FR2673952A1 - MEANS FOR THE IN VITRO DIAGNOSIS OF COMPONENTS OF CYTOPLASMIC GRANULES AND BIOLOGICAL APPLICATIONS. - Google Patents

Abstract

The invention relates to means for the detection of constituents of cytoplasmic granules secreted by "helper" T cells or cytotoxic cells in particular for the detection of granzyme or perforine, characterised in that said means are monoclonal antibodies recognizing specifically an epitope of such constituents by giving rise to an immunologic reaction of the antigen-antibody type.

Description

MOYENS POUR LE DIAGNOSTIC IN VITRO DE CONSTITUANTS DE
GRANULES CYTOPLASMIQUES
ET APPLICATIONS BIOLOGIQUES
L'invention concerne des moyens pour le diagnostic invitro de constituants des cellules cytotoxiques et des cellules T "helper" jouant un rôle dans la réponse immunitaire d'un organisme.MEANS FOR THE IN VITRO DIAGNOSIS OF CONSTITUENTS OF
CYTOPLASMIC GRANULES
AND BIOLOGICAL APPLICATIONS
The invention relates to means for the in vitro diagnosis of constituents of cytotoxic cells and of helper T cells playing a role in the immune response of an organism.

Le système immunitaire est capable de répondre spécifiquement ou non à l'introduction dans l'organisme d'antigènes viraux, bactériens ou allogéniques. Deux types de cellules sont responsables de la neutralisation et de l'élimination de ces différents antigènes : les lymphocytes
B et les lymphocytes T. Ces cellules assurent les deux formes de la réponse immunitaire : la réponse humorale, médiée par les cellules B, et la réponse cellulaire, médiée par au moins deux populations cellulaires, à savoir les lymphocytes T cytotoxiques (CTLs), et les cellules "natural killer" (NK).The immune system is capable of responding specifically or not to the introduction into the body of viral, bacterial or allogenic antigens. Two types of cells are responsible for neutralizing and eliminating these different antigens: lymphocytes
B and T lymphocytes These cells provide the two forms of the immune response: the humoral response, mediated by B cells, and the cellular response, mediated by at least two cell populations, namely cytotoxic T lymphocytes (CTLs), and "natural killer" (NK) cells.

Dans la cytotoxicité à médiation cellulaire, deux processus de lyse ont été décrits. L'un comporte la sécrétion par les cellules effectrices (CTLs et cellules
NK) de protéines cytolytiques en l'absence de seconds messagers intracellulaires. Le deuxième processus, appelé lyse régulée, comprend le stockage des protéines lytiques ou associées à la lyse dans les granules cytoplasmiques, en grande quantité, et leur sécrétion seulement après activation des récepteurs de surface des cellules effectrices et production de seconds messagers intracellulaires.In cell-mediated cytotoxicity, two lysis processes have been described. One involves secretion by effector cells (CTLs and cells
NK) of cytolytic proteins in the absence of second intracellular messengers. The second process, called regulated lysis, involves the storage of lytic or lysis-associated proteins in cytoplasmic granules, in large quantities, and their secretion only after activation of the surface receptors of effector cells and production of second intracellular messengers.

Dans ces granules, différentes protéines ont été identifiées, parmi lesquelles, la perforine ou protéine qui forme des pores, une famille de protéases que l'on appelle les granzymes, et les protéoglycanes, protéines de haut poids moléculaire, chargées du transport soit de la perforine, soit des granzymes, vers la membrane cellulaire.  In these granules, various proteins have been identified, among which, the perforin or protein which forms pores, a family of proteases which are called granzymes, and proteoglycans, proteins of high molecular weight, responsible for the transport of either perforin, or granzymes, to the cell membrane.

Au cours de l'interaction de l'effecteur avec sa cible et de son activation, il se produit une exocytose des vésicules intracytoplasmiques granulaires qui sécrètent leur contenu dans l'espace intercellulaire formé par le contact effecteur/cible, provoquant la lyse de la cellule cible. During the interaction of the effector with its target and its activation, there is an exocytosis of the granular intracytoplasmic vesicles which secrete their content in the intercellular space formed by the effector / target contact, causing the lysis of the cell. target.

La perforine a été isolée à partir d'une lignée cytotoxique chez le rat et chez l'homme. Perforin was isolated from a cytotoxic line in rats and humans.

Les travaux effectués ont permis d'observer qu'en présence de Ca2+, les molécules de perforine polymérisent, s insèrent au niveau de la membrane plasmique de la cellule cible et forment des pores entraînant la destruction des cellules cibles. The work carried out made it possible to observe that in the presence of Ca2 +, the molecules of perforin polymerize, insert themselves at the level of the plasma membrane of the target cell and form pores causing the destruction of the target cells.

Des clones d'ADNc murin et humain ont été isolés,
On a rapporté récemment les séquences génomiques de la perforine chez la souris et l'homme.Murine and human cDNA clones were isolated,
The genomic sequences of perforin have been reported recently in mice and humans.

Quant aux granzymes, de nombreuses équipes ont décrit leur purification à partir de granules de CTLs ou de cellules à activité NK/LAK (lymphokine activated killer). As for granzymes, many teams have described their purification from CTL granules or cells with NK / LAK activity (lymphokine activated killer).

Ils représentent la majorité des protéines des granules intracytoplasmiques (85 n versus 10 % pour la perforine).They represent the majority of proteins in intracytoplasmic granules (85 n versus 10% for perforin).

Differents granzymes ont été isolés et caractérisés chez la souris ainsi que chez l'homme. Plus particulièrement, six granzymes nommés granzymes A à F ont été décrits dans les granules cytoplasmiques de CTLs murins. Un septième granzyme appelé granzyme G a été récemment caractérisé dans les CTLs de souris. Chez l'homme, on a isolé deux granzymes correspondant aux granzymes A et B, et un troisième appelé
H ne correspondant à aucun granzyme murin déjà isolé.Different granzymes have been isolated and characterized in mice as well as in humans. More particularly, six granzymes named granzymes A to F have been described in the cytoplasmic granules of murine CTLs. A seventh granzyme called granzyme G was recently characterized in mouse CTLs. In humans, two granzymes have been isolated corresponding to granzymes A and B, and a third called
H does not correspond to any murine granzyme already isolated.

Les granzymes sont synthétisés sous forme de prémolécules contenant un peptide signal caractéristique des protéines sécrétées ou ayant une localisation granulaire. Cette séquence signal est suivie d'un dipeptide acide d'activation qui est en général Gly-Glu ou Glu-Glu (propeptide) et doit être clivé par une dipepditylpeptidase pour libérer la protéine mature.  The granzymes are synthesized in the form of premolecules containing a signal peptide characteristic of the secreted proteins or having a granular localization. This signal sequence is followed by an acid activating dipeptide which is generally Gly-Glu or Glu-Glu (propeptide) and must be cleaved by a dipepditylpeptidase to release the mature protein.

Il existe une grande homologie entre les différents granzymes, ce qui suggère qu'ils appartiennent à une famille de sérines protéases granulaires. There is a great homology between the different granzymes, which suggests that they belong to a family of granular serine proteases.

Ils contiennent tous les résidus His57, Aspe02 et
Ser195 qui forment la triade catalytique des sérines estérases. Tous les granzymes matures commencent par la séquence N-terminale Ile-Ile-Gly-Gly (résidus 16-19), puis une séquence variable (résidus 20-23), suivie d'une séquence conservée (résidus 24-30). Ce sont des protéines plus ou moins glycolysées. Six résidus Cys conservés forment trois ponts disulfures intra-chaîne.They contain all the residues His57, Aspe02 and
Ser195 which form the catalytic triad of serine esterases. All mature granzymes start with the N-terminal sequence Ile-Ile-Gly-Gly (residues 16-19), then a variable sequence (residues 20-23), followed by a conserved sequence (residues 24-30). These are more or less glycolysed proteins. Six conserved Cys residues form three intra-chain disulfide bridges.

L'approche par la biologie moléculaire a permis d'isoler des gènes codant pour des granzymes exprimés specifiquement dans les CTLs. The molecular biology approach has made it possible to isolate genes coding for granzymes expressed specifically in CTLs.

Plusieurs rôles ont été attribués aux granzymes. Several roles have been assigned to granzymes.

On a rapporté notamment une action indirecte sur la perforine en augmentant son activité lytique, favorisant la fragmentation de l'ADN de la cellule cible.In particular, an indirect action on perforin has been reported by increasing its lytic activity, promoting the fragmentation of the DNA of the target cell.

Ils pourraient également intervenir dans le mecanisme du détachement du CTL de sa cible après la délivrance du coup létal par clivage du complexe TcR/ antigène (TcR = récepteur T à l'antigène) et des autres complexes récepteur/ligands impliqués dans les phénomènes d'adhésion cellulaire. They could also intervene in the mechanism of the detachment of the CTL from its target after the delivery of the lethal blow by cleavage of the TcR / antigen complex (TcR = T receptor for the antigen) and of the other receptor / ligand complexes involved in the phenomena of cell adhesion.

Enfin les granzymes, par protéolyse, pourraient cliver des constituants de la matrice extracellulaire ou des composants du milieu interstitiel et être ainsi impliqués dans les phénomènes de migration et d'infiltration des lymphocytes dans les tissus au cours de processus inflammatoires. Finally, the granzymes, by proteolysis, could cleave constituents of the extracellular matrix or components of the interstitial medium and thus be involved in the phenomena of migration and infiltration of lymphocytes into the tissues during inflammatory processes.

D'autres protéines ont été caractérisées dans les granules de CTLs et de cellules "NK" : il s'agit des proteoglycanes. Ces molecules joueraient notamment un rôle dans le "packaging" de la perforine et des granzymes. Elles peuvent également constituer une sorte de barrière protectrice de la face interne des granules sécrétoires, protégeant ainsi la cellule cytotoxique des effets de ses propres molécules lytiques.  Other proteins have been characterized in the granules of CTLs and "NK" cells: these are proteoglycans. These molecules are said to play a role in the "packaging" of perforin and granzymes. They can also constitute a sort of protective barrier on the internal surface of the secretory granules, thus protecting the cytotoxic cell from the effects of its own lytic molecules.

La perforine et les granzymes ont été très étudiés au niveau de leur expression génique par les techniques de
Northern Blot et de Dot Blot et plus récemment par la technique d'hybridation in site utilisant des ribosondes spécifiques.Perforin and granzymes have been extensively studied in terms of their gene expression by the techniques of
Northern Blot and Dot Blot and more recently by the in-site hybridization technique using specific riboprobes.

Les études réalisées invitro et, in vive en situation pathologique chez la souris et chez l'homme, montrent que ces gènes sont inductibles au cours de l'activation cellulaire de lymphocytes T, de cellules présentant une activité NK/LAK et ce, de façon précoce. The studies carried out invitro and, in vivo in a pathological situation in mice and in humans, show that these genes are inducible during the cellular activation of T lymphocytes, of cells exhibiting NK / LAK activity, precocious.

Chez l'homme, l'expression des gènes des granzymes et de la perforine a pu être observée dans différentes situations pathologiques comme les désordres hématologiques, les maladies auto-immunes, les maladies dermatologiques et les maladies infectieuses parasitaires, bactériennes ou virales. Enfin, les ARNm des granzymes et ou de la perforine ont pu être détectés par hybridation in site au site de plusieurs types d'allogreffes.In humans, the expression of the genes of granzymes and perforin has been observed in different pathological situations such as hematological disorders, autoimmune diseases, dermatological diseases and parasitic, bacterial or viral infectious diseases. Finally, the mRNAs of granzymes and or of perforin could be detected by in-site hybridization at the site of several types of allografts.

L'expression du gène du granzyme B a été observée au niveau des cellules infiltrant des allogreffes de reins. Expression of the granzyme B gene has been observed in cells infiltrating kidney allografts.

L'expression des gènes du granzyme B et/ou de la perforine a pu être détectée dans les cellules préférentiellement
CD8+ dans les infiltrats lymphocytaires de biopsies endomyocardiques réalisées chez des patients présentant un rejet. Une étude similaire a été réalisée au niveau de biopsies de peaux de patients atteints de GVH (Graft versus host reaction) après greffe de moelle allogénique HLA génoou phéno-identique.Expression of granzyme B and / or perforin genes could be detected in cells preferentially
CD8 + in lymphocyte infiltrates from endomyocardial biopsies performed in patients with rejection. A similar study was carried out on the biopsies of the skin of patients with GVH (Graft versus host reaction) after genogenic or pheno-identical HLA allogeneic marrow transplantation.

Les études réalisées ont permis d'observer lors de la suspicion d'un rejet au cours d'une greffe d'organe (coeur, rein) ou d'une GVH après greffe de moelle osseuse, la présence d'infiltrats lymphocytaires "silencieux" détectés par l'histologie, caractérisés phénotypiquement par l'immunohistochimie et qui sont néanmoins dépourvus de l'expression des messagers des granzymes et de la perforine. L'interprétation de tels résultats demeure une interrogation et soulève de nombreuses questions en relation avec l'état d'immunisation des cellules de ces infiltrats, l'effet du traitement immunosuppresseur et la fonction réelle de ces cellules. Seul le suivi des patients dans le temps devrait permettre d'étudier l'évolution de ces infiltrats cellulaires, leur devenir et leur relation à l'évolution du processus de rejet ou de GVH en fonction du traitement administré. The studies carried out made it possible to observe during the suspicion of a rejection during an organ transplant (heart, kidney) or a GVH after bone marrow transplant, the presence of "silent" lymphocyte infiltrates detected by histology, phenotypically characterized by immunohistochemistry and which are nevertheless devoid of the expression of the messengers of granzymes and perforin. The interpretation of such results remains a question and raises many questions in relation to the state of immunization of the cells of these infiltrates, the effect of the immunosuppressive treatment and the real function of these cells. Only monitoring patients over time should make it possible to study the evolution of these cellular infiltrates, their fate and their relationship to the evolution of the rejection or GVH process depending on the treatment administered.

On mesure donc l'intérêt de la recherche de l'expression génique des granzymes et de la perforine au cours de l'activation cellulaire et/ou cytotoxique invivo.  We therefore measure the value of the search for gene expression of granzymes and perforin during cell activation and / or cytotoxic invivo.

La plupart des études effectuées ont été réalisées par Northern Blot, Dot Blot, hybridation insitu. Bien qu'informatives, ces techniques sont lourdes et ne permettent en aucun cas d'étudier un grand nombre de patients avec le suivi nécessaire à la connaissance de l'évolution de leur pathologie. Most of the studies carried out have been carried out by Northern Blot, Dot Blot, hybridization insitu. Although informative, these techniques are cumbersome and in no case make it possible to study a large number of patients with the follow-up necessary to know the evolution of their pathology.

Les infiltrats lymphocytaires détectés par l'histologie restent en fait le seul critère opérationnel sur lequel s'appuient les cliniciens pour confirmer le diagnostic clinique, qu'il s'agisse de rejet ou de GVH dans le cas des allogreffes. The lymphocyte infiltrates detected by histology remain in fact the only operational criterion on which clinicians rely to confirm the clinical diagnosis, whether rejection or GVHD in the case of allografts.

Il est clair que dans toutes ces applications à la clinique, au lieu de détecter des messagers des granzymes et de la perforine, il serait plus aisé de détecter les protéines à l'aide d'anticorps. It is clear that in all of these clinical applications, rather than detecting messengers of granzymes and perforin, it would be easier to detect proteins using antibodies.

L'aspect fondamental qui implique la compréhension du rôle biologique des granzymes et de la perforine requiert également une analyse fine et efficace à l'aide d'anticorps. The fundamental aspect which involves understanding the biological role of granzymes and perforin also requires a fine and efficient analysis using antibodies.

Mettant à profit leur avance technique dans ce domaine et leur grande maîtrise des techniques d'isolement et de purification des granzymes et de la perforine, les inventeurs ont développé de nouveaux outils permettant de diagnostiquer la présence de constituants des granules cytoplasmiques dans des échantillons biologiques à étudier. Taking advantage of their technical advance in this field and their great mastery of the techniques of isolation and purification of granzymes and perforin, the inventors have developed new tools making it possible to diagnose the presence of constituents of cytoplasmic granules in biological samples to to study.

Utilisant l'approche immunologique pour résoudre les problèmes posés à ce jour, les inventeurs ont produit des anticorps de haute spécificité vis-à-vis des protéines précitées.  Using the immunological approach to solve the problems posed to date, the inventors have produced antibodies of high specificity with respect to the abovementioned proteins.

L'invention a donc pour but de fournir de nouveaux moyens très spécifiques de diagnostic invitro de la présence des constituants des granules évoqués ci-dessus. The invention therefore aims to provide new very specific means of invitro diagnosis of the presence of the constituents of the granules mentioned above.

Elle vise également une méthode de diagnostic permettant de simplifier la détection de ces produits en recherche clinique et fondamentale. It also aims at a diagnostic method making it possible to simplify the detection of these products in clinical and fundamental research.

Les anticorps de l'invention, qui sont dirigés contre les constituants des granules cytoplasmiques de cellules T "helper" ou des cellules cytotoxiques, plus spécialement des lymphocytes T cytotoxiques et des cellules "natural killer", sont caractérisés en ce qu'il s'agit d'anticorps monoclonaux capables de reconnaître spécifiquement un épitope d'un constituant donné de ces granules, en particulier un épitope de granzyme ou de la perforine, en donnant lieu à une réaction du type antigène /anticorps. The antibodies of the invention, which are directed against the constituents of cytoplasmic granules of "helper" T cells or of cytotoxic cells, more especially cytotoxic T lymphocytes and "natural killer" cells, are characterized in that they are acts of monoclonal antibodies capable of specifically recognizing an epitope of a given constituent of these granules, in particular an epitope of granzyme or of perforin, giving rise to a reaction of the antigen / antibody type.

L'expression "constituant des granules" telle qu'utilisée dans la description et les revendications recouvre aussi bien la forme native du constituant, qu'une forme recombinante active telle qu'obtenue par les techniques classiques de génie génétique. Ainsi les granzymes ou la perforine auxquels il est fait référence sont soit sous leur forme native, soit sous une forme recombinante. The expression "constituent of granules" as used in the description and the claims covers both the native form of the constituent and an active recombinant form as obtained by conventional techniques of genetic engineering. Thus the granzymes or the perforin to which reference is made are either in their native form, or in a recombinant form.

L'expression "capable de reconnaître spécifiquement un épitope" telle qu'utilisée dans la description et les revendications signifie que les anticorps monoclonaux reagissent avec l'épitope en question en utilisant les techniques immunologiques ELISA, Western
Blot ou Immunoprécipitation décrites dans les exemples.The term "capable of specifically recognizing an epitope" as used in the description and the claims means that the monoclonal antibodies react with the epitope in question using the immunological techniques ELISA, Western
Blot or Immunoprecipitation described in the examples.

Dans une disposition préférée de 1 invention, ces anticorps sont des anticorps monoclonaux anti-granzymes ou anti-perforine humains. In a preferred arrangement of the invention, these antibodies are monoclonal anti-human enzymes or anti-perforin antibodies.

Les anticorps monoclonaux anti-granzymes sont en particulier des anticorps anti-granzyme A ou anti-granzyme
B ou encore anti-granzyme H humains.The monoclonal anti-granzyme antibodies are in particular anti-granzyme A or anti-granzyme antibodies
B or human anti-granzyme H.

Les anticorps monoclonaux de l'invention sont encore caractérisés par le fait qu'ils appartiennent à la classe des IgG et qu'ils sont dirigés contre des protéines de poids moléculaire d'environ 25 à 30 kDa (Granzyme B), 60 kDa (Granzyme A) ou 66 à 75 kDa environ (Perforine). The monoclonal antibodies of the invention are further characterized by the fact that they belong to the class of IgGs and that they are directed against proteins of molecular weight of approximately 25 to 30 kDa (Granzyme B), 60 kDa (Granzyme A) or approximately 66 to 75 kDa (Perforine).

L'invention vise également tout fragment des anticorps monoclonaux ci-dessus dès lors qu'il est capable d'interagir spécifiquement avec un constituant donné desdits granules, en particulier avec un granzyme ou de la perforine. The invention also relates to any fragment of the above monoclonal antibodies as soon as it is capable of interacting specifically with a given constituent of said granules, in particular with a granzyme or perforin.

Les anticorps monoclonaux de l'invention sont également caractérisés par le fait qu'ils sont tels qu'obtenus par sécrétion à partir de souches d'hybridomes résultant de la fusion d'une cellule immortelle de myélome non secréteur avec une cellule productrice d'anticorps dirigés contre un constituant donné de granules de cellules cytotoxiques. The monoclonal antibodies of the invention are also characterized in that they are as obtained by secretion from strains of hybridomas resulting from the fusion of an immortal non-secreting myeloma cell with an antibody-producing cell directed against a given constituent of cytotoxic cell granules.

L'étape de fusion des deux types cellulaires est notamment réalisée selon la technique la plus couramment utilisée à savoir celle de Köhler et Milstein, Nature, vol 256, p. 495, 1975. The step of fusion of the two cell types is in particular carried out according to the most commonly used technique, namely that of Köhler and Milstein, Nature, vol 256, p. 495, 1975.

Les cellules productrices d'anticorps sont des splénocytes. Ces cellules sont récupérées apres immunisation in vive de l'animal avec l'antigène approprié. Antibody producing cells are splenocytes. These cells are recovered after in vivo immunization of the animal with the appropriate antigen.

Pour l'étape d'immunisation, on utilise des protéines purifiées, injectées avec un adjuvant. Des résultats particulièrement satisfaisants sont obtenus en purifiant les constituants des granules cytoplasmiques selon la technique de Krahenbühl et al. dans J. Immunol, 141, 3471-77, 1988. For the immunization step, purified proteins are used, injected with an adjuvant. Particularly satisfactory results are obtained by purifying the constituents of the cytoplasmic granules according to the technique of Krahenbühl et al. in J. Immunol, 141, 3471-77, 1988.

Les cellules immortelles sont des cellules de myélome non sécréteur, ce qui permet d'obtenir des hybridomes ne sécrétant que l'immunoglobuline de la spécificité de la cellule productrice. Immortal cells are non-secreting myeloma cells, which makes it possible to obtain hybridomas secreting only the immunoglobulin of the specificity of the producer cell.

Conformément à la technique classique, les hybridomes obtenus sont mis en culture et clonés selon le procédé de dilution limite. On sélectionne avantageusement les hybridomes dont les surnageants de culture présentent les titres les plus élevés d'anticorps en ELISA. Pour accroître la production d'anticorps, on les injecte à des animaux, par raison de commodité, à des souris, à des rats ou à des lapins et des ascites sont ainsi produites en grande quantité. En variante, les souches d'hybridomes sont maintenues en culture dans des incubateurs à CO2. In accordance with the conventional technique, the hybridomas obtained are cultured and cloned according to the limiting dilution method. Advantageously, hybridomas are selected whose culture supernatants have the highest titers of antibodies in ELISA. To increase the production of antibodies, they are injected into animals, for convenience, mice, rats or rabbits and ascites are thus produced in large quantities. Alternatively, the hybridoma strains are kept in culture in CO2 incubators.

Les anticorps monoclonaux récupérés peuvent être utilisés tels quels ou sont purifiés, par exemple par colonne d'affinité et conservés par congélation, ou éventuellement lyophilisés. The recovered monoclonal antibodies can be used as such or are purified, for example by affinity column and stored by freezing, or optionally lyophilized.

L'invention vise tout spécialement les anticorps monoclonaux produits par les clones appelés GRB 51D, GRA 66D, CE 2.10, déposés à la Collection Nationale de Culture des Microorganismes (CNCM), respectivement sous les numéros I-1060, I-1059, et I-1058, le 12 mars 1991. The invention relates especially to the monoclonal antibodies produced by the clones called GRB 51D, GRA 66D, CE 2.10, deposited in the National Collection of Culture of Microorganisms (CNCM), respectively under the numbers I-1060, I-1059, and I -1058, March 12, 1991.

L'invention vise également les souches d' hybridomes productrices d'anticorps monoclonaux définis ci-dessus et plus spécialement les clones produisant des titres élevés d'anticorps mesurés par test ELISA. The invention also relates to the strains of hybridomas producing monoclonal antibodies defined above and more especially the clones producing high titers of antibodies measured by ELISA test.

Les souches d'hybridomes de l'invention sont caractérisées en ce qu'elles sont formées de cellules hybrides résultant de la fusion de cellules immortelles avec une cellule produisant des anticorps dirigés contre un constituant donné de granules cytoplasmiques de cellules T "helper" ou de cellules cytotoxiques, notamment des anticorps dirigés contre les granzymes ou la perforine. The hybridoma strains of the invention are characterized in that they are formed from hybrid cells resulting from the fusion of immortal cells with a cell producing antibodies directed against a given constituent of cytoplasmic granules of "helper" T cells or cytotoxic cells, including antibodies to granzymes or perforin.

Le procédé d'obtention de ces hybridomes entre également dans le cadre de l'invention. Ce procédé comprend des étapes de fusion et de sélection définies plus haut en rapport avec les anticorps monoclonaux. The process for obtaining these hybridomas also falls within the scope of the invention. This method comprises the fusion and selection steps defined above in relation to the monoclonal antibodies.

Comme indiqué ci-dessus, les protéines contre lesquelles sont dirigés les anticorps monoclonaux de l'invention sont soit des protéines natives, soit des protéines recombinantes. Ces protéines recombinantes sont des produits nouveaux et, en tant que tels, entrent dans le cadre de l'invention. As indicated above, the proteins against which the monoclonal antibodies of the invention are directed are either native proteins or recombinant proteins. These recombinant proteins are new products and, as such, fall within the scope of the invention.

Il s'agit plus spécialement de séquences d'acides aminés renfermant au moins la partie C-terminale active de la protéine mature
En opérant selon les techniques classiques du génie génétique, ces protéines sont produites dans des hôtes cellulaires, notamment dans des bactéries, transformés par introduction de vecteurs d'expression, notamment de plasmides, renfermant les fragments de gène codant pour les séquences d'acides aminés recherchées.More specifically, these are amino acid sequences containing at least the active C-terminal part of the mature protein.
By operating according to conventional techniques of genetic engineering, these proteins are produced in cellular hosts, in particular in bacteria, transformed by introduction of expression vectors, in particular of plasmids, containing the gene fragments coding for the amino acid sequences. wanted.

Ces fragments sont excisés à partir de clones d'ADN codant pour les protéines matures et sont introduits par ligaturation dans un site approprié du vecteur choisi. These fragments are excised from DNA clones encoding the mature proteins and are introduced by ligation into an appropriate site of the chosen vector.

Les protéines exprimées sont récupérées du milieu de culture, après lyse des bactéries, et purifiées. The expressed proteins are recovered from the culture medium, after lysis of the bacteria, and purified.

La mise en oeuvre de ces techniques conduit à l'élaboration d'outils qui constituent des produits nouveaux. Ainsi, les hôtes cellulaires transformés, les vecteurs d'expression tels que plasmides, et fragments d'ADN tels qu'évoqués ci-dessus entrent dans le cadre de l'invention. Celle-ci vise plus spécialement les protéines recombinantes de perforine et de granzyme et les outils mis en oeuvre pour leur expression. The implementation of these techniques leads to the development of tools which constitute new products. Thus, transformed cell hosts, expression vectors such as plasmids, and DNA fragments as mentioned above are within the scope of the invention. This targets more specifically the recombinant proteins of perforin and granzyme and the tools used for their expression.

L'invention vise ainsi un fragment de la séquence de la perforine comportant la partie active C-terminale de la perforine mature de souris, plus spécialement le fragment tel qu'exprimé par le fragment d'ADN SmaI-EcoRV de 1400 pb. L'invention vise en particulier la séquence d'acides aminés s'étendant de la position 98 à 534 sur la figure. Elle vise également le fragment d'ADN capable de coder pour cette séquence d'acides aminés, les vecteurs renfermant un tel fragment d'ADN, en particulier un vecteur plasmidique, ainsi que les bactéries transformées par incorporation de tels vecteurs, en particulier les bactéries transformées mPerf-PL 40 déposées à la C.N.C.M. The invention thus relates to a fragment of the perforin sequence comprising the C-terminal active part of the mature mouse perforin, more especially the fragment as expressed by the DNA fragment SmaI-EcoRV of 1400 bp. The invention relates in particular to the amino acid sequence extending from position 98 to 534 in the figure. It also relates to the DNA fragment capable of coding for this amino acid sequence, the vectors containing such a DNA fragment, in particular a plasmid vector, as well as the bacteria transformed by incorporation of such vectors, in particular bacteria. mPerf-PL 40 transformers deposited at the CNCM

le 12 mars 1991 sous le n" I-1057. March 12, 1991 under No. I-1057.

Comme indiqué ci-dessus, les gènes des granzymes et de la perforine sont inductibles invitro et in vive au cours de l'activation cellulaire en situation normale ou pathologique. Les granzymes apparaissent comme des marqueurs précoces de l'activation cellulaire ; la perforine semble être préférentiellement un marqueur de l'activité cytotoxique d'une cellule. Ces protéines apparaissent donc comme des marqueurs fonctionnels de l'activation cellulaire et/ou cytotoxique. As indicated above, the genes of granzymes and of perforin are inducible invitro and in viva during the cellular activation in normal or pathological situation. Granzymes appear as early markers of cell activation; perforin appears to be preferably a marker for the cytotoxic activity of a cell. These proteins therefore appear as functional markers of cellular and / or cytotoxic activation.

La spécificité élevée des anticorps monoclonaux de l'invention les rend particulièrement précieux pour mettre en évidence la présence de tels marqueurs dans un fluide ou un échantillon biologique. The high specificity of the monoclonal antibodies of the invention makes them particularly valuable for demonstrating the presence of such markers in a fluid or a biological sample.

L'invention vise donc également l'application de ces anticorps monoclonaux en tant que bioréactifs pour le diagnostic in vitro dans un fluide ou échantillon biologique de la présence de constituants des granules cytoplasmiques de cellules T "helper" ou de cellules cytotoxiques plus spécialement de granzymes ou de perforine ou encore, par exemple, de protéoglycanes ou de molécules de type lymphotoxine. The invention therefore also relates to the application of these monoclonal antibodies as bioreagents for the in vitro diagnosis in a fluid or biological sample of the presence of constituents of the cytoplasmic granules of "helper" T cells or of cytotoxic cells more especially of granzymes or perforin or alternatively, for example, proteoglycans or lymphotoxin-like molecules.

Dans cette application, les anticorps monoclonaux sont libres. En variante, ils sont fixés sur un support solide non immunogène. In this application, the monoclonal antibodies are free. Alternatively, they are fixed on a non-immunogenic solid support.

La méthode selon l'invention de diagnostic in vitro de la présence de granzymes ou de perforine ou autre constituant desdits granules cytoplasmiques est caractérisée par le fait qu'elle comprend les étapes suivantes
- on met en contact l'échantillon à tester avec une préparation d'anticorps monoclonaux, ou d'un fragment tel que défini ci-dessus, immobilisé sur un support solide, dans des conditions appropriées pour la production d'un complexe antigène-anticorps avec lesdits constituants, en particulier respectivement avec un granzyme ou la perforine lorsqu'ils sont présents dans l'échantillon, puis on met en évidence la formation d'un tel complexe de type antigèneanticorps.The method according to the invention for in vitro diagnosis of the presence of granzymes or perforin or other constituent of said cytoplasmic granules is characterized in that it comprises the following steps
- the sample to be tested is brought into contact with a preparation of monoclonal antibodies, or of a fragment as defined above, immobilized on a solid support, under conditions suitable for the production of an antigen-antibody complex with said constituents, in particular respectively with a granzyme or perforin when they are present in the sample, then the formation of such a complex of antigen-antibody type is demonstrated.

Pour révéler la réaction immunologique, ledit constituant, plus spécialement le granzyme ou la perforine comporte un groupe marqueur. Il s'agit le plus généralement d'un groupe radioactif. En variante, on utilise un deuxième anticorps couplé à un groupement dont l'activité peut être mesurée telle une enzyme, comme la phosphatase alcaline ou un groupe fluorescent. To reveal the immunological reaction, said constituent, more particularly granzyme or perforin, comprises a marker group. It is most generally a radioactive group. Alternatively, a second antibody is used coupled to a group whose activity can be measured such as an enzyme, such as alkaline phosphatase or a fluorescent group.

Cette méthode de détection permet de révéler avec une grande sensibilité et rapidement la présence desdits constituants, en particulier de granzymes ou de perforine dans un échantillon biologique, notamment de les localiser et de les quantifier par exemple au niveau de biopsies de tissu pathologique, ou de cellules du sang périphérique. This detection method makes it possible to reveal with great sensitivity and quickly the presence of said constituents, in particular of granzymes or of perforin in a biological sample, in particular to locate and quantify them for example at the level of biopsies of pathological tissue, or peripheral blood cells.

Ainsi elle est particulièrement appropriée pour diagnostiquer un rejet dans le cas de transplantation d'organes, (rein, coeur, / poumon, foie, pancréas) et à des fins de diagnostic précoce de GVH Copeau, foie, intestins) dans le cas de greffe de moelle osseuse. Thus it is particularly suitable for diagnosing a rejection in the case of organ transplantation (kidney, heart, / lung, liver, pancreas) and for the purposes of early diagnosis of GVH Chip, liver, intestines) in the case of transplantation bone marrow.

Outre ces applications immunohistologiques, les anticorps monoclonaux de l'invention et leurs fragments, libres ou immobilisés, sont utilisés pour réaliser des diagnostics dans des pathologies où l'évolution de la maladie modifie le taux de granzyme ou de perforine. In addition to these immunohistological applications, the monoclonal antibodies of the invention and their fragments, free or immobilized, are used to carry out diagnostics in pathologies where the course of the disease modifies the level of granzyme or perforin.

Ils pourraient permettre par exemple de suivre le devenir d'une greffe chez un patient, et en particulier les implications du traitement immunosuppresseur qui pourrait être éventuellement modulé. Cette surveillance pourrait être éffectuée par l'étude cinétique des "infiltrats lymphocytaires" présents au niveau de biopsies prélevées au site de la greffe. Ils revêtent également un grand intérêt dans le cas de maladies auto-immunes, dermatologiques, infectieuses (microbiennes, parasitaires ou virales (HIV)). They could, for example, make it possible to follow the fate of a transplant in a patient, and in particular the implications of the immunosuppressive treatment which could possibly be modulated. This surveillance could be carried out by the kinetic study of "lymphocyte infiltrates" present at the level of biopsies taken at the graft site. They are also of great interest in the case of autoimmune, dermatological, infectious (microbial, parasitic or viral (HIV)) diseases.

L'apport des anticorps monoclonaux de l'invention est donc important pour diagnostiquer la présence de cellules activées et/ou cytotoxiques en nombre anormalement élevé au niveau de l'organe atteint, ou au niveau du sang périphérique. The contribution of the monoclonal antibodies of the invention is therefore important for diagnosing the presence of abnormally high activated and / or cytotoxic cells in the affected organ, or in the peripheral blood.

Ils sont également utilisables pour effectuer des études de différenciation cellulaire, les granzymes étant des marqueurs de la différentiation cellulaire T ou B. They can also be used to carry out cell differentiation studies, the granzymes being markers of T or B cell differentiation.

On notera que dans le cas de maladies auto-immunes les protéases impliquées constituent des auto-antigènes. It should be noted that in the case of autoimmune diseases the proteases involved constitute autoantigens.

Elles peuvent donc être utilisées pour reconnaître les auto-anticorps formés. A cet égard, les protéines recombinantes, plus particulièrement de granzyme B et de granzyme H de l'invention, présentent un grand intérêt dans une utilisation comme auto-antigènes en vue d'une reconnaissance par des auto-anticorps présents dans des sérums auto-immuns. Pour effectuer cette réaction, on opère avantageusement selon les techniques habituelles.They can therefore be used to recognize the autoantibodies formed. In this regard, the recombinant proteins, more particularly of granzyme B and of granzyme H of the invention, are of great interest in use as auto-antigens with a view to recognition by auto-antibodies present in auto-sera. immune. To carry out this reaction, the procedure is advantageously carried out according to usual techniques.

L invention vise également un kit pour le diagnostic invitro de la présence desdits constituants des granules cytoplasmiques plus spécialement de granzyme ou de perforine dans un échantillon biologique. The invention also relates to a kit for the in vitro diagnosis of the presence of said constituents of the cytoplasmic granules more especially of granzyme or of perforin in a biological sample.

Ce kit est caractérisé en ce qu'il comprend
- une phase solide appropriée servant de support pour le dosage, telle qu'une plaque de micro-titration,
- une préparation d'anticorps monoclonal ou de fragment, libre ou immobilisé, comme défini ci-dessus,
- une préparation desdits constituants, plus spécialement de granzyme ou de perforine avec le cas échéant un groupe marqueur, et lorsque la préparation ne comporte pas de groupe marqueur, une préparation d'un deuxième anticorps avec un groupe marqueur,
- un système de détection spécifique du marqueur,
- des solutions tampons appropriées pour les réactions immunologiques et pour les réactions de détection.This kit is characterized in that it includes
- an appropriate solid phase serving as a support for the assay, such as a micro-titration plate,
- a preparation of monoclonal antibody or fragment, free or immobilized, as defined above,
a preparation of said constituents, more particularly of granzyme or of perforin with, where appropriate, a marker group, and when the preparation does not contain a marker group, a preparation of a second antibody with a marker group,
- a specific marker detection system,
- appropriate buffer solutions for immunological reactions and for detection reactions.

Les anticorps monoclonaux sont susceptibles également de constituer des agents thérapeutiques de grand intérêt et peuvent jouer le rôle de vecteurs d'enzymes ou de médicaments. Monoclonal antibodies are also capable of constituting therapeutic agents of great interest and can play the role of vectors of enzymes or drugs.

On rapporte dans les exemples qui suivent d'autres caractéristiques et avantages de l'invention. La figure unique comporte la séquence d'acides aminés de la perforine recombinante dont la préparation est rapportée dans les exemples. In the examples which follow, other characteristics and advantages of the invention are reported. The single figure comprises the amino acid sequence of the recombinant perforin, the preparation of which is reported in the examples.

I - Matériel
1-1 Matériel
- Les granzymes A et B sont séparés des autres protéines des granules cytoplasmiques des LGL (lymphocytes à larges granules) sur une colonne Mono S échangeuse de cations (HR/5, PHARMACIA) connectée à un système FPLC (PHARMACIA) selon la technique décrite par (Krähenbül et al., dans J. Immunol, indiqué ci-dessus).I - Hardware
1-1 Hardware
- Granzymes A and B are separated from the other proteins of the cytoplasmic granules of LGL (large granule lymphocytes) on a Mono S cation exchange column (HR / 5, PHARMACIA) connected to an FPLC system (PHARMACIA) according to the technique described by (Krähenbül et al., In J. Immunol, indicated above).

- Les souris utilisées sont des souris BALB/C d'haplotype H-2d. - The mice used are BALB / C mice of haplotype H-2d.

- Le myélome NS-1, non sécréteur dthaplotype H-2d, apporte dans la fusion son pouvoir de prolifération. Il est contre-sélectionné en milieu HAT (Hypoxanthine,
Aminoptérine, Thymidine) car il porte la mutation HPRT (Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6,292-295, 1976).- Myeloma NS-1, non-secretor of the H-2dthaplotype, brings fusion power to fusion. It is counter-selected in HAT environment (Hypoxanthine,
Aminopterin, Thymidine) because it carries the HPRT mutation (Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6,292-295, 1976).

- L'anticorps polyclonal dirigé contre le granzyme
B est tel qu'obtenu selon la technique décrite par Krähenbühl (voir référence ci-dessus).- The polyclonal antibody directed against granzyme
B is as obtained according to the technique described by Krähenbühl (see reference above).

- La lignée REX est une lignée T immortalisée par le virus d'Epstein Barr. - The REX line is a T line immortalized by the Epstein Barr virus.

- L'anticorps monoclonal PAb419 est dirigé contre l'antigène T de SV40 (Harlow et al., J of Virology, 861869, 1981). - The monoclonal antibody PAb419 is directed against the T antigen of SV40 (Harlow et al., J of Virology, 861869, 1981).

I-2 Solutions
MILLIEU 1 : RPMI 1640 (GIBCO), 100 u/ml pénicilline, 100 u/ml streptomycine (GIBCO), 2 mM glutamine (GIBCO).I-2 Solutions
MILLIEU 1: RPMI 1640 (GIBCO), 100 u / ml penicillin, 100 u / ml streptomycin (GIBCO), 2 mM glutamine (GIBCO).

MILIEU 2 : RPMI 1640 (GIBCO), 100 u/ml pénicilline, 100 u/ml streptomycine (GIBCO), 2 mM glutamine (GIBCO), 250 u/ml interleukine 2 (Roussel Uclaf, 0,7 106 u
BRMP / échantillon).MEDIUM 2: RPMI 1640 (GIBCO), 100 u / ml penicillin, 100 u / ml streptomycin (GIBCO), 2 mM glutamine (GIBCO), 250 u / ml interleukin 2 (Roussel Uclaf, 0.7 106 u
BRMP / sample).

MILIEU 3 : RPMI (GIBCO), 100 u/ml pénicilline, 100 u/ml streptomycine (GIBCO), 2 mM glutamine (GIBCO), 1 mM pyruvate de sodium (GIBCO), 10 % sérum de veau foetal inactivé (GIBCO), 0,36 %. glucose (A.P.). MEDIUM 3: RPMI (GIBCO), 100 u / ml penicillin, 100 u / ml streptomycin (GIBCO), 2 mM glutamine (GIBCO), 1 mM sodium pyruvate (GIBCO), 10% inactivated fetal calf serum (GIBCO), 0.36%. glucose (A.P.).

MILIEU 4 : Dubecco's MOD Eagle Medium (GIBCO), 100 u/ml pénicilline, 100 u/ml streptomycine (GIBCO), 2 mM glutamine (GIBCO), 1 mM pyruvate de sodium (GIBCO), 10 % sérum de veau foetal inactivé (GIBCO), 10 % sérum de cheval inactivé (GIBCO), 10 % NCTC 135 (GIBCO), 2 mM NaOH (Prolabo). MID 4: Dubecco's MOD Eagle Medium (GIBCO), 100 u / ml penicillin, 100 u / ml streptomycin (GIBCO), 2 mM glutamine (GIBCO), 1 mM sodium pyruvate (GIBCO), 10% inactivated fetal calf serum ( GIBCO), 10% inactivated horse serum (GIBCO), 10% NCTC 135 (GIBCO), 2 mM NaOH (Prolabo).

MILIEU 5 : Dubecco's MOD Eagle Medium (GIBCO), 100 u/ml pénicilline, 100 u/ml streptomycine (GIBCO), 2 mM glutamine (GIBCO), 1 mM pyruvate de Sodium (GIBCO), 10 % sérum de veau foetal inactivé (GIBCO), 10 % sérum de cheval inactivé (GIBCO), 10 % NCTC 135 (GIBCO), 2 mM NaOH (Prolabo), 2 % Hypoxanthine (GIBCO), 2 % Thymidine (GIBCO), 2 % Aminoptérine (GIBCO). MIDDLE 5: Dubecco's MOD Eagle Medium (GIBCO), 100 u / ml penicillin, 100 u / ml streptomycin (GIBCO), 2 mM glutamine (GIBCO), 1 mM Sodium pyruvate (GIBCO), 10% inactivated fetal calf serum ( GIBCO), 10% inactivated horse serum (GIBCO), 10% NCTC 135 (GIBCO), 2 mM NaOH (Prolabo), 2% Hypoxanthine (GIBCO), 2% Thymidine (GIBCO), 2% Aminopterin (GIBCO).

RIPA : 10 mM Tris pH 8,1 mM EDTA, 150 mM NaC1, 1 %
NP40, 1 % desoxycholate de Na, 0,1 % SDS.RIPA: 10 mM Tris pH 8.1 mM EDTA, 150 mM NaC1, 1%
NP40, 1% Na deoxycholate, 0.1% SDS.

Tampon de lavage des immunoprécipitations : 100 mM
Tris pH 9, 0,5 M LiCl, 1 % mercaptoéthanol.Immunoprecipitation wash buffer: 100 mM
Tris pH 9, 0.5 M LiCl, 1% mercaptoethanol.

Tampon Laemmli (Laemmli, Nature 227, 680-685, 1970) : 62,5 mM Tris pH 6,8, 2 % SDS, 15 % glycérol, 5 % pmercaptoéthanol, 0,01 % bleu de bromophénol. Laemmli buffer (Laemmli, Nature 227, 680-685, 1970): 62.5 mM Tris pH 6.8, 2% SDS, 15% glycerol, 5% pmercaptoethanol, 0.01% bromophenol blue.

II - Méthodes
II-1 Isolement des LGL du sang périphérique
On opère comme décrit par Chouaib et al., dans
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 6875-6879, 1988.II - Methods
II-1 Isolation of LGL from peripheral blood
We operate as described by Chouaib et al., In
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 6875-6879, 1988.

Les lymphocytes sont isolés du sang périphérique par gradient de ficoll (PHARMACIA). Après 2 lavages en milieu 5, les cellules sont numérées en solution de Hayem et incubées à raison de 3 x 108 cellules dans des flacons de culture (COSTAR) prétraités avec du SHN inactivé pendant 1 heure à 37"C. Les cellules non adhérentes sont alors collectées, lavées en RPMI SHN 10 * et fractionnées par centrifugation sur un gradient discontinu de percoll (PHARMACIA). 4 solutions de concentration différente de percoll sont préparées (31 %, 34 %, 37 % et 41 %). Une solution sur deux est préparée dans du milieu RPMI (rouge), ou dans une solution de chlorure de Na isotonique (incolore), permettant ainsi une bonne visualisation des interfaces.Après avoir coulé 4 ml de la solution à 41 g puis déposé délicatement sur celle-ci 2 ml de chaque solution par concentration décroissante dans des tubes coniques de 15 ml (NUNCLON DELTA, PAUL BLOCK), 3 x 108 lymphocytes contenus dans 2 ml de RPMI sont déposés à la surface du gradient. Les tubes sont centrifugés 30 min à 1400 t/min sans frein à température ambiante. Les anneaux de LGL situés à l'interface 37 - 41 % sont récupérés à la pipette Pasteur, lavés 3 fois en RPMI, puis regroupés. Les cellules sont numérées et mises en culture dans du milieu 2 à raison de 5 x 105 cellules par ml. Les LGL représentent 2 à 5 % de la population totale des lymphocytes. Lymphocytes are isolated from peripheral blood by a ficoll gradient (PHARMACIA). After 2 washes in medium 5, the cells are counted in Hayem solution and incubated at the rate of 3 × 10 8 cells in culture flasks (COSTAR) pretreated with inactivated SHN for 1 hour at 37 "C. The non-adherent cells are then collected, washed in RPMI SHN 10 * and fractionated by centrifugation on a discontinuous percoll gradient (PHARMACIA). 4 solutions of different percoll concentration are prepared (31%, 34%, 37% and 41%). is prepared in RPMI medium (red), or in an isotonic Na chloride solution (colorless), thus allowing good visualization of the interfaces. After having poured 4 ml of the 41 g solution and then delicately deposited on it 2 ml of each solution by decreasing concentration in 15 ml conical tubes (NUNCLON DELTA, PAUL BLOCK), 3 x 108 lymphocytes contained in 2 ml RPMI are deposited on the surface of the gradient The tubes are centrifuged for 30 min 1400 t / min without brake at room temperature. The LGL rings located at the 37 - 41% interface are recovered with a Pasteur pipette, washed 3 times in RPMI, then grouped. The cells are counted and cultured in medium 2 at the rate of 5 × 10 5 cells per ml. LGLs represent 2 to 5% of the total lymphocyte population.

II-2 Immunisation de souris avec les granzymes A et B purifiés à partir de LGL du sang périphérique ou de cellules NK. II-2 Immunization of mice with granzymes A and B purified from LGL from peripheral blood or from NK cells.

10 pg de protéines purifiées (granzyme A et B) dissoutes dans 200 pg de VaccicoxR (109 unités), adjuvant, sont injectées par voie intra-péritonéale à une souris
BALB/C. 21 jours après, on effectue un rappel grâce à une 2ème injection par voie intra-veineuse (10 ug de protéines dissoutes dans 200 pg de sérum physiologique).10 pg of purified proteins (granzyme A and B) dissolved in 200 pg of VaccicoxR (109 units), adjuvant, are injected intraperitoneally into a mouse
BALB / C. 21 days later, a booster is given by a second intravenous injection (10 μg of protein dissolved in 200 μg of physiological saline).

II-3 Fusion cellulaire
On opère comme décrit par Oi et Herzenberg, dans
Selected methods in cellular immunology. Freeman and co.II-3 Cell fusion
We operate as described by Oi and Herzenberg, in
Selected methods in cellular immunology. Freeman and co.

Mishell, Shiigi, eds. 1980)
Trois jours après le rappel, la souris est sacrifiée et sa rate est prélevée en milieu stérile. Elle est dilacérée avec un piston de seringue de 5 ml dans une boîte de Pétri stérile contenant 5 ml de RPMI. La solution de splénocytes est ensuite lavée avec 50 ml de RPMI. Après centrifugation, les culots cellulaires sont conservés à température ambiante. Mishell, Shiigi, eds. 1980)
Three days after the booster, the mouse is sacrificed and its spleen is removed in a sterile medium. It is diluted with a 5 ml syringe plunger in a sterile Petri dish containing 5 ml of RPMI. The splenocyte solution is then washed with 50 ml of RPMI. After centrifugation, the cell pellets are stored at room temperature.

Les cellules de myélome NS-1 mis en culture dans du milieu 2 sont centrifugés pendant 7 min à 1500 t/min, puis lavés dans 50 ml de RPMI. Les culots cellulaires sont resuspendus dans 10 ml de RPMI, et transférés dans le tube contenant les splénocytes selon le rapport de 1 cellule de myélome pour 2 splénocytes. Ce mélange est ajusté à 40 ml avec du RPMI, puis centrifugé pendant 7 min à 1500 t/min à 200C. The NS-1 myeloma cells cultured in medium 2 are centrifuged for 7 min at 1500 rpm, then washed in 50 ml of RPMI. The cell pellets are resuspended in 10 ml of RPMI, and transferred to the tube containing the splenocytes according to the ratio of 1 myeloma cell to 2 splenocytes. This mixture is adjusted to 40 ml with RPMI, then centrifuged for 7 min at 1500 rpm at 200C.

Le culot cellulaire mixte est resuspendu avec 1 ml de PEG (polyéthylène glycol 1500, BOEHRINGER), (agent fusionnant), en tournant doucement la pipette dans le tube pendant 1 min. Le PEG est dilué en ajoutant en 1 min 1 ml de RPMI 1640 préchauffé à 37"C puis 7 ml du même milieu en 2 min pour atténuer la toxicité de ce produit. Après centrifugation à 1800 t/min pendant 4 min sans frein, le culot cellulaire est remis en suspension dans 10 ml de milieu (4) préchauffé à 37"C. Les cellules sont distribuées dans des plaques stériles de 96 puits à fond plat à raison de 105 cellules du myélome dans 100 p1 par puits (temps 0). The mixed cell pellet is resuspended with 1 ml of PEG (polyethylene glycol 1500, BOEHRINGER), (fusing agent), by gently turning the pipette in the tube for 1 min. The PEG is diluted by adding in 1 min 1 ml of RPMI 1640 preheated to 37 "C and then 7 ml of the same medium in 2 min to reduce the toxicity of this product. After centrifugation at 1800 rpm for 4 min without brake, the cell pellet is resuspended in 10 ml of medium (4) preheated to 37 "C. The cells are distributed in sterile 96-well flat-bottom plates at the rate of 105 myeloma cells in 100 μl per well (time 0).

24 heures après la fusion (jour 1), 100 p1 de milieu 5 (sélection HAT) préchauffé à 37"C sont ajoutés dans chaque puits. Ce milieu sélectionne les hybridomes et tue les cellules de myélome qui n'ont pas fusionné. 24 hours after the fusion (day 1), 100 μl of medium 5 (HAT selection) preheated to 37 ° C. are added to each well. This medium selects the hybridomas and kills the myeloma cells which have not fused.

Au jour 7, 100 pl de milieu sont aspirés et remplacés par 100 pl de milieu 4 neuf. Au jour 10, le contenu des puits positifs (test ELISA ; kit AMERSHAM), est transféré sur plaque à fond plat de 24 puits dans lesquels on ajoute 1 ml de milieu de culture 4. Au jour 13, les hybridomes sécréteurs peuvent être conservés par congélation en azote liquide dans du SVF/10 DMSO. On day 7, 100 μl of medium are aspirated and replaced with 100 μl of new medium 4. On day 10, the content of the positive wells (ELISA test; AMERSHAM kit) is transferred to a 24-well flat-bottom plate in which 1 ml of culture medium is added. On day 13, the secretory hybridomas can be preserved by freezing in liquid nitrogen in SVF / 10 DMSO.

II-4 Recherche des hybridomes secrétant des anticorps anti-granzymes A et B humains par test ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay). II-4 Search for hybridomas secreting anti-human enzyme A and B antibodies by ELISA test (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay).

(kit Anti-IG de souris, anticorps entier lié à de la peroxydase de raifort, AMERSHAM)
La préparation des plaques de 96 puits à fond plat est réalisée 24 heures avant le test. A cet effet, 100 p1 d'antigène (granzymes A ou B purifiés), à 1 pg/ml (dans du
PBS) sont distribués dans les puits. Les plaques sont mises à 4"C pendant 24 heures.(Mouse anti-IG kit, whole antibody linked to horseradish peroxidase, AMERSHAM)
The flat bottom 96-well plates are prepared 24 hours before the test. For this purpose, 100 μl of antigen (purified granzymes A or B), at 1 μg / ml (in
PBS) are distributed in the wells. The plates are placed at 4 "C for 24 hours.

2 à 5 lavages avec 200 pl par puits de PBS, 0,1 %
Tween 20 sont effectués avant de tester les surnageants de culture des hybridomes. Les plaques sont incubées 1 heure à 37 "C avec 50 pl par puits de surnageant de culture de l'hybridome à tester.2 to 5 washes with 200 µl per well of PBS, 0.1%
Tween 20 are performed before testing the culture supernatants of the hybridomas. The plates are incubated for 1 hour at 37 ° C. with 50 μl per well of culture supernatant of the hybridoma to be tested.

Après 3 lavages avec du PBS, 0,1 % Tween 20, 50 pl d'anticorps secondaire (conjugué à la peroxydase et dilué au 1/500e dans du PBS, 0,2 % Tween 20) sont ajoutés dans chaque puits. L'incubation se fait à 37"C pendant 30 min. After 3 washes with PBS, 0.1% Tween 20, 50 μl of secondary antibody (conjugated to peroxidase and diluted 1 / 500th in PBS, 0.2% Tween 20) are added to each well. Incubation is carried out at 37 "C for 30 min.

Les plaques sont de nouveau lavées 3 fois avec du
PBS, 0,1 % Tween 20. La révélation est effectuée en ajoutant 100 p1 d'une solution contenant le substrat (10 pl
PBS, 3 % H202 dans 12,5 ml d'ABTS 180 mg/l).The plates are again washed 3 times with
PBS, 0.1% Tween 20. The development is carried out by adding 100 μl of a solution containing the substrate (10 μl
PBS, 3% H2O2 in 12.5 ml of ABTS 180 mg / l).

Les plaques sont lues par mesure de la DO à 405 nm 15 à 25 min après l'addition du substrat. The plates are read by measuring the OD at 405 nm 15 to 25 min after the addition of the substrate.

Après fusion des cellules du myélome NS1 avec les splénocytes provenant de la souris immunisée avec le granzyme B, en opérant comme indiqué ci-dessus, les surnageants de 28 hybridomes désignés GRB se sont avérés être spécifiques du granzyme B en test ELISA (test réalisé avec de la protéine purifiée). After fusion of the NS1 myeloma cells with the splenocytes originating from the mouse immunized with granzyme B, operating as indicated above, the supernatants of 28 hybridomas designated GRB were found to be specific for granzyme B in the ELISA test (test carried out with purified protein).

La même démarche suivie avec le granzyme A, a conduit à isoler 15 hybridomes appelés GRA secrétant des anticorps spécifiques du granzyme A, en test ELISA (test réalisé avec de la protéine purifiée). The same approach followed with granzyme A, led to the isolation of 15 hybridomas called GRA secreting antibodies specific for granzyme A, in an ELISA test (test carried out with purified protein).

Le pourcentage d'hybridomes sécréteurs d'anticorps spécifiques est particulièrement satisfaisant, en effet sur 300 hybridomes issus de la fusion entre les cellules du myélome NS1 et les splénocytes de la souris immunisée avec le granzyme B purifié, 10 % secrètent des anticorps spécifiques en test ELISA. Dans le cas du granzyme A, 5 % des hybridomes de la seconde fusion sont spécifiques dans les mêmes conditions.  The percentage of hybridomas secreting specific antibodies is particularly satisfactory, in fact out of 300 hybridomas resulting from the fusion between the NS1 myeloma cells and the splenocytes of the mouse immunized with purified granzyme B, 10% secrete specific antibodies in test ELISA. In the case of granzyme A, 5% of the hybridomas of the second fusion are specific under the same conditions.

II-5 Clonage des hybridomes par dilution limite. II-5 Cloning of hybridomas by limiting dilution.

Les hybridomes dont les surnageants présentent la plus forte positivité en test ELISA sont clonés dans des plaques de 96 puits à fond plat. Plusieurs dilutions sont testées. Le clonage est effectué à 100 cellules, 10 cellules, 1 cellule et 0,25 cellules par puits à raison de 100 pl de milieu 4 par puits. The hybridomas whose supernatants have the highest positivity in the ELISA test are cloned into 96-well plates with flat bottom. Several dilutions are tested. Cloning is carried out at 100 cells, 10 cells, 1 cell and 0.25 cells per well at the rate of 100 μl of medium 4 per well.

Les cellules sont nourries 3 jours après le clonage avec 100 pi de milieu 4, puis tous les 7 jours. The cells are fed 3 days after cloning with 100 μl of medium 4, then every 7 days.

Lorsque la croissance cellulaire, contrôlée sur microscope inversé, semble importante, le surnageant de culture de ces puits est testé en ELISA sur les granzymes purifiés sur du granzyme A ou B et sur le lyzozyme comme contrôle négatif.When cell growth, checked on an inverted microscope, seems significant, the culture supernatant of these wells is tested by ELISA on the granzymes purified on granzyme A or B and on lyzozyme as negative control.

Les hybridomes positifs sont transférés dans les plaques de 24 puits puis sur des plaques de 6 puits et par la suite en flacon pour maintenir la croissance exponentielle des cellules. Ces hybridomes sont injectés dans le péritoine des souris pour produire des ascites. Ils peuvent être laissés en culture jusqu'à la mort cellulaire afin d'obtenir des surnageants très concentrés étudiés en
Western Blot ou en immunoprécipitation.The positive hybridomas are transferred to the 24-well plates, then to 6-well plates and thereafter in a vial to maintain the exponential growth of the cells. These hybridomas are injected into the peritoneum of mice to produce ascites. They can be left in culture until cell death in order to obtain highly concentrated supernatants studied in
Western blot or immunoprecipitation.

On récupère deux hybridomes secrétant des anticorps reconnaissant le granzyme B, appelés respectivement GRB98C et GRB5lD et trois autres souches secrétant des anticorps reconnaissant le granzyme A, appelés GRA66D, GRA382E et GRA1OD. Les hybridomes restants seront clonés afin de constituer un panel d'anticorps dirigés contre les granzymes humains A et B. Two hybridomas secreting antibodies recognizing granzyme B, called respectively GRB98C and GRB5lD and three other strains secreting antibodies recognizing granzyme A, called GRA66D, GRA382E and GRA1OD are recovered. The remaining hybridomas will be cloned in order to constitute a panel of antibodies directed against human granzymes A and B.

II-6 Caractérisation de l'isotype des anticorps clonés
Le surnageant de culture de l'hybridome à tester est dilué au 1/10e en 20 mM Tris pH 7,6, 137 mM NaCl (TBS).II-6 Characterization of the isotype of cloned antibodies
The culture supernatant of the hybridoma to be tested is diluted 1/10 in 20 mM Tris pH 7.6, 137 mM NaCl (TBS).

La bandelette du kit est incubée 15 min à température ambiante avec le surnageant dilué. Après 3 lavages en TBS, 0,1 * Tween 20 (TBS-T), la bandelette est incubée dans une solution d'anticorps anti-souris couplés à la peroxydase (dilués au 1/500e dans du TBS-T).The kit strip is incubated for 15 min at room temperature with the diluted supernatant. After 3 washes in TBS, 0.1 * Tween 20 (TBS-T), the strip is incubated in a solution of anti-mouse antibodies coupled with peroxidase (diluted 1 / 500th in TBS-T).

La révélation s'effectue par incubation de la bandelette durant 15 min à température ambiante dans 3 ml d'une solution contenant le substrat (1 pastille de chloronaphtol dissoute dans 10 ml de méthanol froid, mélangés extemporanément à 50 ml de TBS contenant une goutte de peroxyde d'hydrogène). Après 3 lavages en eau distillée, les bandelettes sont séchées et peuvent être interprétées. The revelation is carried out by incubating the strip for 15 min at room temperature in 3 ml of a solution containing the substrate (1 chloronaphthol tablet dissolved in 10 ml of cold methanol, mixed immediately with 50 ml of TBS containing a drop of hydrogen peroxide). After 3 washes in distilled water, the strips are dried and can be interpreted.

La technique d'immunisation utilisée dans cette étude a permis d'obtenir des hybridomes sécrétant des anticorps d'isotype IgG. L'isotype des anticorps a été confirmé par le kit commercialisé par Amersham d'anticorps monoclonaux de souris. Les anticorps monoclonaux GRB98C,
GRA66D, GRA382E et GRA1OD présentent l'isotype IgG1. Celui sécrété par l'hybridome GRB51D présente l'isotype IgG2a. La titration des surnageants de culture des hybridomes clonés par test ELISA a permis de déterminer un titre du surnageant de culture de l'hybridome GRB98C de 1000. Ceux des surnageants de culture des hybridomes GRB51D, GRA66D et
GRA1OD sont de 10 000. Le titre du surnageant de culture de l'hybridome GRA382E est de 100 000. Il convient de noter les valeurs élevées de ces titres.The immunization technique used in this study made it possible to obtain hybridomas secreting antibodies of the IgG isotype. The antibody isotype was confirmed by the kit marketed by Amersham of mouse monoclonal antibodies. GRB98C monoclonal antibodies,
GRA66D, GRA382E and GRA1OD have the IgG1 isotype. The one secreted by the GRB51D hybridoma has the IgG2a isotype. The titration of the culture supernatants of the cloned hybridomas by ELISA test made it possible to determine a titer of the culture supernatant of the hybridoma GRB98C of 1000. Those of the culture supernatants of the hybridomas GRB51D, GRA66D and
GRA1OD are 10,000. The title of the culture supernatant of the GRA382E hybridoma is 100,000. The high values of these titles should be noted.

Détermination de la spécificité de ces anticorps par les techniques d' électro-transfert de protéines et d'immunorévélation (Western blot). On opère comme décrit par Towbin et al., dans Proc. Natl. Acad. Sci. Determination of the specificity of these antibodies by the techniques of electro-transfer of proteins and immunorevelation (Western blot). The procedure is as described by Towbin et al., In Proc. Natl. Acad. Sci.

76, 4350-4354, 1979.76, 4350-4354, 1979.

La protéine (antigène purifié : granzymes A ou B, ou témoin négatif) est incubée dans du tampon de Laemmli à 100"C pendant 10 min (1 pg/gel de 12 cm de largeur), migre sur un gel de polyacrylamide dénaturant, puis est électrotransférée sur filtre de nitrocellulose (BA83, CERA
LABO) dans un appareil à électrodes en graphite (CERA
LABO), dans un tampon 39 mM de glycine, 48 mM Tris pH 8,3, 0,037 % SDS, 20 % méthanol sous un courant de 1 mA/cm2 de filtre pendant 1,5 à 2 heures. Après transfert, le filtre de nitrocellulose est coloré avec du rouge ponceau 0,2 %, et de l'acide trichloracétique 0,3 % pour vérifier l'efficacité du transfert, puis découpé en bandelettes de 0,6 cm de largeur.The protein (purified antigen: granzymes A or B, or negative control) is incubated in Laemmli buffer at 100 "C for 10 min (1 pg / gel 12 cm wide), migrates on a denaturing polyacrylamide gel, then is electrotransferred on a nitrocellulose filter (BA83, CERA
LABO) in a graphite electrode device (CERA
LABO), in a 39 mM glycine buffer, 48 mM Tris pH 8.3, 0.037% SDS, 20% methanol under a current of 1 mA / cm2 of filter for 1.5 to 2 hours. After transfer, the nitrocellulose filter is colored with 0.2% culvert red and 0.3% trichloroacetic acid to verify the effectiveness of the transfer, then cut into strips 0.6 cm wide.

Les bandelettes sont préincubées dans un tampon
PBS avec 0,2 % de Tween 20 et 5 % de lait écrémé pendant 1 heure à 4"C. Un jeu de bandelettes, représentant différentes protéines à tester, sont incubées 1 nuit à 4"C avec le surnageant d'hybridome dilué au 1/10 dans le tampon
PBS contenant 0,2 % de Tween 20 et 5 % de lait écrémé. Les bandelettes sont ensuite lavées dans du tampon PBS contenant 0,2 % de Tween 20 sous agitation moyenne pendant 5 fois 5 min à température du laboratoire. Les bandelettes sont incubées avec un anticorps anti-immunoglobulines de souris couplé à la phosphatase alcaline (dilué au 1/1000e dans le tampon PBS ci-dessus) pendant 2 heures à température du laboratoire.Après 5 lavages de 5 min dans du PBS, les bandelettes sont équilibrées dans le tampon de réaction de la phosphatase alcaline (100 mM Tris pH 9,5, 100 mM NaC1, 50 mM MgCl2) et mises en présence du substrat de la phosphatase (10 ml de tampon de réaction, 44 pl de chlorure de tétrazolium nitro-bleu, 33 pi de sel de (5bromo-4-chloro-3-indolylphosphatase p-toluidine) pendant 15 minutes à température ambiante. La réaction peut être stoppée en lavant les bandelettes avec H20.The strips are preincubated in a buffer
PBS with 0.2% Tween 20 and 5% skimmed milk for 1 hour at 4 "C. A set of strips, representing different proteins to be tested, are incubated overnight at 4" C with the hybridoma supernatant diluted with 1/10 in the buffer
PBS containing 0.2% Tween 20 and 5% skim milk. The strips are then washed in PBS buffer containing 0.2% Tween 20 with moderate stirring for 5 times 5 min at laboratory temperature. The strips are incubated with an anti-mouse immunoglobulin antibody coupled to alkaline phosphatase (diluted 1 / 1000th in the PBS buffer above) for 2 hours at laboratory temperature. After 5 washes of 5 min in PBS, the strips are balanced in the alkaline phosphatase reaction buffer (100 mM Tris pH 9.5, 100 mM NaC1, 50 mM MgCl2) and placed in the presence of the phosphatase substrate (10 ml of reaction buffer, 44 μl of chloride nitro-blue tetrazolium, 33 µl (5bromo-4-chloro-3-indolylphosphatase p-toluidine) salt for 15 minutes at room temperature The reaction can be stopped by washing the strips with H2O.

Le granzyme B, réduit et dénaturé, est électrotransféré sur un filtre de nitrocellulose. Les bandelettes de nitrocellulose sont incubées avec les différents anticorps à tester, puis avec un anticorps antisouris conjugué à la phosphatase alcaline. Granzyme B, reduced and denatured, is electrotransferred on a nitrocellulose filter. The nitrocellulose strips are incubated with the various antibodies to be tested, then with an anti-mouse antibody conjugated to alkaline phosphatase.

Dans ces conditions, une bande à 31 KD est observée sur la bandelette incubée avec le sérum polyclonal anti-granzyme B. En revanche, cette bande n'est pas détectée sur les bandelettes incubées avec les anticorps anti-granzyme B GRB51D et GRB98C. Les contrôles (bandelettes incubées avec l'anticorps dirigé contre l'antigène T de SV 40, avec les anticorps anti-granzyme A
GRA66D, GRA382E et GRA1OD) sont également négatifs. Les anticorps anti-granzyme B ne reconnaissent donc pas le granzyme B dans les conditions de cette expérience de
Western blot.Under these conditions, a band at 31 KD is observed on the strip incubated with the anti-granzyme B polyclonal serum. On the other hand, this band is not detected on the strips incubated with the anti-granzyme B antibodies GRB51D and GRB98C. Controls (strips incubated with the antibody directed against the SV40 T antigen, with anti-granzyme A antibodies
GRA66D, GRA382E and GRA1OD) are also negative. Anti-granzyme B antibodies therefore do not recognize granzyme B under the conditions of this
Western blot.

II-8 Marquage des cellules in vitro et immunoprécipitation. II-8 Labeling of cells in vitro and immunoprecipitation.

Les LGL sont mis en culture (milieu : RPMI dépiété en méthionine, compiémenté en 35S méthionine : 20 à 50 pCi/ml et en 1 % SHN inactivé) à raison de 3 à 5 x 105 cellules par ml. Le marquage peut être effectué dans un milieu RPMI déplété en leucine et complémenté par 20 à 50 pCi/ml de 3H leucine. Après une incubation de 4 heures à 37"C, les cellules sont lavées 2 fois en PBS. Le culot cellulaire est repris dans 500 pl de RIPA-O,O1 % BSA (B2518, SIGMA), puis soniqué pendant 15 s (micro sonicateur, puissance 40 watts, sonde 0,3-87, BIOBLOCK). The LGLs are placed in culture (medium: RPMI depressed with methionine, supplemented with 35S methionine: 20 to 50 pCi / ml and in 1% inactivated SHN) at a rate of 3 to 5 × 10 5 cells per ml. The labeling can be carried out in an RPMI medium depleted in leucine and supplemented with 20 to 50 pCi / ml of 3H leucine. After an incubation of 4 hours at 37 "C, the cells are washed 2 times in PBS. The cell pellet is taken up in 500 μl of RIPA-O, O1% BSA (B2518, SIGMA), then sonicated for 15 s (micro sonicator , power 40 watts, probe 0.3-87, BIOBLOCK).

L'incorporation de radioactivité est suivie par comptage d'une fraction précipitée au TCA. L'extrait cellulaire est aliquoté par 5 x 106 cpm.The incorporation of radioactivity is followed by counting a fraction precipitated with TCA. The cell extract is aliquoted at 5 x 10 6 cpm.

- Immunoprécipitation (selon Kress et al., dans J. - Immunoprecipitation (according to Kress et al., In J.

Virol. 31, 472-483, 1979).Virol. 31, 472-483, 1979).

L'incubation, pendant 30 min à 4"C avec agitation sur roue, de l'extrait cellulaire avec 60 pl de protéine A
SépharoseR (PHARMACIA, CL4B SépharoseR) permet de diminuer le bruit de fond. L'échantillon est ensuite filtré sur un frité (polyéthylène poreux). 10 pi de sérum normal de souris et 30 pl de protéine A SépharoseR sont ajoutés à l'éluat et laissés 1 heure à 4"C avec agitation. Cette solution est filtrée sur le même filtre. La dernière étape de diminution du bruit de fond est réalisée grâce à l'addition de 30 pi de protéine A SépharoseR au filtrat et à une incubation de 30 min à 4"C avec agitation.Après filtration, l'éluat est incubé, 4 heures à 4"C avec agitation, en présence de 200 pi de surnageant de culture à tester ; 40 pl de protéine A SépharoseR et 20 pi de RIPA0,01 % BSA (B2518, SIGMA). Le complexe antigène-anticorpsprotéine A SépharoseR est filtré, puis lavé, élué par 45 pi de tampon de Laemmli et bouilli 10 min à 100 C. Incubation, for 30 min at 4 "C with shaking on a wheel, of the cell extract with 60 μl of protein A
SepharoseR (PHARMACIA, CL4B SepharoseR) reduces background noise. The sample is then filtered through a fry (porous polyethylene). 10 μl of normal mouse serum and 30 μl of protein A SepharoseR are added to the eluate and left for 1 hour at 4 "C. with stirring. This solution is filtered on the same filter. The last step of reducing the background noise is performed by adding 30 µl of protein A SepharoseR to the filtrate and incubating for 30 min at 4 "C with shaking. After filtration, the eluate is incubated for 4 hours at 4" C with shaking, in the presence of 200 μl of culture supernatant to be tested; 40 μl of protein A Sepharose R and 20 μl of RIPA 0.01% BSA (B2518, SIGMA) The antigen-antibody protein A complex Sepharose R is filtered, then washed, eluted with 45 μl of buffer buffer Laemmli and boiled 10 min at 100 C.

Les échantillons sont déposés sur un gel de polyacrylamide (12,5 %) en présence de SDS. Après migration à 40 mA 200 V, le gel est fixé, traité au EN3HANCE (DUPONT de NEMOURS) lavé en eau distillée, séché 1 heure à 80"C et fluorographié sur Hyperfilm-MP (AMERSHAM) à -80 C.  The samples are deposited on a polyacrylamide gel (12.5%) in the presence of SDS. After migration to 40 mA 200 V, the gel is fixed, treated with EN3HANCE (DUPONT de NEMOURS) washed in distilled water, dried for 1 hour at 80 "C and fluorographed on Hyperfilm-MP (AMERSHAM) at -80 C.

On rapporte ci-après les résultats d'expériences d'immunoprécipitation suivies de séparation sur gel d'acrylamide, réalisées pour vérifier la capacité des anticorps monoclonaux anti-granzymes B d'immunoprécipiter les granzymes B contenus dans les granules des LGL. Dans cette expérience, on utilise des extraits de cellules (LGL ou REX) marquées à la 35S-méthionine. L'immunoprécipitation est réalisée à l'aide des surnageants de culture des hybridomes à tester. Les protéines immunoprécipitées sont séparées sur un gel de polyacrylamide dénaturant à 12,5 %. The results of immunoprecipitation experiments followed by separation on acrylamide gel, carried out to verify the capacity of the monoclonal anti-B-enzyme antibodies to immunoprecipitate the B-enzymes contained in the LGL granules, are reported below. In this experiment, cell extracts (LGL or REX) labeled with 35S-methionine are used. Immunoprecipitation is carried out using culture supernatants of the hybridomas to be tested. The immunoprecipitated proteins are separated on a 12.5% denaturing polyacrylamide gel.

Le temps d'autoradiographie est de 7 jours.The autoradiography time is 7 days.

On observe une bande à 31 KD correspondant à la migration de l'extrait cellulaire de LGL, immunoprécipité par les anticorps anti-granzyme B, GRB51D et GRB98C. Cette bande à 31 KD est aussi observée pour le même extrait cellulaire immunoprécipité par le sérum polyclonal antigranzyme B. En revanche, cette bande n'est pas détectée avec un contrôle négatif. La migration de l'extrait cellulaire REX (cellules n'exprimant pas les granzymes) immunoprécipité par les anticorps décrits précédemment ne révèle aucune bande à ce poids moléculaire. Ces résultats montrent que les anticorps GRB51D et GRB98C reconnaissent bien le granzyme B. A band is observed at 31 KD corresponding to the migration of the LGL cell extract, immunoprecipitated by the anti-granzyme B antibodies, GRB51D and GRB98C. This band at 31 KD is also observed for the same cell extract immunoprecipitated by the polyclonal serum antigranzyme B. On the other hand, this band is not detected with a negative control. The migration of the REX cell extract (cells not expressing granzymes) immunoprecipitated by the antibodies described above does not reveal any band at this molecular weight. These results show that the GRB51D and GRB98C antibodies recognize granzyme B.

Pour la caractérisation des anticorps antigranzyme A (GRA66D, GRA382E, GRA1OD), les immunoprécipitations ont été réalisées sur des extraits de
LGL et de lignées cellulaires REX marqués à la leucine 3H en effet la séquence en acides aminés du granzyme A est très pauvre en méthionine, mais elle contient à l'inverse 26 leucines. Les protéines immunoprécipitées sont séparées sur un gel de polyacrylamide dénaturant à 12,5 %. Le temps d'autoradiographie est de 1 mois. Une bande supplémentaire de faible intensité à 32 Kd est observée uniquement avec l'extrait cellulaire de LGL immunoprécipité par l'anticorps
GRA66D, mais non par les anticorps GRA382E et GRA1OD, ni par un anticorps servant de contrôle négatif.For the characterization of antigranzyme A antibodies (GRA66D, GRA382E, GRA1OD), the immunoprecipitations were carried out on extracts of
LGL and REX cell lines labeled with leucine 3H indeed the amino acid sequence of granzyme A is very poor in methionine, but conversely it contains 26 leucines. The immunoprecipitated proteins are separated on a 12.5% denaturing polyacrylamide gel. The autoradiography time is 1 month. An additional band of low intensity at 32 Kd is observed only with the cell extract of LGL immunoprecipitated by the antibody
GRA66D, but not by the antibodies GRA382E and GRA1OD, nor by an antibody serving as a negative control.

11-9 Production d'ascites
Une injection de 500 pl de tetra-méthyl-pentadécane (JANSSEN) est effectuée en intrapéritonéal à une souris BALB/C. On opère comme décrit par Hoogenraad et
Wraight, dans Methods Enzymol, 121, 375-381, 1986. Dix jours plus tard, 107 hybridomes lavés dans du sérum physiologique sont injectés en intra-péritonéal. Les souris sont ponctionnées chaque jour. Le liquide péritonéal est centrifugé pendant 7 min à 1500 t/min à 4"C. L'ascite récupérée à l'aide d'une pipette Pasteur est filtrée sur 0,2 pm (NALGENE), puis centrifugée à 4"C pendant 30 min à 12000 g pour éliminer les lipides et conservée à -80 C. 11-9 Production of ascites
An injection of 500 μl of tetra-methyl-pentadecane (JANSSEN) is carried out intraperitoneally to a BALB / C mouse. We operate as described by Hoogenraad and
Wraight, in Methods Enzymol, 121, 375-381, 1986. Ten days later, 107 hybridomas washed in physiological saline are injected intraperitoneally. The mice are punctured every day. The peritoneal liquid is centrifuged for 7 min at 1500 rpm at 4 "C. The ascites recovered using a Pasteur pipette is filtered through 0.2 pm (NALGENE), then centrifuged at 4" C for 30 min at 12000 g to remove lipids and stored at -80 C.

II-10 Purification des anticorps
(ImmunoPure IgG Purification kit, PIERCE)
La colonne de protéine A, stockée en 0,02 % azide de Na, est lavée avec 5 ml de tampon de liaison. 2 ml d'ascite, diluée au 1/2 dans le tampon de liaison, sont déposés sur la colonne. Après lavage avec 15 ml de tampon de liaison, les IgG (immunoglobulines G) sont éluées avec 5 ml de tampon d'élution. Cette colonne est régénérée avec 8 ml 0,1 M d'acide citrique pH 3 et stockée en 0,02 % azide de Na.II-10 Purification of antibodies
(ImmunoPure IgG Purification kit, PIERCE)
The protein A column, stored in 0.02% Na azide, is washed with 5 ml of binding buffer. 2 ml of ascites, diluted 1/2 in the binding buffer, are placed on the column. After washing with 15 ml of binding buffer, the IgGs (immunoglobulins G) are eluted with 5 ml of elution buffer. This column is regenerated with 8 ml 0.1 M citric acid pH 3 and stored in 0.02% Na azide.

Les fractions éluées sont dessalées sur des colonnes d'Exocellulose avec 10 ml de PBS. Ces colonnes de dessalage sont régénérées avec 15 ml de PBS et stockées en 0,02 % azide de Na. Les fractions dessalées des IgG sont dosées par mesure de la DO à 280 nm pour déterminer la concentration des immunoglobulines dans chaque fraction selon la formule : [IgG] en mg/l = DO à 280 nm/1,4. The eluted fractions are desalted on Exocellulose columns with 10 ml of PBS. These desalting columns are regenerated with 15 ml of PBS and stored in 0.02% Na azide. The desalted fractions of the IgGs are assayed by measuring the OD at 280 nm to determine the concentration of immunoglobulins in each fraction according to the formula: [IgG] in mg / l = OD at 280 nm / 1.4.

II-11 Détection des granzymes au niveau des LGL par immunocytochimie. II-11 Detection of granzymes at the LGL level by immunocytochemistry.

Les LGL ont été incubés avec des anticorps reconnaissant les granzymes A et B, sélectionnés par le test ELISA comme rapporté plus haut. The LGLs were incubated with antibodies recognizing granzymes A and B, selected by the ELISA test as reported above.

2 x 105 cellules par lames sont cytocentrifugées pendant 5 min à 250 t/min et fixées dans l'acétone pendant 10 min à 4"C. Après 2 lavages en PBS, 10 pi par lame de l'anticorps à tester (dilué au 1/2 dans du PBS, 1 % BSA) sont ajoutés et laissés pendant 1 heure à 37"C. Les lames sont lavées 2 fois en PBS puis 200 pl par lame de l'anticorps anti Ig de souris (dilué au 1/500e dans du PBS, 1 % BSA) sont ajoutés et laissés 30 min à 37"C. Après 2 lavages en PBS, la révélation est effectuée en incubant pendant 10 min à température ambiante la lame recouverte par 200 pl d'une solution contenant le substrat, 1 pastille (10 mg) de 3,3' diaminobenzidine (SIGMA) dissoute dans 10 ml de 50 mM Tris pH 7,6, mélangés extemporanément à 100 pl de H202 à 0,3 %. Les lames sont lavées et les cellules sont colorées par de l'Hémalun de Meyer (MERCK) pendant 1 min à température ambiante. Les cellules sont lavées, déshydratées dans des bains d'méthanol (70 %, 90 % et 100 %), passées dans du toluène et montées avec une goutte de résine de montage (BIOLYON). 2 x 105 cells per slide are cytocentrifuged for 5 min at 250 rpm and fixed in acetone for 10 min at 4 "C. After 2 washes in PBS, 10 μl per slide of the antibody to be tested (diluted to 1 / 2 in PBS, 1% BSA) are added and left for 1 hour at 37 "C. The slides are washed twice in PBS then 200 μl per slide of the anti-mouse Ig antibody (diluted 1 / 500th in PBS, 1% BSA) are added and left for 30 min at 37 "C. After 2 washes in PBS, the development is carried out by incubating for 10 min at room temperature the slide covered with 200 μl of a solution containing the substrate, 1 tablet (10 mg) of 3.3 'diaminobenzidine (SIGMA) dissolved in 10 ml of 50 mM Tris pH 7.6, mixed immediately with 100 μl of 0.3% H 2 O. The slides are washed and the cells are stained with Meyer's Hemalun (MERCK) for 1 min at room temperature. dehydrated in methanol baths (70%, 90% and 100%), passed through toluene and mounted with a drop of mounting resin (BIOLYON).

L'analyse est faite en microscopie photonique.The analysis is done by light microscopy.

Dans ces conditions , une coloration marron du cytoplasme est observée, révélant la fixation de ces anticorps. Aucune coloration n'est obtenue avec un anticorps utilisé comme contrôle négatif. Lorsque les LGL sont activés une nuit en présence d'IL-2 recombinant (250
U/ml), une partie seulement de la population cellulaire est colorée. Après sept jours de culture en présence d'IL2 à la même concentration toute la population cellulaire est colorée.Under these conditions, a brown coloration of the cytoplasm is observed, revealing the binding of these antibodies. No staining is obtained with an antibody used as a negative control. When LGLs are activated overnight in the presence of recombinant IL-2 (250
U / ml), only part of the cell population is colored. After seven days of culture in the presence of IL2 at the same concentration, the entire cell population is colored.

II-12 Détection des granzymes A et B sur les biopsies de peau de patients présentant une GVH par immunohistochimie. II-12 Detection of granzymes A and B on skin biopsies of patients with GVH by immunohistochemistry.

Lors d'une greffe de moelle allogénique réalisée en identité HLA, le syndrome clinique de la réaction du greffon contre l'hôte ou GVH est fréquemment observé. Les manifestations cliniques de la GVH se caractérisent par des atteintes de la peau, de l'intestin et du foie. Les biopsies de peaux sont considérées comme le meilleur matériel pour établir le diagnostic de GVH grâce à l'histologie et l'immunohistochimie. Les biopsies de 2 patients (RAP : leucémie myeloïde chronique (LMC) ; REN leucémie aiguë myeloïde (LAM)) présentant des lésions compatibles avec une GVH ont été étudiées. During an allogeneic marrow transplant performed in HLA identity, the clinical syndrome of the graft versus host reaction or GVH is frequently observed. The clinical manifestations of GVH are characterized by damage to the skin, the intestine and the liver. Skin biopsies are considered the best material for diagnosing GVHD through histology and immunohistochemistry. The biopsies of 2 patients (RAP: chronic myeloid leukemia (CML); REN acute myeloid leukemia (AML)) with lesions compatible with GVH were studied.

Les biopsies de peau congelées en OCT (Tissue-Tek,
MILES), fixées en acétone pendant 10 min à 4"C, sont coupées à froid à 5 pm. Les coupes de tissus sont saturées avec du sérum de cheval (kit Vectastin, VECTOR) pendant 20 min à température ambiante. Après un lavage en PBS, 2,5 pg de l'anticorps à tester sont déposés sur la coupe pendant 30 min à température ambiante. On rapporte les résultats d'expériences réalisées avec les anticorps anti-granzymes
GRA51D et GRA66D. Les lames sont lavées 3 fois en PBS puis incubées avec 50 pi d'anticorps anti Ig de souris biotinylés (kit Vectastin) pendant 30 min à température ambiante, puis avec de l'avidine mélangée à de la peroxidase biotinylée (kit Vectastin) pendant 1 heure à température ambiante.Après 2 lavages en PBS, la révélation est effectuée en incubant pendant 10 min à température ambiante la lame recouverte par 50 pl d'une solution contenant le substrat (1 pastille (10 mg) de diaminobenzidine, dissoute dans 10 ml de Tris 50 mM pH 7,6, mélangés extemporanément à 100 pi de H202 à 0,03 %). Les lames sont lavées et les coupes de tissus sont colorées par de l'Hémalun de Meyer pendant 1 min à température ambiante.Skin biopsies frozen in OCT (Tissue-Tek,
MILES), fixed in acetone for 10 min at 4 "C., are cold cut at 5 pm. The tissue sections are saturated with horse serum (Vectastin kit, VECTOR) for 20 min at room temperature. After washing in PBS, 2.5 μg of the antibody to be tested are deposited on the section for 30 min at room temperature The results of experiments carried out with anti-granzyme antibodies are reported
GRA51D and GRA66D. The slides are washed 3 times in PBS and then incubated with 50 μl of anti-Ig antibodies from biotinylated mice (Vectastin kit) for 30 min at room temperature, then with avidin mixed with biotinylated peroxidase (Vectastin kit) for 1 hour at room temperature. After 2 washes in PBS, the development is carried out by incubating for 10 min at room temperature the slide covered with 50 μl of a solution containing the substrate (1 tablet (10 mg) of diaminobenzidine, dissolved in 10 ml of 50 mM Tris pH 7.6, mixed immediately with 100 μl of 0.03% H 2 O 2). The slides are washed and the tissue sections are stained with Meyer's Hemalun for 1 min at room temperature.

Les coupes de tissus sont lavées, déshydratées dans des bains d'éthanol (70 %, 90 % et 100 %), passées dans du toluène et montées avec une goutte de résine de montage.The tissue sections are washed, dehydrated in ethanol baths (70%, 90% and 100%), passed through toluene and mounted with a drop of mounting resin.

L'analyse est faite en microscopie photonique.The analysis is done by light microscopy.

On observe comme précédemment invitro, dans le cas des LGL, une coloration du cytoplasme des lymphocytes infiltrant la peau. Aucune coloration n'est obtenue avec l'anticorps contrôle utilisé comme témoin négatif. As previously invitro is observed, in the case of LGL, a staining of the cytoplasm of the lymphocytes infiltrating the skin. No staining is obtained with the control antibody used as a negative control.

De plus, la coloration indiquant la fixation des différents anticorps anti-granzymes se trouve être localisée au niveau des infiltrats lymphocytaires qui ont été caractérisés en immunohistochimie par les marqueurs membranaires de différenciation des lymphocytes (CD3, CD4,
CD8).In addition, the coloration indicating the fixation of the various anti-granzyme antibodies is found to be localized at the level of the lymphocyte infiltrates which have been characterized in immunohistochemistry by the membrane markers for differentiating lymphocytes (CD3, CD4,
CD8).

III - Production de perforine recombinante de souris. III - Production of recombinant mouse perforin.

Pour produire de la perforine recombinante de souris, on utilise un vecteur d'expression procaryote pAR3039 qui exprime les protéines sous le contrôle des signaux de transcription et de traduction du phage T 7 (voir Studier et al., : J. Mol. Biol., 189, 113-130, 1986). To produce recombinant mouse perforin, a prokaryotic expression vector pAR3039 is used which expresses the proteins under the control of the transcription and translation signals of phage T 7 (see Studier et al.,: J. Mol. Biol. , 189, 113-130, 1986).

On excise un fragment SmaI-EcoRV de 1400 pb d'un clone d'ADNc complet de perforine de souris. Ce segment code pour la partie C-terminale de la perforine de souris mature recouvrant les résidus 98 à 534 (voir figure unique). A 1400 bp SmaI-EcoRV fragment is excised from a complete mouse perforin cDNA clone. This segment codes for the C-terminal part of the perforin of mature mice covering residues 98 to 534 (see single figure).

L'extrémité franche du segment est ligaturée dans le site BamH1 du vecteur pAR3039 à l'aide de linkers phosphorylés (5'- CCG GAT CCGG-3'). The blunt end of the segment is ligated into the BamH1 site of the vector pAR3039 using phosphorylated linkers (5'-CCG GAT CCGG-3 ').

Ce plasmide est appelé pAR3039-perf. This plasmid is called pAR3039-perf.

On transforme avec ce plasmide des bactéries
E.coli DE3 qui contiennent dans leur génome le gène de la polymérase T7 sous le contrôle d'un promoteur inductible
IPTG. Des bactéries correspondantes ont été déposées à la
C.N.C.M. le 12 mars 1991 sous le n" I-1057. We transform bacteria with this plasmid
E.coli DE3 which contain in their genome the T7 polymerase gene under the control of an inducible promoter
IPTG. Corresponding bacteria have been deposited at the
CNCM on March 12, 1991 under the number I-1057.

La synthèse de la perforine recombinante est induite par IPTG dans les bactéries transformées. The synthesis of recombinant perforin is induced by IPTG in the transformed bacteria.

On purifie la perforine recombinante de 45 kDa en lysant le culot bactérien (à partir de 100 ml de culture) avec 20 ml d'une solution contenant 50 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 0,5 mM d'EDTA et 10 Wug/ml de lypozyme pendant 12 heures sur de la glace. The recombinant 45 kDa perforin is purified by lysing the bacterial pellet (from 100 ml of culture) with 20 ml of a solution containing 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.5 mM EDTA and 10 Wug / ml of hypozyme for 12 hours on ice.

Après addition de 1,5 ml de NaCl 5M et de 1,5 ml de NP-40 à 10 %, on maintient les bactéries lysées 20 minutes sur de la glace. After adding 1.5 ml of 5M NaCl and 1.5 ml of 10% NP-40, the lysed bacteria are kept for 20 minutes on ice.

L'ADN bactérien est ensuite fragmenté par sonication et les corps d'inclusion protéiques sont centrifugés, 15 minutes à 12 000 t/min. The bacterial DNA is then fragmented by sonication and the protein inclusion bodies are centrifuged for 15 minutes at 12,000 rpm.

Le culot est lavé à trois reprises avec une solution de 50 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 0,5 mM d'EDTA et 300 mM de NaCl et dissous dans du tampon SDS-PAGE. The pellet is washed three times with a solution of 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.5 mM EDTA and 300 mM NaCl and dissolved in SDS-PAGE buffer.

La protéine recombinante de 45 kDa est séparée de la majorité des protéines bactériennes par SDS-PAGE (10 g de gel de polyacrylamide) et soumise à une électroélution en utilisant le dispositif d'élution de protéines ISCO. The 45 kDa recombinant protein is separated from the majority of bacterial proteins by SDS-PAGE (10 g polyacrylamide gel) and subjected to electroelution using the ISCO protein elution device.

On obtient en routine de 1 à 2 mg de perforine recombinante à partir de 100 ml de culture bactérienne. 1 to 2 mg of recombinant perforin is routinely obtained from 100 ml of bacterial culture.

IV - Production de l'anticorps monoclonal antiperforine CE2.10 1) Processus d'immunisation
Des rats mâles OFA sont immunisés par voie intrapéritonéale avec 50 pg de perforine recombinante murine (ou rMup) puis par une seconde injection, par voie intrapéritonéale, 3 semaines plus tard. 3 jours avant de prélever les splénocytes (pour la production d'hybridomes), on injecte 50 pg de rMuP dans la veine de la queue sans adjuvant. IV - Production of the antiiperforin monoclonal antibody CE2.10 1) Immunization process
OFA male rats are immunized intraperitoneally with 50 μg of murine recombinant perforin (or rMup) and then by a second injection, intraperitoneally, 3 weeks later. 3 days before removing the splenocytes (for the production of hybridomas), 50 μg of rMuP are injected into the tail vein without adjuvant.

2) Production d'hybridomes et sélection
En opérant comme décrit par Harlow et Lane dans
Cold Spring Harbor Laboratory - New-York, 1988, on réalise la fusion de cellules de myélome Sp2/0-Ag86 ne produisant pas d'immunoglobulines avec des splénocytes de rats immunisés avec la rMuP. Brièvement, les splénocytes sont récupérés en introduisant avec précaution dans les tissus de la rate avec une aiguille et une seringue du milieu RPMI dépourvu de sérum. Les splénocytes sont lavés avec le milieu comme effectué avec les cellules de myélome. 108 splénocytes sont alors mélangés avec 107 cellules de myélome dans un tube FALCON de 50 ml et soumis à centrifugation pendant 10 minutes à 1 000 t/min. On élimine autant de surnageant que possible.Les cellules sont remises en suspension en tapant doucement sur les parois du tube et on ajoute goutte à goutte 0,4 ml de polyéthylène glycol 1500 chaud 50 * (p/v) (PEG, Serva, cat. N" 33123) tout en maintenant le tube dans un bain marie à 37"C. Après l'addition de tout le PEG, le tube est maintenu à 37"C pendant 3 min puis centrifugé à 800 t/min pendant 5 min.2) Production of hybridomas and selection
By operating as described by Harlow and Lane in
Cold Spring Harbor Laboratory - New York, 1988, the fusion of Sp2 / 0-Ag86 myeloma cells not producing immunoglobulins is carried out with splenocytes from rats immunized with rMuP. Briefly, the splenocytes are recovered by introducing carefully into the tissues of the spleen with a needle and a syringe of RPMI medium devoid of serum. The splenocytes are washed with the medium as carried out with the myeloma cells. 108 splenocytes are then mixed with 107 myeloma cells in a 50 ml FALCON tube and subjected to centrifugation for 10 minutes at 1000 rpm. As much supernatant is removed as possible, the cells are resuspended by gently tapping the walls of the tube and 0.4 ml of hot polyethylene glycol 1500 50 * (w / v) (PEG, Serva, cat) is added dropwise. . No. 33123) while maintaining the tube in a water bath at 37 "C. After the addition of all the PEG, the tube is maintained at 37 "C for 3 min and then centrifuged at 800 rpm for 5 min.

Sans enlever le surnageant, on ajoute 5 ml de milieu RPMI dépourvu de sérum (à 37"C) en 2 min, puis à nouveau 5 ml en une fois. Les cellules sont centrifugées à 1 000 t/min pendant 5 min. Le surnageant est éliminé et on ajoute 50 ml d'un milieu RPMI complet - 5 % de FCS. La suspension cellulaire est distribuée dans dix plaques de 96 puits auxquelles on a ajouté au préalable des monocytes péritonéaux/macrophages (cellules nourricières) provenant de souris Balb/c (1 à 5 jours avant). Les plaques sont incubées à 37"C dans une atmosphère humidifiée à 5 % de C02 pendant 24 heures, avant de remplacer le milieu avec un milieu frais cRPMI-5* FCS supplémenté avec 1 % de HAT (Gibco). On laisse les cellules croître pendant environ 10 jours. A ce stade, environ 70 % des puits comportent des clones qui se sont développés, beaucoup d'entr'eux possédant plus d'un seul clone. Environ 20 jours après la fusion, les cellules dans la majorité des puits contenant des hybridomes ont atteint une densité pratiquement maximale et 100 pl de chaque puits sont prélevées pour effectuer un test ELISA sur de la rMuP et de la perforine de murin native. Des hybridomes fortement positifs sont sous-clonés comme décrit dans l'article de Harlow dont question ci-dessus et soumis à une autre opération de sélection.Without removing the supernatant, 5 ml of serum-free RPMI medium (at 37 ° C.) are added over 2 min, then again 5 ml at once. The cells are centrifuged at 1000 rpm for 5 min. is removed and 50 ml of complete RPMI medium - 5% FCS are added. The cell suspension is distributed into ten 96-well plates to which peritoneal monocytes / macrophages (feeder cells) from Balb mice / have been added beforehand. c (1 to 5 days before). The plates are incubated at 37 "C in a humidified atmosphere at 5% CO 2 for 24 hours, before replacing the medium with a fresh medium cRPMI-5 * FCS supplemented with 1% HAT (Gibco). The cells are allowed to grow for about 10 days. At this stage, about 70% of the wells have clones that have grown, many of them having more than one clone. About 20 days after fusion, the cells in the majority of the wells containing hybridomas have reached a practically maximum density and 100 μl of each well are taken to carry out an ELISA test on rMuP and native murine perforin. Strong positive hybridomas are subcloned as described in the Harlow article mentioned above and subjected to another selection operation.

Sélection par test ELISA pour obtenir un anticorps monoclonal anti-perforine. Selection by ELISA test to obtain a monoclonal anti-perforin antibody.

Des plaques de microtitration de 96 puits (Dynatech, MIC 2000) sont recouverts pendant environ 14 heures à 4"C avec 100 pl de rMuP (10 pg/ml dans PBS). En variante, les puits sont recouverts de granules dérivés de
CTL B6.1 de murin (solubilisés dans 1,5 M de NaCl, ultracentrifugês et dilués à 1/10 dans l'eau) ou de granules de cellules LAK humaines (solubilisés dans du phosphate 0,5 M, ultracentrifugés et dilués à 1/5 dans l'eau). Après lavage des puits à trois reprises avec PBS 0,02 % Tween-20, on ajoute 100 pl de surnageant d'hybridomes dans chaque puits en 2 h à température ambiante. Les puits sont lavés comme indiqué plus haut et on ajoute 50 pl d'immunoglobulines de chèvre anti-rat conjuguées à de la phosphatase alcaline (Sigma) en 1 heure.Microtiter plates of 96 wells (Dynatech, MIC 2000) are covered for approximately 14 hours at 4 "C with 100 μl of rMuP (10 μg / ml in PBS). Alternatively, the wells are covered with granules derived from
Murine CTL B6.1 (solubilized in 1.5 M NaCl, ultracentrifuged and diluted 1/10 in water) or granules of human LAK cells (solubilized in 0.5 M phosphate, ultracentrifuged and diluted to 1 / 5 in water). After washing the wells three times with 0.02% Tween-20 PBS, 100 μl of hybridoma supernatant is added to each well in 2 h at room temperature. The wells are washed as indicated above and 50 μl of anti-rat goat immunoglobulins conjugated to alkaline phosphatase (Sigma) are added over 1 hour.

Après le lavage, on ajoute 100 pi de substrat de phosphatase (p-nitrophényl phosphate, Sigma 104 tablettes) et on mesure le A405nm dès que la couleur commence à apparaître. Les puits témoins négatifs sont incubés avec cRPMI-5 % FCS au lieu d'être incubés avec des surnageants d'hybridomes. On récupère ainsi l'anticorps monoclonal anti-perforine désigné par l'abréviation CE2.10. After washing, 100 μl of phosphatase substrate (p-nitrophenyl phosphate, Sigma 104 tablets) are added and the A405nm is measured as soon as the color begins to appear. Negative control wells are incubated with cRPMI-5% FCS instead of being incubated with hybridoma supernatants. The anti-perforin monoclonal antibody thus designated by the abbreviation CE2.10 is thus recovered.

Claims (21)

REVENDICATIONS 1/ Anticorps dirigés contre les constituants des granules cytoplasmiques de cellules activées T "helper" ou de cellules cytotoxiques, plus spécialement des lymphocytes 1 / Antibodies directed against the constituents of the cytoplasmic granules of activated T "helper" cells or of cytotoxic cells, more especially lymphocytes T cytotoxiques et des cellules "natural killer", caractérisés en ce qu'il s'agit d'anticorps monoclonaux capables de réagir spécifiquement avec un épitope d'un constituant donné de ces granules, sous forme native ou sous forme recombinante, en particulier un épitope de granzyme ou de perforine, sous forme native ou recombinante, en donnant lieu à un composé du type antigène-anticorps.T cytotoxic and "natural killer" cells, characterized in that they are monoclonal antibodies capable of reacting specifically with an epitope of a given constituent of these granules, in native form or in recombinant form, in particular a granzyme or perforin epitope, in native or recombinant form, giving rise to a compound of the antigen-antibody type. 2/ Anticorps selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il s'agit d'anticorps monoclonaux anti-granzyme ou anti-perforine humains. 2 / Antibody according to claim 1, characterized in that they are monoclonal anti-granzyme or anti-perforin antibodies. 3/ Anticorps selon la revendication 2, caractérisés en ce que les anticorps monoclonaux antigranzymes sont des anticorps monoclonaux anti-granzyme A, B ou H humains. 3 / Antibodies according to claim 2, characterized in that the monoclonal antigranzyme antibodies are monoclonal anti-granzyme A, B or H human antibodies. 4/ Anticorps selon la revendication 1, caractérisés en ce qu'ils appartiennent à la classe des 4 / Antibodies according to claim 1, characterized in that they belong to the class of IgG, qu'ils sont dirigés contre des protéines de poids moléculaire d'environ 25 à 30 kDa (granzyme B), 60 kDa (granzyme A) ou 66-75 kDa environ (perforine).IgG, which they are directed against proteins of molecular weight of approximately 25 to 30 kDa (granzyme B), 60 kDa (granzyme A) or 66-75 kDa approximately (perforin). 5/ Anticorps selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisés en ce qu'ils sont susceptibles d'être induits par un procédé comprenant les étapes 5 / Antibodies according to one of claims 1 to 4, characterized in that they are capable of being induced by a process comprising the steps - de fusion de cellules de myélome non sécréteur avec des cellules productrices d'anticorps dirigés contre un constituant donné de granules cytoplasmiques de cellules cytotoxiques ou de cellules T "helper", en particulier d'anticorps dirigés contre les granzymes ou la perforine. - fusion of non-secreting myeloma cells with cells producing antibodies directed against a given constituent of cytoplasmic granules of cytotoxic cells or of "helper" T cells, in particular of antibodies directed against granzymes or perforin. - de purification des anticorps monoclonaux tels que produits par exemple à partir de liquides d'ascites ou de milieux de culture. - Purification of monoclonal antibodies as produced for example from ascites liquids or culture media. - de clonage de ces hybridomes, et  - cloning of these hybridomas, and - de sélection de cellules hybrides capables de produire des anticorps spécifiques vis-à-vis desdits constituants, - selection of hybrid cells capable of producing specific antibodies against said constituents, 6/ Anticorps monoclonaux anti-granzyme tels que sécrétés par les clones GRB 51D et GRA 66D déposés à la 6 / Anti-granzyme monoclonal antibodies as secreted by the clones GRB 51D and GRA 66D deposited at the CNCM sous les n" I-1060 et I-1059 le 12 mars 1991.CNCM under numbers I-1060 and I-1059 on March 12, 1991. 7/ Anticorps monoclonaux anti-perforine tels que sécrétés par le clone CE 2.10 déposé à la CNCM sous le n" 1-1058 le 12 mars 1991. 7 / Anti-perforin monoclonal antibodies as secreted by the clone CE 2.10 deposited at the CNCM under the number "1-1058 on March 12, 1991. 8/ Souches d'hybridomes caractérisées en ce qu'elles sont capables de sécréter des anticorps monoclonaux selon l'une quelconque des revendications précédentes. 8 / Hybridoma strains characterized in that they are capable of secreting monoclonal antibodies according to any one of the preceding claims. 9/ Souches d'hybridomes selon la revendication 8, caractérisées en ce qu'elles sont formées de cellules hybrides résultant de la fusion de cellules de myélome avec des cellules produisant des anticorps spécifiques après immunisation avec un constituant donné des granules cytoplasmiques de cellules cytotoxiques, plus spécialement avec des granzymes ou de la perforine purifiés. 9 / hybridoma strains according to claim 8, characterized in that they are formed from hybrid cells resulting from the fusion of myeloma cells with cells producing specific antibodies after immunization with a given constituent of the cytoplasmic granules of cytotoxic cells, especially with purified granzymes or perforin. 10/ Clones producteurs d'anticorps monoclonaux anti-granzyme déposés à la CNCM sous les n" I-1060 et I1059 le 12 mars 1991. 10 / Clones producing anti-granzyme monoclonal antibodies deposited at the CNCM under the numbers I-1060 and I1059 on March 12, 1991. 11/ Clone producteur d'anticorps monoclonaux antiperforine, déposé à la CNCM sous le n" I-1058 le 12 mars 1991. 11 / Clone producer of anti-perforin monoclonal antibodies, deposited at the CNCM under the number I-1058 on March 12, 1991. 12/ Procédé pour la préparation d'un hybridome selon l'une quelconque des revendications 8 à 11, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de fusion et de sélection définies dans la revendication 5. 12 / A method for the preparation of a hybridoma according to any one of claims 8 to 11, characterized in that it comprises the steps of fusion and selection defined in claim 5. 13/ Procédé selon la revendication 12 caractérisé en ce que les cellules de myélome sont des cellules de myéline NS1 et que les cellules productrices d'anticorps monoclonaux sont des splénocytes. 13 / A method according to claim 12 characterized in that the myeloma cells are myelin NS1 cells and that the cells producing monoclonal antibodies are splenocytes. 14/ Méthode de détection invitro de la présence de constituants des granules cytoplasmiques de cellules T "helper" ou de cellules cytotoxiques, en particulier de granzymes ou de perforine dans un échantillon biologique, caractérisée en ce qu'elle comprend 14 / Invitro detection method for the presence of constituents of cytoplasmic granules of "helper" T cells or of cytotoxic cells, in particular of granzymes or of perforin in a biological sample, characterized in that it comprises - la mise en contact de l'échantillon provenant d'un patient susceptible d'être atteint d'une maladie s'accompagnant de l'exocytose desdits constituants, en particulier de granzyme ou de perforine, avec une préparation d'anticorps monoclonal ou d'un fragment de ce dernier, tel que défini dans l'une des revendications 1 à 7, dans des conditions appropriées pour la production d'un complexe antigène-anticorps, et la détection de la liaison immunologique. - bringing the sample from a patient likely to be suffering from a disease accompanied by the exocytosis of said constituents, in particular granzyme or perforin, into contact with a preparation of monoclonal antibody or 'a fragment of the latter, as defined in one of claims 1 to 7, under conditions suitable for the production of an antigen-antibody complex, and the detection of the immunological binding. 15/ Kit pour la détection invitro de la présence des constituants des granules cytoplasmiques de cellules T "helper" ou de cellules cytotoxiques en particulier de granzyme ou de perforine dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend 15 / Kit for the in vitro detection of the presence of the constituents of the cytoplasmic granules of "helper" T cells or of cytotoxic cells, in particular of granzyme or perforin in a biological sample, characterized in that it comprises - une phase solide appropriée servant de support pour le dosage, telle qu'une plaque de micro-titrage, - an appropriate solid phase serving as a support for the assay, such as a micro-titration plate, - une préparation d'anticorps monoclonal spécifique ou de fragment, libre ou immobilisé, comme défini dans l'une des revendications 1 à 7. - a preparation of specific monoclonal antibody or fragment, free or immobilized, as defined in one of claims 1 to 7. - des solutions tampons appropriées pour les réactions immunologiques et pour les réactions de détection. - appropriate buffer solutions for immunological reactions and for detection reactions. - un système de détection spécifique du marqueur, - a specific marker detection system, - une préparation desdits constituants, plus spécialement de granzyme ou de perforine avec le cas échéant un groupe marqueur, et, lorsque la préparation ne comporte pas de groupe marqueur, une préparation d'un deuxième anticorps avec un tel groupe, a preparation of said constituents, more particularly of granzyme or of perforin with, where appropriate, a marker group, and, when the preparation does not contain a marker group, a preparation of a second antibody with such a group, 16/ Application des anticorps monoclonaux selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 à la détection de la présence de constituants des granules cytoplasmiques sécrétés par des cellules cytotoxiques. 16 / Application of the monoclonal antibodies according to any one of claims 1 to 7 to the detection of the presence of constituents of the cytoplasmic granules secreted by cytotoxic cells. 17/ Protéines des granules cytoplasmiques des cellules T "helper" ou des cellules cytotoxiques, caractérisées en ce qu'il s'agit de protéines recombinantes reconnues par un anticorps monoclonal selon l'une des revendications 1 à 7, telles qu'obtenues, par génie génétique, dans des hôtes cellulaires, notamment des bactéries, transformés par introduction de vecteurs d'expression, notamment de plasmides, renfermant des fragments de gène codant pour les séquences d'acides aminés recherchées. 17 / Proteins of the cytoplasmic granules of “helper” T cells or of cytotoxic cells, characterized in that they are recombinant proteins recognized by a monoclonal antibody according to one of claims 1 to 7, as obtained, by genetic engineering, in cellular hosts, in particular bacteria, transformed by introduction of expression vectors, in particular of plasmids, containing gene fragments coding for the desired amino acid sequences. 18/ Fragments d'ADN caractérisés en ce qu'ils sont constitués par la séquence codante vis-à-vis d'une protéine selon la revendication 17, ou qu'ils comportent une telle séquence, et qu'ils sont le cas échéant incorporés dans un vecteur d'expression tel qu'un plasmide. 18 / DNA fragments characterized in that they consist of the coding sequence for a protein according to claim 17, or that they contain such a sequence, and that they are optionally incorporated in an expression vector such as a plasmid. 19/ Vecteurs d'expression notamment plasmide renfermant un fragment d'ADN selon la revendication 18, et hôtes cellulaires transformés par ces vecteurs, en particulier la souche d'E.coli transformée mPerf-PL 40 déposée à la 19 / Expression vectors, in particular plasmid containing a DNA fragment according to claim 18, and cellular hosts transformed by these vectors, in particular the transformed E. coli strain mPerf-PL 40 deposited at C.N.C.M. le 12 mars 1991 sous le n" I-1057. C.N.C.M. March 12, 1991 under No. I-1057. 20/ Perforine recombinante selon la revendication 17 telle qu'exprimée par le fragment SmaI-EcoRV de 1400 paires de base environ, excisé d'un clone d'ADNc de perforine. 20 / Recombinant perforin according to claim 17 as expressed by the SmaI-EcoRV fragment of approximately 1400 base pairs, excised from a perforin cDNA clone. 21/ Perforine recombinante selon la revendication 20 correspondant à la séquence d'acides aminés allant de la position 98 à 534 sur la figure unique.  21 / Recombinant perforin according to claim 20 corresponding to the amino acid sequence going from position 98 to 534 in the single figure.