FR2666898A1 - Dispositif et procede de dosage rapide de recepteurs membranaires ou de leurs ligands. - Google Patents
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Abstract
Le procédé objet de la presente invention a pour but le dosage qualitatif, semi-quantitatif et quantitatif d'un ligand ou de son recepteur à partir d'un faible volume d'echantillon (50 à 100 mul) Il consiste à reconstituer partiellement, dans le dispositif egalement objet de la presente invention, la même cascade de reactions chimiques (flux ioniques, activations enzymatiques, production d'un produit final activé) que celles declenchées par le contact d'un ligand avec son recepteur au niveau des membranes cellulaires. Ce qui contribue à une amplification importante du signal devenu independant du ligand et de son recepteur,puisque chaque messager,en cas de reaction positive (presence de la substance recherchée) produit un très grand nombre de messagers suivants et ainsi de suite,pour aboutir à un produit final activé (comme par exemple l'activation d'une enzyme chromogène) agissant sur un substrat. Il s'agit d'une superposition de membranes jouant chacune un rôle precis: la goutte d'echantillon à tester est deposée sur la membrane (A) et migre de façon programmée dans le temps à travers les diverses membranes pour arriver au niveau de la membrane inferieure (D) et y reveler un signal eventuel si la reaction est positive: En prenant l'exemple d'un dosage de l'INTERLEUKINE-2: schéma pour l'abrégé.
Description
DISPOSITIF ET PROCEDE DE DOSAGE RAPIDE D'UN RECEPTEUR
MEMBRANAIRE OU DE SON LIGAND DANS UN FLUIDE BIOLOGIQUE
La presente invention est relative à un dispositif et un procédé pour la determination qualitative et quantitative d'une substance reactive presente dans un fluide.L'invention s'applique plus particulièrement,mais non limitativement,à la detection de la presence de recepteurs membranaires cellulaires fixes (à la surface externe ou dans la bicouche lipidique ou à la face interne de la dite membrane) ou libres (cellulaires extra ou intra-cytoplasmiques ;;circulant dans le sang,serum,plasma,et tous les fluides biologiques),ou à la detection des ligands (comme les facteurs de croissance,les cytokines,les neuromediateurs,etc..) specifiques de ces recepteurs dans un fluide quelconque,grace à l'activation et l'amplification de phenomènes chimiques (ex: flux de Ca++ ) ou de complexes enzymatiques (ex: phospholipase C ou la Phosphorylase a ou encore la Phospholipase A2) par le simple contact du ligand avec son recepteur.Ce sont ces reactions d'activation et d'amplification aboutissant à un produit final activé tout à fait different du ligand ou du recepteur recherché, qui vont permettre de detecter la presence de la molecule recherchée alors que dans les methodes de dosages classiques,la molecule recherchée (marquée ou non) est directement impliquée ou liée au signal.De plus,alors que dans les autres methodes,il existe une continuité dans le dosage,ici,le processus est discontinu.Exemple : un anticorps marqué radioactivement revèle la presence et le taux d'un antigène sur une plaque
Elisa;si après un rinçage intempestif,une partie du complexe Anticorps-antigène se detache de la plaque,le taux de radioactivité va diminuer,entrainant une fausse evaluation du dosage.Dans le procédé present,le contact ligand-recepteur declenche extrêmement vite un signal proportionnel au taux de la substance recherchée,qui à son tour declenche une cascade de reactions,qui vont se poursuivre même si entre temps le ligand s'est separé de son recepteur.Le signal n'est donc pas proportionnel à la durée ni à la permanence du contact ligand-recepteur.Ceci explique la rapidité des resultats mais aussi que les etapes de lavage, d'incubation,de rinçage,ne sont plus necessaires.
Les methodes deja existantes de determination de la presence ou de la concentration de ligands ou de leurs recepteurs dans des fluides biologiques utilisent le plus souvent les diverses techniques lentes et complexes d'electrophorèse ou la voie immunologique et elles sont bien connues;cette dernière est basée sur la formation d'un complexe entre l'antigène recherché (ici le ligand ou son recepteur) et un ou des anticorps specifiques au dit antigène, marqués le plus souvent par un element radioactif tel que l'iode 125,pour permettre sa detection et/ou son analyse quantitative après separation de l'anticorps marqué complexé à son antigène,de l'anticorps marqué non complexé.
MEMBRANAIRE OU DE SON LIGAND DANS UN FLUIDE BIOLOGIQUE
La presente invention est relative à un dispositif et un procédé pour la determination qualitative et quantitative d'une substance reactive presente dans un fluide.L'invention s'applique plus particulièrement,mais non limitativement,à la detection de la presence de recepteurs membranaires cellulaires fixes (à la surface externe ou dans la bicouche lipidique ou à la face interne de la dite membrane) ou libres (cellulaires extra ou intra-cytoplasmiques ;;circulant dans le sang,serum,plasma,et tous les fluides biologiques),ou à la detection des ligands (comme les facteurs de croissance,les cytokines,les neuromediateurs,etc..) specifiques de ces recepteurs dans un fluide quelconque,grace à l'activation et l'amplification de phenomènes chimiques (ex: flux de Ca++ ) ou de complexes enzymatiques (ex: phospholipase C ou la Phosphorylase a ou encore la Phospholipase A2) par le simple contact du ligand avec son recepteur.Ce sont ces reactions d'activation et d'amplification aboutissant à un produit final activé tout à fait different du ligand ou du recepteur recherché, qui vont permettre de detecter la presence de la molecule recherchée alors que dans les methodes de dosages classiques,la molecule recherchée (marquée ou non) est directement impliquée ou liée au signal.De plus,alors que dans les autres methodes,il existe une continuité dans le dosage,ici,le processus est discontinu.Exemple : un anticorps marqué radioactivement revèle la presence et le taux d'un antigène sur une plaque
Elisa;si après un rinçage intempestif,une partie du complexe Anticorps-antigène se detache de la plaque,le taux de radioactivité va diminuer,entrainant une fausse evaluation du dosage.Dans le procédé present,le contact ligand-recepteur declenche extrêmement vite un signal proportionnel au taux de la substance recherchée,qui à son tour declenche une cascade de reactions,qui vont se poursuivre même si entre temps le ligand s'est separé de son recepteur.Le signal n'est donc pas proportionnel à la durée ni à la permanence du contact ligand-recepteur.Ceci explique la rapidité des resultats mais aussi que les etapes de lavage, d'incubation,de rinçage,ne sont plus necessaires.
Les methodes deja existantes de determination de la presence ou de la concentration de ligands ou de leurs recepteurs dans des fluides biologiques utilisent le plus souvent les diverses techniques lentes et complexes d'electrophorèse ou la voie immunologique et elles sont bien connues;cette dernière est basée sur la formation d'un complexe entre l'antigène recherché (ici le ligand ou son recepteur) et un ou des anticorps specifiques au dit antigène, marqués le plus souvent par un element radioactif tel que l'iode 125,pour permettre sa detection et/ou son analyse quantitative après separation de l'anticorps marqué complexé à son antigène,de l'anticorps marqué non complexé.
Pour le dosage des recepteurs membranaires par voie immunologique,l'on peut citer
Judith L.Luborsky and Harold R.Behrman: Antiserum against rat luteinizing hormone (LH) receptors,insuline receptors and acethylcholine receptors dans Biochemical and biophysical research communications,pages 1407-1413,vol 90,No 4,1979.
Judith L.Luborsky and Harold R.Behrman: Antiserum against rat luteinizing hormone (LH) receptors,insuline receptors and acethylcholine receptors dans Biochemical and biophysical research communications,pages 1407-1413,vol 90,No 4,1979.
Pour le dosage des ligands,Astrid Zimmermann,Anne Sutter et Eric M.Shooter (Proc.Nat.Acad.Sci.USA - vol 78,No 7,pp 4611 - 4615,July 81) ont pu produire des anticorps monoclonaux contre le Beta-Nerve Growth Factor (Beta-NGF),ligand specifique des recepteurs des neurones sympathiques.
Alain Schreiber,Irit Lax,Yossef Yarden,Zelig Eshhar et Joseph Schlesinger (Institut Weizmann - Rehovot - Israel) ont publié leurs travaux dans Proc.Nat.Acad.Sci.USA-vol 78,No12,pp 75357539,December 1981 : ils ont pu produire à la fois des anticorps contre un ligand : le Epidermal
Growth Factor (EGF) et des anticorps contre son recepteur dans les glandes salivaires sousmaxillaires de souris,connues pour leur action trophique et cicatrisante.
Growth Factor (EGF) et des anticorps contre son recepteur dans les glandes salivaires sousmaxillaires de souris,connues pour leur action trophique et cicatrisante.
Depuis ces premiers travaux,la liste des anticorps reconnaissant des ligands ou leurs recepteurs s'est enormément allongée et de nombreux kits commerciaux proposent le dosage immunologique de ces substances.Les publications à ce sujet sont innombrables mais elles ont toutes un point commun: le dosage utilise exculsivement la voie immunologique decrite plus haut.
Ces dosages, qui representent certes un progrès considerable dans la connaissance de la biologie cellulaire et des echanges membranaires,ont malheureusement les defauts et les limites de tout dosage immunologique: alors que par exemple la detection immunologique de l'hormone hCG de grossesse circulant à raison de plusieurs microgrammes par litre,ne presente aucune difficulté,la detection de picogrammes de ligands comme par exemple l'interferon,l'EGF,le
TNF (Tumor Necrosis Factor) ou le NGF (Nerve Growth factor),les cytokines,etc est très difficile: si une molecule de ces ligands se lie à une molecule d'anticorps marqué,le signal delivré par ce dernier,sera imperceptible.Le même problème se pose pour le dosage de recepteurs.De plus,les bruits de fond dans les techniques immunologiques,interdisent tous dosages en dessous d'une certaine limite.Des ameliorations techniques,certes,ont permis par exemple en Immunohistologie de mettre en evidence des recepteurs membranaires grace à des anticorps marqués radioactivement ou par fluoresceine ou encore grâce au complexe Peroxydase Anti Peroxydase.
TNF (Tumor Necrosis Factor) ou le NGF (Nerve Growth factor),les cytokines,etc est très difficile: si une molecule de ces ligands se lie à une molecule d'anticorps marqué,le signal delivré par ce dernier,sera imperceptible.Le même problème se pose pour le dosage de recepteurs.De plus,les bruits de fond dans les techniques immunologiques,interdisent tous dosages en dessous d'une certaine limite.Des ameliorations techniques,certes,ont permis par exemple en Immunohistologie de mettre en evidence des recepteurs membranaires grace à des anticorps marqués radioactivement ou par fluoresceine ou encore grâce au complexe Peroxydase Anti Peroxydase.
Mais les dosages de ligand ou de recepteur circulants restent difficiles.
L'objet de l'invention est donc de mettre en evidence la presence de ligand ou de recepteur dans un echantillon, sans que le signal transmis à l'operateur ne provienne d'un quelconque marquage du ligand ou de son recepteur.
Comme le montrent les exemples qui vont etre decrits ci dessous,il est apparu que la plupart des ligands circulants (hormonaux comme l'insuline,la progesterone ou les estrogenes;neuromediateurs comme l'acethylcholine; facteurs de croissance comme l'EGF ou le
NGF;les messagers du systeme immunitaire et hematopoletique comme les interleukines;etc..),des ligands intracellulaires (metabolites ou messagers),etc..,provoquaient au contact de leur recepteur respectif,la mobilisation ou l'activation de plusieurs substances qui vont activer,chacune,plusieurs milliers de molecules d'autres substances,et ainsi de suite,pour aboutir à un resultat qui devient alors tout à fait quantifiable.Et ce,même si ce contact ligandrecepteur est transitoire.Effectivement,les reactions induites par le contact ligandrecepteur,continuent et vont en s'amplifiant alors même que le ligand a été metabolisé ou même deconnecté de son recepteur.
NGF;les messagers du systeme immunitaire et hematopoletique comme les interleukines;etc..),des ligands intracellulaires (metabolites ou messagers),etc..,provoquaient au contact de leur recepteur respectif,la mobilisation ou l'activation de plusieurs substances qui vont activer,chacune,plusieurs milliers de molecules d'autres substances,et ainsi de suite,pour aboutir à un resultat qui devient alors tout à fait quantifiable.Et ce,même si ce contact ligandrecepteur est transitoire.Effectivement,les reactions induites par le contact ligandrecepteur,continuent et vont en s'amplifiant alors même que le ligand a été metabolisé ou même deconnecté de son recepteur.
Pour illustrer simplement ce qui precède,il suffit de mesurer l'energie que peut fournir rapidement un muscle, et la comparer au nombre de molecules de neuromediateurs synaptiques qui ont declenché la cascade de reactions allant en s'amplifiant pour aboutir à la contraction musculaire.De même,l'action de quelques photons (chez certains animaux nocturnes) sur les recepteurs membranaires (comme la Rhodopsine) de cellules retiniennes.Un autre exemple interessant est celui de l'ornitorync (un mammifère marin des rivières du centre de l'Australie) qui possède sur son bec des organes capables de detecter les faibles signaux electriques emis par ses proies.Mais l'exemple le plus spectaculaire est sans contexte celui de Electrophorus electricus (poisson electrique ou Gymnote) ou encore celui de Torpedo marmorata (poisson torpille) qui delivrent de veritables decharges electriques au simple contact d'une partie de leur peau (la plaque ou organe electrique) recouverte de cellules appelées electrocytes.Ces derniers supportent à leur surface 30.000 recepteurs nicotiniques à l'acetylcholine par ,um2 et un simple influx nerveux mettant en contact des molecules d'acetylcholine avec ces recepteurs provoque un transfert brutal de cations (à travers les canaux contrôlés par l'acetylcholine) qui se transforme en decharge electrique de grande puissance.(1 kiloWatt pour les plus gros poissons).
La presente invention s'est en consequence donné pour but de pourvoir à un dispositif et à un procédé pour la determination qualitative et quantitative rapide de la presence d'une substance reactive,dans un fluide,repondant mieux aux necessités de la pratique que les dispositifs et procédés visant au même but proposés dans l'Art anterieur, notemment en ce que le dispositif conforme à l'invention presente une sensibilité très superieure à celles indiquées dans l'art anterieur,puisqu'il permet de detecter de très faibles concentrations de ligand ou de son recepteur,dans un fluide,notemment biologique,qui peuvent etre de quelques picogrammes,alors que les procédés de l'Art anterieur exigent des manipulations et des appareillages complexes; ;en ce qu'il permet de realiser d'abord une reaction très specifique entre un reactif et une substance à doser, ceci dans une zone du dispositif totalement et temporairement separée de la suivante pour laisser le temps aux reactions de se faire completement,en ce qu'il est capable de declen cher dans la zone suivante une cascade de reactions auto-amplifiées et auto-entretenues, aboutissant à un signal parfaitement quantifiable par tous les modes de lecture tels que colorimetrie,fluorescence,chemiluminescence, spectrophotometrie,etc.. et en ce qu'il permet de realiser des dosages très rapides qualitatifs,semi-quantitatifs et quantitatifs.
Le but de la presente invention est donc de reproduire artificiellement et le plus fidèlement possible certaines reactions biologiques,chimiques ou enzymatiques qui se produisent quand la liaison ligand-recepteur se produit naturellement dans la cellule,et d'y associer ou incorporer un procédé capable d'emettre un signal (par exemple une coloration d'un substrat chromogène par activation finale d'une enzyme issue des dites reactions) afin de determiner qualitativement ou quantativement la presence d'un ligand ou de son recepteur dans un fluide.
Pour les dosages qualitatifs,le dispositif est caractérisé en ce qu'il comprend,en combinaison,de haut en bas Figures 1 (lA-lB-lC) et 2: - une première zone constituée d'une membrane plane (A) en materiau poreux de type cellulose, nylon, polycarbonate, etc..prevue pour recevoir un echantillon de fluide à tester et destinée à filtrer et preparer cet echantillon par des reactifs prealablement insérés dans la dite membrane et conservés ainsi à sec ou lyophilisés (tampons pour l'equilibrer sur le plan ionique,ions,proteines,etc. .)dans le but de reconstituer le plus fidèlement possible le milieu extra cellulaire et si possible le milieu extracellulaire specifique de la cellule concernée par le diagnostic recherché.
- une double membrane (B) (feuillet superieur B1 et feuillet inferieur B2),plane,de nature lipidique ou proteïque (ou les deux) ou synthetique (polycarbonate,nylon,etc),structurée en bicouche permeable, supportant:
- sur le feuillet superieur (B1),un reactif de reference (R1) fixe ou mobile, apte à reconnaitre la substance recherchée.
- sur le feuillet superieur (B1),un reactif de reference (R1) fixe ou mobile, apte à reconnaitre la substance recherchée.
- à la face inferieure du feuillet inferieur (B2),un reactif (R2) en quantité au moins equimolaire au reactif (R1) et surtout biochimiquement complementaires avec ces derniers puisque le contact avec (R1) de la substance recherchée,transmet un signal à (R2) qui active à son tour la cascade de reactions cytoplasmiques.
- parmi les divers composants de cette double membrane (B) se trouvent des substances jouant chacune un rôle specifique (rigidité de la membrane (aminoglycannes),fixation des reactifs R1 ou R2,substances (ex: enzyme Adenylate cyclase) inactives au repos mais activées par R2 en cas de reaction ligand-recepteur,etc) et qui seront decrites plus loin dans les exemples.
Cette membrane (B) tente ainsi de reconstituer le mieux posible une membrane cellulaire.
A Ia face inferieure de cette membrane se trouve une membrane fine (M1) à lyse programmée dont plusieurs types seront detaillés plus loin.Elle arrête temporairement I'ecoulement des liquides de l'echantillon à tester,laissant le temps aux diverses reactions de se faire au dessus.
- une troisième zone (C) distincte et sous-jacente aux precedentes qui est en fait un espace contenant une association de reactifs inactivés au prealable et deposés ici en solution puis sechés ou lyophilisés. L'arrivée de I'echantillon liquide solubilise cette zone (C) initie toute une serie de reactions en cas de liason ligand-recepteur.
- une membrane plane (M2) de composition identique à (M1) et destinée à isoler au moins provisoirement la zone (C) pour laisser le temps aux diverses reactions de s'accomplir et
s' amplifier, et empecher ainsi temporairement l'ecoulement prematuré de l'echantillon à tester vers la zone sous-jacente (D).
s' amplifier, et empecher ainsi temporairement l'ecoulement prematuré de l'echantillon à tester vers la zone sous-jacente (D).
- une quatrième zone (D) constituée d'un support poreux quelconque plat (cellulose,nylon,etc) contenant des moyens de revelation de la reaction qui s'est eventuellement produite dans les zones sus-jacentes.
Selon un autre mode de realisation du dispositif,les membranes B1,B2 ne seraient pas planes mais divisées en plusieurs unités microspheriques concentriques bilamellaires du type liposome,presentant à la surface externe de la première membrane (B1) le reactif (RI) libre ou
fixé,et à la surface interne de la seconde membrane (B2) le reactif (R2) libre ou fixé.Ces liposo mes enferment donc l'espace (C) avec tous ses constituants cytoplasmiques.Si le resultat est positif (ex : presence d'un ligand),le contact ligand-recepteur provoque,via R2,à l'interieur des liposomes,une cascade de reactions aboutissant à l'ouverture de pores ou de canaux dans la membrane liposomique,par lesquels va être expulsé hors du liposome vers la zone (D),un ion (par ex:Ca++ ) ou le produit final activé (par ex : une enzyme).Dans certains cas,le contact ligand-recepteur provoque la lyse du liposome et la liberation de substances (colorants ou tout autre reactif) capables d'indiquer que le dosage est positif.
fixé,et à la surface interne de la seconde membrane (B2) le reactif (R2) libre ou fixé.Ces liposo mes enferment donc l'espace (C) avec tous ses constituants cytoplasmiques.Si le resultat est positif (ex : presence d'un ligand),le contact ligand-recepteur provoque,via R2,à l'interieur des liposomes,une cascade de reactions aboutissant à l'ouverture de pores ou de canaux dans la membrane liposomique,par lesquels va être expulsé hors du liposome vers la zone (D),un ion (par ex:Ca++ ) ou le produit final activé (par ex : une enzyme).Dans certains cas,le contact ligand-recepteur provoque la lyse du liposome et la liberation de substances (colorants ou tout autre reactif) capables d'indiquer que le dosage est positif.
Pour les dosages semi-quantitatifs,il est necessaire de neutraliser une certaine quantité de la substance recherchée, correspondant à la valeur physiologique contenue dans un echantillon considéré normal.ll est donc necessaire que cette quantité ne vienne pas en contact avec les reactifs de reference situés à la surface de (B1).Figure 8.1 (exemple de dosage semi-quantitatif de l'EGF) :: pour cela il suffit d'inserer sous la zone (A) et donc au dessus de la membrane (B1),une membrane plane (B0) de composition identique à (B1) mais ne supportant à sa surface qu'une certaine quantité de reactifs de reference (R1).Ces derniers se lieront avec la quantité physiologique de substance recherchée mais ne produiront aucun signal vers l'espace sousjacent qui n'est pas un espace de type cytoplasmique,et surtout parce qu'il manquera les reactifs (R2) pour transmettre le signal de contact en provenance de (R1).Par contre la substance excedentaire recherchée dans l'echantillon,ne trouvant plus de reactif de reference (R1) disponible sur cette première membrane (B0),traverse cette dernière sans difficulté et vient en contact avec le reactif de reference (R1) de la membrane (Bl),qui lui,transmettra bien un signal vers le reactif (R2) de la membrane (B2) et donc vers le cytoplasme sous-jacent (C) pour reveler en (D) l'excès de la substance recherchée.Pour les mêmes raisons que celles citées plus haut,il convient de programmer ces differentes reactions en inserant entre les membranes (B0) et (B1) une membrane (Ml) à lyse programmée (Fig. 8.1) destinée à laisser le temps à la quantité physiologique de substance recherchée de se lier au reactif de reference de (B0).
Selon un autre mode de realisation du dispositif semi-quantitatif,il est possible de faire supporter par (B0) non pas des reactifs de reference (R1) mais une certaine quantité d'anticorps fixes reconnaissant la substance recherchée et liant donc ainsi la quantité physiologique de cette substance,l'empechant d'entrer en contact avec le reactif (R1) à l'etage sous-jacent.(Figure 4.1: exemple de dosage semi-quantitatif de l'EGF)
Selon un autre mode de realisation avantageux du dispositif,il est possible d'eviter le recours aux membranes supplementaires (B0) et (Ml): en associant aux composants de la zone (A),une certaine quantité d'anticorps mobiles reconnaissant une certaine quantité de la substance recherchée.ll est apparu (Schreiber et al;Dec 1981 - Proc.Natl.Acad.Sci.USA - vol 78) qu'un anticorps complexé avec une molecule de substance recherchée, empechait cette dernière de reagir à l'etage sous-jacent (B1) avec le reactif correspondant (R1).
Selon un autre mode de realisation avantageux du dispositif,il est possible d'eviter le recours aux membranes supplementaires (B0) et (Ml): en associant aux composants de la zone (A),une certaine quantité d'anticorps mobiles reconnaissant une certaine quantité de la substance recherchée.ll est apparu (Schreiber et al;Dec 1981 - Proc.Natl.Acad.Sci.USA - vol 78) qu'un anticorps complexé avec une molecule de substance recherchée, empechait cette dernière de reagir à l'etage sous-jacent (B1) avec le reactif correspondant (R1).
Il est même apparu (J.Luborski et H. Behrman - Biochemical and Biophysical research Communications - Vol 90 - Oct 79) que le complexe anticorps+substance recherchée,au cas où il se lierait malgré tout au reactif (Rl),inhibait totalement la transmission du signal vers (R2) et donc inhibait la cascade de reactions.(Les auteurs cités ont demontré que les anticorps anti LH n'empechaient pas la LH de se fixer sur ses recepteurs des cellules d'ovaires de rat mais la production de progesterone par ces cellules etait inhibée,alors que la LH non liée à son anticorps provoquait la liberation de progesterone).Seules,les molecules excedentaires de substance recherchée,non complexées à des anticorps,transmettent un signal par l'intermediaire de (R1) puis (R2) vers le cytoplasme (Fig. 4.0 dans l'exemple de l'EGF).La membrane à lyse programmée (MO) jouera le même rôle que celui deja decrit plus haut: laisser le temps aux anticorps de reconnaitre une certaine partie de la substance à doser et donc de la neutraliser.
Selon un autre mode de realisation du dispositif pour la determination semi-quantitative d'une substance,la membrane B0 est la même mais les membranes (B1) et (B2) peuvent etre divisées en plusieurs unités microspheriques bilamellaires enfermant l'espace (C) et tous ses constituants cytoplasmiques,comme decrit plus haut pour les dosages qualitatifs.
Le dispositif pour la determination quantitative d'une substance est identique au dispositif qualitatif sauf qu'un appareillage de quantification (par exemple reflectometre,colorimetre,etc..) sera necessaire pour evaluer,après etalonnage precis,l'intensité du signal emis par l'etage de lecture (t)).Si le produit final des reactions est une liberation de Ca++,une quantification precise peut se faire grace à des sondes fluorescentes (decrites plus loin).
Selon un autre mode de realisation du dispositif conforme à la presente invention,les membranes à lyse programmée (MO ou M1 ou M2) ne pourront être lysées que par un agent independant de ces membranes,et qui pourra être eventuellement associé à sec aux reactifs de la zone (A);(par exemple de la collagenase pour lyser des membranes de collagène).Ceci garantira un peu plus une impermeabilité et une separation totale des differents compartiments tant que l'echantillon fluide n'a pas été en contact avec le dispositif.
Selon un autre mode de realisation avantageux du dispositif conforme à la presente invention,le materiau dont sont constituées les membranes (MO ou M1 ou M2)) à lyse programmée,est tel que celles-ci sont dissoutes chacune au bout d'un temps approprié par la phase liquide acqueuse de l'echantillon à tester et non par un quelconque agent de lyse comme decrit plus haut.
Selon un mode de realisation avantageux du dispositif conforme à la presente invention,les membranes (B1) et (B2) sont cette fois,impermeables.Mais après irradiation au cobalt elles acquièrent une porosité très fine possedant un double interet ici: - la finesse de la porosité entraine un ralentissement naturel de l'ecoulement du fluide de l'echantillon et il n'est plus necessaire d'utiliser des membranes à lyse programmées.
- Ces pores peuvent etre comblés par la meme substance que celle des membranes à lyse programmées et contribuer ainsi à une meilleure programmation de l'ecoulement des fluides vers les zones sous-jacentes.
Selon un mode de realisation avantageux du dispositif conforme à la presente invention,la zone (D) contient un substrat chromogène lorsqu'il est prevu que la lecture de la reaction devra se faire par colorimetrie,et que l'enzyme activé en cas de reaction positive,colore le substrat chromogène.
Selon un autre mode de realisation avantageux du dispositif conforme à l'invention,la superposition des membranes decrite plus haut (A -B - M1 -C -M2 -D),peut etre inserée au fond d'un puits des plaques du type ELISA,selon le principe deja existant (ex : Pall) pour les methodes immunologiques.L'echantillon à tester sera simplement deposé au fond du puits pendant un temps determiné.A la difference du procédé immunologique,il n'y a pas d'autre manipulation,le dosage n'est pas basé sur une reaction antigène à doser - anticorps et la sensibilité est bien superieure.La lecture se fera à la face inferieure de la plaque Elisa,soit à l'oiel nu pour les dosages qualitatifs de type oui-non soit par des appareils de quantification.
Selon un autre mode de realisation du dispositif conforme à l'invention,la dite superposition de membranes decrite plus haut peut etre prise (ou thermosoudée) entre deux fines plaques d'un quelconque materiau dont la superieure,opaque,sera perforée pour y deposer l'echantfflon, tandis que l'inferieure sera transparente pour lire le resultat de la reaction;ce qui permet de presenter le dispositif sous la forme d'une carte de type carte de credit,ou sous la forme d'une bandelette,en tous cas sous la forme d'un objet petit et simple.
Selon un autre mode de realisation du dispositif conforme à la presente invention,la migration des fluides de l'echantillon se fait sur un plan horizontal sur un support unique de type bandelette et non plus de haut en bas à travers une superposition de membranes : ce support sera constitué d'un materiau poreux quelconque (de type nylon ou nitrocelulose de preference) soigneusement preparé pour faciliter la migration des fluides d'une extremité à l'autre sans retention parasite des divers reactifs ou ligands recherchés.Support caractérisé en ce qu'au cours d'une première etape,l'echantillon de fluide à analyser est mis en contact à l'extremité de la bandelette dans une première zone contenant les mêmes reactifs que la première zone precedemment decrite (A).Après un temps defini à l'avance,correspondant à la lyse d'une fine bande (M1) d'un materiau à lyse programmée,la migration commence en direction de l'extremité opposée.Les fluides parviennent dans une seconde zone (B) où la substance recherchée (ex:ligand) entre en contact avec son reactif correspondant (ex:recepteur) et produire un signal d'activation des constituants de la zone (C).Cette zone (B) peut etre une double bande de nature lipidique ou proteique ou les deux : la première bande est identique à (B1) decrite plus haut, supportant les reactifs (R1) du côté où arrive le fluide migrant,contigue à une deuxième bande de composition identique à (B2) supportant sur le côté opposé,les reactifs (R2).La migration des fluides se poursuit vers (C) et va etre à nouveau temporairement stoppée par une fine barrière (M2) de composition identique à la precedente (M1) pour laisser le temps à toutes les reactions d'amplification de se produire et donc d'obtenir une haute sensibilité.Après un certain temps defini à l'avance,cette barrière (M2) se lyse et la migration des fluides se poursuit, transportant le produit final activé (ex:une enzyme activée) vers un moyen de revelation (ex:un substrat chromogène) en (1:)).
La presente invention a egalement pour objet un procédé de determination qualitative et quantitative d'un ligand ou d'un recepteur dans un fluide,qui est caractérisé en ce qu'au cours d'une première etape,un echantillon de fluide à analyser est mis en contact pendant un certain temps defini à l'avance,avec un reactif de reference (par exemple un recepteur si la substance à doser est un ligand specifique de ce recepteur - un ligand si la substance recherchée est un recepteur) situé sur/ou/dans/ou/sous un support de type membranaire;;en cas de reaction positive (presence du ligand par exemple)ce contact,même ephemère ou très bref,initie et declenche au cours d'une deuxième etape,sous le support de type membranaire sus-cité et dans une zone de type cytoplasmique,une serie de reactions biochimiques,devenues completement independantes (du contact originel ligand-recepteur par exemple) pour aller en s'amplifiant plusieurs millions de fois;Hurley (Ann.Rev.Physiol.49 : 793-812,1987) a montré qu'une molecule de rhodopsine activée par un photon,activait à son tour une phosphodiesterase qui hydrolyse 3700 molecules de GMPc par seconde;l'hydrolyse de chaque molecule de GMPc entraine la depolarisation de milliers de canaux ioniques dans les membranes de cellules retiniennes,aboutissant ainsi à un signal electrique important vers le nerf optique).
La zone de type cytoplasmique est temporairement isolée des zones dans lesquelles ont lieu les etapes ulterieures du procédé,pendant un temps suffisant pour permettre à ces dites reactions de se produire complètement (favorisant ainsi une bonne sensibilité) aboutissant à l'activation d'une substance jusque là inactive,temps au bout duquel l'isolement de la zone dans laquelle a eu lieu la dite activation est rompu pour permettre au cours d'une troisième etape,à la substance activée d'entrer en contact (dans une nouvelle zone independante dans le temps et l'espace des zones precedentes)avec des moyens de revelation (par exemple chromogènes) et de quantification de la presence du ligand ou du recepteur recherché.
A l'inverse des methodes immunologiques où c'est l'un des deux acteurs antigène-anticorps qui supporte le marquage de revelation et où au moins l'un de ces deux acteurs est impliqué dans le signal,le ligand ou le recepteur ne sont pas marqués et ne jouent aucun rôle dans les moyens de revelation.Ce sont d'autres reactifs activés par d'autres reactifs,etc..(activés à la suite du simple contact du ligand avec son recepteur),totalement separés et independants dans l'espace et le temps,de la reaction originelle ligand-recepteur, qui produisent le signal de revelation. C' est ainsi que le produit final activé par la cascade de reaction peut être simplement le complement d'un ensemble de reactifs incolores dejà installés et qui se colorent en presence de ce comple ment.
ExempIe : le produit final d'un contact de l'interleukine 1 avec son recepteur provoque une nette augmentation de l'AMPc qui va conduire après plusieurs etapes (decrites plus loin) à la production de Glucose 1 Phosphate et de D-Glucose.Si on installe auparavant de la peroxydase et de la glucose oxydase au dessus du spot de revelation contenant du TMB,le D-Glucose produit vient completer le complexe chromogène : le D-Glucose donne de l'H2O2 avec la
Glucose-oxydase,l'H202 reagit avec la peroxydase pour liberer des ions H+ qui colorent en bleu le TMB.Ainsi,ce n'est pas une enzyme activée qui agit sur un chromogène mais un produit final de la cascade de reactions initiées par le contact ligand-recepteur.
Glucose-oxydase,l'H202 reagit avec la peroxydase pour liberer des ions H+ qui colorent en bleu le TMB.Ainsi,ce n'est pas une enzyme activée qui agit sur un chromogène mais un produit final de la cascade de reactions initiées par le contact ligand-recepteur.
Selon un mode de mise en oeuvre du procédé conforme à la presente invention,dans le cas de dosages semi-quantitatifs,l'echantillon de fluide est mis en contact pendant un certain temps defini à 1' avance,avec une première zone apte à immobiliser une certaine quantité seulement du ligand ou du recepteur à doser,(zone temporairement isolée de la zone sous jacente par une membrane à lyse programmée),sans que cela n'entraine la moindre reaction ni la moindre activation de quelque substance que ce soit, laissant la quantité excedentaire, si elle existe,de ligand ou de recepteur à doser,reagir avec la zone sous-jacente qui elle,produira un signal d'activation vers la zone cytoplasmique pour reveler ainsi que la substance recherchée existe en quantité superieure au seuil defini par le procédé,et donc de realiser un dosage semi quantitatif.Le principe de ce dosage semi-quantitatif repose donc sur l'immobilisation d'une partie de la substance à doser pour l'empecher de reagir plus bas,cette partie immobilisée correspondant au seuil normal toléré de cette substance dans un echantillon de fluide à tester.
Selon un mode de mise en oeuvre du procédé conforme à la presente invention,l'immobilisation d'une partie de la substance à doser dans les dosages semi-quantitatifs,peut se faire par le reactif de reference correspondant à la substance recherchée,reactif fixé dans une première zone en quantité equimolaire au seuil de la substance recherchée; l'absence de zone cytoplasmique sous cette première zone,ne produira aucun signal.La quantité excedentaire de substance à doser,si elle existe,migrera après un temps defini à l'avance comme decrit plus haut,vers la zone sousjacente identique à la precedente,cette fois riche en reactif de reference mais surtout en liaison avec la zone cytoplasmique sous-jacente vers laquelle le signal va etre transmis.Exemple : si la substance recherchée est un ligand,une première zone supportera à sa surface une certaine quantité seulement de recepteurs aptes à immobiliser une certaine quantité seulement de ligand.La quantité excedentaire de ligand,si elle existe,entrera avec la zone sous jacente identique à la precedente mais riche en recepteurs et surtout contigüe à la zone cytoplasmique sous jacente pour y transmettre le signal du contact ligand-recepteur.
Selon un mode de mise en oeuvre du procédé conforme à la presente invention,l'immobilisation d'une partie de la substance à doser dans les dosages semi-quantitatifs peut se faire par la voie immunologique : des anticorps (de preference monoclonaux),specifiques de la substance recherchée,et fixés (en quantité equimolaire correspondant au seuil de substance recherchée à immobiliser) sur la première zone de contact avec le fluide de l'echantillon, se complexent avec ce seuil de substance;après un temps defini à l'avance,les membranes temporairement impermeables citées plus haut se lysent ét laissent migrer vers les etages sous-jacents,si elle existe,la quantité de substance excedentaire à doser qui ne s'est pas fixée aux anticorps,et provoquer ainsi le signal dû au contact ligand-recepteur.
Selon un mode de mise en oeuvre du procédé conforme à la presente invention,ces anticorps ne sont pas fixés mais libres,(en quantité equimolaire à la quantité-seuil de substance à doser) au niveau de cette première zone de contact avec le fluide de l'echantillon,temporairement isolée des suivantes.Une partie seulement de la substance à doser se liera aux anticorps libres.Cette fraction,du fait qu'elle est liée à une immunoglobuline,devient inactive.Si c'est un ligand par exemple,il ne reconnaitra plus son recepteur au niveau de la zone suivante,et cette fraction de ligand n'emettra aucun signal,du fait de l'absence de contact ligand-recepteur.La quantité excedentaire de ligand,si elle existe,ne sera pas liée à une immunoglobuline et se liera normalement aux recepteurs pour emettre ensuite son signal comme decrit plus haut.
Selon un mode de mise en oeuvre du procédé conforme à la presente invention,la quantité-seuil de substance à doser dans les dosages semi-quantitatifs,bien que complexée dans une première etape,aux anticorps libres cités ci dessus,se liera quand même au reactif correspondant mais sans etre capable de provoquer le signal.Exemple : une fraction du ligand à doser,complexée à des anticorps,peut quand même se lier à son recepteur,mais l'ensemble anticorps-ligand-recepteur est incapable d'emettre un signal vers la zone cytoplasmique,contrairement à l'ensemble ligand-recepteur.
Selon un mode de mise en oeuvre du procédé conforme à la presente invention,le produit activé final (resultant des reactions initiées dans la zone cytoplasmique par le contact ligand-recepteur au niveau de la membrane sus-jacente) est une enzyme.Le temps necessaire a son activation est le temps qu'une membrane (M1) à lyse programmée située sous cette zone cytoplasmique,va mettre pour se rompre,laissant alors passer vers la zone inferieure sous jacente l'enzyme activée qui va provoquer la coloration d'un substrat chromogène.Dans certaines variantes du procédé,cette enzyme activée ne colore pas un chromogène mais produit des seconds messagers responsables d'un autre processus aboutissant à la coloration d'un chromogène: exemple (Fig.3 illustrant le cas detaillé plus loin de l'EGF): si le second messager est de 1'IP3 (Inositol triphosphate) il provoque l'expulsion de Ca++ hors des vesicules installées en (C),et la coloration d'une sonde sensible au calcium : ce peut être le murexide,l'arsenazo-3,1'antipyrazolo-3 et le
Nitrophenol Blue.Le signal de liberation du Ca++ peut être fluorescent: en utilisant des esters de chelateurs fluorescents du Ca++ : le Quin-2,le Fura-2,1'Indo-3,1e Fluo3 : excités à certaines longueurs d'onde,ils emettent des signaux de fluorescence plus ou moins inttenses selon la concentration de Ca++ liberé et donc selon le taux de ligand lié au recepteur) : dosage quantitatif precis.
Nitrophenol Blue.Le signal de liberation du Ca++ peut être fluorescent: en utilisant des esters de chelateurs fluorescents du Ca++ : le Quin-2,le Fura-2,1'Indo-3,1e Fluo3 : excités à certaines longueurs d'onde,ils emettent des signaux de fluorescence plus ou moins inttenses selon la concentration de Ca++ liberé et donc selon le taux de ligand lié au recepteur) : dosage quantitatif precis.
Selon un mode de mise en oeuvre du procédé conforme à la presente invention,la migration des fluides de l'echantillon ne se fait pas de haut en bas,mais plutot par migration sur un plan horizontal de type bandelette: le fluide de l'echantillon à doser (ex:un ligand) deposé à l'extremité d'un support,migre vers une première zone où est fixé un reactif de reference (ex:des recepteurs).Le contact ligand-recepteur produit un signal vers un seconde zone où le signal va etre amplifié et aboutir à l'activation d'une substance(ex: une enzyme).Cette dernière migrera avec les fluides vers une zone de revelation (ex:substrat chromogène).La migration est rendue possible grace à un gradient (osmotique ou autre) qui fait que les fluides sont en quelque sorte absorbés par la zone suivante à partir de la zone precedente.Il est possible de freiner ou programmer cette migration par de fines bandes (M1 ou M2)(ex: 1 mm de large) d'une substance identique à celle utilisée dans les membranes à lyse programmée, isolant au moins temporairement les zones et surtout laissant le temps aux diverses reactions de s'accomplir totalement pour une meilleure sensibilité.
Selon un autre mode de mise en oeuvre du procédé faisant l'objet de la presente invention,le produit final issu du contact ligand-recepteur,peut être reconnu par un anticorps marqué prealablement associé aux reactifs en (C);le complexe Anticorps marqué + produit final sera alors detecté en aval,en (t)).Dans ce mode de realisation,il devient necessaire de stopper la migration des anticorps marqués quand il n'y a pas de produit final.Pour cela,des molecules identiques au produit final sont fixées sur une membrane (NC) en nylon ou en nitrocellulose inserée sous la zone (C) et egalement doublée d'un film à lyse programmée:tous les anticorps marqués libres non saturés en produit final,viendront s'y fixer et il n'y aura pas de signal en (t)).
Exemple : Figure 5.Y: dans le fonctionnement normal du procédé,il est possible de doser l'AMP cyclique (AMPc : Adenosine 3"5' cyclic monophosphate) produit en grandes quantités dans la zone (C) après le contact de très faibles quantités de ligand avec son recepteur,et ceci grace à des anticorps anti-AMPc marqués (Ref Sigma A 0670).En cas de reaction negative (Fig.
5.Y -),ces derniers ne rencontrent pas d'AMPc en (C) et sont stoppés par les molecules d'AMPc (Ref Sigma A 4137) fixées sur une membrane de nitrocellulose (NC) inserée sous la zone (C).En cas de reaction positive (Fig. 5.Y+),ces anticorps traversent cette dernière membrane NC car ils sont dejà saturés en AMPc et viennent au contact de la zone de revelation (t)).
Dans certains cas le procédé fonctionne en sens inverse de ce qui precède : on ne dose plus l'AMPc formé mais la disparition de l'AMPc prealablement inséré dans le dispositif,en (C).Le contact ligand-recepteur dans ce cas,active une phosphodiesterase dont le rôle est d'hydrolyser le 3'-5"AMPc en 5"AMP qui n'est plus reconnu par les anticorps marqués anti-AMPc.Ces derniers,non saturés,sont stoppés par les molecules d'AMPc fixées sur la membrane selective decrite plus haut et c'est ainsi qu'une reaction positive (contact ligand-recepteur) ne donnera pas de signal en (D).En cas de reaction negative,les anticorps marqués anti AMPc rencontrent en (C) l'AMPc non hydrolysé car la phosphodiesterase n'a pas été activée,se conjuguent à l'AMPc et traversent la membrane (Y) pour delivrer un signal en (t)),revelant cette fois ci l'absence de contact ligand-recepteur.C'est pour cette raison que cette variant de procédé est dite inverse .Elle peut s'averer utile dans le cas de certains dosages (certains facteurs de croissance,Interferons,certaines interleukines,etc..) où l'activité Tyrosine Kinase du recepteur induite par la presence du ligand,fournit une activation intense d'enzymes (comme la phosphodiesterase) et pas d'AMPc.Alors que certaines cytokines,certains facteurs de croissance,les neuromediateurs,les kinines ou les hormones non steroidiennes,etc.. provoquent au contact de leur recepteur membranaire,l'apparition de grandes quantités d'AMPc intracellulaire,et le dosage se fait alors dans le sens normal.
Le rôle de chaque molecule d'AMPc est d'activer de grandes quantités de proteines kinases en presence d'ATP;et chaque proteine kinase active à son tour par phosphorylation,de grandes quantités d'enzymes jusque là inactives.ll est possible d'exploiter cette importante amplification en dosant plus facilement les enzymes activées au lieu de doser l'AMPc.Ceci n'est justifié que si la substance recherchée est en si faible quantité (picogrammes),que les quantités d'AMPc produites sont encore trop faibles:
Selon une variante du procédé,les anticorps marqués peuvent etre avantageusement deposés plus haut en (A) en association avec d'eventuels produits de protection du marquage et qui ne peuvent être,dans certains cas, associés en (C) pour differentes raisons (risque d'inhibition de l'activation du produit final,etc).
Selon une variante du procédé,les anticorps marqués peuvent etre avantageusement deposés plus haut en (A) en association avec d'eventuels produits de protection du marquage et qui ne peuvent être,dans certains cas, associés en (C) pour differentes raisons (risque d'inhibition de l'activation du produit final,etc).
Si,pour des raisons quelconques,l'anticorps marqué ne peut être associé au dispositif,il est possible de proceder de la façon suivante : on depose sur le dispositif, une goutte de l'echantillon et on attend qu'elle ait migré totalement vers le bas.Puis on depose une solution d'anticorps marqué specifique du produit final activé.Si le test est positif,l'anticorps marqué va se conjuguer au produit final activé et traverser la membrane selective decrite plus haut pour aller à l'etage de revelation (t)).Si le test est negatif, l'anticorps marqué ne va pas rencontrer de produit final activé et il va être stoppé dans sa migration par la membrane selective.ll n'y aura alors pas de signal en (t)).
Dans le cas de dosages semi-quantitatifs,l'utilisation d'anticorps marqués pour reveler la presence de produit final activé (et donc pour reveler la presence d'un ligand ou d'un recepteur recherché) ne change rien à la description precedente du procédé semi-quantitatif: une première membrane (B0) stoppe une certaine quantité de la substance recherchée.Si l'echantillon contient plus que cette certaine quantité de substance,cette dernière arrive en B1 et B2 pour produire en (C) un produit final activé qui sera revelé comme decrit plus haut,par les anticorps marqués specifiquement dirigés contre lui.Si l'echantillon ne contient pas de substance recherchée excedentaire,les anticorps marqués vont migrer avec tous les fluides de l'echantillon et seront stoppés par la membrane selective car n'ayant pas rencontré de produit final activé.
EXEMPLE DE PREPARATION DE L'ETAGE (A):
C'est celui qui entre en contact le premier avec l'echantillon à tester.Le rôle de cet etage,comme indiqué plus haut,consistera à equilibrer sur les plans ionique et pH l'echantillon deposé (donc à le tamponner) et dans une moindre mesure à le filtrer.
C'est celui qui entre en contact le premier avec l'echantillon à tester.Le rôle de cet etage,comme indiqué plus haut,consistera à equilibrer sur les plans ionique et pH l'echantillon deposé (donc à le tamponner) et dans une moindre mesure à le filtrer.
Le materiau choisi pour cet exemple est une pastille en papier cellulosique de type Whatman de 300 d'epaisseur,de large porosité,decoupée circulairement et de diamètre 13 mm. Comme tous les papiers même inertes,fixent une partie des substances à doser ou des substances deposées,il est important de pratiquer un blocking de saturation du papier.La methode choisie consiste à deposer simplement une goutte de 10 td de solution de lait ecremé à 2% et laisser ainsi pendant 1 heure avant de rincer et secher.Puis on depose 10,ut de la solution suivante: (les concentrations sont telles que les 50 il de l'echantillon à tester vont diluer ces divers constituants pour les amener à un niveau ideal pour la reaction au niveau membranaire et cytoplasmique.
- TRIS 0.1 M ou Phosphate 0.1 M comme tampon si l'echantillon n'est pas du sang total.
- PEG 6000 (Polyethylène Glycol 6000) 5% pour accelerer et amplifier la reaction ligandrecepteur ainsi que la reaction immunoglobuline-ligand dans le dosage semi-quantitatifilécrit plus haut.
- Potassium 25 mEq/l - Cuivre ionisé 5 mgn soit 0.0005 % - Zinc 5 mg/l soit 0.0005 %
Laisser secher les 10 M1 de cette solution deposée et garder à l'abri de la lumière et de preference sous vide en attendant l'assemblage.
Laisser secher les 10 M1 de cette solution deposée et garder à l'abri de la lumière et de preference sous vide en attendant l'assemblage.
EXEMPLES DE PREPARATION DE MEMBRANES A LYSE PROGRAMMÉE
Ces membranes (MO ou M1 ou M2) sont destinées à programmer l'ecoulement du fluide à tester afin de laisser le temps necessaire aux diverses reactions de se faire completement.
Ces membranes (MO ou M1 ou M2) sont destinées à programmer l'ecoulement du fluide à tester afin de laisser le temps necessaire aux diverses reactions de se faire completement.
- Membranes en lipides : exemple: Phospholipides associés à du cholesterol : phospholipides naturels (Acide phosphatidique ou phosphatidylcholine ou phosphatdylethanolamine ou phosphatidylserine ou phosphatidylglycerol ou cardiolipine ou sphingomyeline) ou phospholipides synthetiques ofrant de plus grandes qualités de resistance et de conservation (DMPC: Dimyristoyl-phosphatidylcholine - ou DPPC: Dipalmitoyl-phosphatidylcholine ou DSPC : Disteraoylphosphatidylcholine).
- Exemple de preparation d'une membrane lipidique à lyse programmée:
1 - Preparer la solution lipidique:
- cholesterol : 1 mole
- phospholipide choisi: 10 moles
- Benzène: 1 ml
- agitation au vortex 1 minute
2 - chauffer au bain marie à 40 "C qq minutes
3 - deposer 124 sur un des supports suivants:
nylon,nitrocellulose,papier,polyester,decoupés en pastilles de 13 mm de
diamètre. .La porosité doit etre au minimum de 0.45 c et l'epaisseur ne doit pas
exceder 100,Ces supports doivent etre prealablement saturés selon les techni
ques classiques de blocking afin de ne pas retenir les substances recherchées.
1 - Preparer la solution lipidique:
- cholesterol : 1 mole
- phospholipide choisi: 10 moles
- Benzène: 1 ml
- agitation au vortex 1 minute
2 - chauffer au bain marie à 40 "C qq minutes
3 - deposer 124 sur un des supports suivants:
nylon,nitrocellulose,papier,polyester,decoupés en pastilles de 13 mm de
diamètre. .La porosité doit etre au minimum de 0.45 c et l'epaisseur ne doit pas
exceder 100,Ces supports doivent etre prealablement saturés selon les techni
ques classiques de blocking afin de ne pas retenir les substances recherchées.
4 - evaporer le benzène sous vide poussé (-60 mm Hg) et stockage au sec et de
preference sous vide ou sous gaz inerte (Argon) pour eviter l'oxydation des lipides,donc
la fragilité des membranes;
Ce type de membranes est lysé au bout de 30 secondes.De cette façon,l'echantillon deposé reste immobile pendant 30 secondes au contact des reactifs de (A) avant de s'ecouler vers les etages sous jacents.
preference sous vide ou sous gaz inerte (Argon) pour eviter l'oxydation des lipides,donc
la fragilité des membranes;
Ce type de membranes est lysé au bout de 30 secondes.De cette façon,l'echantillon deposé reste immobile pendant 30 secondes au contact des reactifs de (A) avant de s'ecouler vers les etages sous jacents.
Il est possible d'allonger ou de raccourcir ce delai de lyse en augmentant ou en diminuant la concentration de phospholipides.
- Membranes en copolymères d'acrylates:
1 - On prepare la solution-mère suivante:
- Propanol-2 (iso-propanol) 30%
- Copolymère acrylique/acrylate 40%
- OH-propyl-Methyl Cellulose 20%
- acetyl-triethyl citrate 5%
- Chlorhydrate d'aluminium 5%
On chauffe 10 mn à 40"C au Bain Marie
On agite 1 mn au vortex.Stockage hermetiquement fermé.
1 - On prepare la solution-mère suivante:
- Propanol-2 (iso-propanol) 30%
- Copolymère acrylique/acrylate 40%
- OH-propyl-Methyl Cellulose 20%
- acetyl-triethyl citrate 5%
- Chlorhydrate d'aluminium 5%
On chauffe 10 mn à 40"C au Bain Marie
On agite 1 mn au vortex.Stockage hermetiquement fermé.
2 - Juste avant la depose on dilue cette solution-mère
- 1 volume de la solution acrylique mère
- 4 volumes d'ethanol pur - > dilution à 1/5
3 - On depose 10,ut sur un des-supports cités ci dessus.
- 1 volume de la solution acrylique mère
- 4 volumes d'ethanol pur - > dilution à 1/5
3 - On depose 10,ut sur un des-supports cités ci dessus.
Laisser secher et stocker à sec (de preference sous vide avec un dessicant)
Cette membrane se lyse au bout de 30 secondes au contact de n'importe quel liquide à tester.Il est possible d'allonger ou de raccourcir le temps de lyse en augmentant ou en diminuant la concentration d'acrylique.
Cette membrane se lyse au bout de 30 secondes au contact de n'importe quel liquide à tester.Il est possible d'allonger ou de raccourcir le temps de lyse en augmentant ou en diminuant la concentration d'acrylique.
- Membranes en proteines:
exemple 1: membrane de gelatine.
exemple 1: membrane de gelatine.
1 - On prepare la solution-mère suivante:
r Gelatine vegetale 5 mg (se conserve mieux)
- Eau demineralisée: 100 ml
2 - on chauffe sous agitation magnetique lente à 50 OC - 15 mn
3 - On depose 10 M1 sur les supports decrits plus haut
On sèche sous vide poussé et stockage sous vide à sec et dessicant.
r Gelatine vegetale 5 mg (se conserve mieux)
- Eau demineralisée: 100 ml
2 - on chauffe sous agitation magnetique lente à 50 OC - 15 mn
3 - On depose 10 M1 sur les supports decrits plus haut
On sèche sous vide poussé et stockage sous vide à sec et dessicant.
Cette membrane se lyse spontanément en 30 secondes au contact du liquide à tester est
possible d'allonger ou de raccourcir le delai de lyse en augmentant ou en diminuant la
concentration de gelatine.Mais il est possible de programmer encore mieux la lyse de
cette variété de membrane en augmentant la concentration de gelatine.La membrane
devient alors completement impermeable.Sauf si les fluides qui proviennent des etages
superieurs contiennent de la collagenase;la description detaillée figure dans le paragraphe
ci dessous consacrée aux membranes de collagene.
possible d'allonger ou de raccourcir le delai de lyse en augmentant ou en diminuant la
concentration de gelatine.Mais il est possible de programmer encore mieux la lyse de
cette variété de membrane en augmentant la concentration de gelatine.La membrane
devient alors completement impermeable.Sauf si les fluides qui proviennent des etages
superieurs contiennent de la collagenase;la description detaillée figure dans le paragraphe
ci dessous consacrée aux membranes de collagene.
exemple 2 :membrane de collagène.
Cette variété de membrane est impermeable aux fluides de l'echantillon.Sauf si elle est degradée par une enzyme : la collagenase (de preference type V extraite d'ilots de pancreas de veau
Ref Sigma C-9263 car elle n'interefère pas avec les ligands,les recepteurs et les divers reactifs contenus dans ce dispositif).
Ref Sigma C-9263 car elle n'interefère pas avec les ligands,les recepteurs et les divers reactifs contenus dans ce dispositif).
Mode operatoire: 1 - Deposer sur un des supports decrits plus haut, 10 Ml d'une solution de collagène (Sigma C9879 par exemple) à 1% (10 mg/ml) ou avantageusement une solution de Polypep sigma (Polypeptides de collagène) beaucoup plus stable,portée à 45"C.Laisser secher sous vide à 40"C pendant une heure.Le film de collagène est epais de 100 M et la membrane qui en resulte est impermeable à tous fluides.
2 - Associer aux composants des etages superieurs du dispositif,la collagenase à 0.2 % (2 mg/ ml) referencée plus haut.Dès qu'elle est solubilisée,elle degrade le collagène en 30 secondes et la membrane qui supportait le collagène devient permeable par lyse
Il est possible d'allonger ou de raccourcir le delai de permeabilisation en diminuant ou en augmentant la concentration de collagenase.
Il est possible d'allonger ou de raccourcir le delai de permeabilisation en diminuant ou en augmentant la concentration de collagenase.
Ces differents exemples de membranes à lyse programmée ne sont pas limitatifs et ont simplement pour but de donner un aperçu des moyens mis en oeuvre pour retarder l'ecoulement de l'echantillon à travers le dispositif.
PREPARATION DES MEMBRANES (B1 et B2) ET DE LA ZONE (C) CONSIDERATIONS GENERALES ll existe plusieurs categories de recepteurs transmembranaires (excluant les recepteurs intracytoplasmique des steroides): 1 - Les recepteurs monomeriques,peptides presentant sept domaines intramembranaires et associés à une proteine G à fonction GTPasique,elle même associée à un effecteur enzymatique comme l'adenylate cyclase ou la phospholipase C,ou à un canal ionique (Ca++ ou K+).Ces recepteurs sont impliqués dasn l'effet de nombreux mediateurs (noradrenaline,dopamine,serotonine) et hormones.
2 - Les recepteurs à activité tyrosine kinase : constitués d'une ou plusieurs sous-unités prteiniques transmembranaires caractérisées par la presence d'une seule helice ~ transmembranaire.La ou les extremités proteiniques intracellulaires sont caracterisées par un site enzymatique qui acquiert une activité Tyrosine Kinase dès que le ligand entre en contact avec le recepteur,aboutissant à l'activation d'une phospholipase C specifique du glycosyl-phosphatidyl inositol .Ce groupe comprend les recepteurs à l'insuline,à l'interleukine 4,au TGF (facteur de croissance des tumeurs),au PDGF (facteur de croissance des plaquettes) et à l'EGF qui a acquis ces derniers temps une importance dans le diagnostic et le suivi de cancers.
3 - Un groupe heterogène de recepteurs membranaires comportant aussi une seule helice > e transmembranaire.Il comprend:
- des proteines de la superfamile des immunoglobulines (recepteur des interleukine 1 et
6,recepteur Fc des Immunoglobuliones G et E (Fc~RI),le recepteur des antigènes au
niveau des lymphocytes et des proteines du complexe majeur d'histocompatibilité
(CMH)
- des proteines de la superfamille des lectines avec notemment les recepteurs assurant
l'endocytose des glycoproteines et le recepteur à basse affinité pour les IgE (Fc RII)
- des recepteurs divers à une helice et transmembranaire comme le recepteur du facteur de
croissance des nerfs (NGF) et le recepteur assurant l'endocytose des lipoproteines
(LDL) 4 - Les recepteurs polymeriques incluant un canal ionique,constitués de plusieurs peptides etroitement associés presentant eux-mêmes plusieurs domaines transmembranaires.La liaison à l'agoniste (ligand) entraine une legère modification de la conformation de cet ensemble transmembranaire permettant le passage selectif d'ions dans le sens de leur gradient electrochimique.Ces recepteurs sont selectifs de certains neuromediateurs comme l'acetylcholine,l'acide gamma-amino-butyrique (GABA) ,le glutamate et la glycine.
- des proteines de la superfamile des immunoglobulines (recepteur des interleukine 1 et
6,recepteur Fc des Immunoglobuliones G et E (Fc~RI),le recepteur des antigènes au
niveau des lymphocytes et des proteines du complexe majeur d'histocompatibilité
(CMH)
- des proteines de la superfamille des lectines avec notemment les recepteurs assurant
l'endocytose des glycoproteines et le recepteur à basse affinité pour les IgE (Fc RII)
- des recepteurs divers à une helice et transmembranaire comme le recepteur du facteur de
croissance des nerfs (NGF) et le recepteur assurant l'endocytose des lipoproteines
(LDL) 4 - Les recepteurs polymeriques incluant un canal ionique,constitués de plusieurs peptides etroitement associés presentant eux-mêmes plusieurs domaines transmembranaires.La liaison à l'agoniste (ligand) entraine une legère modification de la conformation de cet ensemble transmembranaire permettant le passage selectif d'ions dans le sens de leur gradient electrochimique.Ces recepteurs sont selectifs de certains neuromediateurs comme l'acetylcholine,l'acide gamma-amino-butyrique (GABA) ,le glutamate et la glycine.
Le but de la presente invention est d'utiliser ces recepteurs pour doser les ligands correspondants recherchés dans l'echantillon ou d'utiliser des ligands pour doser les recepteurs circulants contenus dans l'echantillon.Ceci est devenu d'une grande importance depuis que la biologie moleculaire a prouvé que de nombreux oncogènes codent pour des recepteurs membranaires des facteurs de croissance collaborant ainsi au processus de croissance anarchique.Ainsi le produit des oncogènes HERS2/neu ou v-erb B est identique au recepteur de l'EGF.Les produits des oncogènes v-fms et c-kit sont proches du recepteur du PDGF (facteur de croissance des plaquettes).Le produit de l'oncogène viral fms est un recepteur du facteur de croissance des macrophages (facteur CSF-1) - (Revue Yarden et Ullrich,1988).
Une fraction importante de ces recepteurs se retrouve dans le sang circulant (après lyse des cellules par exemple) et il est possible de les doser.Il existe dejà des dosages de marqueurs tumoraux qui sont en fait des proteines membranaires de cellules neoplasiques (CA 15-5 pour le cancer du sein, CA 19-9 pour le pancreas,CEA pour le colon,AFP pour le foie,etc..).Mais les quantités circulantes sont si faibles que les techniques actuelles de dosage (immunologiques essentiellement) ne peuvent deceler un processus debutant.L'interet du procédé objet de la presente invention est donc de substituer au dosage du recepteur lui même (pratiquement impossible),le dosage d'un produit final activé après une cascade d'amplifications telles que ce produit devient dosable,proportionnel au taux de recepteur recherché.
Pour doser un ligand (ex : un facteur de croissance ou l'insuline),il est necessaire d'inserer des recepteurs en etat de fonctionner,dans des membranes artificielles reproduisant le plus possible une membrane cellulaire.Il est aussi necessaire de les orienter convenablement : il faut que le site de liaison à l'agoniste soit extracellulaire et non caché en intramembranaire ou intracellulaire.Enfin il faut entourer le recepteur d'un environnement soigneusement dosé en phospholipides et proteines.(De nombreux auteurs ont prouvé qu'un recepteur membranaire ne fonctionne plus si son environnement artificiel ne correspond pas exactement à la composition proteolipidique de son environnement originel naturel).
Deux voies sont possibles pour obtenir des recepteurs fonctionnels: 1 - les extraire de membranes de certaines cellules où on les trouve en grande quantités,les purifier en respectant leurs caracteristiques (polymeres,conformation,etc) .J-L Popot (Methodologie des liposomes - Ed de l'insert - 1982) a purifié et reintegré avec succès le recepteur cholinergique de l'acetylcholine (extrait des electrocytes de Torpedo marmorata) dans des vesicules d'asolectine (un melange proteolipidique complexe mettant en evidence l'effet protecteur des lipides sur le recepteur).
Mais cette methode ne peut aboutir à une preparation à grande echelle du fait que le recepteur concerné ne se trouve pas sur toutes les cellules est apparu par ailleurs que de nombreuses considerations interferaient dans l'obtention de recepteurs fonctionnels : l'utilisation de tel ou tel detergent par exemple entraine des differences considerables dans le comportement du recepteur reconstitué.
2 - les produire par genie genetique en inserant le gène codant pour ces recepteurs,sur des vecteurs de clonage.De nombreuses chimères de recepteurs ont dejà été obtenues par cette methode,avec succès.C'est l'option la plus prometteuse et qui convient le mieux à la presente invention car elle respecte de nombreux caractères originels du recepteur.Cette voie va être decrite plus loin.
Kagawa et Racker (J.Biol.Chem.,1971) sont considérés comme les pionniers de la reconstitution de membranes biologiques.Leur technique consistait à solubiliser des proteines membranaires (par ex: des recepteurs) en presence de lipides dilués dans des detergents non agressifs pour les proteines puis à extraire le detergent par filtration sur gel ou par dialyse rapide.La solution est ensuite etalée sur une surface de verre plane et sechée sous vide.
Brunner et al. (Bioch.Biophys.Acta 1975) ont solubilisé des proteines membranaires dans des dispersions lecithiniques avec du cholate de sodium comme detergent doux,puis eliminé de dernier par filtration sur Sephadex G-50.Les membranes obtenues sont stables un mois à 4"C et contiennent moins d'une molecule de desoxycholate pour 1000 molecules de phospholipides.
Barenholz et al.(FEBS Lett.-1979) ainsi que Hamilton et al. (J.Lipid.Res.-1980) utilisent l'extrusion à haute pression (20.000 p.s.i. à 4"C) à travers la presse de French pour integrer de façon très homogène les proteines membranaires dans des dispersions de phosphatidylcholine d'oeuf.Cette methode presente de nombreux avantages : simple,reproductible,non destructive (aucune oxydation des lipides ni denaturation des proteines du fait du bref laps de temps du traitement physique).
Pick (Arch.Biochem.Biophys.- 1981) a reussi à obtenir des liposomes enfermant des proportions importantes d'ions et à integrer à la membrane une proteine de transport du glucose,fonctionnelle.Ce procédé convient à des melanges de phosphatidylcholines avec des phospholipides chargés negativement ou avec des lipides chargés positivement.
Hub et al. (FEBS Lett. - 1982) utilise les dipalmitoyl phosphatidylcholines additionnées de solution salinejyophilisées au bain-marie à 40"C pendant 4 heures.Le film lipidique se detache ainsi des parois du flacon et forme des vesicules lipidiques de diametre inferieur à 1,um.Ce qui est très interessant ici c'est que ces vesicules sont bilamellaires,ce qui permet de leur faire jouer,après integration de la proteine choisie (ex : un recepteur de l'EGF ou un canal calcique),le rôle de la bicouche membranaire cellulaire.
Dans les liposomes,la distribution des phospholipides entre la couche externe et la couche interne est une distribution asymetrique.La couche externe a une plus grande densité de lipides chargés.Dans des membranes d'ovolecitihines additionnées de dipalmitoyl phosphatidylcholine ou de diarachidonyl phosphatidylcholines,l'espèce la plus insaturée se localise de preference sur la face externe.Ce fait est dû à l'impossibilité,pour l'acide gras insaturé,de se tasser aussi fortement que l'acide gras saturé.Neanmoins,dans un melange de phosphatidylcholine et de sphingomyeline,cette dernière se localise plutôt sur la face externe.
En presence de cholesterol,la composition des deux couches est semblable.Si le rapport molaire cholesterol/phospholipide est superieur à 0.3,le cholesterol est de preference sur la face interne.Il faut noter que la presence de cholesterol associé aux phospholipides donne aux liposomes une grande stabilité dans le temps,même à sec (ce qui est le cas des dispositifs etudiés ici).
Le but de la presente invention est (Figure 2) d'integrer une proteine reactive R1 (ex : un recepteur) au feuillet superieur (ou feuillet externe dans les cas de liposomes) et un reactif R2 (ex: Proteine G) au feuillet inferieur,de les installer en etat fonctionnel afin que le contact de la substance recherchée (ex :: un ligand) avec R1 declenche via R2 une cascade de reactions chimiques en (C).Mais ceci est une schematisation rapide necessitée pour une description la plus claire possible du procédé.En fait si RI est un recepteur,il doit toujours être en position transmembranaire (traverse les deux feuillets),presenter l'extremité N-terminale (extra-cytoplas mique) au ligand,et plonger l'extremité C-terminale dans la zone cytoplasmique (C) tandis que la proteine G est accrochée à la face inferieure du feuillet inferieur (ou interne dans le cas des liposomes) au voisinage du recepteur.Un effecteur enzymatique reagissant à l'activation de R2 est libre ou fixe en position transmembranaire mais tous les autres reactifs de (C) sont libres.
ll faut donc installer en (C) sous la membrane (B) tous les elements concernés par cette cascade de reactions,mais,à l'etat inactivé.C'est le contact ligand-recepteur qui activera l'un après l'autre ces differents elements.
EXEMPLE DE PREPARATION DE MEMBRANES (B! ET DE LA ZONE (C)
La preparation de cet etage comprend deux etapes: 1 - Production des molecules de recepteur.
La preparation de cet etage comprend deux etapes: 1 - Production des molecules de recepteur.
2 - Incorporation de ces molecules aux solutions proteolipidiques soigneusement equilibrées
dans leur composition pour respecter les conditions de fonctionnement des recepteurs.
dans leur composition pour respecter les conditions de fonctionnement des recepteurs.
3 - Preparation de la zone (C) : tous les composants inactifs destinés à être activés par le contact
ligand-recepteur pour emettre finalement un signal en (t)).
ligand-recepteur pour emettre finalement un signal en (t)).
MEMBRANE INTéGRANT UN RECEPTEUR DE L'EPIDERMAL GROWTH FACTOR
POUR LE DOSAGE DE L'EGF
Le facteur de croissance epidermique (EGF) est un polypeptide mitogènique pour de nombreux types cellulaires,composé de 53 acides aminés avec un poids moleculaire de 6045 daltons.fl est synthetisé dans de nombreux organes sous la forme d'une proteine precurseur (1217 acides aminés) de haut poids moleculaire qui subit un phenomène de maturation pour donner la forme active du mitogène.Des fibroblastes transformés par des retrovirus ou par des carcinogènes,secrètent un autre facteur,le TGF (Transforming growth factorocb qui a la particularité de se fixer sur le recepteur de l'EGF.Des etudes recentes ont decrit leur presence dans les cellules tumorales humaines qui ont une capacité à les produire et à repondre à leur propres facteurs de croissance,ce qui leur permet d'acquerir une certaine autonomie de croissance et constitue un lien entre facteurs de croissance et oncogènes.Certains oncogènes permettent aux cellules de proliferer independemment de la presence de'facteurs de croissance,non seulement en codant pour des facteurs autocrines ou leurs recepteurs,mais aussi en amplifiant les signaux mitogeniques provoqués par la liaison du facteur de croissance sur son recepteur membranaire.
POUR LE DOSAGE DE L'EGF
Le facteur de croissance epidermique (EGF) est un polypeptide mitogènique pour de nombreux types cellulaires,composé de 53 acides aminés avec un poids moleculaire de 6045 daltons.fl est synthetisé dans de nombreux organes sous la forme d'une proteine precurseur (1217 acides aminés) de haut poids moleculaire qui subit un phenomène de maturation pour donner la forme active du mitogène.Des fibroblastes transformés par des retrovirus ou par des carcinogènes,secrètent un autre facteur,le TGF (Transforming growth factorocb qui a la particularité de se fixer sur le recepteur de l'EGF.Des etudes recentes ont decrit leur presence dans les cellules tumorales humaines qui ont une capacité à les produire et à repondre à leur propres facteurs de croissance,ce qui leur permet d'acquerir une certaine autonomie de croissance et constitue un lien entre facteurs de croissance et oncogènes.Certains oncogènes permettent aux cellules de proliferer independemment de la presence de'facteurs de croissance,non seulement en codant pour des facteurs autocrines ou leurs recepteurs,mais aussi en amplifiant les signaux mitogeniques provoqués par la liaison du facteur de croissance sur son recepteur membranaire.
Le recepteur de l'EGF comporte une seule chaine polypeptide de 1186 residus acides aminés, avec 621 residus extracellulaires,23 (hydrophobes) transmembranaires.La sequence Nterminale extracellulaire est glycosylée,riche en residus cysteyls et comporte le site de liaison de l'EGF.Une sequence en heIice- traverse la bicouche lipidique.L'extremité C-terminale intracelulaire porte les sites Tyrosine-kinase: dès le contact EGF avec son recepteur,dans les cellules normales,le residu Lys 721 capte le troisième Phosphate de l'ATP et le dirige vers le residu Tyrosine 1173 qui est ainsi autophosphorylé.Cette autophosphorylation maintient une ativité enzymatique elevée (en activant des cascades de reactions) qui ne necessite pas la presence continue del'EGF.De plus,l'exposition à l'EGF,conduit à une rapide oligomerisation des molecules de recepteurs (Cochet et al. - J.Biol.Chem.263,3290-3295.1988).D'après Yarden et
Schlesinger (Biochemistery 26; ;1434-1451.1987) cette oligomerisation allosterique explique l'activation du site Tyrosine Kinase.Dans les cellules intactes,ce recepteur est soumis à une regulation fine qui met enjeu plusieurs types de phosphorylations et modulent son expression.C'est ainsi qu'une des consequences de l'activation du site tyrosine kinase d'un recepteur,est l'activation de la proteine kinase C cytoplasmique qui vient phosphoryler le residu intracytoplasmique Threonine 654 situé à 10 acides aminés du domaine transmembranaire,entrainant l'internalisation de l'ensemble EGF+recepteur,leur degradation et leur recyclage,et surtout la disparition de toute affinité de l'EGF pour les recepteurs encore libres (Hunter et al.Nature 311,480483 - 1985).Une elegante etude menée par Lin et al. (1986 - Cell 44,839-848) decrit les consequences d'une mutation ponctuelle experimentale de ce site
Threonine 654 : l'ensemble EGF-recepteur est internalisé mais pas degradé.Ce qui prouve qu'au moins deux mecanismes independants interviennent dans la perte du signal normalement induit par l'EGF ainsi que dans l'internalisation + degradation de l'ensemble EGF+recepteur.
Schlesinger (Biochemistery 26; ;1434-1451.1987) cette oligomerisation allosterique explique l'activation du site Tyrosine Kinase.Dans les cellules intactes,ce recepteur est soumis à une regulation fine qui met enjeu plusieurs types de phosphorylations et modulent son expression.C'est ainsi qu'une des consequences de l'activation du site tyrosine kinase d'un recepteur,est l'activation de la proteine kinase C cytoplasmique qui vient phosphoryler le residu intracytoplasmique Threonine 654 situé à 10 acides aminés du domaine transmembranaire,entrainant l'internalisation de l'ensemble EGF+recepteur,leur degradation et leur recyclage,et surtout la disparition de toute affinité de l'EGF pour les recepteurs encore libres (Hunter et al.Nature 311,480483 - 1985).Une elegante etude menée par Lin et al. (1986 - Cell 44,839-848) decrit les consequences d'une mutation ponctuelle experimentale de ce site
Threonine 654 : l'ensemble EGF-recepteur est internalisé mais pas degradé.Ce qui prouve qu'au moins deux mecanismes independants interviennent dans la perte du signal normalement induit par l'EGF ainsi que dans l'internalisation + degradation de l'ensemble EGF+recepteur.
La transduction du signal mitogenique induit par la liaison de l'EGF à son recepteur se traduit donc par l'activation de nombreuses fonctions cellulaires qui requièrent au prealable l'integralité de l'ativité tyrosine kinase du recepteur,mais qui assurent surtout,cette fine regulation de l'activité cellulaire,avec la possibilité d'inhiber en temps voulu,l'action de l'EGF.Des etudes recentes permettent d'envisager un rôle du recepteur à l'EGF et de ses ligands (EGF,TGFd+ss) dans le developpement de certaines tumeurs humaines,par disparition de cette fine regulation à differents niveaux (par ex : le signal de l'EGF n'est plus inhibé : soit par la non-phosphorylation du site Threonine 654 qui aurait subi un dommage,soit par l'absence de Proteine Kinase C activée intracytoplasmique et donc la non-phosphorylation du residu Thr 654,soit par l'action d'un oncogène dont le produit serait un recepteur ne fonctionnant que dans un sens : insensible à toute inhibition,et donc repondant à toute stimulation des facteurs EGF ou TGF eux-mêmes produits d'ailleurs en excès par les cellules neoplasiques.)
Mecanisme de transduction du signal induit par le contact EGF-recepteur:
Dimerisation ou oligomerisation des molecules de recepteur - > Activation de leur site Tyrosine
Kinase - > Transformation en GTP du GDP lié à la sous-unité K de la proteine Gp - > mobilisation de ce complexe GTP+sous-unité avers la sous-unité catalytique de la Phospholipase C pour sensibiliser (par phosphorylation) cette dernière au calcium - > Activation,en presence d'ATP de cette phospholipase C selective du PIP2 (Phosphatidylinositol 4,5 Diphosphate) lui même issu de Ia phosphorylation du Phosphatidyllnositol (provenant des phospholipides du feuillet interne de la membrane plasmique) - > Production de DAG (diacylglycerol) et de IP3 (Inositol 1,4,5 triphosphate : responsable du passage massif et rapide (quelques secondes) du
Ca++ du reticulum sarcoplasmique vers le cytoplasme,y faisant brusquement passer la concentration en Ca++ de 0.1 MM à 1 mM.
Mecanisme de transduction du signal induit par le contact EGF-recepteur:
Dimerisation ou oligomerisation des molecules de recepteur - > Activation de leur site Tyrosine
Kinase - > Transformation en GTP du GDP lié à la sous-unité K de la proteine Gp - > mobilisation de ce complexe GTP+sous-unité avers la sous-unité catalytique de la Phospholipase C pour sensibiliser (par phosphorylation) cette dernière au calcium - > Activation,en presence d'ATP de cette phospholipase C selective du PIP2 (Phosphatidylinositol 4,5 Diphosphate) lui même issu de Ia phosphorylation du Phosphatidyllnositol (provenant des phospholipides du feuillet interne de la membrane plasmique) - > Production de DAG (diacylglycerol) et de IP3 (Inositol 1,4,5 triphosphate : responsable du passage massif et rapide (quelques secondes) du
Ca++ du reticulum sarcoplasmique vers le cytoplasme,y faisant brusquement passer la concentration en Ca++ de 0.1 MM à 1 mM.
Le mecanisme d'expulsion du Ca++ hors du reticulum sarcoplasmique (où sa concentration est de 1 mM) est le suivant : l'lP3 entre en contact avec une proteine tetramerique (4 sous-unités de 400 kDa chacune - 5037 acides aminés dont la sequence est connue depuis Takeshima et al.en 1989 : Nature 339:439445) de la membrane du reticulum sarcoplasmique.Cette proteine change alors de conformation et se comporte très rapidement comme un canal permettant un efflux de Ca++ hors du reticulum sarcoplasmique (Agnew 1988 :Nature 334 : 299-300)
A la lumière de ce rappel,le procédé proposé ici pour le dosage de l'EGF est le suivant: (Figure
No ) 1 - Mise en contact de l'EGF de l'echantillon avec son recepteur R1 inseré dans la membrane (B).L'activation du site Tyrosine Kinase active une proteine Gp (R2) en presence d'ATP,laquelle active une phospholipase C toujours en presence d'ATP.Cette phospholipase activée hydrolyse en (C) le PIP2 en DAG et IP3.
A la lumière de ce rappel,le procédé proposé ici pour le dosage de l'EGF est le suivant: (Figure
No ) 1 - Mise en contact de l'EGF de l'echantillon avec son recepteur R1 inseré dans la membrane (B).L'activation du site Tyrosine Kinase active une proteine Gp (R2) en presence d'ATP,laquelle active une phospholipase C toujours en presence d'ATP.Cette phospholipase activée hydrolyse en (C) le PIP2 en DAG et IP3.
2 - L'IP3 agit sur la proteine-canal tetramerique extraite de reticulum sarcoplasmique et inserée dans la bicouche d'un liposome (RS) renfermant du Ca++ en solution: ouverture de ce canal et efflux de Ca++ hors du liposome 3 - Revelation de ce Ca++ par une sonde chromogène sensible au Ca++ ou par fluorescence,etc..
Le recepteur est obtenu par les techniques de genie genetique:
a - en faisant exprimer l'ADNc ou le gène dans un système d'expression,soit par injec
tion de l'ARN correspondant dans des oocytes de xénope,soit par transfection dans des
cellules eucaryotes (par exemple des cellules L ou des cellules de hamster chinois:
Chinese Hamster Ovary cells :CHO) ou dans des cellules eucaryotes (ex : E.Coli)
b - en utilisant la similitude du produit de certains oncogènes avec le recepteur à
l'EGF. C' est cette dernière methode qui sera utilisée dans le mode operatoire de produc tion du recepteur de l'EGF.
a - en faisant exprimer l'ADNc ou le gène dans un système d'expression,soit par injec
tion de l'ARN correspondant dans des oocytes de xénope,soit par transfection dans des
cellules eucaryotes (par exemple des cellules L ou des cellules de hamster chinois:
Chinese Hamster Ovary cells :CHO) ou dans des cellules eucaryotes (ex : E.Coli)
b - en utilisant la similitude du produit de certains oncogènes avec le recepteur à
l'EGF. C' est cette dernière methode qui sera utilisée dans le mode operatoire de produc tion du recepteur de l'EGF.
La proteine canal tetramerique decrite par Takeshima au niveau du reticulum sarcoplasmique est obtenue plus facilement par extraction et purification à partir de cellules de muscles squelettiques d'animaux,puis inserée dans la bicouche de vesicules lipidiques.
Ces vesicules mimant le mieux possible un reticulum sarcoplasmique sont des R.E.V (Reversible Evaporation Vesicles),une variété de liposomes particulièrement solides (polymerisation des chaines d'acides gras par exposition aux U.V.) ne permettant aucune fuite de Ca++ encapsulé tant que la proteine canal n'est pas en contact avec l'IP3,et donc permettent d'eviter des faux resultats.
Le dispositif quant à lui correspond exactement aux diverses options decrites plus hautin peut se presenter par exemple sous la forme d'un empilement de membranes rondes de 10 à 15 mm de diametre,ou carrées de 15 mm de côté;ce sont de bas en haut(Figure 3): une membrane filtre (A),une membrane plane (B) avec le recepteur (R1) et les reactifs (R2) :Proteine G + GDP,la membrane MI à lyse programmée,une zone (C) contenant d'une part les reactifs activés par l'EGF (Proteine Gp,GDP,ATP,Phospholipase inactive) ainsi que des ions catalysant ces reac tions (Mg++,Ca++ < 0.1,uM),et d'autre part les vesicules supportant la proteine canal et enfer- mant le Ca++ à grande concentration.L'ensemble reactifs et vesicules est melangé et deposé sur un support très poreux soigneusement preparé à l'avance (Papier Durieux No 122 par exemple) ce qui donne l'aspect d'une epaisse membrane (100 u d'epaisseur).Sur la face opposée à celle du depôt,un film (M2) d'acrylique copolymère (obtenu par depôt de 15 fi d'acrylique en solution alcoolique puis seché) aura été deposé avant le depot sur l'autre face,du melange reactifs+vesicules.Ce film acrylique (M2) sera temporairement impermeable (30 sec à 2 minutes selon la concentration en acrylique) pour laisser le temps aux diverses reactions de s'accomplir.
La revelation du Ca++ peut eventuellement se faire à l'interieur même de la zone (C) si on y associe une sonde chromogène.Mais il est plus prudent d'installer cette sonde sur une membrane (D) de nylon blanc,sous la forme d'un spot de 3 à 6 mm de diamètre,incolore en l'absence de calcium. Cette membrane servira de toute façon de support et protection à la membrane contenant la zone (C),placée sous cette dernière.
L'empilement de membranes est thermosoudé entre deux plaques de PVC de 0.5 mm d'epaisseur dont la superieure,opaque,sera perforée pour y deposer la goutte de l'echantillon,tandis que l'inferieure sera transparente pour visualiser la coloration du spot (bleu par exemple) proportionnelle à la quantité de Ca++ libéré en (C),et donc proportionnelle au taux d'EGF de l'echantillon.
En cas de dosage semi-quantitatif,comme decrit plus haut,il conviendra d'ajouter (Figures 4.0 et 4.1) une membrane sous la membrane (A) dans le but de neutraliser une partie seulement de l'EGF de l'echantillon,cette partie correspondant au taux circulant normal chez tout individu.La partie excedentaire de l'EGF,si elle existe,sera revelée par la coloration d'un spot à la partie inferieure du dispositif.
Mais le dispositif peut très bien être une bandelette sur l'extrêmité de laquelle on depose une goutte d'echantillon qui va migrer horizontalement vers l'autre extrêmité avec toutes les etapes decrites ci dessus.
I1 peut se presenter aussi sous une forme completement liquide : un tube contenant une solution composée de - vesicules supportant le recepteur et enfermant les reactifs (liberant l'lP3 au contact de l'EGF) - les vesicules supportant la proteine canal liberant le Ca++ au contact de l'IP3 - un chromogène virant par exemple au bleu si le Ca++ a été libéré des vesicules ci dessus.
MODE OPERATOIRE
A - PRODUCTION DU RECEPTEUR A1 - CLONAGE DE L'ONCOGENE HERS2/neu CODANT POUR LE RECEPTEUR
Appartenant à la famille des oncogènes erbB-like,il code pour une proteine identique au recepteur de l'EGF avec les mêmes fonctions cellulaires.Son expression est modulée dans les premiers stades de cancer du sein.Les membranes purifiées de cellules tumorales contiennent 0.4 à 15 fmoles de recepteur par mg de proteine membranaire.Dans environ 25% des cas de cancer du sein (avec adenopathies),son expression est fortement amplifiée : les membranes des cellules tumorales contiennent alors 1000 fmoles de recepteur par mg de proteine.
A - PRODUCTION DU RECEPTEUR A1 - CLONAGE DE L'ONCOGENE HERS2/neu CODANT POUR LE RECEPTEUR
Appartenant à la famille des oncogènes erbB-like,il code pour une proteine identique au recepteur de l'EGF avec les mêmes fonctions cellulaires.Son expression est modulée dans les premiers stades de cancer du sein.Les membranes purifiées de cellules tumorales contiennent 0.4 à 15 fmoles de recepteur par mg de proteine membranaire.Dans environ 25% des cas de cancer du sein (avec adenopathies),son expression est fortement amplifiée : les membranes des cellules tumorales contiennent alors 1000 fmoles de recepteur par mg de proteine.
L'oncogène HERS2/neu sera cloné dans un vecteur plasmidique (nous choisissons le Bluescript KS+ de Stratagène parce qu'il est universel,mais un autre vecteur contenant un site unique
Sal I peut aussi être utilisé.)
La technique de clonage s'inspire de celle decrite par Zabarovsky et Allikmets en 1986: a - Les bouts cohesifs de l'ADN de l'oncogène HERS2/neu constitués de quatre nucleotides simple brin,sont remplis partiellement avec les nucleotides dATP et dGTP (laissant seulement deux nucleotides en simple brin à chaque extremité) dilués dans un tampon de Kienow 10X:
- Tris-HCl pH 7.5 0.5 M
-MgC12 0.1M
- Dithiothreitol 0.001 M (Ref Sigma D-9779)
Methode de remplissage partiel des bouts cohesifs:Dans un microtube (Tube No 1) ajouter:
- Oncogène HERS2/neu 1,ug
- Tampon Kienow 10X 5 Ml
- dATP 2mM pH 7 2,5, t
- dGTP 2mM pH 7 2,5 mol
- Completer H20 à 48, l
- Fragment de Kienow à(6U/Ml) 2!" b - Le vecteur plasmidique Bluescript est linearisé par digestion totale avec Sal I (une endonuclease de restriction extraite de Streptomyces albus G et qui reconnait la sequence: TCGAC-3'. Ref Sigma R 0754):les bouts cohesifs de quatre nucleotides simple brin sont partiellement remplis avec les nucleotides dTTP et dCTP,laissant deux nucleotides en simple brin à chaque extremité.
Sal I peut aussi être utilisé.)
La technique de clonage s'inspire de celle decrite par Zabarovsky et Allikmets en 1986: a - Les bouts cohesifs de l'ADN de l'oncogène HERS2/neu constitués de quatre nucleotides simple brin,sont remplis partiellement avec les nucleotides dATP et dGTP (laissant seulement deux nucleotides en simple brin à chaque extremité) dilués dans un tampon de Kienow 10X:
- Tris-HCl pH 7.5 0.5 M
-MgC12 0.1M
- Dithiothreitol 0.001 M (Ref Sigma D-9779)
Methode de remplissage partiel des bouts cohesifs:Dans un microtube (Tube No 1) ajouter:
- Oncogène HERS2/neu 1,ug
- Tampon Kienow 10X 5 Ml
- dATP 2mM pH 7 2,5, t
- dGTP 2mM pH 7 2,5 mol
- Completer H20 à 48, l
- Fragment de Kienow à(6U/Ml) 2!" b - Le vecteur plasmidique Bluescript est linearisé par digestion totale avec Sal I (une endonuclease de restriction extraite de Streptomyces albus G et qui reconnait la sequence: TCGAC-3'. Ref Sigma R 0754):les bouts cohesifs de quatre nucleotides simple brin sont partiellement remplis avec les nucleotides dTTP et dCTP,laissant deux nucleotides en simple brin à chaque extremité.
Methode de remplissage des bouts cohesifs du vecteur:
Dans un microtube (Tube No 2),ajouter:
- ADN Bluescript-Sal I 1,ug
- Tampon Klenow 10X 5 Ml
- dCTP 2mM pH 7 2,5 l - dTTP 2mM pH 7 2,5!"
- compl H20 à 48, l
- Fragment de Klenow (6 UlMi) 2,u1 c - Incuber les deux tubes à 30 C penadnt 30 mn d - Extraction de l'ADN après precipitation au phenol/chloroforme et à l'ether e - Dissoudre le precipité dans du TE gris-HCl 10 mM pH 7,5,EDTA lmM) pour obtenir 1 Mg d'ADN/Ml.
Dans un microtube (Tube No 2),ajouter:
- ADN Bluescript-Sal I 1,ug
- Tampon Klenow 10X 5 Ml
- dCTP 2mM pH 7 2,5 l - dTTP 2mM pH 7 2,5!"
- compl H20 à 48, l
- Fragment de Klenow (6 UlMi) 2,u1 c - Incuber les deux tubes à 30 C penadnt 30 mn d - Extraction de l'ADN après precipitation au phenol/chloroforme et à l'ether e - Dissoudre le precipité dans du TE gris-HCl 10 mM pH 7,5,EDTA lmM) pour obtenir 1 Mg d'ADN/Ml.
A la suite de ces operations:
L'ADN de l'oncogène sera appelé: Oncogène - dAMP - dGMP
L'ADN du vecteur sear appelé : Bluescript - Sal I - dTMP - dCMP f - Ligature: * - Dans un microtube sur glace,ajouter:
- Tampon ligase 10X Itcl
(Tris-HCl pH 8 0.5 M - MgCl2 70 mM - Dithiothreitol 10 mM)
- ATP 10 mM pH 7 1!"
-H20 5!"
- Oncogène-dAMP-dGMP (1, g/, l) 1 l
- Bluescript-Sal I-dTMP-dCMP (1Mg/!") 1!"
Melanger puis ajouter:
- ADN ligase de T4 (10 U) 1 jul * - Incuber à 4 C toute la nuit.Cette solution va servir à transformer les cellules de E.Coli
A2 - TRANSFORMATION DE E.COLI a - Solutions utilisées et preparées sterilement: * - Milieu LB:
- Extrait de levure Bacto 5 g
- Tryptone Bacto 10 g
- NaCl 10 g
- Eau distillée completer à 1 litre
(pour obtenir un agar dur,il est preferable d'ajouter 1,5 g de Bacto-Agar/100 ml de
milieu LB)
- Autoclaver.
L'ADN de l'oncogène sera appelé: Oncogène - dAMP - dGMP
L'ADN du vecteur sear appelé : Bluescript - Sal I - dTMP - dCMP f - Ligature: * - Dans un microtube sur glace,ajouter:
- Tampon ligase 10X Itcl
(Tris-HCl pH 8 0.5 M - MgCl2 70 mM - Dithiothreitol 10 mM)
- ATP 10 mM pH 7 1!"
-H20 5!"
- Oncogène-dAMP-dGMP (1, g/, l) 1 l
- Bluescript-Sal I-dTMP-dCMP (1Mg/!") 1!"
Melanger puis ajouter:
- ADN ligase de T4 (10 U) 1 jul * - Incuber à 4 C toute la nuit.Cette solution va servir à transformer les cellules de E.Coli
A2 - TRANSFORMATION DE E.COLI a - Solutions utilisées et preparées sterilement: * - Milieu LB:
- Extrait de levure Bacto 5 g
- Tryptone Bacto 10 g
- NaCl 10 g
- Eau distillée completer à 1 litre
(pour obtenir un agar dur,il est preferable d'ajouter 1,5 g de Bacto-Agar/100 ml de
milieu LB)
- Autoclaver.
* -CaC120.îM
- CaCl2.H20 7,35 g
- H20 distillée 500 ml
- Autoclaver * -IPTG0.lM
- Isopropyl-thio-B-galactoside 0.119 g
- H20 distillée 5 ml
- Filtrer sterilement à travers une membrane de 0.22 jt et conserver à -200C * - 2% X-Gal
- 5-bromo-4-chloro-3-indol-B-D-Galactoside O.lg
- N'-N'-dimethylformamide 5 ml
- conserver à 4 C b - Preparation des cellules competentes: *-JOUR 1::
A l'aide d'un fil à boucle chauffé au brûleur puis refroidi,etaler des cellules de Escherichia Coli
XL1-Blue (Tetr) sur un Petri d'agar dur contenant 10 g/ml de tetracycline (Antibiotique à large spectre efficace sauf sur E.Coli - ce qui permet le developpement de colonies de E.Coli sans autres germes parasites).
- CaCl2.H20 7,35 g
- H20 distillée 500 ml
- Autoclaver * -IPTG0.lM
- Isopropyl-thio-B-galactoside 0.119 g
- H20 distillée 5 ml
- Filtrer sterilement à travers une membrane de 0.22 jt et conserver à -200C * - 2% X-Gal
- 5-bromo-4-chloro-3-indol-B-D-Galactoside O.lg
- N'-N'-dimethylformamide 5 ml
- conserver à 4 C b - Preparation des cellules competentes: *-JOUR 1::
A l'aide d'un fil à boucle chauffé au brûleur puis refroidi,etaler des cellules de Escherichia Coli
XL1-Blue (Tetr) sur un Petri d'agar dur contenant 10 g/ml de tetracycline (Antibiotique à large spectre efficace sauf sur E.Coli - ce qui permet le developpement de colonies de E.Coli sans autres germes parasites).
Puis mettre la boite de Petri en position inversée à 37 C,en atmosphère humidifiée.Des colonies
vont apparaitre le lendemain.
vont apparaitre le lendemain.
*-JOUR2:
A l'aide d'un fil à boucle sterile,prelever une colonie isolée et ensemencer 100 ml de milieu LB
Incuber sous forte agitation à 37 Cjusqu'à ce que la DO650 nm = 0.2
Refroidir les cellules dans un bain d'eau glacée pendant 10 mn
Centrifuger à 2500 g pendant 5 mn à 4"C.
A l'aide d'un fil à boucle sterile,prelever une colonie isolée et ensemencer 100 ml de milieu LB
Incuber sous forte agitation à 37 Cjusqu'à ce que la DO650 nm = 0.2
Refroidir les cellules dans un bain d'eau glacée pendant 10 mn
Centrifuger à 2500 g pendant 5 mn à 4"C.
Suspendre doucement par rotation le culot cellulaire dans 1 ml de la solution de CaC12 sterile à
0 C
Ajouter 40 ml de la solution de CaC12 et transferer dans un tube de polycarbonate de 50
ml.Incuber sur glace pendant 30 mn.
0 C
Ajouter 40 ml de la solution de CaC12 et transferer dans un tube de polycarbonate de 50
ml.Incuber sur glace pendant 30 mn.
Centrifuger à 2500 g pendant 5 mn.
Suspendre le culot cellulaire dans 1 ml de CaCl2.Conserver à 0 C.
c - Transformation proprement dite:
Verser 0.1 ml de cellules competentes (preparées ci dessus) dans les tubes de polypropylène
sterile numerotés A,B,C,D
Ajouter:
- Tube A: 5,ul de TE 1X (Temoin sans ADN)
- Tube B : 5,ul de Bluescript intact, 2 ng/!" (temoin d'efficacité)
- Tube C: 5,ul du milieu de ligature Bluescript Sal I-dTMP-dCMP
- Tube D ::5!" de ligature Oncogène-dAMP-dGMP avec le Bluescript Sal I-dTMP-dCMP
Melanger doucement et incuber à 0 C durant 30 mn;
Effectuer un choc thermique à 42 C durant 90 secondes puis placer à 0 C
Ajouter 1 ml de milieu LB et incuber à 37 C durant 1 heure afin de permettre l'expression du
gène de resistance à l'ampicilline.Durant le temps d'incubation et afin de permettre une estima
tion visuelle du nombre de recombinants versus le nombre de transformants,ajouter l'inducteur
(IPTG) et un substrat chromogène(X-Gal ou Blue-Gal) du gène de la B-galactosidase à 3 boites
de Petri d'agar dur contenant 50 g/ml d'ampicilline,de la façon suivante::
- au centre d'une boite de Petri deposer 10 l de IPTG et 50, l de X-Gal,et etaler ce
melange sur toute la surface - incuber à 37"C 1 heure
d - Etalement des cellules transformées
dl: determination de la viabilité cellulaire:
- à partir du tube A,effectuer une dilution de 1:106 avec du milieu LB et etaler sur un
Petri d'agar,incuber à 37 C et mesurer la viabilité des cellules competentes
- à partir du même tube A,non dilué,etaler 100,ul sur un Petri LB contenant 50 g/ml
d'ampicilline (Petri AMP)
Aucune croissance ne devra être observée.
Verser 0.1 ml de cellules competentes (preparées ci dessus) dans les tubes de polypropylène
sterile numerotés A,B,C,D
Ajouter:
- Tube A: 5,ul de TE 1X (Temoin sans ADN)
- Tube B : 5,ul de Bluescript intact, 2 ng/!" (temoin d'efficacité)
- Tube C: 5,ul du milieu de ligature Bluescript Sal I-dTMP-dCMP
- Tube D ::5!" de ligature Oncogène-dAMP-dGMP avec le Bluescript Sal I-dTMP-dCMP
Melanger doucement et incuber à 0 C durant 30 mn;
Effectuer un choc thermique à 42 C durant 90 secondes puis placer à 0 C
Ajouter 1 ml de milieu LB et incuber à 37 C durant 1 heure afin de permettre l'expression du
gène de resistance à l'ampicilline.Durant le temps d'incubation et afin de permettre une estima
tion visuelle du nombre de recombinants versus le nombre de transformants,ajouter l'inducteur
(IPTG) et un substrat chromogène(X-Gal ou Blue-Gal) du gène de la B-galactosidase à 3 boites
de Petri d'agar dur contenant 50 g/ml d'ampicilline,de la façon suivante::
- au centre d'une boite de Petri deposer 10 l de IPTG et 50, l de X-Gal,et etaler ce
melange sur toute la surface - incuber à 37"C 1 heure
d - Etalement des cellules transformées
dl: determination de la viabilité cellulaire:
- à partir du tube A,effectuer une dilution de 1:106 avec du milieu LB et etaler sur un
Petri d'agar,incuber à 37 C et mesurer la viabilité des cellules competentes
- à partir du même tube A,non dilué,etaler 100,ul sur un Petri LB contenant 50 g/ml
d'ampicilline (Petri AMP)
Aucune croissance ne devra être observée.
d2: determination de l'efficacité de transformation:
- etaler 50, l de milieu du tube B (Bluescript intact
- doncpas de colonies recombinantes)sur un Petri AMP contenant aussi de l'IPTG et du
X-Gal afin de verifier que les colonies non recombinantes sont bleues d3: etalement des transformants et determination du bruit de fond:
- etaler:
50, l du tube C sur un Petri AMP-IPTG-X-Gal
50 nul du tube D sur un Petri AMP-IPTG-X-Gal
- incuber en position inversée à 37 C toute la nuit
- denombrer les colonies le lendemain.
- etaler 50, l de milieu du tube B (Bluescript intact
- doncpas de colonies recombinantes)sur un Petri AMP contenant aussi de l'IPTG et du
X-Gal afin de verifier que les colonies non recombinantes sont bleues d3: etalement des transformants et determination du bruit de fond:
- etaler:
50, l du tube C sur un Petri AMP-IPTG-X-Gal
50 nul du tube D sur un Petri AMP-IPTG-X-Gal
- incuber en position inversée à 37 C toute la nuit
- denombrer les colonies le lendemain.
- interpretation des resultats : l'etalement avec le tube (C) donne une indication du niveau
de linearité du vecteur par Sal I
Moins il y a de colonies,meilleure a été la digestion.
de linearité du vecteur par Sal I
Moins il y a de colonies,meilleure a été la digestion.
Le bruit de fond est determiné en comparant le nombre de colonies bleues et blanches obtenues à partir de l'etalement du tube D : les colonies bleues correspondent aux cellules transformées avec le vecteur alors que les blanches sont de vrais recombinants.
Prelever les colonies dont les cellules contiennent l'oncogène et produire sur milieux nutritifs appropriés.Ces cellules vont alors produire de grandes quantités de molecules completes et fonctionnelles de recepteur à l'EGF qui vont être extraites,isolées et purifiées.Le recepteur sera titré à 0.430 mg/ml (1 nano mole)dans la solution suivante appelée R: - N-acetylneuraminic acid (acide sialique - type VIII Ref Sigma A 9646) à 0.2 mg/ml, - un coktail de Glycosaminoglycannes : chitine,chondrotin sulfate,heparan sulfate,heparin,acide hyaluronique,keratan sulfate,keratin : à parts egales pour un total de 0.2 mg/ml - un coktail protecteur: sucrose 10%,a-tocopherol 2%,lait ecremé 5%,sodium azide,PBS ,et gardée à 0 C.
L'addition d'acide sialique et de glycannes est d'une importance capitale : dans la cellule naturelle,ils entrent pour 40 % dans la composition du complexe recepteur et son environnement : rôle mecanique de maintien et d'orientation de la molecule de recepteur.(Segarini et
Seyedin J.Biol.Chem. 263,8366-8370 - 1988)
Le sucrose protège la structure quaternaire et tertiaire de la molecule de recepteur,l'-tocopherol protège de l'oxydation de l'oxygène ambiant,le lait ecremé (pour blocking) evite l'immobilisation de la molecule aux divers supports,tubes de stockage,etc.et le sodium azide est;n bacte riostatique courant des solutions proteiques.
Seyedin J.Biol.Chem. 263,8366-8370 - 1988)
Le sucrose protège la structure quaternaire et tertiaire de la molecule de recepteur,l'-tocopherol protège de l'oxydation de l'oxygène ambiant,le lait ecremé (pour blocking) evite l'immobilisation de la molecule aux divers supports,tubes de stockage,etc.et le sodium azide est;n bacte riostatique courant des solutions proteiques.
B - INSERTION DU RECEPTEUR DANS UNE MEMBRANE PROTEOLIPIDIOUE
Cette operation doit au prealable resoudre trois problèmes: 1 - orienter le recepteur afin de presenter ses sites de liaison au ligand à l'exterieur de la cellule 2 - trouver la composition ideale de la membrane:
- equilibre lipides - proteines
- parmi les lipides:equilibre phospholipides - cholesterol
afin de proteger l'activité maximale du recepteur 3 - eviter la denaturation du-recepteur pendant toute l'operation et surtout eviter de l'amener à
l'etat dit degeneré dans lequel un recepteur ne repond plus à son ligand.
Cette operation doit au prealable resoudre trois problèmes: 1 - orienter le recepteur afin de presenter ses sites de liaison au ligand à l'exterieur de la cellule 2 - trouver la composition ideale de la membrane:
- equilibre lipides - proteines
- parmi les lipides:equilibre phospholipides - cholesterol
afin de proteger l'activité maximale du recepteur 3 - eviter la denaturation du-recepteur pendant toute l'operation et surtout eviter de l'amener à
l'etat dit degeneré dans lequel un recepteur ne repond plus à son ligand.
Solution aux problèmes No 1 et 2
Lindstrom et al (J.Biol.Chem.255,8340-8350 - 1980) et Anholt FILMS 2,288-291 1981),Cartaud et Popot (FEBS Lett.121,327-332) ont elaboré des solution elegantes au problème du positionnement des recepteurs de l'acetylcholine qui se retrouvaient orientés au hasard dans les membranes reconstituées .En associant le cholesterol aux phospholipides à raison de 0.4 g de cholesterol par gramme de phospholipides,à 15% de lysoderivés et en utilisant un solvant detergent doux de type desoxycholate pour diluer dans cette solution proteolipidique,les recepteurs purifiés;puis dialyse partielle et filtration sur gel de Sephadex
G25 pour eliminer detergent et solvants : ils obtiennent des membranes presentant à leur surface exterieure 95% des sites de liaison des recepteurs correctement orientés.Pour cela,il fallut respecter un rapport optimal recepteur/lipides,un equilibre detergent/lipides,un equilibre lipides/ cholesterol.Popot et al.(Eur.j ourn.Biochem.l 18,203-214-1981) ont mis au point une solution proteolipidique ideale l'asolectine : un melange très complexe de phospholipides les plus courants,5 à 20% de lysoderivés,de l'a tocopherol (antioxydant des lipides),certaines quinones et un melange de sterols.
Lindstrom et al (J.Biol.Chem.255,8340-8350 - 1980) et Anholt FILMS 2,288-291 1981),Cartaud et Popot (FEBS Lett.121,327-332) ont elaboré des solution elegantes au problème du positionnement des recepteurs de l'acetylcholine qui se retrouvaient orientés au hasard dans les membranes reconstituées .En associant le cholesterol aux phospholipides à raison de 0.4 g de cholesterol par gramme de phospholipides,à 15% de lysoderivés et en utilisant un solvant detergent doux de type desoxycholate pour diluer dans cette solution proteolipidique,les recepteurs purifiés;puis dialyse partielle et filtration sur gel de Sephadex
G25 pour eliminer detergent et solvants : ils obtiennent des membranes presentant à leur surface exterieure 95% des sites de liaison des recepteurs correctement orientés.Pour cela,il fallut respecter un rapport optimal recepteur/lipides,un equilibre detergent/lipides,un equilibre lipides/ cholesterol.Popot et al.(Eur.j ourn.Biochem.l 18,203-214-1981) ont mis au point une solution proteolipidique ideale l'asolectine : un melange très complexe de phospholipides les plus courants,5 à 20% de lysoderivés,de l'a tocopherol (antioxydant des lipides),certaines quinones et un melange de sterols.
Herbette et al. (Biophys.J.36,27-72 .1981) ont ainsi pu reconstituer des membranes artificielles de reticulum sarcoplasmique en inserant des molecules purifiées de Ca++ ATPase fonctionnelles à 100% et en position correcte après melange à l'asolectine,dialyse partielle et filtration sur gel.
Solution au problème No 3:
Pour eviter la denaturation des recepteurs,il est necessaire d'eviter l'utilisation de detergents ioniques et de solvants organiques (trop forts) pour les lipides,eviter la congelation-decongelation pronée par certains auteurs pour produire des membranes proteolipidiques,eviter des dialyses extensives et trop rapides (inferieures à 24 heures).
Pour eviter la denaturation des recepteurs,il est necessaire d'eviter l'utilisation de detergents ioniques et de solvants organiques (trop forts) pour les lipides,eviter la congelation-decongelation pronée par certains auteurs pour produire des membranes proteolipidiques,eviter des dialyses extensives et trop rapides (inferieures à 24 heures).
Mode operatoire:
Materiels : Acide cholique (Merck) - Asolectine (Associated Concentrates) - Tampon Na 1(0.1
M NaCl,10 mM tampon phosphate,0.02% Sodium Azide,pH 7.4) - Tampon Na II (le même mais avec 0.5 M NaCI au lieu de 0.1 M) - Tampon Cs II (le même que Na II mais avec 0.5 M de CsCL au lieu de 0.5 M NaCl) - Membranes de dialyse en feuilles Spectra Por/2 (Bio Rad)
Sephadex G-25 (Pharmacia) - B-mercaptoethanol
- La solution R de Recepteur : decrite plus haut (in acide sialique,glycannes et coktail protecteur) 1 - Dilution de la solution de recepteur R dans:
cholate 1%
asolectine 1%
B mercaptoethanol 0.25%
tampon Na II 1 volume
solution R de recepteur (decrite plus haut): 1 volume
Concentration finale du recepteur: 0.215 mg/ml (0.5 nanomole) de cette solution (qui represente la future membrane) contenant environ 50 mg de proteines par ml,soit 10 picomoles de recepteur / mg de proteines membranaire.
Materiels : Acide cholique (Merck) - Asolectine (Associated Concentrates) - Tampon Na 1(0.1
M NaCl,10 mM tampon phosphate,0.02% Sodium Azide,pH 7.4) - Tampon Na II (le même mais avec 0.5 M NaCI au lieu de 0.1 M) - Tampon Cs II (le même que Na II mais avec 0.5 M de CsCL au lieu de 0.5 M NaCl) - Membranes de dialyse en feuilles Spectra Por/2 (Bio Rad)
Sephadex G-25 (Pharmacia) - B-mercaptoethanol
- La solution R de Recepteur : decrite plus haut (in acide sialique,glycannes et coktail protecteur) 1 - Dilution de la solution de recepteur R dans:
cholate 1%
asolectine 1%
B mercaptoethanol 0.25%
tampon Na II 1 volume
solution R de recepteur (decrite plus haut): 1 volume
Concentration finale du recepteur: 0.215 mg/ml (0.5 nanomole) de cette solution (qui represente la future membrane) contenant environ 50 mg de proteines par ml,soit 10 picomoles de recepteur / mg de proteines membranaire.
puis agitation 10 minutes.
2 - Centrifugation: 20 minutes à 40.000 rpm (rotor Beckman 65) ou 5 minutes à vitesse
maximale dans une Airfuge Beckman pour eliminer d'eventuels debris.
maximale dans une Airfuge Beckman pour eliminer d'eventuels debris.
3 - Dialyse partielle:
Le surnageant est deposé sur une membrane plate et humide de SpectraPor/2 bouchant le
fond d'un tube de plastique.Le tube est installé de telle sorte que la membrane plonge de
quelques millimètres sous la surface d'un important volume (500 ml) de tampon Na LLes
deux compartiments sont agités à l'aide de barreaux magnetiques (le plus petit - quelques
mm - reposant directement sur la membrane de dialyse) mus par un agitateur magnetique
pendant 24 heures.L'ensemble est gardé sous un courant leger d'azote et à l'abri de la lu
mière pour empecher l'oxydation de l'asolectine malgré la presence deK-tocopherol.
Le surnageant est deposé sur une membrane plate et humide de SpectraPor/2 bouchant le
fond d'un tube de plastique.Le tube est installé de telle sorte que la membrane plonge de
quelques millimètres sous la surface d'un important volume (500 ml) de tampon Na LLes
deux compartiments sont agités à l'aide de barreaux magnetiques (le plus petit - quelques
mm - reposant directement sur la membrane de dialyse) mus par un agitateur magnetique
pendant 24 heures.L'ensemble est gardé sous un courant leger d'azote et à l'abri de la lu
mière pour empecher l'oxydation de l'asolectine malgré la presence deK-tocopherol.
A la fin de la dialyse il ne reste plus au dessus de la membrane SpectraPor/2 qu'une solution
proteolipidique de recepteur pure.Elle sera appelée Solution RL (solution R + Lipides).
proteolipidique de recepteur pure.Elle sera appelée Solution RL (solution R + Lipides).
4 - La membrane proprement dite et son support impermeable à lyse programmée:
Une membrane impermeable en acrylate copolymère à lyse programmee telle que celle decrite
plus haut dans le chapitre des membranes à lyse programmée,sterilisée après exposition à des
rayons gamma,d'epaisseur 50 chargée electriquement negative,est deposée adherente bien à
plat au fond d'un bac.
Une membrane impermeable en acrylate copolymère à lyse programmee telle que celle decrite
plus haut dans le chapitre des membranes à lyse programmée,sterilisée après exposition à des
rayons gamma,d'epaisseur 50 chargée electriquement negative,est deposée adherente bien à
plat au fond d'un bac.
Trois solutions vont être deposées tour à tour:
1 - Une solution de proteine Gp + GDP (Guanosine 5' Diphosphate Ref G 6506),sucrose lait ecremé 5%,sodium Azide,eau deionisée sterile.Sechage sous vide poussé à 37"C 1 heure.La membrane est beaucoup moins transparente et prend un aspect legèrement voilé : les composants de cette première solution sont bien adherents.
1 - Une solution de proteine Gp + GDP (Guanosine 5' Diphosphate Ref G 6506),sucrose lait ecremé 5%,sodium Azide,eau deionisée sterile.Sechage sous vide poussé à 37"C 1 heure.La membrane est beaucoup moins transparente et prend un aspect legèrement voilé : les composants de cette première solution sont bien adherents.
2 - La solution proteolipidique RL (recepteur + lipides) est soniquée 30 secondes pour une homogeneisation parfaite puis versée à une extremité de la membrane.Sechage sous vide poussé à 37"C.
3 - La même solution RL est versée mais cette fois à partir de l'autre extremité de la feuille : un film lipidique bicouche est ainsi formé au dessus de la couche de Proteine
Gp,GDP,etc.;
Elle sera conservée sous vide à 0 C en attendant son incorporation au dispositif;le but de la manipulation est d'obtenir:
1") une double couche proteolipidique : afin de reconstituer la bicouche lipidique des membranes plasmiques.
Gp,GDP,etc.;
Elle sera conservée sous vide à 0 C en attendant son incorporation au dispositif;le but de la manipulation est d'obtenir:
1") une double couche proteolipidique : afin de reconstituer la bicouche lipidique des membranes plasmiques.
2") un support pour cette bicouche extrêmement fine
3 ) support temporairement impermeable pour laisser le temps à l'EGF eventuellement present dans l'echantillon,de se fixer aux recepteurs.
3 ) support temporairement impermeable pour laisser le temps à l'EGF eventuellement present dans l'echantillon,de se fixer aux recepteurs.
4 ) des molecules de recepteurs convenablement orientées : pour en avoir la certitude: test à 1' 1251-EGF :
Une bandelette de 1 cm de long et 5 mm de large est trempée pendant 1 minute dans une solution d'EGF marqué à l'iode radioactif (Ref Sigma E 6135 traité par la methode de Hunter à la chloramine T: la radioactivité specifique obtenue est de 200,uCi/,leg d'EGF),puis sortie et rincée plusioeurs fois avec precaution dans un tampon phosphate.La radioactivité mesurée sur les deux faces montre environ 98% de cpm sur la face superieure,preuve que les recepteurs sont bien orientés.
Une bandelette de 1 cm de long et 5 mm de large est trempée pendant 1 minute dans une solution d'EGF marqué à l'iode radioactif (Ref Sigma E 6135 traité par la methode de Hunter à la chloramine T: la radioactivité specifique obtenue est de 200,uCi/,leg d'EGF),puis sortie et rincée plusioeurs fois avec precaution dans un tampon phosphate.La radioactivité mesurée sur les deux faces montre environ 98% de cpm sur la face superieure,preuve que les recepteurs sont bien orientés.
Cette membrane sera conservée à 0 C en attendant d'être decoupée et integrée au dispositif.
C - PREPARAIION DE LA ZONE (C)
Cette zone comprend deux parties: C1 - les reactifs inactivés destinés à être activés en cas de contact ligand recepteur et
C2 - les vesicules enfermant le Ca++ qui doit être libéré en presence d'IP3.
Cette zone comprend deux parties: C1 - les reactifs inactivés destinés à être activés en cas de contact ligand recepteur et
C2 - les vesicules enfermant le Ca++ qui doit être libéré en presence d'IP3.
Cl : Les reactifs:
1 - ATP : Le choix se porte volontiers sur la reference A 0770 de Sigma qui est un ATP sel de Magnesium.Or le magnesium est indispensable à toutes les reactions.
1 - ATP : Le choix se porte volontiers sur la reference A 0770 de Sigma qui est un ATP sel de Magnesium.Or le magnesium est indispensable à toutes les reactions.
2 - Ca++ : Ionophore A23187 ref C 4403. 0.1 moles par litre sont necessaires pour coactiver la Phospholipase C. Cette concentration de Ca++ est indecelable par les chromogènes sensibles au Ca++.Seule la concentration de 1 mMole de Ca++ qui sort des liposomes pourra colorer les chromogènes.
3 - Phospholipase C (E.C. 3.1.4.3) extraite de Clostridium welchii (ref P 7633): inactivée par PRE (Phosphorus Ruptoring Enzyme) : la sous-unité catalytique est ainsi associée,par dephosphorylation,à la sous-unité regulatrice : la phospholipase C devient insensible au
Ca++.Or le Ca++ à 0.1 MM est indispensable à cette enzyme pour l'hydrolyse du PIP2.En cas de contact EGF-Recepteur,le complexe GTP+sous-unité de la Proteine Gp va donc activer la
Phospholipase C en la rendant sensible au Ca++ present à 0.1 MM dans ce melange de reactifs
Remarque très importante:Si le taux du ligand recherché est important (des centaines de picogrammes ou quelques nanogrammes),la quantité de phospholipase C qui va être activée est telle qu'elle suffit à colorer le p-Nitrophenylphosphorylcholine (Kurioka et
Matsuda,M,Anal.Biochem, 75,281 (1976).Ref Produit: Sigma N 5879).La partie C2 ne s'impose plus et le procédé peut s'arrêter là,en deposant en (D) un spot de ce substrat.
Ca++.Or le Ca++ à 0.1 MM est indispensable à cette enzyme pour l'hydrolyse du PIP2.En cas de contact EGF-Recepteur,le complexe GTP+sous-unité de la Proteine Gp va donc activer la
Phospholipase C en la rendant sensible au Ca++ present à 0.1 MM dans ce melange de reactifs
Remarque très importante:Si le taux du ligand recherché est important (des centaines de picogrammes ou quelques nanogrammes),la quantité de phospholipase C qui va être activée est telle qu'elle suffit à colorer le p-Nitrophenylphosphorylcholine (Kurioka et
Matsuda,M,Anal.Biochem, 75,281 (1976).Ref Produit: Sigma N 5879).La partie C2 ne s'impose plus et le procédé peut s'arrêter là,en deposant en (D) un spot de ce substrat.
Mais dans le cas qui nous interesse ici,et conformément à l'esprit de la presente invention basée sur une très grande amplification finale des reactions initiées à partir de traces infinitesimales de ligand à doser,la description de la zone (C) se poursuit avec le troisième reactif:
4 - PIP2: ks-Phosphatidyl-Inositol 4,5 - Diphosphate (Ref P 9763) qui produit sous l'action de la phospholipase C activée : le DAG (Diacyl-glycerol) et l'IP3 (Inositol 1,4,5 triphosphate) qui nous interesse ici au plus haut point.C'est grâce à ce dernier que l'amplification est importante :Selon Berridge et al. (Nature,312,p.315,-1984) l'IP3 stimule la mobilisation du Ca++ hors de ses reserves intracellulaires:essentiellement le reticulum sarcoplasmique.Le mecanisme a été decrit plus haut (action de 1'in3 sur une proteine tetramerique de la membrane du reticulum sarcoplasmique. Cette proteine change alors de conformation : se transforme en canal ionique avec efflux immediat d'ions Ca++ vers le cytoplasme).Les vesicules artificielles decrites au chapitre qui suit,vont essayer d'imiter au mieux les vesicules naturelles de reticulum sarcoplasmique,se trouvant en très grande quantités dans les cellules des muscles squelettiques de mammifères,donc faciles à obtenir regulièrement en grandes quantités.
4 - PIP2: ks-Phosphatidyl-Inositol 4,5 - Diphosphate (Ref P 9763) qui produit sous l'action de la phospholipase C activée : le DAG (Diacyl-glycerol) et l'IP3 (Inositol 1,4,5 triphosphate) qui nous interesse ici au plus haut point.C'est grâce à ce dernier que l'amplification est importante :Selon Berridge et al. (Nature,312,p.315,-1984) l'IP3 stimule la mobilisation du Ca++ hors de ses reserves intracellulaires:essentiellement le reticulum sarcoplasmique.Le mecanisme a été decrit plus haut (action de 1'in3 sur une proteine tetramerique de la membrane du reticulum sarcoplasmique. Cette proteine change alors de conformation : se transforme en canal ionique avec efflux immediat d'ions Ca++ vers le cytoplasme).Les vesicules artificielles decrites au chapitre qui suit,vont essayer d'imiter au mieux les vesicules naturelles de reticulum sarcoplasmique,se trouvant en très grande quantités dans les cellules des muscles squelettiques de mammifères,donc faciles à obtenir regulièrement en grandes quantités.
C2 : Les vesicules artificielles de reticulum sarcoplasmique .
La technologie s'inspire partiellement de Szoka et Papahadjopoulos (Proc.Nat.Acad.Sci.USA,75,-1978. p.4194-4198),auteurs d'une Procedure de preparation de liposomes par reverse-phase evaporation,permettant une capture importante d'ions en solution acqueuse.ll y est associé ici,la technologie d'insertion d'un recepteur dans la bicouche lipidique selon le protocole decrit plus haut.
L'association des deux procédés donne un resultat interessant aboutissant à l'expulsion hors de ces vesicules,de millions de molecules de Ca++ par seconde après contact avec 1 molecule de
IP3.Comme L molecule de phospholipase C activée produit chaque seconde quelques milliers de molecules d'IP3,et comme 1 molecule de recepteur (par le site Tyrosine kinase) active chaque seconde des milliers de molecule de Proteine Gp puis de Phospholipase C,il est possible d'affirmer que le facteur d'amplification molecules-signal/molecules-ligand est au minimum de 10 puissance 15/seconde.
IP3.Comme L molecule de phospholipase C activée produit chaque seconde quelques milliers de molecules d'IP3,et comme 1 molecule de recepteur (par le site Tyrosine kinase) active chaque seconde des milliers de molecule de Proteine Gp puis de Phospholipase C,il est possible d'affirmer que le facteur d'amplification molecules-signal/molecules-ligand est au minimum de 10 puissance 15/seconde.
L'etape C2 se divise ainsi selon les etapes qui seront detaillées plus loin: a - Production de la proteine-canal du reticulum sarcoplasmique b - Son insertion dans une solution proteolipidique,future membrane liposomique c - Preparation de la solution acqueuse de Ca++ 1 mM à encapsuler d - Assemblage de tous ces elements pour produire les vesicules e - Un contrôle de qualité::
- de l'absence de Ca++ ou de fuites de Ca++ hors des vesicules
- de la bonne orientation de la proteine canal vers l'exterieur
- de la fonction canal a - Production de la proteine-canal du reticulum sarcoplasmique -
Contrairement à l'option genetique choisie plus haut pour la production de recepteur à l'EGF,la production ici se fera par extraction et purification à partir des cellules de muscles striés squelettiques, repandues chez les mammifères en quantités considerables,alors que les cellules supportant le recepteur à l'EGF sont plus difficiles d'accès.
- de l'absence de Ca++ ou de fuites de Ca++ hors des vesicules
- de la bonne orientation de la proteine canal vers l'exterieur
- de la fonction canal a - Production de la proteine-canal du reticulum sarcoplasmique -
Contrairement à l'option genetique choisie plus haut pour la production de recepteur à l'EGF,la production ici se fera par extraction et purification à partir des cellules de muscles striés squelettiques, repandues chez les mammifères en quantités considerables,alors que les cellules supportant le recepteur à l'EGF sont plus difficiles d'accès.
Dans le muscle strié squelettique,les potentiels d'action generés par la stimulation de la plaque motrice quittent la surface de la myofibrille,penetrent à l'interieur de celle-ci par les tubules T et atteignent les triades (1 vesicule de reticulum - 1 tubule - 1 vesicule de reticulum).L'arrivée du potentiel au niveau de ces synapses intracellulaires declenche la liberation de Ca++ à partir du reticulum sarcoplasmique.La microscopie electronique a permis de mettre en evidence des structures typiques ( foot-like structures ) au niveau de ces membranes: - au niveau du tubule : une proteine de 212 kDa se comportant comme un detecteur de potentiel membranaire ( voltage sensor ) et agit sur la proteine canal du reticulum en produisant de l'IP3.Elle est inhibée par les dihydropyridines (antagonistes de l'influx calcique en pharmacologie cardio-vasculaire).
- au niveau de la membrane du reticulum sarcoplasmique : une proteine tetramerique (4 sousunités de 400kDachacune),totalement impermeable au repos mais qui se transforme en canal ionique pour le Ca++ au contact de I'IP3.Elle fixe un de ses antagonistes : la ryanodine (alcaloïde vegetal) puissant inhibiteur calcique.
Le système tubule T - reticulum sarcoplasmique fonctionne en Ca+±induced - Ca+±release (Fabiato. J,Gen.Physioi. 85 : 247-289, 1985): une faible quantité de Ca++ (0.1 feM) traversant le tubule T contribue (avec la proteine Gp) à induire une très importante liberation de Ca++ (1 mM) dans le cytoplasme.
C'est ce dernier mecanisme qui nous interesse dans le dispositif et le procédé faisant l'objet de la presente invention: : amplifier au maximum.
Comme l'IP3 est deja produit dans le procédé present par l'activation de la phospholipase C sur leP1P2,il n'est plus necessaire de coupler la proteine canal à la proteine (voltage sensor) du tubule.
Mode operatoire:
Les fragments de muscles striés squelettiques sont hachés pendant une heure dans un grand volume due solution physiologique et de FicolI à 370C.La centrifugation à vitesses progressives separe- les debris des cellules.Ces dernières subissent une solubilisation des membranes plasmique et intracellulaires par des solutions à 1% de detergents non-ioniques (Triton
X-100 par ex.),le cholate de sodium ou la digitonine,associés à un melange d'inhibiteurs de proteases- tels que le fluorure de phenylmethylesulfonate,la leupeptine,l' aprotinine
Une centrifugation permet d'eliminer complètement les membranes solubilisées et le surna geant-estpassé sur-une colonne de chromatographie d'affmité pour l'isolement de la proteinecanal tetramerique (Travaux
Les fragments de muscles striés squelettiques sont hachés pendant une heure dans un grand volume due solution physiologique et de FicolI à 370C.La centrifugation à vitesses progressives separe- les debris des cellules.Ces dernières subissent une solubilisation des membranes plasmique et intracellulaires par des solutions à 1% de detergents non-ioniques (Triton
X-100 par ex.),le cholate de sodium ou la digitonine,associés à un melange d'inhibiteurs de proteases- tels que le fluorure de phenylmethylesulfonate,la leupeptine,l' aprotinine
Une centrifugation permet d'eliminer complètement les membranes solubilisées et le surna geant-estpassé sur-une colonne de chromatographie d'affmité pour l'isolement de la proteinecanal tetramerique (Travaux
de Takeshima cité plus haut : un anticorps specifique de cette proteine est fixé sur un gel dans la colonne de chromatographie).Une seconde etape de pùrifica tion est necessaire en-HPLC (chromatographie liquide à haute performance) ou en electrophorèse en gel de polyacrylamide en une ou deux dimensions.
b - Melanger cette proteine canal purifiée à une solution proteolipidique identique à celle decrite plus haut pour la solution de recepteur: l'ensemble est appelé solution A c- Preparer la solution acqueuse de Ca++ àencapsuler: la preference va àlareference C5149 Sigma
: Calcium ionophore A23187: sel de calcium-magnesium avec un molar ratio Ca:Mg de 1:1 4 mg de ce produit sont dissous dans 100 ml d'eau deionisée sterile.La solution obtenue est concentrée à 1 mM de Ca++/litre.elle est appelée : solution B d - Production des vesicules:
Le principe general de la methode consiste en la formation de grandes vesicules sous l'effet de l'addition de la solution B à la solution A,ultrasonnée et evaporée sous pression reduite.
: Calcium ionophore A23187: sel de calcium-magnesium avec un molar ratio Ca:Mg de 1:1 4 mg de ce produit sont dissous dans 100 ml d'eau deionisée sterile.La solution obtenue est concentrée à 1 mM de Ca++/litre.elle est appelée : solution B d - Production des vesicules:
Le principe general de la methode consiste en la formation de grandes vesicules sous l'effet de l'addition de la solution B à la solution A,ultrasonnée et evaporée sous pression reduite.
La solution acqueuse B de Ca++ est ajoutée directement à la solution A à raison d'1 volume de
B pour 4 volumes de A.Le melange est ultrasonné pendant 1 minute à 0 C sous atmosphère d'azote: il se presente alors comme une emulsion homogène constituée de très petites gouttelettes de solution acqueuse B stabilisées par une monocouche de la solution proteolipidique A contenant la proteine-canal.Les solvants sont ensuite eliminés sous pression reduite entrainant la formation d'une phase intermediaire visqueuse,semblable à un gel: les gouttelettes entourées d'une monocouche de solution A s'agrègent: une grande partie (50%) se lysent,libèrent leur solution acqueuse B et offrent leur monocouche de solution A aux gouttelettes restées intactes qui se trouvent ainsi entourées d'une bicouche.L'evaporation des dernières traces de solvant est suivie de la formation spontanée de liposomes.
B pour 4 volumes de A.Le melange est ultrasonné pendant 1 minute à 0 C sous atmosphère d'azote: il se presente alors comme une emulsion homogène constituée de très petites gouttelettes de solution acqueuse B stabilisées par une monocouche de la solution proteolipidique A contenant la proteine-canal.Les solvants sont ensuite eliminés sous pression reduite entrainant la formation d'une phase intermediaire visqueuse,semblable à un gel: les gouttelettes entourées d'une monocouche de solution A s'agrègent: une grande partie (50%) se lysent,libèrent leur solution acqueuse B et offrent leur monocouche de solution A aux gouttelettes restées intactes qui se trouvent ainsi entourées d'une bicouche.L'evaporation des dernières traces de solvant est suivie de la formation spontanée de liposomes.
Ce gel contiendra donc les restes de gouttelettes lysées : la solution B avec en particulier beaucoup de Ca++.fl est imperatif de debarrasser le gel de ces molecules de Ca++ car le principe du procédé est de doser le Ca++ expulsé des liposomes : pour cela le gel est dilué dans de l'eau deionisée sterile et dialyse toute une nuit sous agitation reduite à travers une membrane de
SpectraPor/2 contre un grand volume de tampon Na I (decrit plus haut) avant de passer sur une colonne de Sepharose 4B.
SpectraPor/2 contre un grand volume de tampon Na I (decrit plus haut) avant de passer sur une colonne de Sepharose 4B.
Le gel est ensuite irradié (quelques secondes seulement pour preserver la proteine-canal) aux rayons ultra-violets à une longueur d'onde de 254 nm : les groupements - C = C - C = C - de chaque chaine d'acides gras deviennent:
-C-C=C-C-
n n
-C-C=C-C
Des doubles liaisons - > fl II
- C - C = C - C- se créent avec le même groupement de la chaine voisine d'acides gras.Ceci entraine une polymerisation des lipides et surtout une stabilisation de la paroi des vesicules.
-C-C=C-C-
n n
-C-C=C-C
Des doubles liaisons - > fl II
- C - C = C - C- se créent avec le même groupement de la chaine voisine d'acides gras.Ceci entraine une polymerisation des lipides et surtout une stabilisation de la paroi des vesicules.
La preparation obtenue contient exclusivement des vesicules de type R.E.V. de grandes tailles (0.20,um),stables dans le temps (parois polymerisées) avec une grande efficacité d'encapsulation de la solution acqueuse de Ca++ : au microscope,il n'y a pas d'espace mort à l'interieur des vesicules : les bicouches lipidiques supportant la proteine-canal tetramerique convenablement orientée vers l'exterieur,sont en contact direct avec la solution de Ca++ encapsulée.
La preparation sera appelée R.E.V- Ca++
Contrôles de qualité:
1 - Contrôle de l'absence de calcium en dehors des vesicules:
10 qui de la preparation de R.E.V - Ca++ sont dilués dans 1 ml d'une solution à 1% de 2 HydrXyl-1-(2-hydrxy-4-sulfo-1-naphtylazol)-3-naphtoic Acid (Ref Sigma H 2516) in PBS pH 7.4
Si le melange devient bleu immediatement c'est que du Ca++ persiste encore entre les liposomes.ll faut refaire l'etape dialyse + colonne.
Contrôles de qualité:
1 - Contrôle de l'absence de calcium en dehors des vesicules:
10 qui de la preparation de R.E.V - Ca++ sont dilués dans 1 ml d'une solution à 1% de 2 HydrXyl-1-(2-hydrxy-4-sulfo-1-naphtylazol)-3-naphtoic Acid (Ref Sigma H 2516) in PBS pH 7.4
Si le melange devient bleu immediatement c'est que du Ca++ persiste encore entre les liposomes.ll faut refaire l'etape dialyse + colonne.
Si le melange devient bleu après seulement un certain temps,c'est que du Ca++ est relargué anormalement hors des vesicules avec le temps.Mais Hunt et al. (IntJ.Pharm.,8,1981,101-110) ont demontré que l'addition de -tocopherol comme antioxydant (decrit dans la solution A),la conservation sous vide (à l'abri de l'oxygène) et à l'abri de la lumière ainsi que l'irradiationpolymerisation aux U.V. ont permis la conservation de tels liposomes pendant deux ans sans relargage de leur contenu.
2a - Contrôle de la bonne orientation vers l'exterieur de la proteine-canal:
10,bd de la preparation REV-Ca++ et 10 Sd d'une preparation temoin de liposomes sans la proteine-canal,sont dilués dans 1 ml d'une solution à 1% de IP3 marqué à l'iode 121 in
PBS (Methode à la chloramine T de Hunter et Grennwood - radioactivité specifique de 250 ,uCi/,ug d'IP3) et agitation douce pendant 2 minutes à 37 C.Centrifugation (4000 rpm) brève: le surnageant est gardé pour le contrôle 2b suivant et les liposomes sont rincés plusieurs fois
après agitation douce de 30 secondes chaque fois dans du PBS à 37"C.Les liposomes isolés après centrifugation montrent une forte radioactivité alors que les temoins identiques mais sans la proteine-canal n'ont qu'une radioactivité residuelle negligeable.La proteine insérée est bien orientée : elle a fixé 1'IP3 marqué radioactivement.
10,bd de la preparation REV-Ca++ et 10 Sd d'une preparation temoin de liposomes sans la proteine-canal,sont dilués dans 1 ml d'une solution à 1% de IP3 marqué à l'iode 121 in
PBS (Methode à la chloramine T de Hunter et Grennwood - radioactivité specifique de 250 ,uCi/,ug d'IP3) et agitation douce pendant 2 minutes à 37 C.Centrifugation (4000 rpm) brève: le surnageant est gardé pour le contrôle 2b suivant et les liposomes sont rincés plusieurs fois
après agitation douce de 30 secondes chaque fois dans du PBS à 37"C.Les liposomes isolés après centrifugation montrent une forte radioactivité alors que les temoins identiques mais sans la proteine-canal n'ont qu'une radioactivité residuelle negligeable.La proteine insérée est bien orientée : elle a fixé 1'IP3 marqué radioactivement.
2b - Contrôle de la fonction canal :
Les surnageants sont mis en contact avec le reactif chromogène sensible au Ca++,decrit plus haut.Le surnageant du test à 1'IP3 radiomarqué colore le reactif en bleu : presence de Ca++ : il y a bien eu ouverture du canal au contact de l'IP3.Tandis que le surnageant du tube temoin < liposomes sans la proteine-canal) reste incolore : il n' y a pas de fuite de Ca++ hors des liposomes.
Les surnageants sont mis en contact avec le reactif chromogène sensible au Ca++,decrit plus haut.Le surnageant du test à 1'IP3 radiomarqué colore le reactif en bleu : presence de Ca++ : il y a bien eu ouverture du canal au contact de l'IP3.Tandis que le surnageant du tube temoin < liposomes sans la proteine-canal) reste incolore : il n' y a pas de fuite de Ca++ hors des liposomes.
CONFE in DE LA ZONE CYTOPLASMIQUE" (C!:
Materiels:
- Papier Durieux No 122
- Lait ecremé
- Solution de reactifs : ATP,GDP,Proteine Gp,Mg++,Ca++ 0.1 M,Phospholipase C
inactivée,PB S ,bacteriostatiques.
Materiels:
- Papier Durieux No 122
- Lait ecremé
- Solution de reactifs : ATP,GDP,Proteine Gp,Mg++,Ca++ 0.1 M,Phospholipase C
inactivée,PB S ,bacteriostatiques.
- La solution de liposomes in eau deionisée sterile.
Mode operatoire:
I - Des carrés de 15 mm de côtés sont decoupés dans le papier Durieux no 122 et placés
1 heure dans une boite de Petri contenant 50 ml de lait ecremé dilué à 5% in PBS à
370C,sur agitateur oscillant.
I - Des carrés de 15 mm de côtés sont decoupés dans le papier Durieux no 122 et placés
1 heure dans une boite de Petri contenant 50 ml de lait ecremé dilué à 5% in PBS à
370C,sur agitateur oscillant.
2 - Rincés plusieurs fois avec du PBS + Sodium Azide 2% (bacteriostatique) et sechés
sous vide à 50 C: ce support est saturé et le melange reactifs+liposomes qui va y
sejourner ne s'y fixera pas (risque de non-mobilisation des reactifs quand le liquide de
l'echantillon arrivera en (C))
3 - Dans un tube en polypropylène (faible retention de proteines sur les parois) sterile on
ajoute 1 volume de la solution de reactifs et 1 volume de solution de liposomes.
sous vide à 50 C: ce support est saturé et le melange reactifs+liposomes qui va y
sejourner ne s'y fixera pas (risque de non-mobilisation des reactifs quand le liquide de
l'echantillon arrivera en (C))
3 - Dans un tube en polypropylène (faible retention de proteines sur les parois) sterile on
ajoute 1 volume de la solution de reactifs et 1 volume de solution de liposomes.
Agitation douce au vortex 30 secondes. 20 fd du melange est ensuite deposé au centre
de chaque carré de papier,puis seché à 37"C sous vide très poussé (- 100 mm Hg)
pendant au moins une nuit.La face de depose est notée par un repère.C'est la face
superieure.
de chaque carré de papier,puis seché à 37"C sous vide très poussé (- 100 mm Hg)
pendant au moins une nuit.La face de depose est notée par un repère.C'est la face
superieure.
4 - Le lendemain,10 ui d'une solution d'acrylate copolymère sont deposés à la face
inferieure du papier.Sechage rapide à 37"C sous vide: Ce produit va former un film
impermeable pendant 45 secondes à tout liquide,laissant le temps aux reactions de se
faire dans la zone (C).
inferieure du papier.Sechage rapide à 37"C sous vide: Ce produit va former un film
impermeable pendant 45 secondes à tout liquide,laissant le temps aux reactions de se
faire dans la zone (C).
Les supports papier sont ensuite placés par groupes de dix dans des boites de Petri (contenant chacune deux pastilles de silicate-dessicant bleu,à rejeter ou changer absolument quand il vire au rose) steriles elles mêmes placées dans des sachets en papier aluminium (opaque) qui seront soudés ensuite sous vide poussé (pas d'oxygène) suivi de reinjection d'argon (gaz neutre) pour eviter l'implosion des sachets d'aluminium sous l'effet de la forte depression.Une partie est gardé à 4"C et une partie est gardée à temperature ambiante pour les etudes de conservation.
CONFECTION DE L'ETAGE DE RSVELATION (D)
La preference va au nylon (Nytran de Pall) pour sa solidité,sa faible porosité (0.45 M) et sa blancheur.Un carré de 15 mm de côté est decoupé et 2,5 $l de HydroxynaphtolBlue dilué à 2% in NaCl 0,6 M sont deposés au centre.line fois seché,le spot est incolore.La concentration de
NaCl elevée ici (4 fois la concentration physiologique qui est de 0.15 M) est voulue : elle provoque un appel osmotique des liquides de (C) vers le spot,une fois la membrane d'acrylate lysée à la face inferieure de (C).
CONFECTION DE L'ETAGE DE RSVELATION (D)
La preference va au nylon (Nytran de Pall) pour sa solidité,sa faible porosité (0.45 M) et sa blancheur.Un carré de 15 mm de côté est decoupé et 2,5 $l de HydroxynaphtolBlue dilué à 2% in NaCl 0,6 M sont deposés au centre.line fois seché,le spot est incolore.La concentration de
NaCl elevée ici (4 fois la concentration physiologique qui est de 0.15 M) est voulue : elle provoque un appel osmotique des liquides de (C) vers le spot,une fois la membrane d'acrylate lysée à la face inferieure de (C).
MONTAGE FINAL D'UN DISPOSITIF DE DOSAGE DE L'EGF
Materiels: On depose dans l'ordre:
- Une plaque de polystyrène cristal de taille Credit-carte
et de 0.5 mm d'epaisseur,sterilisée (Rayons gamma par ex)
-Un carré (D)
- Un carré (C)
- Un carré (B)
- Un carré de (A) filtre et tampon eventuel
- Une plaque en PVC non transparente de 0.75 mm d'epaisseur,sterile,de même taille que
la plaque inferieure de polystyrène,mais perforée d'un orifice de 8 mm de diamètre qui
va servir de puits de depose de l'echantfflon
L'ensemble,bien superposé,est thermosoudé sous pression.Placé dans un sachet d'aluminium opaque qui sera soudé sous vide poussé après reinjection d'argon,et conservé de preference au frais.Ne jamais congeler: eclatement des liposomes dans lesquels nous avons vu qu'il n'y avait pas de volume mort,liberation de Ca++ et test completement faussé.
Materiels: On depose dans l'ordre:
- Une plaque de polystyrène cristal de taille Credit-carte
et de 0.5 mm d'epaisseur,sterilisée (Rayons gamma par ex)
-Un carré (D)
- Un carré (C)
- Un carré (B)
- Un carré de (A) filtre et tampon eventuel
- Une plaque en PVC non transparente de 0.75 mm d'epaisseur,sterile,de même taille que
la plaque inferieure de polystyrène,mais perforée d'un orifice de 8 mm de diamètre qui
va servir de puits de depose de l'echantfflon
L'ensemble,bien superposé,est thermosoudé sous pression.Placé dans un sachet d'aluminium opaque qui sera soudé sous vide poussé après reinjection d'argon,et conservé de preference au frais.Ne jamais congeler: eclatement des liposomes dans lesquels nous avons vu qu'il n'y avait pas de volume mort,liberation de Ca++ et test completement faussé.
MODE D'EXECUITON D'UN DOSAGE OUALITATIF.ETUDE DE SENSIBILrTt
Materiels:
- 7 tubes plastique de 2,5 ml numerotés 1 à 6
- Epidermal cell growth factor Endotoxin Free - lyophilisé - Ref E 1257 - 0.1 mg
dilué dans 1 ml de PBS 0.1 mg/ml = solution-mère
-PBS
Mode operatoire:
Le tube No 1 est temoin negatif: PBS seul - 100 l
Le tube No 2: PBS 99 ,tl + l sol-mère EGF - > dilution à 1,teg/ml
Le tube No 3 : PBS 99 M1 + 1, l du tube No 2- > dilution à 10 ng/ml Le tube No :PBS 99, l + 1, l du tube No 3 - > dilution à 100 pg/ml
Le tube No 5 : PBS 90 l + 10,ul du tube No 4- > dilution à 10 pg/ml
Le tube No 6 : PBS 90 l + 10 mol du tube No 5- > dilution à 1 pg/ml
Le tube No 7 : PBS 90 l + 10 mol du tube No 6- > dilution à 0.1 pg/ml
Le contenu de chaque tube est versé sur un dispositif different numeroté selon le tube versé.
Materiels:
- 7 tubes plastique de 2,5 ml numerotés 1 à 6
- Epidermal cell growth factor Endotoxin Free - lyophilisé - Ref E 1257 - 0.1 mg
dilué dans 1 ml de PBS 0.1 mg/ml = solution-mère
-PBS
Mode operatoire:
Le tube No 1 est temoin negatif: PBS seul - 100 l
Le tube No 2: PBS 99 ,tl + l sol-mère EGF - > dilution à 1,teg/ml
Le tube No 3 : PBS 99 M1 + 1, l du tube No 2- > dilution à 10 ng/ml Le tube No :PBS 99, l + 1, l du tube No 3 - > dilution à 100 pg/ml
Le tube No 5 : PBS 90 l + 10,ul du tube No 4- > dilution à 10 pg/ml
Le tube No 6 : PBS 90 l + 10 mol du tube No 5- > dilution à 1 pg/ml
Le tube No 7 : PBS 90 l + 10 mol du tube No 6- > dilution à 0.1 pg/ml
Le contenu de chaque tube est versé sur un dispositif different numeroté selon le tube versé.
Resultats obtenus :Intensité du spot bleu noté de +++ à 0
No tube: 1 2 3 4 5 6 7
Resultat: 0 +++++ ++++ ++ + 0 0 DOSAGE SEMr-OUANIITAl if DE LIGAND EXEMPLE DE L'EGF
Deux procédés peuvent être utilisés pour neutraliser la quantité estimée normale de ligand qui ne doit pas declencher de signal: 1 - Inserer au dessus de la membrane (13) un membrane (B0) semblable en tous points à (B) mais ne contenant qu'une certaine quantité seulement de recepteurs qui vont fixer cette quantité limite.Comme il n'y a pas d'espace (C) reactif sous cette membrane (B0),aucun signal n'est transmis par cette quantité physiologique de ligand stoppée en (B0).Seules les quantités de ligand superieures au seuil defini pour ce test semi-quantitatif,traverseront (B0) et viendront se fixer en (B) pour transmettre cette fois-ci en (C) un signal revelant un excès de ligand.
No tube: 1 2 3 4 5 6 7
Resultat: 0 +++++ ++++ ++ + 0 0 DOSAGE SEMr-OUANIITAl if DE LIGAND EXEMPLE DE L'EGF
Deux procédés peuvent être utilisés pour neutraliser la quantité estimée normale de ligand qui ne doit pas declencher de signal: 1 - Inserer au dessus de la membrane (13) un membrane (B0) semblable en tous points à (B) mais ne contenant qu'une certaine quantité seulement de recepteurs qui vont fixer cette quantité limite.Comme il n'y a pas d'espace (C) reactif sous cette membrane (B0),aucun signal n'est transmis par cette quantité physiologique de ligand stoppée en (B0).Seules les quantités de ligand superieures au seuil defini pour ce test semi-quantitatif,traverseront (B0) et viendront se fixer en (B) pour transmettre cette fois-ci en (C) un signal revelant un excès de ligand.
2 - Un second procédé consiste à fixer sur une simple membrane de nylon ou de nitrocellulose bien preparées,une certaine quantité bien definie à l'avance d'anticorps très specifiques du ligand recherché. Si ce dernier est en excès,il traverse la memebrane (B0).
Devant la simplicité de cette seconde solution et la disponibilité des anticorps concernés,les dosages semi-quantitatifs qui vont être decrits utilisent tous une membrane (B0) en nitrocellulose aec un coating d'anticorps monoclonaux dirigés contre une certaine quantité seulement de ligand recherché.
Les figures 4.0 (excès d'EGF) et 4.1 (pas d'excès) illustrent le procédé:
Le dispositif est identique auprededent sauf qu'une membrane (B0) supportant une certaine quantité seulement d'anticorps monoclonaux de haute affinité anti-EGF est inserée au dessus de la membrane (B).Cette membrane supplementaire est aussi rendue temporairement etanche par un film à lyse programmée prealablement deposé à sa face inferieure.
Le dispositif est identique auprededent sauf qu'une membrane (B0) supportant une certaine quantité seulement d'anticorps monoclonaux de haute affinité anti-EGF est inserée au dessus de la membrane (B).Cette membrane supplementaire est aussi rendue temporairement etanche par un film à lyse programmée prealablement deposé à sa face inferieure.
Mode operatoire pour la membrane (B0): 1 - Humidifier une feuille carrée de 45 mm de côté,en nitrocellulose renforcée de Schleicher et
Schull (Reference BAS 95,porosité 0.45 Uepaisseur 50 .) en la plongeant dans une solution de
Proteine A à 1 fegtml in PBS sterile.Secher sous vide poussé à 37"C pendant 1 heure,à l'abri de la lumière.
Schull (Reference BAS 95,porosité 0.45 Uepaisseur 50 .) en la plongeant dans une solution de
Proteine A à 1 fegtml in PBS sterile.Secher sous vide poussé à 37"C pendant 1 heure,à l'abri de la lumière.
2 - Rincer plusieurs fois dans un bac sterile avec du PBS sterile.
3 - Coating: Sans secher,la placer dans une boite de Petri de 10 cm de diametre contenant la solution suivante:
- Anticorps Monoclonal Anti - EGF Ref C2635 Sigma. 1 Mg/ml
- Thimerosal 0.01%
- PBS qsp pour 25 ml
Agitateur orbital à petite vitesse pendant 2 heures.
- Anticorps Monoclonal Anti - EGF Ref C2635 Sigma. 1 Mg/ml
- Thimerosal 0.01%
- PBS qsp pour 25 ml
Agitateur orbital à petite vitesse pendant 2 heures.
4 - Ricer plusierus fois comme dans 2).
5 - Blocking de la nitro-cellulose pour qu'elle ne retienne pas à tort l'EGF eventuel en excès par rapport aux anticorps correspondants:
Bain à 37 "C dans la solution suivante : BSA 2% - TRIS - Thimerosal 0.01%; 1 heure sous agitation douce.
Bain à 37 "C dans la solution suivante : BSA 2% - TRIS - Thimerosal 0.01%; 1 heure sous agitation douce.
6 - Rincer plusieurs fois comme dans 2).
Stocker à sec avec un dessicant,à l'abri de la lumière,sous vide de preference,en attendant l'assemblage du dispositif comme indiqué dans les figures 4.0 et 4.1:
Dans l'exemple present,Ie taux d'EGF au dessus duquel le test se colore (Fig. 4.0) est de 0,875 nanogrammes / ml d'echantillon.
Dans l'exemple present,Ie taux d'EGF au dessus duquel le test se colore (Fig. 4.0) est de 0,875 nanogrammes / ml d'echantillon.
En dessous de cette limite,il n'y a pas de coloration.
Il est possible d'abaisser cette limite ou de l'augmenter en abaissant ou augmentant la concentration d'anticorps anti-EGF dans l'etape de coating ( 3-)
DOSAGE DE PLUSIEURS LTGANDS AVEC LA MEME (;OUITE D'ECHANTILLON
PROPOSITION D'UN MULTlTEST D'ALERTE
En associant plusieurs types de recepteurs dans la solution proteolipidique destinée à la confection de la membrane (B),il est possible de doser les ligands correspondants. Si au moins un des ligands est present dans l'echantfflon,le test se colore.
DOSAGE DE PLUSIEURS LTGANDS AVEC LA MEME (;OUITE D'ECHANTILLON
PROPOSITION D'UN MULTlTEST D'ALERTE
En associant plusieurs types de recepteurs dans la solution proteolipidique destinée à la confection de la membrane (B),il est possible de doser les ligands correspondants. Si au moins un des ligands est present dans l'echantfflon,le test se colore.
Exemple : en associant en (B) (dispositif d'alerte) les recepteurs à l'EGF,au TGF- et B,au
PDGF.Si au moins l'un des facteurs est present dans l'echantillon,le test se colore et il est alors
possible de proceder à des tests specifiques de chaque facteur de croissance (dispositif d'orien
tation).
PDGF.Si au moins l'un des facteurs est present dans l'echantillon,le test se colore et il est alors
possible de proceder à des tests specifiques de chaque facteur de croissance (dispositif d'orien
tation).
De même pour les cytokines dans les desordres hematopoietiques : il est possible d'associer
plusieurs recepteurs aux interleukines en (B).si le test se colore c'est qu'au moins l'une d'elles
est presenteS partir de ce test d'alerte,il est possible de pratiquer des tests pour chacune des
interleukines concernées : orientation vers la sphère concernée (ex: 1r6 pour le myelome)
Ceci est tout à fait valable pour le dosage semi-quantitatif des ligands concernés (en fixant en
(BO) une association d'anticorps specifiques des ligands) et en (B) une association de recepteurs
de ces ligands.La seule condition requise est que ces recepteurs declenchent chacun le même
processus d'activation des reactifs en (C):en possedant tous un site Tyrosine kinase par exemple
pour utiliser l'amplification Phospholipase C - > IP3 et expulsion du Ca++ intraliposomique,
soit en possedant tous le pouvoir d'augmenter l'AMPc come nous l'avons vu plus hautin faut
donc grouper dans ces tests d'alerte,les recepteurs appartenent au même groupe et doués des
mêmes propriétés d'activation en (C).
plusieurs recepteurs aux interleukines en (B).si le test se colore c'est qu'au moins l'une d'elles
est presenteS partir de ce test d'alerte,il est possible de pratiquer des tests pour chacune des
interleukines concernées : orientation vers la sphère concernée (ex: 1r6 pour le myelome)
Ceci est tout à fait valable pour le dosage semi-quantitatif des ligands concernés (en fixant en
(BO) une association d'anticorps specifiques des ligands) et en (B) une association de recepteurs
de ces ligands.La seule condition requise est que ces recepteurs declenchent chacun le même
processus d'activation des reactifs en (C):en possedant tous un site Tyrosine kinase par exemple
pour utiliser l'amplification Phospholipase C - > IP3 et expulsion du Ca++ intraliposomique,
soit en possedant tous le pouvoir d'augmenter l'AMPc come nous l'avons vu plus hautin faut
donc grouper dans ces tests d'alerte,les recepteurs appartenent au même groupe et doués des
mêmes propriétés d'activation en (C).
DOSAGE DES RECEPTEURS DE L'EPIDERMAL GROWTH FACTOR
En dehors du dosage des recepteurs circulant,il est interessant de doser la concentration des
recepteurs membranaires : produits en très grandes quantités par de nombreux oncogènes,leur
concentration par mg de proteine membranaire est multipliée par 200 à 5000 fois;passant de
0.5-5 fmoles par mg de proteine membranaire dans la cellule normale à 1000 fmoles par mg de
proteine membranaire de cellule tumorale.
En dehors du dosage des recepteurs circulant,il est interessant de doser la concentration des
recepteurs membranaires : produits en très grandes quantités par de nombreux oncogènes,leur
concentration par mg de proteine membranaire est multipliée par 200 à 5000 fois;passant de
0.5-5 fmoles par mg de proteine membranaire dans la cellule normale à 1000 fmoles par mg de
proteine membranaire de cellule tumorale.
Le principe du procédé est le même que pour le dosage de l'EGF:
Figures 3-R et 4-R: - l'EGF est fixé sur une membrane smlaquelle on depose tous les constituants de la zone (C)
decrits dans l'exemple du dosage de l'EGF: à savoir les reactifs inactivés et les liposomes
portant la proteine canal qui s'ouvre pour liberer le Ca++ intraliposomique en presence d'IP3.
Figures 3-R et 4-R: - l'EGF est fixé sur une membrane smlaquelle on depose tous les constituants de la zone (C)
decrits dans l'exemple du dosage de l'EGF: à savoir les reactifs inactivés et les liposomes
portant la proteine canal qui s'ouvre pour liberer le Ca++ intraliposomique en presence d'IP3.
L'orientation de la molecule de EGF est capitale : il est imperatif que le segment C- terminal
soit libre et orienté vers le haut,c'est à dire vers le recepteur qui arrive dans l'echantfflon.1a
fixation de 1'EGF sur cette membrane doit donc se aire par l'extremité N-terminale.
soit libre et orienté vers le haut,c'est à dire vers le recepteur qui arrive dans l'echantfflon.1a
fixation de 1'EGF sur cette membrane doit donc se aire par l'extremité N-terminale.
La presence de recepteurs dans l'echantfflon à doser est revelée par l'activation de leur site
Tyrosine kinase au contact de l'EGF fixé dans le dispositif: - > activation de la proteine Gp - > -activation de la phospholipase C - > production de 1'IP3 - > liberation du Ca++ revelé par un
chromogène.
Tyrosine kinase au contact de l'EGF fixé dans le dispositif: - > activation de la proteine Gp - > -activation de la phospholipase C - > production de 1'IP3 - > liberation du Ca++ revelé par un
chromogène.
Le dispositif: de haut en bas:
- une membrane-filtre en papier Wathman (A) sur laquelle est deposé l'echantillon à tester;
- une membrane de nitrocellulose (NC) sur laquelle est fixé l'EGF et sur laquelle est deposée
ensuite la solution de reactifs inactivés et de liposomes
- une membrane à lyse programmée (M)
- une membrane en nylon blanc supportant un spot de chromogène sensible au Ca++
Mode operatoire:: - La membrane (A) est decoupée en carrés. de 15 mm de côté dans du papier Wathman prealablement saturé par un bain de BSA à 5% in PBS pendant 2 heures puis rincé plusieurs fois dans de l'eau deionisée puis seché à 37"C sous vide.La saturation est importante pour que ce filtre ne retienne pas à tort les recepteurs à doser;; -La membrane (NC) est decoupée en carrés de 15 mm de côté dans la feuille de nitrocellulose renforcée (Ref NCR BAS 25 Schleicher et Schull ,Porosité 0.45 épaisseur 50 qui aura été prealablement trempée dans une solution sterile de BSA à 2,5% in PBS sterile puis pressée entre deux feuilles de papier sopalin pour l'amener à un etat legèrement humide.Les carrés sont alignés sur une feuille de papier Durieux no 22 propre et la face sur laquelle va être deposée la solution de EGF est notée par un repère quelconque.
- une membrane-filtre en papier Wathman (A) sur laquelle est deposé l'echantillon à tester;
- une membrane de nitrocellulose (NC) sur laquelle est fixé l'EGF et sur laquelle est deposée
ensuite la solution de reactifs inactivés et de liposomes
- une membrane à lyse programmée (M)
- une membrane en nylon blanc supportant un spot de chromogène sensible au Ca++
Mode operatoire:: - La membrane (A) est decoupée en carrés. de 15 mm de côté dans du papier Wathman prealablement saturé par un bain de BSA à 5% in PBS pendant 2 heures puis rincé plusieurs fois dans de l'eau deionisée puis seché à 37"C sous vide.La saturation est importante pour que ce filtre ne retienne pas à tort les recepteurs à doser;; -La membrane (NC) est decoupée en carrés de 15 mm de côté dans la feuille de nitrocellulose renforcée (Ref NCR BAS 25 Schleicher et Schull ,Porosité 0.45 épaisseur 50 qui aura été prealablement trempée dans une solution sterile de BSA à 2,5% in PBS sterile puis pressée entre deux feuilles de papier sopalin pour l'amener à un etat legèrement humide.Les carrés sont alignés sur une feuille de papier Durieux no 22 propre et la face sur laquelle va être deposée la solution de EGF est notée par un repère quelconque.
La solution deposée est la suivante: 15,ut de:
- N-(4-carboxycyclohexylmethyl) maleimide N-hydroxysuccinimide ester (Lab Fluka)
0,01 M / ml (fixe l'EGF à la nitrocellulose par son extremité -NH2,laissant libre
l'extremité -COOH qui doit reagir avec le recepteur)
- Epidermal Growth Factor: 1 nanomole (6,045 Ag / ml) à partir de la reference E 6135
Sigma.
- N-(4-carboxycyclohexylmethyl) maleimide N-hydroxysuccinimide ester (Lab Fluka)
0,01 M / ml (fixe l'EGF à la nitrocellulose par son extremité -NH2,laissant libre
l'extremité -COOH qui doit reagir avec le recepteur)
- Epidermal Growth Factor: 1 nanomole (6,045 Ag / ml) à partir de la reference E 6135
Sigma.
- Proteine Gp 1 yMole/ml
- PBS sterile qsp completer à 1 mi
Sechage sous vide poussé à 37"C pendant 10 heures.Pendant le sechage,on prepare la seconde solution de depose:
- 1 volume de la solution proteolipidique decrite dans l'exemple precedent: liposomes
enfermant du Ca++(1 mMole/ml) et supportant la proteine-canal sensible à l'IP3
- 1 volume de la solution de reactifs inactivés decrite dans l'exemple precedent:
ATP,GDP,Phospholipase C inactivée,Ca++ 0,1,uM/l
- Sucrose lait ecremé 5%,hexaferricyanure lmM,Zinc lmM,Manganèse lmM,Cuivre
lmM,Thimerosal lmM comme protecteurs et conservateurs stabilisant la structure
tertiaire et quaternaire de la molecule d'EGF.
- PBS sterile qsp completer à 1 mi
Sechage sous vide poussé à 37"C pendant 10 heures.Pendant le sechage,on prepare la seconde solution de depose:
- 1 volume de la solution proteolipidique decrite dans l'exemple precedent: liposomes
enfermant du Ca++(1 mMole/ml) et supportant la proteine-canal sensible à l'IP3
- 1 volume de la solution de reactifs inactivés decrite dans l'exemple precedent:
ATP,GDP,Phospholipase C inactivée,Ca++ 0,1,uM/l
- Sucrose lait ecremé 5%,hexaferricyanure lmM,Zinc lmM,Manganèse lmM,Cuivre
lmM,Thimerosal lmM comme protecteurs et conservateurs stabilisant la structure
tertiaire et quaternaire de la molecule d'EGF.
Sechage sous vide poussé à 37"C pendant 10 heures.
- La membrane (M) à lyse programmée: Sur la face opposée au repère,c'est à dire opposée à celle de la depose de la solution EGF,15 uI d'une solution d'acrylate copolymère sont deposés puis sechés egalement sous vide poussé à 370Une fois seche,cet copolymère forme un film (M) impermeable pendant 45 secondes,laissant le temps aux reactions de se faire dans la membrane NC avant d'arriver sur - La membrane (D) de revelation: carré de 15 mm de côté en nylon blanc sur lequel on depose 3 jtl de Hydroxynaphtol Blue à 2% : insensible aux 0.1,uM/I contenus dans (C) mais se colore en bleu si le Ca ++ intraliposomique (1 mM/ml) libéré en (C) arrive en (D).
Les membranes A-NC/M-D sont empilées soigneusement et placées entre les deux plaques decrites plus haut puis thermosoudage,insertion dans un sachet en aluminium opaque contenant un silicate dessicant,vide puis reinjection d'argon et soudure du sachet.Conservation de preference à 4"C.
CONTROLE:
Des fragments provenant de la biopsie d'une tumeur qui s'est revelée benigne sont placés dans un tube 0,tandis que ceux provenant de tumeurs revelées malignes node positive (ganglions satellites) sont placés dans un tube M; ils sont ensuite traités separément par la solution tampon suivante::
- 1 mM EDTA (Chelateur pour eliminer toute trace de Ca++ risquant de fausser le
dosage) - 0.5 mL DTT - 10 mM sodium molybdate - 10% glycerol - 1 mM PMFS - 10
UG/ml de leupeptine 2,5 mM MgC12 - in TRIS-HC1 10 mM ,pH 7.4 puis homogeneisée et centrifugée (100.000 G, 1 heure, à 4"C)
Le culot de chaque tube est resuspendu separément dans 2 volumes de la même solutiontampon et centrifugé (1500 G,10 minutes à 4"C) : le culot obtenu correspond alors au materiel nucleaire,le surnageant est de nouveau centrifugé (25.000 G,30 minutes,à 4"C) : ce dernier culot represente la fraction membranaire des cellules;elle contient 500 à 1000 g de proteines.Elle est homogeneisée dans 100 1 de tampon HEPES 20 mM + PMFS 1 mM.
Des fragments provenant de la biopsie d'une tumeur qui s'est revelée benigne sont placés dans un tube 0,tandis que ceux provenant de tumeurs revelées malignes node positive (ganglions satellites) sont placés dans un tube M; ils sont ensuite traités separément par la solution tampon suivante::
- 1 mM EDTA (Chelateur pour eliminer toute trace de Ca++ risquant de fausser le
dosage) - 0.5 mL DTT - 10 mM sodium molybdate - 10% glycerol - 1 mM PMFS - 10
UG/ml de leupeptine 2,5 mM MgC12 - in TRIS-HC1 10 mM ,pH 7.4 puis homogeneisée et centrifugée (100.000 G, 1 heure, à 4"C)
Le culot de chaque tube est resuspendu separément dans 2 volumes de la même solutiontampon et centrifugé (1500 G,10 minutes à 4"C) : le culot obtenu correspond alors au materiel nucleaire,le surnageant est de nouveau centrifugé (25.000 G,30 minutes,à 4"C) : ce dernier culot represente la fraction membranaire des cellules;elle contient 500 à 1000 g de proteines.Elle est homogeneisée dans 100 1 de tampon HEPES 20 mM + PMFS 1 mM.
50 ul du tube 0 (membranes de cellules benignes) sont deposés dans l'orifice du dispositif decrit ci-dessus et s'ecoulent lentement et completement au bout d'une rninute.Le dispositif est ensuite retourné: la membrane (D) est mouillée mais incolore : le taux de recepteur dans cet echantillon est trop bas (inferieur à 1 fmole de recepteur / mg de proteine membranaire).
Confirmation du resultat: les 50 L restant du tube 0 sont incubés dans 1 nM d'125I - EGF (marquage EGF par la technique de Hunter et Greenwood à la chloramine T : la radioactivité est de 200 Ci/Mg d'EGF) pendant 1 heure à 250Ce melange est ensuite deposé sur un filtre
Wathman GF/C en fibre de verre et lavé plusieurs fois avec 5 ml de BSA 0.1% in PBS glacé pH 7.2: la radioactivité retenue dans le filtre est ensuite comptée: elle sera alors exprimée en fmoles d'EGF lié / mg de proteine membranaire: dans le cas present du tube 0,on trouve 0,175 fmoles d'EGF / mg de proteine membranaire.
Wathman GF/C en fibre de verre et lavé plusieurs fois avec 5 ml de BSA 0.1% in PBS glacé pH 7.2: la radioactivité retenue dans le filtre est ensuite comptée: elle sera alors exprimée en fmoles d'EGF lié / mg de proteine membranaire: dans le cas present du tube 0,on trouve 0,175 fmoles d'EGF / mg de proteine membranaire.
50 ul du tube (M)(membranes de cellules malignes) sont deposés dans l'orifice d'un autre dispositif qui est retourné après une minute : le spot central de la membrane (D) s'est coloré en bleu.
Confirmation: les 50 1 restant du tube M sont testés de la même façon que le test de confirmation precedent: la radioactivité comptée sur le filtre GF/C montre une concentration membranaire de recepteurs de 12 fmoles / mg de proteine,soit environ 100 fois plus que dans les cellules benignes.
Au cours de cette operation de contrôle de qualité,il a été decidé de doser parallèlement par la methode radioactive sur filtre GF/C Wathman le taux de recepteurs à l'oestrogène (ER: ooestrogène recepteur) : le taux de ER est effondré dans les cellules malignes tandis que les cellules benignes contiennent un taux normal d'ER.Ce qui fait que la combinaison des deux dosages (recepteurs EGF + recepteurs ER) constitue un element de pronostic de grande valeur : les cellules malignes encore faibles en recepteurs à l'EGF et presentant encore des recepteurs à l'oestroène sont en faveur d'un bon pronostic et le traitement sera essentiellement chirurgical.Tandis qu'un excès de recepteurs EGF et la disparition de recepteurs oestrogène necessitent des traitements adjuvants de tamoxifen à 20 mgljour pendant au moins 2 ans,en plus de la chirurgie et de la chimiotherapie instaurée cas par cas.
DOSAGE DE PLUSIEURS RECEPTEURS AVEC LA MEME GOUTTE D'ECHANTILLON
PROPOSITION D'UN MULTITEST-RECEPTEURS
Dans une etape de Pré-screening (ou etape d' alerte ),il est tout à fait possible de doser un excès de recepteurs de facteurs de croissance de mauvais pronostic: EGF,TGF - et ss,PDGF (Platelet Derivated Growth Factor - facteur de croissance derivé des plaquettes) à l'aide de la même goutte d'echantillon,en associant dans le dispositif les quatre facteurs concernés: si au moins un des recepteurs est en excès,le test se colore et il faudra alors proceder à une etape de screening (ou etape d'orientation) en faisant des tests specifiques pour chacun des recepteurs et deceler lequel est en excès.
PROPOSITION D'UN MULTITEST-RECEPTEURS
Dans une etape de Pré-screening (ou etape d' alerte ),il est tout à fait possible de doser un excès de recepteurs de facteurs de croissance de mauvais pronostic: EGF,TGF - et ss,PDGF (Platelet Derivated Growth Factor - facteur de croissance derivé des plaquettes) à l'aide de la même goutte d'echantillon,en associant dans le dispositif les quatre facteurs concernés: si au moins un des recepteurs est en excès,le test se colore et il faudra alors proceder à une etape de screening (ou etape d'orientation) en faisant des tests specifiques pour chacun des recepteurs et deceler lequel est en excès.
DOSAGE SEMI-QUANTITATIF D'UN RECEPTEUR
Selon le même principe du dosage semi-quantitatif de l'EGF decrit plus haut,une membrane (BO) supportant des anticorps monoclonaux de haute specificité en quantité precise pour fixer une certaine quantité seulement de recepteur (ex pour le recepteur à l'EGF: 1 fignole / mg de proteine membranaire.La normale etant de 0.5 - 1 fmole/mg de prot.).Si la quantité de recepteurs dans l'echantillon est superieure à cette limite (1000 fmoles dans certains carcinomes du sein),le test se colore.
Selon le même principe du dosage semi-quantitatif de l'EGF decrit plus haut,une membrane (BO) supportant des anticorps monoclonaux de haute specificité en quantité precise pour fixer une certaine quantité seulement de recepteur (ex pour le recepteur à l'EGF: 1 fignole / mg de proteine membranaire.La normale etant de 0.5 - 1 fmole/mg de prot.).Si la quantité de recepteurs dans l'echantillon est superieure à cette limite (1000 fmoles dans certains carcinomes du sein),le test se colore.
Si ce seuil n'est pas depassé dans l'echantillon,les recepteurs sont stoppés en (B0) et il n'y a pas de reactions en (C).
DOSAGE DE L'EXCES D'UN RECEPTEUR ET DE L'EFFONDREMENT D'UN AUTRE
PROPOSITION D'UN TEST PRONOSTIC
De nombreux cancers se distinguent par la proliferation de certains recepteurs accompagnant l'effondrement d'autres recepteurs.
PROPOSITION D'UN TEST PRONOSTIC
De nombreux cancers se distinguent par la proliferation de certains recepteurs accompagnant l'effondrement d'autres recepteurs.
Exemple : le cas des recepteurs à l'oestrogène cité à la fin du chapitre sur le dosage des recepteurs de l'EGF.La proliferation de ces derniers,accompgnée de l'effondrement des recepteurs à l'oestrogène est d'un mauvais pronostic.Cela signe la presence certaine de metastases dans les cancers du sein (classés T1,T2,N0/N1 et Mo(UICC 1987) en fonction du stade,du nombre de ganglions (nodes en anglais) et des metastases).(Sainsbury et al. EGF-Receptors and Oestrogen receptors in humain breast cancer.Lancet,1985 :364-366).
Le dispositif objet de la presente invention consiste donc à associer deux tests differents sur la même plaque,necessitant alors deux gouttes d'echantillon (une pour chaque puits): 1 - un test de dosage semi-quantitatif des recepteurs de l'EGF : appelé EGFR. (EGFR+ s'il se colore. EGFR- s'il ne se colore pas.) 2 - un test de dosage semi-quantitatif des recepteurs à l'oestrogène : appelé ER (ER+ : coloration. ER-: absence de coloration)
Plusieurs cas se presentent:
- EGFR- ER+ : Excellent pronostic: pas de recepteurs EGF en excès et recepteurs oestrogènes en quantité normale.Stade debutant probable.
Plusieurs cas se presentent:
- EGFR- ER+ : Excellent pronostic: pas de recepteurs EGF en excès et recepteurs oestrogènes en quantité normale.Stade debutant probable.
- EGFR+ ER+ : Le pronostic est encore bon malgré l'augmentation de recepteurs de I'EGF: stade evolutif moyen.
- EGFR+ ER- : Mauvais pronostic.Les recepteurs à l'Oestrogène ont disparu.Le rôle protecteur de l'oestrogène ne peut plus s'exercer.
Selon certains auteurs,c'est l'effondrement de l'hormone oestrogène à la menopause,qui serait responsable de la disparition des recepteurs ER,ce qui predisposerait au cancer du sein;(Peyrat et al.Recepteurs de l'EGF dans les cancers du sein humain et relations avec les recepteurs hormonaux. Ann.Endocrinol.1984,45 :412-413).
Les recepteurs à la progesterone (PR) jouent egalement un rôle important et un triple test EGFR
ER et PR searit extrêmement utile en prescreening ou en depistage de masse.
ER et PR searit extrêmement utile en prescreening ou en depistage de masse.
PROPOSITION D'UN MULTITEST-RECEPTEURS SEMl-OUANTfTATw
En associant en (B0) des anticorps monoclonaux specifiques de l'association de recepteurs recherchés,à un taux calculé à l'avance pour fixer uniquement la quantité de recepteurs estimée normale en associant à l'etage inferieur (où va se produire la liaison recepteur recherchéligand deposé dans le dispositif),l'association de ligands correspondant aux recepteurs recherchés.
En associant en (B0) des anticorps monoclonaux specifiques de l'association de recepteurs recherchés,à un taux calculé à l'avance pour fixer uniquement la quantité de recepteurs estimée normale en associant à l'etage inferieur (où va se produire la liaison recepteur recherchéligand deposé dans le dispositif),l'association de ligands correspondant aux recepteurs recherchés.
Si au moins un des recepteurs recherchés est superieure à la normale,il traverse la membrane (B0) et vient provoquer la coloration du spot en (D).A partir de ce test d'alerte,il faudra alors faire des tests specifiques de chaque recepteur pour orienter le diagnostic.
LISTE NON EXHAUSTIVE DES DOSAGES POSSIBLES DE LIGANDS QU DE LEURS
RECEPTEURS PAR LE PROCÉDÉ IDENTIIOUE A CELUI DE L'EGF
En changeant simplement la molecule de recepteur au niveau de la membrane (B),il est possible de doser des ligands qui provoquent exactement la même cascade de reactions au contact de leur recepteur respectif: activation Proteine Gp puis Phospholipase C et expulsion massive de
Ca++ dans (C) puis revelation colorée en (D).I1 s'agit de: -I'INSULSNE
Polypeptide de PM 6000 Da (comme l'EGF 6045 Da),elle joue un rôle capital dans le metabolisme glucidique et lipidique.Mais elle presente aussi des propriétés de facteur de croissance Elle se presente sous deux chaines A (21 acides aminés) et B (30 ac am).
RECEPTEURS PAR LE PROCÉDÉ IDENTIIOUE A CELUI DE L'EGF
En changeant simplement la molecule de recepteur au niveau de la membrane (B),il est possible de doser des ligands qui provoquent exactement la même cascade de reactions au contact de leur recepteur respectif: activation Proteine Gp puis Phospholipase C et expulsion massive de
Ca++ dans (C) puis revelation colorée en (D).I1 s'agit de: -I'INSULSNE
Polypeptide de PM 6000 Da (comme l'EGF 6045 Da),elle joue un rôle capital dans le metabolisme glucidique et lipidique.Mais elle presente aussi des propriétés de facteur de croissance Elle se presente sous deux chaines A (21 acides aminés) et B (30 ac am).
Son recepteur a pu être solubilisé et purifié à partir de membranes de foie et d'adipocytes.ll comprend deux sous-unités - extracellulaires (de 719 residus d'acides aminés chacune),et deux sous-unités ss transmembranaires et intracytoplasmiques (de 620 residus d'acides aminés chacune) porteurs de sites tyrosine kinase.
Les extremités N-terminales sont extracellulaires comme pour l'EGF et supportent les sites de glycosylation (liaison à l'insuline)
Ebina et al. (Cell ,259 : 11083-11092,1985) ont cloné l'ADNc qui est tout à fait accessible en banque genomique pour une production par genie genetique.
Ebina et al. (Cell ,259 : 11083-11092,1985) ont cloné l'ADNc qui est tout à fait accessible en banque genomique pour une production par genie genetique.
- 1' IGF4 ET Il: INSULINE-LIKE GROWTH FACTOR (ou SOMATOMEDINES!
PM de 7500 Da - une seule chaine polypeptidique presentant de grandes similitudes avec la pro-insuline humaine.Le gène de l'IGF-1 se trouve sur le bras court du chromosome 12;tandis que celui de l'IGF-2 se trouve sur le bras court du chromosome 11,tout près du gène de la pré-pro-insuline (presurseur inactif de l'insuline).
PM de 7500 Da - une seule chaine polypeptidique presentant de grandes similitudes avec la pro-insuline humaine.Le gène de l'IGF-1 se trouve sur le bras court du chromosome 12;tandis que celui de l'IGF-2 se trouve sur le bras court du chromosome 11,tout près du gène de la pré-pro-insuline (presurseur inactif de l'insuline).
Les IGF ont acquis une grande importance depuis que Sporn et Roberts (Autocrine growth factors and cancer - Nature (London) :313,745-747 - 1985) ont decouvert que des cellules cancereuses du sein produisaient l'IGF (et d'autres facteurs de croissance) en reponse à la stimulation oestrogenique,tandis que les cellules cancereuses de la prostate produisaient l'IGF en reponse aux androgènes.Alexander et Currie (Concommitant synthesis of growth factors and their receptors : an aspect of malignant transformation. Biochem.Pharmacol.
33,941-943 - 1984) a montré que les cellules cancereuses,en reponse aux hormones steroïdes,produisaient de grandes quantités de recepteurs à ces facteurs de croissance,en même temps que les dits facteurs de croissance (incluant l'IGF),entrainant un veritable cycle de croissance auto-entretenu.
L'hormone de croissance (GH) contrôle l'expression du gène de l'IGF,surtout dans le foie.Ce qui explique l'effondrement du taux d'IGF dans la deficience en GH,et l'excès d'IGF dans l'acromegalie (maladie due à l'hypersecretion d'hormone de croissance par l'hypophyse).Ceci a été verifié en diminuant le taux de GH par paliers : le taux d'IGF suit exactement les mêmes paliers.De plus,l'âge et l'etape de croissance pubertaire favorisent un taux elevé d'IGF.(Pic serique surtout chez les filles).Le mecanisme est indirect: les steroides (comme la testosterone) potentiaiisent la secretion de GH pituitaire (induite par la stimulation GH-RH) et donc de l'IGF.
Les cellules de Leydig traitées pendant 48 heures par l'IGF-1,repondent à la LH en secretant de la testosterone: elles sont devenues adultes ,l'IGF ayant eu une action de maturation sur elles.
L'hypothyroïdisme montre des taux d'IGF bas car l'hormone thyroïalenne moaule la secretion deGH.
Le staut nutritionnel agit sur le taux d'IGF: dans la malnutrition proteinique et energetique le taux d'IGF-1 est bas mais retourne à la normale avec une nutrition adequate.
Ce qui fait de l'IGF un excellent marqueur des interactions hormonales, de la maturation de l'organisme et du statut nutritionnel.(Clemmons et al. Somatomedin-C in blood. Clin. Endocrinol. Metab. 13 : 113-143 - 1984)
A la lumière de ces interactions,plusieurs facteurs sont susceptibles d'agir avec l'IGF-1: - le FGF : FIBROBLAST GROWTH FACTOR qui est un puissant mitogène et le - TGF-J3 (voir plus loin)
La question primordiale à l'heure actuele est de savoir comment ces trois facteurs agissent ensemble pour contrôler la differentiation et la croissance cellulaire.
A la lumière de ces interactions,plusieurs facteurs sont susceptibles d'agir avec l'IGF-1: - le FGF : FIBROBLAST GROWTH FACTOR qui est un puissant mitogène et le - TGF-J3 (voir plus loin)
La question primordiale à l'heure actuele est de savoir comment ces trois facteurs agissent ensemble pour contrôler la differentiation et la croissance cellulaire.
Leur dosage en tous les cas permettra de depister tôt un desordre cellulaire.
- le PDGF : PLATELET DERWATED GROWTH FACTOR
purifié à partir de plaquettes humaines par Antoniadès et al (Proc.Nat.Acad.Sci. 76: 1809-1813 - 1979),il est composé de deux chaines peptidiques,totalise un PM de 30 KDa.Il en existe trois types : le PDGF AA secrété par des cellules tumorales,le PDGF AB purifié à partir des plaquettes humaines,le PDGF BB purifié des palquettes de porc mais aussi secrété par les cellules rendues malignes par le SSV (Simian Sarcoma Virus).
purifié à partir de plaquettes humaines par Antoniadès et al (Proc.Nat.Acad.Sci. 76: 1809-1813 - 1979),il est composé de deux chaines peptidiques,totalise un PM de 30 KDa.Il en existe trois types : le PDGF AA secrété par des cellules tumorales,le PDGF AB purifié à partir des plaquettes humaines,le PDGF BB purifié des palquettes de porc mais aussi secrété par les cellules rendues malignes par le SSV (Simian Sarcoma Virus).
ll existe deux types de recepteur du PDGF: - le recepteur B est un carbohydrate de 180 KDa dont la partie extracellulaire se compose de cinq domaines immunoglobulin-like,la sequence transmembranaire est de 25 acides aminés et la partie intracellulaire contient le domaine tyrosine kinase.n ne lie que le PDGF BB.Sa structure est etonnement similaire à celle du recepteur du CSF-1 (colony stimulating factor .1) et de la proteine c-kit.Le gène humain de ce recepteur est localisé sur le chromosome 5 tout près du gène du recepteur du CSF-1 (Roberts et al.Cell, 55: 655-661 - 1988).L'ADNc a été cloné avec succès par Yarden et al (Nature, 323 : 226-232- 1986) - le recepteur A,170 KDa,lie les trois types de PDGF et a été rencontré entre autres sur les cellules de glioma U - 343 MGa 31L qui contiennent un ARNm-transcript s'hybridant avec le
ADNc du recepteur PDGF de type B.Le gène du recepteur A se trouve sur le chromosome 4 et la sequence complete a été caracterisée à partir de l'ADNc de fibroblastes humains en 1989 par
Claesson-Welsch et al. ( J.Biol.Chem. 264: 1742-1747 ).
ADNc du recepteur PDGF de type B.Le gène du recepteur A se trouve sur le chromosome 4 et la sequence complete a été caracterisée à partir de l'ADNc de fibroblastes humains en 1989 par
Claesson-Welsch et al. ( J.Biol.Chem. 264: 1742-1747 ).
Le PDGF est secrété par les cellules transformées par le SSVirus et ont un rôle de developpement du stroma et des vaisseaux dans les cancers.Son ARNm est abondant dans les cellules endotheliales du glioblastome multiforme.(Hermansson et al.Proc.Nat.Acad.Sci.USA No 85: 7748-7752- 1988).
n est aussi secrété par des cellules non cancereuses dans les processus inflammatoires,dans les cicatrisations de blessures,dans les processus degeneratifs (fibrose pulmonaire,desordres proliferatifs de l'oeil au niveau du corps vitré et de la retine) et dans le developpement foetal.
le TGF-a et 13 : TRANSFORMING GROWTH FACTOR
C'est un homodimère de 112 acides aminés chacun,PM 25 KDa et son gène a été cloné par
Derynck et al.en 1985 (Nature 316,701-705).
C'est un homodimère de 112 acides aminés chacun,PM 25 KDa et son gène a été cloné par
Derynck et al.en 1985 (Nature 316,701-705).
Le TGF- se lie au recepteur de l'EGF ce qui opermet de le doser avec le dispositif decrit en exemple plus haut pour le dosage de l'EGF.
le TGF-ss a son propre recepteur sur de nombreuses cellules (hepatocytes,lymphocytes,etc) et son action est complexe: inhibe la proliferation dans certaines conditions et la stimule dans d'autres : il inhibe la croissance des lymphocyytes B et T,des hepatocytes et de quelques lignées de cellules tumorales humaines mais cet effet s'inverse en proliferation dès que ces cellules sont infectées par le virus d'Epstein-Barr.
A l'opposé,le TGF-B stimule la proliferation des cellules NRK-49F mais inhibe la proliferation de ces mêmes cellules quand elles sont infectées par le Kirsten sarcoma virus (porteur du gène
K-ras).
K-ras).
La concentration joue aussi un rôle important : Besnard et al. (C.R.Acad.Sci.Paris in press.) ont montré que la croissance des oligodendrocytes de rat est stimulée par le TGF-ss en presence d'EGF à la concentration inferieure à 0.2 ng/ml mais est inhibée à fortes doses.Morera et al.
(J.Steroid.Bioch. 30,443447) ont montré que le TGF-B à dose inferieure à 0.2 ng/mi augmente la production de tesosterone par les cellules de Leydig mais l'inhibe à fortes doses.
D'où l'importance du dosage du TGF.
Enfin le TGF-ss bloque l'activité des cellules Natural Killer,des lymphocytes B et T ce qui conduit à une diminution de l'immunité.
Action du TGF-B :
n induit l'expression de quelques proto-oncogènes : c-sis,c-fos,c-myc ainsi que son propre gène (autoregulation)
n augmente l'activité de promoteurs conduisant à l'augmentation de la transcription du gène du collagène dans les reactions stromales favorisant le developpement de tumeurs solides,bien que le collagène procure une barrière basale contre l'envahissement metastatique.
n induit l'expression de quelques proto-oncogènes : c-sis,c-fos,c-myc ainsi que son propre gène (autoregulation)
n augmente l'activité de promoteurs conduisant à l'augmentation de la transcription du gène du collagène dans les reactions stromales favorisant le developpement de tumeurs solides,bien que le collagène procure une barrière basale contre l'envahissement metastatique.
Le TGF-ss est donc un constituant de cellules normales mais dans certaines conditions (modification des recepteurs et desordres cellulaires par exemple) il devient un agent pathogène.
L' INlsERLEUKlNE 4 auparavant appelée BSF-1 ou BCGF-1-ou BCDF-1 ou BCDFJ en fonction de ses cibles (voir plus loin)
PM 20 KDa,elle est secretée par les lymphocytes T activés.
PM 20 KDa,elle est secretée par les lymphocytes T activés.
Elle est classée dans ce groupe de facteurs de croissance dont le recepteur a une activité tyrosine-kinase,depuis les travaux de Cambier et Ransom (Ann.Rev.Immunol. 5: 175-199, 1987)
C'est un facteur de croissance pour certains lymphocytes T (effet TCG FII),les lymphocytcs B (BSF-1),les mastocytes conjonctifs en synergie avec IL3 (MCGFII) mais c'est aussi un facteur de differenciation pour les lymphocytes B (BCDFgamma et BCDF
L'ILA peut s'averer être un facteur de competence ou de progression selon l'etat de la cellule dans le cycle cellulaire: sur un lymphocyte B quiescent,l'I14 seule,est capable d'induire ds modifications telles que l'augmentation de la taille,la synthèse d'ARNm,l'expression des molecules de classe II du complexe majeur d'histocompatibilité et l'augmentation de la recep tivité cellulaire au signal antigenique.
C'est un facteur de croissance pour certains lymphocytes T (effet TCG FII),les lymphocytcs B (BSF-1),les mastocytes conjonctifs en synergie avec IL3 (MCGFII) mais c'est aussi un facteur de differenciation pour les lymphocytes B (BCDFgamma et BCDF
L'ILA peut s'averer être un facteur de competence ou de progression selon l'etat de la cellule dans le cycle cellulaire: sur un lymphocyte B quiescent,l'I14 seule,est capable d'induire ds modifications telles que l'augmentation de la taille,la synthèse d'ARNm,l'expression des molecules de classe II du complexe majeur d'histocompatibilité et l'augmentation de la recep tivité cellulaire au signal antigenique.
Mais si une cellule a dejà reçu ce signal antigenique (donc au stade G1),l'IL4 va alors jouer un rôle de cofacteur de progression classique.Ces effets de l'IL4 sur la competence ou la progression dans le cycle cellulaire du lymphocyte B se retrouvent egalement pour le lymphocytes T.
Un deuxième facteur critique est representé par la dose d'interleukine.En effet,l'induction de competence requiert des doses d'IL4 beaucoup plus faibles que ne le necessite la progression.
L'effet cellulaire de l'IL4 sur le lymphocyte B est l'induction de synthèse du recepteur pour l'IgE de faible affinité (Fc RII ou CD23) ainsi que la production d'anticorps (en combinaison avec d'autres interleukines).Chez la souris,l'IL4 induit la production de la sous-classe IgG1 ainsi que les IgE et IgA mais inhibe la production de la sous-classe IgG2 : Paul et Ohara (Ann.Rev.lmmunol. 5 : 65-84) ont montré que 1XATL4 induit l'orientation isotypique,c'est à dire la selection de clones specifiques d'un type d'immunoglobuline.
- L'INTERLEUNNE 3
Elle trouve sa place-dans ce groupe depuis les travaux de Isfort et al. (Proc.NatlAcad.Sci.USA 85,7982-7986 - 1988) qui a mis en evidence son recepteur de 140 KDa possedant une activité specifique Tyrosine Kinase intrinsèque.L'IL-3 est un facteur de croissance hematopoïetique qui assure la survie et la proliferation de lymphocytes T et B dans les cultures in vitro ou in vivo dans la moelle de souris irradiées,surtout en association avec d'autres facteurs de croissance (GM-CSF Granular macrophage colony stimulating factor,CSF-1 colony stimulating factor =
M-CSF macrophage colony stimulating factor qui favorise les macrophages,G-CSF Granulocyte colony stimulating factor qui privilegie les neutrophiles): l'injection à des primates de
GM-CSF + IL-3 provoque une augmentation de lymphocytes et de toutes les classes de polynucleaires beaucoup plus forte qu'avec l'injection de GM-CSF seule.L'IL-3 est donc un facteur de lymphopoièse qui maintient un haut niveau intracellulaire de glycolyse,de production de lactate,d'hexose-transport et d'ATP,puis de synthèse de DNA.
Elle trouve sa place-dans ce groupe depuis les travaux de Isfort et al. (Proc.NatlAcad.Sci.USA 85,7982-7986 - 1988) qui a mis en evidence son recepteur de 140 KDa possedant une activité specifique Tyrosine Kinase intrinsèque.L'IL-3 est un facteur de croissance hematopoïetique qui assure la survie et la proliferation de lymphocytes T et B dans les cultures in vitro ou in vivo dans la moelle de souris irradiées,surtout en association avec d'autres facteurs de croissance (GM-CSF Granular macrophage colony stimulating factor,CSF-1 colony stimulating factor =
M-CSF macrophage colony stimulating factor qui favorise les macrophages,G-CSF Granulocyte colony stimulating factor qui privilegie les neutrophiles): l'injection à des primates de
GM-CSF + IL-3 provoque une augmentation de lymphocytes et de toutes les classes de polynucleaires beaucoup plus forte qu'avec l'injection de GM-CSF seule.L'IL-3 est donc un facteur de lymphopoièse qui maintient un haut niveau intracellulaire de glycolyse,de production de lactate,d'hexose-transport et d'ATP,puis de synthèse de DNA.
L'IL-3 est une glycoproteine de 20-30 KDa dont le taux est très augmenté quand le lymphocyte
T est stimulé par un mitogène : c'est le cas des cellules WEHI-3B de la leucemie myelomonocytaire ou EL-4 ou LBRM-33 des Ieucémies à cellules T.Mais à l'opposé,les propriétés de l'IL3 ont permis d'augmenter le potentiel cytotoxique des monocytes (traités par l'lL-3,ces derniers ont vu augmenter leur capacité de detruire les cellules du fibrsarcome WEHI-164)
Le recepteur est identique à celui decrit plus loin en detail dans le chapitre des recepteurs de 1'IL-2 (heterodimère p55 + p70) mais avec une activité tyrosine kinase et non par activation de l'adenylate cyclase comme pour l'IL-2.
T est stimulé par un mitogène : c'est le cas des cellules WEHI-3B de la leucemie myelomonocytaire ou EL-4 ou LBRM-33 des Ieucémies à cellules T.Mais à l'opposé,les propriétés de l'IL3 ont permis d'augmenter le potentiel cytotoxique des monocytes (traités par l'lL-3,ces derniers ont vu augmenter leur capacité de detruire les cellules du fibrsarcome WEHI-164)
Le recepteur est identique à celui decrit plus loin en detail dans le chapitre des recepteurs de 1'IL-2 (heterodimère p55 + p70) mais avec une activité tyrosine kinase et non par activation de l'adenylate cyclase comme pour l'IL-2.
DOSAGE DES ACIDES AMINÉS NEURO-EXCITATEURS OU DE LEURS RECEPTEURS
Chez les vertebrés,les acides aminés excitateurs,principalement le L-Glutamate et le L
Aspartate,semblent être les deux principaux neuromediateurs excitateurs au niveau du système nerveux central.
Chez les vertebrés,les acides aminés excitateurs,principalement le L-Glutamate et le L
Aspartate,semblent être les deux principaux neuromediateurs excitateurs au niveau du système nerveux central.
Leurs recepteurs ont connu recemment un grand interêt du fait de leur rôle supposé dans les phenomènes de LTP ( long term potentiation ),d'hypoxie et des crises epileptiformes.Ces recepteurs ne peuvent être activés qu'en presence de magnesium et de glycine (assurant leur regulation allosterique en facilitant les transitions induites par les acides aminés excitateurs).Cette-potentialisation est comparable au phenomène de potentialisation des reponses au GABA (Acide Gamma Amino-Butyrique) par les benzodiazepines.
Sladecezek et al.(A new mechanism for glutamate receptor action : phosphoinositide hydrolysis.Trends Neurol.Sci. 11 :545-549- 1988) ont montré que le contact des acides aminés excitateurs avec leurs recepteurs declenchaient la même cascade de reactions que l'EGF en aboutissant à l'activation de la phospholipase C et la liberation de Ca++ intracellulaire.
La même equipe a permis de definir la structure complète des recepteurs concernés qui ont pu être clonés et sont disponibles.
Ceci permet de doser ces acides aminés qui ne sont presents dans le liquide cephalo-rachidien qu'à des concentrations micromolaires mais surtout ouvre la voie d'exploration des pathologies liées soit à une intense activation des recepteurs des acides aminés excitateurs (dans l'epilepsie) ou peut-être d'autres mediateurs inconnus ce jour,soit au contraire liées à un effondrement du nombre de recepteurs comme dans le Parkinson au niveau du Nigrum Striatum ou dans la
Maladie d'Alzheimer.
Maladie d'Alzheimer.
Le dispositif et le procédé sont identiques à ceux decrits pour le dosage de l'EGF ou de son recepteur.Il faut simplement tenir compte de l'importance de la glycine comme co-agoniste et l'associer (5,amole/1) aux divers reactifs decrits dans la zone (C).Le magnesium,très important ici,figure dejà en bonne place dans le dispositif de l'EGF.
Pour le dosage des ligands ou leurs recepteurs utilisant comme voie de transduction cytoplasmique,celle de l'activation de la phospholipase C avec ouverture de canaux calciques,iI existe sans doute de très nombreux ligands et recepteurs à decouvrir et qui utilisent cette voie.La liste et les exemples decrits ne sont donc pas exhaustifs ni limmitants; ces derniers n'ont été exposés ici qu'à titre d'exemples d'illustration du dispositif et du procédé faisant l'objet de la presente invention.
Une autre voie,tout aussi interessante,est celle qui aboutit à une très nette augmentation de l'AMPc (Adenosine Monophosphate cyclique) dès le contact du ligand avec son recepteur.C'est l'objet du chapitre suivant.
DOSAGE DE LIGANDS OU DE LEURS RECEPTEURS METIT;T U14 JEU UNE
AUGMENTATION TNTRACYTOPLASMTOUE DE L'AMP CYCLIQUE
Les recepteurs sont depourvus d'activité tyrosine kinase et possèdent une seule helice transmembranaire.Ce sont les fameux recepteurs de l'extremité Fc des immunoglobulines
A,E,G et M,les recepteurs des interleukine 1,2 et 6,le recepteur d'antigène des lymphocytes
T,les molecules de classe I et II du complexe majeur d'histocompatibilité (système HLA),etc..
AUGMENTATION TNTRACYTOPLASMTOUE DE L'AMP CYCLIQUE
Les recepteurs sont depourvus d'activité tyrosine kinase et possèdent une seule helice transmembranaire.Ce sont les fameux recepteurs de l'extremité Fc des immunoglobulines
A,E,G et M,les recepteurs des interleukine 1,2 et 6,le recepteur d'antigène des lymphocytes
T,les molecules de classe I et II du complexe majeur d'histocompatibilité (système HLA),etc..
Des proteines membranaires appartiennent à cette famille de recepteurs mais elles sont extrinsèques,ancrées à des glycophospholipides des membranes cellulaires,sans activité intracytoplasmique: c'est le cas des marqueurs tumoraux dont le plus connu est le CEA (carcinoembryonic antigen) qui comprend sept domaines pour 668 acides aminés (Oikawa et al.:The
CEA contains multiple immuno-globulin-like domains. Biochem. Biophys.Res.Commun. 144: 634-642- 1987)
Description du procédé: Figures 5 et 6.
CEA contains multiple immuno-globulin-like domains. Biochem. Biophys.Res.Commun. 144: 634-642- 1987)
Description du procédé: Figures 5 et 6.
Le contact ligand-recepteur entraine des changements electriques et conformationnels des recepteurs qui agissent alors sur la proteine G exactement comme decrit dans le chapitre precedent: la sous-unité ~ de la proteine G quitte les autres sous unités (13 et gamma) et voit son groupement GDP se phosphoryler en GTP à partir de l'ATP present dans le cytoplasme.Le complexe sous-unité G- + GTP n'active plus comme nous l'avons vu precedemment une phospholipase C mais active une enzyme ancrée sous la membrane plasmique: l'adenylatecyclase qui va transformer I'ATP en AMP cyclique (AMPc).Ce dernier active une phosphorylase kinase qui,en presence d'ATP,de Ca++ et de Mg++,transforme la phosphorylase b (inactive) en phosphorylase a active sur le glycogène qui s'hydrolyse en Glucose 1 Phosphate et D
Glucose.Ce dernier,en presence de Glucose-oxydase,fournit du peroxyde d'hydrogène (H202) à la peroxydase liberant des ions H+ qui viennent colorer en CD) en bleu le 3-3'-5-5'-Tetra Methyl
Benzidine.A chacune de ces etapes il y a une amplification d'environ 1000 fois / seconde. (1 molecule de ligand active 1000 molecules de Proteines G par seconde,etc..1 molecule de
Phosphorylase a hydrolyse 1000 molecules de glycogène par seconde,etc..)
Le dispositif::
Le recepteur et l'adenylate cyclase sont inserés dans une membrane (B) proteolipidique comme decrit pour l'EGF,etalée sur un film de proteine G + GDP supporté par une membrane impermeable à lyse programmée servant de support à cette membrane proteolipidique.
Glucose.Ce dernier,en presence de Glucose-oxydase,fournit du peroxyde d'hydrogène (H202) à la peroxydase liberant des ions H+ qui viennent colorer en CD) en bleu le 3-3'-5-5'-Tetra Methyl
Benzidine.A chacune de ces etapes il y a une amplification d'environ 1000 fois / seconde. (1 molecule de ligand active 1000 molecules de Proteines G par seconde,etc..1 molecule de
Phosphorylase a hydrolyse 1000 molecules de glycogène par seconde,etc..)
Le dispositif::
Le recepteur et l'adenylate cyclase sont inserés dans une membrane (B) proteolipidique comme decrit pour l'EGF,etalée sur un film de proteine G + GDP supporté par une membrane impermeable à lyse programmée servant de support à cette membrane proteolipidique.
La zone (C) contient des reactifs inactifs (decrits dans le procédé et plus loin en detail dans les exemples) deposés sur une membrane en papier dont la face inferieure est recouverte d'un film impermeable à lyse programmée.
La zone de revelation CD) est en nylon blanc supportant un spot de chromogène et divers reactifs complementaires pour la coloration.
EXEMPLE: DOSAGE DE L'INTERLEUKINE 1
L'interleukine 1 est une hormone polypeptidique produite notemment par les macrophages.Elle stimule la croissance et la proliferation de nombreuses cellules du système immunitaire et existe sous deux formes : l'IL1- (localisation membranaire) et l'IL1-ss (qui est la forme majeure d'IL1 produite et secrétée par les phagocytes monoclunéés) issues de deux gènes distincts mais partageant le même recepteur: en effet,le sixième exon code la partie homologue des deux formes < et B,qui comporte precisément le site de fixation.Le PM est de 17,5 KDa.
L'interleukine 1 est une hormone polypeptidique produite notemment par les macrophages.Elle stimule la croissance et la proliferation de nombreuses cellules du système immunitaire et existe sous deux formes : l'IL1- (localisation membranaire) et l'IL1-ss (qui est la forme majeure d'IL1 produite et secrétée par les phagocytes monoclunéés) issues de deux gènes distincts mais partageant le même recepteur: en effet,le sixième exon code la partie homologue des deux formes < et B,qui comporte precisément le site de fixation.Le PM est de 17,5 KDa.
Le recepteur de l'IL1 des lymphocytes de souris a été sequencé et cloné par Sims et al. (cDNA expression cloning of the IL1 receptor,a member of the immunoglobulin superfamily. Science 241 : 585-588 - 1988).La sequence N-terminale est extracellul aire, comprend les trois domaines caracteristiques de la superfamille,comporte 319 acides aminés et sept sites potentiels de Nglycosylation (Asn).L'helicetC transmembranaire comporte 21 acides aminés dont 3 residus cysteyls.La sequence C-terminale (217 acides aminés) est intracytoplasmique et ne comporte pas de sequence caracteristique d'une activité tyrosine kinase.Par contre la sequence Lys429
Lys-Ser-Arg-Arg433 sert de substrat à une proteine kinase C: l'association des deux aboutit à une diminution de l'affinité de l'IL1 pour son recepteur : regulation fine.
Lys-Ser-Arg-Arg433 sert de substrat à une proteine kinase C: l'association des deux aboutit à une diminution de l'affinité de l'IL1 pour son recepteur : regulation fine.
La transduction après le contact ILI-recepteur : Shirakawa et al. (Cyclic-AMP : an intracellular second messenger for ilterleukin 1.Proc.Natl.Acad.Sci. USA 85 : 8201-8205 - 1988) a montré le couplage du recepteur à l'adenylate cyclase et l'augmentation de l'AMPc entrainant une proliferation cellulaire mais surtout induit la synthèse du recepteur de l'IL2 : le lymphocyte devient receptif à l'IL2 sous l'action de l'IL1.
MODE OPERATOIRE:
Le recepteur sequencé par Sims et al (cité plus haut) est produit par la technique decrite pour le recepteur de l'EGF,puis associé à l'adenylate cyclase dans la solution proteolipidique decrite dans le même chapitre qui sera deposée sur le film de proteine G + GDP recouvrant la membrane impermeable d'acrylate copolymère à lyse programmée.
Le recepteur sequencé par Sims et al (cité plus haut) est produit par la technique decrite pour le recepteur de l'EGF,puis associé à l'adenylate cyclase dans la solution proteolipidique decrite dans le même chapitre qui sera deposée sur le film de proteine G + GDP recouvrant la membrane impermeable d'acrylate copolymère à lyse programmée.
La zone (C) est un carré de papier Durieux No 22 preparé comme decrit plus haut (15 tel de acrylate copolymère sur une face pour la rendre temporairement impermeable,noter la face de depose,secher,retourner le papier) et on depose 15 Sd de la solution suivante: -ATP - (ref Sigma A 1020) 0.1 M - Ionophore A23187 Ref C 5149: Ca++ et Mg++ (molar ratio 1:1) 0.1 mM - Phosphorylase kinase : Ref P 2014 Sigma 2 UI/ ml de PRE à 0.5% in PBS (Phosphorus
Ruptoring Enzyme: desactive la phosphorylase kinase).
Ruptoring Enzyme: desactive la phosphorylase kinase).
- Phosphorylase b . Ref P 6635. inactive: 0.05 mg/ml (devient phosphorylase a active quand la phosphorylase kinase redevient active grâce à l'AMPc) - Glycogene Sigma Type X (Rabbit liver) - Ref G 4011 : 0,5 mg/ml - Peroxydase Ref P 6782: 0,1g/ml - Glucose-oxydase Ref G 1262: 1 U.I./d
Sechage sous vide poussé pendant 1 heure.
Sechage sous vide poussé pendant 1 heure.
La zone de revelation (D) est un carré de nylon blanc sur lequel on depose 2 ou 3,xd de la solution suivante de TMB à 1 mg/ml - 3-3'-5-5'-Tetra Methyl Benzidine (de preference Lab Miles) 1 mg - Methanol pur 99% lml.Agiter au vortex pendant au moins 3 minutes car le TMB est lent à se dissoudre completement.
Secher et surtout garder à l'abri de la lumière car le TMB vire spontanément au bleu après exposition prolongée à la lumière.
Assemblage : Placer,bien superposés, sur une plaque de PVC transparente:
I'element (A)
sur l'element (C)
sur l'element (D)
Placer une plaque opaque de PVC perforée d'un orifice de 8 mm,sur l'element (A) bien visible au fond de l'orifice,puis thermosouder les deux plaques.Garder au noir dans un sachet opaque,à sec et sous vide avec reinjection d'argon.
I'element (A)
sur l'element (C)
sur l'element (D)
Placer une plaque opaque de PVC perforée d'un orifice de 8 mm,sur l'element (A) bien visible au fond de l'orifice,puis thermosouder les deux plaques.Garder au noir dans un sachet opaque,à sec et sous vide avec reinjection d'argon.
MODE D'EXECUTION :
La SolutiOn à tester est
- Interleukine - lB (reference 86/552: NBSB,NIBSC,Potters Bar, U.K Son activité specifique est titrée arbitrairement à 1.0 x 108 U/mg de proteine à partir de la quantité d'3Hthymidine fixée par les lymphocytes T en presence d'IL-lss. soit 17,5 x 1014 U/mole.)
Cinq tubes de I ml de PBS correspondant à des dilutions differentes d'IL-lB sont notés:
Tube A: 0.1 U/ml
Tube B: 1U/ml
Tube C: 10 U/ml
Tube D: 100U/ml
Tube E: 1000 U/ml 100 1 de chaque tube sont deposés sur cinq dispositifs notés A à E.
La SolutiOn à tester est
- Interleukine - lB (reference 86/552: NBSB,NIBSC,Potters Bar, U.K Son activité specifique est titrée arbitrairement à 1.0 x 108 U/mg de proteine à partir de la quantité d'3Hthymidine fixée par les lymphocytes T en presence d'IL-lss. soit 17,5 x 1014 U/mole.)
Cinq tubes de I ml de PBS correspondant à des dilutions differentes d'IL-lB sont notés:
Tube A: 0.1 U/ml
Tube B: 1U/ml
Tube C: 10 U/ml
Tube D: 100U/ml
Tube E: 1000 U/ml 100 1 de chaque tube sont deposés sur cinq dispositifs notés A à E.
Resultats obtenus:
Tube: A B C D E
Signal 0 + ++ ++++ ++++
DOSAGE COMBINANT LA RECONNAISSANCE DU LIGAND re vU DJRECEPTUR) PAR UN an IICORPS ET UN RECEPTEUR (OU UN T LIGAND)
PROPOSITION D'UN DOSAGE SEMI-OUANllTATIF
Le principe : le signal emis resulte de l'addition de deux procédés differents :Fig. 9 - Un anticorps marqué (placé en C) specifique du ligand recherché,est piégé en (NC) (membrane coatée en ligand) s'il n'est pas saturé en ligand.S 'il est saturé en ligand,il rejoint en (D) - Une substance issue de l'activation du recepteur par le même ligands reprenant l'exemple ci dessus,le marquage de l'anticorps serait une peroxydase tandis que le produit final activé par le contact ligand-recepteur serait du peroxyde H202 (après action de la Glucose-Oxydase sur le
D-Glucose issu de l'hydrolyse du glycogène).Dans ce cas,il n'y a pas de peroxydase en (C) parmi tous les reactifs decrits dans l'exemple ci dessus ou dans les figures 5 et 6.puisqu'elle est apportée par-le marquage des anticorpsAinsi donc,une molecule de ligand apporte le reactif activé en (C) tandis qu'une autre molecule de ligand apporte la peroxydase du marquage des anticorps.
Tube: A B C D E
Signal 0 + ++ ++++ ++++
DOSAGE COMBINANT LA RECONNAISSANCE DU LIGAND re vU DJRECEPTUR) PAR UN an IICORPS ET UN RECEPTEUR (OU UN T LIGAND)
PROPOSITION D'UN DOSAGE SEMI-OUANllTATIF
Le principe : le signal emis resulte de l'addition de deux procédés differents :Fig. 9 - Un anticorps marqué (placé en C) specifique du ligand recherché,est piégé en (NC) (membrane coatée en ligand) s'il n'est pas saturé en ligand.S 'il est saturé en ligand,il rejoint en (D) - Une substance issue de l'activation du recepteur par le même ligands reprenant l'exemple ci dessus,le marquage de l'anticorps serait une peroxydase tandis que le produit final activé par le contact ligand-recepteur serait du peroxyde H202 (après action de la Glucose-Oxydase sur le
D-Glucose issu de l'hydrolyse du glycogène).Dans ce cas,il n'y a pas de peroxydase en (C) parmi tous les reactifs decrits dans l'exemple ci dessus ou dans les figures 5 et 6.puisqu'elle est apportée par-le marquage des anticorpsAinsi donc,une molecule de ligand apporte le reactif activé en (C) tandis qu'une autre molecule de ligand apporte la peroxydase du marquage des anticorps.
Selon une variante plus sensible : la même molecule de ligand se lie au recepteur et à l'anticorps marqué placé en (C): le recepteur active une première substance qui migre vers (E > ) (par exemple: production d'H202) tandis que l'anticorps marqué apporte sa peroxydase,pour produire le signal en (D) (bleu si TMB) : la même molecule de ligand a donc produit tous les elements necessaires à un signal puissant.(1 molecule de peroxydase agit sur plusieurs milliers de molecules d'H202 par seconde).S'il n'y a pas de ligand,les anticorps marqués sont piegés en (NC).
Ce double signal nous conduit donc directement à definir un:
DOSAGE SEMI-QUANTITATIF DE L'INTERLEUNNE 1: Figures 9
Les recepteurs en (B) sont en quantité molaire correspondant exactement à la quantité molaire maximale admise.Ils activent,au contact du ligand,un produit final (1'H202 par ex.).
DOSAGE SEMI-QUANTITATIF DE L'INTERLEUNNE 1: Figures 9
Les recepteurs en (B) sont en quantité molaire correspondant exactement à la quantité molaire maximale admise.Ils activent,au contact du ligand,un produit final (1'H202 par ex.).
Si la quantité de ligand est superieure au maximum admis,l'excès de ligand deborde la membrane (B) pour se lier aux anticorps marqués (peroxydase par ex.) qui traversent alors la membrane selective (NC).
Si la quantité de ligand est inferieure ou egale au maximum admis,elle ne depasse pas la membrane (B) et les anticorps marqués,n'etant pas saturés en ligand,sont piegés en (NC).
MODE OPERATOIRE: Fig. 9
Le procédé est semblable à celui de la figure 5 sauf que l'on enlève la peroxydase de la zone (C) puisqu'elle est apportée par le marquage des anticorps obtenus chez la souris mâle C3H/
HeN (Charles River Italia,Calco,Italy) après immunisation par le peptide 163-176 (sequence reactive de l'IL-lB reconnue par les anticorps) fourni par Novabiochem AG (Läufelfingen,
Switzerland).Le marquage se fait par la methode SMCC permettant de fixer 2 molecules de peroxydase par molecule d'immunoglobuline.Les anticorps marqués sont passés dans une colonne HPLC (Pharmacia) pour garantir l'absence de peroxydase libre dans la solution d'anticorps marqués qui sera deposée en (C) après dilution à 1,ug/ml de PBS.
Le procédé est semblable à celui de la figure 5 sauf que l'on enlève la peroxydase de la zone (C) puisqu'elle est apportée par le marquage des anticorps obtenus chez la souris mâle C3H/
HeN (Charles River Italia,Calco,Italy) après immunisation par le peptide 163-176 (sequence reactive de l'IL-lB reconnue par les anticorps) fourni par Novabiochem AG (Läufelfingen,
Switzerland).Le marquage se fait par la methode SMCC permettant de fixer 2 molecules de peroxydase par molecule d'immunoglobuline.Les anticorps marqués sont passés dans une colonne HPLC (Pharmacia) pour garantir l'absence de peroxydase libre dans la solution d'anticorps marqués qui sera deposée en (C) après dilution à 1,ug/ml de PBS.
La membrane (NC) est destinée à pieger ces anticorps s'ils ne sont pas saturés en IL-1,c'est à dire s'il n'y a pas suffisemment d'IL-1 : la quantité de recepteurs de l'IL-1 bien calculée à l'avance en (B),a fixé et stoppé la quantité admise d'IL-1.fl n'y a pas d'fl-1 excedentaire dans l'echantillon et les anticorps n'etant pas saturés en IL-1,vont se fixer sur (NC) et n'apporteront pas en (D) de peroxydase à 1'H202 produit par le contact IL-1 avec son recepteur.Par contre si la quantité d'IL-1 dans l'echantillon depasse le taux maximal.admis (Fig. 9+),elle va saturer les anticorps qui ne pourront plus reconnaitre le peptide 163-176 de 1 r- xe en en(NC) et qui vont donc migrer vers (I)) où leur peroxydase va provoquer la coloration du TMB au contact de 1'H202 provenant du contact IL-i avec son recepteur.
Toujours pour les mêmes raisons,une membrane à lyse programée M3 stoppe temporairement la migration des fluides de l'echantillon.
Ce procédé du double signal permet une meilleure fiabilité: la coloration sera issue de deux voies differentes;chacune des voies n'etant possible que s'il y a la substance recherchée.
EXEMPLE 2: DOSAGE DE L'INERLEUKNE-2
L'IL-2 est à l'heure actuelle la plus connue des immuno-hormones et les resultats preliminaires dans l'administration in vivo est extremement prometteuse.Elle a été decouverte par hasard par l'equipe du laboratoire de Robert Gallo : les cultures de lymphocytes stimulés produisaient un nouveau facteur induisant la multiplication in vitro des lymphocytes T d'où son ancienne denomination de T Cell Growth Factor (TCGF)l'lL-2 est secrétée par les lymphocytes T
Helper stimulés par une cascade d'interactions impliquant l'antigène agresseur et les monocytes.
L'IL-2 est à l'heure actuelle la plus connue des immuno-hormones et les resultats preliminaires dans l'administration in vivo est extremement prometteuse.Elle a été decouverte par hasard par l'equipe du laboratoire de Robert Gallo : les cultures de lymphocytes stimulés produisaient un nouveau facteur induisant la multiplication in vitro des lymphocytes T d'où son ancienne denomination de T Cell Growth Factor (TCGF)l'lL-2 est secrétée par les lymphocytes T
Helper stimulés par une cascade d'interactions impliquant l'antigène agresseur et les monocytes.
C'est une simple chaine polypeptide de PM 15 à 16.000 Da qui contient 133 acides aminés et qui est très stable.
Steve Gillis et ses collègues du Kendall Smith's laboratory (J.Exp.Med. 152,1709 - 1980-
USA) ont examiné en culture continue in vitro de nombreuses lignées de cellules tumorales ou de leucemiques.Une seule lignée : Jurkatt lymphocyte line produit de larges quantités de IL-2 ce qui a permis de la sequencer et à Taniguchi et al.(Nature 302,305 ,1983) de la cloner : le gène de l'IL-2 contient 4,5 kilobases et 3 exons (sequences non-codantes) et ne presente aucune homologie avec aucun facteur connu,ni proteine ni hormone.Aucun oncogène connu ne contient une sequence homologue à celle de l'lL-2.Stimulés par l'IL-1 et l'antigène presenté par les macrophages,les lymphocytes T Helper se differencient et se mettent à produire de 1'IL-2.
USA) ont examiné en culture continue in vitro de nombreuses lignées de cellules tumorales ou de leucemiques.Une seule lignée : Jurkatt lymphocyte line produit de larges quantités de IL-2 ce qui a permis de la sequencer et à Taniguchi et al.(Nature 302,305 ,1983) de la cloner : le gène de l'IL-2 contient 4,5 kilobases et 3 exons (sequences non-codantes) et ne presente aucune homologie avec aucun facteur connu,ni proteine ni hormone.Aucun oncogène connu ne contient une sequence homologue à celle de l'lL-2.Stimulés par l'IL-1 et l'antigène presenté par les macrophages,les lymphocytes T Helper se differencient et se mettent à produire de 1'IL-2.
En fait l'IL-2 joue un rôle predominant dans le developpement de la seconde phase de la reponse immunitaire (production de cellules T Killer et de cellules B productrices d'anticorps).C'est veritablement le conducteur de l'immunité .Parmi les cellules les plus sensibles à l'IL-2 figurent par exemple les CTL (Cytotoxic T Lymphocytes) responsable de l'elimination de virus influenza et de cellules infectées selon un mecanisme d'une extrême precision: en presence de virus influenza,seules les CTL precurseurs sont activés: ils se mettent à produire des recepteurs de 1'IL-2 à leur surface: et à proliferer (puisque 1'IL-2 induit lui même une proliferation) mais surtout deviennent competentes: detruire les cellules infectées par le virus et epargner les cellules saines.
Le taux d'IL-2 est très diminué dans les cancers et le SIDA (AIDS).
D'où le grand interêt de son dosage.
Tout recemment,il est apparu que les LGL (Large Granular Lymphocytes : 5% des lymphocytes du sang peripherique) possedent une activité cytotoxique contre les NK cells (lignées tumorales).Cette activité a été multipliée par 100 après une courte incubation dans 1'IL-2 in vitro: elles sont devenues des LAK cells (Lymphokine Actvated Killer cells),hautement cytotoxiques pour de nombreuses cellules-cibles,incluant des cellules tumorales.
Ces cellules LAK ont été utlisées in vivo pour traiter des patients cancereux.Mais l'IL-2 s'est revélée hautement toxique (hemorragies capillaires).
Rosenberg et al. (Ann.Internatl.Med.l08,853-864 - 1988) a proposé une solution elegante au problème de cette toxicité: traiter extemporanément les LGL par l'IL-2 : ces lymphocytes sont extraits de la tumeur (d'où leur nom de TIL: tumor-infiltrating lymphocytes) et cultivés in vitro en presence d'IL-2,avant d'être reinjectés (sans 1'IL-2 bien sûr) au patient: leur pouvoir cytotoxique est apparu 50 à 100 fois plus fort encore que les LAK et ont favorisé la regression de lesions metastatiques de certains cancers : l'immunotherapie du cancer par des associations de lymphokines est très prometteuse.Le New England Journal of Medicine du 30 Aout 1990,323,9,page 570 - publie le premier bilan des experiences realisées dans le traitement du melanome malin metastasé,par Steven A Rosenberg,de l'Institut national du cancer à Bethesda (Washington D.C.) : il obtient 50% de remissions de melanomes metastasés,sans effets secondaires chez le patient.Ce qui l'a conduit à obtenir des autorités federales la première autorisation d'inserer un gène codant pour l'IL-2 dans des lymphocytes reinjectés au patient.
J.R.Ortaldo,J.Frey,Toshikazu Takeshita et Kazuo Sugamura (European Cytokine Network,vol 1
No 1,March-April 1990,pp 27-34) ont observé l'effet d'un anticorps monoclonal TU27 contre le recepteur p70-75 de l'IL-2 sur les lymphocytes CD3- : l'IL-2 ne pouvait plus se lier à son recepteur : pas d'induction d'activité LAK mais,au contact de cet anticorps,les lymphocytes
CD3- produisaient de grandes quantités d'interferon gamma.
No 1,March-April 1990,pp 27-34) ont observé l'effet d'un anticorps monoclonal TU27 contre le recepteur p70-75 de l'IL-2 sur les lymphocytes CD3- : l'IL-2 ne pouvait plus se lier à son recepteur : pas d'induction d'activité LAK mais,au contact de cet anticorps,les lymphocytes
CD3- produisaient de grandes quantités d'interferon gamma.
Le recepteur de 1'IL2 est une proteine largement glycosylée de 55 KDa sequencée aux USA par le groupe de Waidmann (Uchiyama et al. J.Immunol. 126,1393,-1981) et clonée par le groupe Yodoï au Japon (Nikaido et al. Nature,311,631,1984).Le RNA messager corresopondant à cet ADNc produit une proteine (le recepteur) de 35 KDa (depourvue d'acide sialique et d'aminoglycannes,ce qui explique la difference avec les 55 KDa du PM cité plus haut) qui se lie à l'lL-2.En 1987 un autre recepteur a été decouvert de PM 70 KDa et il est apparu que ces deux recepteurs associés en un heterodimère formaient un complexe avec une très forte affinité (Kd = 30x10-2) pour l'IL2,bien superieure à celle observée avec un seul des deux recepteurs.Seul le recepteur p70 contient un domaine intracytoplasmique.
L'effet de l'IL2 sur les recepteurs est une augmentation rapide d'AMPc dans le cytoplasme et une cascade de reactions aboutissant à la division et proliferation des cellules identiques (possedant un recepteur à l'IL-2.)
Les steroides et la cyclosporine (therapeutique anti-rejet) inhibent l'effet de l'IL-2.
Les steroides et la cyclosporine (therapeutique anti-rejet) inhibent l'effet de l'IL-2.
L'INTERLEU1UNE- 6
C'est une proteine de 21 KDa d'origine très diversifiée: monocytes,lymphocytes
T,fibroblastes,cellules de myxome cardiaque et d'osteosarcome.Les lymphocytes B transformées par le virus d'Epstein Barr secrètent de 1'IL6 dans le liquide surnageant les cultures.
C'est une proteine de 21 KDa d'origine très diversifiée: monocytes,lymphocytes
T,fibroblastes,cellules de myxome cardiaque et d'osteosarcome.Les lymphocytes B transformées par le virus d'Epstein Barr secrètent de 1'IL6 dans le liquide surnageant les cultures.
Elle ne possède pas d'activité growth promoting puisqu'elle n'augmente pas l'incorporation de thymidine marquée dans la cellule, mais agit plutôt comme un puissant inducteur de differenciation sur les lymphocytes B aboutissant à la secretion de grandes quantités d'immunoglobulines.
Le gène de l'IL-6 possède un grand nombre de sites d'initiation de la transcription,ce qui fait que la-molecule finale transcrite varie d'un tissu à l'autre et dans le même tissu quand les conditions physiologiques varient: par exemple les monocytes secrètent six IL-6 differentes par leur PM et par le nombre de sites de glycosylation.
Le taux d'IL-6 est très augmenté dans les maladies auto-immunes et dans les desordres inflammatoires.
Le recepteur de l'IL-6 est largement repandu dans les cellules B et T,les macrophages.Le nombre de recepteurs par cellule augmente considerablement dès que la proliferation cellulaire est induite,ce qui donne un intêret considerable au dosage du recepteur sur les fragments de biopsie mais certainement aussi dans le sang peripherique puisque les cibles de l'IL-6 sont dans le sang peripherique.
C'est une proteine de 468 acides aminés avec un domaine extracellulaire typique de la superfamille des immunoglobulines,et un domaine intracytoplasmique depourvu de site tyrosine kinase.Son cDNAs a été cloné par Haegeman et al. (Eur.J.Biochem.159,625-632 - 1986).
L'INIERFERON - a - ss - gamma 1 - Interferon- - Proteine de 20KDa secrétée par les lymphocytes B et T,peut être induite par le Sondai Virus Superinfection et dans les cellules ss-lymphoblastoides et des lymphomes.
2 - Interferon ss - De même structure,c'est un produit des fibroblastes et est plus connu pour son
ativité anti-virale.
ativité anti-virale.
Effets ceux d'une lymphokine Exemples: - sur les Ig: Ces deux interferons ont des effets dose-dependants sur la production d'immu noglobulines : la favorisent à dose faible,la suppriment à fortes doses.
- sur la proliferation des cellules B peripheriques : l'inhibent en cooperation avec IL-2 et IL
6,deviennent mitogènes pour les mêmes cellules en cooperation avec les anti-M 3 - Interferon gamma - produite par les cellules T CD4+,elle antagonise les effets mitogènes de l'IL-4 sur les lymphocytes B et favorise la production d'Ig.
6,deviennent mitogènes pour les mêmes cellules en cooperation avec les anti-M 3 - Interferon gamma - produite par les cellules T CD4+,elle antagonise les effets mitogènes de l'IL-4 sur les lymphocytes B et favorise la production d'Ig.
Les recepteurs de ces interferons ont été identifiés et clonés par Cambier et Ransom -(Ann.Rev.Iinmunol.5,175-199,1987).Ils activent l'adenylate cyclase dès le contact avec l'interferon et donc la production d'AMPc,puis la recompartimentalisation de la proteine kinase C vers l'enveloppe nucléaire par un processus d'endocytose,pour aller contrôler la transcription de certains gènes.
A doses therapeutiques,l'interferon est utilisé comme adjuvant antiviral dans les infections virales graves (HrV 1 et 2) mais est souvent toxique (myalgies et hypotension).Son dosage peut être precieux.
DOSAGE DES ALLERGENES.Figures 7.1 et 7.2
Lors de la phase dite de sensibilisation l'organisme reagit à la presence d'allergènes par la synthèse d'IgE specifiques qui viennent se fixer par leur fragment Fc sur les mastocytes et les basophiles sans entrainer d'effet particulier (Fig 7.1).Lorsque l'antigène est à nouveau en contact avec l'organisme,il se fixe sur les extremités NH2 des IgE specifiques de cet antigène: c'est cette liaison qui declenche la reponse cellulaire : nette augmentation de l'AMPc et secretion d'histamine par exemple.
Lors de la phase dite de sensibilisation l'organisme reagit à la presence d'allergènes par la synthèse d'IgE specifiques qui viennent se fixer par leur fragment Fc sur les mastocytes et les basophiles sans entrainer d'effet particulier (Fig 7.1).Lorsque l'antigène est à nouveau en contact avec l'organisme,il se fixe sur les extremités NH2 des IgE specifiques de cet antigène: c'est cette liaison qui declenche la reponse cellulaire : nette augmentation de l'AMPc et secretion d'histamine par exemple.
Contrairement à la plupart des systemes de reconnaissance de la membrane plasmique qui impliquent une interaction agoniste-recepteur pour obtenir une reponse,il faut dans ce cas trois acteurs : le recepteur,l'IgE et l'antigène.
Le recepteur FOC RI comporte 4 peptides transmembranaires,leurs sequences ont été determinées et clonées par Shimizu et al.(Proc.NatlÂcad.Si.USA.85,1907-1911,1988),Kinet et al.(Biochemistery 26,4605-4610,1988),et Blank et al.(Nature 337,187-189,1989).
La structure est monomerique à sept domaines transmembranaires avec couplage à la proteine
G et l'adenylate cyclase.(Cockcroft et Gomperts,Nature 314: 534-536,1985) Mode- operatoire:
Les recepteurs Fc~RI et l'adenylate cyclase sont integrés à la membrane (B) proteolipidique decrite plus haut,reposant sur un film temporairement impermeable d'acrylate copolymère à lyse programmée et contenant la proteine G.
G et l'adenylate cyclase.(Cockcroft et Gomperts,Nature 314: 534-536,1985) Mode- operatoire:
Les recepteurs Fc~RI et l'adenylate cyclase sont integrés à la membrane (B) proteolipidique decrite plus haut,reposant sur un film temporairement impermeable d'acrylate copolymère à lyse programmée et contenant la proteine G.
La zone (C) contient les mêmes reactifs inactivés cités ci dessus dans les exemples de dosage avec production d'AMPc (ATP,Ca++,Mg++,phosphorylase kinase inactivée,phosphorylase b,glycogène,peroxydase et glucose oxydase).
L'etage de revelation (D) est identique.
Une fois que les differents etages sont assemblés,on depose 10 M1 d'une solution à 10 ng/jd d'IgE specifique de l'allergène recherché,in PBS pH 7,4 + sodium azide comme bacteriostatique,sur la face superieure de la membrane (B).Une grande partie de ces IgE vont se fixer spontanément par leur extremité Fc au recepteur inséré dans la membrane (B).Le reste va suivre l'ecoulement des liquides de l'echantillon sans aucun trouble pour le test,car non liés au recepteur.
Mode d'execution:
IgE utilisées : Anti Tree/Shrub pollens Juniperus Scopulorum à lmg/ml
in PBS et sodium azide.Dilués au 1/100 avant depose.
IgE utilisées : Anti Tree/Shrub pollens Juniperus Scopulorum à lmg/ml
in PBS et sodium azide.Dilués au 1/100 avant depose.
Allergène: Ref P 7145 Sigma (Rocky Mountain Junniper)
Solution temoin No 0 : PBS sans allergène
Solution No 1: 1 pg/ml; No 2: 10 pg/ml; No 3: 100 pg/ml; No 4: 1 ng/ml; No 5: 10 ng/ mI;No6: 100ng/ml;No7: 1,ug/ml
Resultats:
No de la solution: 0 1 2 3 4 5 6 7 Intesnsité Signal 0 +1- + + ++ ++ +++ +++ +++
Ce test permet de doser le taux d'allergènes dans une solution.
Solution temoin No 0 : PBS sans allergène
Solution No 1: 1 pg/ml; No 2: 10 pg/ml; No 3: 100 pg/ml; No 4: 1 ng/ml; No 5: 10 ng/ mI;No6: 100ng/ml;No7: 1,ug/ml
Resultats:
No de la solution: 0 1 2 3 4 5 6 7 Intesnsité Signal 0 +1- + + ++ ++ +++ +++ +++
Ce test permet de doser le taux d'allergènes dans une solution.
DOSAGE DES RECEPTEURS DES IgE DANS LE SANG : DETECTION D'ALLERGIE
Figure 7.2
Principe : Des allergènes sont disposés dans la membrane filtre (A).Le dosage consiste à les mettre en contact avec d'eventuels complexes recepteur+IgE specifique de cet allergène et supportés par les plasmocytes du sang peripherique : la presence de ces complexes est la preuve formelle qu'il y a allergie à l'allergène reconnu par l'IgE associée au recepteur.Un detergent doux non-ionique Triton X-100 est ajouté sur le filtre (A) pour lyser les plasmocytes et liberer des fragments membranaires contenant le recepteur et son IgE mais surtout pour liberer le fragment intracellulaire du recepteur,fragment à partir duquel va partir le signal vers la proteine
G et l'adenylate cyclase presents en (B).
Figure 7.2
Principe : Des allergènes sont disposés dans la membrane filtre (A).Le dosage consiste à les mettre en contact avec d'eventuels complexes recepteur+IgE specifique de cet allergène et supportés par les plasmocytes du sang peripherique : la presence de ces complexes est la preuve formelle qu'il y a allergie à l'allergène reconnu par l'IgE associée au recepteur.Un detergent doux non-ionique Triton X-100 est ajouté sur le filtre (A) pour lyser les plasmocytes et liberer des fragments membranaires contenant le recepteur et son IgE mais surtout pour liberer le fragment intracellulaire du recepteur,fragment à partir duquel va partir le signal vers la proteine
G et l'adenylate cyclase presents en (B).
Mode operatoire:
La membrane (B) preparée selon le protocole decrit plus haut,contient uniquement de la proteine G et de l'adenylate cyclase.Ces reactifs seront activés par la formation du complexe
Allerène+IgE+recepteur au niveau des debris membranaires de plasmocytes de l'echantillon,puis production d'AMPc et cascade de reactions amplifiées qui aboutissent à la coloration du TMB.
La membrane (B) preparée selon le protocole decrit plus haut,contient uniquement de la proteine G et de l'adenylate cyclase.Ces reactifs seront activés par la formation du complexe
Allerène+IgE+recepteur au niveau des debris membranaires de plasmocytes de l'echantillon,puis production d'AMPc et cascade de reactions amplifiées qui aboutissent à la coloration du TMB.
Sur un carré de 15mm x 15 mm de papier Durieux preparé (blocking) on depose 15 L de la solution des reactifs inactivés.C'est la zone (C).
La zone (I?) est identique aux precedentes.
Sur un carré de membrane-filtre (A) on depose 15 il de la solution contenant 1% de Triton X100 (non toxique sur la peroxydase ni sur l'hemoglobine qui participe à la synergie peroxydasique sur le TMB) et 1 Mg/mi d'allergène.
(A) est posé sur (B) elle même deposée sur (C) puis (E)).
Mode d'execution:
Sur un dispositif assemblé,on depose: 100 l de Sang total temoin (non allergique) et sur un autre dispositif assemblé on depose: 100,ul de Sang total de patient allergique au Juniperus decrit plus haut.
Sur un dispositif assemblé,on depose: 100 l de Sang total temoin (non allergique) et sur un autre dispositif assemblé on depose: 100,ul de Sang total de patient allergique au Juniperus decrit plus haut.
L'allergène associé en (A) est le même que celui decrit plus haut (Rocky Mountain Juniper),à la dose de 1,ug/ml (en excès)
Resultats : Figure 7
Le sang temoin colore en rose (serum + sang hemolysé) toute la membrane de revelation (D) tandis que le sang positif (d'un sujet allergique) colore en 1 minute et 20 secondes,en bleu le spot central de TMB en 0)) sur fond rose dû à la coloration du reste du nylon blanc par le sens.
Resultats : Figure 7
Le sang temoin colore en rose (serum + sang hemolysé) toute la membrane de revelation (D) tandis que le sang positif (d'un sujet allergique) colore en 1 minute et 20 secondes,en bleu le spot central de TMB en 0)) sur fond rose dû à la coloration du reste du nylon blanc par le sens.
Le sang temoin (non allergique) contenait bien des plasmocytes avec leur recepteur mais sans liaison avec l'IgE specifique qui reconnait l'allergène faisant l'objet du test.
Le sang du sujet allergique au Juniperus contient bien des plasmocytes dont les recepteurs supportent par leur fragment Fc,les IgE specifiques anti-Juniperus.Le contact de cette IgE avec l'allergène Juniperus,declenche via le recepteur l'activation de la proteine G puis de l'adenylate cyclase,production d'AMPc-et activation finale de la phosphorylase avec production de D
Glucose qui reagit avec la glucose-oxydase - > H202 qui reagit avec la peroxydase pour colorer en bleu le TMB.A chaque etape,ily a une amplification de 1000 X par seconde,ce qui permet une haute sensibilité et un signal visible à l'oeil nu.
Glucose qui reagit avec la glucose-oxydase - > H202 qui reagit avec la peroxydase pour colorer en bleu le TMB.A chaque etape,ily a une amplification de 1000 X par seconde,ce qui permet une haute sensibilité et un signal visible à l'oeil nu.
DOSAGES DE LIGANDS SE LIANT AUX DEUX TYPES DE ke F*uRS DECR1TS
Certaines hormones comme le glucagon par exemple,exercent leur action par l'lntermediaire de deux recepteurs distincts : le recepteur GR-1 est couplé à la PLC (Phospholipase C) tandis que le recepteur GR-2 est couplé à l'adenylate cyclase.
Certaines hormones comme le glucagon par exemple,exercent leur action par l'lntermediaire de deux recepteurs distincts : le recepteur GR-1 est couplé à la PLC (Phospholipase C) tandis que le recepteur GR-2 est couplé à l'adenylate cyclase.
Ce sont bien deux recepteurs separés differents,à l'inverse du cas de l'Interleukine-2 qui a deux recepteurs,certes diffferents par leur poids moleculaires (p55 et p70) mais qui sont necessaires tous les deux en même temps,pour l'activité de 1'IL-2 : la liaison simultanée aux deux recepteurs est beaucoup plus solide et plus efficace au point de vue transduction du signal vers le cytoplasme,signal unique (liberation de Ca++) malgré la difference des deux recepteurs.
Dans le cas present du glucagon pris en exemple,le recepteur GR-1 couplé à la PLC declenche une augmentation brutale de Ca++ cytosolique comme il est decrit dans le premier type de recepteur (Fig 4.0).Tandis que le recepteur GR-2 declenche une augmentation brutale d'AMPc et donc la glycogenolyse comme decrit dans le second type de recepteur (Fig. 6).
Wakelam et al. (Activation of two signal-transduction systems in hepatocytes by Glucagon.Nature,323,68-71,1986) a demontré que le glucagon,à des doses physiologiques (10puises10 M) provoque Ia production d'IP3 (selon le premier type de recepteur) mais surtout inhibe l'adenylate cyclase du second type de recepteur: pas de production d'AMPc.Par contre,à fortes doses,il declenche une glycogenolyse en empruntant le second type de recepteurs (liberation AMPc)
Ceci est interessant en ce qui concerne l'utilisation du dispositif et du procédé objet de la presente invention: il s'agit d'ùn dosage semi-quantitatif naturel:
En utilisant un dispositif reunissant les deux procédés en un seul : les deux types de recepteurs en (B),les deux types de reactifs inactivés en (C),un spot unique en a)) du melange suivant: Hydrxy Naphtol Blue 2% - 5-AS : 5 Amino-salicylate 1 mg/ml se colore en rose au contact de la peroxydase et H202 (il vient remplacer ici le TMB) - in PBS.
Ceci est interessant en ce qui concerne l'utilisation du dispositif et du procédé objet de la presente invention: il s'agit d'ùn dosage semi-quantitatif naturel:
En utilisant un dispositif reunissant les deux procédés en un seul : les deux types de recepteurs en (B),les deux types de reactifs inactivés en (C),un spot unique en a)) du melange suivant: Hydrxy Naphtol Blue 2% - 5-AS : 5 Amino-salicylate 1 mg/ml se colore en rose au contact de la peroxydase et H202 (il vient remplacer ici le TMB) - in PBS.
Trois hypothèses peuvent se presenter: - Taux de Glucagon pathologiquement bas (Hypoglycemies sevères) : aucune coloration du test.
- Taux de glucagon egal ou inferieur à la normale : coloration en bleu du spot d'Hydrxy Naphtol Blue par l'intermediaire du premier type de recepteur seul activé.
- Taux exagéré de Glucagon : le spot se colore en violet : le rose du 5-AS (second type de recepteur activé et le bleu du Hydroxy Naphtol Blue
Cet exemple du Glucagon s'applique au dosage de nombreuses substances hormonales:
- Vasopressines V1 et V2
- Angiotensine
- Les cathecolamines
DOSAGES DE MEDICANIENTS BETA-BLOOUAbTS.
Cet exemple du Glucagon s'applique au dosage de nombreuses substances hormonales:
- Vasopressines V1 et V2
- Angiotensine
- Les cathecolamines
DOSAGES DE MEDICANIENTS BETA-BLOOUAbTS.
DéTECTION DE SOUS OU SURDOSAGE.
Les medicaments Beta-bloquant largement utilisés en Cardiologie et depuis peu en psychiatrie (Anti-depresseurs),se fixent aux recepteurs beta sans declencher la casacade d'activations intracellulaires qui aurait normalement abouti à une vasoconstriction si c'etait des cathecolamines qui s'y etaient fixées: ils entrent en competition avec les cathecolamines au niveau des recepteurs beta,d'où leur nom de beta-bloquant.Leur effet benefique consiste à inhiber la vasoconstriction arterielle chez les hypertendus,et à baisser le rythme cardiaque.
Le surdosage est très dangereux et relativement trop frequent: il provoque des lipothymies par bradycardie importante (pouls inferieur à 40/mn) et même parfois des arrêts cardiaques.
Ce surdosage survient chez des personnes traitées à des doses normales,mais dont le fonctionnement renal ou hepatique fait que l'elimination urinaire ou biliaire du produit est par moments diminuée,ce qui aboutit à une accumulation du medicament circulant et des accidents de surdosage.
Le principe d'une detection de surdosages est le suivant:
Les beta-bloquants,prioritaires sur les cathecolamines au contact du recepteur beta,ne provoquent aucun effet intracytoplasmique,donc dans le cas present : n'entrainent aucune coloration du test.
Les beta-bloquants,prioritaires sur les cathecolamines au contact du recepteur beta,ne provoquent aucun effet intracytoplasmique,donc dans le cas present : n'entrainent aucune coloration du test.
Par contre les cathecolamines circulantes dans les sang du patient, Si elles trouvent des recepteurs libres (sous dosage de beta-bloquant par exemple),s'y fixent et provoquent la coloration du test.
Le dispositif: Fig. 8.1
A l'inverse du dosage semi-quantitatif des fateurs de croissance ou des cytokines ou de leurs recepteurs,le dispositif present ne va pas utiliser des anticorps pour neutraliser la quantité de beta-bloquant normale admise: les beta-bloquant sont de petites molecules (haptenes),en nombre de plus en plus important dans le commerce,avec des epitopes differents pour chacun;il est impossible d'inserer en (B0) un anticorps qui les reconnaisse tous.La preference va donc à l'insertion d'une certaine quantité de recepteurs beta : il n'en existe que quelques types très peu differents et leur avantage est de reconnaître tous les beta-bloquants comercialisés.Cet avantage est de loin superieur à la contrainte de devoir produire des recepteurs.
A l'inverse du dosage semi-quantitatif des fateurs de croissance ou des cytokines ou de leurs recepteurs,le dispositif present ne va pas utiliser des anticorps pour neutraliser la quantité de beta-bloquant normale admise: les beta-bloquant sont de petites molecules (haptenes),en nombre de plus en plus important dans le commerce,avec des epitopes differents pour chacun;il est impossible d'inserer en (B0) un anticorps qui les reconnaisse tous.La preference va donc à l'insertion d'une certaine quantité de recepteurs beta : il n'en existe que quelques types très peu differents et leur avantage est de reconnaître tous les beta-bloquants comercialisés.Cet avantage est de loin superieur à la contrainte de devoir produire des recepteurs.
Une première membrane BO supporte donc des recepteurs beta-adrenergiques en quantité molaire correspondant au taux molaire maximal de beta-bloquant admis.Elle ne comporte aucune molecule de Proteine G ni d'adenylate cyclase : elle ne transmet aucun signal.Sa face inferieure est enduite d'un film à lyse programmée pour laisser le temps à cette première etape de se faire.
Une seconde membrane (B) supporte les mêmes recepteurs beta en quantité egale à (B0) mais avec tous les elements necessaires pour transmettre un signal vers la zone (C) si des cathecolamines se fixent à ces recepteurs beta.Cela se traduira alors par une ativation des reactifs inactifs en (C) et une coloration bleue du TMB en (D).
Deux cas se presentent: - dosage convenable des beta-bloquants : Fig. 8.3
La membrane (B0) fixe toutes les molecules de beta-bloquant de l'echantillon.Les cathecolamines du patient migrent vers les recepteurs de la seconde membrane : (B) et declenchent en (C) l'activation des reactifs et la coloration en bleu en (D) du spot central de TMB qui se trouve entouré d'une coloration rose en peripherie due au serum du patient.
La membrane (B0) fixe toutes les molecules de beta-bloquant de l'echantillon.Les cathecolamines du patient migrent vers les recepteurs de la seconde membrane : (B) et declenchent en (C) l'activation des reactifs et la coloration en bleu en (D) du spot central de TMB qui se trouve entouré d'une coloration rose en peripherie due au serum du patient.
- Surdosage de medicament : Fig. 8.2: quelquesoit la membrane (B) ou 90),tous les recepteurs beta sont saturés en beta-bloquants et non en cathecolamines : aucun recepteur beta ne va s'exprimer: coloration en rose de la zone (D) par le serum du patient et aucune coloration du spot central de TMB.
DOSAGE DE LA DOPAMINE ET DE SES RECEPTEURS
La dopamine est le neurotransmetteur le plus impliqué dans l'exercice des grandes fonctions cerebrales.Dès l'age de 50 ans l'activité dopaminergique est diminuée de près de 40% dans le cerveau, compromettant le bon fonctionnement synaptique,mitochondrial et la synthèse proteique neuronale.Les messages ne passent plus au niveau: - de la voie mesocorticale (memoire,vigilance,intellect) - de la voie mesolimbique (humeur et comportement) - de la voie nigro-striée (motricité extra-pyramidale) - des organes neuro-sensoriels (cochlée,retine,vestibule)
Les recepteurs de la dopamine sont largement distribués au niveau ivuviiasculaire.
La dopamine est le neurotransmetteur le plus impliqué dans l'exercice des grandes fonctions cerebrales.Dès l'age de 50 ans l'activité dopaminergique est diminuée de près de 40% dans le cerveau, compromettant le bon fonctionnement synaptique,mitochondrial et la synthèse proteique neuronale.Les messages ne passent plus au niveau: - de la voie mesocorticale (memoire,vigilance,intellect) - de la voie mesolimbique (humeur et comportement) - de la voie nigro-striée (motricité extra-pyramidale) - des organes neuro-sensoriels (cochlée,retine,vestibule)
Les recepteurs de la dopamine sont largement distribués au niveau ivuviiasculaire.
La revue Nature du 6 Septembre 1990,p.72,76,80, publie la somme des travaux importants qui ont conduit à l'identification du gène du recepteur D1 de la dopamine et son clonage.II est localisé sur le bras long du chromosome 5.
A la difference du recepteur DZle recepteur D1 active la proteine G et l'adenylate cyclase avec nette augmentation d'AMPc qui phosphoryle une proteine kinase A: la DARPP-32 ( Dopamine and cycllc AMP regulated phosphoprotein .
Plus recemment encore,le docteur Jean Charles Scwartz et coll.de l'Unité 109 de L'INSERT a publié dans Nature du 13 Septembre 1990,page 146,publie ses travaux sur la commande genetique d'un nouveau recepteur dopaminergique : le D3 se trouve concentré dans le système limbique (zone cognitive et emotionnelle).C'est ce recepteur qui constitue le mediateur des effets de medicaments antipsychotiques ou antiparkinsoniens dont on pensait jusqu'à present qu'ilq agissaient sur le recepteur D2.Ainsi,le ciblage des traitements est bien meilleur et surtout,il n'y aura plus d'effets secondaires (secheresse de bouche,raideurs musculaires,somnolence diurne,etc..) qui etaient dus au blocage des recepteurs D1 et D2.
Ce travail du Dr Schwartz est important en lui même dejà: il emprunte la voie inverse de la recherche pharmacologique classique qui part de la molecule de medicament pour etudier son site d'action,trouver son recepteur puis l'ADN codant pour ce recepteurEn effet le Dr Schwartz part du genome d'une cellule cerebrale concernée et choisit parmi les gènes,ceux qui codent pour un recepteur à la dopamine En testant plusieurs types de neuroleptiques (il en existe des milliers non encore testés chez l'homme) sur chacun des recepteurs choisis,il est arrivé après un travail de plusieurs années à isoler ce recepteur D3 qui semble être beaucoup plus specifique des medicaments des psychoses que les autres recepteurs.
Le but du dispositif et du procédé objet de cette invention,est un dosage simplifié de la dopamine ou de son recepteur qui peut apporter en pratique medicale courante des progrès considerables en orientant mieux l'acte therapeutique et le suivi des processus evolutifs de vieillissement,des processus degeneratifs (Alzheimer,etc..) et surtout des psychoses.
Il peut egalement être un outil de recherche pahrmacologique: un dispositif selon la description de cette invention,peut integrer un recepteur D3 et permettre un screening à très grande echelle parmi les milliers de molecules de neuroleptiques non encore testées et surtout non encore identifiées et decouvertes.
Selon ce principe particulier,il est permis de generaliser l'usage de ce dispositif et de ce procédé à toute la recherche pharmacologique sur les recepteurs et leurs ligands: en cancerologie,en hormonologie,etc.. car des milliers de recepteurs restent à identifier et des milliers de ligands n'ont pas encore de recepteurs connus.
PATHOLOGIE DES RECEPTEURS
En fait,la cellule in vivo sait faire toute seule une selection semiquantitative : il existe plusieurs recepteurs des cathecolamines et certains sont prioritaires sur les autres.Certains,comme le recepteur 1 module le recepteur 132 et evite ainsi des reactions trop brutale des cellules dans les decharges d'adrenaline par exemple.Ceci est valable aussi pour les recepteurs des acides aminés excitateurs : un dereglement de cette fine regulation aboutit aux decharges brutales de ces ligands sur les recepteurs dans les crises d'epilepsie.
En fait,la cellule in vivo sait faire toute seule une selection semiquantitative : il existe plusieurs recepteurs des cathecolamines et certains sont prioritaires sur les autres.Certains,comme le recepteur 1 module le recepteur 132 et evite ainsi des reactions trop brutale des cellules dans les decharges d'adrenaline par exemple.Ceci est valable aussi pour les recepteurs des acides aminés excitateurs : un dereglement de cette fine regulation aboutit aux decharges brutales de ces ligands sur les recepteurs dans les crises d'epilepsie.
Cette modulation d'un recepteur par un autre n'est en fait qu'une illustration resumée de regulations extrêmement fines qui se produisent in vivo.Le mecanisme principal est une phosphorylation,le plus souvent par l'intermediaire de proteine-kinases qui agissent sur des sites très precis specifiques.
Le premier exemple (Revue Kenakin - Pharmacol.Rev.36: 165-222, 1984) met en evidence l'augmentation rapide du nombre de sites de liaisons ss-adrenergiques cardiaques chez le foetus;pourtant,la reactivité cardiaque beta-adrenergique diminue à la naissance en raison de l'accroissement à ce moment precis,du nombre des recepteurs alpha.De même les oestrogènes suscitent au niveau de l'uterus,l'augmentation du nombre des recepteurs alpha-adrenergiques
augmentation de la contractilité uterine) alors que la progesterone provoque l'effet con traire (atonie uterine) en suscitant l'augmentation de recepteurs beta-åurenerglques.
augmentation de la contractilité uterine) alors que la progesterone provoque l'effet con traire (atonie uterine) en suscitant l'augmentation de recepteurs beta-åurenerglques.
Le second exemple est celui du site Threonine 654 du segment intracytoplasmique du recepteur de l'EGF: après contact avec l'EGF,le site Tyrosine kinase (acide aminé numeroté 1173 à partir de l'extremité extra-cytoplasmique) entre en activité et declenche des phosphorylations en cascade : activation d'une proteine kinase qui phosphoryle specifiquement ce site Threonine 654 : la phosphorylation de ce site desensibilise complètement le recepteur: 1") - il ne fixe plus l'EGF. 2") - si l'EGF se fixe quand même,le signal est stoppé au niveau de la threonine654 et ne parvient pas en aval au site Tyrosine kinase : recepteur desensibiIisé.
n est à present clairement etabli (Lin et al.CELL 44, 839-848. 1986) que les recepteurs codés par des oncogènes,ne possèdent pas,entre autres,de site Threonine 654 : le recepteur est encore activable par l'EGF mais devient indesensibilisable .De plus il est clairement etabli que les cellules dans lesquelles l'oncogène s'exprime,supportent cent ou mille fois plus de ces recepteurs par rapport au nombre de recepteurs normaux supportés par des cellules saines (Growth Factors and Onchogenes.Ed M.Bolla,E.M.Chambaz,C.Vroussos.Colloque INSERM/John
Libbey Eurotext Ltd.1989.Vol 190,pp 107-118).Comme d'autres oncogènes codent pour de grandes quantités d'EGF ou de TGF (qui reconnait le même recepteur que l'EGF) secretées en excès dans le milieu extracellulaire,la cellule supportant les recepteurs depourvus de site Threonine 654,va connaitre une forte stimulation continue pour une division sans fin.
Libbey Eurotext Ltd.1989.Vol 190,pp 107-118).Comme d'autres oncogènes codent pour de grandes quantités d'EGF ou de TGF (qui reconnait le même recepteur que l'EGF) secretées en excès dans le milieu extracellulaire,la cellule supportant les recepteurs depourvus de site Threonine 654,va connaitre une forte stimulation continue pour une division sans fin.
Le virus d'Epstein-Barr agit comme ces oncogènes par l'intermediaire du TGF-ss sur les lignées cellulaires B.(13lomhof et al. Eur.J.Immunol.17, 299-301, 1987) ll existe aussi des modifications des recepteurs induites par une fonction endocrine (Mahan et al. Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.27 : 215-235, 1987):
- l'angiotensine n (système Renine-Angiotensine) facilite la liberation de noradrenaline neuronale par l'intermediaire de l'enzyme de conversion.Parmi les nouvelles generations de medicaments anti-hypertension figurent les Inhibiteurs de l'enzyme de conversion.
- l'angiotensine n (système Renine-Angiotensine) facilite la liberation de noradrenaline neuronale par l'intermediaire de l'enzyme de conversion.Parmi les nouvelles generations de medicaments anti-hypertension figurent les Inhibiteurs de l'enzyme de conversion.
- Les giucocorticoïdes potentialisent les effets des cathecolamines par elevation du nombre de recepteurs et de leur affinité.
- L'hyperthyroïdisme est accompagné d'une augmentation du nombre de recepteurs betaadrenergiques.
n existe aussi des modifications de recepteurs dans differentes pathologies: - L'asthme : hyporeactivité beta-adrenergique par diminution du nombre et de l'affinité des recepteurs beta adrenergiques au niveau bronchique.
- La Maladie de Parkinson: est due à une deficience dopaminergique au niveau de la substance noire (Substantia Nigra) dont les cellules supportent les recepteurs D1 de la dopamine.Les neuroleptiques utilisés dans certaines psychoses dont la schizophrenie,bloquent ces recepteurs D1 et-provoquent des syndromes comparables au Parkinson.
- La chorée de Huntington,maladie transmise genetiquement et dont le gène vient tout juste d'être localisé,est due à un deficit du nombre de recepteurs muscariniques.
- La Maldie d'Alzheimer: les recepteurs 5HT1 et 5HT2 de la serotonine ainsi que les recepteurs al-adrenergiques sont diminués au niveau du cortex et de l'hippocampe ainsi que les recepteurs D2 de la dopamine mais pas les recepteurs D1.Les recepteurs a 2 adrenergiques sont diminués dans le noyau basal (Nucleus basalis).Lrecepteurs du GABA sont diminués dans certaines regions corticales et 50% des recepteurs centraux de la somatostatine,ont disparu ainsi que les recepteurs des acides aminés excitateurs decrits plus haut dans le chapitre des recepteurs à site Tyrosine Kinase.
-Les Maladies cardio-vasculaires : Lefkowitz et al.(New England Journal ofMed.310: 15701579,1984) ont demontré avec elegance l'evolution des recepteurs Beta-adrenergiques dans l'insuffisance cardiaque : leur diminution initiale est la cause primaire de la maladie et plus tard leur augmentation serait alors un des mecanismes secondaires de compensation.Beaucoup plus tard leur disparition entraine la non-reactivité aux medicaments,ce qui explique les decès des insuffisants cardiaques en phase terminale.
Mitchel (Renal adrenergic receptors alterations,FASEB J.3 : 139-144,1989) a mis en evidence l'augmentation du nombre de recepteurs a-post synaptiques vasculaires dans le rein,responsable de l'hypertension arterielle essentielle ou primaire .
De Crée et al. (Drugs, 36 (Supplem.l) : 87-91, 1988) a demontré que l'hyperagregabilité plaquettaire responsable de troubles circulatoires arteriels,est due à une augmentation importante des recepteurs S2 de la serotonine au niveau de ces plaquettes.
Les modifications directes de recepteurs provoquées par un traitement pharmacologique: deux exemples:
- Les antidepresseurs tricycliques en administration permanente,diminuent le recaptage des monoamines (adrenaline,noradrenaline,dopamine,serotonine) qui se retrouvent alors à un taux elevé dans le système nerveux central : diminution progressive des recepteurs beta-adrenergiques
- Les opiacés,en agissant à repetition sur leurs recepteurs,entrainent une inhibition de l'adenylate-cyclase (Thomas et Hoffman,trends Pharmacol.sci.8 : 308-311,1987) - Les modifications indirectes: exemple des benzodiazepines : elles se fixent sur les recepteurs
GABA-A et n'en diminuent ni le nombre ni l'affinité aux benzodiazepines.Par contre,l'affinité aux GABA s'en trouve considerablement reduite avec des effets electrophysiologiques importants dont l'ouverture des canaux Chlore des membranes cellulaires (Gallager et al.EurJ.Pharmacol.98: 159-160, 1984).
- Les antidepresseurs tricycliques en administration permanente,diminuent le recaptage des monoamines (adrenaline,noradrenaline,dopamine,serotonine) qui se retrouvent alors à un taux elevé dans le système nerveux central : diminution progressive des recepteurs beta-adrenergiques
- Les opiacés,en agissant à repetition sur leurs recepteurs,entrainent une inhibition de l'adenylate-cyclase (Thomas et Hoffman,trends Pharmacol.sci.8 : 308-311,1987) - Les modifications indirectes: exemple des benzodiazepines : elles se fixent sur les recepteurs
GABA-A et n'en diminuent ni le nombre ni l'affinité aux benzodiazepines.Par contre,l'affinité aux GABA s'en trouve considerablement reduite avec des effets electrophysiologiques importants dont l'ouverture des canaux Chlore des membranes cellulaires (Gallager et al.EurJ.Pharmacol.98: 159-160, 1984).
- Plusieurs mecanismes peuvent être impliqués dans les variations de recepteurs : exemple:
- la reponse secretoire de la medullo-surrenale à la stimulation nicotinique : reduction progressive de la secretion de cathecolamines par les cellules chromaffines par desensibilisation des recepteurs nicotiniques.
- la reponse secretoire de la medullo-surrenale à la stimulation nicotinique : reduction progressive de la secretion de cathecolamines par les cellules chromaffines par desensibilisation des recepteurs nicotiniques.
- Les experiences recentes montrent que toutes les etapes du mecanisme stimulationsecretion peuvent en fait participer à la desensibilisation des cellules.(Marley ,Trends
Pharmacol;Sci. 9: 102-lOi, 1988) - Les syndromes de sevrage:
On admet generalement qu'un traitement diminuant la stimulation d'un recepteur,est susceptible d'entrainer une hypersensibilité.Pour des traitements courts,ces perturbations sont en general reversibles.par contre dans les traitements de longue durée,la modifications des transmissions entraine des effets indesirables et difficilement reversiblesDeux exemples::
- Le propanolol (Beta-bloquant) au long cours augmente le nombre de recepteurs beta adrenergiques dont la stimulation chronique entrain leur desensibilisation par phosphorylation par les proteines kinases (qui ne phosphorylent que les recepteurs activés,c'est à dire ceux en contact avec le propanolol).Or la desensibilsation des recepteurs est synonyme-d'hyperreactivité (Christine Capdeville et Barbara F.Roth-Schechter,Pharmacol.Molecul. Ed.Medsi/McGraw
Hill,Chap.24,page 506, 1990): plusieurs cas d'angor et d'infarctus du myocarde ont été observés à la suite de l'arrêt brutal d'un traitement de longue durée par le propanolol.
Pharmacol;Sci. 9: 102-lOi, 1988) - Les syndromes de sevrage:
On admet generalement qu'un traitement diminuant la stimulation d'un recepteur,est susceptible d'entrainer une hypersensibilité.Pour des traitements courts,ces perturbations sont en general reversibles.par contre dans les traitements de longue durée,la modifications des transmissions entraine des effets indesirables et difficilement reversiblesDeux exemples::
- Le propanolol (Beta-bloquant) au long cours augmente le nombre de recepteurs beta adrenergiques dont la stimulation chronique entrain leur desensibilisation par phosphorylation par les proteines kinases (qui ne phosphorylent que les recepteurs activés,c'est à dire ceux en contact avec le propanolol).Or la desensibilsation des recepteurs est synonyme-d'hyperreactivité (Christine Capdeville et Barbara F.Roth-Schechter,Pharmacol.Molecul. Ed.Medsi/McGraw
Hill,Chap.24,page 506, 1990): plusieurs cas d'angor et d'infarctus du myocarde ont été observés à la suite de l'arrêt brutal d'un traitement de longue durée par le propanolol.
- La clonidine,antihypertenseur à action centrale,stimule les recepteurs 2 bullaires: abaisse la pression arterielle par diminution du tonus sympathique.Lors de l'arrêt du traitement,apparait une forte labilité de la tension arterielle: le traitement avait entrainé une augmentation du nombre des recepteurs post synaptiques au niveau bullaires l'arrêt du traitement,la disparition de la clonidine est plus rapide que la synthèse de l'adrenaline,et les recepteurs liberés de tout contrôle : la tension arterielle passe d'un maximum à un minimum en très peu de temps.
- Le recepteur de l'alcool au niveau du cervelet vient d'être identifié: son activation par l'alcool est responsable des troubles de l'equillEre,et quand elle devient chronique,le recepteur devient insensibilisé,donc hyperreactif,ce qui explique les troubles et les grosses difficultés du sevrage des ethyliques.La decouverte de ce recepteur est importante : il est possible de le moduler par des molecules mimant les molecules d'alcool pour aider au sevrage mais il est permis aussi d'entrevoir un test d'alcoolemie simple à partir d'une goutte de sang prelevée à un doigt.
La description de ces dosages qualitatifs,semi-quantitatifs ou quantitatifs de ligands ou de leurs recepteurs est loin d'être limitative.D'innombrables facteurs hematopoïetiques,de cytokines,de facteurs de croissance,de peptides,d'acides aminés sont decouverts tous les jours et leur rôle precisé,leur gène cloné et produit.Leurs recepteurs les precedent ou les suivent de très peu.
Ensemble,ils elargissent considerablement les perspectives de la biologie en general,de la medecine,du diagnostic mais aussi de la therapeutique,en aidant à mieux comprendre les mecanismes cellulaires.
Claims (33)
1. Dispositif pour la determination qualitative,semi-quantitative et quantitative rapide de la presence d'une substance,dans un fluide,du type comprenant une zone de reaction contenant un reactif specifique de cette substance,notemment un recepteur cellulaire si la substance recherchée est un ligand,un ligand si la substance recherchée est un recepteur,destiné à reagir avec cette substance en emettant un signal vers une seconde zone destinée à amplifier ce signal,et une troisième zone destinée à reveler le signal de la première zone amplifié dans la seconde,lequel dispositif est caractérisé en ce qu'il comporte,en combinaison::
- un filtre (A) qui reçoit l'echantillon à tester
- une première zone de reaction (B) destinée à être associée à au moins un reactif apte à reconnaître la substance recherchée eventuellement contenue dans le dit echantillon
- une membrane (M1) impermeable,à lyse programmée par les fluides de l'echantillon,destinée à stopper temporairement la migration des fluides de l'echantillon au niveau de (B) pour laisser le temps aux reactions de se faire complètement en (B)
- une deuxième zone de reaction (C) distincte de la première et au moins temporairement isolée de celle-ci par la membrane (M1) susdite,comprenant des reactifs inactifs ou rendus inactifs aptes à devenir actifs si un signal de liaison d'un ligand avec son recepteur provient de la première zone (B)
- une membrane (M2) impermeable,à lyse programmée par les fluides de l'echantillon,identique à (M1) et destinée à stopper temporairement la migration des fluides de l'echantilon au niveau de (C) pour laisser le temps aux reactions de se faire comletement en (C)
- une troisième zone de reaction (D) au moins temporairement isolée de la deuxième zone (C) susdite par la deuxième membrane (M2) susdite, qui contient des moyens de revelation de la reaction qui s'est eventuellement produite dans la première zone (B) et amplifiée dans la deuxième zone (C).
2. Dispositif selon la revendication 1,caracterisé en ce que les moyens de permeabilisation d'une ou des membrane(s) (M1 et M2) sont independants de la membrane concernée.
3. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 et 2,caractérisé en ce que les moyens de permeabilisation d'une ou des membrane(s)(Mi et M2) sont incorporés à la membrane concernée.
4. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la première zone de reaction (B) est une membrane dans laquelle sont fixés des reactifs dont l'un au moins, correctement orienté (recepteur,notemment) correspond à la substance que l'on cherche à detecter (ligand,notemment).
5. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 4,caractérisé en ce que la seconde zone (C) est constituée par un support insoluble poreux sur lequel sont deposés des reactifs dont l'un au moins,est fixé,correctement orienté,(ligand,notemment) et correspond à la substance que l'on cherche à detecter (recepteur membranaire, notemment).
6. Dispositif selon la revendication 5,caractérisé en ce que la zone (C) comprend des vesicules proteolipidiques bicouches,dans lesquelles est encapsulée un substance chromogène propre à être libérée si l'un des reactifs presents dans cette zone (C) devient activé.
7. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 5,caractérisé en ce que la troisième zone (D) est constituée par un support insoluble poreux contenant les moyens de revelation de la liaison eventuelle du ligand à son recepteur en (B) amplifiée en (C)
8. Dispositif selon la revendication 7,caractérisé en ce que cette troisième zone (D) contient un substrat chromogène lorsqu'il est prevu que la lecture de la reaction doit se faire par colorimetrie.
9. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 8,caractérisé en ce que en ce que la troisième zone (C) du dit dispositif est associée à un appareillage de quantification connu en lui même,tel que spectrophotometre,RIA,entre autres
10. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 9,caractérisé en ce que en ce que le filtre,les zones de reactions susdites et les membranes à lyse programmée,sont superposées pour former un etage superieur contenant le filtre (A), la première zone (B) de reaction et une première membrane (M1) à lyse programmée,un etage median contenant la deuxième zone de reaction (C) et la seconde membrane à lyse programmée (M2) et un etage inferieur contenant la zone de revelation.
11. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 10,caractérisé en ce que le dispositif comprend,en cas de dosages semi-quantitatifs,au dessus de la première zone (B) de reaction,une zone de reaction (B0) destinée à fixer et neutraliser une certaine quantité seulement de substance recherchée,quantité qui correspond à la normale maximum tolérée dans l'echantillon, laissant la substance excedentaire,si elle existe,reagir avec le reste du dispositif tel qu'il est decrit plus haut
12.Procédé de determination qualitative et quantitative rapide de la presence d'un ligand,dans un fluide,caracterisé en ce qu'au cours d'une première etape,un echantillon du fluide à analyser est mis en contact avec un reactif,notemment tel qu'un recepteur,dans une zone temporairement isolée des zones dans lesquelles ont lieu les etapes ulterieures du procèdé,pendant un temps suffisant pour permettre à la reaction ligand-recepteur de se produire,au bout duquel l'isolement de la zone dans laquelle a eu lieu la dite reaction,est rompu pour permettre au signal emis par la liaison ligand-recepteur d'activer, au cours d'une deuxième etape,des reactifs jusque là inactifs dans une seconde zone temporairement isolée de la zone qui lui fait suite,après quoi l'isolement de cette deuxième zone est rompu pour permettre au produit final qui y a été activé,d'entrer en contact au cours de la troisième etape du procédé,avec des moyens de revelation de la presence ou de I'absence du ligand que l'on cherche à detecter.
13.Procédé selon la revendication 12,caractérisé en ce que le recepteur (R1) fixé dans la membrane (B),produit en cas de liaison avec un ligand eventuel contenu dans l'echantillon,une activation de reactifs (R2) egalement contenus dans cette membrane (B) (Proteines G notemment),lesquels activent à leur tour des reactifs deposés en (C) aboutissant à la production d'lm produit final activé qui provoque la coloration d'un substart chromogène en (D).
14.Procédé selon la revendication 12,caractérisé en ce qu'une membrane (B0),en cas de dosages semi-quantitatifs,au cours de la première etape du procédé,piège une certaine quantité seulement du ligand à doser,la quantité excedentaire de ligand,si elle existe,reagissant avec le reste du dispositif selon le procédé revendiqué en 12.
15.Procédé selon la revendication 14,caractérisé en ce que l'agent de piegeage en (130) est un recepteur identique à celui fixé en (B) mais seulement en quantité equimolaire à la quantité de ligand à pieger correspondant au taux maximal admis dans l'echantillon à analyser,et ne produisant vers (C) aucun signal au contact de cette fraction de ligand.
16.Procédé selon la revendication 14,caractérisé en ce que l'agent de piegeage en (B0) est un anticorps specifique du ligand à doser,fixé en quantité telle qu'elle ne piège au cours d'une première etape du procédé,qu'une certaine quantité de ligand correspondant au taux maximal admis dans l'echantillon.
17.Procédé selon la revendication 14,caractérisé en ce que l'agent de piegeage est une substance quelconque libre ou fixée en (B0),apte à priver une certaine quantité seulement de ligand,de son pouvoir de liaison au recepteur fixé en (B)
18.Procédé selon la revendication 13,caractérisé en ce que l'addition dans la même membrane (B) d'un second type de recepteur,prioritaire mais emettant un autre signal ou pas de signal du tout,module l'activité du premier type de recepteur,n'aboutissant à une revelation en (D) que si ce second type de recepteur est completement saturé,ce qui conduit à un autre procédé de dosage semi-quantitatif
19.Procédé de determination qualitative et quantitative rapide de la presence d'un recepteur dans un fluide,caracterisé en ce qu'au cours d'une première etape,un echantillon du fluide à analyser est mis en contact avec un ligand correspondant au recepteur à doser,fixé et convenablement orienté,dans une première zone (C) temporairement isolée des zones dans lesquelles ont lieu les etapes ulterieures du procédé,pendant un temps suffisant pour permettre au recepteur de se fixer au ligand et produire le signal d'activation de la Proteine G egalement placée en (C),puis de l'activation de reactifs inactivés,temps au bout duquel l'isolement de cette zone (C) est rompu pour permettre au produit activé final eventuel,d'entrer en contact au cours d'une seconde etape,avec des moyens de revelation de la presence ou de l'absence du recepteur recherché.
20.Procédé selon la revendication 19,caractérisé en ce qu'en cas de dosages semi-quantitaifs de recepteurs,une certaine quantité seulement de recepteurs, correspondant au taux maximal admis dans l'echantillon,est piegée au cours d'une première etape par une première zone (B0),la quantité excedentaire de recepteurs,si elle existe,reagissant au cours d'etapes ulterieures avec le reste du dispositif selon le procédé revendiqué en 18.
21.Procédé selon la revendication 20,caractérisé en ce que l'agent de piegeage d'une certaine quantité seulement de recepteurs,est un ligand correspondant à ce recepteur,et fixé en (B0) seulement en quantité equimolaire au recepteur à pieger.
22.Procédé selon la revendication 20,caractérisé en ce que l'agent de piegeage d'une certaine quantité seulement de recepteurs, est un anticorps specifique de ce recepteur,et fixé en (B0) seulement en quantité equimolaire au recepteur à pieger.
23.Procédé selon la revendication 20,caractérisé en ce que l'agent de piegeage d'une certaine quantité seulement de recepteurs,est une substance chimique quelconque libre ou fixée en (B0) et apte à priver cette quantité seulement de recepteurs de leur pouvoir de laison au ligand en (C) et donc à activer les reactifs en (C).
24.Procédé selon l'une quelconque des revendications 12 à 23,caractérisé en ce que le produit final activé en (C) est totalement independant dans le temps-,de la liaison ligandrecepteur,les reactions induites par cette liaison se poursuivant en s'amplifiant même si le ligand n'est plus en liaison avec son recepteur.
25.Procédé selon l'une quelconque des revendications 12 à 23,caractérisé en ce que la quantité de produit final activé en (C) est egale à la quantité de ligand ou de recepteur dosé multipliée par un facteur d'amplification important dû au fait qu'une molecule de reactif activé active à son tour des milliers d'autres molecules de reactifs par seconde et ainsi de suite,au contraire d'autres procédés (immunologiques,notemment) où la quantité de signal est strictement egale à la quantité de substance recherchée.
26.Procédé selon l'une quelconque des revendications 12 à 25,caractérisé en ce que plusieurs types de recepteurs emettant le même signal en cas de liaison avec leur ligand respectif,sont fixés dans un même dispositif de pré-screening,pour detecter la presence de ces ligands: si au moins un de ces ligands est present dans l'echantillon,il se lie à son recepteur propre qui va activer seul les reactifs en (C) et aboutir au produit final activé et la revelation en (D):la : la lecture de ce signal informe qu'au moins un des ligands recherchés est present et qu'il faudra proceder à un dosage plus specifique de chaque ligand
27.Procédsselon l'une quelconque des revendications 12 à 25,caractérisé en ce que plusieurs types de ligands sont fixés dans le même dispositif de pré-screening,pour detecter la presence de leur reçepteur: si au moins un des recepteurs est present dans l'echantillon,sa
liaison avec son ligand propre declenche la csacade d'activations pour aboutir au produit final
activé et un signal de revelation en (D) qui informe qu'au moins un des recepteurs recherchés
est present dans l'echantillon et qu'il faudra proceder à un dosage plus specifique de chaque recepteur.
28. Procédé de detection rapide de la presence d'un allergène dans un fluide,caractérisé
en ce qu'au cours d'une première etape,un echantillon du fluide à analyser est mis en contact avec une Immunoglobuline de type IgE fixée par son extremité Fc à un recepteur specifique
Fc~RI,dans une zone temporairement isolée des zones dans lesquelles ont lieu les etapes ulterieures du procédé,pendant un temps suffisant pour permettre au complexe allergène + IgE + recepteur Fc RI de l'IgE d'emettre un signal d'activation des reactifs en (C),temps au bout duquel l'isolement de cette zone (C) est rompu pour permettre au produit final activé d'entrer au contact,au cours d'une seconde etape,avec des moyens de revelations en (D)
29.Procédé selon la revendication 28 caractérisé en ce que plusieurs types d'immunoglobulines E correspondant à plusieurs types d'allergènes differents,fixées chacune à son recepteur FcEU propre par l'extremité Fc,reconnaissent chacune son allergène eventuellement present dans l'echantillon à analyser,et declenchant par l'intermediafre du dit recepteur un signal d'activation des reactifs en (C) : informant qu'au moins un des allergènes est present dans l'echantillon à tester.
30. Procédé de detection rapide de l'existence d'allergie chez un sujet,caracterisé en ce qu'au cours d'une première etape,les plasmocytes contenus dans l'echantillon sont mis en contact avec un allergène fixé dans une zone temporairement isolée des zones dans lesquelles ont lieu les etapes ulterieures,pour permettre à cet allergène de se lier à l'immunoglobuline E eventuellement presente,liée aux recepteurs FcRI des plasmocytes de l'echantillon: cette triple liaison Recepteur + IgE + allergène declenche,par l'intermediaire du recepteur,les diverses activations et plus tard,au cours d'une seconde etape,le signal de revelation en (D).Si l'echantillon provient d'un sujet non allergique,il n'existe pas d'IgE specifique de l'allergène fixé,et ce dernier ne peut transmettre aucun signal au recepteur et donc aucun signal en (D).
31. Procédé selon la revendication 30,caractérisé en ce < que plusieurs types d'allergènes sont fixés,dans le cadre d'un pré-screening,dans le dispositif en (C) et que si les plasmocytes du sujet supportent une categorie d'IgE specifique d'au moins un des allergènes,il y a activation des reactifs en (C) et plus tard signal en (D) iriformant que le sujet a au moins une allergie parmi toutes celles definies à l'avance dans ce dispositif,et qu'il faudra proceder à une recherche d'allergie plus specifique de chaque allergène.Si le sujet n'est allergique à aucun des allergènes considérés,ses plasmocytes ne supportent aucune IgE specifique de ces allergènes et le contact avec le dispositif ne produit aucun signai.
32. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 caracterisé en ce que la migration des fluides se fait sur le même plan horizontal d'un point à un autre en migrant à travers toutes les zones decrites dans les revendications I à 11.
33. Dispositif selon l'une quelconque des revendicatiqns 1 à 11 caractérisé en ce que la membrane (B) est une vesicule proteolipidique ou synthetique,temporairement fermée supportant le recepteur ou le ligand à sa surface externe,contenant les reactifs de la zone (C) enfermés et les liberant en cas de contact ligand-recepteur pour activer d'autres reactifs ou colorer un substrat;l'ensemble du dispositif etant en solution ou à sec.
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|---|---|---|---|
| FR9011595A FR2666898A1 (fr) | 1990-09-18 | 1990-09-18 | Dispositif et procede de dosage rapide de recepteurs membranaires ou de leurs ligands. |
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| Publication Number | Publication Date |
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| FR2666898A1 true FR2666898A1 (fr) | 1992-03-20 |
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| FR9011595A Withdrawn FR2666898A1 (fr) | 1990-09-18 | 1990-09-18 | Dispositif et procede de dosage rapide de recepteurs membranaires ou de leurs ligands. |
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| Country | Link |
|---|---|
| FR (1) | FR2666898A1 (fr) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| WO1995006252A1 (fr) | 1993-08-25 | 1995-03-02 | Societe Diagnostica-Stago | Procede d'identification d'une substance immunologique au moyen d'un systeme multimembranaire |
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| US10656059B2 (en) | 2018-03-07 | 2020-05-19 | Alcala Pharmaceutical, Inc. | Method for qualitative and quantitative multiplexing of drug analytes from biological samples |
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1990
- 1990-09-18 FR FR9011595A patent/FR2666898A1/fr not_active Withdrawn
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