 6 résidus dans la ré-

gion C-terminale, perte provoquée par la création d'un

codon stop.

La protéine non éditée est plus hydrophile avec 6 résidus supplémentaires au niveau C-terminal; de

plus, cette forme non éditée d'ATP 9 sélectionnée, consti-

tue un modèle de protéine modifiée particulièrement avan-

tageux car il constitue un élément du canal à proton de i'ATP synthase et, en conséquence, il est indispensable à la fonction de ce complexe; ce fragment est également avantageux en raison de la taille réduite de la séquence codante, qui facilite la manipulation et le fait que

l'ATP 9 peut avoir une localisation nucléaire ou mitochon-

driale. il

EXEMPLE 2: Production de plantes transgéniques mâle-

stériles. Aussi bien la construction plasmidique conforme à l'invention (voir exemple 1, plasmide p H 2) que les constructions contrôles (plasmide p Hl) et les constructions correspondant à la forme éditée de l'ATP 9 plasmide p H 5) sont utilisées pour la transformation de protoplastes d'une lignée de Nicotiana tabacum cv Petit

Havana, dénommée SRI.

* Transformation des Drotoulastes:

Les protoplastes utilisés pour la transforma-

tion sont isolés à partir des feuilles de plantes de Nicotiana tabacum SRI, cultivés en condition axénique et âgées d'un mois Les jeunes feuilles sont prélevées, débarrassées de la nervure centrale et coupées en fines

lamelles Les fragments sont ensuite incubés à l'obscu-

rité à 26 C, pendant une nuit, dans une solution enzyma-

tique constituée du milieu K 3 (NAGY et MALIGA, 1976)

additionnée de cellulase Onozuka R 10 ( 1,2 %), de macéro-

zyme Onozuka RI O ( 0,4 %) et de driselase Fluka ( 0,1 %) (p H 5,6) Avant la récolte, la solution enzymatique est diluée avec une solution de saccharose 0,6 M, MES 0,1 %

(p/v) (p H 5,6) dans les proportions respectives 2 v/lv.

Les protoplastes sont séparés des tissus non digérés par filtration à travers un tamis de 100 pm La suspension est recouverte d'une solution W 5 (MENCZEL et al., Theor Appl Genetics, 1981, 59:191-195) en prenant

soin de ne pas mélanger les phases liquides Après cen-

trifugation à 600 rpm pendant 10 min, les protoplastes sont rassemblés sous forme d'une bande à l'interface entre la solution W 5 et la solution enzymatique Ils sont

recueillis soigneusement et lavés deux fois avec la solu-

tion W 5 pour éliminer les traces d'enzymes Les proto-

plastes sont placés dans une chambre froide à 4-6 C pen-

dant 1-2 heures Après une nouvelle centrifugation à 750 rpm pendant 5 min, ils sont remis en suspension dans une solution mannitol/magnésium (Mannitol Merck 0,5 M; Mg C 12, 6 H 20 Prolabo 1,5 m M, MES Sigma 0,1 %, p H 5,6) et

leur concentration est ajustée à 1,6 x 106 proto-

plastes/ml Les protoplastes sont soumis à un choc ther-

mnique à 45 'C pendant 5 minutes. Après retour à la température ambiante, 300 gl de suspension de protoplastes ( 5 x 105 protoplastes) sont répartis dans un tube conique de 12 ml Ensuite, 20 gg de

plasmide p H 2 (ou de plasmide p H 4), selon la plante trans-

génique que l'on souhaite obtenir, 300 gl d'une solution de PEG 4000 l(PEG 4000 Merck; 40 % (p/v), mannitol

Merck, 0,4 M; Ca(NO 3)2 4 H 20 Merck; p H 8 (solution sté-

rilisée par filtration à 0,45 pm)l et 60 gg d'ADN de thy-

mus de veau comme ADN entraîneur, sont ajoutés dans la

suspension de protoplastes Ce mélange est incubé à tem-

pérature ambiante pendant 25-30 minutes, et agité douce-

ment de temps en temps La suspension de transformation est ensuite diluée progressivement en ajoutant petit à

petit 10 ml de W 5 sur une période de 10 minutes Les pro-

toplastes sont récupérés par centrifugation et repris

dans 1 ml de milieu K 3.

* Culture des Droto Dlastes et régénération de plantes: les protoplastes sont cultivés à raison de 5 x 104 protoplastes/ml, dans 3 ml d'un mélange de milieux K 3 et H (KAO et MICHAYLUK, 1975) en proportion 1:1 (v/v),

solidifié avec de l'agarose ( 0,8 %) Les colonies résul-

tantes sont successivement cultivées, en présence de l'agent de sélection hygromycine à 20 mg/l, dans le milieu A 50 m (milieu A contenant 50 g/l mannitol) (CABOCHE, 1980) pendant le premier mois, puis sur le milieu A 3 Om (le milieu A contenant 30 g/l mannitol) durant le deuxième mois, et enfin sur le milieu A-m

(milieu A sans mannitol), milieu contenant 40 mg/ml d'hy-

gromycine, durant le troisième mois Pour la régénéra-

tion, les cals sont transférés sur le milieu AR Le 13 milieu AR est le milieu A contenant seulement 20 g/l

saccharose comme source d'hydrate de carbone et 0,25 mg/1 BAP comme hormone de croissance Les plantules issues de cals sont cultivées sur le milieu T (NITCH et NITCH, 5 1969) Le milieu M Soo est utilisé pour l'entretien des plantes.

EXEMPLE 3: Analyse phénotypique des plantes trans- géniques obtenues. Les tailles des plantes âgées de 14 semaines, obtenues conformément à l'exemple 2 sont précisées dans le Tableau I ci- après:

TABLEAU I

1 F = fertile, F/S = semi-fertile, S = mâle-stérile 2 valeur moyenne de production de graine par capsule

après auto-pollinisation.

lignée Hi = plantes transgéniques obtenues avec le plasmide p Hl, lignée H 2 = plantes transgéniques obtenues avec le plasmide p H 2,

lignée H 5 = plantes transgéniques obtenues avec le plasmide p H 5.

lignée contrôle SR 1 (plante non transformée).

La taille des plantes n'est pas significative-

ment différente de celle des lignées SR 1 non transfor-

Fertilité de la plante 1 nbre de nbre Lignées plantes F F/S S Croissance de graines 2 testées (%) (%) (%) (cm) noeuds (mg)

SR 1 1 100 O O 87,0 24 109 36

Hi 3 100 O O 120 6 19 1 108 14

100 32

H 2 16 19 103 26 19 2 25 17

31 O

H 5 9 100 O O 92 23 23 5 94 28

14 mées Le nombre de noeuds moyen est similaire dans les trois lignées transgéniques différentes ( 19 à 24 noeuds par plante). Apparemment, il n'y a pas de modification dans le fonctionnement des méristèmes végétatifs dans la dif- férenciation des noeuds et des feuilles des plantes transgéniques. La floraison dans les lignées H 1, H 2 et H 5 est induite 7 à 14 semaines après la transplantation Les fleurs des plantes transgéniques sont similaires dans leurs formes et dans leurs couleurs à celles des fleurs

SRI (pétales roses-rouges et anthères dans chaque fleur).

Les plantes mâles-stériles ont des anthères blanches, contenant quelques grains de pollen ou aucun (figures 7 A 1 et 7 B), tandis que les plantes fertiles ont des anthères blanc-jaunes avec des grains de pollen normaux (figures 7 A 2 et 7 C) Il n'y a aucune différence dans la forme et

dans la couleur du pistil entre les plantes mâles-

stériles et mâles-fertiles.

EXEMPLE 4: Analyse de la fertilité des plantes trans-

géniques. Les transformants Hl et H 5 produisent des

plantes fertiles, alors que les transformants H 2 présen-

tent des caractéristiques de fertilité, de semi-fertilité ou de stérilité définies sur la base de la germination du

pollen ou par la réaction au diacétate de fluorescéine.

* Dans les plantes transgéniques fertiles, la viabilité du pollen est comprise entre 31 et 75 %, proche des valeurs trouvées dans la lignée de contrôle SR 1; dans les plantes semi-fertiles, la viabilité du pollen

est d'environ 10 à 20 %; dans les plantes mâles-sté-

riles, la viabilité est généralement inférieure à 2 %.

La fertilité des plantes est également déter- minée par la production de graines après auto-pollinisa-

tion ou rétrocroisement Les résultats sont également

illustrés au Tableau I ci-dessus.

Les lignées H 1 et H 5 ont une production moyenne de graines de 100 mg/capsule comparable à celle des lignées contrôles S Rl ( 110 mg/capsule) Les lignées H 2 qui correspondent à des plantes stériles ne produisent aucune graine, les plantes semi-fertiles produisent entre 12 et 50 mg/capsule, les plantes fertiles produisent en moyenne 100 mg/capsule Ces valeurs sont bien corrélées

avec la viabilité pollinique.

La caractéristique de fertilité femelle, pour les plantes stériles et semi-fertiles, est déterminée par

rétrocroisement avec les lignées SR 1 comme parent mâle.

Toutes les plantes mâles-stériles sont fe-

melles fertiles et produisent une quantité normale de graines viables ( 63 à 92 mg/capsule), avec une valeur de

viabilité des graines supérieure à 77 % Ainsi le carac-

tère stérile ou semi-fertile dans 50 % des lignées H 2 est dû à l'absence ou à la production très faible de pollen viable. La transmission des transgènes est analysée à travers la ségrégation génétique du gène de l'hygromycine phosphotransférase (hpt) chez les descendants (entre 200 et 500 descendants analysés) Après auto- fécondation (plantes fertiles et/ou semi-fertiles), la résistance à l'hygromycine est transmise dans la majorité des cas

comme un caractère mendélien (mono ou di-génique).

Après rétrocroisement avec le parent SR 1 (plante stérile), 4 des 5 plantes mâles-stériles héritent du caractère de résistance à l'hygromycine comme un ca-

ractère mendélien digénique, ceci exprimant 2 loci

actifs.

Ces analyses montrent que les plantes stériles sont uniquement affectées dans la production de pollen, puisqu'elles sont femelles fertiles et produisent une quantité de graines par fruit ( 100 à 150 mg), comparable,

voir supérieure à celle des témoins.

EXEMPLE 5: Analyse moléculaire des transformants.

Pour mettre en évidence la présence et la transcription du transgène ATP 9, l'analyse des produits de transcription est effectuée par hybridation de type Southern et Northern L'ADN total est isolé à partir des lignées H 2 (stériles, semi-fertiles et fertiles) et des lignées H 5 Par ailleurs, le gène chimérique est analysé

par amplification PCR.

* Méthodes utilisées: L'ADN total est isolé à partir de 10 g de tissus de feuilles essentiellement comme décrit dans SAGHAL-MAROOF M A et al, 1984, Proc Natl Acad Sci. USA, 81, 8014- 8018 1 gg d'ADN est amplifié dans un volume final de 100 Rl, en utilisant 0,5 unité de Taq polymérase, 0,18 rm M d NT Ps et 100 pmol de chacune des amorces Les amorces utilisées sont celles précisées à

l'exemple 1 L'utilisation de ces amorces exclut l'ampli-

fication de l'ATP 9 endogène (voir figure 8 C).

L'étape de dénaturation est réalisée à 95 C pendant 1 min, l'étape d'hybridation est réalisée pendant 2 min à 52 C et l'étape de polymérisation est réalisée

pendant 1 min à 72 C.

cycles sont réalisés, les échantillons sont soumis à une électrophorèse dans un gel d'agarose à 1,5 % et transférés sur une membrane Hybond-N+ (Amersham), comme décrit dans SAGHAL-MAROOF M A al (référence citée) Les filtres sont pré-hybridés à 42 C dans de la formamide déionisée à 50 %, 5 x SSC, 8 x Denhardt et SDS à 0,5 % Les filtres sont hybridés avec la séquence codante de 300 paires de base de l'ATP 9, fragment Eco RI/Hind III marqué au 32 P.

Une bande (correspondant à un produit compre-

nant 700 paires de bases) est observée dans la plupart des lignées H 2 et H 5 comme prévu La figure 8 A montre les résultats obtenus avec l'ADN H 2 2 et H 2 16, issu de plantes mâles-stériles (pistes 1 et 2) et avec des

plantes fertiles (ADN H 5 6 et H 5 15, pistes 3 et 4).

L'ADN issu des plantes non transformées SR 1 ne donne

aucun signal (piste 5).

L'ARN total des lignées SR 1, H 2 et H 5 est extrait, à partir des feuilles, comme suit: 5 g de feuilles sont cryobroyés; puis on procède à une première extraction à partir de la poudre congelée, avec 5 ml d'un mélange phénol:chloroforme:alcool isoamylique ( 25:24:1; v:v:v) et 5 ml de TNES+DTT ( 0,1 M Na Cl, 10 m M Tris-H Cl p H 7,5, 1 m M EDTA, 0,1 % SDS et 2 m M dithiothréitol); on procède ensuite à une deuxième extraction, à partir de la

phase aqueuse, deux fois avec un volume égal de chloro-

forme et d'alcool isoamylique ( 24:1; v:v) et 1 'ARN est précipité avec un volume égal de chlorure de lithium 4 M

à O 'C pendant une nuit.

Les AR Ns sont dissous dans une eau traitée au DEPC La concentration d'ARN est mesurée par la densité optique (DO) à 260 nm Les AR Ns poly(A)+ sont purifiés par chromatographie d'affinité oligo(d T)- cellulose 20 jg d'ARN total et 1 gg d'ARN poly(A)+ sont soumis à une

électrophorèse sur gel d'agarose 1,5 %, tampon formaldé-

hyde/formamide, puis transférés sur des membranes de ny-

lon Hybond-N+ Les hybridations avec la sonde ATP 9 sont

réalisées comme décrit ci-dessus.

Une bande de 0,48 kb est obtenue avec les li-

gnées contrôle SR 1 (figure 8 B, piste 1) Cette bande est présente dans toute les lignées et correspond à l'AR Nm

endogène mitochondrial.

Un transcrit additionnel, correspondant à une bande de 0,98 kb est présente seulement chez les plantes

transformées Comme illustré à la figure 8 B, ces molé-

cules peuvent être séparées de l'AR Nm endogène par chro-

matographie oligo(d T)-cellulose, confirmant son origine cytoplasmique. La figure 8 B, (pistes 3 et 4), montre les résultats obtenus avec les plantes mâles-stériles H 2 2 et H 2.16 et avec les plantes fertiles H 5 6 et H 5 15, (pistes et 6) Le transcrit de 0,98 kb est absent des contrôles

non transformés (piste 2).

En parallèle, par la technique de la PCR de l'AD Nc, il est possible d'obtenir des transcrits prove- nant du transgène grâce aux séquences ajoutées au cours de la manipulation in vitro telles que les régions de la pré-séquence provenant de la levure (cox IV) et la région de terminaison du Ca MV De plus, seul le transcrit de 0,98 kb hybride avec une sonde provenant de la séquence

cox IV fusionnée à l'ATP 9.

EXEMPLE 6: Analyse de la production de la protéine chi-

mère. Pour comprendre si les transgènes affectent l'expression du gène mitochondrial ATP 9 endogène, l'ARN total des plantes transformées H 2 et H 5 ainsi que des

plantes contrôles ont été hybridés avec une sonde mito-

chondriale spécifique.

Comme le montre la figure 9, aucune différence substantielle n'est observée lorsque le transgène est édité ou non édité et le marquage est similaire à celui

du contrôle.

La production de la protéine transgénique est analysée par immunoblotting des extraits mitochondriaux

et cytosoliques Des anticorps dirigés contre les frag-

ments 21 à 54 de la partie pré-séquence de cox IV de le-

vure, faisant partie du transgène, sont obtenus chez le lapin. On procède comme suit: un fragment Xba I/Kpn I contenant les codons 21 à 54 de cox IV de levure est

isolé à partir du plasmide 19 4 précité.

Ce fragment est ligaturé au plasmide p GEX-A

(figure 10) en phase avec la séquence codante de la glu-

tathion S-transférase, sous le contrôle du promoteur de

la P-galactosidase.

La protéine de fusion est induite après transformation de cellules d'E coli DH 5 a par l'IPTG Ces cellules produisent environ 80 mg de protéines/litre de culture. La protéine fusionnée est purifiée à partir d'un extrait d'E coli par chromatographie d'affinité sur une colonne de glutathion-agarose La protéine éluée par du glutathion est obtenue avec un taux de pureté de l'ordre de 95 % La protéine de fusion est utilisée comme antigène pour produire des anticorps anti-cox IV chez le

lapin.

Les feuilles de plantes de serre sont uti-

lisées pour le fractionnement cellulaire 100 gg de pro-

téines cytosoliques et mitochondriales sont fractionnés

par urée/SDS-PAGE L'immunoréaction est réalisée en uti-

lisant un anti-sérum anti-cox IV dilué au 1/500 ème selon la méthode de DARLEY-USMAR et al l 1987, Mitochondria, a practical approach, eds DARLEY-USMAR, (IRL Press Ltd) pp 113-152)l Les protéines des plantes transgéniques portant le phénotype mâle-stérile sont révélées par des

anticorps Ig G anti-lapin conjugués à de la peroxydase.

Aucun signal n'est observé, ni avec la frac-

tion mitochondriale (figure ll B, piste 1), ni avec la

fraction cytosolique de la lignée SR 1 non transformée.

La fraction mitochondriale des plantes mâles-

stériles H 2 2 et fertiles H 5 15 (figure 11 B, pistes 2 et 4 respectivement) montre une bande de 12 k Da correspondant à la taille attendue pour la protéine (voir figure ll A, qui précise la structure du précurseur de 15

k Da et de la protéine importée de 12 k Da).

Les protéines cytosoliques de ces lignées (figure ll B, pistes 3 et 5) montrent 2 bandes, l'une à k Da, la taille attendue pour le polypeptide précurseur chimérique, et l'autre à 14 k Da La nature de ce dernier polypeptide reste à déterminer; il s'agit probablement

d'un produit de dégradation du précurseur de 15 k Da.

La protéine associée avec la fraction mito-

chondriale de la lignée H 5 15 (figure 11, piste 4) migre à peu près au même endroit que la protéine mitochondriale H 2.2, mais légèrement en aval Cette différence est due au fait que les gènes chimériques diffèrent au niveau de la position du codon stop En effet, comme déjà précisé ci-dessus, la protéine éditée présente 6 résidus en moins que la protéine non éditée due à la génération d'un codon

stop lors de l'editing de 1 'ARN.

EXEMPLE 7: Etude de la respiration des mitochondries des

plantes transgéniques.

L'effet du transgène au niveau subcellulaire doit se traduire par un dysfonctionnement de la fonction

respiratoire de la mitochondrie L'analyse de la respira-

tion des parties non chlorophylliennes des plantes trans-

géniques a été réalisée.

La détermination des vitesses de respiration des organes non chlorophylliens (racines), en présence ou en absence de découplants est effectuée par analyse de la

consommation d'oxygène à l'aide d'une électrode de Clark.

Des études plus fines ont été conduites sur des mitochon-

dries purifiées par centrifugation différentielle et en

gradient de Ficoll L'effet de découplants sur la respi-

ration et les rapports ADP/O ont été déterminés sur des mitochondries issues de lignées mâles-stériles et comparé

aux plantes contrôles transformées ou sauvages.

Ces différentes mesures montrent que la fonc-

tion mitochondriale est réduite dans les plantes mâle-

stériles par rapport au témoin non transformé ou trans-

formé avec le plasmide p H 5 Cette situation est proche de

celle rencontrée chez les plantes mâle-stérile natu-

relles. Il ressort de ce qui précède que l'expression dans des plantes transgéniques de tabac d'une séquence d'ADN codant pour de l ATP 9 mitochondrial non édité de

blé n'a pas d'effet sur la plupart des caractères phéno-

typiques des plantes transformées, à l'exception de l'ap-

parition de la stérilité mâle.

En effet, la taille, la vitesse de croissance, le nombre de noeuds, la forme et la taille des feuilles

et des fleurs sont similaires chez les plantes transgé-

niques et chez les plantes contrôles Toutefois, des ef- fets significatifs sont observés au niveau des organes de la reproduction mâle lorsque la séquence d'ATP 9 de blé, sous sa forme non éditée, est exprimée dans les plantes

de tabac.

En fait, les expérimentations de transforma-

tions réalisées avec le plasmide p H 2 conduit à la produc-

tion de beaucoup de plantes ( 50 %) modifiées dans leur fertilité Approximativement 19 % sont semi-fertiles et

31 % sont entièrement stériles.

Toutes les lignées semi-fertiles et stériles

H 2 expriment le transgène sous la forme d'AR Nm polyadé-

nylé Les lignées H 2 fertiles ne présentent pas le trans-

crit de 0,98 kb, même lorsque le transgène est détecté après amplification par PCR, ceci indiquant que dans ce

dernier cas le transgène est inactif.

Des résultats montrent également, de manière inattendue, que le phénotype mâle-stérile est corrélé uniquement avec la présence de séquence non éditée d'ATP 9 tandis que les transformants obtenus avec la forme éditée

d'ATP 9 sont tous fertiles.

Dans tous les cas, les plantes stériles sont seulement mâles-stériles et peuvent être pollinisées avec un pollen étranger, ceci reflétant une fertilité femelle normale.

EXEMPLE 8: Production des plantes transgéniques présen-

tant une séquence hybride conforme à l'invention anti-

sens.

On procède comme dans l'exemple 2, la trans-

formation de protoplastes étant toutefois réalisée à

l'aide des plasmides p H 4.

En croisant ces plantes mâle-fertiles avec les

22 plantes transgéniques mâle-stériles, conformes à l'inven-

tion, on obtient des hybrides mâle-fertiles non consan- guins. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui vien-

nent d'être décrits de façon plus explicite; elle en em- brasse au contraire toutes les variantes qui peuvent ve- nir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écar-10 ter du cadre, ni de la portée de la présente invention.

Claims (13)

REVENDICATIONS

1 ) Plantes transgéniques, caractérisées en ce qu'elles possedent dans leurs noyaux, une séquence hybride exprimable (transgène), comprenant au moins une région codante d'un gène mitochondrial non édité de végé- taux supérieurs et une séquence susceptible de transférer la protéine exprimée par ladite région codante, vers la

mitochondrie, laquelle séquence hybride est apte à modi-

fier la fertilité mâle des plantes ayant incorporé ledit

transgène, tout en ne modifiant pas les autres caracté-

ristiques phénotypiques desdites plantes.

2 ') Plantes transgéniques selon la revendica-

tion 1, caractérisées en ce que la séquence susceptible

de transférer ladite protéine exprimée vers la mitochon-

drie est sélectionnée dans le groupe constitué par la tryptophanyl AR Nt synthétase de levure, la sous-unité 5

de l'AT Pase de Nicotiana plumbaginifolia, le transloca-

teur ATP/ADP de mais et la sous-unité IV de la cytochrome

oxydase de levure.

3 ) Plantes transgéniques selon la revendica-

tion 1 ou la revendication 2, caractérisées en ce que ladite séquence hybride comprend au moins la région codante d'un gène mitochondrial non édité intervenant

dans la chaîne respiratoire ou dans la synthèse de l'ATP.

4 ') Plantes transgéniques selon l'une quel-

conque des revendications 1 à 3, caractérisées en ce que

les gènes mitochondriaux non édités sont choisis parmi

les gènes codant pour une protéine du complexe ATP syn-

thase (ATP 9; ATP 6), les sous-unités 1 à 7 de la NAD déshydrogénase, l'apocytochrome b et les sous-unités I,

II ou III de la cytochrome-oxydase.

') Plantes transgéniques selon l'une quel-

conque des revendications 1 à 4, caractérisées en ce que

ladite séquence d'acide nucléique hybride comprend la région codante du gène codant pour la forme non éditée de l'ATP 9, à laquelle est associée en tant que séquence de transfert, la pré-séquence de la sous-unité IV de la

cytochrome-oxydase (cox IV) de levure.

6) Plante transgénique selon l'une quelconque

des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que la

plante ayant incorporé ledit transgène est du tabac. 7) Plante transgénique selon l'une quelconque

des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que la

plante ayant incorporé ledit transgène est notamment choisie parmi: le colza, le tournesol, le soja, la tomate, la pomme de terre, le melon, la carotte, le piment, l'endive, le trèfle, le lupin, le haricot, le pois, le mais, le blé, le seigle, l'avoine, l'orge, le

riz, le millet, les agrumes, le coton.

8 ) Séquence d'acide nucléique hybride, carac-

térisée en ce qu'elle comprend au moins la région codante d'un gène mitochondrial non édité de végétaux supérieurs, à laquelle est associée une séquence susceptible de transférer la protéine exprimée par ladite région

codante, vers la mitochondrie.

9) Séquence d'acide nucléique hybride selon la revendication 8, caractérisée en ce que la séquence susceptible de transférer ladite protéine exprimée vers la mitochondrie est sélectionnée dans le groupe constitué

par la tryptophanyl AR Nt synthétase de levure, la sous-

unité 5 de l'AT Pase de Nicotiana plumbaginifolia, le translocateur ATP/ADP de mais et la sous-unité IV de la

cytochrome oxydase de levure.

') Séquence d'acide nucléique hybride selon la revendication 8 ou la revendication 9, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins la région codante d'un gène

mitochondrial non édité intervenant dans la chaîne respi-

ratoire ou dans la synthèse de 1 'ATP 11-) Séquence d'acide nucléique hybride selon

l'une quelconque des revendications 8 à 10, caractérisée

en ce que les gènes mitochondriaux sont choisis parmi les gènes codant pour une protéine du complexe ATP synthase

(ATP 9; ATP 6), les sous-unités 1 à 7 de la NAD déshydro-

génase, l'apocytochrome b et les sous-unités I, II ou III

de la cytochrome-oxydase.

12 ) Séquence d'acide nucléique hybride selon

l'une quelconque des revendications 8 à 11, caractérisée

en ce qu'elle comprend la région codante du gène codant

pour la forme non éditée de l'ATP 9, à laquelle est asso-

ciée en tant que séquence de transfert, la pré-séquence de la sous-unité IV de la cytochrome-oxydase (cox IV) de

levure.

13 ') Plasmide, caractérisé en ce qu'il inclut

une séquence d'acide nucléique hybride selon l'une quel-

conque des revendications 8 à 12, associée à un promoteur

choisi parmi les promoteurs s'exprimant constitutivement et les promoteurs s'exprimant au niveau des anthères et à

un terminateur convenable.

14 ') Plasmide selon la revendication 13, ca-

ractérisé en ce que ladite séquence est sous le contrôle

du promoteur 35 S et du terminateur du gène VI du Ca MV.

15-) Plasmide selon la revendication 13 ou la revendication 14, caractérisé en ce qu'il comprend en

outre au moins un gène marqueur.

16 ') Procédé de production de plantes trans-

géniques selon l'une quelconque des revendications 1 à 7,

caractérisé en ce qu'il comprend, pour la transformation du végétal supérieur sélectionné, l'introduction d'au moins une copie de la séquence nucléique hybride selon

l'une quelconque des revendications 8 à 12, dans une

plante réceptrice, à l'aide d'un plasmide contenant la-

dite séquence, selon l'une quelconque des revendications

13 à 15.

17 ') Procédé selon la revendication 16, carac-

térisé en ce que ladite transformation est obtenue par l'une quelconque des méthodes suivantes: transformation

de protoplastes, agrotransformation, microinjection, bio-

listique. 18 ) Procédé d'inhibition de la production de pollen, chez les végétaux supérieurs, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: (a) insertion d'une séquence d'acide nucléique

hybride, selon l'une quelconque de revendications 8 à 12,

chez les végétaux sélectionnés, par tout moyen appro-

prié; (b) régénération et culture des végétaux transgéniques obtenus en (a); et (c) mesure de la production et de la viabilité

du pollen (test de germination, notamment).

19 ') Procédé de restauration de plantes mâle-

fertiles, à partir de plantes transgéniques mâle-stérile,

selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caracté-

risé en ce qu'il comprend les étapes suivantes:

( 1) transformation du végétal supérieur sélec-

tionné par l'introduction d'au moins une copie de la sé-

quence nucléique hybride selon l'une quelconque des re-

vendications 8 à 12, dans une plante réceptrice, à l'aide d'un plasmide contenant ladite séquence, pour l'obtention de plantes transgéniques mâle-stériles (PTMS); ( 2) transformation du même végétal supérieur qu'en ( 1), par l'introduction d'au moins une copie d'une séquence nucléique hybride anti-sens, incluant au moins

la même région codante de gène mitochondrial non édité de végétaux que celle incluse dans lesdites plantes trans-

géniques mâle-stérile obtenues en ( 1), dans une plante réceptrice, à l'aide d'un plasmide contenant ladite sé- quence, pour l'obtention de plantes transgéniques mâle-30 fertiles (PTMF);

( 3) croisement des plantes transgéniques mâle-

stériles obtenues en ( 1) et des plantes mâle-fertiles ob-

tenues en ( 2), pour l'obtention d'hybrides.

') Plantes transgéniques, caractérisées en ce qu'elles comprennent dans leurs noyaux une séquence d'acide nucléique hybride dite anti-sens, c'est-à-dire

incluant au moins la même région codante de gène mito-

chondrial non édité de végétaux que celle incluse dans

les plantes transgéniques mâle-stérile selon l'une quel-

conque des revendications 1 à 7, dans le sens inverse,

lesquelles plantes transgéniques sont aptes à restaurer les plantes transgéniques selon l'une quelconque des

revendications 1 à 7.

21 ') Plasmide, caractérisé en ce qu'il inclut une région codante d'un gène mitochondrial non édité de végétaux anti-sens, associée à un promoteur choisi-_parmi

les promoteurs s'exprimant constitutivement et les promo-

teurs s'exprimant au niveau des anthères et à un termina-

teur convenable.