FR2687410A1 - Beta-lactamase recombinante, utilisable en tant que molecule porteuse pour la preparation de compositions immunogenes. - Google Patents
Beta-lactamase recombinante, utilisable en tant que molecule porteuse pour la preparation de compositions immunogenes. Download PDFInfo
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Abstract
La présente invention concerne une séquence nucléotidique, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi l'un des enchaînements nucléotidiques suivants: la séquence du gène codant pour une beta-lactamase, ou toute partie de ce gène, en particulier la séquence comprise entre les nucléotides 1 et 394 contenant les signaux d'expression du gène, ou la séquence codante comprenant les nucléotides 395 à 1274, ou toute séquence hybridant dans des conditions stringentes avec la séquence ci-dessus. Utilisation de la beta-lactamase comme protéine porteuse d'épitopes hétérologues, pour la préparation de compositions vaccinantes.
Description
P-lactamase recombinante, utilisable en tant
que molécule porteuse pour la préparation de
compositions immunogènes.
que molécule porteuse pour la préparation de
compositions immunogènes.
La presente demande a pour objet de nouveaux moyens pour la préparation de compositions immunogènes et de préférence de compositions vaccinantes protectrices, susceptibles de se présenter sous forme de "vaccins vivants", de particules ou de molécules administrables à l'homme ou à l'animal.
L'un des buts de la présente invention est de proposer des moyens pour élaborer des compositions immunogènes susceptibles de déclencher chez l'homme ou chez l'animal une réponse immunitaire cellulaire et/ou humorale (par l'intermédiaire d'anticorps), contre des déterminants antigéniques et notamment des épitopes caractéristiques de différents agents pathogènes. Plus généralement l'invention propose de nouveaux moyens pour déclencher ou favoriser une réponse immunitaire contre tout épitope déterminé pour produire des anticorps ou une réponse immunitaire cellulaire, et en particulier lorsque les determinants antigéniques sont de type haptène et par conséquent incapables de déclencher par eux-mêmes cette réponse immunitaire.
L'invention présente également un interêt en vue de favoriser une réponse immunitaire suceptible d'être conférée par un antigène, et notamment d'en augmenter le niveau ou le caractère protecteur.
L'invention décrit à cet égard de nouvelles molécules susceptibles d'être utilisées comme vecteur de l'antigénicfté de différents épitopes, à la fois dans des compositions immunogènes contenant les molécules hybrides (recombinantes) ainsi formées ou dans des vaccins vivants.
Différents facteurs peuvent être determinants dans le choix d'une molécule, en particulier d'une protéine capable de se comporter comme protéine porteuse (encore appelée vecteur) dans le but de conférer ou d'améliorer l'immunogénicité d'un épitope hétérologue par rapport à cette molécule. On doit par exemple tenir compte des paramètres de taille de la protéine vecteur en tant que telle et de sa taille par rapport à celle de l'épitope qu'elle doit contenir ainsi que de la taille de l'épitope en tant que tel.D'autres contraintes pour l'élaboration de vaccins, vivants ou non, faisant intervenir des molécules porteuses, sont par exemple l'antigénicité de la molécule porteuse, sa toxicité pour un hôte cellulaire dans lequel elle serait produite ou pour le sujet auquel elle serait administrée. I1 convient aussi de déterminer les sites potentiels d'insertion pour l'épitope, et de façon tout à fait importante lorsque cette protéine modifiée est utilisée dans le cadre de la préparation d'un vaccin vivant, sa capacité à être exportée voire sécrétée par l'hôte qui la produit, afin d'être accessible au système immunitaire du sujet auquel est administré le vaccin.
Dans le cadre de la présente invention, les inventeurs se sont intéressés à des protéines de la famille des P-lactamases, dont certaines propriétés ont été étudiées jusqu'à présent dans un contexte différent de celui de la présente invention.
Les ss-lactamases sont des enzymes réparties dans différentes classes, en fonction de leur activité enzymatique sur différents substrats. Elles sont produites par différents organismes et en particulier par des bactéries, par exemple des bactéries de type
E.coli, Staphylococcus aureus, ou encore par des mycobactéries. Ces enzymes sont étudiées pour leur capacité à protéger des bactéries contre les effets létaux des antibiotiques du type p-lactams, et donc leur capacité à conférer à certaines bactéries la résistance à différents antibiotiques. C'est dans ce contexte d'étude de la résistance de bactéries aux antibiotiques que plusieurs auteurs ont publié des articles décrivant la purification de certaines p- lactamases.
E.coli, Staphylococcus aureus, ou encore par des mycobactéries. Ces enzymes sont étudiées pour leur capacité à protéger des bactéries contre les effets létaux des antibiotiques du type p-lactams, et donc leur capacité à conférer à certaines bactéries la résistance à différents antibiotiques. C'est dans ce contexte d'étude de la résistance de bactéries aux antibiotiques que plusieurs auteurs ont publié des articles décrivant la purification de certaines p- lactamases.
Par exemple Choubey et al ont publié des résultats décrivant la purification jusqu'à l'homogénéité d'une P-lactamase de Mycobacterium smegmatis (Microbiology, 1986, Vol.13:171-175). D'autres auteurs ont publié des données relatives à la caractérisation de la p- lactamase produite dans une souche de Mycobacterium fortuitum (J. Amicosante et al, Biochem. J., 1990, 271:729-734 ; L. Fattorili et al, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Septembre 1991, p. 1760-1764). Dans cette seconde publication, les auteurs rappellent que les p- lactamases ont été décrites comme étant des enzymes périplasmiques chez les bactéries Gramnégatives. Chez les Gram-positives, puisqu'il existe une unique membrane cellulaire, ces enzymes sont exportées à la surface ou relarguées dans le milieu.
Certaines sont retrouvées en grande quantité dans le milieu de culture, d'autres sont ancrées à la membrane bactérienne.Ces enzymes présentent un large spectre d'activité.
Le relargage de cette enzyme par les bactéries qui la produisent, serait donc lié en partie à des facteurs d'environnement ou à des facteurs propres à la physiologie de la cellule productrice ou encore à des déterminants structuraux de la p-lactamase.
Malgré les caractéristiques connues des p- lactamases, d'intervenir dans la résistance à certains antibiotiques, et en dépit du fait que le mode d'expression et notamment la possibilité de sécrétion de cette protéine par la cellule qui la produit n'étaient pas totalement caractérisés, les inventeurs se sont intéressés à la capacité de cette enzyme de se comporter comme un vecteur de l'antigénicité d'un épitope qui lui serait hétérologue.
Par épitope hétérologue on entend ici une séquence d'acides aminés caractéristique d'une protéine et notamment d'un antigène différent d'une P-lactamase, à tout le moins différent de la ss-lactamase choisie comme molécule porteuse.
Selon les inventeurs les propriétés connues de différentes p-lactamases, telles que le fait qu'elles sont exportées et monomériques, ainsi que leurs propriétés structurales sont susceptibles de leur conférer de nombreux avantages pour être utilisées comme protéines vectrices de l'antigénicité de différents epitopes. Elles se sont en outre révélées intéressantes dans le cadre de l'élaboration de vaccins vivants. Dans le but de définir les conditions à respecter pour la construction de protéines recombinantes à partir de la P-lactamase, les inventeurs ont déterminé la séquence et l'organisation structurale du gène et prédit par modélisation la structure tridimensionnelle de la protéine p-lactamase d'une mycobactérie, Mycobacterium fortuitum (désignée dans la suite M. fortuitum). La connaissance de ce gène a permis de localiser des régions propres à contenir la séquence nucléotidique codant pour un peptide ou un polypeptide porteur d'au moins un épitope contre lequel on cherche à obtenir une réponse immunitaire et d'envisager la préparation de protéines recombinantes.
Ces recherches ont en outre permis de définir quelles étaient les séquences codant pour une p-lactamase et les signaux nécessaires à l'expression et également à l'exportation voire à la sécrétion, d'une proteine recombinante produite chez un hôte cellulaire.
En outre l'obtention de la séquence du gène de la ss-lactamase de M. fortuitum permet de prévoir l'utilisation d'autres ss-lactamases de structure comparable, en particulier au niveau de leur structure tridimensionnelle, pour realiser des proteines recombinantes dans le cadre de l'invention.
Dans le cadre de l'application particulière de ces proteines recombinantes à l'élaboration de vaccins vivants, les inventeurs se sont intéressés à des mycobactéries. Un candidat interessant pour le développement de tels vaccins est la mycobactérie
M. bovis BCG (le Bacille de Calmette et Guérin), aussi désignée par la suite BCG, utilisée jusqu'à présent comme vaccin pour protéger contre la tuberculose. BCG est une bactérie avirulente, qui présente un tropisme pour les macrophages et est capable d'induire à la fois une réponse cellulaire B, T et CTL (par les lymphocytes
T cytotoxiques) de forte amplitude. Sa paroi cellulaire fonctionne comme un adjuvant très efficace et une seule inoculation peut déclencher une immunité de longue durée.
M. bovis BCG (le Bacille de Calmette et Guérin), aussi désignée par la suite BCG, utilisée jusqu'à présent comme vaccin pour protéger contre la tuberculose. BCG est une bactérie avirulente, qui présente un tropisme pour les macrophages et est capable d'induire à la fois une réponse cellulaire B, T et CTL (par les lymphocytes
T cytotoxiques) de forte amplitude. Sa paroi cellulaire fonctionne comme un adjuvant très efficace et une seule inoculation peut déclencher une immunité de longue durée.
La présente invention a permis de mettre en évidence que l'utilisation d'une protéine vecteur telle que la P-lactamase peut favoriser le clonage et l'expression chez des mycobactéries, en particulier chez le BCG, de déterminants antigéniques hétérologues.
Avantageusement, dans le cas de l'utilisation de BCG comme hôte cellulaire pour l'expression de la p- lactamase, on aura recours à une ss-lactamase exogène par rapport à celles qui préexistent naturellement dans le BCG, et ce afin d'éviter ou de minimiser les phénomènes de recombinaison.
L'invention concerne donc une séquence nucléotidique caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi l'un des enchaînements nucléotidiques suivants - la séquence du gène codant pour une p-lactamase,
comprenant l'enchaînement représenté à la figure
4, - toute partie de l'enchaînement nucléotidique
représenté à la figure 4, participant à la
structure de la p-lactamase, ou nécessaire à son
expression dans un hôte cellulaire approprié, en
particulier la séquence comprise entre les
nucléotides 1 et 394 de l'enchaînement de la
figure 4 contenant les signaux d'expression du
gène, - la séquence codante contenue dans l'enchaînement
représenté à la figure 4, et comprenant les
nucléotides 395 à 1274, - toute séquence hybridant dans des conditions
stringentes avec l'enchaînement de la figure 4 et
notamment avec l'enchaînement compris entre les
nucléotides 1 et 394 ou avec l'enchaînement
compris entre les nucléotides 395 et 1274 de cette
séquence.
comprenant l'enchaînement représenté à la figure
4, - toute partie de l'enchaînement nucléotidique
représenté à la figure 4, participant à la
structure de la p-lactamase, ou nécessaire à son
expression dans un hôte cellulaire approprié, en
particulier la séquence comprise entre les
nucléotides 1 et 394 de l'enchaînement de la
figure 4 contenant les signaux d'expression du
gène, - la séquence codante contenue dans l'enchaînement
représenté à la figure 4, et comprenant les
nucléotides 395 à 1274, - toute séquence hybridant dans des conditions
stringentes avec l'enchaînement de la figure 4 et
notamment avec l'enchaînement compris entre les
nucléotides 1 et 394 ou avec l'enchaînement
compris entre les nucléotides 395 et 1274 de cette
séquence.
Avantageusement, des séquences répondant aux définitions précédentes, sont constituées par les enchaînements nucléotidiques clonés dans les plasmides contenus dans les souches E.coli déposées à la C.N.C.M.
sous les numéros I-1170 et 1-1171, ainsi que toute séquence nucléotidique hybridant dans des conditions stringentes avec ces enchaînements clonés.
La séquence représentée à la figure 4 contient le gène codant pour la P-lactamase de M. fortuitum, ainsi que les parties non codantes. La séquence nucléotidique du gène de la ss-lactamase de M. fortuitum n'est pas la seule séquence intéressante dans le cadre de l'invention ; en effet des fragments ou partie de l'enchaînement représenté à la figure 4 peuvent être intéressants.
En particulier une séquence nucléotidique avantageuse dans le cadre de l'invention est la séquence nucléotidique correspondant à l'extrémité 5' non codante du gène de la p-lactamase, cette séquence contenant les signaux d'expression du gène de cette enzyme. Cette partie 5' de la séquence du gène peut être utilisée pour l'expression de séquences nucléotidiques variées dans des hôtes cellulaires de type mycobactéries. Elle convient par exemple pour l'expression dans des mycobactéries, de p-lactamases issues d'organismes différents des mycobactéries, puisqu'elle contient des signaux d'expression reconnus par les mycobactéries.
D'autres fragments de la séquence nucléotidique représentée à la figure 4, utilisables dans le cadre de l'invention, sont les séquences codant pour une protéine tronquée dont la structure globale est préservée, par rapport à la protéine native, en particulier dans des conditions telles que le produit d'expression de cette séquence nucléotidique est stable et notamment insensible aux protéases cellulaires de l'hôte qui le produit et/ou éventuellement du sujet auquel il est administré.
Par stabilite de la protéine on entend notamment la possibilité de la purifier ou la possibilité pour cette protéine d'être reconnue par un anticorps.
Une séquence nucléotidique avantageuse est une séquence présentant des similitudes avec l'enchaînement représenté à la figure 4. Par similitude, on entend notamment la capacité d'hybrider dans des conditions stringentes avec la séquence de la figure 4.
Pour déterminer si une séquence nucléotidique est capable d'hybrider dans des conditions stringentes avec la séquence codante contenue dans l'enchaînement représenté à la figure 4, on peut mettre en oeuvre le test suivant
On utilise par exemple une sonde déterminée à partir de l'enchaînement codant représenté à la figure 5 avec lequel on souhaite tester l'hybridation d'une séquence déterminée; cette sonde est marquée au 32p (106 cpm/ml) et on la met en contact avec la séquence testée pendant 16 heures à 65"C dans une solution d'hybridation (formamide 50%, 5 x SSPE, DNA de sperme de saumon 200 yg/ml et 10 x Denhart). Les membranes sur lesquelles est réalisée l'hybridation sont ensuite lavées deux fois pendant 30 minutes avec une solution ISSU, 0,1% SDS à temérature ambiante (20"C) puis lavées deux fois avec 0,îSSC, 0,1% SDS pendant 30 minutes à 65"C.
On utilise par exemple une sonde déterminée à partir de l'enchaînement codant représenté à la figure 5 avec lequel on souhaite tester l'hybridation d'une séquence déterminée; cette sonde est marquée au 32p (106 cpm/ml) et on la met en contact avec la séquence testée pendant 16 heures à 65"C dans une solution d'hybridation (formamide 50%, 5 x SSPE, DNA de sperme de saumon 200 yg/ml et 10 x Denhart). Les membranes sur lesquelles est réalisée l'hybridation sont ensuite lavées deux fois pendant 30 minutes avec une solution ISSU, 0,1% SDS à temérature ambiante (20"C) puis lavées deux fois avec 0,îSSC, 0,1% SDS pendant 30 minutes à 65"C.
Composition de 5 x SSPE
NaCl : 900 mM
NaH2PO4 : 450 mM
Na2EDTA : 5 mM pH : 7,4
Denhart ficoll : 2,5 g/l polyvinylpyrrolidone : 2,5 g/l
BSA (Pentex fraction V) : 2,5 g/l 0,1 x SSC
NaCl : 15 mM
Na3 citrate : 0,1%
Selon une autre définition, une séquence nucléotidique de l'invention est caractérisée en ce qu'elle code pour une protéine de type P-lactamase comprenant l'enchaînement d'acides aminés représenté à la figure 4.
NaCl : 900 mM
NaH2PO4 : 450 mM
Na2EDTA : 5 mM pH : 7,4
Denhart ficoll : 2,5 g/l polyvinylpyrrolidone : 2,5 g/l
BSA (Pentex fraction V) : 2,5 g/l 0,1 x SSC
NaCl : 15 mM
Na3 citrate : 0,1%
Selon une autre définition, une séquence nucléotidique de l'invention est caractérisée en ce qu'elle code pour une protéine de type P-lactamase comprenant l'enchaînement d'acides aminés représenté à la figure 4.
L'invention concerne par ailleurs une séquence nucléotidique recombinante caractérisée en ce qu'elle comprend - une séquence nucléotidique répondant à l'une des
définitions précédentes, codant pour une p
lactamase, modifiée par au moins un enchaînement
nucléotidique hétérologue codant pour une séquence
peptidique hétérologue comprenant au moins un
épitope, la modification étant réalisée en au
moins un site permettant, lorsque la séquence
recombinante est exprimée, l'exposition de
l'épitope à la surface de la P-lactamase ou son
accessibilité au solvant, - une séquence nucléotidique répondant aux
définitions précédentes, codant pour une p-
lactamase tronquée, modifiée par au moins un
enchaînement nucléotidique hétérologue codant pour
une séquence peptidique hétérologue comprenant au
moins un épitope, la modification étant réalisée
en au moins un site permettant, lorsque la
séquence recombinante est exprimée, l'exposition
de l'épitoge à la surface de la p-lactamase ou son
accessibilité au solvant, et la protéine hybride
exprimée conservant les caractéristiques
structurales essentielles de la p-lactamase
native, en particulier celles qui lui confèrent sa
reconnaissance par des anticorps dirigés contre le
ou les épitopes, ou sa stabilité, lorsqu'elle est
recombinée.
définitions précédentes, codant pour une p
lactamase, modifiée par au moins un enchaînement
nucléotidique hétérologue codant pour une séquence
peptidique hétérologue comprenant au moins un
épitope, la modification étant réalisée en au
moins un site permettant, lorsque la séquence
recombinante est exprimée, l'exposition de
l'épitope à la surface de la P-lactamase ou son
accessibilité au solvant, - une séquence nucléotidique répondant aux
définitions précédentes, codant pour une p-
lactamase tronquée, modifiée par au moins un
enchaînement nucléotidique hétérologue codant pour
une séquence peptidique hétérologue comprenant au
moins un épitope, la modification étant réalisée
en au moins un site permettant, lorsque la
séquence recombinante est exprimée, l'exposition
de l'épitoge à la surface de la p-lactamase ou son
accessibilité au solvant, et la protéine hybride
exprimée conservant les caractéristiques
structurales essentielles de la p-lactamase
native, en particulier celles qui lui confèrent sa
reconnaissance par des anticorps dirigés contre le
ou les épitopes, ou sa stabilité, lorsqu'elle est
recombinée.
L'exposition au niveau de la protéine recombinante, de l'épitope hétérologue, correspond à l'accessibilité de cet épitope au solvant, en particulier aux molécules d'eau, ou à la disponibilité de cet épitope pour être présenté à des anticorps.
Selon la définition donnée dans le paragraphe précédent, la séquence nucléotidique codant pour la p- lactamase ou pour une ss-lactamase tronquée, peut être modifiée par au moins un enchaînement nucléotidique hétérologue. En effet de même que la taille de l'enchaînement nucléotidique hétérologue ne constitue pas un paramètre limitant a priori, on peut envisager d'insérer plusieurs séquences hétérologues au sein de la séquence codant pour la p-lactamase ou pour une plactamase tronquée.
L'insertion de séquences hétérologues comprenant au moins un épitope et présentant une taille de quelques nucléotides peut paraître avantageuse dans la mesure où les problèmes pouvant résulter d'une déformation de la P-lactamase modifiée codée par la séquence nucléotidique recombinante de l'invention, sont limités. Cependant il est possible d'insérer en un ou plusieurs sites de la séquence nucleotidique codant pour la P-lactamase, des enchaînements nucléotidiques hétérologues de séquences plus longues, dès lors qu'ils codent pour une séquence peptidique dont l'épitope ou les épitopes seront exposés à la surface de la protéine recombinante formée ou accessibles au solvant.De préférence l'hybride ainsi formé conserve les caractéristiques les plus importantes de sa structure, notamment sa capacité à être reconnu par des anticorps anti-p-lactamase et des anticorps anti-séquence hétérologue, ainsi que sa capacité à être purifié.
Une protéine dite stable selon l'invention présente au moins une des propriétés suivantes - l'activité enzymatique de la ss-lactamase, les cas
échéant modifiée en intensité, - la capacité à être reconnue par un anticorps
notamment un anticorps anti-p-lactamase, ou un
anticorps dirigé contre un épitope hétérologue
qu'elle contient, lorsqu'il s'agit de la protéine
recombinante ou, - une insensibilite à la dégradation par les
protéases cellulaires, - la possibilité d'être purifiée.
échéant modifiée en intensité, - la capacité à être reconnue par un anticorps
notamment un anticorps anti-p-lactamase, ou un
anticorps dirigé contre un épitope hétérologue
qu'elle contient, lorsqu'il s'agit de la protéine
recombinante ou, - une insensibilite à la dégradation par les
protéases cellulaires, - la possibilité d'être purifiée.
Differents enchaînements nucléotidiques hétérologues peuvent être choisis pour réaliser les séquences nucléotidiques recombinantes de l'invention.
Un premier groupe d'enchaînements hétérologues est caractérisé en ce qu'il comprend des séquences codant pour un peptide ou un polypeptide, impliqué dans la virulence d'un agent pathogène ou de façon générale pour un antigène à potentiel protecteur contre un facteur produit à la suite d'une infection. A cet égard une séquence caracteristique d'un organisme pathogène est par exemple une séquence de virus, de parasite, de bactérie ou de champignon (par exemple du genre Aspergillus). En particulier on citera dans le cadre de la presente invention les séquences de bactéries telles que M. leprae, M. tuberculosis, M.
intracellulare, M. africanum, M. avium, les bacilles responsables de la diphtérie, du tétanos, Salmonella, certains treponèmes, la toxine de pertussis, des sequences d'autres microorganismes tels que les sporozoites et les mérozoïtes de plasmodium, les séquences de Leishmania ou Schistosoma, de
Shigella, de Neisseria, de Borrelia, des séquences de virus notamment le virus des oreillons, de la rubéole, de la rougeole, de l'herpes, d'influenza, le virus de la rage, de la polio, de l'hépatite, du SIDA HIV,
HTLV-I, HTLV-II et SIV ainsi que des virus oncogènes.
Shigella, de Neisseria, de Borrelia, des séquences de virus notamment le virus des oreillons, de la rubéole, de la rougeole, de l'herpes, d'influenza, le virus de la rage, de la polio, de l'hépatite, du SIDA HIV,
HTLV-I, HTLV-II et SIV ainsi que des virus oncogènes.
La séquence d'acide nucléique à exprimer peut aussi coder pour une séquence immunogène telle que celle de venin de serpent ou d'insecte.
A titre d'exemple un enchaînement nucléotidique hétérologue interessant est par exemple un enchaînement codant pour une séquence peptidique d'un antigène de rétrovirus humain de type HIV, notamment un antigène d'enveloppe, de qaq, nef ou pol d'un rétrovirus HIV-1 ou HIV-2.
D'autres séquences intéressantes sont les séquences immunogènes de mycobactéries, en particulier les protéines ou les fragments des protéines correspondant à des gènes impliqués dans la virulence et des antigènes à potentiel protecteur. Un antigène est dit à "potentiel protecteur" lorsqu'il est susceptible de déclencher ou de favoriser une réponse immunitaire protectrice, en particulier par production d'anticorps ou par induction d'une réponse immunitaire à médiation cellulaire, en particulier de type CTL. Un tel antigène à potentiel protecteur peut être constitué par un épitope voire un haptène insuffisant en soi pour déclencher la réponse immunitaire.
L'invention permet ainsi la préparation de protéines recombinantes intéressantes notamment pour la constitution de compositions immunogènes, dans lesquelles l'épitope exposé à la surface de la protéine recombinante est caractéristique par exemple d'une hormone, ou de toute substance dont on cherche à atténuer, voire neutraliser les effets biologiques.
Avantageusement une séquence nucléotidique recombinante peut être constitué par une séquence nucléotidique codant pour la ss-lactamase ou une p- lactamase tronquée, telle que décrite précédemment dans laquelle serait insere un enchaînement hétérologue codant pour la séquence peptidique V3 de l'antigène d'enveloppe des différentes variants HIV-1 ou une séquence de plus grande taille de l'enveloppe d'un virus HIV. Cette séquence a été décrite dans la publication de K. Javaherian et al. (Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 86:6768-6772, 1989).
L'invention vise egalement un vecteur recombinant de clonage et/ou d'expression, réplicatif ou intégratif caractérisé en ce qu'il est modifié, en l'un de ses sites non essentiels pour sa réplication ou son intégration, par une sequence nucléotidique recombinante ci-dessus decrite.
Lorsque ce vecteur est modifié par la seule séquence codante ou par une séquence codante partielle de la 8-lactamase, il peut comprendre également des signaux d'expression, de traduction et voire de sécrétion, d'origine differente de celle de la p- lactamase, choisis en fonction de l'hôte dans lequel on cherche à cloner ou à exprimer ce vecteur recombinant.
A titre d'exemple de vecteur pour la préparation de vecteurs recombinants selon 1'invention, on peut citer les plasmides, les phages ou les transposons.
En particulier un plasmide de l'invention est le plasmide pACYC184BlaM contenant le fragment SphI de l'enchaînement de la p-lactamase de M. fortuitum présenté à la figure 4, et qui est déposé à la C.N.C.M.
(Collection Nationale des Microorganismes, Paris,
France) dans une souche E.coli HB101(pACYC184BlaM) sous le numéro I-1171 déposée le 11 Février 1992.
France) dans une souche E.coli HB101(pACYC184BlaM) sous le numéro I-1171 déposée le 11 Février 1992.
La plasmide pACYC184BlaM contient le fragment
SphI/Sp I, d'environ 4,7 kb, de 1'ADN génomique de
M. fortuitum D316 hybridant avec la sonde BlaOl. Ce fragment porte les 834 premières bases du gène codant pour une ss-lactamase de classe A, ainsi que ses régions régulatrices.
SphI/Sp I, d'environ 4,7 kb, de 1'ADN génomique de
M. fortuitum D316 hybridant avec la sonde BlaOl. Ce fragment porte les 834 premières bases du gène codant pour une ss-lactamase de classe A, ainsi que ses régions régulatrices.
Le milieu de culture préconisé pour cette souche est un milieu L-Broth plus chloramphénicol (30pg/ml) et l'ensemencement est effectué su milieu L-Broth, la température d'incubation étant d'environ 37"C sous agitation.
Un autre plasmide préféré selon l'invention contient le gène de la P-lactamase de M. fortuitum ; il s'agit du plasmide pIPJ39 contenu dans une souche de E.coli MC1061(pIPJ39), déposée à la C.N.C.M. le 11
Février 1992 sous le numéro 1-1170.
Février 1992 sous le numéro 1-1170.
Le plasmide pIPJ39 contient le fragment
BamHI/BamIII, d'environ 6 kb, de 1'ADN génomique de
M. fortuitum FC1 hybridant avec la sonde BlaOl. Ce fragment porte le gène codant pour une ss-lactamase de classe A, ainsi que des régions flanquantes.
BamHI/BamIII, d'environ 6 kb, de 1'ADN génomique de
M. fortuitum FC1 hybridant avec la sonde BlaOl. Ce fragment porte le gène codant pour une ss-lactamase de classe A, ainsi que des régions flanquantes.
Le milieu de culture préconisé pour cette souche est un milieu L-Broth plus ampicilline (100pg/ml) et l'ensemencement est effectué avec un milieu L-Broth et la température d'incubation est d'environ 37"C sous agitation.
L'invention a encore pour objet un hôte cellulaire recombinant caractérisé en ce qu'il est transformé par une séquence nucléotidique recombinante décrite cidessus ou par un vecteur recombinant ci-dessus, dans des conditions permettant l'expression de la séquence nucléotidique recombinante et son exposition, à la surface de l'hôte ou de préférence son exportation ou sa sécrétion dans le milieu extracellulaire.
De nombreux hôtes cellulaires peuvent être modifiés par une séquence nucléotidique recombinante ou un vecteur recombinant selon l'invention.
Un procédé adapté pour la préparation d'hôtes cellulaires recombinants selon l'invention est par exemple l'électroporation, conformément à la description de Snapper S. et al (1988, PNAS USA 85: 6985-6991) ou la conjugaison selon par exemple la technique de Lazraq R. et al (1990, FEMS Microbiol.
Lett. 69: 135-138), ou selon la technique de Gormley
E.P. et Davies J. (J. Bacteriol, 173:6705-6708).
E.P. et Davies J. (J. Bacteriol, 173:6705-6708).
Avantageusement on aura recours à des mycobactéries lorsque la séquence codant pour la Plactamase est une séquence originaire de mycobactérie.
En effet dans ce cas le transfert dans une souche de mycobactéries du gène codant pour une p-lactamase de mycobactérie permet de faciliter l'expression de cette séquence, dans la mesure où les signaux de reconnaissance et d'expression, voire de sécrétion contenus dans le gène de la p-lactamase sont reconnus par les mycobactêries hôtes. De façon générale on pourra avoir recours à une souche d'Actinomycètes et en particulier une souche avirulente ou rendue avirulente, en s'assurant que les signaux de reconnaissance sont appropriés pour l'expression de la séquence recombinante ou du vecteur recombinant introduit dans la souche.
De façon particulièrement préférée pour la réalisation de l'invention, on aura recours à la souche
BCG. L'invention concerne donc une souche de BCG, transformée par une sequence nucléotidique recombinante ou un vecteur recombinant de l'invention permettant l'exposition à la surface de la cellule d'une protéine recombinante (protéine hybride), dans des conditions assurant l'exposition de 1'épitope ou des épitopes contre lesquels on cherche à induire une réponse immunitaire.
BCG. L'invention concerne donc une souche de BCG, transformée par une sequence nucléotidique recombinante ou un vecteur recombinant de l'invention permettant l'exposition à la surface de la cellule d'une protéine recombinante (protéine hybride), dans des conditions assurant l'exposition de 1'épitope ou des épitopes contre lesquels on cherche à induire une réponse immunitaire.
Une protéine hybride est dite exposee lorsqu'elle est extracellulaire mais qu'elle demeure ancrée en un point de la surface de la cellule qui la produit. De façon particulièrement intéressante on exprimera les séquences nucléotidiques de l'invention de telle façon que les produits d'expression soient sécrétés à l'extérieur de la cellule qui les produit et par conséquent liberés dans le milieu.
D'autres hôtes cellulaires selon l'invention sont des bactéries, une souche E.coli non virulente, ou d'une souche non virulente d'entérobactérie telle qu'une salmonelle avirulente, dès lors que la séquence nucléotidique recombinante ou le vecteur recombinant ci-dessus, transformant la bactérie, est placé sous le contrôle de signaux d'expression reconnus par cette bactérie.
D'autres microorganismes intéressants sont par exemple des champignons tels que les Aspergillus.
Dans le cas de l'utilisation à titre d'hôte cellulaire, de cellules procaryotes ou eucaryotes n'appartenant pas au groupe des mycobactéries, on aura recours à l'utilisation de signaux d'expression reconnaissables par la cellule hôte, afin d'obtenir l'expression voire la sécrétion de la protéine recombinante contenant la p-lactamase ou une Plactamase tronquée ainsi que la séquence peptidique hétérologue.
D'autres systèmes pour l'expression de la p- lactamase recombinante selon l'invention peuvent être par exemple constitués par des cellules animales, par exemple des cellules d'insectes ou des cellules de mammifères comme des cellules CHO. Dans ce cas les vecteurs propres à l'insertion de 1'ADN ou de 1'ADNC ou encore de 1'ARN dans ces cellules peuvent être des virus, ou des plasmides. D'autres systèmes tels que les systèmes de levures comme Saccharomyces Cerevisiae peuvent être également appropriés.
Par site exposé on entend un site qui permet l'accès ou la reconnaissance de la séquence peptidique hétérologue et en particulier l'accès à 1'épitope ou aux épitopes ou leur reconnaissance, dans le but d'obtenir une réponse immunitaire. Un site exposé est soit un site se trouvant à la surface de la protéine P-lactamase soit un site contenu dans cette protéine dont l'épitope reste reconnu par les anticorps, par exemple même quand la protéine est dénaturée.
A titre d'exemple on peut mentionner la possibilité selon laquelle la séquence peptidique hétérologue est insérée en amont d'un site normalement non exposé à la surface de la protéine p-lactamase, ce site se trouvant exposé du fait de l'insertion de la séquence hétérologue, par exemple à la suite d'un repliement résultant d'interactions entre la protéine ss-lactamase et la séquence hétérologue. En choisissant le site d'insertion dans la protéine ss-lactamase, on aura avantage à sélectionner des sites qui permettent de conserver la structure globale de la protéine et par conséquent sa stabilité.
Les connaissances acquises par les inventeurs sur la séquence du gène de la p-lactamase de M. fortuitum leur ont permis de localiser les différentes régions du type hélices a et feuillets p responsables de la conformation tridimensionnelle de cette protéine. En consequence les inventeurs ont été en mesure de déterminer à l'aide de la structure tridimensionnelle de la P-lactamase de S. aureus et de S. albus G, quels pouvaient être les domaines appropriés pour l'insertion de séquences peptidiques hétérologues, évitant l'altération de la structure de la protéine native dans des conditions qui auraient nui à son intérêt en tant que molécule porteuse.Ainsi les inventeurs ont établi la possibilité d'insérer de préférence les séquences peptidiques hétérologues dans un domaine d'une p- lactamase en dehors des régions structurées en hélices a ou en feuillet ss.
A titre préféré une séquence peptidique hétérologue est insérée dans la ss-lactamase de
M. fortuitum dans la région formant la jonction entre l'hélice a2 et l'hélice a3 de la p-lactamase.
M. fortuitum dans la région formant la jonction entre l'hélice a2 et l'hélice a3 de la p-lactamase.
D'autres sites d'insertion preférés sont constitués par les régions comprises entre le feuillet ss2 et l'hélice a2, entre l'hélice a3 et l'hélice a4 ou encore entre le feuillet ss4 et le feuillet Ps.
Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, la séquence hétérologue peut également être insérée dans la partie C-terminale de la séquence de la P-lactamase.
Pour la préparation de protéines recombinantes faisant intervenir des p-lactamases d'origine differente, on determinera avantageusement la localisation des hélices a et feuillets P leur conférant leur structure, par rapport aux donnees obtenues pour la p-lactamase de S. aureus.
De préférence l'insertion est réalisée de telle façon que la séquence peptidique hétérologue soit accessible aux molécules d'eau de l'environnement.
Les séquences hétérologues susceptibles d'être insérées dans la p-lactamase ou dans une p-lactamase tronquée sont les séquences qui ont été décrites plus haut dans la partie qui concerne les séquences nucléotidiques. I1 s'agit par exemple de séquences du rétrovirus HIV, en particulier de séquences de la glycoprotéine d'enveloppe, des protéines qaq, nef ou pol, d'un rétrovirus HIV-1 ou HIV-2. A titre d'exemple on citera le peptide V3 de l'enveloppe de HIV-1.
L'invention a aussi pour objet une composition immunogène caractérisée en ce qu'elle comprend une souche BCG recombinante décrite ci-dessus, en combinaison avec un véhicule pharmaceutiquement approprié pour son administration à l'homme ou à l'animal.
Une telle composition est susceptible de constituer un vaccin vivant. Elle peut être administrée par voie d'injection ou par toute autre voie adaptée.
Une telle composition immunogène peut être utilisée pour déclencher la réponse immunitaire, par exemple pour déclencher la réponse cellulaire et éventuellement pour déclencher la production d'anticorps protecteurs, ou encore pour contribuer à la production de ces anticorps chez un hôte auquel elle est administrée.
L'invention vise non seulement la fabrication de compositions vaccinantes administrables à l'homme mais également la préparation de compositions à des fins de vaccination en médecine vétérinaire.
La composition immunogène de l'invention peut aussi être utilisée à titre de composition de rappel pour stimuler la production d'anticorps initiée par l'administration d'une protéine ou d'un autre constituant de l'agent pathogène ou de façon plus générale de l'agent contre lequel on recherche une réponse immunitaire.
A titre préféré l'invention concerne une composition immunogène caractérisée en ce que la souche recombinante qu'elle contient à titre de principe actif est une souche M. bovis de type BCG répondant aux définitions précédemment données. Une souche BCG particulière est la souche avirulente de 1'INSTITUT
PASTEUR n" 1137P2, utilisée pour le vaccin commercialisé contre la tuberculose.
PASTEUR n" 1137P2, utilisée pour le vaccin commercialisé contre la tuberculose.
A titre de véhicule pharmaceutique approprié pour la réalisation des compositions immunogènes de l'invention, on peut citer les excipients physiologiquement acceptables habituellement utilisés, notamment les excipients neutres ou acides et par exemple le stéarate de magnésium, la polyvinyle pyrrolidone ou les alcools. Cette composition immunogène peut également comprendre des adjuvants de la réponse immunitaire tels que l'adjuvant complet ou incomplet de Freund, l'hydroxyde d'aluminium, des dérivés de muramyl dipeptide, une huile métabolisante comme le squalène.
Dans le cas de l'utilisation d'un vaccin vivant, les doses habituelles pour la vaccination avec le BCG pourront être utilises.
Une autre composition immunogène de l'invention est caractérisée en ce qu'elle comprend une protéine recombinante repondant aux définitions ci-dessus, en combinaison avec un véhicule pharmaceutique approprie pour son administration. Cette composition, comme la composition immunogène formant le vaccin vivant, peut être utilisée pour declencher la réponse immunitaire ou sous forme de composition de rappel.
D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaissent dans les exemples qui suivent et dans les figures qui sont décrites ci-dessous.
LEGENDE DES FIGURES
Figure 1
Séquence nucléotidique de la sonde BlaM1
Figure 2
Plasmide pACYC184 recombiné avec un insérat d'environ 4,7 kb du gène de la p lactamase,
Figure 3
Plasmide pIPJ39 recombiné avec le gène de la P lactamase,
Figure 4
Séquence de la région génétique portant le gène codant pour la ss-lactamase de M. fortuitum.
Figure 1
Séquence nucléotidique de la sonde BlaM1
Figure 2
Plasmide pACYC184 recombiné avec un insérat d'environ 4,7 kb du gène de la p lactamase,
Figure 3
Plasmide pIPJ39 recombiné avec le gène de la P lactamase,
Figure 4
Séquence de la région génétique portant le gène codant pour la ss-lactamase de M. fortuitum.
La séquence nucléotidique est indiquée en lettres capitales et est numérotee dans la colonne de droite.
La séquence peptidique de la p-lactamase est indiquée avec le code à trois lettres sous la séquence nucléotidique lui correspondant. La numérotation est indiquée sous la séquence.
La séquence nuléotidique de ntl à nt1061 a été déterminée à partir du plasmide pIPJ319.
Figure 5 MF : Mycobacterium fortuitum
SA : Streptomyces albus
AU : Staphylococcus aureus
La position des insertions à effectuer est indiquée par des traits pointillés.
SA : Streptomyces albus
AU : Staphylococcus aureus
La position des insertions à effectuer est indiquée par des traits pointillés.
La position des hélices a et P est indiquée sous la séquence de S. aureus.
Les prédictions de structure de M. fortuitum sont indiquées au dessus de sa séquence.
Figure 6
Position des motifs structuraux prédits pour la p- lactamase de M. fortuitum
Les différentes hélices a et feullets p sont indiqués par des rectangles. Sur cette figure sont également indiquées la séquence nucléotidique et la position de plusieurs sites de restriction.
Position des motifs structuraux prédits pour la p- lactamase de M. fortuitum
Les différentes hélices a et feullets p sont indiqués par des rectangles. Sur cette figure sont également indiquées la séquence nucléotidique et la position de plusieurs sites de restriction.
PARTIE EXERIMENTALE
Dans l'exemple qui suit on a utilisé une p- lactamase mycobactérienne, en vue de son expression dans M. bovis BCG, les signaux d'expression étant adaptés au contexte mycobactérien.
Dans l'exemple qui suit on a utilisé une p- lactamase mycobactérienne, en vue de son expression dans M. bovis BCG, les signaux d'expression étant adaptés au contexte mycobactérien.
Une p-lactamase de M. fortuitum a été précédemment purifiée par Amicosante et al et Fattorili et al à partir d'une souche mutante produisant cette enzyme en quantité importante. La séquence N-terminale de la P- lactamase a été déterminée par Amicosante et al APIDDQLAELERRDNVLIGLYANLQSGRRITHRPDEMFAMXSTFKGYV
X correspond à une indétermination.
X correspond à une indétermination.
Afin d'isoler le gène codant pour cette protéine, une sonde ADN, BlaMl correspondant au fragment de gène codant pour cette partie N-terminale de la protéine a été synthétisee par PCR. Pour cela, deux mélanges d'oligonucléotides ont été synthétisés en utilisant la dégénérescence du code génetique, et l'utilisation préférentielle des codons chez les mycobactéries (J.
Dale et A. Pakti, Molecular Biology of the
Mycobacteria, Surrey University Press, Guilford, UK, 1990, p. 173-198). La séquence en acides aminés APIDDQ est donc vraisemblablement codée par une famille de séquences d'ADN dont la formule est indiquée par le consensus suivant
5' GC(CouG) CC(GouC) ATC GA(CouT) GA(CouT) CAG 3'
Les nucléotides sont indiqués en lettres capitales ; chaque oligonucléotide appartenant à la famille est détermine en choisissant l'un des nucléotides indiques entre parenthèses. Le mélange de ces oligonucléotides, appelé Moligol a été synthétise chimiquement en incorporant l'un ou l'autre des nucléotides indiqués entre parenthèses. Nous avons utilisé le synthétiseur d'oligonucléotides Cyclone (Biosearch USA).
Mycobacteria, Surrey University Press, Guilford, UK, 1990, p. 173-198). La séquence en acides aminés APIDDQ est donc vraisemblablement codée par une famille de séquences d'ADN dont la formule est indiquée par le consensus suivant
5' GC(CouG) CC(GouC) ATC GA(CouT) GA(CouT) CAG 3'
Les nucléotides sont indiqués en lettres capitales ; chaque oligonucléotide appartenant à la famille est détermine en choisissant l'un des nucléotides indiques entre parenthèses. Le mélange de ces oligonucléotides, appelé Moligol a été synthétise chimiquement en incorporant l'un ou l'autre des nucléotides indiqués entre parenthèses. Nous avons utilisé le synthétiseur d'oligonucléotides Cyclone (Biosearch USA).
Le deuxième mélange d'oligonucléotides, appelé
Moligo2 est constitué d'oligonucléotides correspondant aux brins complémentaires des séquences d'ADN codant pour la partie C-terminale du fragment N-terminal indiqué ci-dessus, c'est à dire : STFKGYV.
Moligo2 est constitué d'oligonucléotides correspondant aux brins complémentaires des séquences d'ADN codant pour la partie C-terminale du fragment N-terminal indiqué ci-dessus, c'est à dire : STFKGYV.
Avec la même nomenclature que ci-dessus, les oligonucléotides constituant le mélange Moligo2 répondent au consensus 5'AG(CouG) TG(CouG) AAG TTC CC(GouA) AT(AouG)
CA(GouC)3'
L'un des mélanges contient des oligonucléotides de séquence identique ou très similaire à la partie 5' de BlaM1, le deuxième mélange contient des oligonucléotides complémentaires de la partie 3' de
BlaMl. Ces deux mélanges sont utilisés pour synthétiser par PCR la sonde BlaM1 à partir de 1'ADN que nous avons extrait de M. fortuitum FC1 (C. Martin et al, Nature
Vol. 345:739-743, 1990). La sonde BlaM1 a été séquence (figure 1).A partir de cette sequence 1 'oligonucléotide, BlaOl :5 'CTTGAAGGTCGAGCACATCGCGAACAT3' a été synthétisé et marque radioactivement afin de l'utiliser comme sonde pour repérer dans une banque de gène de M. fortuitum D316 (Amicosante et al) un clone possedant un fragment portant le gène codant pour la
P-lactamase. Cette banque a été construite en coupant 1'ADN chromosomique de M. fortuitum D316 par l'enzyme de restriction SphI et en clonant les fragments au hasard dans le vecteur pACYC184. Les fragments SPhI ont été insérés au site SphI de pACYC184 et la souche HB101 de E.coli a été transformée par ce mélange de ligation en présence de chlorure de calcium. Les souches transformantes ont été sélectionnées sur boîte de milieu LB contenant 30 g/ml de chloramphénicol.Les souches resistantes obtenues ont été repiquées sur le milieu LB solide contenant 25yg/ml de tétracycline et seules celles sensibles à cet antibiotique ont été retenues. Un clone transformant contenant un fragment hybridant avec BlaO1 a été isolé. Ce clone contient un plasmide pACYC184 recombinant avec un insert d'environ 4,7 kb hybridant avec BlaO1. La carte de restriction de ce plasmide a été effectuée (figure 2) et la région hybridant avec BlaO1 a été séquencée. La séquence nucléotidique est indiquée à la figure 4. L'analyse de cette séquence montre une phase de lecture possédant des similarités avec d'autres B-lactamases de classe A.
CA(GouC)3'
L'un des mélanges contient des oligonucléotides de séquence identique ou très similaire à la partie 5' de BlaM1, le deuxième mélange contient des oligonucléotides complémentaires de la partie 3' de
BlaMl. Ces deux mélanges sont utilisés pour synthétiser par PCR la sonde BlaM1 à partir de 1'ADN que nous avons extrait de M. fortuitum FC1 (C. Martin et al, Nature
Vol. 345:739-743, 1990). La sonde BlaM1 a été séquence (figure 1).A partir de cette sequence 1 'oligonucléotide, BlaOl :5 'CTTGAAGGTCGAGCACATCGCGAACAT3' a été synthétisé et marque radioactivement afin de l'utiliser comme sonde pour repérer dans une banque de gène de M. fortuitum D316 (Amicosante et al) un clone possedant un fragment portant le gène codant pour la
P-lactamase. Cette banque a été construite en coupant 1'ADN chromosomique de M. fortuitum D316 par l'enzyme de restriction SphI et en clonant les fragments au hasard dans le vecteur pACYC184. Les fragments SPhI ont été insérés au site SphI de pACYC184 et la souche HB101 de E.coli a été transformée par ce mélange de ligation en présence de chlorure de calcium. Les souches transformantes ont été sélectionnées sur boîte de milieu LB contenant 30 g/ml de chloramphénicol.Les souches resistantes obtenues ont été repiquées sur le milieu LB solide contenant 25yg/ml de tétracycline et seules celles sensibles à cet antibiotique ont été retenues. Un clone transformant contenant un fragment hybridant avec BlaO1 a été isolé. Ce clone contient un plasmide pACYC184 recombinant avec un insert d'environ 4,7 kb hybridant avec BlaO1. La carte de restriction de ce plasmide a été effectuée (figure 2) et la région hybridant avec BlaO1 a été séquencée. La séquence nucléotidique est indiquée à la figure 4. L'analyse de cette séquence montre une phase de lecture possédant des similarités avec d'autres B-lactamases de classe A.
Nous en avons donc conclu qu'il devait s'agir du gène de structure de la p-lactamase de M. fortuitum. Le fragment SphI séquencé ne contient qu'une partie du gène. Un fragment de restriction BqlII-SphI (représenté en trait épais sur la figure 2) interne au gène, appelé
BlaO2 a été utilisé comme sonde ; l'ensemble du gène a été cloné à partir d'une banque de M. fortuitum FC1.
BlaO2 a été utilisé comme sonde ; l'ensemble du gène a été cloné à partir d'une banque de M. fortuitum FC1.
Cette banque a été construite en clonant des fragments chromosomiques BamHI de 4 à 10 kb isolés par électrophorèse sur gel d'agarose et clonés dans le site
BamHI du plasmide pUC18 linéarisé par coupure à ce site et déphosphorylé. Les clones transformants ont été sélectionnés sur bote de milieu LB contenant 100Ag/ml d'ampicilline. Un clone transformant hybridant avec la sonde Bla02 a été isolé. I1 contient un plasmide recombinant portant un insert d'environ 6 kb hybridant avec la sonde BlaO2. La carte de restriction de cet insert a été effectuée (figure 3) et la région hybridant avec la sonde a été séquencée. Elle contient l'extrémité C-terminale du gène (figure 4).Les deux fragments de gènes obtenus à partir des banques SphI et
BamHI ont une partie commune qui permet de reconstituer l'ensemble du gène ; il est représenté à la figure 4 avec la séquence en acides amines de la proteine déduite de la sequence nucléotidique. La séquence en acides aminés possède des similarités avec les séquences des autres ss-lactamases de classe A connues.
BamHI du plasmide pUC18 linéarisé par coupure à ce site et déphosphorylé. Les clones transformants ont été sélectionnés sur bote de milieu LB contenant 100Ag/ml d'ampicilline. Un clone transformant hybridant avec la sonde Bla02 a été isolé. I1 contient un plasmide recombinant portant un insert d'environ 6 kb hybridant avec la sonde BlaO2. La carte de restriction de cet insert a été effectuée (figure 3) et la région hybridant avec la sonde a été séquencée. Elle contient l'extrémité C-terminale du gène (figure 4).Les deux fragments de gènes obtenus à partir des banques SphI et
BamHI ont une partie commune qui permet de reconstituer l'ensemble du gène ; il est représenté à la figure 4 avec la séquence en acides amines de la proteine déduite de la sequence nucléotidique. La séquence en acides aminés possède des similarités avec les séquences des autres ss-lactamases de classe A connues.
Un alignement des séquences des p-lactamases de
M. fortuitum, de S. albus, de S. aureus est proposé à la figure 5. La position des différentes motifs structuraux, hélices a et feuillet p déterminés pour la ss-lactamase de S. aureus est indiquée sur la structure primaire de cette enzyme sur la même figure. D'après les similarités entre la structure primaire de la Plactamase de M. fortuitum que nous venons de déduire du gène dont nous venons de déterminer la structure, et celle de S. aureus, la position des motifs structuraux est proposée à la figure 5. Sur la figure 6, les motifs structuraux de la p-lactamase de M. fortuitum ainsi que la séquence nucléotidique du gène sont aussi représentes.Une région formant la jonction entre l'hélice a2 et l'hélice a3 devrait correspondre à une région étendue à l'intérieur de laquelle des épitopes pourront être introduits sans modifier la structure générale de la protéine. Le fragment du gène codant pour cette région, nt648 à nt719 contient un site BglII unique qui sera utilisé pour l'insertion de fragments d'ADN etrangers codant pour divers épitopes. Trois autres regions paraissent intéressantes pour l'insertion d'épitopes : la région nt585 à nt613, permettant une insertion entre le feuillet ss2 et l'hélice a2, la région nt744 à nt748, permettant une insertion entre les hélices a3 et a4, et nt1152 à nt1167 qui permettront l'insertion d'épitopes entre les feuillets ss4 et Ps.
M. fortuitum, de S. albus, de S. aureus est proposé à la figure 5. La position des différentes motifs structuraux, hélices a et feuillet p déterminés pour la ss-lactamase de S. aureus est indiquée sur la structure primaire de cette enzyme sur la même figure. D'après les similarités entre la structure primaire de la Plactamase de M. fortuitum que nous venons de déduire du gène dont nous venons de déterminer la structure, et celle de S. aureus, la position des motifs structuraux est proposée à la figure 5. Sur la figure 6, les motifs structuraux de la p-lactamase de M. fortuitum ainsi que la séquence nucléotidique du gène sont aussi représentes.Une région formant la jonction entre l'hélice a2 et l'hélice a3 devrait correspondre à une région étendue à l'intérieur de laquelle des épitopes pourront être introduits sans modifier la structure générale de la protéine. Le fragment du gène codant pour cette région, nt648 à nt719 contient un site BglII unique qui sera utilisé pour l'insertion de fragments d'ADN etrangers codant pour divers épitopes. Trois autres regions paraissent intéressantes pour l'insertion d'épitopes : la région nt585 à nt613, permettant une insertion entre le feuillet ss2 et l'hélice a2, la région nt744 à nt748, permettant une insertion entre les hélices a3 et a4, et nt1152 à nt1167 qui permettront l'insertion d'épitopes entre les feuillets ss4 et Ps.
L'insertion d'épitopes en position C-terminale de la protéine, c'est à dire proche du nucléotide 1043 pourrait être aussi intéressante.
Pour analyser l'expression du gène BlaM, celui-ci a été fusioné avec la p-galactosidase, une enzyme facile à doser et dont l'expression chez les bactéries est facilement repérable sur boîte de Pétri. Pour ce faire, un fragment BqlII-PstI de 1598 pb, contenant une partie du gène blaM et de la région en amont, a été isolé et inséré entre les sites BamHI et PstI du plasmide pNM482. La fusion blaM-lacZ résultante a ensuite été transférée à un vecteur navette E.colimycobactérie et cette construction a été utilisée pour transformer par électroporation E.coli et M. smegmatis.
L'expression du gène lacZ a été observée uniquement chez M. smeqmatis. Ces résultast montrent que la région clonie situee en amont du gène blaM est suffisante pour induire l'expression du gène et qu'elle doit par consequent contenir la plupart des signaux d'initiation de la transcription et de la traduction.
Ces signaux sont spécifiques des mycobactéries. Ils pourront donc de ce fait avantageusement être utilisés pour l'expression de tout gène clone sous leur contrôle, sous forme de fusion d'opéron ou de fusion de protéine.
Le fait que la fusion blaM-lacZ est fonctionnelle montre que la système blaM pourra être utilise pour l'expression de divers gènes ou fragments de gènes hétérologues chez les mycobactéries. Suivant les fusions de gènes réalisées, les protéines fusion resultantes pourront avoir une localisation cytoplasmique, être exportees à l'extérieur de la bacterie dans le milieu de culture, ou rester ancrées à la membrane externe.
Claims (33)
1. Séquence nucléotidique, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi l'un des enchaînements nucléotidiques suivants - la séquence du gène codant pour une p-lactamase,
comprenant l'enchaînement représenté à la figure
4, - toute partie de l'enchaînement nucléotidique
représenté à la figure 4, participant à la
structure de la P-lactamase, ou nécessaire à son
expression dans un hôte cellulaire approprié, en
particulier la séquence comprise entre les
nucléotides 1 et 394 de l'enchaînement de la
figure 4 contenant les signaux d'expression du
gène, - la séquence codante contenue dans l'enchaînement
représenté à la figure 4, et comprenant les
nucléotides 395 à 1274, - toute séquence hybridant dans des conditions
stringentes avec l'enchaînement de la figure 4 et
notamment avec l'enchaînement compris entre les
nucléotides 1 et 394, ou avec l'enchaînement
compris entre les nucléotides 395 et 1274 de cette
séquence.
2. Séquence nucléotidique, caractérisée en ce qu'elle code pour une protéine de type p-lactamase comprenant l'enchaînement d'acides aminés représenté à la figure 4.
3. Séquence nucléotidique recombinante, caractérisée en ce qu'elle comprend - une séquence nucléotidique selon l'une quelconque
des revendications 1 à 2 codant pour la p-
lactamase, modifiée par au moins un enchaînement
nucléotidique hétérologue codant pour une séquence
peptidique hétérologue comprenant au moins un
épitope, la modification étant réalisée en au
moins un site permettant, lorsque la séquence
recombinante est exprimée, l'exposition de
1'épitope à la surface de la p-lactamase, ou son
accessibilité au solvant, - une séquence nucléotidique selon l'une quelconque
des revendications 1 ou 2, codant pour une p
lactamase tronquée, modifiée par au moins un
enchaînement nucléotidique hétérologue codant pour
une séquence peptidique hétérologue comprenant au
moins un épitope, la modification étant réalisée
en au moins un site permettant, lorsque la
séquence recombinante est exprimée, l'exposition
de l'épitope à la surface de la ss-lactamase ou son
accessibilité au solvant, et la protéine hybride
exprimée conservant les caractéristiques
structurales essentielles de la P-lactamase
native, en particulier celles qui lui confèrent sa
stabilité, notamment sa reconnaissance par des
anticorps.
4. Séquence nucléotidique recombinante selon la revenducation 3, caractérisée en ce que l'enchaînement nucléotidique hetérologue qu'elle contient code pour une séquence peptidique impliquée dans la virulence d'un agent pathogène, ou pour un antigène à potentiel protecteur.
5. Séquence nucléotidique recombinante selon l'une quelconque des revendications 3 ou 4, caractérisée en ce que l'enchaînement nucléotidique hétérologue qu'elle contient code pour une séquence peptidique d'un antigène d'un rétrovirus humain de type HIV, notamment un antigène d'enveloppe, de qaq, nef, ou pol, d'un rétrovirus HIV-1 ou HIV-2.
6. Séquence nucléotidique recombinante selon l'une quelconque des revendications 3 à 5, caractérisée en ce que l'enchaînement nucléotidique hétérologue qu'elle contient code pour la séquence peptidique V3 de l'antigène d'enveloppe de HIV-1.
7. Vecteur recombinant de clonage et/ou d'expression, caractérisé en ce qu'il est modifié par l'un de ses sites non essentiels pour sa réplication ou son intégration, par une séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 6.
8. Vecteur recombinant selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un plasmide, d'un phage ou d'un transposon.
9. Vecteur recombinant selon l'une quelconque des revendications 7 ou 8, caractérisé en ce qu'il s'agit du plasmide pACYC184 BlaM contenant le fragment SphI de l'enchaînement représenté à la figure 4, contenu dans une souche de E.coli déposée à la C.N.C.M. le 11
Février 1992 sous le numéro I-1171.
10. Vecteur recombinant selon l'une quelconque des revendications 7 ou 8, caractérisé en ce qu'il s'agit du plasmide pIPJ39, contenant le gène de la P-lactamase de M. fortuitum, ce plasmide étant contenu dans une souche de E.coli déposée à la C.N.C.M. le 11 Février 1992 sous le numéro I-1170.
11. Hôte cellulaire recombinant, caractérise en ce qu'il est transformé par une séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 ou par un vecteur recombinant selon l'une quelconque des revendications 7 à 10, dans des conditions permettant l'expression de la séquence nucléotidique recombinante et son exposition, à la surface de l'hôte ou de préférence son exportation ou sa secrétion dans le milieu.
12. Hôte cellulaire selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il s'agit d'une souche d'Actinomycète, de préférence d'une souche de mycobactérie, avirulente ou rendue avirulente.
13. Hôte cellulaire recombinant selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il s'agit de M. bovis BCG.
14. Hôte cellulaire recombinant selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il s'agit d'une bactérie, par exemple d'une souche E.coli non virulente, ou d'une souche non virulente d'entérobactérie telle qu'une salmonelle avirulente, dès lors que la séquence nucléotidique recombinante ou le vecteur recombinant selon l'une quelconque des revendications 3 à 10, qu'elle contient, est placé sous le contrôle de signaux d'expression reconnus par cette bactérie.
15. Hôte cellulaire recombinant selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un champignon, par exemple du genre Aspergillus dès lors que la séquence nucléotidique recombinante ou le vecteur recombinant selon l'une quelconque des revendications 3 à 10, qu'elle contient, est placé sous le contrôle de signaux d'expression reconnus par ce champignon.
16. Protéine recombinante, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une P-lactamase modifiée en un site exposé, par au moins une séquence peptidique hétérologue comportant au moins un épitope antigénique dans des conditions telles que la protéine recombinante est capable d'induire une réponse immunitaire contre le (les) polypeptide(s) hétérologue(s) chez l'animal ou chez l'homme.
17. Protéine recombinante selon la revendication 16, caractérisée en ce que la structure de la ss-lactamase est essentiellement conservée, de telle sorte que la protéine recombinante est stable, et en particulier qu'elle est insensible aux protéases cellulaires.
18. Protéine selon l'une quelconque des revendications 16 ou 17, caractérisée en ce que la ss-lactamase est une p-lactamase de classe A.
19. Protéine recombinante selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée en ce que la P- lactamase est celle de M. fortuitum.
20. Protéine recombinante selon l'une quelconque des revendications 16 à 19, caractérisée en ce que la p- lactamase est sous forme active.
21. Protéine P-lactamase recombinante selon l'une quelconque des revendications 16 à 20, caractérisée en ce que la séquence peptidique hétérologue qu'elle contient, est accessible au solvant.
22. Protéine P-lactamase recombinante selon l'une quelconque des revendications 16 à 20, caractérisée en ce qu'elle contient au moins une séquence peptidique hétérologue comportant au moins un épitope, inséré au niveau d'un site présent dans une région de la P- lactamase en dehors des régions structurées en hélices a ou en feuillets ss.
23. Protéine P-lactamase recombinante selon l'une quelconque des revendications 16 à 22, caractérisée en ce qu'elle contient au moins une séquence peptidique hétérologue comportant au moins un épitope inséré dans la région formant la jonction entre l'hélice a2 et l'hélice a3 de la p-lactamase.
24. Protéine ss-lactamase recombinante selon l'une quelconque des revendications 16 à 22, caractérisée en ce qu'elle contient au moins une séquence peptidique hétérologue comportant au moins un épitope inséré dans la région formant la jonction entre l'hélice a3 et l'hélice a4 de la p-lactamase.
25. Protéine ss-lactamase recombinante selon l'une quelconque des revendications 16 à 22, caractérisée en ce qu'elle contient au moins une séquence peptidique hétérologue comportant au moins un épitope inséré dans la région formant la jonction entre le feuillet ss4 et le feuillet P5 de la p-lactamase.
26. Protéine p-lactamase recombinante selon l'une quelconque des revendications 16 à 22, caractérisée en ce qu'elle contient au moins une séquence peptidique hétérologue comportant au moins un épitope inséré dans la région exposée de la séquence C-terminale de la p- lactamase.
27. Protéine ss-lactamase recombinante selon l'une quelconque des revendications 16 à 26, caractérisée en ce qu'elle contient à titre de séquence peptidique hétérologue, une séquence peptidique du rétrovirus HIV, en particulier une séquence de la glycoprotéine d'enveloppe, ou des protéines qaq, nef, pol, d'un rétrovirus HIV-1 ou HIV-2.
28. Protéine p-lactamase recombinante selon l'une quelconque des revendications 16 à 26, caractérisée en ce qu'elle contient à titre de séquence peptidique hétérologue, le peptide V3 de l'enveloppe de HIV-1.
29. Composition immunogène, caractérisée en ce qu'elle comprend un hôte cellulaire recombinant, avirulent selon l'une quelconque des revendications 11 à 15 et un véhicule pharmaceutique approprié pour l'administration.
30. Composition immunogène selon la revendication 29, caractérisée en ce qu'elle comprend une souche recombinante M. bovis BCG, en combinaison avec un véhicule pharmaceutiquement approprié pour l'administration.
31. Composition immunogène, caractérisée en ce qu'elle comprend une protéine recombinante selon l'une quelconque des revendications 16 à 28, en combinaison avec un véhicule pharmaceutique approprié pour l'administration.
32. Séquence nucléotidique recombinante selon l'une quelconque des revendications 3 à 6, caractérisée en ce que la séquence nucléotidique hétérologue est insérée dans une région comprise entre les hélices a et les feuillet P de la séquence de la P-lactamase représentée à la figure 6.
33. Séquence nucléotidique recombinante selon la revendication 32, caractérisée en ce que le site d'insertion est contenu dans une région de la séquence de la figure 6 choisie parmi - la région entre le feuillet ss2 et l'hélice a2
correspondant aux nucléotides 585 à 613, - la région entre les hélices a2 et a3,
correspondant aux nucléotides 648 à 719, en
particulier le site BqlII, - la région entre les hélices a3 et a correspondant
aux nucléotides 744 à 748, - la région entre les feuillets ss4 et PS
correspondant aux nucléotides 1152 à 1167.
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9201713A FR2687410A1 (fr) | 1992-02-14 | 1992-02-14 | Beta-lactamase recombinante, utilisable en tant que molecule porteuse pour la preparation de compositions immunogenes. |
| US08/284,465 US5830457A (en) | 1992-02-14 | 1993-02-12 | Recombinant beta-lactamase, usable as carrier molecule in immunogenic compositions |
| EP93905393A EP0626013A1 (fr) | 1992-02-14 | 1993-02-12 | $g(b)-LACTAMASE RECOMBINANTE, UTILISABLE EN TANT QUE MOLECULE PORTEUSE POUR LA PREPARATION DE COMPOSITIONS IMMUNOGENES |
| PCT/FR1993/000151 WO1993017113A1 (fr) | 1992-02-14 | 1993-02-12 | β-LACTAMASE RECOMBINANTE, UTILISABLE EN TANT QUE MOLECULE PORTEUSE POUR LA PREPARATION DE COMPOSITIONS IMMUNOGENES |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9201713A FR2687410A1 (fr) | 1992-02-14 | 1992-02-14 | Beta-lactamase recombinante, utilisable en tant que molecule porteuse pour la preparation de compositions immunogenes. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2687410A1 true FR2687410A1 (fr) | 1993-08-20 |
| FR2687410B1 FR2687410B1 (fr) | 1994-12-16 |
Family
ID=9426670
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR9201713A Granted FR2687410A1 (fr) | 1992-02-14 | 1992-02-14 | Beta-lactamase recombinante, utilisable en tant que molecule porteuse pour la preparation de compositions immunogenes. |
Country Status (4)
| Country | Link |
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| US (1) | US5830457A (fr) |
| EP (1) | EP0626013A1 (fr) |
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