FR2700172A1

FR2700172A1 - Procédé de culture de bactéries filamenteuses non photosynthétiques et non fructifiantes.

Info

Publication number: FR2700172A1
Application number: FR9400425A
Authority: FR
Inventors: Aubert Lucien; Martin Richard
Original assignee: LOreal SA
Current assignee: LOreal SA
Priority date: 1992-07-20
Filing date: 1994-01-17
Publication date: 1994-07-08
Anticipated expiration: 2014-01-17
Also published as: FR2700172B1

Abstract

Procédé de culture en milieu aqueux de bactéries filamenteuses non photosynthétiques et non fructifiantes, notamment du genre Beggiatoa, caractérisé par le fait que l'on effectue la culture en utilisant un ose, au lieu d'acétate, comme source de carbone principale. Grâce à ce procédé, il devient possible de cultiver ces bactéries dans un milieu entièrement défini et d'obtenir des cultures pures. Application notamment à la préparation de médicaments contenant des lipopolysaccharides extraits de ces bactéries.

Description

L'invention a pour objet un nouveau procédé de culture en milieu aqueux de bactéries filamenteuses non photosynthétiques et non fructifiantes.

On sait que certains constituants des enveloppes des bactéries Gram négatives, et notamment les fractions lipopolysaccharidiques qui peuvent en être extraites, présentent des propriétés de stimulation non spécifique des défenses immunitaires de l'organisme; voir par exemple Int.Archs Allergy Appl. Immun.76 Suppl.1.119-127, (1985), et Journal of
Immunopharmacology 3(2), 119-132 (1981).

On a maintenant découvert que les enveloppes de certaines bactéries appelées, selon la classification du Bergey's Manual, bactéries filamenteuses non photosynthétiques et non fructifiantes, présentent des propriétés immunomodulatrices particulièrement intéressantes.

Elles stimulent notamment, de façon non spécifique, les défenses immunitaires, y compris l'immunité cellulaire, et en particulier les macrophages.

On peut donc préparer, grâce à l'invention, un médicament ayant notamment un effet immunomodulateur, contenant des enveloppes de bactéries ou des fractions de ces enveloppes, caractérisé par le fait que lesdites bactéries sont choisies parmi les bactéries filamenteuses non photosynthétiques et non fructifiantes telles que définies selon la classification du Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, volume 3, section 23, 9e édition 1989.

On appelle ici "enveloppe" la paroi bactérienne et éventuellement les membranes sousjacentes.

Parmi les bactéries dont les enveloppes ou fractions d'enveloppes constituent un ingrédient actif du médicament immunomodulateur de l'invention, on citera plus particulièrement les bactéries appartenant à l'ordre des Beggiatoales, et notamment les bactéries appartenant au genre Beggiatoa, telles que par exemple diverses souches de
Beggiatoa alba suivant la définition donnée dans Arch. Microbiol. (1984) 137, 139-144. Il convient de noter que cette définition de B.alba correspond aux anciennes appellations
Beggiatoa arachnoidea, B. gigantea, B.leptomiformis, B.minima, B.mirabilis du Bergey's manual, 8e édition.

On peut citer par ailleurs les bactéries appartenant au genre Vitreoscilla, dont on sait qu'il est proche et souvent difficilement discernable du genre Beggiatoa.

Les bactéries qui viennent d'être définies, et dont plusieurs ont déjà été décrites, ont généralement un habitat aquatique, et peuvent être trouvées notamment dans les sources d'eau thermale.

Parmi les bactéries utilisables, on peut citer par exemple:
- Vitreoscilla beggiatoïdes (ATCC 43181)
- Beggiatoa alba (ATCC 33555).

On sait que la culture des bactéries filamenteuses non photosynthétiques et non fructifiantes est relativement difficile, de même que l'obtention de cultures pures. La plupart des auteurs préconisent l'utilisation de milieux mal définis, y compris des macérations diverses utilisant l'eau de ville. La source de carbone recommandée est un acétate.

On a maintenant découvert qu'il est possible d'adapter ces bactéries, par contre-sélection, à l'utilisation d'un ose, au lieu d'acétate, comme source de carbone.

On a découvert en outre qu'il est possible de cultiver ces bactéries sur un milieu de culture parfaitement défini. On peut en particulier effectuer une culture dans le milieu suivant:
TABLEAU 1

<tb> <SEP> COMPOSITION <SEP> CONCENTRATION
<tb> Extrait <SEP> autolytique <SEP> de <SEP> levures <SEP> 0,5 <SEP> à <SEP> 5 <SEP> g/l
<tb> Peptone <SEP> 0,5 <SEP> à <SEP> 5 <SEP> g/l
<tb> Glucose <SEP> anhydre <SEP> 0,5 <SEP> à7 <SEP> g/l <SEP>
<tb> Micro-éléments <SEP> de <SEP> Heller <SEP> 0,5 <SEP> à <SEP> 5 <SEP> ml/l
<tb> Caca2, <SEP> 10 <SEP> H20 <SEP> 0,010 <SEP> à <SEP> 0,200 <SEP> g/l
<tb>
On complète à 1 000 ml par de l'eau distillée. Parmi les peptones utilisables, on peut citer par exemple la peptone papainique de soja.

Ce milieu particulier se distingue des milieux généralement utilisés par l'absence de catalase et de sulfure.

Les micro-éléments de Heller, dont la composition est donnée dans la partie expérimentale ci-après, ont été décrits par RelIer, Ann Sci. Nat. Biol. Veg. 14:1-223 (1953).

Il s'agit de mélanges de divers éléments minéraux qui ont été recommandés par Heller, non pas pour la culture des bactéries, mais pour la nutrition des tissus végétaux cultivés in vitro. I1 convient de noter ici que l'on n'a pas cherché à déterminer si les micro-éléments de Heller sont tous indispensables ou utiles dans la culture des bactéries filamenteuses non photosynthétiques et non fructifiantes. Il a cependant été trouvé que les micro-éléments de Heller, utilisés ensemble, par exemple en combinaison avec les autres constituants mentionnés dans le tableau 1 ci-dessus. permettent effectivement la culture des bactéries considérées.

La culture peut être effectuée à la température appropriée convenant pour l'espèce bactérienne cultivée. Généralement cette température est comprise entre 18 et 40"C suivant les souches. Le pH du milieu de culture est de préférence compris entre 5,5 et 8.

Grâce au procédé de l'invention, il a été possible d'obtenir, à partir de prélèvements d'eaux thermales, des cultures axéniques, en dépit des difficultés connues d'obtention de cultures pures de bactéries filamenteuses non photosynthétiques et non fructifiantes.

L'invention a donc également pour objet un procédé de culture en milieu aqueux de bactéries filamenteuses non photosynthétiques et non fructifiantes, principalement caractérisé par le fait que l'on effectue la culture en utilisant un ose, par exemple le glucose, comme source de carbone principale. On cultive donc ainsi des souches ayant été adaptées et sélectionnées, comme indiqué ci-dessus, pour l'utilisation d'un ose, au lieu d'acétate, comme source principale de carbone. On peut donc effectuer la culture en l'absence d'acétate. Selon d'autres modes de réalisation, on peut en outre opérer en l'absence de H2S (ou de sulfures) et/ou en l'absence de catalase, alors que ces ingrédients étaient généralement considérés comme indispensables jusqu'à présent.On peut également opérer en présence de micro-éléments de Heller, par exemple dans les proportions indiquées au Tableau 1. On peut utiliser notamment le milieu de culture défini au Tableau 1.

L'invention a également pour objet un procédé de préparation d'un médicament tel que défini ci-dessus caractérisé par le fait que l'on cultive lesdites bactéries dans un milieu de culture approprié, puis que l'on sélectionne et cultive les souches capables de se multiplier en utilisant un ose comme source principale de carbone, que l'on sépare la biomasse ou les enveloppes bactériennes, et que l'on extrait éventuellement des fractions desdites enveloppes, notamment des fractions lipopolysaccharidiques, selon les méthodes connues.

Lorsque l'on utilise des souches non encore adaptées, par exemple des souches ou des mélanges de souches provenant de prélèvement d'eaux thermales ou d'eau de mer, on les cultive d'abord dans un milieu de culture classique, contenant de l'acétate (par exemple acétate de sodium) comme seule source de carbone. On sélectionne ensuite les souches capables de se multiplier en utilisant un ose, par exemple le glucose, comme seule source de carbone, en particulier par culture dans le milieu défini qui a été indiqué précédemment. Pour la sélection et l'obtention de cultures pures, on utilise, de façon connue, les méthodes d'ensemencement de milieux de culture solides (gel d'agar) à l'aide de dilutions de milieux de culture liquide, afin d'isoler des colonies issues d'une même cellule bactérienne.

Après culture des bactéries, on peut isoler la biomasse par diverses méthodes connues, par exemple par filtration, par coagulation avec un alcool (éthanol, isopropanol, isobutanol), par séchage sur cylindre à précouche (amidon, diatomées...) raclée, ou par lyophilisation. Une concentration préalable, par exemple à 800C sous pression réduite, améliore cette séparation.

On peut procéder à une opération de rupture des enveloppes, par exemple par l'action des ultrasons. On peut en outre préparer des extraits ayant une activité immunostimulante, notamment à l'aide d'un alcool tel que l'éthanol ou le propanol.

On peut également préparer des extraits lipopolysaccharidiques selon les méthodes connues ; voir par exemple Noris et Ribbons, Methods in Microbiology, Vol. 5B, Academic
Press (1971). La méthode généralement utilisée est la méthode bien connue dite de Westphal (ou une méthode apparentée), qui consiste à faire l'extraction avec des mélanges phénol-eau à 650C. On soumet ensuite l'extrait à une dialyse pour éliminer le phénol.

L'invention permet d'obtenir notamment une composition pharmaceutique caractérisée par le fait qu'elle contient comme principe actif au moins un médicament tel que défini précédemment.

Une telle composition contient le principe actif à une concentration suffisante pour permettre l'administration de doses efficaces avec un volume acceptable de composition.

Généralement, cette composition contient de 0,01 à 1 % en poids de principe actif (exprimé par convention en poids de lipopolysaccharide) par rapport au poids total de la composition.

Elle contient, outre le principe actif, un excipient approprié permettant son administration par voie entérale, parentérale ou locale.

Elle peut être préparée selon les méthodes galéniques usuelles.

Elle peut se présenter notamment sous la forme d'une solution ou suspension dans un véhicule pharmaceutique liquide convenable, y compris un véhicule et un conditionnement permettant l'administration en aérosol. La composition liquide peut être soumise à une lyophilisation, et reconstituée au moment de l'emploi. La composition est notamment une composition conditionnée sous la forme de suspension buvable ou injectable, ou pour l'application locale, ou encore sous la forme de compositions conditionnées pour l'application par voie nasale ou conjonctivale.

La composition pouvant être obtenue grâce à l'invention peut être encore présentée par exemple sous la forme de gélules, de comprimés, de poudres, de suppositoires, de pâtes gingivales ou de crèmes.

La composition pharmaceutique obtenue selon l'invention est utilisable notamment comme médicament immunostimulant, chez l'homme ou chez l'animal.

Elle peut être administrée par exemple par voie parentérale (intra-péritonéale, sous-cutanée, intra-musculaire, intra-veineuse, percutanée) par voie orale, par voie nasale, par voie conjonctivale, par voie rectale ou par voie per-linguale.

Elle peut être aussi utilisée en application locale, par exemple à l'aide de comprimés à délitement buccal, notamment dans l'immunothérapie non spécifique des maladies de la cavité buccale.

La posologie usuelle, exprimée par convention en poids de lipopolysaccharide, peut aller par exemple de lpLg à 100 Wg/kg de poids corporel et par jour, en une ou plusieurs administrations, selon l'affection traitée.

Le médicament peut être administré à titre prophylactique, dans les différents cas ci-dessus et en particulier pour la prévention des infections récidivantes de la sphère otorhinolaryngologique (ORL), et pour la prévention des risques infectieux chez les malades chroniques.

Les formes galéniques permettant l'application sur la peau, par exemple les crèmes, peuvent être utilisées dans le traitement des brûlures et plaies superficielles. Elles présentent en outre des propriétés cicatrisantes.

Le médicament obtenu selon l'invention est administré notamment à titre de traitement immunostimulant, dans le domaine ORL ou bronchopulmonaire ou dans le domaine dermatologique, dans le cas d'infections bactériennes, fongiques ou virales. Ainsi, lorsque le médicament est utilisé dans le traitement des infections ORL ou bronchopulmonaires (rhinopharyngites, laryngites, sinusites, angines, otites, bronchites...), il peut être administré par voie orale sous forme de comprimés contenant par exemple de 0,05 à 2 mg de principe actif, ou sous forme de composition injectable par exemple sous forme d'ampoule stérile contenant de 0,01 mg à 0,05 mg de principe actif ou encore sous forme de composition aérosol contenant par exemple de 1 à 5 mg de principe actif pour 10 ml (et ceci pour 200 doses).

Lorsque le médicament est utilisé dans le traitement des affections dermatologiques comme les brûlures, les plaies, les ulcères ou les escarres, il est généralement utilisé sous forme de crème ou de gel contenant de 0,01 à 1 % de principe actif.

Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois la limiter.

EXEMPLE 1 :Sélection/adaptation d'une bactérie filamenteuse non photosynthétique et non fluctiflante; activité pharmacologique
A la suite d'un prélèvement d'eau thermale de la source de Saint-Thomas, Pyrénées
Orientales (France), différentes cultures microbiennes ont été effectuées, en utilisant l'acétate de sodium comme source de carbone.

Ces premières cultures ont été effectuées dans les conditions habituelles de recherche de microorganismes dans l'eau, la température de culture étant de 26"C.

A partir de colonies bactériennes isolées par épuisement sur milieu gélosé, on a procédé à une sélection des bactéries en cultures pures capables de s'adapter à la multiplication dans un milieu contenant du glucose comme source principale de carbone.

On a utilisé le milieu de culture suivant (Tableau 2):
TABLEAU 2

<tb> <SEP> COMPOSITION <SEP> CONCENTRATION
<tb> Extrait <SEP> autolytique <SEP> de <SEP> levure <SEP> 2 <SEP> gll <SEP>
<tb> Biokar <SEP> (réf. <SEP> 112002)
<tb> Peptone <SEP> papaïnique <SEP> de <SEP> soja <SEP> 2g/l <SEP>
<tb> (origine <SEP> PPS-USP <SEP> Biokar <SEP> réf.11601)
<tb> Micro-éléments <SEP> de <SEP> Heller <SEP> 2 <SEP> ml/l
<tb> <SEP> Glucose <SEP> anhydre <SEP> 2 <SEP> gel <SEP>
<tb> <SEP> Caca2, <SEP> 10 <SEP> H20 <SEP> 0,066 <SEP> g/l
<tb> <SEP> Eau <SEP> distillée <SEP> 100 <SEP> ml
<tb>
Le pH est ajusté à 7,15 par addition de soude ou potasse 1N avant stérilisation à 1210C pendant 20 min.

La composition des micro-éléments de Heller, pour 11 d'eau distillée, est la suivante:
-ZnSO4,7H2O îg
-MnSO4,H2O 0,076 g0,076g
- CuSO4,5H2O .................... 0,003 g - KI............................. 0,010 g
- H3BO3 1 g
- AlCl3,6H2O 0,050 g
- NiCl2,6H2O 0,030 g
On a pu ainsi sélectionner diverses souches de bactéries filamenteuses non photosynthétiques et non fructifiantes.On décrit ci-après les caractéristiques d'une bactérie filamenteuse qui a ainsi été isolée:
- Filaments (trichomes) de diamètre 2-3 llm contenant des cellules séparées par des septa,
- production d'hormogonies,
- couleur blanc beige en culture,
- bio-masse isolée de couleur rosée,
- aérobie,
- Gram négative,
- n'exigeant pas de catalase,
- inclusions de poly-ss-hydroxy butyrate
Ces caractéristiques ne permettent pas, dans l'état actuel des techniques et de la taxonomie bactérienne, de classer cette souche qui se situe à l'interface des deux genres
Beggiatoa et Vitreoscilla. On sait que ces genres sont très similaires.

Cette souche peut être conservée par congélation directe de la culture en phase exponentielle de croissance, à - 800 C. La souche peut être décongelée par passage dans un bain-marie à 37 C.

Après plusieurs repiquages en milieu solide, la souche adaptée au milieu indiqué ci-dessus a été stabilisée.

La culture en milieu liquide glucosé permet d'obtenir des filaments parfaitement distincts alors que la culture en milieu acétate tend à donner des agrégats.

L'optimum de température de culture est entre 26 et 300C.

L'entretien s'effectue par repiquage à 48 h sur le même milieu liquide, en utilisant 1% du volume total comme innoculum.

Culture en fermenteur
On effectue cette culture dans un fermenteur de 600 1 agité (200 tours/min) et aéré.

Le milieu de culture est celui indiqué ci-dessus, avec addition de 0,2 g/l d'un antimousse de type polyméthylsiloxane (Silbione 97350 RP). La température est régulée entre 26 et 300C, l'optimum se situant à 29"C.

Un cycle complet de croissance s'effectue en 48h environ. Le rendement atteint est de l'ordre de 1,4 g de poids sec par litre.

L'aération est régulée par un débitmètre massique pour avoir au minimum 20 % d'oxygène dissous.

I1 n'y a pratiquement plus de glucose résiduel en fin de croissance.

La biomasse est récoltée par centrifugation.

On opère dans une centrifugeuse de type industriel refroidie à 200C et capable d'imprimer une accélération supérieure à 5000 x g. La biomasse ainsi obtenue peut être chauffée à 1210C pendant 20 min. Ce traitement casse l'enveloppe cellulaire et libère les lipopolysaccharides. On obtient ainsi un extrait brut directement utilisable que l'on peut, le cas échéant, purifier par la méthode de Westphal précédemment citée.

Mise en évidence de l'activité immunoréqulatrice sur macrophages humains en culture:
Le principe utilisé est le suivant: lorsqu'une substance immunomodulatrice est introduite dans une culture de macrophages humains, on peut observer une activation du système par la mesure du CaH libre cytosolique, dont l'élévation correspond à une activation des macrophages. Le taux de calcium cytosolique est mesuré par fluorescence à l'aide de la sonde INDO-1 sous forme d'ester. La sonde pénètre dans les cellules ou elle est transformée sous l'action d'esterases en une forme liant le calcium, la formation d'un complexe avec les ions calcium s'accompagnant d'un déplacement du spectre d'émission.

On utilise une lignée leucémique myélomonocytaire humaine THP1 fournie par le
Dr. Matsushima (National Cancer Institute, Fredericks, MD, USA) produite dans du milieu
RPMI 1640 (GIBCO BRL FRANCE) additionné de 5 % (V/V) de sérum de veau foetal décomplémenté (SIGMA, FRANCE), de glutamine-2mM, de pyruvate de sodium lmM, de pénicilline 50U/ml et de streptomycine 50U/ml.

Le principe actif étudié, constitué par l'extrait obtenu ci-dessus, est introduit à diverses concentrations et incubé 45 minutes à l'obscurité. Les macrophages (5.106 cellules/ml) sont soumis à une incubation de 45min à 370C à l'obscurité en présence de 4mM de la sonde INDO-1 AM (sous forme d'ester), commercialisée par France Biochem, dans un milieu composé de 140mM NaCl, 5mM KCl, lmM CaCl2, lmM MgCl2, l0mM glucose, 20mM HEPES, de sérum albumine bovine 0,1 %, pH 7,4. Les cellules sont ensuite lavées et remises en suspension à une concentration de 106 cellules/ml dans le même milieu.

La fluorescence est mesurée au moyen d'un spectrofluorimètre PERKIN-ELMER
LS.5B à une longueur d'onde d'émission de 410nm pour une longueur d'onde d'excitation de 331nm.

On constate que le principe actif étudié augmente la concentration de CaH cytosolique, cette augmentation croissant avec la concentration du principe actif qui varie de 33 à 2671lg/ml.

On peut également déterminer l'activation des macrophages par la mesure de la mobilisation des stocks intracellulaire de calcium. Cette estimation se fait après addition de la sonde INDO-1. Le calcium extracellulaire est ensuite chélaté par l'EGTA (lmM). On ajoute ensuite le principe actif étudié, à diverses concentrations. Après stabilisation du signal la concentration de calcium extra-cellulaire est restaurée par l'ajout de CaCl2 (2mM) dans le milieu d'incubation.

On constate que le principe actif étudié, à des concentration de 33 à 267 ,ug/ml permet la libération des stocks intracellulaires de Ca.

Mesure de la production d'interleukine 1 p
On sait que l'on peut provoquer la sécrétion d'IL1B par des lignées monocytaires à l'aide de stimuli variés, notamment les stimuli chimiques à l'aide d'esters de phorbol (PMA)
Les cellules THP1 sont incubées en l'absence ou en présence de 1 ou 2 ng/ml de
PMA et de concentrations variables du principe actif étudié (variant de 10 à 100 ug/ml), pendant 24H à 370C. La sécrétion d'IL1P est mesurée dans le surnageant de culture à l'aide d'un essai ELISA, en utilisant des plaques de polypropylène (immulon 2 Dynatech). Des immunoglobulines (IgG) de mouton anti-ILlss sont immobilisées sur les parois des puits.La révélation est effectuée à l'aide de fragments Fab' d'anticorps anti-interleukine 1,ss, couplés à la peroxydase. La lecture est effectuée par mesure de la densité optique à 492nM, en présence d'orthophénylènediamine, par comparaison avec une courbe standard obtenue à l'aide d'IL1 recombinante.

Les résultats sont les suivants (Tableau 3):
TABLEAU 3

<tb> <SEP> Concentration <SEP> Principe <SEP> Actif
<tb> <SEP> 10 <SEP> KLg/ml <SEP> 100 <SEP> SLg/ml <SEP> 10 <SEP> ,ug/ml <SEP> 100 <SEP> g/ml <SEP>
<tb> <SEP> Production <SEP> IL1 <SEP> 0,2 <SEP> 1,0 <SEP> 15 <SEP> 100
<tb> ng/ml
<tb> <SEP> Concentration <SEP> 1 <SEP> 2
<tb> <SEP> PMA <SEP> ng/ml
<tb>
En conclusion, le principe actif étudié stimule les flux de CaFF chez les macrophages. L'effet est rapide (moins de 2 secondes) et est dépendant de la dose. Il concerne à la fois l'influx de Ca* et la mobilisation des réserves intracellulaires.De plus, le principe actif étudié stimule la production d'IL1P après 24H d'incubation, ce qui montre l'absence de toxicité pour les macrophages.

Activité cicatrisante:
Cicatrisation épidermique:
Sur le cobaye épilé, il est possible d'induire par succion (dépression de 120 mm de mercure pendant deux heures) deux plaies purement épidermiques de taille identique. L'une des plaies peut alors être traitée avec le produit à étudier, l'autre servant de témoin.

Les produits étudiés sont appliqués sous forme de crème contenant 1 % de l'extrait préparé à l'exemple 1, immédiatement après découpe de la bulle de succion (0,5 cm2), sous pansement occlusif, à raison de 10 mg/cm2 de plaie.

Au bout de 24 heures, des fragments de peau portant les cicatrices sont prélevés.

Après séparation du derme et de l'épiderme par l'action du bromure de sodium, la taille de la plaie est mesurée sur l'épiderme séparé, par planimétrie.

L'activité est exprimée en pourcentage de réduction de la surface initiale de la plaie.

On a constaté une réduction de 72 % de la surface initiale de la plaie alors que sur la zone témoin la réduction de surface n'est que de 49 % (moyenne de 12 mesures).

Dans une autre expérience on a provoqué une plaie épidermique par incision du coussinet plantaire du cobaye. Les plaies subissent trois traitements, immédiatement après incision puis au bout de 24 heures et 48 heures. Après application, les plaies sont recouvertes d'un pansement occlusif. 24 heures après le dernier traitement, la peau des pattes est prélevée et l'épiderme portant la cicatrisation est séparé du derme par l'action du bromure de sodium.

Après rinçage, on mesure la force de rupture de l'épiderme cicatriciel à l'aide d'un extensiomètre de marque INSTRON.

Pour les cicatrices traitées, la force de rupture (moyenne sur 9 animaux par produit) est de 139,8+2366 Newtons, alors que chez les témoins la force de rupture est de 63,216,14
Newtons.

Cicatrisation dermique chez le rat:
On effectue de manière standardisée des incision concernant toute l'épaisseur de la peau dorsale.

Le produit étudié est appliqué sous forme de crème, comme précédemment, à raison de 10 mg/cm2 (quotidiennement) des jours J + 5 à J + 9 après incision, sans pansement.

Comme précédemment on mesure les forces de ruptures de la peau totale cicatricielle excisée à J + 12. Avec le produit étudié à une concentration de 1 %, la force de rupture est de 428,4 Newtons (moyenne sur 9 animaux par produit) tandis que la force de rupture de la zone témoin est de 290,4 Newtons.

Les exemples suivants sont des exemples d'application de l'extrait bactérien qui peut être obtenu selon le procédé de l'invention.

EXEMPLE 2: Composition dermique sous forme de crème
On a préparé une crème ayant la composition suivante: - Extrait bactérien obtenu selon le procédé de
préparation de l'exemple 1 0,3 g - Huile de vaseline 20 g - Acide stéarique 3g - Alcool cétylique 3g - Stéarate de polyéthylèneglycol à 100 OE 5g - Propylèneglycol 3g - Conservateur 0,3 g - Eau purifiée qsp 100 g
Cette crème est appliquée à raison de trois applications par jour pendant 10 à 15 jours sur des brûlures ou des plaies, en vue d'accélérer la cicatrisation.

EXEMPLE 3 : Solution injectable
On a préparé une solution injectable sous forme de dose unitaire ayant la composition suivante: - Extrait bactérien obtenu selon le procédé de
préparation de l'exemple 1 0,03 g - Chlorure de sodium à 0,8 % dans l'eau 1 ml
Cette solution injectable est utilisée dans le traitement des affections ORL ou bronchopulmonaires chroniques. La posologie est de 1 injection sous-cutanée profonde en commençant par une demi-dose puis une dose tous les 15 jours pendant 2 mois.

Claims

REVENDICATIONS

1. Procédé de culture en milieu aqueux de bactéries filamenteuses non photosynthétiques et non fructifiantes, caractérisé par le fait que l'on effectue la culture en utilisant un ose, au lieu d'acétate, comme source de carbone principale.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que ledit ose est le glucose.

3. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que l'on effectue la culture en l'absence d'acétate.

4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que l'on opère en l'absence de H2S et en l'absence de sulfures.

5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que l'on opère en l'absence de catalase.

6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que l'on opère en présence de micro-éléments de Heller, en particulier à raison de 0,5 à 5 ml/l.

7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que l'on effectue la culture dans le milieu suivant:

- Extrait autolytique de levures 0,5 à 5 g/l

- Peptone 0,5 à 5 g/l

- Glucose anhydre 0,5 à 7 g/l

- Micro-éléments de Heller 0,5 à 5 ml/l

- CaCl2, 10 H20 0,010 à 0,200 g/l

- Eau distillée q.s.p. 1000 ml.

8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que le pH du milieu de culture est compris entre 5,5 et 8.

9. Procédé selon l'une quelconque des revenbications précédentes, caractérisé par le fait que l'on opère à une température comprise entre 18 et 40"C.

10. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que lesdites bactéries appartiennent à l'ordre des Beggiatoales.

11. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que lesdites bactéries appartiennent au genre Beggiatoa.

12. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que lesdites bactéries sont choisies parmi les souches de Beggiatoa alba.

13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé par le fait que lesdites bactéries appartiennent au genre Vitreoscilla.

14. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé par le fait que lesdites bactéries appartiennent à l'espèce Vitreoscilla beggiatoïdes.

15. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que lesdites bactéries sont des bactéries ayant été adaptées et sélectionnées pour l'utilisation d'un ose, au lieu d'acétate, comme source principale de carbone.

16. Utilisation d'un milieu de culture tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 8 dans un procédé de culture de bactéries filamenteuses non photosynthétiques et non fructifiantes.