FR2676456A1 - Thermostable variants of Bacillus licheniformis alpha -amylase, process for preparing them and their use - Google Patents
Thermostable variants of Bacillus licheniformis alpha -amylase, process for preparing them and their use Download PDFInfo
- Publication number
- FR2676456A1 FR2676456A1 FR9105740A FR9105740A FR2676456A1 FR 2676456 A1 FR2676456 A1 FR 2676456A1 FR 9105740 A FR9105740 A FR 9105740A FR 9105740 A FR9105740 A FR 9105740A FR 2676456 A1 FR2676456 A1 FR 2676456A1
- Authority
- FR
- France
- Prior art keywords
- amylase
- variant
- alpha
- bacillus licheniformis
- amino acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12C—BEER; PREPARATION OF BEER BY FERMENTATION; PREPARATION OF MALT FOR MAKING BEER; PREPARATION OF HOPS FOR MAKING BEER
- C12C5/00—Other raw materials for the preparation of beer
- C12C5/004—Enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12C—BEER; PREPARATION OF BEER BY FERMENTATION; PREPARATION OF MALT FOR MAKING BEER; PREPARATION OF HOPS FOR MAKING BEER
- C12C9/00—Methods specially adapted for the making of beerwort
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2411—Amylases
- C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
- C12N9/2417—Alpha-amylase (3.2.1.1.) from microbiological source
Landscapes
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
L'invention a pour objet de nouvelles alpha-amylases thermostables, leur procédé de préparation ainsi que leur utilisation dans les industries textile, papetière et en brasserie. The subject of the invention is new thermostable alpha-amylases, their preparation process and their use in the textile, paper and brewery industries.
Sous le terme générique d'amylase, on désigne toute activité enzymatique capable d'hydrolyser tout ou partie des liaisons alpha 1-4 ou alpha 1-6 de l'amidon. The generic term "amylase" denotes any enzymatic activity capable of hydrolyzing all or part of the alpha 1-4 or alpha 1-6 bonds of the starch.
Dans la pratique industrielle, on utilise une alpha-amylase dite enzyme liquéfiante, afin d'hydrolyser l'amidon après l'avoir transformé en empois par chauffage à une température supérieure à 95"C. Ce type d'activité enzymatique hydrolyse les liaisons alpha-amylase 1,4 glucosidiques, caractéristiques de l'amylose et du l'amylopectine. L'usage d'une alpha-amylase thermostable présente un intérêt immédiat dans la mesure où il évite d'avoir à refroidir l'empois avant de l'y ajouter. D'autre part, l'opération de liquéfaction ne peut s'effectuer qu'après l'empesage ou gélification de l'amidon natif, après qu'il ait été débarassé de ses constituants solubles par trempage.La gélification s'effectue à des températures de l'ordre de 100 à 115"C. I1 est donc souhaitable de pouvoir disposer d'une amylase qui possède des caractéristiques de thermorésistance accrue, afin notamment de pouvoir effectuer simultanément ou à des température proches les deux opérations d'empesage et de liquéfaction. In industrial practice, a so-called liquefying enzyme alpha-amylase is used to hydrolyze the starch after it has been converted into starch by heating to a temperature above 95 ° C. This type of enzymatic activity hydrolyzes the alpha bonds -amylase 1,4 glycosides, characteristics of amylose and amylopectin The use of a thermostable alpha-amylase is of immediate interest in that it avoids having to cool the starch before the On the other hand, the liquefaction operation can be carried out only after the starching or gelling of the native starch, after it has been stripped of its soluble constituents by soaking. performs at temperatures of the order of 100 to 115 ° C. It is therefore desirable to have an amylase which has enhanced thermoresistance characteristics, in particular to be able to perform simultaneously or at similar temperatures the two operations of setting and liquefaction.
En outre, un acroissement de la température réactionnelle permet d'augmenter la cinétique enzymatique et de diminuer la viscosité du mélange. In addition, an increase in the reaction temperature makes it possible to increase the enzymatic kinetics and to reduce the viscosity of the mixture.
La société danoise Novo commercialise, sous l'appellation
Termamyl, une alpha-amylase thermostable produite par fermentation d'une souche de Bacillus licheniformis.The Danish company Novo markets, under the name
Termamyl, a heat-stable alpha-amylase produced by fermentation of a strain of Bacillus licheniformis.
Cette enzyme est sécrétée dans le milieu de culture. En l'absence de tout protecteur (ion Ca ++ et amidon), elle conserve 90 % de son activité après 10 minutes à 80"C. En présence d'ions Ca 0,1 M, elle est stable à 100 % à 90"C pendant 15 minutes (Rosendal P., Nielsen B.H.,
Lange NK (1972) Stability of bacterial alpha-amylase in the starch liquefaction process. Die Starie 31, 368-372). This enzyme is secreted in the culture medium. In the absence of any protector (Ca ++ ion and starch), it retains 90% of its activity after 10 minutes at 80 ° C. In the presence of 0.1 M Ca ions, it is 100% stable at 90 ° C. C for 15 minutes (Rosendal P., Nielsen BH,
Lange NK (1972) Stability of bacterial alpha-amylase in the starch liquefaction process. Die Starie 31, 368-372).
D'autre part, les publications françaises de brevet FR-A-2 533 583 et FR-A-2 537 602 décrivent le clonage du gène de Bacillus licheniformis codant pour l'alpha-amylase thermostable et son expression par Escherichia coli et Bacillus subtilis, le gène étant localisé sur un plasmide multicopies. Synthétisée par ces deux microorganismes, l'aphaamylase conserve toutes ses propriétés inchangées : poids moléculaire, thermostabilité, activité spécifique en fonction du pH, propriétés immunologiques. Le gène a été séquencé et sa séquence, ainsi que la séquence d'acides aminés correspondante, sont indiquées à la figure 1. On the other hand, the French patent publications FR-A-2,533,583 and FR-A-2,537,602 describe the cloning of the Bacillus licheniformis gene encoding heat-stable alpha-amylase and its expression by Escherichia coli and Bacillus subtilis. , the gene being localized on a multicopy plasmid. Synthesized by these two microorganisms, aphaamylase retains all its unchanged properties: molecular weight, thermostability, specific activity as a function of pH, immunological properties. The gene was sequenced and its sequence, as well as the corresponding amino acid sequence, are shown in Figure 1.
Les inventeurs ont maintenant mis au point des variants de l'alpha-amylase dont la séquence est représentée à la figure 1, pour lesquels les propriétés intéressantes de l'alpha-amylase de Bacillus licheniformis sont maintenues et qui en outre présentent, par rapport à la forme naturelle, des caractéristiques de thermostabilité accrues. The inventors have now developed variants of alpha-amylase, the sequence of which is shown in FIG. 1, for which the interesting properties of Bacillus licheniformis alpha-amylase are maintained and which, in addition, have the natural form, increased thermostability characteristics.
L'invention a donc tout d'abord pour objet un variant thermostable de l'alpha-amylase de Bacillus licheniformis caractérisé en ce que, par rapport à la séquence d'acides aminés représentée à la figure 1, sa séquence comporte au voisinage de l'histidine (His) en position 133 au moins une substitution par un acide aminé plus hydrophobe que His, et/ou au voisinage de l'Alanine (Ala) en position 209 au moins une substitution par un acide aminé plus hydrophobe que Ala. Le terme "au voisinage de" désigne aussi bien les positions His ou Ala elles-mêmes que quelques acides aminés situés de part et d'autre de ces positions. The invention therefore firstly relates to a thermostable variant of Bacillus licheniformis alpha-amylase, characterized in that, with respect to the amino acid sequence shown in FIG. histidine (His) at position 133 at least one substitution by an amino acid more hydrophobic than His, and / or in the vicinity of Alanine (Ala) at position 209 at least one substitution with a more hydrophobic amino acid than Ala. The term "in the vicinity of" designates both the His or Ala positions themselves and some amino acids located on either side of these positions.
La séquence présentée à la figure 1 correspond à la séquence mature de l'alpha-amylase, c'est-à-dire après clivage post-traductionnel du peptide signal. The sequence shown in FIG. 1 corresponds to the mature sequence of alpha-amylase, that is to say after post-translational cleavage of the signal peptide.
En ce qui concerne la substitution au voisinage de la position 133, le variant
<tb> <SEP> 133 <SEP> 133
<tb> His <SEP> - > Tyr <SEP>
<tb> est tout particulièrement préféré. I1 faut également citer les variants pour lesquels His est remplacé par un acide aminé choisi parmi Phe, Leu, Tyr, Glu, Lys, Gln.<tb><SEP> 133 <SEP> 133
<tb> His <SEP>-> Tire <SEP>
<tb> is especially preferred. It is also necessary to mention the variants for which His is replaced by an amino acid selected from Phe, Leu, Tyr, Glu, Lys, Gln.
L'invention repose sur la découverte que la région située notamment autour de l'acide aminé 133 est une région importante, sinon essentielle pour la thermostabilité de la protéine. The invention is based on the discovery that the region located in particular around the amino acid 133 is an important region, if not essential for the thermostability of the protein.
Une autre région importante pour la stabilité de l'alpha-amylase se trouve située au voisinage de la position 209 de la protéine mature. En particulier, un ou plusieurs acides aminés naturellement présent en position 209 ou dans son voisinage peut être substitué par un acide aminé choisi notamment parmi Val, Leu, Ile, pour obtenir un variant alpha-amylase thermostable. Another important region for the stability of alpha-amylase is located near the 209 position of the mature protein. In particular, one or more amino acids naturally present in position 209 or in its neighborhood may be substituted by an amino acid chosen in particular from Val, Leu, Ile, to obtain a thermostable alpha-amylase variant.
Pour cette position, une mutation tout particulièrement préférée
209 est celle pour laquelle Ala est substituée par Val209. For this position, a mutation particularly preferred
209 is that for which Ala is substituted by Val209.
Les variants de l'alpha-amylase selon l'invention peuvent contenir une mutation dans une seule des deux régions mentionnées, ou bien dans les deux régions à la fois. The alpha-amylase variants according to the invention may contain a mutation in only one of the two regions mentioned, or in both regions at the same time.
De tels variants doublement mutés possèdent une stabilité accrue à la chaleur par rapport à chacune des amylases variants et une demie vie à 90"C augmentée d'un facteur 9 à 10 par rapport à la forme naturelle. Such doubly mutated variants have increased heat stability relative to each of the variant amylases and a half life at 90 ° C increased by a factor of 9 to 10 over the natural form.
Les variants selon l'invention peuvent être préparés par les techniques de génie génétique, à partir d'un gène de structure modifié par rapport au gène naturel. On utilise à cette fin les techniques courantes de mutagénèse et on prépare un oligonucléotide susceptible de s'hybrider à l'ADNc au voisinage de la position 133. The variants according to the invention can be prepared by genetic engineering techniques, from a structural gene modified with respect to the natural gene. To this end, standard mutagenesis techniques are used and an oligonucleotide capable of hybridizing to the cDNA in the vicinity of position 133 is prepared.
La Demanderesse a également mis au point une stratégie de mutagénèse au hasard, à partir d'un variant thermosensible appelé p841ts (possédant une double mutation en position 164 et 165). The Applicant has also developed a random mutagenesis strategy, from a thermosensitive variant called p841ts (having a double mutation at positions 164 and 165).
L'invention a donc également pour objet un gène codant pour un variant thermostable de l'alpha-amylase conforme à l'invention. Dans un mode de réalisation préféré, l'invention a pour objet un gène qui comprend la séquence d'ADN telle que représentée à la figure 1, sauf que le codon codant pour His est remplacé par un codon codant pour Tyr et/ou le codon codant pour Ala209 est remplacé par un codon codant pour Val209
La séquence de la figure 1 n'est pas reprise dans le corps de la description pour ne pas l'alourdir, mais elle en fait partie intégrante.The subject of the invention is therefore also a gene encoding a thermostable variant of the alpha-amylase according to the invention. In a preferred embodiment, the subject of the invention is a gene which comprises the DNA sequence as shown in FIG. 1, except that the codon encoding His is replaced by a codon encoding Tyr and / or the codon. coding for Ala209 is replaced by a codon coding for Val209
The sequence of Figure 1 is not repeated in the body of the description to not weigh it down, but it is an integral part.
L'invention a également pour objet un vecteur d'expression d'un variant thermostable de l'apha-amylase selon l'invention dans une cellule hôte c'est-à-dire un vecteur qui contient un gène codant pour l'alphaamylase tel que décrit précédemment ainsi que les éléments assurant son expression dans ladite cellule hôte. The subject of the invention is also a vector for the expression of a thermostable variant of apha-amylase according to the invention in a host cell, that is to say a vector which contains a gene coding for alphaamylase such as described above as well as the elements ensuring its expression in said host cell.
Différentes cellules hôtes peuvent être envisagées dans le cadre de l'invention et les éléments assurant l'expression sont choisis en relation avec la cellule hôte. On peut citer plus particulièrement des bactéries, des préférence les bactéries telles que Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis ou E.coli. Different host cells may be envisaged within the scope of the invention and the elements ensuring the expression are chosen in relation to the host cell. There may be mentioned more particularly bacteria, preferably bacteria such as Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis or E. coli.
Suivant une caractéristique avantageuse de l'invention, pour l'expression dans Bacillus subtilis les éléments assurant l'expression du gène codant pour le variant de l'alpha-amylase contiennent la région régulatrice promoteur-SacR située en amont du gène de la lévane saccharase de Bacillus subtilis. Une telle construction est décrite dans la publication de brevet FR-A-2 582 316. Grâce à ce type de construction, l'aîpha-amylase est sécrétée dans le milieu extérieur dans des conditions où elle ne l'est pas naturellement, c'est-à-dire durant la phase exponentielle de croissance. According to an advantageous characteristic of the invention, for the expression in Bacillus subtilis, the elements ensuring the expression of the gene coding for the variant of alpha-amylase contain the promoter-SacR regulatory region located upstream of the levan sucrase gene. of Bacillus subtilis. Such a construction is described in the patent publication FR-A-2,582,316. Thanks to this type of construction, the alpha-amylase is secreted in the external medium under conditions in which it is not naturally present. that is, during the exponential phase of growth.
Plus généralement, on peut utiliser la région régulatrice du gène codant pour l'alpha-amylase de Bacillus licheniformis pour exprimer le gène codant pour le variant selon l'invention dans n'importe quel système hôte. More generally, the regulatory region of the gene coding for Bacillus licheniformis alpha-amylase can be used to express the gene encoding the variant according to the invention in any host system.
L'invention a également pour objet les cellules hôtes transformées par un vecteur d'expression selon l'invention ainsi qu'un procédé de préparation des variants conformes à l'invention, selon lequel on cultive des cellules hôtes telles que définies précédemment dans des conditions de culture appropriées et on récupère le variant obtenu. The subject of the invention is also the host cells transformed with an expression vector according to the invention as well as a process for preparing the variants in accordance with the invention, according to which host cells are cultured as defined above under conditions appropriate culture and the resulting variant is recovered.
Enfin, l'invention a pour objet l'utilisation des variants selon l'invention dans différentes industries textile, papetière, en brasserie, notamment pour l'empesage et la liquéfaction de l'amidon. Finally, the subject of the invention is the use of the variants according to the invention in various textile, paper and brewery industries, in particular for the starch etching and liquefaction.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaitront à la lecture de la description détaillée suivante, en relation avec les figures 1 à 6 qui montrent
- figure 1 : la séquence d'ADN d'un gène de structure de l'apha-amylase thermostable de Bacillus licheniformis ainsi que la séquence d'acides aminés correspondante.Other features and advantages of the invention will appear on reading the following detailed description, in relation to FIGS. 1 to 6 which show
FIG. 1: the DNA sequence of a structural gene of the thermostable apha-amylase of Bacillus licheniformis as well as the corresponding amino acid sequence.
- figure 2 : la structure du plasmide pINA90l. - Figure 2: the structure of the plasmid pINA90l.
- figure 3 : sous forme d'un courbe, l'évolution comparée de la thermostabilité de l'alpha-amylase His133 et du variant Tyr133 en fonction du temps d'incubation à 90"C en présence de 0,1 mM de Cas12. FIG. 3: in the form of a curve, the comparative evolution of the thermostability of the His133 alpha-amylase and of the Tyr133 variant as a function of the incubation time at 90 ° C. in the presence of 0.1 mM of Cas12.
- figure 4 : la meme courbe que la figure 3 avec 1 mM de Caca,. - Figure 4: the same curve as Figure 3 with 1 mM of poop ,.
- figure 5 : la meme courbe que la figure 3 avec 10 mM de Caca,. - Figure 5: the same curve as Figure 3 with 10 mM of poop ,.
- figure 6 : un diagramme représentant la thermostabilité de différents variants en position 133 à des températures variables. FIG. 6: a diagram representing the thermostability of different variants at position 133 at variable temperatures.
- figure 7 : diagramme d'inactivation thermique de l'alphaamylase de B. licheniformis par rapport aux variants p841ts et p841ts
Val209, à 90"C, pH6, 1 mM CaC12. FIG. 7: Thermal inactivation diagram of B. licheniformis alpha-amylase relative to p841ts and p841ts variants
Val209, at 90 ° C, pH6, 1 mM CaCl2.
- figure 8 : diagramme d'inactivation thermique de l'alphaamylase de B. licheniformis et des variants d'alpha-amylase à 90"C et pH6, 1 mM CaCI2. 133
Exemple 1 : Préparation du variant Tyr de l'alpha-amylase thermostable de Bacillus licheniformis.Figure 8: Thermal inactivation diagram of B. licheniformis alpha-amylase and alpha-amylase variants at 90 ° C and pH6, 1 mM CaCl2.
EXAMPLE 1 Preparation of the Tyr Variant of Bacillus licheniformis heat-stable alpha-amylase
1) préparation du gène
On synthétise un oligonucléotide de 25 nucléotides de séquence : 5' TCA GGA GAA TAC CTA ATT AAA GCC CT 3', susceptible de s'hybrider à l'ADN du gène de structure dont la séquence est représentée à la figure 1, et d'y introduire après usage des techniques classiques de mutagénèse dirigée, le codon TAC correspondant à l'acide aminé Tyr à la place du codon CAC correspondant à l'acide aminé His en position 133.1) gene preparation
An oligonucleotide of 25 nucleotides with the following sequence is synthesized: 5 'TCA GGA CTA GAA CTA ATT AAA GCC CT 3', capable of hybridizing to the DNA of the structural gene whose sequence is shown in FIG. 1, and of introduce there after using conventional techniques of site-directed mutagenesis, the TAC codon corresponding to the amino acid Tyr instead of the CAC codon corresponding to the amino acid His in position 133.
Afin de s'assurer qu'aucune modification autre que la mutation désirée n'est intervenue, on isole un fragment du gène de structure généré par les enzymes de restriction Sst II et Cla I encadrant le codon correspondant à l'acide aminé 133, on détermine sa séquence nucléotidique puis on l'introduit dans un gène naturel traité par les mêmes enzymes Sst II et Cla I, afin de reconstituer un gène entier. In order to ensure that no modification other than the desired mutation has occurred, a fragment of the structural gene generated by the restriction enzymes Sst II and Cla I flanking the codon corresponding to amino acid 133 is isolated. determines its nucleotide sequence and is then introduced into a natural gene treated with the same enzymes Sst II and Cla I, in order to reconstitute a whole gene.
Grâce au gène ainsi reconstitué, il est certain que seule la modification effectuée sur la position 133 est présente et confére à la nouvelle enzyme ses propriétés. Thanks to the gene thus reconstituted, it is certain that only the modification performed on position 133 is present and confers on the new enzyme its properties.
2) Préparation du vecteur d'expression
On prépare le plasmide PINTA901 dont la structure est représentée à la figure 2. I1 s'agit d'un vecteur à faible nombre de copies (10 à 40) possédant plusieurs sites de restriction uniques dans le gène de l'alpha-amylase pour faciliter le sous-clonage des fragments mutés. Ce plasmide pINA90î permet l'expression des gènes d'alpha-amylase à un niveau modéré, non toxique pour les cellules, mais suffisamment élevé pour la caractérisation des variants. Il porte l'origine de réplication (ORI) de type ColEl d'un plasmide à faible nombre de copies dérivé de pJRD158 (Davison et al., 1984). Contrairement à pBR322, le gène de résistance à l'ampicilline (Ap) ne contient pas de site PstI.La délétion d'un fragment
Xhol-SalI a permis aussi d'éliminer le site SalI de pJRD158. On introduit un fragment EcoRI-HindIII de 2,9 kb portant le gène codant pour l'alphaamylase sauvage (Amy). Ainsi construit, ce vecteur possède 8 sites de restriction uniques qui partagent le gène amylase en segments de 120 à 600 kb et facilitent ainsi le sous-clonage de fragments mutés. On remplace ensuite le gène codant pour I'alpha-amylase par le gène préparé précédemment.2) Preparation of the expression vector
The plasmid PINTA901, the structure of which is shown in FIG. 2, is prepared. It is a low copy number vector (10 to 40) having several unique restriction sites in the alpha-amylase gene for ease of use. subcloning the mutated fragments. This plasmid pINA901 allows the expression of alpha-amylase genes at a moderate level, which is nontoxic for the cells but high enough for the characterization of the variants. It carries the ColEl origin of replication (ORI) of a low copy number plasmid derived from pJRD158 (Davison et al., 1984). Unlike pBR322, the ampicillin resistance gene (Ap) does not contain a PstI site. The deletion of a fragment
Xhol-SalI also eliminated the SalI site from pJRD158. A 2.9 kb EcoRI-HindIII fragment carrying the gene encoding wild-type alpha-amylase (Amy) is introduced. Thus constructed, this vector has 8 unique restriction sites that share the amylase gene in 120 to 600 kb segments and thus facilitate the subcloning of mutated fragments. The gene coding for alpha-amylase is then replaced by the previously prepared gene.
3) Expression du gène dans une souche de E.Coli
On transforme une souche de E.Coli avec le plasmide préparé précédemment. Les cellules sont mises en culture en milieu liquide LB (Luria Broth) avec 100 mg/l d'ampicilline, puis elles sont reprises dans 1/2 volume de saccharose 25 % et agitées pendant 15 minutes à 20"C, puis de nouveau 15 minutes à 20"C en présence de saccharose 25 %, EDTA 10 mM.3) Expression of the gene in a strain of E.Coli
An E. coli strain is transformed with the previously prepared plasmid. The cells are cultured in LB liquid medium (Luria Broth) with 100 mg / l of ampicillin, then they are taken up in 1/2 volume of 25% sucrose and stirred for 15 minutes at 20 ° C., and then again. minutes at 20 ° C in the presence of 25% sucrose, 10 mM EDTA.
Après centrifugation, les cellules sont reprises dans l'eau glacée et centrifugée après 20 minutes à 0 C. After centrifugation, the cells are taken up in ice water and centrifuged after 20 minutes at 0 C.
4) Détermination des caractéristiques du variant obtenu. 4) Determination of the characteristics of the variant obtained.
La thermostabilité se définit comme étant l'activité amylolytique résiduelle après chauffage. Thermostability is defined as residual amylolytic activity after heating.
L'activité amylolytique est mesurée par l'action dextrinifiante de l'enzyme. On utilise la méthode à l'iode en mesurant la densité optique à 620 nm d'une solution d'amidon à I % (pH = 5.8), en présence d'une solution iodo-iodurée. Les unités sont exprimées en DO par rapport à un témoin sans incubation. Amylolytic activity is measured by the dextrinizing action of the enzyme. The iodine method is used by measuring the optical density at 620 nm of a 1% starch solution (pH = 5.8) in the presence of an iodine-iodide solution. The units are expressed in OD relative to a control without incubation.
Un aliquot de surnageant de culture est soumis à l'action de la température pendant un temps donné et on mesure l'activité enzymatique résiduelle. An aliquot of culture supernatant is subjected to the action of the temperature for a given time and the residual enzymatic activity is measured.
L'activité amylolytique résiduelle est exprimée en pourcentage de l'activité par rapport à l'activité d'un aliquot non traité. Residual amylolytic activity is expressed as a percentage of activity relative to the activity of an untreated aliquot.
La détermination de la demi-vie de la protéine obtenue est effectuée à 90"C, dans un tampon acétate de sodium 50 mM, pH 6. Elle dépend de la concentration en Ca ++ dans le milieu. L'ion Calf n'intervient pas dans la réaction catalytique mais joue un rôle structurel pour le maintien d'une structure biologiquemernt active. The determination of the half-life of the protein obtained is carried out at 90 ° C., in a 50 mM sodium acetate buffer, pH 6. It depends on the concentration of Ca ++ in the medium.The Calf ion does not intervene not in the catalytic reaction but plays a structural role for the maintenance of a biologically active structure.
Les résultats obtenus pour dlfférentes concentrations d'ions Ca ++ sont illustrés par les figures 3 à 5
- pour une concentration de 0,1 mM Cas12, les demi-vies sont 133 respectivement de 8 et 5 minutes pour le variant Tyr et la forme naturelle.The results obtained for different concentrations of Ca ++ ions are illustrated in FIGS.
for a concentration of 0.1 mM Cas12, the half-lives are 133 respectively of 8 and 5 minutes for the variant Tyr and the natural form.
- pour une concentration de 1 mM CaC12 les demi-vies sont respectivement de 200 et 55 minutes. for a concentration of 1 mM CaCl 2 the half-lives are respectively 200 and 55 minutes.
- pour une concentration de 10 mM CaC12, le variant Tyr133 conserve 95 % de son activité après 5 heures à 90"C, contre 50 % pour la forme naturelle. for a concentration of 10 mM CaCl2, the Tyr133 variant retains 95% of its activity after 5 hours at 90 ° C., compared to 50% for the natural form.
Exemple 2 : Préparation d'autres variants en position 133.Example 2: Preparation of other variants in position 133
On procède comme indiqué à l'exemple 1, sauf que la mutagénèse est est effectuée de façon à remplacer le codon codant pour His par un codon codant respectivement pour Ala(A), Glu(E), Pro(P), Lys(K), Leu(L),
Ser(S), Gln(Q), Gly(G), Phe(F). The procedure is as in Example 1, except that the mutagenesis is carried out so as to replace the codon coding for His by a codon coding respectively for Ala (A), Glu (E), Pro (P), Lys (K). ), Leu (L),
Ser (S), Gln (Q), Gly (G), Phe (F).
La figure 6 indique les résultats de thermostabilité (activité résiduelle après chauffage) obtenus pour ces différents variants. Elle permet en outre de constater une relation entre le degré d'hydrophobicité de l'acide aminé substitué et la thermostabilité du variant de l'alpha-amylase obtenu. Il apparaît que les variants comportant à la position 133 une substitution par un acide aminé plus hydrophobe que His présentent effectivement une thermostabilité accrue par rapport à la forme naturelle. Figure 6 shows the thermostability results (residual activity after heating) obtained for these different variants. It also makes it possible to observe a relationship between the degree of hydrophobicity of the substituted amino acid and the thermostability of the variant of the alpha-amylase obtained. It appears that the variants having at position 133 a substitution with a more hydrophobic amino acid than His actually exhibit increased thermostability compared to the natural form.
Les variants Pro, Ser, Gly, Ala sont donc indiqués uniquement à titre d'exemples comparatifs. The variants Pro, Ser, Gly, Ala are therefore indicated only as comparative examples.
Exemple 3 : Obtention d'un gène muté de l'alpha-amylase de Bacillus licheniformis exprimant une protéine plus thermostable que la protéine sauvage.EXAMPLE 3 Obtaining a mutated gene of Bacillus licheniformis alpha-amylase expressing a protein that is more thermostable than the wild-type protein.
La nature même de l'enzyme rend difficile l'obtention de variants affectés dans la thermostabilité, en effet une activité amylolytique thermostable ne confère pas un avantage sélectif aux bactéries qui l'expriment, ce qui rend difficile l'usage de cribles génétiques simples, ou l'utilisation de cribles biologiques, comme il en a été décrit pour l'obtention de variants thermostables de la Kanamicine Nucléotidyltransférase (J. Biol. Chem., 1985, 260, 15298-15303), par l'utilisation de souches bactériennes thermophiles. The very nature of the enzyme makes it difficult to obtain affected variants in thermostability, in fact thermostable amylolytic activity does not confer a selective advantage on the bacteria that express it, which makes the use of simple genetic screens difficult, or the use of biological screens, as has been described for obtaining thermostable variants of Kanamicin Nucleotidyltransferase (J. Biol Chem., 1985, 260, 15298-15303), by the use of thermophilic bacterial strains .
Une stratégie de mutagénèse au hasard à partir d'une forme thermosensible de la protéine a donc été développée, afin d'isoler des mutations intragéniques capables de restaurer tout ou partie de la thermostabilité de la forme sauvage. A strategy of random mutagenesis from a thermosensitive form of the protein has therefore been developed, in order to isolate intragenic mutations capable of restoring all or part of the thermostability of the wild form.
Un tel variant thermosensible a été obtenu par mutagénèse dirigée, il s'agit de la double substitution Asp 164tAla et Trp 1653goy. La cinétique de dénaturation thermique à 90"C de ce variant thermosensible, appelé p841ts, est montrée dans la figure 7. A 90"C en présence de tampon acétate 50 mM contenant CaCl2 1 mM , plus de 90% de l'activité amylolytique est perdue après 8 minutes d'incubation alors que la protéine sauvage en conserve près de 100 %. Such a thermosensitive variant has been obtained by site-directed mutagenesis, it is the double substitution Asp 164tAla and Trp 1653goy. The thermal denaturation kinetics at 90 ° C of this thermosensitive variant, designated p841ts, is shown in Figure 7. At 90 ° C in the presence of 50 mM acetate buffer containing 1 mM CaCl 2, more than 90% of the amylolytic activity is lost after 8 minutes of incubation while the wild protein canned almost 100%.
I1 fallait choisir un système biologique peu sensible à la chaleur et de manipulation aisée pour la mutagénèse, le séquençage des mutants et la production d'amylase. Le système du phage simple brin M13 remplit toutes ces conditions: après un chauffage de 45 minutes à 800C la quasi totalité des particules phagiques reste infectieuse; le gène de l'alphaamylase s'y exprime dans les deux orientations à partir de son propre promoteur ; l'activité amylolytique est facilement repérable sur milieu amidon par la production de halos autour des plages, après coloration à l'iode; les facilités de manipulation tant pour la séquence nucléotidique que pour la mutagénèse sont évidentes. It was necessary to choose a biological system that is not very sensitive to heat and easy to handle for mutagenesis, mutant sequencing and amylase production. The M13 single-strand phage system fulfills all these conditions: after heating for 45 minutes at 800 ° C., almost all the phage particles remain infectious; the alpha-amylase gene is expressed in both orientations from its own promoter; the amylolytic activity is easily identifiable on starch medium by the production of halos around the beaches, after staining with iodine; the handling facilities for both the nucleotide sequence and the mutagenesis are obvious.
La totalité du gène de structure, codant pour le variant thermosensible de l'alpha-amylase p841ts, ainsi que la région promotrice, est cloné, sous forme d'un fragment EcoRI-HindIII de 2,8 Kb dans le phage
M13mp18. Le phage recombinant obtenu est appelé M 13 mpl8 p841ts. La transcription du gène clone est sous le contrôle de son propre promoteur.The entire structural gene, coding for the thermosensitive variant of the alpha-amylase p841ts, as well as the promoter region, is cloned in the form of a 2.8 Kb EcoRI-HindIII fragment in the phage
M13mp18. The recombinant phage obtained is called M13 mpl8 p841ts. The transcription of the cloned gene is under the control of its own promoter.
Les particules phagiques sont mutagénisées à l'hydroxylamine (250 mM, tampon acétate pH6) et utilisées pour infecter E. coli TG1. Les cellules sont étalées sur milieu Luria broth, EDTA 1 mM et incubées une nuit à 37"C. Des aliquotes correspondants à 1-10% de particules phagiques survivantes sont utilisés pour l'expérience. Pour augmenter la sensibilité du test, de 1'EDTA lmM est ajouté au milieu afin de chélater les ions Calcium stabilisateurs de l'amylase. Les boites sont ensuite placées à haute température (80"C pendant 45 mn) et recouvertes d'une seconde couche de milieu LB gélosé, EDTA lmM, contenant 1 % d'amidon soluble. Après 45 minutes d'incubation à 50"C, les boites sont colorées par des vapeurs d'iode.Les phages produisant des amylases thermorésistantes sont détectées par l'apparition d'un halo ; dans ces conditions, I'amylase thermosensible ne produit pas de halo. The phage particles are mutagenized with hydroxylamine (250 mM, pH6 acetate buffer) and used to infect E. coli TG1. The cells are plated on Luria broth medium, 1 mM EDTA and incubated overnight at 37 ° C. Aliquots corresponding to 1-10% of surviving phage particles are used for the experiment. 1mM EDTA is added to the medium in order to chelate the Calcium Amylase Stabilizer ions.The plates are then placed at high temperature (80 ° C for 45 min) and covered with a second layer of LB agar medium, 1 mM EDTA, containing 1% soluble starch. After 45 minutes of incubation at 50 ° C., the plates are stained with iodine vapors. Phages producing heat-resistant amylases are detected by the appearance of a halo, in which case the thermosensitive amylase does not produce of halo.
Parmi 104 phages testés, on a pu isoler un phage produisant une amylase de thermostabilité nettement supérieure à la forme thermosensible. Among 104 phages tested, it was possible to isolate a phage producing a thermostability amylase significantly greater than the thermosensitive form.
Le séquençage des gènes a révélé une mutation suppressive située en dehors du site de mutation d'origine. La substitution Ala209- > Val a été trouvée chez 3 variants indépendants, il est donc probable que seul un petit nombre de positions est susceptible de produire des variants de thermostabilité accrue. Gene sequencing revealed a suppressive mutation located outside the original mutation site. The Ala209-> Val substitution was found in 3 independent variants, so it is likely that only a small number of positions is likely to produce increased thermostability variants.
Introduite dans la protéine sauvage, la substitution Ala209- > Val augmente par un facteur deux la demie vie de la protéine à 90 C, ce qui constitue un gain appréciable pour cette protéine déjà extrêmement therm ostable. Introduced into the wild-type protein, the Ala209-> Val substitution increases by a factor of two the half life of the protein at 90 ° C., which constitutes an appreciable gain for this already extremely heat-sensitive protein.
Cette même stratégie appliquée sur le gène cloné dans l'autre orientation dans le phage M13mp19, ainsi que l'utilisation d'un autre mutagène devrait permettre l'isolement d'autres mutations suppressives, de même que l'utilisation d'un autre variant thermosensible. This same strategy applied to the cloned gene in the other orientation in phage M13mp19, as well as the use of another mutagen should allow the isolation of other suppressive mutations, as well as the use of another variant. thermosensitive.
Exemple 4
Par recombinaison in vitro, des gènes codant pour les protéines variantes Val209 et Tyr133, on a obtenu le variant protéique doublement
Val 133 substitué -Tyr . Les effets de ces deux substitutions sur la thermostabilité de la protéine s'additionnent, la demie vie de l'amylase
Val209 133 -Tyr , testée à 90 C en présence de tampon acétate 50 mM et de
CaCl2 ImM, est de plus de 10 Heures, alors que celles de la protéine sauvage, et de chacun des variants Val209 et Tyr sont respectivement de 1h 30, 3h 30 et 4 heures (figure n 8). Example 4
By in vitro recombination of the genes encoding variant proteins Val209 and Tyr133, the doubled protein variant was obtained.
Val 133 substituted -Tyr. The effects of these two substitutions on the thermostability of the protein add up, the half-life of the amylase
Val209 133 -Tyr, tested at 90 ° C. in the presence of 50 mM acetate buffer and
ImM CaCl2 is greater than 10 hours, while those of the wild-type protein, and of each of Val209 and Tyr variants are respectively 1 h 30, 3 h and 4 h (FIG. 8).
Claims (14)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9105740A FR2676456A1 (en) | 1991-05-13 | 1991-05-13 | Thermostable variants of Bacillus licheniformis alpha -amylase, process for preparing them and their use |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9105740A FR2676456A1 (en) | 1991-05-13 | 1991-05-13 | Thermostable variants of Bacillus licheniformis alpha -amylase, process for preparing them and their use |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2676456A1 true FR2676456A1 (en) | 1992-11-20 |
Family
ID=9412704
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR9105740A Pending FR2676456A1 (en) | 1991-05-13 | 1991-05-13 | Thermostable variants of Bacillus licheniformis alpha -amylase, process for preparing them and their use |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| FR (1) | FR2676456A1 (en) |
Cited By (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1994018314A1 (en) * | 1993-02-11 | 1994-08-18 | Genencor International, Inc. | Oxidatively stable alpha-amylase |
| WO1995010603A1 (en) * | 1993-10-08 | 1995-04-20 | Novo Nordisk A/S | Amylase variants |
| WO1995035382A2 (en) * | 1994-06-17 | 1995-12-28 | Genecor International Inc. | NOVEL AMYLOLYTIC ENZYMES DERIVED FROM THE B. LICHENIFORMIS α-AMYLASE, HAVING IMPROVED CHARACTERISTICS |
| WO1996023873A1 (en) * | 1995-02-03 | 1996-08-08 | Novo Nordisk A/S | Amylase variants |
| US5736499A (en) * | 1995-06-06 | 1998-04-07 | Genencor International, Inc. | Mutant A-amylase |
| US5801043A (en) * | 1993-10-08 | 1998-09-01 | Novo Nordisk A/S | Amylase variants |
| EP0891442A1 (en) * | 1996-04-03 | 1999-01-20 | Participant Project IP Limited | Paper pulp drainage aid |
| US5958739A (en) * | 1996-06-06 | 1999-09-28 | Genencor International Inc. | Mutant α-amylase |
| US6080568A (en) * | 1997-08-19 | 2000-06-27 | Genencor International, Inc. | Mutant α-amylase comprising modification at residues corresponding to A210, H405 and/or T412 in Bacillus licheniformis |
| US6093562A (en) * | 1996-02-05 | 2000-07-25 | Novo Nordisk A/S | Amylase variants |
| US6197070B1 (en) | 1996-05-15 | 2001-03-06 | The Procter & Gamble Company | Detergent compositions comprising alpha combination of α-amylases for malodor stripping |
| EP1707624A2 (en) * | 1993-10-08 | 2006-10-04 | Novozymes A/S | Amylase variants |
| US7713723B1 (en) | 2000-08-01 | 2010-05-11 | Novozymes A/S | Alpha-amylase mutants with altered properties |
| EP2261359A1 (en) | 1998-06-10 | 2010-12-15 | Novozymes A/S | Mannanases |
| EP2500423A3 (en) * | 2003-02-26 | 2012-12-12 | Genencor International, Inc. | Amylases producing an altered immunogenic response and methods of making and using the same |
| WO2023225459A2 (en) | 2022-05-14 | 2023-11-23 | Novozymes A/S | Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections |
-
1991
- 1991-05-13 FR FR9105740A patent/FR2676456A1/en active Pending
Cited By (32)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6297037B1 (en) | 1993-02-11 | 2001-10-02 | Christopher C. Barnett | Oxidatively stable alpha-amylase |
| WO1994018314A1 (en) * | 1993-02-11 | 1994-08-18 | Genencor International, Inc. | Oxidatively stable alpha-amylase |
| WO1995010603A1 (en) * | 1993-10-08 | 1995-04-20 | Novo Nordisk A/S | Amylase variants |
| EP2199386A1 (en) | 1993-10-08 | 2010-06-23 | Novozymes A/S | Amylase variants |
| EP1707624A3 (en) * | 1993-10-08 | 2007-01-03 | Novozymes A/S | Amylase variants |
| US5753460A (en) * | 1993-10-08 | 1998-05-19 | Novo Nordisk A/S | Amylase variants |
| US5801043A (en) * | 1993-10-08 | 1998-09-01 | Novo Nordisk A/S | Amylase variants |
| EP1707624A2 (en) * | 1993-10-08 | 2006-10-04 | Novozymes A/S | Amylase variants |
| WO1995035382A2 (en) * | 1994-06-17 | 1995-12-28 | Genecor International Inc. | NOVEL AMYLOLYTIC ENZYMES DERIVED FROM THE B. LICHENIFORMIS α-AMYLASE, HAVING IMPROVED CHARACTERISTICS |
| WO1995035382A3 (en) * | 1994-06-17 | 1996-02-01 | Gist Brocades Bv | NOVEL AMYLOLYTIC ENZYMES DERIVED FROM THE B. LICHENIFORMIS α-AMYLASE, HAVING IMPROVED CHARACTERISTICS |
| US6939703B2 (en) * | 1994-06-17 | 2005-09-06 | Genencor International, Inc. | Amylolytic enzymes derived from the B.licheniformis α-amylase, having improved characteristics |
| US5830837A (en) * | 1994-11-22 | 1998-11-03 | Novo Nordisk A/S | Amylase variants |
| US6297038B1 (en) | 1995-02-03 | 2001-10-02 | Novozymes A/S | Amylase variants |
| EP1752525A1 (en) * | 1995-02-03 | 2007-02-14 | Novozymes A/S | Amylase variants |
| EP2465930A2 (en) | 1995-02-03 | 2012-06-20 | Novozymes A/S | Amylase variants |
| EP2455468A2 (en) | 1995-02-03 | 2012-05-23 | Novozymes A/S | Amylase variants |
| EP2455465A2 (en) | 1995-02-03 | 2012-05-23 | Novozymes A/S | Amylase Variants |
| US6867031B2 (en) | 1995-02-03 | 2005-03-15 | Novozymes A/S | Amylase variants |
| WO1996023873A1 (en) * | 1995-02-03 | 1996-08-08 | Novo Nordisk A/S | Amylase variants |
| US5736499A (en) * | 1995-06-06 | 1998-04-07 | Genencor International, Inc. | Mutant A-amylase |
| US6093562A (en) * | 1996-02-05 | 2000-07-25 | Novo Nordisk A/S | Amylase variants |
| EP0891442A4 (en) * | 1996-04-03 | 2000-03-01 | Participant Project Ip Limited | Paper pulp drainage aid |
| EP0891442A1 (en) * | 1996-04-03 | 1999-01-20 | Participant Project IP Limited | Paper pulp drainage aid |
| US6197070B1 (en) | 1996-05-15 | 2001-03-06 | The Procter & Gamble Company | Detergent compositions comprising alpha combination of α-amylases for malodor stripping |
| US5958739A (en) * | 1996-06-06 | 1999-09-28 | Genencor International Inc. | Mutant α-amylase |
| US6080568A (en) * | 1997-08-19 | 2000-06-27 | Genencor International, Inc. | Mutant α-amylase comprising modification at residues corresponding to A210, H405 and/or T412 in Bacillus licheniformis |
| EP2284272A1 (en) | 1998-06-10 | 2011-02-16 | Novozymes A/S | Mannanases |
| EP2287318A1 (en) | 1998-06-10 | 2011-02-23 | Novozymes A/S | Mannanases |
| EP2261359A1 (en) | 1998-06-10 | 2010-12-15 | Novozymes A/S | Mannanases |
| US7713723B1 (en) | 2000-08-01 | 2010-05-11 | Novozymes A/S | Alpha-amylase mutants with altered properties |
| EP2500423A3 (en) * | 2003-02-26 | 2012-12-12 | Genencor International, Inc. | Amylases producing an altered immunogenic response and methods of making and using the same |
| WO2023225459A2 (en) | 2022-05-14 | 2023-11-23 | Novozymes A/S | Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3025627B2 (en) | Liquefied alkaline α-amylase gene | |
| EP0605040B1 (en) | Pullulanase, micro-organisms producing the same, method for preparation thereof as well as its use | |
| EP1066374B1 (en) | Amylolytic enzyme variants | |
| FR2676456A1 (en) | Thermostable variants of Bacillus licheniformis alpha -amylase, process for preparing them and their use | |
| JP3086249B2 (en) | Mutant α-amylase derived from bacteria having high heat, acid and / or alkali stability | |
| JPH11506941A (en) | Mutant α-amylase | |
| Saha et al. | Purification and characterization of a highly thermostable novel pullulanase from Clostridium thermohydrosulfuricum | |
| EP2295563B1 (en) | Beta-amylase, gene coding therefor and manufacturing method thereof | |
| Ara et al. | Purification and characterization of an alkaline amylopullulanase with both α-1, 4 and α-1, 6 hydrolytic activity from alkalophilic Bacillus sp. KSM-1378 | |
| EP1199356B2 (en) | Highly productive alpha-amylases | |
| Lo et al. | Deletion analysis of the C-terminal region of the α-amylase of Bacillus sp. strain TS-23 | |
| JP2002519054A (en) | Starch debranching enzyme | |
| JPH10508475A (en) | Tripeptidyl aminopeptidase | |
| EP1002062B1 (en) | Starch conversion process using thermostable isoamylases from sulfolobus | |
| JP3025625B2 (en) | Alkaline pullulanase gene having alkaline α-amylase activity | |
| FR2665178A1 (en) | Heat-stable variants of the alpha-amylase of Bacillus licheniformis, process for their preparation and their use | |
| WO1995034645A1 (en) | Hyperthermostable protease gene | |
| JP4495789B2 (en) | Mutant pullulanase | |
| JP4372986B2 (en) | Alkaline pullulanase | |
| WO2020213604A1 (en) | NOVEL β-AMYLASE AND METHOD FOR UTILIZATION AND PRODUCTION THEREOF | |
| KR102312807B1 (en) | Amylases having resistance to starch decomposition activity in Bifidobacterium and uses thereof | |
| KR102312806B1 (en) | Amylases having resistance to starch decomposition activity derived from Bifidobacterium genus and uses thereof | |
| BE1007723A6 (en) | Pullulanase, micro-organisms producing same, methods for preparing saidpullulanase and uses thereof | |
| WO2020145288A1 (en) | Heat-resistant isoamylase | |
| BE1007313A3 (en) | Pullulanase, micro-organisms producing same, methods for preparing saidpullulanase and uses thereof |