FR2659740A1 - METHOD FOR CONTROLLING THE DILUTION AND CONTAMINATION OF HIGH DILUTION SOLUTIONS. - Google Patents

Abstract

The object of the invention is a process for monitoring the dilution and contamination of a solution of given diluteness in which: before any dilution n, where n is a whole number greater than 0, a marker substance soluble in the solution and not interfering therewith is introduced into the solution of dilution n-1, while the marker substance has the property of disappearing between dilution n-1+m and n+m, where m is the number of dilutions in which the marker substance is present and is comprised particularly between 5 and 8; the marker substance is titred in at least once after dilution n; the concentration of the marker substance obtained is compared with that calculated after dilution. This process facilitates the qualitative and quantitative monitoring of the dilutions.

Description

PROCEDE DE CONTROLE DE LA DILUTION ET DE LA
CONTAMINATION DE SOLUTIONS A HAUTE DILUTION
L'invention a pour objet un procédé de contrôle de la dilution et de la contamination de solutions à haute dilution, destinées notamment à la préparation de médicaments homéopathiques.METHOD FOR CONTROLLING DILUTION AND
CONTAMINATION OF HIGH-DILUTION SOLUTIONS
The invention relates to a method for controlling the dilution and contamination of high dilution solutions, especially for the preparation of homeopathic medicines.

Par solution à haute dilution, on désigne celles qui sont obtenues à partir d'une substance initiale diluée un nombre suffisant de fois dans une solution de dilution pour que la substance active soit inférieure à environ 10-10 moles/l, ou ne soit plus présente. High dilution solutions are those obtained from an initial substance diluted a sufficient number of times in a dilution solution so that the active substance is less than about 10-10 mol / l, or no longer present.

I1 n'existe à ce jour, aucun procédé assurant d'une part que la dilution est correcte, et d'autre part qu'il n'y a pas de contamination pendant la préparation des solutions à haute dilution. To date, no method exists to ensure that the dilution is correct, and secondly that there is no contamination during the preparation of high dilution solutions.

Or, la préparation des solutions à haute dilution est un stade particulièrement important de la fabrication des médicaments homéopathiques. Etant donné les quantités infimes de substance active mises en oeuvre, il est indispensable d'éviter la présence de toute impureté ou pollution. En effet, si une impureté quelconque se glissait à l'occasion d'une dilution, celle-ci prendrait petit à petit au cours des dilutions ultérieures une importance presque égale à la substance active elle-même et pourrait alors contrecarrer son effet thérapeutique. C'est dans cette optique que certains laboratoires préparent les dilutions dans une enceinte à atmosphère rigoureusement purifiée et contrôlée.Or, à ce jour, on ne s'est encore jamais posé la question de contrôler qualitativement et quantitativement les dilutions obtenues à partir d'une solution initiale ainsi que la présence éventuelle de contaminants. Or, l'invention a pour objet de poser le problème et d'y apporter une solution. However, the preparation of high dilution solutions is a particularly important stage in the manufacture of homeopathic medicines. Given the minute amounts of active substance used, it is essential to avoid the presence of any impurity or pollution. Indeed, if any impurity creeps on the occasion of a dilution, it would take little by little during the subsequent dilutions an importance almost equal to the active substance itself and could then counteract its therapeutic effect. It is with this in mind that some laboratories prepare dilutions in an enclosure with a rigorously purified and controlled atmosphere. However, to date, the question of qualitatively and quantitatively controlling the dilutions obtained from an initial solution as well as the possible presence of contaminants. Now, the object of the invention is to pose the problem and to provide a solution thereto.

Dans l'hypothèse où le problème du contrôle de la qualité des dilutions aurait été posé (ce qui n'a jamais été fait), on aurait pu penser à contrôler les dilutions en dosant directement la substance active, mais, à cet égard, il faut rappeler que les méthodes biochimiques habituelles ne permettent pas de doser des quantités inférieures à 10-6M. Par des systèmes très sensibles et selon les substances actives à doser, il peut être possible de détecter lesdites substances actives jusqu'à la concentration de 10-12M. In the event that the problem of the quality control of the dilutions has been raised (which has never been done), one could have thought of controlling the dilutions by directly dosing the active substance, but in this respect it It should be remembered that the usual biochemical methods do not allow to dose amounts lower than 10-6M. By very sensitive systems and according to the active substances to be assayed, it may be possible to detect said active substances up to the concentration of 10-12M.

Si un dosage jusqu'à l012M est possible pour certaines substances actives, par exemple les immunoglobulines pour lesquelles on dispose d'anticorps, il ne l'est pas pour la plupart des substances utilisées en thérapeutique. De plus, le dosage direct de la substance active nécessiterait la mise au point et la mise en oeuvre d'un dosage spécifique pour chacune des substances, ce qui impliquerait une méthodologie quasi impossible à mettre en oeuvre à l'échelle industrielle, étant donné qu'il faudrait doser directement 1000 ou 2000 produits. If a dosage up to 1012M is possible for certain active substances, for example immunoglobulins for which antibodies are available, it is not available for most substances used in therapeutics. In addition, the direct dosage of the active substance would require the development and implementation of a specific assay for each of the substances, which would imply a methodology that is almost impossible to implement on an industrial scale, since It would be necessary to directly dose 1000 or 2000 products.

L'invention a pour objet un procédé de contrôle qualitatif des solutions à haute dilution. The subject of the invention is a method for the qualitative control of high dilution solutions.

L'invention a également pour objet un procédé de contrôle quantitatif des solutions à haute dilution. The invention also relates to a quantitative control method for high dilution solutions.

L'invention a pour objet un procédé de contrôle de la contamination des solutions à haute dilution. The invention relates to a method for controlling the contamination of high dilution solutions.

Ces différents aspects de l'invention sont réalisés par un procédé pour le contrôle de la dilution et de la contamination d'une solution de dilution déterminée provenant d'une solution initiale contenant une substance active, procédé dans lequel - la solution initiale subit des dilutions successives, la première dilution de la solution initiale étant obtenue par prélèvement d'une fraction ou de la totalité de la solution initiale, et le mélange de cette fraction ou de la totalité de la solution initiale dans une solution de dilution, ce qui donne la solution de première dilution, la deuxième dilution de la solution initiale étant obtenue par prélèvement d'une fraction ou de la totalité de la solution de première dilution, et le mélange de cette fraction ou de la totalité de la solution de première dilution dans une solution de dilution, pour donner la solution de deuxième dilution et ainsi de suite, jusqu'à la solution de la dernière dilution, - chacune des solutions allant de la solution de première dilution à la solution de dernière dilution constituant une solution de dilution déterminée, - chaque solution de dilution déterminée subit une agitation vigoureuse, - les dilutions successives étant telles qu'au moins une des solutions de dilution déterminée contient la substance active en quantité inférieure à 10-10 moles, avantageusement inférieure à 10-12 moles/l et de préférence inférieure à 10-14 moles/l, ou ne contient plus de substance active, ladite solution de dilution déterminée présentant encore une activité à des dilutions supérieures à celle à laquelle la substance active a disparu, caractérisé en ce que:: - on introduit, avant au moins l'une quelconque des dilutions n, n étant un nombre entier supérieur à 0, dans la solution de dilution n-l une substance témoin soluble dans ladite solution et n'interférant pas avec la solution de dilution n-l, et la substance témoin présentant la propriété de disparaître entre la dilution n - 1 + m et n + m, m étant le nombre de dilutions où est présente la substance témoin, et étant compris notamment de 5 à 8, - on dose au moins une fois la substance témoin après la dilution n, de préférence au moins une fois dans l'intervalle allant de la dilution n à la dilution n - 1 + m et au moins une fois dans l'intervalle allant de la dilution n + m à la dilution n + m + y, y étant la plage de dilution libre de substance témoin et étant avantageusement compris de 3 à 5, - et de la dilution n à la dilution n - 1 + m, on compare la valeur de la concentration de la substance témoin obtenue et la valeur de la concentration de la substance témoin calculée d'après la dilution, ce qui permet de contrôler quantitativement les dilutions, et - de la dilution n + m à la dilution n + m + y, on vérifie qu'il n'y a plus de substance témoin, ce qui permet de contrôler d'une part la qualité des dilutions et d'autre part l'absence de contamination. These different aspects of the invention are realized by a method for controlling the dilution and contamination of a specific dilution solution from an initial solution containing an active substance, in which process the initial solution is diluted the first dilution of the initial solution being obtained by taking a fraction or all of the initial solution, and mixing this fraction or the totality of the initial solution in a dilution solution, which gives the first dilution solution, the second dilution of the initial solution being obtained by taking a fraction or all of the first dilution solution, and mixing that fraction or the totality of the first dilution solution in a solution of dilution, to give the second dilution solution and so on, until the solution of the last dilution, - each solutions ranging from the first dilution solution to the last dilution solution constituting a determined dilution solution, - each determined dilution solution undergoes a vigorous stirring, - the successive dilutions being such that at least one of the determined dilution solutions contains the active substance in an amount of less than 10-10 mol, advantageously less than 10-12 mol / l and preferably less than 10-14 mol / l, or no longer contains active substance, said determined dilution solution still having an activity at dilutions higher than that at which the active substance has disappeared, characterized in that before at least one of the dilutions n is introduced, n being an integer greater than 0, in the dilution solution nl a control substance soluble in said solution and not interfering with the dilution solution nl, and the control substance having the property to disappear between the dilution n - 1 + m and n + m, m being the number of dilutions where the control substance is present, and being comprised in particular of 5 to 8, the control substance is dosed at least once after dilution n, preferably at least once in the range from dilution n to dilution n - 1 + m and at least once in the range from dilution n + m to dilution n + m + y where y is the free dilution range of the control substance and is advantageously from 3 to 5, and from the dilution n to the n-1 + m dilution, the value of the concentration of the control substance obtained is compared with the value the concentration of the control substance calculated on the basis of the dilution, which makes it possible to control the dilutions quantitatively, and - from the dilution n + m to the dilution n + m + y, one verifies that there are no longer any of control substance, which makes it possible to control on the one hand the quality of the dilutions and on the other hand the absence of contamination.

L'invention réside dans l'utilisation, comme substance témoin, d'une substance d'une part qui est facilement détectable et d'autre part qui est détectable jusqu'à ce qu'elle disparaisse. De façon avantageuse, on utilise une enzyme détectable par son activité chromogène. The invention lies in the use, as a control substance, of a substance which is easily detectable and which is detectable until it disappears. Advantageously, an enzyme detectable by its chromogenic activity is used.

La présence de la substance témoin dans les premières dilutions et son absence dans les dilutions extrêmes, (c'est-à-dire dilutions supérieures à la quatorzième dilution et notamment à la vingt-troisième dilution) qui sont néanmoins actives, affirment la relation entre le phénomène observé et le mécanisme des hautes dilutions. On part d'une solution initiale contenant une substance active et on la dilue une première fois à l'aide d'une solution de dilution, ce qui conduit à une . solution de première dilution, laquelle est à son tour diluée, pour donner une solution de deuxième dilution, et ainsi de suite pour donner les dilutions successives, jusqu'à la solution de dernière dilution. Chacune des dilutions conduit à une solution de dilution déterminée. The presence of the control substance in the first dilutions and its absence in the extreme dilutions, (ie dilutions greater than the fourteenth dilution and in particular the twenty-third dilution) which are nonetheless active, affirm the relationship between the phenomenon observed and the mechanism of high dilutions. Starting from an initial solution containing an active substance and diluting it a first time with the aid of a dilution solution, which leads to one. first dilution solution, which in turn is diluted, to give a second dilution solution, and so on to give the successive dilutions, to the last dilution solution. Each of the dilutions leads to a specific dilution solution.

Le procédé de l'invention est tel qu'il permet de contrôler à chacune des dilutions (qui donne lieu à une solution de dilution déterminée), si la dilution a été correctement faite et s'il n'y a pas de contamination. Une dilution incorrecte pourrait, par exemple, consister en l'oubli d'une dilution antérieure ou en l'introduction d'une goutte, contenant par exemple la substance active à la dernière dilution détectée, ou l'utilisation d'une pipette mal rincée, ce qui à de telles dilutions risque de tout changer. The method of the invention is such that it allows to control at each dilution (which gives rise to a specific dilution solution), if the dilution has been correctly made and if there is no contamination. An incorrect dilution could, for example, consist in forgetting an earlier dilution or introducing a drop, for example containing the active substance at the last dilution detected, or the use of a poorly rinsed pipette. which at such dilutions may change everything.

Le procédé est tel qu'il permet de contrôler chacune des dilutions et lorsque la substance témoin est encore présente, de quantifier la dilution en comparant la quantité théorique calculée de substance témoin et la quantité effectivement trouvée. Lorsqu'il n'y a plus de substance témoin, il n'y a plus non plus de substance active puisque la substance témoin disparaît après la substance active. Après un certain nombre de dilutions on doit s'attendre non seulement à l'absence de substance active, mais aussi à l'absence de substance témoin. The method is such as to control each of the dilutions and when the control substance is still present, to quantify the dilution by comparing the calculated theoretical amount of control substance and the amount actually found. When there is more control substance, there is no more active substance since the control substance disappears after the active substance. After a certain number of dilutions, one must expect not only the absence of active substance, but also the absence of a control substance.

Comme indiqué ci-dessus, les dilutions seront repérées par première dilution, deuxième dilution-, troisième dilution, énième dilution ou encore dilution 1, 2, 3, 4, ... n. De façon habituelle, les dernières dilutions sont les dilutions 30 ou 40 (décimales). As indicated above, the dilutions will be identified by first dilution, second dilution-, third dilution, nth dilution or dilution 1, 2, 3, 4, ... n. Usually, the last dilutions are dilutions 30 or 40 (decimal).

Ces dilutions peuvent être faites selon n'importe quelle échelle, notamment décimale ou centésimale. These dilutions can be made according to any scale, in particular decimal or centesimal.

Dans tout ce qui précède et dans tout ce qui suit, les valeurs chiffrées correspondent, sauf indications contraires, aux dilutions décimales.  In all of the foregoing and in all that follow, the numerical values correspond, unless otherwise indicated, to the decimal dilutions.

Mais, le terme "dilution" peut s'appliquer aux dilutions centésimales. Au fur et à mesure des dilutions, la solution diluée sera telle qu'elle contient 10-10 moles/l, puis 10-12 moles/l, puis une quantité inférieure à 10-14 moles/l. Généralement audelà de cette concentration molaire par litre il n'y a plus de molécules dans la solution, ce qui n'empêche pas ladite solution diluée de présenter encore, et d'une façon tout à fait inattendue, une activité. However, the term "dilution" can be applied to centesimal dilutions. As dilutions proceed, the diluted solution will contain 10-10 mol / l, then 10-12 mol / l and then less than 10-14 mol / l. Generally beyond this molar concentration per liter there are no more molecules in the solution, which does not prevent said diluted solution from still presenting, and quite unexpectedly, an activity.

Dans le procédé de l'invention, on peut introduire la substance témoin avant n'importe quelle dilution, c'est-à-dire dans n'importe quelle solution de dilution déterminée. In the process of the invention, the control substance can be introduced prior to any dilution, i.e. in any given dilution solution.

Par "substance témoin n'interférant pas avec la solution de dilution n - 1" on définit une substance témoin telle que sa présence n'a aucune incidence sur l'activité éventuelle de la solution de dilution n - 1. By "control substance not interfering with the dilution solution n - 1" is defined a control substance such that its presence does not affect the possible activity of the dilution solution n - 1.

Lorsqu'on a introduit la substance témoin à la dilution n - 1 et que l'on procède à une première dilution de la solution de dilution n - 1 contenant la substance témoin, on continue ensuite à diluer jusqu'à ce qu'on atteigne une dilution à laquelle la substance témoin disparaît. Le procédé de l'invention implique au moins un dosage de la substance témoin après la dilution n. Ce dosage a lieu de préférence au moins une fois dans l'intervalle allant de la dilution n à la dilution n - 1 + m, c'est-à-dire au moins une fois de la première dilution de la substance témoin à la dilution à laquelle la substance témoin disparaît. When the control substance is introduced at the n - 1 dilution and the dilution of the n - 1 dilution solution containing the control substance is first diluted, the dilution is continued until a dilution at which the control substance disappears. The method of the invention involves at least one assay of the control substance after dilution n. This assay preferably takes place at least once in the range from dilution n to the n-1 + m dilution, i.e., at least once from the first dilution of the control substance to the dilution. at which the control substance disappears.

Sur l'intervalle allant de la dilution n à la dilution n - 1 + m de la substance témoin, on peut faire en principe un dosage quantitatif puisqu'on peut après chacune des dilutions de n à n - 1 + m doser la substance témoin et la comparer avec la valeur correspondante théorique calculée.  Over the interval from dilution n to the dilution n - 1 + m of the control substance, a quantitative determination can be made in principle since, after each dilutions from n to n - 1 + m, the control substance can be assayed. and compare it with the calculated theoretical corresponding value.

Lorsque la substance témoin est telle qu'elle n'est plus présente dans aucune solution de dilution déterminée, il est également avantageux de faire un dosage par exemple sur les trois dilutions qui suivent celle à partir de laquelle la substance témoin a disparu, dilution pendant laquelle on n'ajoute pas de substance témoin. When the control substance is such that it is no longer present in any given dilution solution, it is also advantageous to make an assay, for example, on the three dilutions which follow that from which the control substance has disappeared, dilution during no control substance is added.

Ceci permet de confirmer qu'il n'y a pas eu de contamination par rapport à la dilution à laquelle on constate qu'il n'y a plus de substance témoin. Dans ce cas, il ne s'agit plus d'un contrôle quantitatif mais d'un contrôle qualitatif permis par l'absence de la substance témoin, la subtance témoin se comportant alors comme un témoin négatif. This confirms that there has been no contamination with respect to the dilution at which it is found that there is no longer any control substance. In this case, it is no longer a quantitative control but a qualitative control allowed by the absence of the control substance, the control substance then behaving as a negative control.

Selon un autre mode de réalisation préféré de l'invention, on introduit au moins deux fois la substance témoin, l'une des deux introductions de la substance témoin étant effectuée dans la solution de dilution n - 1, la substance témoin disparaissant entre la dilution n - 1 + m et n + m, l'autre introduction est effectuée au plus tôt dans la solution de dilution n + m, et de préférence dans la solution de dilution n + m + y, n étant un nombre entier supérieur à 0, m étant avantageusement compris de 5 à 8, y étant avantageusement compris de 3 à 5. According to another preferred embodiment of the invention, the control substance is introduced at least twice, one of the two introductions of the control substance being carried out in the dilution solution n-1, the control substance disappearing between the dilution n - 1 + m and n + m, the other introduction is carried out at the earliest in the dilution solution n + m, and preferably in the dilution solution n + m + y, n being an integer greater than 0 , m advantageously being from 5 to 8, advantageously being from 3 to 5.

Ce procédé correspond au fait que l'on introduit une première fois la substance témoin dans la solution de dilution n - 1, on dilue jusqu'à l'obtention d'une solution de dilution dans laquelle la substance témoin a disparu et sans ajouter à nouveau de substance témoin avant que celle-ci n'ait disparu, sinon le dosage effectué sur chacune des dilutions de la solution de dilution n à la dilution dans laquelle la substance témoin a disparu n'aurait plus de sens. This method corresponds to the fact that the control substance is first introduced into the dilution solution n-1, diluted to a dilution solution in which the control substance has disappeared and without adding to the control substance before it has disappeared, otherwise the assay performed on each dilution of the dilution solution n to the dilution in which the control substance has disappeared would no longer have any meaning.

On attend donc que la substance témoin ait disparu pour en ajouter à nouveau. On peut ajouter à nouveau de la substance témoin à la dilution qui suit tout de suite celle pour laquelle la substance témoin a disparu, mais de façon avantageuse, on ajoute à nouveau la substance témoin de 2 à 10 dilutions qui suivent la dilution à laquelle la substance témoin a disparu pour la première fois, et avantageusement à partir de la troisième, quatrième ou cinquième dilution qui suit la dilution correspondant à la disparition de la substance témoin. It is expected that the control substance will disappear to add again. The control substance can be added again to the dilution immediately following that for which the control substance has disappeared, but, advantageously, the control substance is added again from 2 to 10 dilutions which follow the dilution at which the control substance disappeared for the first time, and advantageously from the third, fourth or fifth dilution following the dilution corresponding to the disappearance of the control substance.

On peut ainsi répéter le procédé d'introduction de la substance témoin toutes les fois que celle-ci a disparu ou en attendant 3 dilutions à 5 dilutions après la dilution à partir de laquelle la substance témoin a disparu. It is thus possible to repeat the method of introducing the control substance whenever it has disappeared or waiting for 3 dilutions at 5 dilutions after the dilution from which the control substance has disappeared.

En pratique, selon le procédé de l'invention, on peut réintroduire la substance témoin a intervalle régulier, et il suffit par exemple de pouvoir détecter la substance témoin sur 3 ou 4 dilutions, pour montrer que la diminution de la substance témoin est régulière (donc que les dilutions sont correctes) et qu'en dehors des zones où la substance témoin est détectable, il n'y a pas de contamination. In practice, according to the method of the invention, it is possible to reintroduce the control substance at regular intervals, and it suffices, for example, to be able to detect the control substance over 3 or 4 dilutions, to show that the reduction of the control substance is regular ( therefore the dilutions are correct) and outside the areas where the control substance is detectable, there is no contamination.

Selon un mode de réalisation du procédé de l'invention, on introduit la substance témoin pour la première fois dans la solution de dilution n - 1, puis on réintroduit la substance témoin dans la solution de dilution qui suit celle qui correspond à la disparition de la substance témoin introduite dans la dilution n - 1, puis on réintroduit une deuxième fois la substance témoin dans la solution de dilution qui suit celle qui correspond à la disparition de la substance témoin réintroduite et ainsi de suite. According to one embodiment of the method of the invention, the control substance is introduced for the first time into the dilution solution n-1, and then the control substance is reintroduced into the dilution solution which follows that which corresponds to the disappearance of the control substance introduced into the dilution n - 1, then reintroduces a second time the control substance in the dilution solution which follows that which corresponds to the disappearance of the reintroduced control substance and so on.

Selon un autre mode de réalisation du procédé de l'invention, on introduit la substance témoin pour la première fois dans la solution de dilution n - 1, la substance témoin disparaissant entre la dilution n - 1 + m et n + m, m étant compris notamment de 5 à 8, on réintroduit la substance témoin dans la solution de dilution n + m + y, y étant compris de 2 à 10, avantageusement de 3 à 5, et ainsi de suite. According to another embodiment of the method of the invention, the control substance is introduced for the first time into the dilution solution n - 1, the control substance disappearing between the dilution n - 1 + m and n + m, m being including 5 to 8 in particular, the control substance is reintroduced into the dilution solution n + m + y, y being from 2 to 10, advantageously from 3 to 5, and so on.

Selon un autre mode de réalisation on introduit la substance témoin pour la première fois dans la solution de dilution n - 1, puis toutes les m dilutions, m étant compris de 5 à 15, avantageusement de 10 à 15, et avantageusement encore 10 ou 15. According to another embodiment, the control substance is introduced for the first time into the dilution solution n-1, then all the dilutions, m being from 5 to 15, advantageously from 10 to 15, and advantageously still 10 or 15. .

Selon un mode de réalisation avantageux, le procédé de l'invention est tel que - la solution initiale subit des dilutions successives, la première dilution de la solution initiale étant obtenue par prélèvement d'une fraction ou de la totalité de la solution initiale, et le mélange de cette fraction ou de la totalité de la solution initiale dans une solution de dilution, ce qui donne la solution de première dilution, la deuxième dilution de la solution initiale étant obtenue par prélèvement d'une fraction ou de la totalité de la solution de première dilution, et le mélange de cette fraction ou de la totalité de la solution de premiere dilution dans une solution de dilution, pour donner la solution de deuxième dilution et ainsi de suite, jusqu'à la solution de la dernière dilution, - chacune des solutions allant de la solution de première dilution à la solution de dernière dilution constituant une solution de dilution déterminée, - chaque solution de dilution déterminée subit une agitation vigoureuse, - les dilutions successives étant telles qu'au moins une des solutions de dilution déterminée contient la substance active en quantité inférieure à 10-10 moles, avantageusement inférieure à 10-12 moles/l et de préférence inférieure à 10-14 moles/l, ou ne contient plus de substance active, ladite solution de dilution déterminée présentant encore une activité à des dilutions supérieures à celle à laquelle la substance active a disparu, caractérisé en ce que:: - on introduit, avant au moins l'une quelconque des dilutions n, n étant un nombre entier supérieur à 0, dans la solution de dilution n-l une substance témoin soluble dans ladite solution et n'interférant pas avec la solution de dilution n-1,
* la substance témoin présentant la propriété d'être détectable à des dilutions supérieures à celle à partir de laquelle la substance active n'est plus détectable, et
* la substance témoin présentant également la propriété de disparaître entre la dilution n - 1 + m et n + m, m étant le nombre de dilutions où est présente la substance témoin et étant compris notamment de 5 à 8, - on dose au moins une fois la substance témoin après la dilution n, de préférence au moins une fois dans l'intervalle allant de la dilution n à la dilution n - 1 + m et au moins une fois dans l'intervalle allant de la dilution n + m à la dilution n + m + y, y étant la plage de dilution libre de substance témoin et étant avantageusement compris de 3 à 5, - et de la dilution n à la dilution n - 1 + m on compare la valeur de la concentration de la substance témoin obtenue et la valeur de la concentration de la substance témoin calculée d'après la dilution, ce qui permet de contrôler quantitativement les dilutions, et - de la dilution n + m à la dilution n + m + y, on vérifie qu'il n'y a plus de substance témoin, ce qui permet de contrôler d'une part la qualité des dilutions et d'autre part l'absence de contamination. According to an advantageous embodiment, the process of the invention is such that: the initial solution undergoes successive dilutions, the first dilution of the initial solution being obtained by taking a fraction or all of the initial solution, and the mixture of this fraction or the totality of the initial solution in a dilution solution, which gives the first dilution solution, the second dilution of the initial solution being obtained by taking a fraction or all of the solution the first dilution, and the mixture of that fraction or the whole of the first dilution solution in a dilution solution, to give the second dilution solution and so on, until the solution of the last dilution, - each solutions ranging from the first dilution solution to the last dilution solution constituting a predetermined dilution solution, - each dilution solution of determined is vigorously agitated, the successive dilutions being such that at least one of the determined dilution solutions contains the active substance in an amount of less than 10-10 mol, advantageously less than 10-12 mol / l and preferably less than 10 mol. -14 mol / l, or no longer contains active substance, said determined dilution solution still having an activity at higher dilutions than that at which the active substance has disappeared, characterized in that: - is introduced, before at least any of the dilutions n, n being an integer greater than 0, in the dilution solution nl a control substance soluble in said solution and not interfering with the dilution solution n-1,
the control substance exhibiting the property of being detectable at dilutions higher than that from which the active substance is no longer detectable, and
the control substance also having the property of disappearing between the dilution n-1 + m and n + m, m being the number of dilutions where the control substance is present and being comprised in particular of 5 to 8, the dose is measured at least one the control substance after dilution n, preferably at least once in the range from dilution n to the dilution n - 1 + m and at least once in the range from dilution n + m to dilution n + m + y, y being the free dilution range of the control substance and advantageously being from 3 to 5, and from the dilution n to the dilution n-1 + m the value of the concentration of the substance is compared. obtained control and the value of the concentration of the control substance calculated from the dilution, which allows to control quantitatively the dilutions, and - from the dilution n + m to the dilution n + m + y, it is verified that it no more control substance, which makes it possible to control the quality of the dilutions and the absence of contamination.

La substance témoin est douée de la propriété d'être détectable à des dilutions supérieures à celle à partir de laquelle la substance active n'est plus détectable, c'est-à-dire que si elle était introduite dans la solution initiale avant la première dilution de la solution de départ elle disparaîtrait à une dilution supérieure à celle à laquelle la substance active n'est plus détectable. The control substance has the property of being detectable at dilutions higher than that from which the active substance is no longer detectable, that is to say that if it was introduced into the initial solution before the first dilution of the starting solution it would disappear at a dilution greater than that at which the active substance is no longer detectable.

Pour fixer les idées, compte tenu des moyens techniques disponibles à ce jour, une substance est décelable par les moyens biochimiques habituels jusqu'à une quantité d'environ 10-6 moles/l. To fix the ideas, considering the technical means available to date, a substance is detectable by the usual biochemical means up to a quantity of about 10-6 mol / l.

Dans certains cas, les substances actives peuvent être détectables jusqu'à 10-12 moles/l. Mais, ceci implique des systèmes de détection très sensibles. In some cases, the active substances can be detectable up to 10-12 mol / l. But this implies very sensitive detection systems.

En ce qui concerne la substance témoin, de façon générale, elle est détectable jusqu'à environ 3x10-10-3x10-" moles/l, ce qui correspond à la dilution 7 lorsque la concentration initiale est d'environ 0,1 environ 10 mg/l, notamment d'environ 1 mg/ml. La quantité en moles/l, jusqu'à laquelle la substance témoin est détectable correspond à la limite à partir de laquelle on considère qu'il n'y a plus de substance témoin. With respect to the control substance, generally, it is detectable up to about 3x10-10-3x10- "moles / l, which corresponds to the dilution 7 when the initial concentration is about 0.1 mg / l, in particular of approximately 1 mg / ml The amount in moles / l until the control substance is detectable corresponds to the limit from which it is considered that there is no longer any control substance .

Or, les substances actives utilisables dans le procédé de l'invention sont détectables à des concentrations d'environ lx10-3 à lx10-6 moles/l, c'est-à-dire jusqu'à environ la troisième dilution décimale, pour une concentration initiale d'environ lx10-3 moles/l. However, the active substances that can be used in the process of the invention are detectable at concentrations of approximately 1 × 10 -3 to 1 × 10 -6 mol / l, that is to say up to about the third decimal dilution, for initial concentration of approximately lx10-3 mol / l.

Selon un mode de réalisation avantageux du procédé de l'invention, la substance témoin est introduite à la dilution n - 1, et disparaissant entre la dilution n - 1 + m et n + m, elle est réintroduite à la dilution n + m + y l'intervalle m + y + 1 étant tel que, - sur environ l'une des deux moitiés de cet intervalle les dilutions sont telles que les solutions de dilution correspondantes ne sont pas actives et - sur environ l'autre moitié de cet intervalle, l'une au moins des solutions de dilution correspondantes est active. According to an advantageous embodiment of the process of the invention, the control substance is introduced at the dilution n-1, and disappearing between the dilution n-1 + m and n + m, it is reintroduced at the dilution n + m + the range m + y + 1 being such that, on about one of the two halves of this range, the dilutions are such that the corresponding dilution solutions are not active and - over about the other half of this interval at least one of the corresponding dilution solutions is active.

On a représenté sur la Figure 1
- en traits pointillés la variation de l'activité de la solution de dilution en fonction de la dilution,
- en traits pleins la variation de la concentration initiale de la substance témoin ajoutée au départ en fonction de la dilution, et
- en traits pointillés courts - pointillés longs, la variation de concentration initiale de la substance active en fonction de la solution de dilution.Figure 1 is shown
- in dotted lines, the variation of the activity of the dilution solution as a function of the dilution,
- in full lines, the variation of the initial concentration of the control substance initially added as a function of the dilution, and
- in short dashed lines - long dots, the variation of initial concentration of the active substance as a function of the dilution solution.

Pour fixer les idées, la concentration initiale de la substance témoin est d'environ 1 mg/ml, et celle de la substance active est d'environ 1 mg/ml. For the sake of clarity, the initial concentration of the control substance is about 1 mg / ml, and that of the active substance is about 1 mg / ml.

Sur cette figure 1, donnée à titre illustratif et non limitatif, la substance témoin disparaît entre la dilution 7 et 8, la substance active disparaît entre la dilution 4 et 5, l'intervalle de dilution sur lequel la substance témoin est présente est de 0 à 8 dilutions. Sur la moitié de cet intervalle c'est-àdire de 0 à 4 dilutions, on constate que la solution présente une certaine activité alors que sur l'autre moitié de l'intervalle, c'est-à-dire de la quatrième à la huitième dilutions, la solution ne présente plus d'activité.Sur l'intervalle de 0 à 4 dilutions, la substance témoin est telle qu'il y ait une activité dans la solution de dilution correspondante et sur l'intervalle de 4 à 8 dilutions la substance témoin est telle qu'il n'y a seulement pas d'activité des solutions de dilutions correspondantes. In this FIG. 1, given by way of nonlimiting illustration, the control substance disappears between the dilution 7 and 8, the active substance disappears between the dilution 4 and 5, the dilution range over which the control substance is present is 0 at 8 dilutions. Over half of this interval, that is to say from 0 to 4 dilutions, it is found that the solution exhibits a certain activity whereas in the other half of the interval, that is to say from the fourth to the Eighth dilution, the solution is no longer active.On the interval from 0 to 4 dilutions, the control substance is such that there is an activity in the corresponding dilution solution and over the range of 4 to 8 dilutions the control substance is such that there is no activity of the corresponding dilution solutions.

Selon un autre mode de réalisation, la substance témoin présente la propriété selon laquelle si elle est introduite dans la solution initiale avant la première dilution de la solution de départ et si la substance active disparaît (n'est plus détectable) entre la dilution p et la dilution p + 1, la substance témoin disparaît entre la dilution p + x et la dilution p + x + 1, x étant compris notamment de 2 à 4, p étant compris notamment de 3 à 6. According to another embodiment, the control substance has the property that if it is introduced into the initial solution before the first dilution of the starting solution and if the active substance disappears (no longer detectable) between the dilution p and the dilution p + 1, the control substance disappears between the dilution p + x and the dilution p + x + 1, x being included in particular from 2 to 4, p being included in particular from 3 to 6.

Dans les définitions sus-indiquées, m correspond à p + x, lorsque la substance témoin est introduite dans la solution initiale avant la première dilution de la solution de départ. In the above-mentioned definitions, m corresponds to p + x, when the control substance is introduced into the initial solution before the first dilution of the starting solution.

Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le procédé comprend les étapes suivantes: - on introduit la substance témoin dans la solution initiale contenant la substance active avant la première dilution de ladite solution initiale, - on effectue les dilutions successives de la solution initiale contenant la substance active et la substance témoin, la première dilution de la solution initiale étant obtenue par prélèvement d'une fraction ou de la totalité de la solution initiale, et le mélange de cette fraction ou de la totalité de la solution initiale dans une solution de dilution, ce qui donne la solution de première dilution, la deuxième dilution de la solution initiale étant obtenue par prélèvement d'une fraction ou de la totalité de la solution de première dilution, et le mélange de cette fraction ou de la totalité de la solution de première dilution dans une solution de dilution, pour donner la solution de deuxième dilution et ainsi de suite, jusqu'à la solution de la dernière dilution, la substance active disparaît entre la dilution p et la dilution p + 1 et la substance témoin disparaît entre la dilution p + x et la dilution p + x + 1, p étant compris de 3 à 6, x étant compris de 2 à 4, la solution présentant encore une activité pour au moins une dilution supérieure ou égale à la dilution p + 1, - après la première dilution, on prélève pour au moins une dilution déterminée, à partir de la solution obtenue à l'issue de ladite dilution une quantité suffisante de solution pour doser la substance témoin, et de préférence on dose la substance témoin à chaque dilution de la dilution 1 à la dilution p + x et de préférence au moins une fois de la dilution p + x + 1 à la dilution 1 + p + x + y, y étant avantageusement compris de 2 à 10, avantageusement de 3 à 5, et avantageusement encore à chaque dilution de la dilution p + x + 1 à la dilution 1 + p + x + y, - et de la dilution 1 à la dilution p + x, on compare la valeur de la concentration de la substance témoin obtenue et la valeur de la concentration de la substance témoin calculée d'après la dilution, ce qui permet de contrôler quantitativement les dilutions et de la dilution p + x + 1 à la dilution 1 + p + x + y, on vérifie qu'il n'y a plus de substance témoin, ce qui permet de contrôler d'une part qu'il n'y a pas eu contamination et d'autre part la qualité des dilutions. According to another embodiment of the invention, the process comprises the following steps: the control substance is introduced into the initial solution containing the active substance before the first dilution of said initial solution, the successive dilutions of the solution are carried out; containing the active substance and the control substance, the first dilution of the initial solution being obtained by taking up a fraction or all of the initial solution, and mixing this fraction or the totality of the initial solution in a dilution solution, which gives the first dilution solution, the second dilution of the initial solution being obtained by taking a fraction or all of the first dilution solution, and mixing that fraction or all of the the first dilution solution in a dilution solution, to give the second dilution solution and so on, until to the solution of the last dilution, the active substance disappears between the dilution p and the dilution p + 1 and the control substance disappears between the dilution p + x and the dilution p + x + 1, p being between 3 and 6 , x being from 2 to 4, the solution still having an activity for at least one dilution greater than or equal to the dilution p + 1, - after the first dilution, is taken for at least a determined dilution, from the solution obtained at the end of said dilution a sufficient quantity of solution for assaying the control substance, and preferably the control substance is dosed at each dilution of the dilution 1 at the dilution p + x and preferably at least once of the dilution p + x + 1 at the dilution 1 + p + x + y, y being advantageously from 2 to 10, advantageously from 3 to 5, and advantageously still at each dilution of the dilution p + x + 1 at the dilution 1 + p + x + y, - and from dilution 1 to dilution p + x, the value of the concentration of the control substance obtained is compared with the value of the concentration of the control substance calculated from the dilution, which makes it possible to quantitatively control the dilutions and the dilution p + x + 1 at the dilution 1 + p + x + y, it is verified that there is no more control substance, which makes it possible to control on the one hand that there was no contamination and on the other hand the quality of the dilutions.

Selon un autre mode de réalisation on introduit pour la première fois la substance témoin avant la première dilution, puis on introduit la substance témoin pour la deuxième fois dans la solution de dilution qui suit celle à laquelle la substance témoin introduite pour la deuxième fois disparaît, puis on introduit une troisième fois la substance témoin dans la solution de dilution qui suit celle qui correspond à la disparition de la substance témoin introduite la deuxième fois, et ainsi de suite. According to another embodiment, the control substance is introduced for the first time before the first dilution, and then the control substance is introduced for the second time into the dilution solution which follows that at which the control substance introduced for the second time disappears, then the control substance is introduced a third time in the dilution solution which follows that which corresponds to the disappearance of the control substance introduced the second time, and so on.

De façon avantageuse, chaque introduction de la substance témoin a lieu de 2 à 10, avantageusement 3 à 5 dilutions après celle qui correspond à la disparition de la substance témoin précédemment introduite. Advantageously, each introduction of the control substance takes place from 2 to 10, advantageously 3 to 5 dilutions after that which corresponds to the disappearance of the previously introduced control substance.

Selon un autre mode de réalisation on introduit la substance témoin avant la première dilution et toutes les m dilutions, m étant compris de 5 à 15, avantageusement de 10 à 15, et avantageusement encore 10 ou 15. According to another embodiment, the control substance is introduced before the first dilution and all the mutions, m being from 5 to 15, advantageously from 10 to 15, and advantageously still 10 or 15.

Selon un autre mode de réalisation, on introduit la substance témoin pour la première fois dans la solution initiale, puis toutes les dix dilutions à partir de la solution initiale. According to another embodiment, the control substance is introduced for the first time into the initial solution and then all ten dilutions from the initial solution.

Selon un autre mode de réalisation on dose la substance témoin avantageusement toutes les 10 dilutions, et de préférence à chaque dilution. According to another embodiment, the control substance is preferably administered at all dilutions, and preferably at each dilution.

Selon un autre mode de réalisation la solution initiale contient une substance active à raison d'environ 1x10-3 à environ lx10-6 moles/l. According to another embodiment, the initial solution contains an active substance at a rate of about 1 × 10 -3 to about 1 × 10 -6 mol / l.

Selon un autre mode de réalisation la substance témoin est constituée par une enzyme, dont la présence est avantageusement détectable par son activité chromogène. According to another embodiment, the control substance consists of an enzyme whose presence is advantageously detectable by its chromogenic activity.

Selon un autre mode de réalisation l'enzyme est choisie parmi la peroxydase, est notamment la peroxydase de raifort, détectable par sa réactivité avec le substrat D-phenylène diamine en milieu H202.  According to another embodiment, the enzyme is chosen from peroxidase, in particular horseradish peroxidase, detectable by its reactivity with the D-phenylenediamine substrate in H202 medium.

La solution initiale et la solution de dilution sont des solutions aqueuses, d'alcool pur, ou de glycérine, et de façon avantageuse des solutions aqueuses. The initial solution and the dilution solution are aqueous, pure alcohol, or glycerine solutions, and advantageously aqueous solutions.

Les solutions de dilution déterminée contrôlées quant à leur dilution et à leur contamination selon le procédé de l'invention peuvent être utilisées telles quelles comme médicament fini, ou peuvent être utilisées en tant que solutions actives, pour la préparation de compositions homéopathiques galéniques solides.  The determined dilution solutions controlled as to their dilution and to their contamination according to the process of the invention can be used as such as finished medicament, or they can be used as active solutions, for the preparation of solid homeopathic galenic compositions.

En ce qui concerne les compositions galéniques homéopathiques solides, on peut citer les granules ou globules, qui sont rendues actives par imprégnation dans une solution de dilution déterminée contrôlée quant à sa pureté et leur contamination selon le procédé de l'invention. As regards the solid homeopathic pharmaceutical compositions, mention may be made of granules or globules, which are made active by impregnation in a determined dilution solution that is checked for purity and contamination according to the process of the invention.

EXEMPLE I
Cet exemple est relatif au contrôle de l'activation et de l'inhibition de l'achromasie des basophiles humains, en utilisant le procédé de l'invention de contrôle de la dilution et de la contamination d'une solution provenant d'une solution initiale, laquelle subit des dilutions successives.EXAMPLE I
This example relates to the control of the activation and inhibition of human basophils achromasia, using the method of the invention to control the dilution and contamination of a solution originating from an initial solution. which undergoes successive dilutions.

Plus précisément, dans cet exemple, on vérifié l'effet des hautes dilutions d'un anticorps anti-IgE sur les basophiles humains, les solutions de haute dilution étant contrôlées quant à leur dilution et à leur contamination selon le procédé de l'invention. More precisely, in this example, the effect of the high dilutions of an anti-IgE antibody on human basophils is verified, the high dilution solutions being controlled as to their dilution and to their contamination according to the method of the invention.

I- PRELEVEMENT SANGUIN
Il est effectué chez des sujets ne présentant aucune allergie reconnue, ni séro-positifs ni hépatite-positifs.I- BLOOD SAMPLING
It is performed in subjects with no known allergy, neither sero-positive nor hepatitis-positive.

Vingt ml de sang de ces donneurs sont recueillis dans deux tubes en verre glycérinés contenant chacun 250p1 d'anticoagulant ainsi préparé
- Mélanger (1:1) deux solutions d'EDTA-Na2 et d'EDTA-Na4 (Merck, Darmstadt, RFA) 0,2 M, pH 7,40.Twenty ml of blood from these donors are collected in two glycerinated glass tubes each containing 250 μl of anticoagulant thus prepared.
- Mix (1: 1) two solutions of EDTA-Na2 and EDTA-Na4 (Merck, Darmstadt, Germany) 0.2 M, pH 7.40.

* EDTA-Na2 (PM=372,24) : 3,7 g dissous dans 50 ml d'eau distillée chauffée,
* EDTA-Na4 (PM=452,24) : 4,5 g dissous dans 50 ml d'eau distillée froide.* EDTA-Na2 (MW = 372.24): 3.7 g dissolved in 50 ml of heated distilled water,
* EDTA-Na4 (MW = 452.24): 4.5 g dissolved in 50 ml of cold distilled water.

- A 100 ml du mélange, on ajoute de l'héparine sans phénol (Choay, Paris, France) à la concentration finale de 40 U/ml (c.ad. 4000 U dans 100 ml de solution d'EDTA).  To 100 ml of the mixture, phenol-free heparin (Choay, Paris, France) is added to the final concentration of 40 U / ml (ie 4000 U in 100 ml of EDTA solution).

Les tubes contenant l'anticoagulant (250 pl/tube) sont préparés à l'avance et conservés à +4"C.  Tubes containing the anticoagulant (250 μl / tube) are prepared in advance and stored at +4 ° C.

II- PREPARATION DES TAMPONS
On dispose de deux tampons
- un tampon de lavage, ne contenant pas de calcium, nécessaire à la préparation des cellules;
- un tampon de dilution, contenant du calcium, nécessaire à la préparation des dilutions.II- PREPARATION OF TAMPONS
We have two buffers
a washing buffer, not containing calcium, necessary for the preparation of the cells;
a dilution buffer, containing calcium, necessary for the preparation of the dilutions.

Ces deux tampons sont préparés extemporanément à partir du tampon de Tyrode stock suivant 1. Tampon de Tyrode tamponné à l'HEPES : "Tyrode
HEPES"

These two buffers are prepared extemporaneously from the following Tyrode stock buffer. 1. Tyrode stamp buffered with HEPES: "Tyrode
HEPES "

<tb> <SEP> Produits <SEP> Molarité <SEP> (mM) <SEP> PM <SEP> g/litre
<tb> <SEP> KCl <SEP> 2,6 <SEP> 74,6 <SEP> 0,195
<tb> <SEP> NaC1 <SEP> 137,0 <SEP> 58,4 <SEP> 8,0
<tb> <SEP> Glucose <SEP> 5,55 <SEP> 180,16 <SEP> 1,0
<tb> <SEP> HEPES <SEP> 10,0 <SEP> 260,0 <SEP> 2,6
<tb> <SEP> EDTA-Na2 <SEP> 2,3 <SEP> 292,2 <SEP> 0,672
<tb> (sans <SEP> acide)
<tb>
Les produits sont dissous à chaud par agitation dans de l'eau ultra-pure (obtenue après traitement par une machine à osmose inverse et filtration). Le pH est ajusté à 7,40 avec NaOH 5N et 1N. Le tampon est alors filtré (filtre 2 pm, Costar, Cambridge, USA) sous hotte stérile et conservé à +4"C durant 10 jours maximum.<tb><SEP> Products <SEP> Molarity <SEP> (mM) <SEP> PM <SEP> g / liter
<tb><SEP> KCl <SEP> 2.6 <SEP> 74.6 <SEP> 0.195
<tb><SEP> NaCl <SEP> 137.0 <SEP> 58.4 <SEP> 8.0
<tb><SEP> Glucose <SEP> 5.55 <SEP> 180.16 <SEP> 1.0
<tb><SEP> HEPES <SEP> 10.0 <SEP> 260.0 <SEP> 2.6
<tb><SEP> EDTA-Na2 <SEP> 2,3 <SEP> 292.2 <SEP> 0.672
<tb> (without <SEP> acid)
<Tb>
The products are dissolved by stirring in ultrapure water (obtained after treatment with a reverse osmosis machine and filtration). The pH is adjusted to 7.40 with 5N NaOH and 1N. The buffer is then filtered (2 μm filter, Costar, Cambridge, USA) in a sterile hood and stored at +4 ° C for up to 10 days.

Source des produits
KCl, NaCl, Glucose, EDTA-Na4 sont des réactifs pour culture cellulaire, Sigma Chemical Company, Saint
Louis, Missouri, USA.Source of products
KCl, NaCl, Glucose, EDTA-Na4 are reagents for cell culture, Sigma Chemical Company, Saint
Louis, Missouri, USA.

HEPES, Seromed , Biochrom KG, Berlin, RDA. HEPES, Seromed, Biochrom KG, Berlin, GDR.

2. Le tampon de lavage
C'est le tampon de Tyrode-HEPES ramené à la température ambiante et ajusté à pH 7,40 extemporanément.2. The washing buffer
It is the Tyrode-HEPES buffer brought to room temperature and adjusted to pH 7.40 extemporaneously.

3. Le tampon de dilution
C'est le tampon de Tyrode précédent, porté à température ambiante et ajusté extemporanément à pH 7,40 après addition de calcium.3. The dilution buffer
This is the previous Tyrode buffer, brought to room temperature and adjusted extemporaneously to pH 7.40 after addition of calcium.

a) Solution stock de CaClv 220 mM
1,62 g de CaCl2 2H2O dans 50 ml de tampon de
Tyrode-HEPES à pH 7.40. La conservation a lieu à +4"C. a) Stock solution of CaClv 220 mM
1.62 g of CaCl 2 2H 2 O in 50 ml of buffer of
Tyrode-HEPES at pH 7.40. The preservation takes place at +4 ° C.

b) Tampon de dilution
La concentration finale dans les dilutions est de llmM : 5 ml de CaC12 220 mM q.s.p. 100 ml de tampon de
Tyrode-HEPES. Ajuster à pH 7,40 avec NaOH 1N ou 0,1N.b) Dilution buffer
The final concentration in the dilutions is 11 mM: 5 ml of 220 mM CaC12 qs 100 ml of buffer of
Tyrode-HEPES. Adjust to pH 7.40 with 1N or 0.1N NaOH.

III- PREPARATION DES GAMMES DE DILUTIONS D'ANTI-I9E (TEST), D'ANTI-I4G ET D'EAU DISTILLEE ULTRA-PURE (CONTROLES)
Les dilutions d'eau distillée ultra-pure ne sont pas préparées et testées systématiquement pour toutes les expériences.III- PREPARATION OF THE RANGE OF DILUTIONS OF ANTI-I9E (TEST), ANTI-I4G AND ULTRA-PURE DISTILLED WATER (CONTROLS)
Dilutions of ultra-pure distilled water are not prepared and tested systematically for all experiments.

1. Les antisérums anti-IgE et anti-IqG
Il s'agit d'un antisérum de chèvre anti-IgG humaine (Fc spécifique, GAHu/IgG(Fc)) et d'un antisérum de chèvre anti-IgE humaine (Fc spécifique, GAHu/IgE (Fc)) (Nordic Immunology, Tilburg, The
Netherlands) dont la concentration en anticorps est de 1 mg/ml.1. Anti-IgE and anti-IqG antisera
It is an anti-human IgG goat antiserum (specific Fc, GAHu / IgG (Fc)) and a goat anti-human IgE antiserum (specific Fc, GAHu / IgE (Fc)) (Nordic Immunology) , Tilburg, The
Netherlands) with an antibody concentration of 1 mg / ml.

Les antisérums lyophilisés sont repris par 1 ml d'eau distillée ultra-pure puis aliquotés en tubes eppendorf (15 pl/tube) et conservés à -20 C.  The freeze-dried antisera are taken up in 1 ml of ultra-pure distilled water and then aliquoted into eppendorf tubes (15 μl / tube) and stored at -20 ° C.

La concentration en anticorps est de 1 mg/ml. The antibody concentration is 1 mg / ml.

2. Dilution des antisérums et de l'eau distillée ultra-pure
Les dilutions se font sous le contrôle d'un chercheur étranger au laboratoire et responsable du traitement statistique des résultats (INSERM U292).2. Dilution of antisera and ultra-pure distilled water
Dilutions are carried out under the supervision of a foreign researcher in the laboratory who is responsible for the statistical treatment of results (INSERM U292).

Elles sont réalisées sous hotte à flux laminaire sur un Automate Programmable 222-401E Gilson (Gilson
Medical Electronics, France) en utilisant des tubes stériles neufs tirés au sort de 5 ml en polypropylène (Greiner). Le tampon de dilution utilisé est du tampon de Tyrode-HEPES contenant du calcium l1 mM et ajusté à pH 7,40.They are carried out under a laminar flow hood on a Gilson 222-401E Programmable Logic Controller (Gilson
Medical Electronics, France) using new, sterile 5 mL polypropylene tubes (Greiner). The dilution buffer used is Tyrode-HEPES buffer containing 1 mM calcium and adjusted to pH 7.40.

On dilue d'abord l'eau distillée ultra-pure, puis l'anti-IgG, puis l'anti-IgE. Un cycle de rinçage est programmé au début et à la fin de chacune des gammes de dilutions. Celles-ci comportent 29 tubes allant de la dilution 1 x 102 à la dilution 1 x 1030 de l'eau distillée ultra-pure ou de la solution d'antisérum anti-IgG ou anti-IgE de départ. Ultrapure distilled water is first diluted, then anti-IgG, then anti-IgE. A rinse cycle is programmed at the beginning and end of each dilution range. These include 29 tubes ranging from the 1 x 102 dilution to the 1 x 1030 dilution of ultrapure distilled water or the anti-IgG or anti-IgE antiserum solution.

A titre de traceur enzymatique permettant de juger de la bonne pratique des dilutions, on ajoute de la peroxydase (Sigma) en même temps que l'eau distillée ou l'antisérum anti-IgG ou anti-IgE. La solution de peroxydase a été préparée à 1 mg/ml, aliquotée en tubes eppendorf (15 Ml/tube) et conservée à -20 C.  As an enzymatic tracer for judging the good practice of dilutions, peroxidase (Sigma) is added together with distilled water or anti-IgG or anti-IgE antiserum. The peroxidase solution was prepared at 1 mg / ml, aliquoted into eppendorf tubes (15 μl / tube) and stored at -20 ° C.

Réalisation d'une gamme de dilutions
Les 29 tubes de la gamme, vides et portant le numéro correspondant à leur dilution marqué au feutre, sont placés sur le portoir de l'appareil automatique
Gilson.Realization of a range of dilutions
The 29 tubes of the range, empty and bearing the number corresponding to their dilution marked with the felt, are placed on the rack of the automatic apparatus
Gilson.

Dans le premier tube, correspondant à la dilution 1 x 102, 10 ssl d'eau distillée ou d'anti-IgG ou d'anti-IgE (1 mg/ml) et 10 yl de peroxydase (1 mg/ml) sont ajoutés à 980 pl de tampon de Tyrode contenant du calcium 11 mM (tampon de dilution). Le tube est bouché et agité pendant 30 sec sur un Vortex.  In the first tube, corresponding to the 1 × 102 dilution, 10 μs of distilled water or anti-IgG or anti-IgE (1 mg / ml) and 10 μl of peroxidase (1 mg / ml) are added. 980 μl of Tyrode buffer containing 11 mM calcium (dilution buffer). The tube is plugged and stirred for 30 sec on a Vortex.

La dilution 1 x 102 faite manuellement est replacée sur le portoir et le programme de dilution automatique est alors engagé. Après un cycle de rinçage avec le tampon de dilution, une seringue de 500il (piston inox) prélève 100 pl de la dilution 1 x 102 et aspire 400 pl du tampon de dilution. Le tout est rejeté dans le tube suivant, correspondant à la dilution 1 x 103. Cinq cent pl de tampon de dilution sont encore aspirés et rejetés dans le tube de la dilution 1 x 103, ce qui assure le rinçage de la seringue. L'agitation de la dilution est assurée par une aspiration-refoulement de 500 ssl d'air, 5 fois de suite, au maximum de vitesse de refoulement. Manual 1 x 102 dilution is returned to the rack and the automatic dilution program is initiated. After a rinse cycle with the dilution buffer, a 500 μl syringe (stainless steel plunger) takes 100 μl of the 1x102 dilution and draws in 400 μl of the dilution buffer. The whole is discharged into the next tube, corresponding to the 1 x 103 dilution. Five hundred μl of dilution buffer is still aspirated and discharged into the 1 x 103 dilution tube, which ensures the rinsing of the syringe. The stirring of the dilution is ensured by a suction-discharge of 500 ssl of air, 5 times in succession, at the maximum of discharge speed.

L'aiguille prélève ensuite 100 1 de la dilution 1 x 103, aspire 400 pl puis 500 pl de tampon de dilution selon le même processus que précédemment pour obtenir la dilution 1 x 104 et ainsi de suite.The needle then takes 100 l of the 1 x 103 dilution, aspirates 400 μl and then 500 μl of dilution buffer according to the same process as before to obtain the 1 x 104 dilution and so on.

A la dilution 1 x 1030, l'appareil s'arrête automatiquement et enclenche un cycle de rinçage. Une nouvelle gamme peut alors être mise en oeuvre. At 1 x 1030 dilution, the device automatically shuts off and starts a rinse cycle. A new range can then be implemented.

Schéma du processus de dilution automatique de l'antisérum anti-IgE
Ce schéma fait l'objet de la figure 2, sur laquelle on a représenté le procédé de dilution automatique dans lequel les étapes d'agitation mentionnées par "bullage" sont faites conformément au procédé de l'invention et dans lequel l'étape d'agitation qui suit la première dilution est faite manuellement sur un appareil à agitation par excentrique.Diagram of the automatic dilution process of anti-IgE antiserum
This diagram is the object of FIG. 2, on which the automatic dilution method has been represented in which the stirring steps mentioned by "bubbling" are carried out in accordance with the method of the invention and in which the step of The stirring following the first dilution is done manually on an eccentric agitation apparatus.

3. Codage des tubes des dilutions d'eau distillée et d'antisérums
Lors d'une expérience "activation", on teste
- les dilutions pondérales 1 x 102 à 1 x 104 d'anti-IgE et du contrôle anti-IgG et/ou eau distillée;
- les hautes dilutions 1 x 1021 à 1 x 1030 (audelà du nombre limite de molécules calculé grâce au nombre d'Avogadro) d'anti-IgE et du contrôle anti-IgG et/ou eau distillée. N'importe quelle partie de la gamme de dilution au-delà de la limite donnée par le nombre d'Avogadro peut être utilisée;
- les témoins internes contrôlant la sensibilité au calcium des basophiles et correspondant aux tampons de Tyrode sans calcium et de Tyrode avec calcium.3. Coding of dilutions of distilled water and antisera
During an "activation" experiment, we test
weight dilutions 1 × 10 2 to 1 × 10 4 of anti-IgE and anti-IgG control and / or distilled water;
the high dilutions 1 x 1021 to 1 x 1030 (above the limit number of molecules calculated thanks to the Avogadro number) of anti-IgE and anti-IgG control and / or distilled water. Any part of the dilution range beyond the limit given by the Avogadro number can be used;
the internal controls controlling the calcium sensitivity of the basophils and corresponding to Tyrode buffers without calcium and Tyrode with calcium.

a) Réalisation du code
Dans ce protocole "activation", tous les tubes sont testés en aveugle.a) Realization of the code
In this "activation" protocol, all tubes are blind tested.

Le chercheur étranger au laboratoire et contrôlant la réalisation des expériences attribue à chacun des tubes, suivant une table de randomisation
- un nombre compris entre 1 et 30 lorsque l'expérience compare l'efficacité des dilutions d'anti-IgE et d'anti-IgG;
- un nombre compris entre 1 et 43 lorsque l'expérience compare l'efficacité des dilutions d'eau distillée, d'anti-IgG et d'anti-IgE.The foreign researcher at the laboratory and controlling the realization of the experiments assigns to each of the tubes, according to a randomisation table
a number between 1 and 30 when the experiment compares the effectiveness of the dilutions of anti-IgE and anti-IgG;
a number between 1 and 43 when the experiment compares the effectiveness of the dilutions of distilled water, anti-IgG and anti-IgE.

Pour ce faire, les numéros correspondant aux dilutions et marqués au feutre sur les tubes sont effacés à l'alcool et des étiquettes portant un numéro de code sont collées sur les tubes. To do this, the numbers corresponding to the dilutions and marked with felt on the tubes are erased with alcohol and labels bearing a code number are glued on the tubes.

Exemple : dans le cas d'un code compris entre 1 et 30, les tubes codés seront
- les tubes des dilutions 1 x 102 à 1 x 104 d'anti-IgG (3 tubes) et d'anti-IgE (3 tubes);
- les tubes des dilutions 1 x 1021 à 1 x 1030 d'anti-IgG (10 tubes) et d'anti-IgE (10 tubes);
- les tubes de contrôles internes : 1) tampon de dilution, Tyrode avec calcium (2 tubes); 2) tampon de lavage, Tyrode sans calcium (2 tubes). Example: in the case of a code between 1 and 30, the coded tubes will be
the tubes of the 1 × 102 dilutions to 1 × 10 4 anti-IgG (3 tubes) and anti-IgE (3 tubes);
the tubes of the dilutions 1 × 1021 to 1 × 1030 anti-IgG (10 tubes) and anti-IgE (10 tubes);
- the internal control tubes: 1) dilution buffer, Tyrode with calcium (2 tubes); 2) Wash buffer, Tyrode without calcium (2 tubes).

b) Dédoublage de la gamme codée de 1 à 30 ou de 1 à 43
De chacun des tubes codés, on prélève 200 tl (Pipetman 200) qui sont déposés dans des tubes d'agrégamètre de 1 ml. Les tubes sont bouchés et emportés par la personne ayant fait le code pour un dosage de contrôle éventuel, ultérieur et indépendant, des immunoglobulines pouvant être contenues dans les dilutions (dosage par électrophorèse sur gel de polyacrylamide) ou tout autre contrôle approprié (spectrométrie de masse etc...).(b) Digitization of the coded range from 1 to 30 or from 1 to 43
From each of the coded tubes, 200 μl (Pipetman 200) are taken which are deposited in 1 ml aggregameter tubes. The tubes are plugged and removed by the person making the code for a possible, subsequent and independent control assay, immunoglobulins that may be contained in the dilutions (polyacrylamide gel electrophoresis assay) or any other appropriate control (mass spectrometry etc ...).

IV- PREPARATION CELLULAIRE
Avant de procéder à l'obtention d'une suspension enrichie en basophiles à partir du sang recueilli sur l'anticoagulant héparine-EDTA (paragraphe I), on détermine le nombre de basophiles présents par mm3 de sang total du sujet.IV- CELL PREPARATION
Before proceeding to obtain a suspension enriched with basophils from the blood collected on the heparin-EDTA anticoagulant (paragraph I), the number of basophils present per mm 3 of whole blood of the subject is determined.

1. Coloration et comptage des basophiles sur sang total
Les basophiles sont comptés grâce à leur propriété de coloration métachromatique avec le bleu de toluidine.1. Staining and counting of basophils in whole blood
Basophils are counted by virtue of their metachromatic staining property with toluidine blue.

a) Solution de coloration : le bleu de toluidine
Cent mg de bleu de toluidine (Toluidine Blue, CI Nô52040 C15 H16 CIN3 S, PM=305,84, Fluka, Mulhouse,
France) sont dissous dans 100 ml d'éthanol 25% et ajustés à pH 3,20-3,40 avec 80-100 ssl d'acide acétique glacial. La solution est conservée à température ambiante en bouteille hermétiquement close et à l'abri de la lumière.a) Staining solution: toluidine blue
One hundred mg of toluidine blue (Toluidine Blue, CI No. 52040 C15 H16 CIN3 S, MW = 305.84, Fluka, Mulhouse,
France) are dissolved in 100 ml of 25% ethanol and adjusted to pH 3.20-3.40 with 80-100 ssl of glacial acetic acid. The solution is kept at room temperature in a sealed bottle and protected from light.

b) La coloration
Elle est réalisée en mélangeant 90 Ml de colorant et 10 j1 de sang total dans le puits à fond rond d'une plaque de microtitration (Costar). Le mélange est immédiatement et doucement agité par 5 à 6 aspirations et refoulements à l'aide de la pipette (Pipetman 200) ayant servi à déposer le colorant.b) Coloring
It is performed by mixing 90 μl of dye and 10 μl of whole blood in the round bottom well of a microtiter plate (Costar). The mixture is immediately and gently stirred with 5 to 6 aspirations and discharges using the pipette (Pipetman 200) used to deposit the dye.

c) Comptage des basophiles
Cinq à 10 minutes après le mélange du sang et du colorant, celui-ci est à nouveau doucement agité et immédiatement déposé dans une chambre de Fuchs
Rosenthal (3,2 mm3) à l'aide d'une pipette (Pipetman 200).c) Counting basophils
Five to 10 minutes after the mixing of the blood and the dye, it is again gently agitated and immediately deposited in a chamber of Fuchs
Rosenthal (3.2 mm3) using a pipette (Pipetman 200).

La lame est déposée en atmosphère humide (dans une boîte fermée et humidifiée) pour éviter son dessèchement. Après 3 à 5 minutes correspondant au temps nécessaire pour que la suspens ion colorée se déposé dans le chambre de l'hémocytomètre, on procède au comptage sur un microscope Olympus au grossissement
G x 10 x 20.The blade is deposited in a humid atmosphere (in a closed and humidified box) to prevent it from drying out. After 3 to 5 minutes corresponding to the time required for the suspension of the colored ion to settle in the chamber of the hemocytometer, counting is performed on an Olympus microscope at magnification.
G x 10 x 20.

Les basophiles sont les seules cellules ayant un cytoplasme coloré. Ils apparaissent rouges et sont très facilement identifiés sur un fond pâle. En cas de doute, il est nécessaire de modifier la mise au point de façon à bien distinguer les cytoplasmes colorés en rose-rouge des basophiles de ceux des autres cellules qui restent transparentes. Les noyaux des autres leucocytes sont légèrement colorés en bleu. Basophils are the only cells with a colored cytoplasm. They appear red and are very easily identified on a pale background. In case of doubt, it is necessary to modify the focus in order to distinguish the pink-red colored cytoplasm from the basophils from those of the other cells which remain transparent. The nuclei of the other leucocytes are slightly colored in blue.

Généralement, sur sang total, on compte en moyenne 7 à 15 basophiles par chambre de Fuchs
Rosenthal, leur nombre pouvant aller de 2-3 à 30-35.Generally, on whole blood, there are on average 7 to 15 basophils per room of Fuchs
Rosenthal, their number ranging from 2-3 to 30-35.

2. Obtention d'une suspension enrichie en basophiles
Lorsque les 10 111 nécessaires au comptage des basophiles sur sang total sont prélevés, du Dextran
T500 4, (Pharmacia, Uppsala, Suède) est ajouté à raison d'un volume pour cinq volumes de sang. Les tubes sont inclinés et au fur et à mesure de la sédimentation (20 min environ à 1 x g à température ambiante), on recueille le plasma riche en leucocytes ainsi que des globules rouges en suspension. La présence de ces derniers renforcent la coloration des basophiles par le bleu de toluidine (observation empiriquement faite au laboratoire lors des essais expérimentaux).2. Obtaining a suspension enriched with basophils
When the 10,111 needed to count basophils on whole blood are taken, Dextran
T500 4, (Pharmacia, Uppsala, Sweden) is added at one volume for five volumes of blood. The tubes are inclined and as sedimentation (about 20 min at 1 xg at room temperature), the leukocyte-rich plasma and red blood cells are collected in suspension. The presence of the latter enhances the staining of basophils with toluidine blue (observation empirically made in the laboratory during the experimental tests).

La sédimentation est recueillie dans 2 tubes en plastique de 10 ml auxquels on ajoute du tampon de lavage (Tyrode-HEPES sans calcium, pH 7,40). Après centrifugation (150 x g, 10 min), les culots de leucocytes (+ globules rouges) sont réunis en un seul tube, suspendus dans 10 ml de tampon de lavage et centrifugés à nouveau (150 x g, 10 min). Le plasma riche en leucocytes est initialement séparé en 2 tubes afin de mieux laver les cellules. Sedimentation is collected in 2 10 ml plastic tubes to which wash buffer (Tyrode-HEPES without calcium, pH 7.40) is added. After centrifugation (150 x g, 10 min), the leukocyte pellets (+ red blood cells) are combined into a single tube, suspended in 10 ml of washing buffer and centrifuged again (150 x g, 10 min). The leukocyte-rich plasma is initially separated into 2 tubes in order to better wash the cells.

Le culot est finalement repris dans un aliquote du même tampon, entre 400 et 900 ssl environ, en fonction du nombre de puits à déposer (10 ssl de suspension x fois le nombre de puits + 40 à 60 pl supplémentaires pour les pertes sur les parois du tube). The pellet is finally taken up in an aliquot of the same buffer, between 400 and 900 ssl approximately, depending on the number of wells to be deposited (10 ssl suspension x times the number of wells + 40 to 60 pl extra for losses on the walls of the tube).

On a représenté sur la figure 3 le schéma de la préparation cellulaire. FIG. 3 shows the scheme of the cell preparation.

V- PROTOCOLE DE L'ACTIVATION DES BASOPHILES HUMAINS
PAR L'ANTI-IGE (ANTI-IGG OU EAU DISTILLEE A TITRE DE
CONTROLE)
Après la préparation des dilutions d'antisérums anti-IgG et anti-IgE (et, pour une quinzaine d'expériences, des dilutions d'eau distillée) et leur codage, après obtention de la suspension enrichie en basophiles, on procède au test proprement dit, sous hotte à flux laminaire. Le processus est identique dans le cas du code à 30 tubes et du code à 43 tubes.V- PROTOCOL ON THE ACTIVATION OF HUMAN BASOPHILES
BY THE ANTI-IGE (ANTI-IGG OR DISTILLED WATER AS A
CONTROL)
After preparing the dilutions of anti-IgG and anti-IgE antisera (and, for about fifteen experiments, dilutions of distilled water) and their coding, after obtaining the suspension enriched with basophils, the test is carried out properly. said, under laminar flow hood. The process is identical in the case of the 30-tube code and the 43-tube code.

1. Le protocole
- Dix Sl de tampon de lavage (Tyrode sans calcium) sont déposés au fond de 30 (ou 43) puits à fond rond d'une plaque de microtitration stérile (Costar), en évitant les puits périphériques où les risques de contamination et d'évaporation sont plus grands,
- vingt pl de chacune des dilutions codées (code de 1 à 30 ou de 1 à 43) sont ensuite déposés au fond de ces mêmes puits,
- la plaque est préincubée 5 min à 37"C, sous scotch et couvercle pour eviter l'évaporation du contenu des puits,
- dix 41 de suspension enrichie sont ensuite ajoutées,
- la plaque est alors doucement agitée par lents mouvements de rotation afin d'homogénéiser le contenu de chacun des puits; il est important que cette agitation soit douce afin d'éviter toute contamination d'un puits à l'autre,
- la plaque est ensuite incubée 15 min à 37"C, sous scotch et couvercle pour eviter toute évaporation,
- après incubation, 90 j1 de bleu de toluidine sont ajoutés à chacun des puits et immédiatement agités par 5 à 6 aspirations et refoulements avec une pipette multicanaux. On change des cônes entre chaque rangée de puits,
- après coloration, la plaque est scotchée et conservée une nuit à +4"C avant de procéder à la lecture. Sur cellules, lavées, la coloration est plus homogène après plusieurs heures. 1. The protocol
Ten μl of washing buffer (Tyrode without calcium) are deposited in the bottom of 30 (or 43) round-bottom wells of a sterile microtiter plate (Costar), avoiding the peripheral wells where the risks of contamination and evaporation are larger,
twenty μl of each of the coded dilutions (code from 1 to 30 or from 1 to 43) are then deposited at the bottom of these same wells,
the plate is pre-incubated for 5 minutes at 37 ° C., under a tape and lid to prevent evaporation of the contents of the wells,
ten of enriched suspension are then added,
- The plate is then gently agitated by slow rotational movements to homogenize the contents of each of the wells; it is important that this agitation be gentle to avoid any contamination from one well to another,
the plate is then incubated for 15 min at 37 ° C., under a tape and lid to prevent any evaporation,
after incubation, 90 μl of toluidine blue are added to each of the wells and immediately shaken with 5-6 aspirations and discharges with a multichannel pipette. We change cones between each row of wells,
after staining, the plate is taped and kept overnight at +4 ° C. before reading.On washed cells, the staining is more homogeneous after several hours.

2. Schéma de plaque
Exemple : dans le cas d'un code de 1 à 30 X X X X X X X X X X X X
X 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 X
X 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 X
X 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 X
X X X X X X X X X X X X
X X X X X X X X X X X X
X X X X X X X X X X X X
X X X X X X X X X X X X
10 41 tampon de lavage (Tyrode sans Ca++)
+ 20 41 dilutions codées (1 à 30)
PREINCUBATION 5 min à 37"C
+ 10 41 suspension riche en basophiles (+
globules rouges)
INCUBATION 15 min à 37"C
+ 90 41 bleu de toluidine
CONSERVATION une nuit à +4"C puis LECTURE
3. Lecture au microscope optique.Comptage des basophiles
Les basophiles sont comptés le jour suivant l'expérimentation par la même personne qui a préparé les cellules la veille. La technique est identique à celle du comptage des basophiles en sang total (paragraphe IV-1-c).2. Plate diagram
Example: in the case of a code from 1 to 30 XXXXXXXXXXXX
X 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 X
X 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 X
X 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 X
XXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXX
Washing buffer (Tyrode without Ca ++)
+ 20 41 coded dilutions (1 to 30)
PREINCUBATION 5 min at 37 "C
+ 10 41 suspension rich in basophils (+
Red cells)
INCUBATION 15 min at 37 "C
+ 90 41 toluidine blue
CONSERVATION one night at +4 "C then READING
3. Optical microscope reading. Basophiles counting
Basophils are counted the day after the experiment by the same person who prepared the cells the day before. The technique is identical to the counting of basophils in whole blood (paragraph IV-1-c).

Lorsque le nombre de basophiles est important (supérieur à 100 sur une chambre entière de Fuchs
Rosenthal), il est possible de ne lire (pour tous les puits) qu'une demi-chambre. Si plus de 150 basophiles apparaissent sur une demi-chambre de Fuchs-Rosenthal, il est préférable de déposer le contenu des puits dans la chambre d'un hémocytomètre de Malassez (1 mm3).When the number of basophils is important (greater than 100 on a whole chamber of Fuchs
Rosenthal), it is possible to read (for all the wells) only half a room. If more than 150 basophils appear on a half-chamber of Fuchs-Rosenthal, it is preferable to deposit the contents of the wells in the chamber of a Malassez hemocytometer (1 mm3).

Trois à cinq minutes sont nécessaires pour compter le contenu en basophiles d'une chambre d'hémocytomètre. Un expérimentateur entraîné peut préparer 3 à 4 hémocytomètres en même temps à condition d'entreposer ceux-ci dans une boîte humidifiée afin d'éviter leur dessèchement. En cas de doute sur un compte, il est possible de redéposer le contenu d'un puits dans une chambre de Fuchs-Rosenthal pour procéder à un nouveau compte. Mais il est recommandé de ne pas renouveler cette opération plus de deux fois pour un même puits car il semble que les prélèvements répétés avec agitation puissent endommager l'échantillon et entraîner alors des résultats erratiques. Three to five minutes are required to count the basophil content of a hemocytometer chamber. A trained experimenter can prepare 3 to 4 hemocytometers at the same time provided they are stored in a humidified box to prevent drying out. In case of doubt about an account, it is possible to re-deposit the contents of a well in a room of Fuchs-Rosenthal to proceed to a new account. But it is recommended not to repeat this operation more than twice for the same well because it seems that repeated sampling with agitation can damage the sample and then lead to erratic results.

Les nombres de basophiles sont reportes dans un tableau à l'image du schéma de la plaque. The numbers of basophils are reported in a table in the image of the diagram of the plate.

4. Contrôle de qualité des dilutions d'antisérums anti-IgG et anti-IgE : Dosage de la peroxydase
La peroxydase est dosée le jour-même de l'expérimentation, indépendamment, par la deuxième personne prenant part au protocole et n'ayant pas fait l'expérience ce jour-là. Il a pour but de contrôler le processus de dilution et de déceler une éventuelle contamination des hautes dilutions par des concentrations pondérales d'antiserum, contamination qui serait alors responsable de l'activité biologique observée à haute dilution.4. Quality control of anti-IgG and anti-IgE antisera dilutions: Peroxidase assay
The peroxidase is assayed the same day of the experiment, independently, by the second person taking part in the protocol and not having the experiment that day. It aims to control the dilution process and to detect possible contamination of high dilutions by weight concentrations of antiserum, which contamination would then be responsible for the biological activity observed at high dilution.

C'est un dosage par spectrocolorimétrie à 490 nm basé sur la réactivité de la peroxydase avec le substrat O-Phénylène-Diamine en milieu H2 2
a) Préparation des tampons et solutions
- Tampon citrate pH 5,0
C'est un melange de 20,5 ml d'une solution 0,1M d'acide citrique (PM=210,1) et de 29,5 ml d'une solution 0,1M de citrate de sodium (PM=294,1). It is a 490 nm spectrocolorimetric assay based on the reactivity of peroxidase with the O-phenylene-diamine substrate in H2 medium.
a) Preparation of buffers and solutions
- Citrate buffer pH 5.0
It is a mixture of 20.5 ml of a 0.1M solution of citric acid (MW = 210.1) and 29.5 ml of a 0.1M solution of sodium citrate (MW = 294, 1).

- Solution d'O-Phénylène-Diamine (OPD) :
Huit mg d'OPD (Sigma) sont dissous extemporanément dans 10 ml de tampon citrate pH 5,0. - O-Phenylene-Diamine Solution (OPD):
Eight mg of OPD (Sigma) are extemporaneously dissolved in 10 ml of citrate buffer pH 5.0.

La solution est conservée à l'abri de la lumière sous feuille d'aluminium.The solution is kept away from light under aluminum foil.

b) Le dosage
Dans les puits d'une plaque de microtitration 96 puits à fond plat (Costar), on dépose successivement
- 50 41 de chacune des dilutions codées (de 1 à 30 ou de 1 à 43) et des dilutions non codées (1 x à 1 x 1020 ) des gammes d'eau distillée, d'anti-IgG et d'anti-IgE (Pipetman 200).b) The dosage
In the wells of a 96-well flat-bottomed microtiter plate (Costar), one deposits successively
50 41 of each of the coded dilutions (from 1 to 30 or from 1 to 43) and uncoded dilutions (1 x to 1 × 1020) of the ranges of distilled water, anti-IgG and anti-IgE (Pipetman 200).

- 50 41 d'OPD à 8 mg/10 ml (pipette distributrice eppendorf). - 50 41 OPD 8 mg / 10 ml (eppendorf dispensing pipette).

- 10 41 d'H2 O2 30 vol. (pipette distributrice eppendorf). - 10 41 H2 O2 30 vol. (dispenser pipette eppendorf).

On observe une coloration jaune-orange des puits correspondant aux dilutions les plus concentrées. A yellow-orange coloring of the wells corresponding to the most concentrated dilutions is observed.

Laisser la reaction se faire pendant 10 minutes à l'abri de la lumière, sous aluminium. Allow the reaction to take place for 10 minutes, protected from light, under aluminum.

Ajouter 50 41 (pipette distributrice eppendorf) d'H2SO4 9% (H2SO4 concentré, dilué 10 fois, 3% final dans le puits). La coloration précédemment observée s'accentue (coloration ocre-orange). Add 50 (eppendorf dispensing pipette) of 9% H2SO4 (concentrated H2SO4, diluted 10-fold, final 3% in the well). The previously observed coloration is accentuated (ocher-orange color).

Lire immédiatement à 490 nm avec un spectrophotomètre-lecteur de plaque automatique (Dynatech Laboratories). Les résultats sont automatiquement enregistrés et imprimés. Read immediately at 490 nm with an automatic plate spectrophotometer (Dynatech Laboratories). The results are automatically saved and printed.

Schéma de plaque
Exemple dans le cas d'un code de 1 à 30

Plate diagram
Example in the case of a code from 1 to 30

<tb> <SEP> x <SEP> x <SEP> x <SEP> x <SEP> x <SEP> x <SEP> x <SEP> x <SEP> x <SEP> x <SEP> x <SEP> x
<tb> <SEP> X <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> 9 <SEP> 10
<tb> n <SEP> \i::t <SEP> rc <SEP> - <SEP> 0 <SEP> gammes
<tb> <SEP> -e <SEP> Xx <SEP> 11 <SEP> 12 <SEP> 13 <SEP> 14 <SEP> 15 <SEP> 16 <SEP> 17 <SEP> 18 <SEP> 19 <SEP> 20 <SEP> X <SEP> { <SEP> codées
<tb> <SEP> c=ce <SEP> (X <SEP> 21 <SEP> 22 <SEP> 23 <SEP> 24 <SEP> 25 <SEP> 26 <SEP> 27 <SEP> 28 <SEP> 29
<tb> <SEP> x <SEP> X <SEP> X <SEP> X <SEP> X <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> 9 <SEP> 10 <SEP> X) <SEP> gamme
<tb> ^s, <SEP> ercs <SEP> X <SEP> ll <SEP> 12 <SEP> 13 <SEP> 14 <SEP> 15 <SEP> 16 <SEP> 17 <SEP> 18 <SEP> 19 <SEP> 20
<tb> <SEP> -es <SEP> X <SEP> X <SEP> X <SEP> X <SEP> x <SEP> 15 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> 9 <SEP> 10 <SEP> X <SEP> ) <SEP> gamme
<tb> <SEP> X <SEP> cns <SEP> X <SEP> 11 <SEP> 12 <SEP> 13 <SEP> 14 <SEP> 15 <SEP> 16 <SEP> 17 <SEP> 18 <SEP> 19 <SEP> 20 <SEP> X <SEP> lanti-IgE
<tb>
5) Les résultats "activation"
Les résultats (nombres de basophiles + dosage peroxydase) sont remis chaque jour à la personne ayant fait les codes.<tb><SEP> x <SEP> x <SEP> x <SEP> x <SEP> x <SEP> x <SEP> x <SEP> x <SEP> x <SEP> x <SEP> x <SEP> x
<tb><SEP> X <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> 9 <SEP> 10
<tb> n <SEP> \ i :: t <SEP> rc <SEP> - <SEP> 0 <SEP> Ranges
<tb><SEP> -e <SEP> Xx <SEP> 11 <SEP> 12 <SEP> 13 <SEP> 14 <SEP> 15 <SEP> 16 <SEP> 17 <SEP> 18 <SEP> 19 <SEP > 20 <SEP> X <SEP>{SEP> coded
<tb><SEP> c = this <SEP> (X <SEP> 21 <SEP> 22 <SEP> 23 <SEP> 24 <SEP> 25 <SEP> 26 <SEP> 27 <SEP> 28 <SEP> 29
<tb><SEP> x <SEP> X <SEP> X <SEP> X <SEP> X <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> 9 <SEP> 10 <SEP> X) <SEP> range
<tb> ^ s, <SEP> ercs <SEP> X <SEP> 11 <SEP> 12 <SEP> 13 <SEP> 14 <SEP> 15 <SEP> 16 <SEP> 17 <SEP> 18 <SEP> 19 <SEP> 20
<tb><SEP> -es <SEP> X <SEP> X <SEP> X <SEP> X <SEP> x <SEP> 15 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> 9 <SEP > 10 <SEP> X <SEP>) <SEP> range
<tb><SEP> X <SEP> cns <SEP> X <SEP> 11 <SEP> 12 <SEP> 13 <SEP> 14 <SEP> 15 <SEP> 16 <SEP> 17 <SEP> 18 <SEP> 19 <SEP> 20 <SEP> X <SEP> lanti-IgE
<Tb>
5) The results "activation"
The results (numbers of basophils + peroxidase assay) are given each day to the person who made the codes.

Les tubes correspondant à chaque expérience sont enfermes dans une enveloppe scellée et datée et conservée à +4"C, aux fins de contrôles ultérieurs. The tubes corresponding to each experiment are enclosed in a sealed and dated envelope and stored at +4 ° C for subsequent controls.

a) Interprétation des résultats
Elle sera faite après une analyse statistique indépendante, sur les expériences sélectionnées selon les critères suivants
1. Nombre de basophiles dans les témoins supérieur à 35. Les témoins correspondent aux dilutions d'eau distillée, d'anti-IgG et aux témoins internes (tampon de Tyrode avec et sans Ca++).a) Interpretation of results
It will be done after an independent statistical analysis, on the selected experiments according to the following criteria
1. Number of basophils in the controls greater than 35. The controls correspond to dilutions of distilled water, anti-IgG and internal controls (Tyrode buffer with and without Ca ++).

2. Activité anti-IgE à dose pondérale supérieur à 40% d'achromasie par rapport aux dilutions pondérales respectives d'eau distillée ou d'anti-IgG. 2. Anti-IgE activity at a weight dose greater than 40% achromasia relative to the respective weight dilutions of distilled water or anti-IgG.

(L'anti-IgG à dose pondérale peut théoriquement entraîner une achromasie des basophiles par rapport aux mêmes dilutions d'eau distillée ou par rapport aux témoins "Tyrode avec calcium". On peut invoquer une reconnaissance des chaînes légères de l'IgE par l'anti-IgG ou une réaction anaphylactique IgGdépendante).(The weight-specific anti-IgG can theoretically cause achromasia of basophils with respect to the same dilutions of distilled water or with respect to "Tyrode with calcium" controls. anti-IgG or an IgG-dependent anaphylactic reaction).

3. En présence de calcium seul, c'est-à-dire sans addition d'anti-IgE, le nombre de basophiles ne doit pas varier de plus de 25%. Ceci est vérifié en comparant le nombre des basophiles mis en présence de tampon de Tyrode-calcium avec celui des basophiles mis en présence de tampon de Tyrode sans calcium. 3. In the presence of calcium alone, that is to say without addition of anti-IgE, the number of basophils should not vary by more than 25%. This is verified by comparing the number of basophils in the presence of Tyrode-calcium buffer with that of basophils in the presence of Tyrode buffer without calcium.

L'achromasie est ainsi déterminée

basos = basophiles
Pour chaque expérience sélectionnée selon les critères
1) calcul de la différence entre la moyenne du nombre de basophiles comptés dans les puits contenant la solution anti-IgE et la moyenne du nombre de basophiles comptés dans les puits contenant la solution témoin (eau distillée ou anti-IgG), pour toutes les dilutions comprises entre 1 x 1021 et 1 x 1030. Achromasia is thus determined

basos = basophiles
For each experiment selected according to the criteria
1) calculation of the difference between the average number of basophils counted in the wells containing the anti-IgE solution and the average number of basophils counted in the wells containing the control solution (distilled or anti-IgG), for all dilutions between 1 x 1021 and 1 x 1030.

2) recherche, également, pour les hautes dilutions d'anti-IgE, de la présence d'au moins un pic d'achromasie de 3 à 4 points successifs significatifs en fonction des données de l'abaque (paragraphe VI-2). 2) also seeks, for the high dilutions of anti-IgE, the presence of at least one achromatic peak of 3 to 4 successive significant points according to the abacus data (paragraph VI-2).

b) Représentation des résultats
Elle est faite après ouverture des codes, au terme de 18 expériences d'activation interprétables (c.a.d. répondant aux critères de sélection).b) Representation of results
It is done after opening the codes, after 18 interpretable activation experiments (ie meeting the selection criteria).

Le nombre d'expériences nécessaires a été déterminé après analyse statistique des résultats fournis par des expériences préliminaires. The number of experiments required was determined after statistical analysis of the results provided by preliminary experiments.

Les résultats sont représentés de la façon suivante
Les dilutions (anti-IgE, anti-IgG ou eau distillée) logarithmiques sont portées en abscisses tandis que le nombre de basophiles est porté en ordonnées.The results are represented as follows
The logarithmic dilutions (anti-IgE, anti-IgG or distilled water) are plotted on the abscissa while the number of basophils is plotted on the ordinate.

Chaque graphique correspond à une expérience. Il comporte
1) une courbe qui représente les variations du nombre de basophiles en fonction des dilutions d'anti-IgE;
2) une (ou deux) courbe(s) contrôle(s) figurant les variations du nombre de basophiles en fonction des dilutions d'eau distillée et/ou d'anti-IgG.Each graph corresponds to an experiment. It comprises
1) a curve which represents the variations in the number of basophils as a function of the dilutions of anti-IgE;
2) one (or two) control curve (s) showing the variations in the number of basophils according to the dilutions of distilled water and / or anti-IgG.

En fonction du nombre moyen de basophiles obtenu pour les dilutions témoins d'eau distillée et pour le témoin "Tyrode avec calcium", on definit une limite de significativité correspondant au nombre en-dessous duquel l'effet de l'anti-IgE (ou de l'anti-IgG) sera considéré comme significatif. Cette limite correspond le plus souvent à environ 20% d'achromasie. Elle est donnée par une abaque (cf. figure 4) et est représentée en pointillé sur les graphiques. Based on the average number of basophils obtained for the control dilutions of distilled water and for the "Tyrode with calcium" control, a significance limit corresponding to the number below which the effect of anti-IgE (or anti-IgG) will be considered significant. This limit most often corresponds to about 20% of achromasia. It is given by an abacus (see Figure 4) and is represented in dashed lines on the graphs.

Plus le nombre de basophiles est faible par comparaison avec la moyenne des témoins, plus l'effet observé est significatif. The lower the number of basophils compared to the average of the controls, the greater the effect observed.

On a représenté sur la figure 4 l'abaque pour déterminer la significativité de l'achromasie des basophiles humains. The abacus is shown in FIG. 4 to determine the significance of the achromasia of human basophils.

L'abaque indique la significativité (p < 0,05) de l'achromasie observée pour les basophiles. Exemple lorsque 70 basophiles sont comptés dans le puits contrôle, 56 basophiles, au plus, doivent être comptés dans le puits test pour que l'achromasie soit significative. The abacus indicates the significance (p <0.05) of the achromasia observed for basophils. Example: When 70 basophils are counted in the control well, at most 56 basophils must be counted in the test well for achromasia to be significant.

VI- PROTOCOLE EXPERIMENTAL DE LA MODULATION DE
L'ACHROMASIE DES BASOPHILES PAR APIS MELLIFICA
Ce protocole est pratiqué soit en même temps que le protocole "activation" lorsque le nombre de basophiles dans le sang total du donneur est suffisant (supérieur à 15 sur une chambre de Fuchs-Rosenthal), soit indépendamment du protocole "activation", sur le sang d'un autre donneur.VI- EXPERIMENTAL PROTOCOL OF THE MODULATION OF
THE ACHROMASY OF BASOPHILES BY APIS MELLIFICA
This protocol is practiced at the same time as the "activation" protocol when the number of basophils in the donor's whole blood is sufficient (greater than 15 on a Fuchs-Rosenthal chamber), or independently of the "activation" protocol, on the blood from another donor.

1) Principe :
L'effet modulateur de dilutions d'Apis mellifica de 15 à 20CH (Centésimale Hahnemannienne) est testé comparativement au contrôle correspondant, NaC1 137 mM 20CH sur l'achromasie des basophiles en présence de dilutions pondérales d'anti-IgE. L'effet d'Apis mellifica et de NaCl 137 mM est testé, à titre de contrôle, sur des basophiles mis en présence du seul tampon de dilution des anti-IgE, sans anti-IgE. 1) Principle:
The modulating effect of Apis mellifica dilutions from 15 to 20CH (Hahnemannian centesimal) is tested compared to the corresponding control, 137CM NaCI 20CH on basophil achromasia in the presence of weight dilutions of anti-IgE. The effect of Apis mellifica and 137 mM NaCl is tested, as a control, on basophils in the presence of the single anti-IgE dilution buffer, without anti-IgE.

2) Les dilutions d'Apis mellifica et de NaCl 137 mM
Elles sont fournies par les laboratoires Boiron
L.H.F. (Lyon, France) en ampoules stériles de lml, dans du NaCl 137 mM. Le contenu des ampoules est transvasé dans des tubes stériles neufs de 5 ml en polypropylène, sous hotte à flux laminaire. Les tubes sont bouchés au fur et à mesure et agités pendant 30 secondes sur un Vortex.2) Dilutions of Apis mellifica and 137 mM NaCl
They are provided by Boiron laboratories
LHF (Lyon, France) in sterile 1 ml ampoules, in 137 mM NaCl. The contents of the ampoules are transferred to new sterile 5 ml polypropylene tubes under a laminar flow hood. The tubes are plugged as and and stirred for 30 seconds on a Vortex.

Des ampoules identiques sont adressées à un laboratoire extérieur afin de contrôler la qualité des produits par spectrométrie de masse. Identical bulbs are sent to an outside laboratory to control the quality of products by mass spectrometry.

3) Codage des dilutions d'Apis mellifica et de
NaCl 137 mM
Dans ce protocole, nous avons étudié l'effet modulateur des dilutions 15 à 20CH d'Apis mellifica comparativement à un contrôle, la dilution 20CH de
NaCl 137 mM.3) Coding of the dilutions of Apis mellifica and
137 mM NaCl
In this protocol, we studied the modulatory effect of Apis mellifica dilutions 15 to 20CH compared to a control, the 20CH dilution of
137 mM NaCl.

Toutes ces dilutions sont testées en aveugle. Un numéro de code arbitraire compris entre 1 et 8 est attribué au hasard à chacune des dilutions (6 dilutions 15 à 20CH d'Apis mellifica et 2 dilutions 20CH de NaCl 137 mM) par le chercheur étranger au laboratoire qui contrôle le processus et est responsable de l'interprétation statistique des résultats. All these dilutions are blind tested. An arbitrary code number between 1 and 8 is randomly assigned to each of the dilutions (6 dilutions 15 to 20CH of Apis mellifica and 2 dilutions 20CH of 137mM NaCl) by the foreign researcher to the laboratory that controls the process and is responsible the statistical interpretation of the results.

Pour ce faire, une étiquette portant un numéro de code est collée sur chacun des tubes contenant la dilution correspondante. Le code est changé à chaque nouvelle expérience, de nouvelles étiquettes portant un nouveau numéro remplaçant les précédentes. To do this, a label bearing a code number is pasted on each of the tubes containing the corresponding dilution. The code is changed with each new experiment, new labels bearing a new number replacing the previous ones.

Les tubes codés sont conservés d'une expérience à l'autre à +4"C sous feuille d'aluminium pendant 2 semaines. Après ce tempos, une nouvelle procédure (transvasement des ampoules dans les tubes et codage) est réalisée et ce, pendant toute la durée du protocole expérimental. The coded tubes are preserved from one experiment to another at + 4 ° C. under aluminum foil for 2 weeks After this time, a new procedure (transferring of the ampoules into the tubes and coding) is carried out and this, during the entire duration of the experimental protocol.

4) Les dilutions ponderales d'anti-IgE
Les dilutions (1 x 102 à 1 x 104 ) sont préparées manuellement en tampon de dilution (tampon de Tyrode
HEPES + Ca++ 11 mM final, pH 7,40), sous hotte à flux laminaire, en tubes stériles de 5ml en polypropylène, à partir d'antisérum de chèvre anti-IgE humaine (1 mg/ml d'anticorps) aliquote en tubes eppendorf et conservé à -20 C. 4) Weight dilutions of anti-IgE
Dilutions (1 x 102 to 1 x 104) are prepared manually in dilution buffer (Tyrode's buffer
HEPES + Ca ++ 11 mM final, pH 7.40), under laminar flow hood, in sterile polypropylene 5 ml tubes, from goat anti-human IgE antiserum (1 mg / ml antibody) aliquot into tubes eppendorf and stored at -20 C.

Dix 41 d'anti-IgE (1 mg/ml) sont ajoutés à 990 41 de tampon de dilution. Le tube est bouché et agité pendant 30 secondes sur un Vortex : la dilution 1 x 102 est obtenue. Ten anti-IgE (1 mg / ml) are added to 990 μl of dilution buffer. The tube is plugged and stirred for 30 seconds on a Vortex: the 1 x 102 dilution is obtained.

Cent 41 en sont prélevés et ajoutés à 900 tl de tampon de dilution contenus dans un second tube. One hundred and forty-one were taken and added to 900 μl of dilution buffer contained in a second tube.

Celui-ci est bouché et agité à son tour pendant 30 secondes sur le Vortex. On obtient ainsi la dilution 1 x 103 et on procède de même pour la dilution 1 x 104.It is clogged and stirred in turn for 30 seconds on the Vortex. The 1 x 103 dilution is thus obtained and the same procedure is followed for the 1 x 104 dilution.

5) Le protocole lui-même
Dans un premier temps ont donc été préparées
- les dilutions d'Apis mellifica,
- les dilutions d'anti-IgE,
- la suspens ion cellulaire enrichie en basophiles (paragraphe IV).5) The protocol itself
At first were therefore prepared
- the dilutions of Apis mellifica,
the dilutions of anti-IgE,
cell suspension enriched with basophils (paragraph IV).

Le test
- Dix l de chacune des 8 dilutions codées sont déposées au fond des puits à fond rond d'une plaque de microtitration stérile (Costar). Chacune des dilutions est déposée autant de fois que de doses d'anti-IgE à inhiber et une fois pour le tampon de dilution. Dans le présent protocole, les dilutions codées d'Apis mellifica et de NaCl 137 mM sont donc déposées 4 fois (anti-IgE 1 x 102, 1 x 103, 1 X 104; tampon de dilution). The test
Ten μl of each of the 8 coded dilutions are deposited at the bottom of the round bottom wells of a sterile microtiter plate (Costar). Each of the dilutions is deposited as many times as doses of anti-IgE to be inhibited and once for the dilution buffer. In this protocol, the coded dilutions of Apis mellifica and 137 mM NaCl are therefore deposited 4 times (anti-IgE 1 x 102, 1 x 103, 1 x 104, dilution buffer).

- Dix 41 de suspens ion riche en basophiles sont ensuite déposés dans chacun des puits. Ten of suspensions rich in basophils are then deposited in each of the wells.

- La plaque est délicatement agitée par rotation très douce afin d'homogénéiser le contenu des puits et laissée 30 minutes à température ambiante, sous ruban adhésif et couvercle afin d'éviter toute évaporation. - The plate is gently agitated by very gentle rotation to homogenize the contents of the wells and left for 30 minutes at room temperature, tape and cover to prevent evaporation.

- Après ce temps de pré incubation des basophiles avec les produits 20 41 d'anti-IgE aux dilutions 1 x 102, 1 x 103, 1 x 104 et 20 41 de tampon de
Tyrode-HEPES contenant du calcium 11 mM (et sans anti-IgE) sont ajoutés aux puits pour chacune des dilutions codées d'Apis mellifica et de NaCl 137 mM.After this pre-incubation time of the basophils with the anti-IgE products at 1 x 102, 1 x 103, 1 x 104 and 20
Tyrode-HEPES containing 11 mM calcium (and without anti-IgE) are added to the wells for each of the coded dilutions of Apis mellifica and 137 mM NaCl.

- La plaque est doucement agitée pour homogénéiser le contenu des puits et placée 15 minutes à 37"C sous ruban adhésif et couvercle afin d'éviter l'évaporation dans les puits. - The plate is gently agitated to homogenize the contents of the wells and placed 15 minutes at 37 ° C under adhesive tape and cover to prevent evaporation in the wells.

- Après incubation, 90 41 de bleu de toluidine sont ajoutés à chacun des puits et immédiatement agités par aspirations et refoulements, à l'aide d'une pipette multicanaux. On change les cônes entre chaque rangée de puits. After incubation, 90 ml of toluidine blue are added to each of the wells and immediately agitated by aspirations and expulsions, using a multichannel pipette. The cones are changed between each row of wells.

- Après coloration, la plaque est recouverte d'un ruban adhésif et conservée une nuit à +4"C avant de procéder à la lecture. La coloration des cellules lavées est plus homogène après plusieurs heures.  After staining, the plate is covered with an adhesive tape and kept overnight at +4 ° C. before reading.The staining of the washed cells is more homogeneous after several hours.

Schéma de plaque
Les témoins "Tyrode sans Cl++" (*) sont ajoutés, au même titre que dans le protocole "activation", pour contrôler la sensibilité des basophiles au calcium.Plate diagram
The "Tyrode without Cl ++" (*) controls are added, in the same way as in the "activation" protocol, to control the sensitivity of basophils to calcium.

6) Lecture au microscope et compte des basophiles:
Le principe est identique à celui décrit pour l'activation des basophiles (paragraphe V-3).6) Reading under a microscope and counting basophils:
The principle is identical to that described for the activation of basophils (paragraph V-3).

7) Les résultats
Les comptes de basophiles sont reportés dans un tableau à l'image du schéma de la plaque et sont remis pour chaque expérience à la personne ayant fait le code.7) The results
The basophil counts are reported in a chart similar to the schematic of the plate and are given for each experiment to the person who made the code.

a) Interprétation des résultats
Les expériences, après décodage, ne sont retenues pour interprétation statistique que si elles répondent à 3 critères

a) Interpretation of results
The experiments, after decoding, are retained for statistical interpretation only if they meet 3 criteria

<tb> <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> n' <SEP> n <SEP> de <SEP> code
<tb> <SEP> aux <SEP> 6 <SEP> dilutions <SEP> d'Apis <SEP> mel
<tb> <SEP> algE <SEP> 1 <SEP> x <SEP> lo2 <SEP> I <SEP> I <SEP> I <SEP> I <SEP> I <SEP> I <SEP> 1 <SEP> 15CH <SEP> 20cl <SEP> et <SEP> aurr <SEP> 2 <SEP> dilutions
<tb> <SEP> algE <SEP> i <SEP> x <SEP> io3 <SEP> contr31es <SEP> de <SEP> NbCl <SEP> 137 <SEP> mM.
<tb><tb><SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> n '<SEP> n <SEP> from <SEP > code
<tb><SEP> to <SEP> 6 <SEP><SEP> dilutions of Apis <SEP> mel
<tb><SEP> algE <SEP> 1 <SEP> x <SEP> lo2 <SEP> I <SEP> I <SEP> I <SEP> I <SEP> I <SEP> I <SEP> 1 <SEP> 15CH <SEP> 20cl <SEP> and <SEP> aurr <SEP> 2 <SEP> dilutions
<tb><SEP> algE <SEP> i <SEP> x <SEP> io3 <SEP> Controllers <SEP> of <SEP> NbCl <SEP> 137 <SEP> mM.
<Tb>

<SEP> aigu <SEP> 1 <SEP> x <SEP> 104
<tb> <SEP> '\ynzde-Ca <SEP> L <SEP> ~ <SEP> t <SEP> f <SEP> { <SEP> H <SEP> - <SEP> 10 <SEP> pI <SEP> de <SEP> dilutions <SEP> codées <SEP> et
<tb> <SEP> - <SEP> 10 <SEP> ,ul <SEP> de <SEP> basophiles <SEP> sont <SEP> placés
<tb> <SEP> dans <SEP> les <SEP> puits <SEP> de <SEP> la <SEP> plaque
<tb> <SEP> PREINCUBATION <SEP> 30 <SEP> min <SEP> t" <SEP> amiante
<tb> <SEP> <SEP> *| <SEP> - <SEP> 20 <SEP> p1 <SEP> aIgE <SEP> ou <SEP> Tyrode-Ca
<tb> <SEP> ++ <SEP> sans <SEP> Ca++ <SEP> t <SEP> INCUBATION <SEP> 15 <SEP> min <SEP> 33 C
<tb> Témoins <SEP> sans <SEP> Ca <SEP> :<SEP> 10 <SEP> pi <SEP> de <SEP> NaCl <SEP> - <SEP> 90 <SEP> pi <SEP> bleu <SEP> de <SEP> toluidine
<tb> 137 <SEP> mM <SEP> + <SEP> 10 <SEP> pi <SEP> basophiles <SEP> sont <SEP> placés <SEP> CONSERVATION <SEP> 1 <SEP> nuit <SEP> +4"C
<tb> dans <SEP> chacun <SEP> des <SEP> deux <SEP> puits <SEP> térneins <SEP> qui <SEP> LECTURE
<tb> sont <SEP> dits <SEP> "telllUills <SEP> SdllS <SEP> calciuin", <SEP> puis
<tb> pr+incubation, <SEP> + <SEP> 20 <SEP> pi <SEP> de <SEP> Tyrode <SEP> sans
<tb> Ca <SEP> + <SEP> - <SEP> incubation <SEP> --r <SEP> coloration <SEP> --sr
<tb> lecture
<tb>
1. Nombre de basophiles dans les témoins supérieur à 35 (basophiles préincubés avec du NaCl 137 mM ou avec Apis mellifica et n'ayant pas été mis en présence d'anti-IgE).<SEP> acute <SEP> 1 <SEP> x <SEP> 104
<tb><SEP>'\ ynzde-Ca <SEP> L <SEP> ~ <SEP> t <SEP> f <SEP>{SEP> H <SEP> - <SEP> 10 <SEP> pI <SEP><SEP><SEP> coded dilutions <SEP> and
<tb><SEP> - <SEP> 10 <SEP>, <SEP> ul <SEP> basophil <SEP> are <SEP> placed
<tb><SEP> in <SEP><SEP> wells <SEP> of <SEP><SEP> plate
<tb><SEP> PREINCUBATION <SEP> 30 <SEP> min <SEP> t "<SEP> Asbestos
<tb><SEP><SEP> * | <SEP> - <SEP> 20 <SEP> p1 <SEP> aIgE <SEP> or <SEP> Tyrode-Ca
<tb><SEP> ++ <SEP> without <SEP> Ca ++ <SEP> t <SEP> INCUBATION <SEP> 15 <SEP> min <SEP> 33 C
<tb> Controls <SEP> without <SEP> Ca <SEP>: <SEP> 10 <SEP> pi <SEP> from <SEP> NaCl <SEP> - <SEP> 90 <SEP> pi <SEP> blue <SEP > of <SEP> toluidine
<tb> 137 <SEP> mM <SEP> + <SEP> 10 <SEP> pi <SEP> basophil <SEP> are <SEP> placed <SEP> CONSERVATION <SEP> 1 <SEP> night <SEP> +4 " C
<tb> in <SEP> each <SEP> of <SEP> two <SEP> well <SEP> terpenes <SEP> which <SEP> READ
<tb> are <SEP> said <SEP>"telllUills<SEP> SdllS <SEP>calciuin",<SEP> then
<tb> pr + incubation, <SEP> + <SEP> 20 <SEP> pi <SEP> of <SEP> Tyrode <SEP> without
<tb> Ca <SEP> + <SEP> - <SEP> incubation <SEP> --r <SEP> staining <SEP> --sr
<tb> reading
<Tb>
1. Number of basophils in controls greater than 35 (basophils preincubated with 137 mM NaCl or with Apis mellifica and not exposed to anti-IgE).

2. Sensibilité spontanée des basophiles au calcium seul inférieure à 25% d'achromasie en comparant d'une part les basophiles qui, préincubés avec du NaCl 137 mM, sont, en l'absence de tout anti
IgE, mis en présence de tampon de Tyrode-calcium avec, d'autre part, ceux mis en présence de tampon de Tyrode sans calcium.2. Spontaneous sensitivity of basophils to calcium alone less than 25% achromasia by comparing on the one hand basophils which, preincubated with 137 mM NaCl, are, in the absence of any anti
IgE, in the presence of Tyrode-calcium buffer with, on the other hand, those in the presence of Tyrode buffer without calcium.

3. Présence d'au moins une dose d'anti-IgE présentant une achromasie comprise entre 40 et 60% des basophiles qui, préincubés avec NaC1 137 mM, sont mis en présence d'anti-IgE 1 x 102 à 1 x 104 par rapport à ceux mis en présence de tampon de Tyrode-Ca++ sans anti-IgE. Ceci est fondé sur des études préliminaires qui ont montré qu'en-dessous de 40%, l'achromasie des basophiles est trop faible pour que l'étude de l'inhibition puisse être effectuée. Au-dessus de 60%, elle est trop forte pour pouvoir être significativement modulée par des agonistes à haute dilution. 3. Presence of at least one dose of anti-IgE exhibiting an achromasia of between 40 and 60% of the basophils which, preincubated with 137 mM NaCl, are brought into contact with anti-IgE 1 x 102 at 1 x 104 per compared to those in the presence of Tyrode-Ca ++ buffer without anti-IgE. This is based on preliminary studies that showed that below 40%, the achromasia of basophils is too weak for the study of inhibition to be performed. Above 60%, it is too strong to be significantly modulated by high dilution agonists.

L'achromasie des basophiles est ainsi déterminée:

basos = basophiles
b) Représentation des résultats
Trois types de résultats (en nombre de basophiles) sont obtenus et doivent être comparés
- les puits correspondant aux basophiles mis en présence d'Apis mellifica ou de NaCl 137 mM mais sans anti-IgE donnent le nombre maximal de basophiles. Ce sont les témoins de référence.Achromasia of basophils is thus determined:

basos = basophiles
b) Representation of results
Three types of results (in number of basophils) are obtained and must be compared
the wells corresponding to the basophils placed in the presence of Apis mellifica or of 137 mM NaCl but without anti-IgE give the maximum number of basophils. These are the reference witnesses.

- les puits correspondant aux basophiles mis en présence de NaCl 137 mM et d'anti-IgE sans Apis mellifica donnent le nombre minimal de basophiles (achromasie maximale). the wells corresponding to the basophils placed in the presence of 137 mM NaCl and anti-IgE without Apis mellifica give the minimum number of basophils (maximum achromasia).

- les puits correspondant aux basophiles mis en présence d'Apis mellifica et d'anti-IgE donnent un nombre de basophiles sur lequel est évalué l'éventuel effet modulateur du produit. Plus ce nombre se rapprochera du nombre maximal de basophiles, plus l'effet inhibiteur sera grand. Inversement, plus ce nombre se rapprochera du nombre minimal de basophiles, plus l'effet inhibiteur sera faible ou nul. S'il devient inférieur à ce nombre minimal, l'effet est activateur. the wells corresponding to the basophils placed in the presence of Apis mellifica and anti-IgE give a number of basophils on which is evaluated the possible modulatory effect of the product. The closer this number is to the maximum number of basophils, the greater the inhibitory effect. Conversely, the closer this number gets to the minimum number of basophils, the lower the inhibitory effect or zero. If it becomes less than this minimum number, the effect is activating.

La représentation graphique
Pour chaque dose d'anti-IgE testée, les dilutions d'Apis mellifica et les dilutions contrôles de NaCl 137 mM sont portées en abscisses tandis que le nombre de basophiles est porté en ordonnées.The graphical representation
For each dose of anti-IgE tested, the dilutions of Apis mellifica and the control dilutions of 137 mM NaCl are plotted on the abscissa while the number of basophils is plotted on the ordinate.

Chaque graphique comporte
1) une courbe qui représente les variations du nombre de basophiles en présence d'anti-IgE en fonction des dilutions d'Apis mellifica et de NaCl 137mM;
2) une courbe qui représente les variations du nombre de basophiles en présence de tampon Tyrode-Ca++ sans anti-IgE en fonction des dilutions d'Apis mellifica et de NaCl 137 mM.Each graph includes
1) a curve which represents the variations in the number of basophils in the presence of anti-IgE as a function of the dilutions of Apis mellifica and of 137 mM NaCl;
2) a curve which represents the variations of the number of basophils in the presence of Tyrode-Ca ++ buffer without anti-IgE as a function of the dilutions of Apis mellifica and 137 mM NaCl.

c) Analyse statistique des résultats
L'effet modulateur des dilutions d'APis mellifica est étudié statistiquement par un test de rang de
Whitney-Wilcoxon à l'issue d'une série d'une quinzaine d'expériences indépendantes. On comparera, pour chaque dilution d'APis mellifica, le nombre de basophiles mis en présence d'une dose d'anti-IgE avec le nombre de basophiles préincubés avec du NaCl 137 mM et mis en présence de la même dose d'anti-IgE. c) Statistical analysis of the results
The modulatory effect of APis mellifica dilutions is studied statistically by a rank test of
Whitney-Wilcoxon at the end of a series of fifteen independent experiments. For each dilution of APis mellifica, the number of basophils placed in the presence of a dose of anti-IgE with the number of basophils preincubated with 137 mM NaCl and compared with the same dose of anti- IgE.

Ces études sont effectuées de façon indépendante par les personnes responsables du contrôle des expériences et de l'interprétation statistique des résultats.  These studies are performed independently by those responsible for the control of the experiments and the statistical interpretation of the results.

Claims (14)

REVENDICATIONS 1. Procédé de contrôle de la dilution et de la contamination d'une solution de dilution déterminée provenant d'une solution initiale contenant une substance active, procédé dans lequel - la solution initiale subit des dilutions successives, la première dilution de la solution initiale étant obtenue par prélèvement d'une fraction ou de la totalité de la solution initiale, et le mélange de cette fraction ou de la totalité de la solution initiale dans une solution de dilution, ce qui donne la solution de première dilution, la deuxième dilution de la solution initiale étant obtenue par prélèvement d'une fraction ou de la totalité de la solution de première dilution, et le mélange de cette fraction ou de la totalité de la solution de première dilution dans une solution de dilution, pour donner la solution de deuxième dilution et ainsi de suite, jusqu'à la solution de la dernière dilution, - chacune des solutions allant de la solution de première dilution à la solution de dernière dilution constituant une solution de dilution déterminée, - chaque solution de dilution déterminée subit une agitation vigoureuse, - les dilutions successives étant telles qu'au moins une des solutions de dilution déterminée contient la substance active en quantité inférieure à 10-10 moles, avantageusement inférieure à 10-12 moles/l et de préférence inférieure à 10-14 moles/l, ou ne contient plus de substance active, ladite solution de dilution déterminée présentant encore une activité à des dilutions supérieures à celle à laquelle la substance active a disparu, caractérisé en ce que:: - on introduit, avant au moins l'une quelconque des dilutions n, n étant un nombre entier supérieur à 0, dans la solution de dilution n-l une substance témoin soluble dans ladite solution et n'interférant pas avec la solution de dilution n-l, et la substance témoin présentant la propriété de disparaître entre la dilution n - 1 + m et n + m, m étant le nombre de dilutions où est présente la substance témoin, et étant compris notamment de 5 à 8, - on dose au moins une fois la substance témoin après la dilution n, de préférence au moins une fois dans l'intervalle allant de la dilution n à la dilution n - 1 + m et au moins une fois dans l'intervalle allant de la dilution n + m à la dilution n + m + y, y étant la plage de dilution libre de substance témoin et étant avantageusement compris de 3 à 5, - et de la dilution n à la dilution n - 1 + m, on compare la valeur de la concentration de la substance témoin obtenue et la valeur de la concentration de la substance témoin calculée d'après la dilution, ce qui permet de contrôler quantitativement les dilutions, et - de la dilution n + m à la dilution n + m + y, on vérifie qu'il n'y a plus de substance témoin, ce qui permet de contrôler d'une part la qualité des dilutions. et d'autre part l'absence de contamination. A method of controlling the dilution and contamination of a specific dilution solution from an initial solution containing an active substance, wherein the initial solution undergoes successive dilutions, the first dilution of the initial solution being obtained by taking a fraction or all of the initial solution, and mixing this fraction or the totality of the initial solution in a dilution solution to give the first dilution solution, the second dilution of the original initial solution being obtained by taking a fraction or all of the first dilution solution, and mixing that fraction or all of the first dilution solution in a dilution solution to give the second dilution solution and so on, until the solution of the last dilution, - each of the solutions ranging from the first dilution solution to the the dilution of the last dilution constituting a determined dilution solution, - each determined dilution solution undergoes vigorous stirring, - the successive dilutions being such that at least one of the determined dilution solutions contains the active substance in an amount of less than 10-10 moles , advantageously less than 10-12 mol / l and preferably less than 10-14 mol / l, or no longer contains active substance, said determined dilution solution still having an activity at dilutions higher than that at which the active substance has disappeared, characterized in that before any of the dilutions n, n is introduced, n being an integer greater than 0, in the dilution solution nl a control substance that is soluble in said solution and does not interfere with not with the dilution solution nl, and the control substance having the property of disappearing between the dilution n - 1 + m and n + m, m eta In the number of dilutions in which the control substance is present, and being comprised in particular from 5 to 8, the control substance is dosed at least once after the dilution, preferably at least once in the interval ranging from the dilution. n at the dilution n - 1 + m and at least once in the range from the dilution n + m to the dilution n + m + y, y being the free dilution range of the control substance and being advantageously comprised of 3 at 5, - and from dilution n to the dilution n - 1 + m, the value of the concentration of the control substance obtained is compared with the value of the concentration of the control substance calculated from the dilution, which allows to control quantitatively the dilutions, and - from the dilution n + m to the dilution n + m + y, one verifies that there is no more of control substance, which makes it possible to control on the one hand the quality of the dilutions . and on the other hand the absence of contamination. 2. Procédé de contrôle de la dilution et de la contamination d'une solution de dilution déterminée provenant d'une solution initiale contenant une substance active, procédé dans lequel - la solution initiale subit des dilutions successives, la première dilution de la solution initiale étant obtenue par prélèvement d'une fraction ou de la totalité de la solution initiale, et le mélange de cette fraction ou de la totalité de la solution initiale dans une solution de dilution, ce qui donne la solution de première dilution, la deuxième dilution de la solution initiale étant obtenue par prélèvement d'une fraction ou de la totalité de la solution de première dilution, et le mélange de cette fraction ou de la totalité de la solution de première dilution dans une solution de dilution, pour donner la solution de deuxième dilution et ainsi de suite, jusqu'à la solution de la dernière dilution, - chacune des solutions allant de la solution de première dilution à la solution de dernière dilution constituant une solution de dilution déterminée, - chaque solution de dilution déterminée subit une agitation vigoureuse, - les dilutions successives étant telles qu'au moins une des solutions de dilution déterminée contient la substance active en quantité inférieure à 10-10 moles, avantageusement inférieure à 10-12 moles/l et de préférence inférieure à 10-14 moles/l, ou ne contient plus de substance active, ladite solution de dilution déterminée présentant encore une activité à des dilutions supérieures à celle à laquelle la substance active a disparu, caractérisé en ce que:: - on introduit, avant au moins l'une quelconque des dilutions n, n étant un nombre entier supérieur à 0, dans la solution de dilution n-l une substance témoin soluble dans ladite solution et n'interférant pas avec la solution de dilution n-l, A method of controlling the dilution and contamination of a specific dilution solution from an initial solution containing an active substance, wherein the initial solution undergoes successive dilutions, the first dilution of the initial solution being obtained by taking a fraction or all of the initial solution, and mixing this fraction or the totality of the initial solution in a dilution solution to give the first dilution solution, the second dilution of the original initial solution being obtained by taking a fraction or all of the first dilution solution, and mixing that fraction or all of the first dilution solution in a dilution solution to give the second dilution solution and so on, until the solution of the last dilution, - each of the solutions ranging from the first dilution solution to the olution of last dilution constituting a determined dilution solution, - each determined dilution solution undergoes a vigorous stirring, - the successive dilutions being such that at least one of the determined dilution solutions contains the active substance in an amount of less than 10-10 moles , advantageously less than 10-12 mol / l and preferably less than 10-14 mol / l, or no longer contains active substance, said determined dilution solution still having an activity at dilutions higher than that at which the active substance has disappeared, characterized in that before any of the dilutions n, n is introduced, n being an integer greater than 0, in the dilution solution nl a control substance that is soluble in said solution and does not interfere with not with the dilution solution nl, * la substance témoin présentant la propriété d'être détectable à des dilutions supérieures à celle à partir de laquelle la substance active n'est plus détectable, et the control substance exhibiting the property of being detectable at dilutions higher than that from which the active substance is no longer detectable, and * la substance témoin présentant également la propriété de disparaître entre la dilution n - 1 + m et n + m, m étant le nombre de dilutions où est présente la substance témoin et étant compris notamment de 5 à 8, - on dose au moins une fois la substance témoin après la dilution n, de préférence au moins une fois dans l'intervalle allant de la dilution n à la dilution n - 1 + m et au moins une fois dans l'intervalle allant de la dilution n + m à la dilution n + m + y, y étant la plage de dilution libre de substance témoin et étant avantageusement compris de 3 à 5, - et de la dilution n à la dilution n - 1 + m on compare la valeur de la concentration de la substance témoin obtenue et la valeur de la concentration de la substance témoin calculée d'après la dilution, ce qui permet de contrôler quantitativement les dilutions, et - de la dilution n + m à la dilution n + m + y, on vérifie qu'il n'y a plus de substance témoin, ce qui permet de contrôler d'une part la qualité des dilutions et d'autre part l'absence de contamination. the control substance also having the property of disappearing between the dilution n-1 + m and n + m, m being the number of dilutions where the control substance is present and being comprised in particular of 5 to 8, the dose is measured at least one the control substance after dilution n, preferably at least once in the range from dilution n to the dilution n - 1 + m and at least once in the range from dilution n + m to dilution n + m + y, y being the free dilution range of the control substance and advantageously being from 3 to 5, and from the dilution n to the dilution n-1 + m the value of the concentration of the substance is compared. obtained control and the value of the concentration of the control substance calculated from the dilution, which allows to control quantitatively the dilutions, and - from the dilution n + m to the dilution n + m + y, it is verified that it no more control substance, which makes it possible to control a p the quality of dilutions and the absence of contamination. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, dans lequel la substance témoin présente la propriété selon laquelle si elle est introduite dans la solution initiale avant la première dilution de la solution de départ et si la substance active disparaît (n'est plus détectable) entre la dilution p et la dilution p + 1, la substance témoin disparaît entre la dilution p + x et la dilution p + x + 1, x étant compris notamment de 2 à 4, p étant compris notamment de 3 à 6. 3. Method according to one of claims 1 or 2, wherein the control substance has the property that if it is introduced into the initial solution before the first dilution of the starting solution and if the active substance disappears (is not more detectable) between the dilution p and the dilution p + 1, the control substance disappears between the dilution p + x and the dilution p + x + 1, x being included in particular from 2 to 4, p being included in particular from 3 to 6 . 4. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, dans lequel on introduit la substance témoin pour la première fois dans la solution de dilution n - 1, puis on réintroduit la substance témoin dans la solution de dilution qui suit celle qui correspond à la disparition de la substance témoin introduite dans la dilution n - 1, puis on réintroduit une deuxième fois la substance témoin dans la solution de dilution qui suit celle qui correspond à la disparition de la substance témoin réintroduite et ainsi de suite. 4. Method according to one of claims 1 or 2, wherein the control substance is introduced for the first time into the dilution solution n - 1, then the control substance is reintroduced into the dilution solution which follows that which corresponds to the disappearance of the control substance introduced into the dilution n - 1, then reintroduces a second time the control substance in the dilution solution that follows that which corresponds to the disappearance of the reintroduced control substance and so on. 5. Procédé selon la revendication 4, dans lequel on introduit la substance témoin pour la première fois dans la solution de dilution n - 1, la substance témoin disparaissant entre la dilution n - 1 + m et n + m, on réintroduit la substance témoin dans la solution de dilution n + m + y, y étant compris de 2 à 10, avantageusement de 3 à 5, et ainsi de suite. A process according to claim 4, wherein the control substance is introduced for the first time into the dilution solution n - 1, the control substance disappearing between the dilution n - 1 + m and n + m, the control substance is reintroduced. in the dilution solution n + m + y, y being from 2 to 10, advantageously from 3 to 5, and so on. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, dans lequel on introduit la substance témoin pour la première fois dans la solution de dilution n - 1, puis toutes les m dilutions, m étant compris de 5 à 15, avantageusement de 10 à 15, et avantageusement encore 10 ou 15. 6. Method according to one of claims 1 or 2, wherein the control substance is introduced for the first time into the dilution solution n - 1, then all m dilutions, m being between 5 to 15, advantageously 10. at 15, and advantageously still 10 or 15. 7. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, dans lequel - on introduit la substance témoin dans la solution initiale contenant la substance active avant la première dilution de ladite solution initiale, - on effectue les dilutions successives de la solution initiale contenant la substance active et la substance témoin, la première dilution de la solution initiale étant obtenue par prélèvement d'une fraction ou de la totalité de la solution initiale, et le mélange de cette fraction ou de la totalité de la solution initiale dans une solution de dilution, ce qui donne la solution de première dilution, la deuxième dilution de la solution initiale étant obtenue par prélèvement d'une fraction ou de la totalité de la solution de première dilution, et le mélange de cette fraction ou de la totalité de la solution de première dilution dans une solution de dilution, pour donner la solution de deuxième dilution et ainsi de suite, jusqu'a la solution de la dernière dilution, la substance active disparaît entre la dilution p et la dilution p + 1 et la substance témoin disparaît entre la dilution p + x et la dilution p + x + 1, p étant compris de 3 à 6, x étant compris de 2 à 4, la solution présentant encore une activité pour au moins une dilution supérieure ou égale à la dilution p + 1, - après la première dilution, on prélève pour au moins une dilution déterminée, à partir de la solution obtenue à l'issue de ladite dilution une quantité suffisante de solution pour doser la substance témoin, et de préférence on dose la substance témoin à chaque dilution de la dilution 1 à la dilution p + x et de préférence au moins une fois de la dilution p + x + 1 à la dilution 1 + p + x + y, y étant avantageusement compris de 2 à 10, avantageusement de 3 à 5, et avantageusement encore à chaque dilution de la dilution p + x + 1 à la dilution 1 + p + x + y, - et de la dilution 1 à la dilution p + x, on compare la valeur de la concentration de la substance témoin obtenue et la valeur de la concentration de la substance témoin calculée d'après la dilution, ce qui permet de contrôler quantitativement les dilutions et de la dilution p + x + 1 à la dilution 1 + p + x + y, on vérifie qu'il n'y a plus de substance témoin, ce qui permet de contrôler d'une part qu'il n'y a pas eu contamination et d'autre part la qualité des dilutions. 7. Method according to one of claims 1 or 2, wherein - the control substance is introduced into the initial solution containing the active substance before the first dilution of said initial solution, - the successive dilutions of the initial solution containing the active substance and the control substance, the first dilution of the initial solution being obtained by taking a fraction or all of the initial solution, and the mixture of this fraction or the totality of the initial solution in a dilution solution to give the first dilution solution, the second dilution of the initial solution being obtained by taking a fraction or all of the first dilution solution, and mixing that fraction or all of the solution of first dilution in a dilution solution, to give the second dilution solution and so on, until the solution of the last dil ution, the active substance disappears between the dilution p and the dilution p + 1 and the control substance disappears between the dilution p + x and the dilution p + x + 1, p being between 3 and 6, x being from 2 to 4, the solution still having an activity for at least one dilution greater than or equal to the dilution p + 1, - after the first dilution, is taken for at least one determined dilution, from the solution obtained at the end of said diluting a sufficient amount of solution to assay the control substance, and preferably the control substance is dosed at each dilution of the dilution 1 to the p + x dilution and preferably at least once of the dilution p + x + 1 at the dilution 1 + p + x + y, y being advantageously from 2 to 10, advantageously from 3 to 5, and advantageously still at each dilution of the dilution p + x + 1 at the dilution 1 + p + x + y, - and from dilution 1 to the dilution p + x, the value of the conc input of the control material obtained and the value of the concentration of the control substance calculated from the dilution, which makes it possible to quantitatively control the dilutions and the dilution p + x + 1 at the dilution 1 + p + x + y it is verified that there is no longer any control substance, which makes it possible to control, on the one hand, that there has been no contamination and, on the other hand, the quality of the dilutions. 8. Procédé selon la revendication 1, dans lequel on introduit pour la première fois la substance témoin avant la première dilution, puis on introduit la substance témoin pour la deuxième fois dans la solution de dilution qui suit celle à laquelle la substance témoin introduite pour la deuxième fois disparaît, puis on introduit une troisième fois la substance témoin dans la solution de dilution qui suit celle qui correspond à la disparition de la substance témoin introduite la deuxième fois, et ainsi de suite, et de façon avantageuse, chaque introduction de la substance témoin a lieu de 2 à 10, avantageusement 3 à 5 dilutions après celle qui correspond à la disparition de la substance témoin précédemment introduite. The method according to claim 1, wherein the control substance is introduced for the first time before the first dilution, and then the control substance is introduced for the second time into the dilution solution following that to which the control substance introduced for the first time. second time disappears, then introduced a third time the control substance in the dilution solution which follows that which corresponds to the disappearance of the control substance introduced the second time, and so on, and advantageously, each introduction of the substance control takes place from 2 to 10, advantageously 3 to 5 dilutions after that which corresponds to the disappearance of the control substance previously introduced. 9. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2 dans lequel on introduit la substance témoin avant la première dilution et toutes les m dilutions, m etant compris de 5 à 15, avantageusement de 10 à 15, et avantageusement encore 10 ou 15. 9. Method according to one of claims 1 or 2 wherein the control substance is introduced before the first dilution and all the mutions, ranging from 5 to 15, advantageously from 10 to 15, and advantageously still 10 or 15. 10. Procédé selon la revendication 2 dans lequel la substance témoin est introduite à la dilution n 1, et disparaissant entre la dilution n - 1 + m et n + m, elle est réintroduite à la dilution n + m + y l'intervalle m + y + 1 étant tel que, - sur environ l'une des deux moitiés de cet intervalle les dilutions sont telles que les solutions de dilution correspondantes ne sont pas actives et - sur environ l'autre moitié de cet intervalle, l'une au moins des solutions de dilution correspondantes est active. 10. The method of claim 2 wherein the control substance is introduced at the dilution n 1, and disappearing between the dilution n - 1 + m and n + m, it is reintroduced at the dilution n + m + y the interval m + y + 1 being such that, on about one of the two halves of this range the dilutions are such that the corresponding dilution solutions are not active and - on about the other half of this interval, one at less of the corresponding dilution solutions is active. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'on dose la substance témoin la dilution, avantageusement toutes les 10 dilutions, et de préférence encore à chaque dilution. 11. Process according to any one of the preceding claims, characterized in that the control substance is diluted, advantageously all dilutions, and more preferably at each dilution. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la solution initiale contient une substance active à raison d'environ lx10-3 à environ lx10-6 moles/l. 12. Method according to any one of the preceding claims, characterized in that the initial solution contains an active substance at a rate of about 1 × 10 -3 to about 1 × 10 -6 mol / l. 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la substance témoin est constituée par une enzyme, dont la présence est avantageusement détectable par son activité chromogène. 13. Method according to any one of the preceding claims, characterized in that the control substance is constituted by an enzyme, the presence of which is advantageously detectable by its chromogenic activity. 14. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'enzyme est choisie parmi la peroxydase, est notamment la peroxydase de raifort, détectable par sa réactivité avec le substrat D-phenylène diamine en milieu H2O2.  14. Method according to any one of the preceding claims, characterized in that the enzyme is selected from peroxidase, is in particular horseradish peroxidase, detectable by its reactivity with the D-phenylene diamine substrate in H2O2 medium.