FR2682113A1 - Peptides derived from the protein A of the ribonucleoprotein snRNP-U1 and their use for the diagnosis of mixed connective tissue disease - Google Patents
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Abstract
Description
Peptides issus de la protéine A de la ribonucléoprotéine snRNP-U1 et leur utilisation pour le diagnostic de la connectivite mixte. Peptides derived from the snRNP-U1 ribonucleoprotein protein A and their use for the diagnosis of mixed connective tissue disease.
L'invention concerne des peptides ayant la propriété d'être reconnus spécifiquement par les anticorps présents chez des patients atteints de connectivite mixte. The invention relates to peptides having the property of being specifically recognized by the antibodies present in patients with mixed connective tissue disease.
L'invention concerne également les applications de ces peptides et des compositions les contenant pour le diagnostic in vitro chez l'homme de la connectivite mixte, ainsi que leur utilisation pour la constitution de trousses de diagnostic de cette maladie. The invention also relates to the applications of these peptides and compositions containing them for the in vitro diagnosis in humans of mixed connective tissue disease, as well as their use for the constitution of diagnostic kits for this disease.
L'invention concerne en outre les anticorps formés contre ces peptides et l'application de ces anticorps et des compositions les contenant pour le diagnostic in vitro chez l'homme de la connectivite mixte, ainsi qu'à la production de médicaments contre cette maladie. The invention further relates to the antibodies raised against these peptides and the application of these antibodies and compositions containing them for the in vitro diagnosis in humans of mixed connective tissue disease, as well as to the production of drugs against this disease.
L'invention a enfin pour objet les applications de ces peptides à la production de compositions immunogènes et de compositions vaccinantes contre cette maladie. The invention finally relates to the applications of these peptides to the production of immunogenic compositions and vaccinating compositions against this disease.
Les patients atteints de connectivite mixte produisent des anticorps réagissant avec une variété de composants cellulaires tels que l'ADN, l'ARN, des protéines et des complexes ARN-protéines (Smeenk et al., 1985; Morrow et Isenberg, 1987; Tan, 1989). Certains de ces anticorps constituent des marqueurs spécifiques d'un syndrome clinique; par exemple, les anticorps anti-ADN et les anticorps dirigés contre l'antigène Sm sont des marqueurs du lupus érythémateux disséminé, les anticorps anti-centromère sont des marqueurs du syndrome de CREST et les anticorps anti-topoisomérase I constituent des marqueurs de la sclérodermie. Patients with mixed connective tissue disease produce antibodies that react with a variety of cellular components such as DNA, RNA, proteins and RNA-protein complexes (Smeenk et al., 1985, Morrow and Isenberg, 1987; 1989). Some of these antibodies are markers specific to a clinical syndrome; for example, anti-DNA antibodies and antibodies to Sm antigen are markers of systemic lupus erythematosus, anti-centromere antibodies are markers of CREST syndrome and anti-topoisomerase I antibodies are markers of scleroderma .
Parmi les nombreux types d'autoanticorps identifiés dans les maladies précédentes, ceux réagissant avec l'antigène Sm sont présents chez 20 à 30 des sujets atteints de lupus érythémateux disséminé et très rarement chez les sujets atteints d'autres maladies autoimmunes systémiques des tissus connectifs. Among the many types of autoantibodies identified in the preceding diseases, those reactive with Sm antigen are present in 20 to 30 subjects with systemic lupus erythematosus and very rarely in subjects with other systemic autoimmune diseases of connective tissue.
L'antigène Sm est associé à une classe particulière de ribonucléoprotéines dénommées snRNP; ces ribonucléoprotéines contiennent cinq espèces d'ARN riches en uridine, dénommés U1, U2, U4, U5 et U6 (Lerner et Steitz, 1979; Brunel et al., 1985). Il a été identifié dans chaque ribonucléoprotéine snRNP sept protéines, dénommés en fonction de leur mobilité électrophorétique sur gels de polyacrylamide, bande B4 (29 kd), bande B (28 Kd), bande D (16 Kd), bande D'(15,5
Kd), bande E (12 Kd), bande F (11 Kd) et bande G (9 Kd).The Sm antigen is associated with a particular class of ribonucleoproteins called snRNP; these ribonucleoproteins contain five species of uridine-rich RNA called U1, U2, U4, U5 and U6 (Lerner and Steitz 1979, Brunel et al. Seven proteins, named for their electrophoretic mobility on polyacrylamide gels, band B4 (29 kd), band B (28 Kd), band D (16 Kd), band D '(15, were identified in each ribonucleoprotein snRNP. 5
Kd), E band (12 Kd), F band (11 Kd) and G band (9 Kd).
Outre ces protéines qui constituent le noyau commun, les ribonucléoprotéines snRNP comprennent d'autres protéines; la ribonucléoprotéine snRNP-U1 comprend trois protéines de 70 Kd, 34 Kd et 22 Kd, la protéine de 34
Kd est identifié dans la littérature par la lettre A et dénommée protéine ou polypeptide A ou U1A. La demande de brevet européen 0 313 156 au nom de la Société AKZO N.V.In addition to these proteins that make up the common core, snRNP ribonucleoproteins include other proteins; ribonucleoprotein snRNP-U1 comprises three proteins of 70 Kd, 34 Kd and 22 Kd, the protein of 34
Kd is identified in the literature by the letter A and called protein or polypeptide A or U1A. European Patent Application 0 313 156 in the name of AKZO NV
décrit la séquence en acides aminés de la protéine A représentée à la figure 1.describes the amino acid sequence of protein A shown in FIG.
Parmi les anticorps réagissant avec les ribonucléoprotéines snRNP et susceptibles d'être détectés en mmunoblot, on peut distinguer les anticorps anti-snRNP-U1 réagissant avec au moins une des trois protéines de snRNP-Uî, les anticorps anti-Sm réagissant avec les protéines B',B et D qui sont communes aux snRNPs U1, U2, U4, U5 et U6, et les anticorps anti (snRNP U1, U2) réagissant avec les protéines A'ou B" de la ribonucléoprotéine snRNP-U2. Among the antibodies reactive with snRNP ribonucleoproteins which can be detected in mmunoblot, it is possible to distinguish the anti-snRNP-U1 antibodies reacting with at least one of the three proteins of snRNP-U1, the anti-Sm antibodies reacting with the B proteins. ', B and D which are common to snRPs U1, U2, U4, U5 and U6, and the anti-antibodies (snRNP U1, U2) reactive with the proteins A'or B "of the ribonucleoprotein snRNP-U2.
Le clonage des antigènes snRNP a permis de mettre en évidence des homologies de séquences entre ces protéines. La protéine B" de snRNP-U2 présente des similarités avec la protéine A de snRNP-U1, ces protéines seront dénommées dans ce qui suit U2B" et UlA; notamment la partie aminoterminale de U1A comprise entre les résidus d'amino-acide 7 et 101 présente environ 77 % d'homologie avec le segment de de la protéine U2B" compris entre les résidus d'amino-acide 4 et 98, et la partie carboxy-terminale de U1A comprise entre les résidus d'acides aminés 206 et 283 présente environ 86 % de similarité avec le segment 147-225 de U2B". Cloning of the snRNP antigens made it possible to demonstrate sequence homologies between these proteins. SnRNP-U2 protein B "has similarities to snRNP-U1 protein A, these proteins will be referred to in the following as U2B- and UlA; in particular, the aminoterminal part of U1A between the amino acid residues 7 and 101 has about 77% homology with the segment of the protein U2B "between the amino acid residues 4 and 98, and the part The carboxy-terminal U1A between amino acid residues 206 and 283 has about 86% similarity to the 147-225 segment of U2B-.
L'existence de séquences communes entre les deux protéines explique les réactions croisées observées entre les anticorps anti-U2B" et anti-UlA.The existence of common sequences between the two proteins explains the cross-reactions observed between the anti-U2B- and anti-UlA antibodies.
Les travaux de recherche ayant conduit aux peptides de l'invention ont précisément visé à déterminer dans la séquence en acides aminés de la protéine UlA des segments ne présentant peu ou pas d'homologie avec les séquences des autres antigènes associés aux maladies autoimmunes. The research that led to the peptides of the invention specifically aimed to determine in the amino acid sequence of the protein UlA segments with little or no homology with the sequences of other antigens associated with autoimmune diseases.
Les développements des travaux des inventeurs ont permis d'isoler de la séquence de U1A treize segments, dont trois non décrits à ce jour sont reconnus par les sérums de patients atteints de maladies autoimmunes; parmi ceux-ci les inventeurs ont mis en évidence une séquence d'amino-acides spécifiquement reconnue par les autoanticorps présents chez les patients atteints de connectivite mixte. The developments of the work of the inventors made it possible to isolate thirteen segments from the U1A sequence, of which three not yet described are recognized by the sera of patients suffering from autoimmune diseases; among these, the inventors have demonstrated an amino acid sequence specifically recognized by the autoantibodies present in patients with mixed connective tissue disease.
La présente invention a en conséquence pour objet un peptide comprenant au moins une partie de la séquence en acides aminés de la protéine A de snRNP-Ul, caractérisé en ce qu'il est constitué par ou comprend tout ou partie de la séquence de formule suivante
SQFGQILDILVSRSLKMRGQAFVI (I)
La signification des symboles représentant les acides aminés est rappelée en annexe. The subject of the present invention is therefore a peptide comprising at least a part of the amino acid sequence of the protein A of snRNP-1 L, characterized in that it consists of or comprises all or part of the following sequence of formula
SQFGQILDILVSRSLKMRGQAFVI (I)
The meaning of the symbols representing the amino acids is recalled in the appendix.
Dans la formule (I), l'aminoacide serine Nterminal et l'amino-acide isoleucine C-terminal correspondent respectivement aux résidus 35 et 58 de la séquence de U1A représentée à la figure 1. In formula (I), the N-terminal amino-serine amino acid and the C-terminal isoleucine amino-acid correspond respectively to residues 35 and 58 of the U1A sequence shown in FIG.
Un peptide préféré comprenant une partie de la séquence de formule (I) est constitué par ou comprend la séquence de formule suivante
G Q I L D I LV S R S L K (II)
Des peptides préférés comprenant toute la séquence de formule (I) sont constitués par ou comprennent la séquence de formule (I) prolongée à son extrémité N-terminale par un groupe peptidique de 1 à 10 acides aminés correspondant aux résidus 25 à 34 de U1A représenté à la figure 1, et/ou prolongée à son extrémité C-terminale par un groupe peptidique de 1 à 10 acides aminés correspondant aux résidus 59 à 68 de U1A représenté à la figure 1.A preferred peptide comprising a part of the sequence of formula (I) is constituted by or comprises the following sequence of formula
GQILDI LV SRSLK (II)
Preferred peptides comprising the entire sequence of formula (I) are constituted by or comprise the sequence of formula (I) extended at its N-terminus by a peptide group of 1 to 10 amino acids corresponding to residues 25 to 34 of U1A represented by in FIG. 1, and / or extended at its C-terminal end by a peptide group of 1 to 10 amino acids corresponding to residues 59 to 68 of U1A shown in FIG.
L'invention a également pour objet les peptides constitués par ou comprenant un fragment et/ou un dérivé et/ou une variante des séquences de formules (I) et (II), dès lors qu'ils sont reconnus spécifiquement par les autoanticorps présents chez les patients atteints de connectivite mixte. The subject of the invention is also the peptides constituted by or comprising a fragment and / or a derivative and / or a variant of the sequences of formulas (I) and (II), provided that they are specifically recognized by the autoantibodies present in patients with mixed connective tissue disease.
On entend par variantes, les séquences précédentes modifiées par insertion et/ou délétion et/ou substitution d'un ou plusieurs amino-acides, pour autant que les propriétés antigéniques desdites séquences ne s'en trouvent pas modifiées; on entend aussi par variantes les séquences dans lesquelles la liaison peptidique (-CO-NH-) est remplacé par les structures
CO-N(CH3)-, -CH2-CH2-, -CO-CH2-, ou encore les séquences dans lesquelles le squelette peptidique présente un ou plusieurs groupes intercalés tels que les groupes -CH2-, -NH-, -O-. L'invention envisage également les peptides dans lesquels les acides aminés présentant un carbone asymétrique sont sous forme D ou L. "Variations" means the preceding sequences modified by insertion and / or deletion and / or substitution of one or more amino acids, provided that the antigenic properties of said sequences are not modified; variants are also understood to mean sequences in which the peptide bond (-CO-NH-) is replaced by the structures
CO-N (CH3) -, -CH2-CH2-, -CO-CH2-, or else the sequences in which the peptide backbone has one or more intercalated groups such as the -CH2-, -NH-, -O- groups. . The invention also contemplates peptides in which the amino acids having asymmetric carbon are in D or L form.
L'invention concerne également les conjugués obtenus par couplage des peptides de l'invention avec des molécules porteuses éventuellement physiologiquement acceptables et non toxiques; à titre de molécules porteuses, on peut citer des protéines naturelles comme l'anatoxine tétanique, l'albumine ou des sérums albumines ou encore des transporteurs tels que des liposomes (Frisch et al. Eur. J. Immunol., 1991, 21:185 193)
L'invention concerne encore les anticorps formés contre les peptides de l'invention.Anticorps qui peuvent être polyclonaux ou monoclonaux et produits alors par tout hybridome préparé selon les méthodes classiques de fusion cellulaire entre des cellules spléniques activées in vitro par l'antigène ou provenant soit d'un animal immunisé contre l'un des peptides de l'invention soit d'un animal non immunisé autoimmun, et des cellules d'une lignée myélomateuse.The invention also relates to the conjugates obtained by coupling the peptides of the invention with carrier molecules that are optionally physiologically acceptable and non-toxic; as carrier molecules, mention may be made of natural proteins such as tetanus toxoid, albumin or albumin-containing serums or carriers such as liposomes (Frisch et al., J. Immunol., 1991, 21: 185). 193)
The invention also relates to the antibodies formed against the peptides of the invention. Antibodies which may be polyclonal or monoclonal and then produced by any hybridoma prepared by conventional cell fusion methods between spleen cells activated in vitro by the antigen or from either an animal immunized against one of the peptides of the invention or an unimmunized autoimmune animal, and cells of a myelomaous line.
En raison de la spécificité des peptides de l'invention vis à vis des autoanticorps présents chez les patients atteints de connectivite mixte, les anticorps préparés à partir des peptides constituent des sondes immunologiques également très spécifiques de la connectivite mixte. Because of the specificity of the peptides of the invention with respect to autoantibodies present in patients with mixed connective tissue disease, the antibodies prepared from the peptides constitute immunological probes that are also very specific to mixed connective tissue disease.
Par ailleurs les anticorps formés contre les peptides de l'invention et les autoanticorps des patients réagissant avec lesdits peptides et obtenus après chromatographies d'affinité peuvent être utilisés pour préparer des anticorps anti-idiotypes, lesquels anticorps anti-idiotypes constituent en partie une copie exacte du peptide antigénique initial et donc capables de se lier aux autoanticorps observés chez les patients atteints de connectivite mixte. La présente invention concerne donc ces anticorps anti-idiotypes et les compositions les contenant ainsi que leur application pour le diagnostic in vitro chez l'homme de la présence d'autoanticorps observés dans le cas de connectivite mixte. Moreover, the antibodies formed against the peptides of the invention and the autoantibodies of the patients reacting with said peptides and obtained after affinity chromatography can be used to prepare anti-idiotypic antibodies, which anti-idiotype antibodies constitute in part an exact copy. of the original antigenic peptide and thus able to bind to the autoantibodies observed in patients with mixed connective tissue disease. The present invention thus relates to these anti-idiotypic antibodies and compositions containing them and their application for the in vitro diagnosis in humans of the presence of autoantibodies observed in the case of mixed connective tissue disease.
Les peptides de l'invention présentent des propriétés antigéniques et peuvent donc être utilisés dans des procédés de diagnostic pour la détermination et le suivi de patients atteints de maladies autoimmunes et plus particulièrement pour le diagnostic de la connectivite mixte. L'invention a donc aussi pour objet les compositions contenant au moins un desdits peptides ou encore ces peptides conjugués à une molécule porteuse, et susceptibles d'être reconnues par les autoanticorps présents dans le sérum ou tout autre fluide biologique de patients atteints de connectivite mixte. La détection du complexe peptide-anticorps in vitro est réalisée par des tests immunoenzymatiques du type ELISA, immunofluorescence, radioimmunologique ou de radioimmunoprécipitation, ou encore d'immunot raz s d'immunotransfert (immunoblot ou dot blot). The peptides of the invention have antigenic properties and can therefore be used in diagnostic methods for the determination and monitoring of patients with autoimmune diseases and more particularly for the diagnosis of mixed connective tissue disease. The subject of the invention is therefore also compositions containing at least one of said peptides or peptides conjugated to a carrier molecule, and capable of being recognized by autoantibodies present in the serum or any other biological fluid of patients with mixed connective tissue disease. . The detection of the peptide-antibody complex in vitro is carried out by immunoenzymatic tests of the ELISA, immunofluorescence, radioimmunoassay or radioimmunoprecipitation type, or immunotransfer immunoblots (immunoblot or dot blot).
L'invention concerne en conséquence aussi un procédé de diagnostic in vitro de la maladie du tissu connectif, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes
- la mise en contact d'un fluide biologique susceptible de contenir des autoanticorps avec au moins un peptide selon l'invention ou ce peptide conjugué à une molécule porteuse, dans des conditions permettant la formation d'un complexe immmunologique peptideautoanticorps,
- la détection du complexe immunologique formé par des méthodes physiques ou chimiques.The invention therefore also relates to a method for in vitro diagnosis of connective tissue disease, characterized in that it comprises the following steps
contacting a biological fluid capable of containing autoantibodies with at least one peptide according to the invention or that peptide conjugated to a carrier molecule, under conditions allowing the formation of an immunological peptide complex with autoantibody,
the detection of the immunological complex formed by physical or chemical methods.
Pour la mise en oeuvre de ces tests, l'invention concerne les peptides froids non marqués ou marqués à l'aide d'un marqueur adéquat qui peut être la biotine ou ses dérivés, une enzyme comme la peroxydase, un marqueur fluorescent comme la fluorescéine, un marquer radioactif, etc... For the implementation of these tests, the invention relates to cold peptides unmarked or labeled with a suitable marker which may be biotin or its derivatives, an enzyme such as peroxidase, a fluorescent marker such as fluorescein , a radioactive marker, etc.
De tels tests comprennent par exemple les étapes suivantes
- dépôt d'une quantité déterminée d'une composition contenant au moins un peptide de l'invention ou un conjugué du peptide ou encore un anticorps antiidiotype selon l'invention, dans les puits d'une plaque de microtitration ou sur un autre support tel que des billes ou une membrane de nitrocellulose,
- dépôt dans les puits du liquide biologique à tester ou incubation de celui-ci avec les billes ou la membrane, en présence d'agents saturant ou après saturation préalable des supports activés,
- après incubation et rinçage des microplaques ou des billes, dépôt dans les puits ou incubation avec les bilLes d'un système de révélation du complexe peptide-autoanticorps éventuellement formé.Such tests include for example the following steps
depositing a determined quantity of a composition containing at least one peptide of the invention or a conjugate of the peptide or an antiidiotype antibody according to the invention, in the wells of a microtiter plate or on another support such as that beads or nitrocellulose membrane,
depositing in the wells of the biological liquid to be tested or incubating it with the beads or the membrane, in the presence of saturating agents or after prior saturation of the activated supports,
after incubation and rinsing of the microplates or beads, deposition in the wells or incubation with the bilids of a system for revealing the peptide-autoantibody complex that may be formed.
De manière avantageuse, ce test est mis en oeuvre avec un mélange de peptides, d'une part au moins un peptide de l'invention réagissant de manière spécifique avec les anticorps présents dans le sérum de patients atteints de connectivite mixte et d'autre part au moins un peptide réagissant avec les anticorps présents dans le sérums de patients atteints d'une autre maladie autoimmune. Advantageously, this test is carried out with a mixture of peptides, on the one hand at least one peptide of the invention reacting specifically with the antibodies present in the serum of patients with mixed connectivitis and secondly at least one peptide reacting with the antibodies present in the sera of patients suffering from another autoimmune disease.
Les trousses pour la mise en oeuvre du procédé de diagnostic de l'invention comprennent
- au moins un peptide selon l'invention, ou ce peptide conjugué à une molécule porteuse,
- des réactifs pour la constitution d'un milieu propice à la réalisation d'une réaction immunologique entre le ou les peptides et les autoanticorps éventuellement présents dans un échantillon biologique,
- un ou plusieurs réactifs éventuellement marqués aptes à réagir avec le ou lesdits peptides pour la détection des complexes peptide-autoanticorps formés,
- le cas échéant, au moins un milieu biologique de référence, tel qu'un sérum dépourvu d'autoanticorps.Kits for carrying out the diagnostic method of the invention include
at least one peptide according to the invention, or this peptide conjugated to a carrier molecule,
reagents for the constitution of a medium which is suitable for carrying out an immunological reaction between the peptide (s) and the autoantibodies possibly present in a biological sample,
one or more optionally labeled reagents capable of reacting with said peptide (s) for the detection of the peptide-autoantibody complexes formed,
where appropriate, at least one reference biological medium, such as a serum devoid of autoantibodies.
L'invention concerne enfin des compositions immunogènes pour la production de vaccins dont le principe actif est constitué par au moins un peptide ou un anticorps anti-idiotype selon l'invention, éventuellement conjugué à une molécule porteuse, induisant la production d'anticorps contre lesdits peptides et qui sont capables d'interférer avec la pathologies et/ou les manifestations cliniques de la maladie du tissu connectif. Ces compositions pharmaceutiques selon l'invention, utilisables comme vaccins, sont constituées par des solutions ou suspensions injectables ou administrables par d'autres voies, pouvant être données à des doses situés entre 10 Fg/kg et 100 mg/kg de peptide. Finally, the invention relates to immunogenic compositions for the production of vaccines whose active principle is constituted by at least one peptide or an anti-idiotype antibody according to the invention, optionally conjugated to a carrier molecule, inducing the production of antibodies against said antibodies. peptides and which are capable of interfering with the pathologies and / or clinical manifestations of connective tissue disease. These pharmaceutical compositions according to the invention, which can be used as vaccines, consist of solutions or suspensions injectable or administrable by other routes, which can be given at doses of between 10 Fg / kg and 100 mg / kg of peptide.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent et qui sont illustrés par les figures en annexes, étant entendu que ces exemples ne sauraient être interprétés comme tendant à réduire la portée des revendications. Other features and advantages of the invention will appear on reading the examples which follow and which are illustrated by the appended figures, it being understood that these examples can not be interpreted as tending to reduce the scope of the claims.
EXEMPLE 1 : PREPARATION DES PEPTIDES
Quatorze peptides correspondant aux segments 1-11, 7-37, 35-58, 38-50, 56-77, 74-96, 103-135, 131153, 149-166, 163-184, 180-205, 203-225, 224-251 et 257282 de la protéine A de snRNP-U1 dont la séquence est représentée à la figure 1, ont été préparés selon les techniques classiques de synthèses peptidique en phase solide (Briand et al., 1990), soit par condensation successive des résidus d'acides aminés dans l'ordre requis, soit par condensation des résidus d'acides aminés sur un fragment préalablement formé et contenant déjà plusieurs aminoacides dans l'ordre approprié ou encore par condensation de plusieurs fragments préalablement préparés, en prenant soin de protéger au préalable toutes les fonctions réactives portées par les résidus d'acides aminés ou les fragments, exceptées les fonctions engagées dans la liaison peptidique formée lors de la condensation.EXAMPLE 1 PREPARATION OF PEPTIDES
Fourteen peptides corresponding to segments 1-11, 7-37, 35-58, 38-50, 56-77, 74-96, 103-135, 131153, 149-166, 163-184, 180-205, 203-225 , 224-251 and 257282 of the snRNP-U1 protein A, the sequence of which is shown in FIG. 1, were prepared according to standard solid phase peptide synthesis techniques (Briand et al., 1990), or by successive condensation. amino acid residues in the required order, either by condensation of the amino acid residues on a previously formed fragment already containing several amino acids in the appropriate order or by condensation of several previously prepared fragments, taking care to to protect beforehand all the reactive functions carried by the amino acid residues or the fragments, except the functions engaged in the peptide bond formed during the condensation.
Selon un exemple de préparation, la fonction amine de l'acide aminé ajouté est protégé par un groupe terbutyloxycarbonyle (Boc), les chaînes latérales des amino-acides trifonctionnels sont protégées par exemple par les groupes suivants : le cyclohexyle pour l'acide glutamique et l'acide aspartique, le benzyle pour la thréonine et la sérine, le 2-chlorobenzyloxycarbonyle pour la lysine, le 2,6-dichlorobenzyle pour la tyrosine, le p-toluènesulfonyle pour l'arginine et l'histidine; la méthionine est introduite sous forme de terbutyloxycarbonyle (O) sulfoxyde méthionine qui est réduite en methionine lors du clivage final du peptide de la résine par action de l'acide fluorhydrique anhydre. Les Bocs amino-acides sont couplés sous forme d'ester de benzotriazole sauf Boc histidine qui est introduit sous forme d'anhydre symétrique. According to an example of preparation, the amine function of the added amino acid is protected by a terbutyloxycarbonyl (Boc) group, the side chains of the trifunctional amino acids are protected for example by the following groups: cyclohexyl for glutamic acid and aspartic acid, benzyl for threonine and serine, 2-chlorobenzyloxycarbonyl for lysine, 2,6-dichlorobenzyl for tyrosine, p-toluenesulfonyl for arginine and histidine; methionine is introduced as terbutyloxycarbonyl (O) sulfoxide methionine which is reduced to methionine upon final cleavage of the peptide from the resin by the action of anhydrous hydrofluoric acid. The amino acid Bocs are coupled in the form of benzotriazole ester except Boc histidine which is introduced as a symmetrical anhydride.
Le temps de couplage total est d'environ 45 minutes; un test à la ninhydrine est utilisé pour vérifier la bonne réalisation du couplage lequel, si nécessaire, peut être doublé. The total coupling time is approximately 45 minutes; a ninhydrin test is used to verify that the coupling has been successfully completed, which, if necessary, can be doubled.
A la fin de la synthèse et après la dernière étape de déprotection, la résine est lavée et séchée. At the end of the synthesis and after the last deprotection step, the resin is washed and dried.
Selon la présence ou l'absence de (O)méthionine dans la séquence un traitement fort ou faible à l'acide fluorhydrique est utilisé pour la déprotection et le clivage du peptide de la résine.Depending on the presence or absence of (O) methionine in the sequence a strong or weak treatment with hydrofluoric acid is used for the deprotection and cleavage of the peptide of the resin.
Après lyophilisation le produit brut est dissout dans l'acide acétique 10 % et purifié par chromatographie moyenne pression (Barakat et al., 1990). After lyophilization, the crude product is dissolved in 10% acetic acid and purified by medium pressure chromatography (Barakat et al., 1990).
La pureté finale de chaque peptide est contrôlée et leur caractérisation est réalisée par chromatographie en phase liquide à haute pression ainsi que par l'analyse de leur composition en amino-acides par spectrométrie de masse.The final purity of each peptide is monitored and their characterization is carried out by high pressure liquid chromatography as well as by the analysis of their amino acid composition by mass spectrometry.
Afin d'être utilisés en ELISA, les peptides 1-11 et 38-50 sont conjugués à la sérum albumine bovine (BSA) par l'intermédiaire de la fonction SH d'une cystéine introduite dans les peptides durant la synthèse, en utilisant comme agent de couplage l'ester de m-Maleimido benzoyl-N-hydroxysuccinimide (Muller, 1988). Les peptides 35-58, 56-77, 131-153, 149-166, 163184, 180-205, 203-225 et 224-251 sont conjugués à la sérum albumine bovine (BSA) en utilisant 1 % ou 0,5 % de glutaraldehyde selon la composition de la séquence en lysine (Muller 1988). Les peptides 7-37, 74-96, 103-135 et 257-282 n'ont été conjugués à aucune protéine porteuse. In order to be used in ELISA, peptides 1-11 and 38-50 are conjugated to bovine serum albumin (BSA) via the SH function of a cysteine introduced into the peptides during synthesis, using coupling agent the m-Maleimido benzoyl-N-hydroxysuccinimide ester (Muller, 1988). Peptides 35-58, 56-77, 131-153, 149-166, 163184, 180-205, 203-225 and 224-251 are conjugated to bovine serum albumin (BSA) using 1% or 0.5% of glutaraldehyde according to the composition of the lysine sequence (Muller 1988). Peptides 7-37, 74-96, 103-135 and 257-282 were not conjugated to any carrier protein.
Les peptides synthétisés comportent entre 11 et 33 résidus d'amino-acides et représentent 96 % des 282 résidus d'amino-acides que comportent la protéine A de la ribonucléoprotéine snRNP-U1, ci-après dénommée
U1A.The peptides synthesized comprise between 11 and 33 amino acid residues and represent 96% of the 282 amino acid residues that comprise the protein A of the ribonucleoprotein snRNP-U1, hereinafter referred to as
U1A.
Les peptides 149-166, 163-184 et 180-205 correspondent au domaine de la protéine A de snRNP-U1 ne présentant pas d'homologie avec la protéine B" de snRNP
U2. Les peptides 7-37, 35-58, 56-77, 74-96, 203-225, 224-251 et 257-282 présentent une forte homologie avec la portion correspondante de la protéine B" de snRNP-U2.Peptides 149-166, 163-184 and 180-205 correspond to the domain of snRNP-U1 protein A not showing homology with snRNP protein B ".
U2. Peptides 7-37, 35-58, 56-77, 74-96, 203-225, 224-251 and 257-282 show strong homology with the corresponding portion of snRNP-U2 protein B ".
Le peptide 38-50 bien que correspondant au domaine de forte homologie entre U1A et U2B", ne comporte que quatre résidus d'amino-acides commun aux positions 38, 42, 43 et 50.Peptide 38-50, although corresponding to the high homology domain between U1A and U2B-, has only four amino acid residues common at positions 38, 42, 43 and 50.
EXEMPLE II : ETUDE SEROLOGIOUE
1) Préparation d'antisérums chez le lapin
Des antisérums dirigés contre les peptides 1-11, 7-37, 35-58, 56-77, 74-96, 103-135, 131-153, 149166, 163-184, 180-205, 203-225, 224-251 et 257-282 non conjugués ont été obtenus chez le lapin. La réactivité des antisérums avec leur peptide correspondant a été mesuré en ELISA en utilisant des microplaques activées par les différents peptides. Une réponse forte a été obtenue avec chacun des treize peptides précédents, permettant d'établir que les treize peptides étaient liés de manière satisfaisante à la surface des plaques et pouvaient donc être utilisés en tant qu'antigène dans un test ELISA avec les sérums de patients étudiés.EXAMPLE II: SEROLOGICAL STUDY
1) Preparation of antisera in rabbits
Antisera against peptides 1-11, 7-37, 35-58, 56-77, 74-96, 103-135, 131-153, 149166, 163-184, 180-205, 203-225, 224- Unconjugated 251 and 257-282 were obtained in rabbits. The reactivity of the antisera with their corresponding peptide was measured in ELISA using microplates activated by the different peptides. A strong response was obtained with each of the thirteen previous peptides, making it possible to establish that the thirteen peptides were satisfactorily bound to the surface of the plates and could therefore be used as an antigen in an ELISA test with patient sera. studied.
2) Matériels et méthodes
La procédure ELISA mise en oeuvre pour mesurer la réaction immunologique entre les peptides précédents et les anticorps présents dans les sérums humains testés a été la suivante
- 0,25 à 2 pLM de chaque peptide dilués dans une solution 0,05 M de tampon carbonate sont déposés dans les puits de plaques de microtitration, à une température de 370 Celsius; les plaques sont ensuite mises à incuber 1 heure à 37 C avec une solution à 10 mg/ml de sérum albumine bovine (BSA) en tampon PBS à pH 7,4 et contenant 0,05 % de TWEEN 20(PBS-T-BSA).2) Materials and methods
The ELISA procedure used to measure the immunological reaction between the preceding peptides and the antibodies present in the human sera tested was as follows
0.25 to 2 pLM of each peptide diluted in a 0.05 M solution of carbonate buffer are deposited in the wells of microtiter plates at a temperature of 370 Celsius; the plates are then incubated for 1 hour at 37 ° C. with a 10 mg / ml solution of bovine serum albumin (BSA) in PBS buffer at pH 7.4 and containing 0.05% of Tween 20 (PBS-T-BSA). ).
- Après trois lavages des plaques de microtitration avec le tampon PBS-T, le sérum des patients dilué au 1/1000 dans le tampon PBS-T-BSA est ajouté et laissé incubé 1 heure à 37 OC. After three washes of the microtiter plates with PBS-T buffer, patient serum diluted 1/1000 in PBS-T-BSA buffer is added and incubated for 1 hour at 37 ° C.
- Après plusieurs lavages par le PBS-T, la réaction est détectée par incubation de 30 minutes à 37
OC avec un conjugué anti-IgG humaine de chèvreperoxydase. La réaction est alors visualisée par addition d'un substrat de la peroxydase tel que le 3,3',5,5'-tétraméthylbenzidine en présence de H2O2 pendant 15 minutes à 37 OC. La réaction est stoppée par addition d'HCl (concentration finale 0,25 M) et la densité optique (DO) est lue à 450 nm.After several washes with PBS-T, the reaction is detected by incubation for 30 minutes at 37.degree.
OC with anti-human IgG conjugate of goat peroxidase. The reaction is then visualized by addition of a peroxidase substrate such as 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine in the presence of H 2 O 2 for 15 minutes at 37 ° C. The reaction is stopped by the addition of HCl (0.25 M final concentration) and the optical density (OD) is read at 450 nm.
Afin de déterminer le seuil de positivité du test, 60 sérums d'individus sains, dilué au 1/1000 ont été testés selon le protocole précédent avec 0,25 ZM du peptide 257-282 et 2 FM des treize autres peptides. In order to determine the threshold of positivity of the test, 60 sera of healthy individuals diluted 1/1000 were tested according to the previous protocol with 0.25% of peptide 257-282 and 2 FM of the thirteen other peptides.
L'absorption moyenne est de 0,16 avec une déviation standard de 0,070 pour le peptide 257-282 et inférieure ou égale à 0,12 avec une déviation standard de 0,075 pour les autres peptides. Un sérum a donc été considéré positif lorsque la valeur de sa DO est supérieure à la valeur moyenne de DO trouvé pour le peptide 257-282 additionné de deux fois la déviation standard, soit 0,3 unité de DO. En utilisant cette valeur de seuil, respectivement 5, 1,7 et 5 % des sérums d'individus normaux ont été trouvés positifs avec les peptides 1-11 (DO comprise entre 0,03 et 0,46), 38-50 (DO comprises entre 0,03 et 0,39) et 257-282 (DO comprises entre 0,07 et 0,40); alors qu'aucune réaction positive n'était observée avec les autres peptides.The average absorption is 0.16 with a standard deviation of 0.070 for peptide 257-282 and less than or equal to 0.12 with a standard deviation of 0.075 for the other peptides. A serum was thus considered positive when the value of its OD is greater than the mean value of OD found for the peptide 257-282 supplemented with twice the standard deviation, ie 0.3 units of OD. Using this threshold value, respectively, 5, 1.7 and 5% of the sera of normal individuals were found positive with peptides 1-11 (OD between 0.03 and 0.46), 38-50 (OD between 0.03 and 0.39) and 257-282 (OD between 0.07 and 0.40); whereas no positive reaction was observed with the other peptides.
2) Etude des sérums de patients atteints de maladies autoimmunes
Les sérums suivants ont été testés afin de détecter la présence d'anticorps capables de réagir en
ELISA avec les peptides synthétisés
- 18 sérums de patients atteints de connectivite mixte (MCTD),
- 145 sérums de patients atteints de lupus érythémateux disséminé (LED),
- 120 sérums de patients atteints d'autres maladies rhumatoïdes : 40 serums de patients atteints du syndrome primaire de Sjôgren (SS), 41 sérums de patients atteints de polyarthrite rhumatoïde (PR) et 39 sérums de patients atteints d'arthrite chronique juvénile (JCA),
- 60 sérums de sujets normaux ont été utilisés comme témoins (NHS). 2) Study of sera from patients with autoimmune diseases
The following sera were tested for the presence of antibodies capable of reacting with
ELISA with synthesized peptides
- 18 sera of patients with mixed connective tissue disease (MCTD),
- 145 sera from patients with systemic lupus erythematosus (SLE),
- 120 sera from patients with other rheumatoid diseases: 40 sera from patients with Sjögren's primary syndrome (SS), 41 sera from rheumatoid arthritis (RA) patients and 39 sera from juvenile chronic arthritis patients (JCA) )
- 60 sera of normal subjects were used as controls (NHS).
Le tableau I ci-dessous rapporte les résultats observé avec les peptides 1-11, 35-58 et 257282 en utilisant les valeurs seuils de 0,3 et 0,4. Le protocole mis en oeuvre correspond à celui décrit précédemment. Les sérums de patients dilués au 1/1000 sont mis en contact avec 0,25 FM du peptide 1-11 et 2 iM des peptides 35-58 et 257-282 absorbés sur la plaque de microtitration, puis mesure de la DO après incubation de 15 minutes du conjugué anti-IgG humaine peroxydase avec le substrat. Les résultats sont exprimés en pourcentage de sérums positifs par rapport au nombre total de sérums testés. Un sérum est considéré comme positif lorsque la valeur de DO est supérieure ou égale à 0,3 (ce qui correspond à la valeur moyenne de la DO pour les 60 sérums de sujets normaux ajoutée de 4 fois la déviation standard). Table I below reports the results observed with the peptides 1-11, 35-58 and 257282 using the threshold values of 0.3 and 0.4. The protocol implemented corresponds to that described above. The sera of patients diluted 1/1000 are brought into contact with 0.25 μM of the peptide 1-11 and 2 μM of the peptides 35-58 and 257-282 absorbed on the microtitration plate, then measurement of the OD after incubation of 15 minutes of the anti-human IgG peroxidase conjugate with the substrate. The results are expressed as a percentage of positive sera relative to the total number of sera tested. A serum is considered positive when the OD value is greater than or equal to 0.3 (which corresponds to the average value of the OD for the 60 sera of normal subjects added by 4 times the standard deviation).
TABLEAU I
<tb> <SEP> Peptides <SEP> Peptides
<tb> <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> (Seuil <SEP> 0,30) <SEP> (Seuile <SEP> 0,40)
<tb> <SEP> Serums <SEP> patients
<tb> <SEP> 1-11 <SEP> 35-58 <SEP> 257-282 <SEP> 1-11 <SEP> 35-58 <SEP> 257-282
<tb> MTCD <SEP> 18 <SEP> 50,0 <SEP> 94,4 <SEP> 94,4 <SEP> 44,4 <SEP> 77,8 <SEP> 94,4
<tb> LED <SEP> 145 <SEP> 33,8 <SEP> 19,3 <SEP> 64,8 <SEP> 17,2 <SEP> 13,8 <SEP> 53,8
<tb> SS <SEP> 40 <SEP> 10,0 <SEP> 0 <SEP> 25,0 <SEP> 10,0 <SEP> 0 <SEP> 17,5
<tb> PR <SEP> 41 <SEP> 4,9 <SEP> 0 <SEP> 14,6 <SEP> 2,4 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> JCA <SEP> 39 <SEP> 2,6 <SEP> 0 <SEP> 10,2 <SEP> 2,6 <SEP> 0 <SEP> 2,6
<tb> NHS <SEP> 60 <SEP> 5 <SEP> 0 <SEP> 5,0 <SEP> 1,7 <SEP> 0 <SEP> 1,7
<tb>
En utilisant une valeur seuil de 0,30, 39 des 145 sérums de patients de LED (soit 33,8 %) réagissent avec le peptide 1-11, 28 (soit 19,3 %) réagissent avec le peptide 35-58 et 94 (soit 64,8 %) réagissent avec le peptide 257-282. Les valeurs de DO mesurées pour chacun des peptides sont les suivantes
- peptide 1-11 : DO comprise entre 0,06 et 1, 11; valeur moyenne de la DO 0,27 avec une déviation standard de 0,19.<tb><SEP> Peptides <SEP> Peptides
<tb><SEP> Number <SEP> of <SEP> (Threshold <SEP> 0.30) <SEP> (Threshold <SEP> 0.40)
<tb><SEP> Serums <SEP> patients
<tb><SEP> 1-11 <SEP> 35-58 <SEP> 257-282 <SEP> 1-11 <SEP> 35-58 <SEP> 257-282
<tb> MTCD <SEP> 18 <SEP> 50.0 <SEP> 94.4 <SEP> 94.4 <SEP> 44.4 <SEP> 77.8 <SEP> 94.4
<tb> LED <SEP> 145 <SEP> 33.8 <SEP> 19.3 <SE> 64.8 <SE> 17.2 <SE> 13.8 <SE> 53.8
<tb> SS <SEP> 40 <SEP> 10.0 <SEP> 0 <SEP> 25.0 <SEP> 10.0 <SEP> 0 <SEP> 17.5
<tb> PR <SEP> 41 <SEP> 4.9 <SEP> 0 <SEP> 14.6 <SEP> 2.4 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> JCA <SEP> 39 <SEP> 2.6 <SEP> 0 <SEP> 10.2 <SEP> 2.6 <SEP> 0 <SEP> 2.6
<tb> NHS <SEP> 60 <SEP> 5 <SEP> 0 <SEP> 5.0 <SEP> 1.7 <SEP> 0 <SEP> 1.7
<Tb>
Using a threshold value of 0.30, 39 of the 145 sera of LED patients (ie 33.8%) react with the peptide 1-11, 28 (ie 19.3%) react with the peptide 35-58 and 94. (ie 64.8%) react with peptide 257-282. The OD values measured for each of the peptides are as follows
peptide 1-11: OD of between 0.06 and 1.11; mean value of OD 0.27 with a standard deviation of 0.19.
- peptide 35-58 : DO comprise entre 0,01 et 1,45; valeur moyenne de la DO 0,21 avec une déviation standard de 0,19. peptide 35-58: OD between 0.01 and 1.45; mean value of OD 0.21 with a standard deviation of 0.19.
- peptide 257-282 : DO comprise entre 0,02 et supérieure ou égale à 2; valeur moyenne de la DO 0,74 avec une déviation standard de 0,69. peptide 257-282: OD of between 0.02 and greater than or equal to 2; mean value of the OD 0.74 with a standard deviation of 0.69.
Ces résultats sont également rapportés à la figure 2 en annexe. These results are also reported in Figure 2 in the appendix.
Le tableau II ci-dessous montre que parmi les 145 sérums de patients atteints de LED tout ceux comportant des anticorps réagissant avec le peptide 1-11 et/ou le peptide 35-58 réagissent également avec le peptide 257-282. Table II below shows that among the 145 sera of LED patients all those with antibodies reactive with peptide 1-11 and / or peptide 35-58 also react with peptide 257-282.
TABLEAU II
<tb> Réactivité <SEP> avec <SEP> Réactivité <SEP> avec
<tb> <SEP> le <SEP> peptide <SEP> les <SEP> peptides <SEP> Nombre <SEP> de
<tb> <SEP> 257-282 <SEP> 1-11 <SEP> et/ou <SEP> 35-58 <SEP> sérums
<tb> <SEP> + <SEP> + <SEP> 47 <SEP> 32,4
<tb> <SEP> + <SEP> ~ <SEP> <SEP> 47 <SEP> 32,4
<tb> <SEP> + <SEP> 5 <SEP> 3,4
<tb> <SEP> 46 <SEP> 31,7
<tb>
Aucun des dix autre peptides 7-37, 56-77, 74-96, 103-135, 131-153, 149-166, 163-184, 180-205, 203225 et 224-251 n'a été reconnu par l'un des sérums.<tb> Reactivity <SEP> with <SEP> Reactivity <SEP> with
<tb><SEP> the <SEP> peptide <SEP><SEP> peptides <SEP> Number <SEP> of
<tb><SEP> 257-282 <SEP> 1-11 <SEP> and / or <SEP> 35-58 <SEP> sera
<tb><SEP> + <SEP> + <SEP> 47 <SEP> 32.4
<tb><SEP> + <SEP> ~ <SEP><SEP> 47 <SEP> 32.4
<tb><SEP> + <SEP> 5 <SEP> 3,4
<tb><SEP> 46 <SEP> 31.7
<Tb>
None of the other ten peptides 7-37, 56-77, 74-96, 103-135, 131-153, 149-166, 163-184, 180-205, 203225 and 224-251 were recognized by the one of the sera.
Les treize peptides ont également été testés avec des sérums de patients atteints d'autres maladies rhumatoïdes. On remarque dans le tableau I que seulement quelques uns d'entre eux issus de la région 1-250 réagissent avec moins de 5 % de ces sérums, sauf en ce qui concerne les sérums de patients atteints de SS qui réagissent avec le peptide 1-11 (DO comprises entre 0,10 et 1,21; DO moyenne de 0,21 avec une déviation standard de 0,22).Par ailleurs, on constate que les anticorps liant le peptide 257-282 sont présents dans 25 % des sérums de patients atteints de SS (DO comprises entre 0,07 et 1,89; DO moyenne de 0,29 avec une déviation standard de 0,31), 15 % des sérums de patients atteints de PR (DO comprise entre 0,08 et 0,38; DO moyenne de 0,18 avec une déviation standard de 0,09)et 10 % des sérums de patients atteints de JCA (DO comprises entre 0,05 et 0,41; DO moyenne de 0,33 avec une déviation standard de 0,04). The thirteen peptides were also tested with sera from patients with other rheumatoid diseases. It is noted in Table I that only a few of them from region 1-250 react with less than 5% of these sera, except for sera from SS patients that react with peptide 1- 11 (OD between 0.10 and 1.21, average OD of 0.21 with a standard deviation of 0.22). Moreover, it is found that the antibodies binding peptide 257-282 are present in 25% of the sera. of patients with SS (OD between 0.07 and 1.89, mean OD of 0.29 with a standard deviation of 0.31), 15% of sera from patients with RA (OD between 0.08 and 0.38, mean OD of 0.18 with a standard deviation of 0.09) and 10% of patients with JCA (OD between 0.05 and 0.41, mean OD of 0.33 with deviation standard of 0.04).
Ces résultats montrent une fréquence importante des anticorps réagissant avec le peptide 257-282 à la fois dans le cas de patients atteints de
MCTD (94%) et de LED (65%), et une fréquence plus faible mais tout de même significative de ces anticorps dans le cas de patients atteints des autres maladies autoimmunes étudiées. Au contraire, le peptide 35-58 correspondant au peptide de l'invention de formule I, permet une bonne discrimination entre les sérums de patients atteints de
MCTD (94%) et ceux de patients atteints de LED (19%).These results show a high frequency of antibodies reacting with peptide 257-282 both in the case of patients with
MCTD (94%) and LED (65%), and a lower frequency but still significant of these antibodies in the case of patients with other autoimmune diseases studied. In contrast, the peptide 35-58 corresponding to the peptide of the invention of formula I, allows a good discrimination between the sera of patients suffering from
MCTD (94%) and those with LEDs (19%).
3) Réactivité en ELISA de sérums de patients atteints de maladies autoimmunes avec le peptide 38-50
Le peptide 35-58 de la protéine A de snRNP U1 comporte environ 15 résidus d'acides aminés communs avec la séquence 32-55 de la protéine B" de snRNP-U2. En conséquence, une partie des sérums de patioents atteints de LED réagissant avec le peptide 35-58 pourrait correspondre à des sérums contenant des anticorps réagissant avec la protéine snRNP-U2. Afin de disposer d'un marqueur plus spécifique de la maladie du tissu connectif, les inventeurs ont préparé le peptide 38-50, correspondant aux peptides de 1 invention de formule II. 3) ELISA reactivity of sera from patients with autoimmune diseases with peptide 38-50
Peptide 35-58 of snRNP U1 protein A has about 15 amino acid residues common to the 32-55 sequence of snRNP-U2 protein B. As a result, a portion of the LED reactive serum sera with peptide 35-58 could correspond to sera containing antibodies reactive with the snRNP-U2 protein In order to have a more specific marker of the connective tissue disease, the inventors prepared the peptide 38-50 corresponding to the peptides of the invention of formula II.
Ce peptide ne présente que quatre résidus d'acide aminé communs avec la séquence 35-47 de U2B", il s'agit du résidu glycine en position 38, du résidu acide aspartique en position 42, du résidu isoleucine en position 43 et du résidu lysine en position 50; en outre, il ne contient pas le site RNP1 correspondant au domaine de fixation de l'ARN, et répondant à la formule : RGQAFVIF; lequel site est localisé dans U1A en position 52-59, dans U2B" en position 49-56 et dans la protéine de 70 Kd de snRNP-U1 en position 320-327 dans la séquence déterminée par Spritz et au.(1987). This peptide has only four amino acid residues common with the 35-47 sequence of U2B-, it is the glycine residue at position 38, the aspartic acid residue at position 42, the isoleucine residue at position 43 and the residue lysine in position 50, in addition, it does not contain the RNP1 site corresponding to the RNA binding domain, and having the formula: RGQAFVIF, which site is located in U1A at position 52-59, in U2B "in position 49-56 and in the 70 Kd protein of snRNP-U1 at position 320-327 in the sequence determined by Spritz et al (1987).
Le peptide 38-50 a été testé en ELISA avec 12 sérums de patients atteints de MCTD, 145 sérums de patients atteints de LED et 60 sérums de sujets normaux en tant que contrôle. Peptide 38-50 was tested in ELISA with 12 sera from MCTD patients, 145 sera from LED patients and 60 sera from normal subjects as a control.
Une expérience préliminaire utilisant un antisérum anti-peptide 38-50 préparé chez le lapin a mis en évidence que le peptide 38-50 n'était pas adsorbé sur la phase solide. Les plaques ont donc été activées avec un conjugué du peptide et de sérum albumine bovine, conjugué avec lequel l'antisérum a réagit. A preliminary experiment using anti-38-50 peptide antiserum prepared in the rabbit demonstrated that the 38-50 peptide was not adsorbed on the solid phase. The plates were therefore activated with a conjugate of peptide and bovine serum albumin, conjugated with which the antiserum reacted.
Le peptide 38-50 conjugué a été reconnu par 29 % des sérums de patients atteints de MCTD (DO comprises entre 0,07 et 0,82; valeure moyenne de la DO 0,29 avec une déviation standard de 0,19),par seulement 4% des sérums de patients atteints de LED (DO comprises entre 0,07 et 0,63; valeure moyenne de la DO 0,17 avec une déviation standard de 0,09) et par moins de 4% des sérums de patients atteints d'autres maladies rhumatoïdes ou de sujets normaux (1,7%)
Le sérum standard de référence AF/CDC 4 fournit par le CDC comme sérum anti-UlRNP, calibré pour être utilisé en fluorescence, a réagit en ELISA avec le peptide 38-50 (titre 80), comme avec les peptides 1-11 (titre 160) et 257-282 (titre 40).The 38-50 conjugated peptide was recognized by 29% of MCTD patient sera (OD between 0.07 and 0.82, mean value of OD 0.29 with a standard deviation of 0.19), only 4% of the sera of patients with SLE (OD between 0.07 and 0.63, mean value of OD 0.17 with a standard deviation of 0.09) and by less than 4% of patients with SLE other rheumatoid diseases or normal subjects (1.7%)
The standard AF / CDC 4 standard serum provided by CDC as an anti-UlRNP serum, calibrated for fluorescence use, reacted by ELISA with peptide 38-50 (title 80), as with peptides 1-11 (titre 160) and 257-282 (Title 40).
EXEMPLE 3 : COMPARAISON ENTRE L'ELISA ET L'IMMUNOBLOT
1) Immunoblot
Les expériences d'immunoblot ont été réalisées selon le protocole décrit par Abuaf et al. (1990) en utilisant comme antigène un extrait de thymus de lapin et non de veau qui ne contient pas la protéine de 70 Kd spécifique de U1-SnRNP. Les protéines sont ensuite séparées dans un gel de polyacrylamide-SDS à 13 % et transférées sur des membranes de nitrocellulose comme décrit par Towbin et al. (1979).EXAMPLE 3 COMPARISON BETWEEN ELISA AND IMMUNOBLOT
1) Immunoblot
Immunoblotting experiments were performed according to the protocol described by Abuaf et al. (1990) using as antigen a rabbit and non-calf thymus extract which does not contain the 70 Kd protein specific for U1-SnRNP. The proteins are then separated in a 13% SDS-polyacrylamide gel and transferred to nitrocellulose membranes as described by Towbin et al. (1979).
L'immunoréactivité est détectée sur les taches avec les sérums de patients dilués au 1/100 et un conjugué d'anti-IgG humaine et de peroxydase de raifort.Immunoreactivity is detected on stains with sera of patients diluted 1/100 and conjugate of anti-human IgG and horseradish peroxidase.
Le titre ANA est mesuré par immunofluorescence (IF) sur des monocouches de cellules
HEp-2 et des cryocoupes de foie de rats.The ANA titre is measured by immunofluorescence (IF) on cell monolayers
HEp-2 and cryocoupes of rat liver.
Les anticorps dirigés contre l'antigène nucléaire extrait (ENA) sont détectés par immunodiffusion (ID). Antibodies raised against the extracted nuclear antigen (ENA) are detected by immunodiffusion (ID).
L'immunoblot constitue une méthode particulièrement adaptée pour la détection des anticorps anti-RNP (Pettersson et al., 1986; Hoch, 1989; Combe et al., 1989)
La figure 3 en annexe illustre l'analyse en immunoblot de sérums de patients dont on a détecté par immunodiffusion des anticorps anti-Sm et/ou anti-snRNP
U1. L'antigène nucléaire extrait (ENA) est séparé en
SDS-PAGE 13% et transféré sur bande de nitrocellulose.The immunoblot is a particularly suitable method for detecting anti-RNP antibodies (Pettersson et al., 1986, Hoch 1989, Combe et al.
Figure 3 in the appendix illustrates the immunoblot analysis of sera from patients detected by immunodiffusion of anti-Sm and / or anti-snRNP antibodies.
U1. The extracted nuclear antigen (ENA) is separated into
SDS-PAGE 13% and transferred to nitrocellulose band.
Chaque bande est ensuite incubée avec les sérums de patients dilués au 1/100, et mis en contact avec un conjugué anti-IgG humaine de chèvre-peroxydase puis avec un substrat chloronaphtol. Les bandes A,B,C ont été incubées avec un sérum de pateint contenant des anticorps anti-Sm, la bande J a été incubbé avec un sérum de patient contenant des anticorps anti-snRNP-U1 et la bande K avec un sérum de sujet normal; les bandes
D, E, F, G, H et I ont été respectivement incubé avec les sérums des pateints 11, 17, 14, 15, 3 et 4 du tableau III ci-après.Each band is then incubated with patient sera diluted 1/100, and contacted with a goat-peroxidase anti-human IgG conjugate and then with a chloronaphthol substrate. Strips A, B, C were incubated with a pateint serum containing anti-Sm antibodies, the J band was incubated with a patient serum containing anti-snRNP-U1 antibodies and the K band with a subject serum. normal; groups
D, E, F, G, H and I were respectively incubated with the sera of pateints 11, 17, 14, 15, 3 and 4 of Table III below.
2) Résultats
Dix neuf sérums de patients hommes (M) ou femmes (F) diagnostiqués MCTD ou SLE sont testés en parallèle en ELISA avec les peptides 1-11, 35-58, 257282 et en immunoblot avec un extrait nucléaire de thymus en tant qu'antigène.2) Results
Nineteen sera of male (M) or female (F) patients diagnosed with MCTD or SLE are tested in parallel with ELISA peptides 1-11, 35-58, 257282 and immunoblotted with a thymus nuclear extract as antigen. .
Le tableau III ci-dessous rapporte les résultats de cette étude comparée entre immunoblot et
ELISA. Table III below reports the results of this comparative study between immunoblot and
ELISA.
TABLEAU III
Patients <SEP> Sexe <SEP> Diagnostic <SEP> ANA <SEP> IF <SEP> Anti <SEP> ENA <SEP> ID <SEP> IMMUNOBLOT <SEP> ELISA
<tb> <SEP> Titre <SEP> 70Kd <SEP> A <SEP> BB' <SEP> C <SEP> D <SEP> 1-11 <SEP> 35-58 <SEP> 257-282
<tb> <SEP> 1 <SEP> M <SEP> MTCD <SEP> 1000 <SEP> RNP <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> + <SEP> ++
<tb> <SEP> 2 <SEP> F <SEP> MTCD <SEP> > 1000 <SEP> RNP <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> + <SEP> ++
<tb> <SEP> 3 <SEP> M <SEP> MTCD <SEP> > 1000 <SEP> RNP <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> + <SEP> + <SEP> ++
<tb> <SEP> 4 <SEP> F <SEP> MTCD <SEP> > 1000 <SEP> RNP <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> + <SEP> + <SEP> ++
<tb> <SEP> 5 <SEP> F <SEP> MTCD <SEP> 1000 <SEP> RNP <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> ++ <SEP> ++
<tb> <SEP> 6 <SEP> F <SEP> MTCD <SEP> 500 <SEP> RNP <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> ++
<tb> <SEP> 7 <SEP> F <SEP> MTCD <SEP> 1000 <SEP> RNP <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> ++
<tb> <SEP> 8 <SEP> F <SEP> MTCD <SEP> 500 <SEP> RNP <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> ++
<tb> <SEP> 9 <SEP> F <SEP> MTCD <SEP> 500 <SEP> RNP <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> ++
<tb> <SEP> 10 <SEP> F <SEP> MTCD <SEP> 200 <SEP> RNP <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> + <SEP> ++
<tb> <SEP> 11 <SEP> F <SEP> MTCD <SEP> > 1000 <SEP> RNP <SEP> - <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> ++
<tb> <SEP> 12 <SEP> F <SEP> MTCD <SEP> 1000 <SEP> RNP <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> ++
<tb> <SEP> 13 <SEP> F <SEP> MTCD <SEP> 1000 <SEP> RNP <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> ++
<tb> <SEP> 14 <SEP> F <SEP> LED <SEP> 1000 <SEP> RNP+Sm <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> ++
<tb> <SEP> 15 <SEP> F <SEP> LED <SEP> 500 <SEP> RNP <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> ++
<tb> <SEP> 16 <SEP> F <SEP> LED <SEP> 1000 <SEP> RNP <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> ++
<tb> <SEP> 17 <SEP> M <SEP> LED <SEP> > 1000 <SEP> RNP <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> ++
<tb> <SEP> 18 <SEP> F <SEP> LED <SEP> > 1000 <SEP> RNP <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> ++
<tb> <SEP> 19 <SEP> F <SEP> LED <SEP> 500 <SEP> RNP <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> + <SEP> ++
<tb>
Comme cela apparaît dans le tableau IV ciaprès, 4 des 19 sérums réagissent avec le peptide 1-11 en ELISA et en immunoblot avec le polypeptide A, alors que 4 sérums sont négatifs dans les deux tests; 2 érums positifs en ELISA avec le peptide 1-11 sont négatifs en immunoblot alors que 4 sérums négatifs sont négatifs en
ELISA et positif avec le polypeptide A en immunoblot. De manière interessante, tout les sérums réagissant avec la bande A en immunoblot sont positifs en ELISA avec les deux peptides 35-58 et 257-282; en outre, 6 sérums (1
LED et 5 MCTD) ont réagit avec les deux peptides mais nront pas lié le polypeptide A en immunoblot.Patients <SEP> Gender <SEP> Diagnosis <SEP> ANA <SEP> IF <SEP> Anti <SEP> ENA <SEP> ID <SEP> IMMUNOBLOT <SEP> ELISA
<tb><SEP> Title <SEP> 70Kd <SEP> A <SEP> BB '<SEP> C <SEP> D <SEP> 1-11 <SEP> 35-58 <SEP> 257-282
<tb><SEP> 1 <SEP> M <SEP> MTCD <SEP> 1000 <SEP> RNP <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> + <SEP> ++
<tb><SEP> 2 <SEP> F <SEP> MTCD <SEP>> 1000 <SEP> RNP <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP > + <SEP> ++
<tb><SEP> 3 <SEP> M <SEP> MTCD <SEP>> 1000 <SEP> RNP <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> + <SEP > + <SEP> ++
<tb><SEP> 4 <SEP> F <SEP> MTCD <SEP>> 1000 <SEP> RNP <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> + <SEP > + <SEP> ++
<tb><SEP> 5 <SEP> F <SEP> MTCD <SEP> 1000 <SEP> RNP <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> ++ <SEP> ++
<tb><SEP> 6 <SEP> F <SEP> MTCD <SEP> 500 <SEP> RNP <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> ++
<tb><SEP> 7 <SEP> F <SEP> MTCD <SEP> 1000 <SEP> RNP <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> ++
<tb><SEP> 8 <SEP> F <SEP> MTCD <SEP> 500 <SEP> RNP <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> ++
<tb><SEP> 9 <SEP> F <SEP> MTCD <SEP> 500 <SEP> RNP <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> ++
<tb><SEP> 10 <SEP> F <SEP> MTCD <SEP> 200 <SEP> RNP <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> + <SEP> ++
<tb><SEP> 11 <SEP> F <SEP> MTCD <SEP>> 1000 <SEP> RNP <SEP> - <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP > + <SEP> ++
<tb><SEP> 12 <SEP> F <SEP> MTCD <SEP> 1000 <SEP> RNP <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> ++
<tb><SEP> 13 <SEP> F <SEP> MTCD <SEP> 1000 <SEP> RNP <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> ++
<tb><SEP> 14 <SEP> F <SEP> LED <SEP> 1000 <SE> RNP + Sm <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> ++
<tb><SEP> 15 <SEP> F <SEP> LED <SEP> 500 <SE> RNP <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> ++
<tb><SEP> 16 <SEP> F <SEP> LED <SEP> 1000 <SEP> RNP <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> ++
<tb><SEP> 17 <SEP> M <SEP> LED <SEP>> 1000 <SEP> RNP <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP > + <SEP> ++
<tb><SEP> 18 <SEP> F <SEP> LED <SEP>> 1000 <SEP> RNP <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP > + <SEP> ++
<tb><SEP> 19 <SEP> F <SEP> LED <SEP> 500 <SE> RNP <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> + <SEP> ++
<Tb>
As shown in Table IV below, 4 of 19 sera reacted with peptide 1-11 in ELISA and immunoblot with polypeptide A, while 4 sera were negative in both tests; 2 ELISA positive sera with peptide 1-11 are immunoblot negative whereas 4 negative sera are negative in
ELISA and positive with the immunoblot polypeptide A. Interestingly, all sera reacting with immunoblot band A are ELISA positive with both peptides 35-58 and 257-282; in addition, 6 sera (1
LED and MCTD) reacted with both peptides but will not bind the A polypeptide in immunoblot.
TABLEAU IV
<tb> <SEP> Réactivité <SEP> en <SEP> ELISA
<tb> Réactivité <SEP> avec
<tb> <SEP> la <SEP> bande <SEP> A <SEP> en <SEP> Peptide <SEP> 1-11 <SEP> Peptides
<tb> <SEP> immoblot <SEP> 35 <SEP> - <SEP> 48 <SEP> et <SEP> 257 <SEP> - <SEP> 282
<tb> <SEP> Positif <SEP> Négatif <SEP> Positif <SEP> Négatif
<tb> <SEP> Positif <SEP> 8 <SEP> 5 <SEP> 13 <SEP> 0
<tb> <SEP> Négatif <SEP> 2 <SEP> 4 <SEP> 6 <SEP> 0
<tb>
EXEMPLE IV : PREDICTION DES SITES
ANTIGENIOUES
L'étude précédente a permis aux inventeurs d'identifier plusieurs régions de la protéine A de snRNP-U1 reconnues par les autoanticorps présents dans les sérums de patients atteints de diverses maladies autoimmunes.La protéine A interagit directement avec snRNA-U1 par l'intermédiaire d'un motif de reconnaissance RRM localisé dans la région N-terminale de la protéine en position 12-84. Cette région contient la séquence consensus RNP1 en position 52-59, laquelle est également présente dans les protéines 70Kd et B" et dans l'antigène La 60 Kd. Un second motif RRM localisé dans la région C-terminale de la protéine en position 210-277 n'est pas nécessaire pour la liason spécifique entre l'ARN et U1A (Scherly et al., 1990).Toutefois les protéines U1A et U2B" possèdent une homologie de séquence importante, notamment, environ 77% d'homologie au niveau des résidu 7-101 de U1A et 4-98 de U2B"; la région définie par Scherly et al. (1990) comme déterminant majeur de la liaIson spécifique avec l'ARN est situé tout proche de la séquence consensus RNP dans l'une des régions les plus variables du motif conservé.<tb><SEP> Reactivity <SEP> in <SEP> ELISA
<tb> Reactivity <SEP> with
<tb><SEP> the <SEP> band <SEP> A <SEP> in <SEP> Peptide <SEP> 1-11 <SEP> Peptides
<tb><SEP> real estate <SEP> 35 <SEP> - <SEP> 48 <SEP> and <SEP> 257 <SEP> - <SEP> 282
<tb><SEP> Positive <SEP> Negative <SEP> Positive <SEP> Negative
<tb><SEP> Positive <SEP> 8 <SEP> 5 <SEP> 13 <SEP> 0
<tb><SEP> Negative <SEP> 2 <SEP> 4 <SEP> 6 <SEP> 0
<Tb>
EXAMPLE IV: PREDICTION OF SITES
ANTIGENIOUES
The previous study allowed the inventors to identify several regions of the protein A of snRNP-U1 recognized by autoantibodies present in the sera of patients with various autoimmune diseases. Protein A interacts directly with snRNA-U1 via a RRM recognition pattern located in the N-terminal region of the protein at position 12-84. This region contains the RNP1 consensus sequence at position 52-59, which is also present in the 70Kd and B "proteins and in the La 60 Kd antigen. A second RRM motif located in the C-terminal region of the protein at position 210 -277 is not necessary for the specific binding between RNA and U1A (Scherly et al., 1990). However, the U1A and U2B "proteins have significant sequence homology, including about 77% homology at 7-101 of U1A and 4-98 of U2B ", the region defined by Scherly et al. (1990) as a major determinant of the specific binding with RNA is located very close to the RNP consensus sequence in one the most variable regions of the preserved motif.
Ceci semble expliquer la différence entre U1A et U2B" au niveau des propriétés de liaison entre ARN et protéine.This seems to explain the difference between U1A and U2B- at the level of binding properties between RNA and protein.
Trois des peptides étudiés précédemment sont reconnus par les anticorps présents dans les sérums de patients testés. Le peptide 257-282 et à l'extrémité opposé le peptide 1-11 sont reconnus par les sérums de patients atteints de LED et de MCTD, ainsi que par les anticorps présents dans les sérums de patients atteints d'autres maladies rhumatoïdes. Le peptide 35-58 est reconnu par 94% des sérums de patients atteints de MCTD et seulement par 19% des sérums LED. Three of the peptides studied previously are recognized by the antibodies present in the sera of patients tested. Peptide 257-282 and at the opposite end peptide 1-11 are recognized by sera from patients with SLE and MCTD, as well as antibodies present in the sera of patients with other rheumatoid diseases. The 35-58 peptide is recognized by 94% of the MCTD patient sera and only 19% of the LED sera.
Les méthodes de prédiction des sites antigéniques mettent en oeuvre des algorithmes basés sur certains paramètres comme lthydrophobicité ou l'hydrophilicité ou encore la mobilité de courts segments de la structure des protéines. The methods for prediction of antigenic sites use algorithms based on certain parameters such as hydrophobicity or hydrophilicity or the mobility of short segments of the protein structure.
La figure 4 en annexe représente les profiles de prédiction antigénique de la protéine U1A construits selon les échelles suivantes
- en A : selon l'échelle d'hydrophilicité de
Parker et al. (1986)
- en B : selon l'échelle de mobilité de
Karplus et Schultz (1985).Figure 4 in the appendix shows the antigenic prediction profiles of the U1A protein constructed according to the following scales
- in A: according to the hydrophilicity scale of
Parker et al. (1986)
- in B: according to the mobility scale of
Karplus and Schultz (1985).
Les échelles ont été normalisées selon la méthode de Pellequer et al. (1991). Les graphiques sont tracés entre le quatrième résidu et le résidu n-3. La localisation des épitopes reconnus les sérums MCTD et
LED (régions 1-11, 35-58 et 257-282) sont représentés en traits épais.The scales were normalized according to the method of Pellequer et al. (1991). Charts are plotted between the fourth residue and the n-3 residue. The localization of epitopes recognized MCTD sera and
LEDs (regions 1-11, 35-58 and 257-282) are shown in thick lines.
Le tableau V ci-après, indique pour les trois peptides réactifs en ELSA (peptides 1-11, 35-58 et 258-282) le résultat de la prédiction antigénique obtenue selon les quatres méthodes suivantes
- échelle de mobilité, Karplus et Schultz (1985); résultat obtenu à partir des données de la figure 4,
- échelle d'hydrophilicité, Parker et al.Table V below indicates, for the three peptides reactive in ELSA (peptides 1-11, 35-58 and 258-282), the result of the antigenic prediction obtained according to the following four methods.
- mobility scale, Karplus and Schultz (1985); result obtained from the data of Figure 4,
hydrophilicity scale, Parker et al.
(1986); résultat obtenu à partir des données de la figure 4,
- échelle d'hydrophilicité selon le programme HYDRO 3 de Hopp (1986); Pollard et Cohen (1990)
- échelle d'acrophilicité selon le programme
ACRO de Hopp (1986); Pollard et Cohen (1990).(1986); result obtained from the data of Figure 4,
hydrophilicity scale according to the HYDRO 3 program of Hopp (1986); Pollard and Cohen (1990)
- acrophilicity scale according to the program
ACRO de Hopp (1986); Pollard and Cohen (1990).
TABLEAU V
<tb> <SEP> PEPTIDE
<tb> <SEP> 1-11 <SEP> 35-58 <SEP> 258-282
<tb> Echelle <SEP> de <SEP> mobilité <SEP> Karplus <SEP> et <SEP> + <SEP> - <SEP> +
<tb> <SEP> Schultz <SEP> (1985)
<tb> Echelle <SEP> d'hydrophilicité, <SEP> Parker <SEP> +/- <SEP> - <SEP> +
<tb> <SEP> et <SEP> au.(1986) <SEP>
<tb> Echelle <SEP> d'hydrophilicité <SEP> selon
<tb> <SEP> le <SEP> programme <SEP> HYDRO <SEP> 3 <SEP> de <SEP> Hopp <SEP> - <SEP> + <SEP>
<tb> <SEP> (1986)
<tb> Echelle <SEP> d'acrophilicité <SEP> selon <SEP> le
<tb> <SEP> programme <SEP> ACRO <SEP> de <SEP> Hopp <SEP> (1886) <SEP> <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP>
<tb>
Le programme HYDRO 3 (Hopp, 1986) basé sur l'hydrophylicité indique que la séquence 43-56 pourrait contenir un site antigénique de la protéine U1A (Pollard et Cohen, 1990).Ce site n'est toutefois pes remarqué en utilisant l'échelle d'hydrophilicité de Parker et al., l'échelle de mobilité de Karplus et Scultz ou l'échelle d'acrophilicité (ACRO) de Hopp. Les régions 1-11 et 258282 ne sont pas mises en évidence avec les programmes
HYDRO 3 et ACRO et 9 régions déterminées par les programmes HYDRO 3 et ACRO comme potentiellement antigéniques n'ont pas été reconnues dans l'étude décrite précédemment, il s'agit des régions 15-28, 8396, 99-112, 106-119, 123-136, 134-147, 153-166, 198-211 et 212-225 décrite par Pollard et Cohen (1990).<tb><SEP> PEPTIDE
<tb><SEP> 1-11 <SEP> 35-58 <SEP> 258-282
<tb> Scale <SEP> of <SEP> mobility <SEP> Karplus <SEP> and <SEP> + <SEP> - <SEP> +
<tb><SEP> Schultz <SEP> (1985)
<tb> Scale <SEP> of Hydrophilicity, <SEP> Parker <SEP> +/- <SEP> - <SEP> +
<tb><SEP> and <SEP> in (1986) <SEP>
<tb> Scale <SEP> of hydrophilicity <SEP> according to
<tb><SEP> the <SEP> program <SEP> HYDRO <SEP> 3 <SEP> of <SEP> Hopp <SEP> - <SEP> + <SEP>
<tb><SEP> (1986)
<tb> Scale <SEP> of acrophilicity <SEP> according to <SEP>
<tb><SEP> program <SEP> ACRO <SEP> from <SEP> Hopp <SEP> (1886) <SEP><SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP>
<Tb>
The HYDRO 3 program (Hopp, 1986) based on hydrophilicity indicates that the 43-56 sequence might contain an antigenic site of the U1A protein (Pollard and Cohen, 1990). This site is however not noticed using the Parker et al. hydrophilicity scale, Karplus and Scultz mobility scale, or Hopp acrolegality scale (ACRO). Regions 1-11 and 258282 are not highlighted with programs
HYDRO 3 and ACRO and 9 regions determined by the programs HYDRO 3 and ACRO as potentially antigenic have not been recognized in the study described previously, these are the regions 15-28, 8396, 99-112, 106-119 , 123-136, 134-147, 153-166, 198-211 and 212-225 described by Pollard and Cohen (1990).
Ces résultats illustrent les limites des échelles de prédiction antigénique, en particulier lorsqu'elles sont appliquées aux autoantigènes RNP. These results illustrate the limitations of antigenic prediction scales, particularly when applied to RNP autoantigens.
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C Cys cystéine
D Asp acide aspartique
E Glu acide glutamique
F Phe phenylalanine
G Gly glycine
H His histidine
I Ile isoleucine
K Lys lysine
L Leu leucine
M Met methionine
N Asn asparagine
P Pro proline
Q Gln glutamine
R Arg arginine
S Ser serine
T Thr thréonine
V Val valine
W Trp tryptophane
Y Tyr tyrosine Symbols of amino acids
Ala alanine
Cysteine Cysteine
D Asp aspartic acid
E Glu glutamic acid
F Phenylalanine
Gly glycine
H his histidine
I Isoleucine Island
K Lily lysine
Leucine leucine
M Met methionine
N Asn asparagine
P Pro proline
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R Arg arginine
Serin serine
TH threonine
Valine Valley
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Tyr Tyrosine Y
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Cited By (5)
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