FR2651505A1 - Fragments d'acides nucleiques derives d'un genome de mycobacterie appropriee, leurs applications dans le diagnostic des infections a mycobacteries et plasmides contenant lesdits fragments. - Google Patents
Fragments d'acides nucleiques derives d'un genome de mycobacterie appropriee, leurs applications dans le diagnostic des infections a mycobacteries et plasmides contenant lesdits fragments. Download PDFInfo
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Abstract
Fragments d'acides nucléiques, dérivés d'un génome de mycobactérie appropriée, notamment de Mycobacterium tuberculosis, leurs applications dans le diagnostic des infections à mycobactéries, ainsi que des plasmides contenant lesdits fragments. La séquence nucléotidique est constituée par une séquence nucléotidique répétée dans le génome d'une mycobactérie et spécifique du groupe du bacille de la tuberculose et en ce qu'elle s'hybride très fortement avec M. tuberculosis.
Description
La présente invention est relative à des fragments d'acides nucléiques, dérives d'un génome de mycobactérie appropriée, notamment de Mycobacterium tuberculosis, à leurs applications dans le diagnostic des infections à mycobactéries, ainsi qu'à des plasmides contenant lesdits fragments.
Les mycobactéries correspondent au genre Mycobacterium qui comprend au moins 54 espèces différentes.
Parmi celles-ci environ 10 sont pathogènes ou opportunistes pour l'homme ou l'animal. Deux d'entre-elles, M. tuberculosis et M. leprae sont respectivement les agents de la tuberculose et de la lèpre.
Lu est connu que ces deux maladies représentent un problème majeur de Santé Publique; en effet, il existe actuellement entre 15 et 60 millions d'individus atteints de tuberculose dans le Monde et 2 à 3 millions de personnes meurent chaque année à cause de cette infection. Dans les pays développés, M. tuberculosis est la cause la plus commune des infections mycobactériennes. En France, il apparaît environ 104 nouveaux cas de tuberculose par an. La vaccination par le BCG (Bacille de
Calmette et Guérit, une souche atténuée de M. bovis) est loin d'être efficace au sein de toutes les populations. Cette efficacité varie environ de 80 % dans les pays occidentaux comme l'Angleterre à 0 % en Inde (résultats du dernier essai de vaccination à
Chingleput).De plus, l'apparition de souches de M. tuberculosîs résistantes aux antituberculeux usuels et l'existence d'une corrélation entre tuberculose et SIDA ajoute à l'urgence de mettre au point une méthode rapide de détection et d'identification des mycobactéries.
Calmette et Guérit, une souche atténuée de M. bovis) est loin d'être efficace au sein de toutes les populations. Cette efficacité varie environ de 80 % dans les pays occidentaux comme l'Angleterre à 0 % en Inde (résultats du dernier essai de vaccination à
Chingleput).De plus, l'apparition de souches de M. tuberculosîs résistantes aux antituberculeux usuels et l'existence d'une corrélation entre tuberculose et SIDA ajoute à l'urgence de mettre au point une méthode rapide de détection et d'identification des mycobactéries.
Par exemple, une étude épidémiologique réalisée en Floride a montré que 10 % des malades atteints de SIDA sont atteints de tuberculose au moment du diagnostic du SIDA ou 18 mois avant celui-ci. Chez ces malades, la tuberculose apparaît dans 60 % des cas sous une forme disséminée donc non répérable par les critères de diagnostic classiques comme Ia radiographie pulmonaire ou l'analyse de crachats.
Enfin, le diagnostic de la tuberculose et des autres mycobactérioses apparentées est difficile à réaliser pour différentes raisons : les maladies pulmonaires causées par différentes mycobactéries ne peuvent pas être distinguées cliniquement, radiologiquement ou histologiquement; les mycobactéries sont souvent présentes en faible quantité et lorsqu'elles sont en quantité détectable par les méthodes classiquement utilisées, la maladie est déjà en évolution et les malades sont contagieux pour leur entourage ; de plus, en raison du temps de génération très long de ces bactéries (24 h pour M. tuberculosis comparé à 20 min pour E. coli), la culture de- ces organismes est difficile. Ainsi faut-il 6 à 8 semaines pour identifier les germes et davan tage pour obtenir un antibiogramme utilisable pour le traitement adéquat des malades.
La nécessité d'un test de détection n'exigeant pas de culture des germes et directement utilisable avec les échantillons pathologiques, même lorsque les germes y sont présents à de faibles concentrations, est donc indispensable.
Plusieurs techniques sont actuellement utilisées en clinique, pour identifier une infection mycobactérienne.
I1 faut tout d'abord citer la détection directe des microorganismes au microscope; cette technique est rapide, mais ne permet pas l'identification de l'espèce mycobactérienne observée et manque de sensibilité dans la mesure où un grand nombre de microerganlsmes doit être présent dans l'échantillon ( > 104/ml) pour permettre une détection fiable (BATES J., CHEST, 1979, 76, (suppL), 757-763).
Les cultures, lorsqu'elles sont positives, ont une spécificité approchant 100 % et permettent l'identification de l'espèce mycobactérienne isolée; néanmoins, comme précisé ci-dessus, la croissance des mycobactéries in vitro ne peut être réalisée qu'en 3 à 6 semaines et lorsque peu de mycobactéries sont présentes au site de l'infection, des cultures répétées sont nécessaires pour s'assurer d'un résultat positif (BATES J., 1979 et BATES J. et al., Am. Rev. Respir. Dis., 1986, 134,415417).
Les techniques sérologiques peuvent s'avérer utiles dans certaines conditions, mais leur utilisation est limitée par leur sensibilité et/ou leur spécificité faibles 0)PANEL T.M. et al., Am. Rev. Respir. Dis., 1987, 135, 1137-1151).
La présence ou l'absence de mycobactéries peut également être déterminée par hybridation avec de 1'ADN ou de L'ART en utilisant des sondes spécifiques des séquences d'ADN (KIEHN TE. et al., J. Clin Microbiol., 1987, 25, 15511552 ; ROBERTS M.C. et al., J. Clin. Microbiol., 1987, 25, 1239-1243; DRAKE T.A. et al., J. Clin. Microbiol., 1987, 25, 1442-1445). Cependant, ces méthodes reposent sur le polymorphisme des séquences-nucléotidiques des fragments utilisés ou sur le polymorphisme des régions avoisinantes et nécessitent également la culture des microorganismes.
Certaines séquences d'ADN de différentes mycobactéries et notamment certains gènes codant pour des antigènes mycobactériens ont été décrits. On peut citer notamment la Demande Internationale PCT WO 88/00974, qui a pour Inventeur
YOUNG R. et dont le contenu est repris dans un article paru dans Nature, 1985, 316, 450 ; ces publications décrivent les gènes codant pour cinq antigènes de M. leprae immunodominants et en particulier le gène codant pour l'antigène de 65 kDA a été séquencé. On peut également citer la Demande Internationale PCT WO 88/05823, qui a pour Co-Inventeurs IRIS SON R., YOUNG R. et SHINNICK T. et dont le contenu est repris dans l'article paru dans J.Bact., 1987, 169, 1081088 et qui décrit les gènes de M. tuberculosis codant pour des antigènes protéiques et notamment pour l'antigène de 65 kDa. Cette Demande Internationale précise, en particulier, que les antigènes de
M. tuberculosis codant pour cinq protéines immunologiquement actives ont été isolés par un criblage systématique d'une banque d'ADN recombinant exprimée dans un bactériophage lambda gtll, avec une collection d'anticorps monoclonaux dirigés contre les antigènes protéiques de cette bactérie. L'un des antigènes de M. tuberculosis, une protéine 65 kDa présente des déterminants communs à M. tuberculosis et M.
YOUNG R. et dont le contenu est repris dans un article paru dans Nature, 1985, 316, 450 ; ces publications décrivent les gènes codant pour cinq antigènes de M. leprae immunodominants et en particulier le gène codant pour l'antigène de 65 kDA a été séquencé. On peut également citer la Demande Internationale PCT WO 88/05823, qui a pour Co-Inventeurs IRIS SON R., YOUNG R. et SHINNICK T. et dont le contenu est repris dans l'article paru dans J.Bact., 1987, 169, 1081088 et qui décrit les gènes de M. tuberculosis codant pour des antigènes protéiques et notamment pour l'antigène de 65 kDa. Cette Demande Internationale précise, en particulier, que les antigènes de
M. tuberculosis codant pour cinq protéines immunologiquement actives ont été isolés par un criblage systématique d'une banque d'ADN recombinant exprimée dans un bactériophage lambda gtll, avec une collection d'anticorps monoclonaux dirigés contre les antigènes protéiques de cette bactérie. L'un des antigènes de M. tuberculosis, une protéine 65 kDa présente des déterminants communs à M. tuberculosis et M.
leprae.
La Demande Internationale PCT WO 88/06591, qui a notamment pour Co-Inventeur T. SHINNICK, décnt une protéine recombinante de 540 acides aminés (protéine de 65 kDa) ainsi que la séquence d'ADN et les vecteurs d'expression de ladite protéine, ainsi que les applications de ladite protéine recombinée. Cette
Demande décrit également des peptides correspondant à des séquences de cette protéine et leurs applications.
Demande décrit également des peptides correspondant à des séquences de cette protéine et leurs applications.
Les gènes codant pour les protéines d'autres mycobactéries (M. afri- canum, M. smegmatîs, M. bovis BCG et M. aviurn) ont également été isolés. On peut citer notamment THOLE et al. infect. Immunol., 1987, 55, 1466-1475), qui ont décrit une protéine de 64 kDa de M. bovis BCG exprimée dans E. coli.
Cependant, les quantités d'ADN mycobactérien présentes dans la plupart des échantillons biologiques sont insuffisantes pour donner un signal positif; cette technique s'est donc révélée inadaptée à l'identification d'ADN mycobactérien extrait directement d'échantillons biologiques ; en effet, les sondes utilisées sont constituées d'ADN, d'ARN ribosomique ou de fragments d'ADN mycobactériens non caractérisés et provenant de banque de gènes.
Un certain nombre d'études ont également montré une certaine homologie de structure entre les différentes mycobactéries. Cependant, des différences dans la séquence d'ADN de M. tuberculosis et M. bovis ont été décrites dans la région 3' du cadre ouvert de lecture de l'antigène 65 kDa (SHINNICK et al., 1987,
THOLE et al., 1987), mais une région homologue n'a pas été observée dans l'ADN de
M. leprae (MEHRA et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1986, 83, 7013-7017, également PCT 88/000974).
THOLE et al., 1987), mais une région homologue n'a pas été observée dans l'ADN de
M. leprae (MEHRA et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1986, 83, 7013-7017, également PCT 88/000974).
ll existe également des publications qui ont mis en évidence l'existence de séquences répétées chez les mycobactéries ; on peut citer en particulier l'article au -nom de KD. EISENACH et al (J. Clin. Microbiol., 1988, X, 11, 22402245) qui décrit trois segments clonés d'ADN de M. tubercuiosis, qui ont été identi fiés par hybridation sélective avec de l'ADN de M. bovis.Ces trois segments recombinants, dénommés respectivement M13KE37 (790 paires de bases), M13KE49 (570 paires de bases) et M13KE115 (environ 1600 paires de bases) sont obtenus par clone nage dans le bactériophage M13 de fragments d'ADN de M. aiberculosis. Toutefois, la séquence nucléotidique des segments correspondants n'est pas connue.
On peut également citer l'article de D.M. COLLINS et al. (FEMS
Microbiol. Letters, 1989, 60, 175-178), qui décrit l'identification d'une séquence d'ADN répétitive spécifique de M. paratuberculosis.
Microbiol. Letters, 1989, 60, 175-178), qui décrit l'identification d'une séquence d'ADN répétitive spécifique de M. paratuberculosis.
Les références complémentaires suivantes constituent également l'état de l'Art préalable à la présente invention
BAESS L, Acta Path. Microbiol. Scand, 1979, 87, 221-226
BEAUCAGE S.L. et al., Tetrahedron Lett., 1981,22, 1859-1862 ; EISENACH KD.
BAESS L, Acta Path. Microbiol. Scand, 1979, 87, 221-226
BEAUCAGE S.L. et al., Tetrahedron Lett., 1981,22, 1859-1862 ; EISENACH KD.
et al., Am. Rev. Respir. Dis., 1986, 133, 1065-1068; GHEORGH1U M. et al., J. BioI.
Standardization, 1988, 16, 15-26 ; GLASSROTH J. et al., N. Engi. J. Med., 1980, 302, 1441-1450 ; HAWKINS C.C. et al., Aun. Intern. Med, 1985, 105, 184-188 IMEDA T., Int. J. Systematic BacterioL, 1985, 35, 147-150; IMAEDA T. et al., Int.
J. Systematic Bacteriol., 1988, 38, 151-156; KOGAN S.C. et al., N. Engl. J. Med., 1987,317,985-990 ; LI IL et al., Nature (Lond.), 1988,335,414417 ; LU M.C. et al.,
Infect. Immun., 1987, 55, 2378-2382 ; MANIATIS T. et al., 1982, Cold Spring
Harbor, New York; McFADDEN J.J. et al., Mol. Microbiol., 1987, 1,283-291; PAO
C.C. et al., Tubercle, 1988,69,27-36 ; PATEL R, J. Gen. Microbiol., 1986, 132, 541- 551; SAIKI R.K. et al., Science, 1988, 239, 487-491; SANGER F. et al., Proc. Natl.
Infect. Immun., 1987, 55, 2378-2382 ; MANIATIS T. et al., 1982, Cold Spring
Harbor, New York; McFADDEN J.J. et al., Mol. Microbiol., 1987, 1,283-291; PAO
C.C. et al., Tubercle, 1988,69,27-36 ; PATEL R, J. Gen. Microbiol., 1986, 132, 541- 551; SAIKI R.K. et al., Science, 1988, 239, 487-491; SANGER F. et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 1977, 74, 5463-5467 ; SMIDA J. et al., Int. J. Leprosy, 1988, 56, 449-454; THEIN St. et al., in Human Genetic Diseases, 1986, IRL Press, 33-50;
THOLE J.E.R. et al., Infect. Immun., 1985, 50, 800-806; WATSON E.A., Canad. J.
THOLE J.E.R. et al., Infect. Immun., 1985, 50, 800-806; WATSON E.A., Canad. J.
Pub. Health, 1935, 26, 268-275; WOLINSKY E., Am. Rev. Respir. Dis, 1979, 119, 107-159.
Récemment un procédé de détection de faibles quantités de myco bactéries par amplification et hybridation directement sur des échantillons biologiques a été mis au point; ledit procédé utilise le polymorphisme des séquences nucléotidiques d'un fragment de gène commun à toutes les mycobactéries, et notamment un fragment du gène codant pour la protéine 65 kD (Demande de Brevet français n0 89 05057).
Poursuivant les travaux sur les mycobactéries dans cette voie, les
Inventeurs ont mis au point un procédé de détection spécifique et encore plus rapide car permettant d'identifier dans un échantillon biologique une mycobactérie d'un groupe donné en moins de 24 heures.
Inventeurs ont mis au point un procédé de détection spécifique et encore plus rapide car permettant d'identifier dans un échantillon biologique une mycobactérie d'un groupe donné en moins de 24 heures.
La présente invention s'est, en conséquence, donné pour but de pourvoir à un procédé de détection et/ou d'identification spécifique d'au moins un groupe de mycobactéries, notamment spécifique du groupe du bacille de la tuberculose permettant de détecter de faibles quantités d'ADN extrait des germes eux-mêmes en nombre restreint et de révéler la présence des mycobactéries du/des groupes à détecter directement dans les échantillons pathologiques.
C'est également un but de l'invention de pourvoir à des réactifs de diagnostic spécifiques de groupe de mycobactéries et notamment du groupe du bacille de la tuberculose.
La présente invention a pour objet une séquence nucléotidique issue de mycobactéries, caractérisée en ce qu'elle est constituée par une séquence nucléotidique répétée dans le génome d'une mycobactérie et spécifique du groupe du bacille de la tuberculose et en ce qu'elle s'hybride très fortement avec M. tuberculosis.
Dans la présente invention, on appelle groupe du bacille de la tuberculose, le groupe qui comprend M. bovis-BCG, M. bovis, M. tuberculosis, M. ca- num.
On entend par séquence nucléotidique, dans la présente invention, aussi bien une séquence d'ADN double brin, une séquence d'ADN simple que les produits de transcription desdites séquences.
On entend par forte hybridation, au sens de la présente invention, une hybridation donnant un signal important lié au nombre de séquences répétées présentes sur 1'ADN génomique ; un signal important permet d'obtenir une tache visible facilement à l'oeil nu après une autoradiographie d'une durée courte, réalisée dans les conditions définies à l'exemple 1 ci-après, notamment inférieure ou égale à une heure ; on obtient, par exemple, une tache très importante après une autoradiographie d'une heure environ, lorsque l'on utilise une sonde marquée ayant une activité spécifique voisine de 109 cpm par g d'ADN, avec M. ruberculosis, alors que pour M. bovis BCG, on obtient un signal faible, et ce, seulement après un délai de 48 heures.
Selon un mode de réalisation préféré de ladite séquence, elle comporte à son extrémité 5' la séquence 5' TGAACCGCCCCGG 3'de formule I et à son extrémité 3' la séquence 5'CCGG(3GoeGTrCA 3' de formule 11, ladite séquence contenant en outre au moins un fragment d'une séquence de formule m suivante::
10 20 30 40 50 60
GTCGACACGC CTTCTGCACG GGAAGTCCTT CTGCGGCCAT CGTTGCTATG GCCGCTTACT
CAGCTGTGCG GAAGACGTGC CCTTCAGGAA GACGCCGGTA GCAACGATAC CGGCGAATGA
70 80 90 100 110 120
GCCTTCTAGT CCGTGCGGCT CTCGCAACAG CTCACGGGAC CTTTTTGAGG ATCGCCACTT
CGGAAGATCA GGCACGCCGA GAGCGTTGTC GAGTGCCCTG GAAAAACTCC TAGCGGTGAA
130 140 150 160 170 180
CAGGTCTTGA ACTCGCGGAT GCCCTCATTG GCAACGTTTG CGCCCTGCCT TGGGGCGGCC
GTCCAGAAGT TGAGCGCCTA CGGGAGTAAC CGTTGCAAAC GCGGGACGGA ACCCCGCCGG
190 100 210 220 230 240
GGCAGCCACC AAGTCGAGCA CTTTGCGGCG GAACTACTCG GGGTAACACT TCGGCACGGA
CCGTCGGTGG TTCAGCTCGT GAAACGCCGC CTTGATGAGC CCGATTGTGA AGCCGTGCCT
250 260 270 280 290 300
CACGGCTCGT TCGACGGACG TCGTGACCAG AAGTCGAGCA AACCGACTCC ACTCTAGCTA
GTGCCGAGCA AGCTGCCTGC AGCACTGGTC TTCAGCTCGT TTGGCTGAGG TGAGATCGAT
310 320 330 340 350 360
GTGATACAAG CTTTTTTGTA GCCGCGCGAT GAACCGCCCC GGCATGTCCG GAGACTCCAG
CACTATGTTC GAAAAAACAT CGGCGCGCTA CTTGGCGGGG CCGTACAGGC CTCTGAGGTC
370 380 390 400 410 420
TTCTTGGAAA GGATGGGGTC ATGTCAGGTG GTTCATCGAG GAGGTACCCG CCGGAGCTGC
AAGAACCTTT CCTACCCCAG TACAGTCCAC CAAGTAGCTC CTCCATGGGC GGCCTCGACG
430 440 450 460 470 480
GTGACGGGGC GGTGCGGATG GTCGCAGAGA TCCGCGGTCA GCACGATTCG GAGTGGGCAG
CACTGCCCCG CCACGCCTAC CAGCGTCTCT AGGCGCCAGT CGTGCTAAGC CTCACCCGTC
490 500 510 520 530 540
CGATCAGTGA GGTCGCCCGT GTACTTGGTG TTGGCTGCGG AGACGGTGCG TAAGTGGGTG
GCTAGTCACT CCAGCGGGCA CATGAACCAC AACCGACGCC TCTGCCACGC ATTCACCCAC
550 560 570 580 590 600
CGCCAGGCGC AGGTCGATGC CGGCGCACGG CCCGGGACCA CGACCGAAGA ATCCGCTGAG
GCGGTCCGCG TCCAGCTACG GCCGCGTGCC GGGCCCTGGT GCTGGCTTCT TAGGCGACTC
610 620 630 640 650 660
CTGAAGCGCT TCGGCGGGAC AACGCGAATT GCGAAGGGCG AACGCGATTT TAAAGACCGC
GACTTCGCGA AGCCGCCCTG TTGCGCTTAA CGCTTCCCGC TTGCGCTAAA ATTTCTGGCC
670 680 690 700 710 720
GTCGGCTTTC TTCGCGGCCG AGCTCGACCG GCCAGCACGC TAATTACCCG GTTCATCGCC
CAGCCGAAAG AAGCGCCGGC TCGAGCTGGC CGGTCGTGCG ATTAATGGGC CAAGTAGCGG
730 740 750 760 770 780
GATCATCAGG GCCACCGCGA GGGCCCCGAT GGTTTGCGGT GGGGTGTCGA GTCGATCTGC
CTAGTAGTCC CGGTGGCGCT CCCGGGGCTA CCAAACGCCA CCCCACAGCT CAGCTAGACG
790 800 810 820 830 840
ACACAGCTGA CCGAGCTGGG TGTGCCGATC GCCCATCGAC CTACTACGAC CACATCAACC
TGTGTCGACT GGCTCGACCC ACACGGCTAG CGGGTAGCTG GATGATGCTG GTGTAGTTGG
850 860 870 880 890 900
GGGAGCCCAG CCGCGCGAGC TGCGCGATGG CGAACTCAAG GAGCACATCA GCCGCGTCCA
CCCTCGGGTC GGCGCGCTCG ACGCGCTACC GCTTGAGTTC CTCGTGTAGT CGGCGCAGGT
910 920 930 940 950 960
CGCCGCCAAC TACGGTGTTT ACCGTGCCCG CAAAGTGTGG CTAACCCTGA ACCGTGAGGG
GCGGCGGTTG ATGCCACAAA TGGCACGGGC GTTTCACACC GATTGGGACT TGGCACTCCC
970 980 990 1000 1010 1020
CATCGAGGTG GCCAGATGCA CCGTCGAACG GCTGATGACC AAACTCGGCC TGTCCGGGAC
GTAGCTCCAC CGGTCTACGT GGCAGCTTGC CGACTACTGG TTTGAGCCGG ACAGGCCCTG
1030 1040 1050 1060 1070 1080
CACCCGCGGC AAAGCCCGCA GGACCACGAT CGCTGATCCG GCCACAGCCC GTCCCGCCGA
GTGGGCGCCG TTTCGGGCGT CCTGGTGCTA GCGACTAGGC CGGTGTCGGG CAGGGCGGCT
1090 1100 1110 1120 1130 1140
TCTCGTCCAG CGCCGCTTCG GACCACCAGC ACCTAACCGG CTGTGGGTAG CAGACCTCAC
AGAGCAGGTC GCGGCGAAGC CTGGTGGTCG TGGATTGGCC GACACCCATC GTCTGGAGTG
1150
CTATGTGTCG AC
GATACACAGC TG
Ladite séquence a été dénommée IS6020 par les Inventeurs et comprend notamment les sites de restriction suivants : SalI, SmaI, KpnI, Hindi.
10 20 30 40 50 60
GTCGACACGC CTTCTGCACG GGAAGTCCTT CTGCGGCCAT CGTTGCTATG GCCGCTTACT
CAGCTGTGCG GAAGACGTGC CCTTCAGGAA GACGCCGGTA GCAACGATAC CGGCGAATGA
70 80 90 100 110 120
GCCTTCTAGT CCGTGCGGCT CTCGCAACAG CTCACGGGAC CTTTTTGAGG ATCGCCACTT
CGGAAGATCA GGCACGCCGA GAGCGTTGTC GAGTGCCCTG GAAAAACTCC TAGCGGTGAA
130 140 150 160 170 180
CAGGTCTTGA ACTCGCGGAT GCCCTCATTG GCAACGTTTG CGCCCTGCCT TGGGGCGGCC
GTCCAGAAGT TGAGCGCCTA CGGGAGTAAC CGTTGCAAAC GCGGGACGGA ACCCCGCCGG
190 100 210 220 230 240
GGCAGCCACC AAGTCGAGCA CTTTGCGGCG GAACTACTCG GGGTAACACT TCGGCACGGA
CCGTCGGTGG TTCAGCTCGT GAAACGCCGC CTTGATGAGC CCGATTGTGA AGCCGTGCCT
250 260 270 280 290 300
CACGGCTCGT TCGACGGACG TCGTGACCAG AAGTCGAGCA AACCGACTCC ACTCTAGCTA
GTGCCGAGCA AGCTGCCTGC AGCACTGGTC TTCAGCTCGT TTGGCTGAGG TGAGATCGAT
310 320 330 340 350 360
GTGATACAAG CTTTTTTGTA GCCGCGCGAT GAACCGCCCC GGCATGTCCG GAGACTCCAG
CACTATGTTC GAAAAAACAT CGGCGCGCTA CTTGGCGGGG CCGTACAGGC CTCTGAGGTC
370 380 390 400 410 420
TTCTTGGAAA GGATGGGGTC ATGTCAGGTG GTTCATCGAG GAGGTACCCG CCGGAGCTGC
AAGAACCTTT CCTACCCCAG TACAGTCCAC CAAGTAGCTC CTCCATGGGC GGCCTCGACG
430 440 450 460 470 480
GTGACGGGGC GGTGCGGATG GTCGCAGAGA TCCGCGGTCA GCACGATTCG GAGTGGGCAG
CACTGCCCCG CCACGCCTAC CAGCGTCTCT AGGCGCCAGT CGTGCTAAGC CTCACCCGTC
490 500 510 520 530 540
CGATCAGTGA GGTCGCCCGT GTACTTGGTG TTGGCTGCGG AGACGGTGCG TAAGTGGGTG
GCTAGTCACT CCAGCGGGCA CATGAACCAC AACCGACGCC TCTGCCACGC ATTCACCCAC
550 560 570 580 590 600
CGCCAGGCGC AGGTCGATGC CGGCGCACGG CCCGGGACCA CGACCGAAGA ATCCGCTGAG
GCGGTCCGCG TCCAGCTACG GCCGCGTGCC GGGCCCTGGT GCTGGCTTCT TAGGCGACTC
610 620 630 640 650 660
CTGAAGCGCT TCGGCGGGAC AACGCGAATT GCGAAGGGCG AACGCGATTT TAAAGACCGC
GACTTCGCGA AGCCGCCCTG TTGCGCTTAA CGCTTCCCGC TTGCGCTAAA ATTTCTGGCC
670 680 690 700 710 720
GTCGGCTTTC TTCGCGGCCG AGCTCGACCG GCCAGCACGC TAATTACCCG GTTCATCGCC
CAGCCGAAAG AAGCGCCGGC TCGAGCTGGC CGGTCGTGCG ATTAATGGGC CAAGTAGCGG
730 740 750 760 770 780
GATCATCAGG GCCACCGCGA GGGCCCCGAT GGTTTGCGGT GGGGTGTCGA GTCGATCTGC
CTAGTAGTCC CGGTGGCGCT CCCGGGGCTA CCAAACGCCA CCCCACAGCT CAGCTAGACG
790 800 810 820 830 840
ACACAGCTGA CCGAGCTGGG TGTGCCGATC GCCCATCGAC CTACTACGAC CACATCAACC
TGTGTCGACT GGCTCGACCC ACACGGCTAG CGGGTAGCTG GATGATGCTG GTGTAGTTGG
850 860 870 880 890 900
GGGAGCCCAG CCGCGCGAGC TGCGCGATGG CGAACTCAAG GAGCACATCA GCCGCGTCCA
CCCTCGGGTC GGCGCGCTCG ACGCGCTACC GCTTGAGTTC CTCGTGTAGT CGGCGCAGGT
910 920 930 940 950 960
CGCCGCCAAC TACGGTGTTT ACCGTGCCCG CAAAGTGTGG CTAACCCTGA ACCGTGAGGG
GCGGCGGTTG ATGCCACAAA TGGCACGGGC GTTTCACACC GATTGGGACT TGGCACTCCC
970 980 990 1000 1010 1020
CATCGAGGTG GCCAGATGCA CCGTCGAACG GCTGATGACC AAACTCGGCC TGTCCGGGAC
GTAGCTCCAC CGGTCTACGT GGCAGCTTGC CGACTACTGG TTTGAGCCGG ACAGGCCCTG
1030 1040 1050 1060 1070 1080
CACCCGCGGC AAAGCCCGCA GGACCACGAT CGCTGATCCG GCCACAGCCC GTCCCGCCGA
GTGGGCGCCG TTTCGGGCGT CCTGGTGCTA GCGACTAGGC CGGTGTCGGG CAGGGCGGCT
1090 1100 1110 1120 1130 1140
TCTCGTCCAG CGCCGCTTCG GACCACCAGC ACCTAACCGG CTGTGGGTAG CAGACCTCAC
AGAGCAGGTC GCGGCGAAGC CTGGTGGTCG TGGATTGGCC GACACCCATC GTCTGGAGTG
1150
CTATGTGTCG AC
GATACACAGC TG
Ladite séquence a été dénommée IS6020 par les Inventeurs et comprend notamment les sites de restriction suivants : SalI, SmaI, KpnI, Hindi.
Selon une modalité avantageuse de cette disposition, ladite séquence comprend les nucléotides 343-1152 de la séquence de formule m ci-dessus et les fragments de celle-ci.
La présente invention englobe également des fragments nucléotidiques, notamment des oligonucléotides, dérivés des séquences nucléotidiques telles que définies ci-dessus.
Parmi ces fragments, on peut citer en particulier:
- un oligonucléotide, caractérisé en ce qu'il présente la séquence de formule IV suivante:
ATGTCAGGTGGTTCATCGAG (IV); ledit oligonucléotide a été dénommé ISTB1 par les Inventeurs;
- un oligonucléotide, caractérisé en ce qu'il présente la séquence de formule V suivante:
ACAGGCCGAGTTTGGTCATC (V); ledit oligonucléotide a été dénommé ISTB2 par les Inventeurs.
- un oligonucléotide, caractérisé en ce qu'il présente la séquence de formule IV suivante:
ATGTCAGGTGGTTCATCGAG (IV); ledit oligonucléotide a été dénommé ISTB1 par les Inventeurs;
- un oligonucléotide, caractérisé en ce qu'il présente la séquence de formule V suivante:
ACAGGCCGAGTTTGGTCATC (V); ledit oligonucléotide a été dénommé ISTB2 par les Inventeurs.
La présente invention a également pour objet des produits de traduction et/ou des fragments de ceux-ci, caractérisés en ce qu'ils sont codés par une séquence ou un fragment de séquence nucléotidique conforme à l'invention.
La présente invention a, de plus, pour objet un procédé de détection d'une séquence répétée spécifique du groupe du bacille de la tuberculose, caractérisé en ce qu'il comprend:
(1) une étape dans laquelle on réalise une banque de cosmides recombinants comprenant des fragments d'ADN d'une mycobactérie appropriée supé rieurs à 30 kb; et
(2) une étape dans laquelle on détecte le/les clones cosmidiques contenant au moins une séquence répétée, par hybridation avec un ADN génomique total de mycobactérie appropriée, marqué de manière convenable.
(1) une étape dans laquelle on réalise une banque de cosmides recombinants comprenant des fragments d'ADN d'une mycobactérie appropriée supé rieurs à 30 kb; et
(2) une étape dans laquelle on détecte le/les clones cosmidiques contenant au moins une séquence répétée, par hybridation avec un ADN génomique total de mycobactérie appropriée, marqué de manière convenable.
La révélation des hybrides formés permet la détection rapide des séquences répétées présentes sur le génome desdites mycobactéries.
La présente invention a également pour objet des réactifs de diagnostic pour la détection d'au moins un groupe de mycobactéries, caractérisés en ce qu'ils comprennent au moins une séquence nucléotidique ou un fragment de celle-ci, telle que définie ci-dessus, pour la détection des mycobactéries du groupe du bacille de la tuberculose, éventuellement associée à au moins une autre séquence nucléotidique appropriée à la détection d'un autre groupe de mycobactéries et/ou au moins un marqueur approprié.
Un tel réactif permet, par exemple, la détection simultanée d'une mycobactérie du groupe du bacille de la tuberculose et d'une mycobactérie du groupe
MAIP (M. avium; M. intracellulare, M. paratuberculosis)
Selon un mode de réalisation avantageux desdits réactifs, ils correspondent à des paires d'amorces pour la synthèse d'un fragment d'ADN ou d'ARN du groupe du bacille de la tuberculose, chaque amorce comprenant une séquence ou un fragment de séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus.
MAIP (M. avium; M. intracellulare, M. paratuberculosis)
Selon un mode de réalisation avantageux desdits réactifs, ils correspondent à des paires d'amorces pour la synthèse d'un fragment d'ADN ou d'ARN du groupe du bacille de la tuberculose, chaque amorce comprenant une séquence ou un fragment de séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus.
Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, une paire d'amorces conforme à l'invention est notamment constituée par un oligonucléotide de formule W apparié à un oligonucléotide de formule V.
Ces amorces permettent notamment la synthèse de la séquence nucléotidique de formule ffi ci-dessus et/ou de son brin complémentaire et/ou de la séquence IS6020.
Selon un autre mode de réalisation avantageux desdits réactifs, ils correspondent à une sonde de détection d'un fragment d'ADN ou d'ARN du groupe du bacille de la tuberculose.
Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ladite
sonde de détection comprend avantageusement une séquence nucléotidique de for -mule m, pour la détection d'une mycobactérie du groupe du bacille de la tuberculose.
sonde de détection comprend avantageusement une séquence nucléotidique de for -mule m, pour la détection d'une mycobactérie du groupe du bacille de la tuberculose.
Selon un autre mode de réalisation avantageux, le marqueur est choisi dans le groupe qui comprend notamment les isotopes radioactifs, les enzymes
appropriées, les fluorochromes, les marqueurs chimiques appropriés, les haptènes et les anticorps ou les analogues de base tels que ceux décrits dans le brevet français n' 2 518755 ou la demande de brevet européen n 158758.
appropriées, les fluorochromes, les marqueurs chimiques appropriés, les haptènes et les anticorps ou les analogues de base tels que ceux décrits dans le brevet français n' 2 518755 ou la demande de brevet européen n 158758.
Lesdits réactifs peuvent être utilisés dans un très grand nombre de
techniques de diagnostic basées sur la détection d'acides nucléiques par hybridation; en particulier, une sonde conforme à l'invention telle que la séquence de formule m permet notamment de détecter spécifiquement l'ADN d'une mycobactérie du groupe
du bacille de la tuberculose et en particulier Mycobactenum tubercuiosis.
techniques de diagnostic basées sur la détection d'acides nucléiques par hybridation; en particulier, une sonde conforme à l'invention telle que la séquence de formule m permet notamment de détecter spécifiquement l'ADN d'une mycobactérie du groupe
du bacille de la tuberculose et en particulier Mycobactenum tubercuiosis.
La présente invention a également pour objet une famille de plas
mides recombinants, caractérisés en ce qu'ils contiennent au moins une séquence nucléotidique conforme à l'invention.
mides recombinants, caractérisés en ce qu'ils contiennent au moins une séquence nucléotidique conforme à l'invention.
Selon un mode de réalisation avantageux dudit plasmide, il comprend la séquence nucléotidique de formule m ou un fragment de celle-ci.
Selon une disposition préférée dudit mode de réalisation, ledit plas
mide comprend ladite séquence associée à un vecteur pUC18.
mide comprend ladite séquence associée à un vecteur pUC18.
Ce plasmide recombinant a été dénommé pMT01 par les Inventeurs.
Conformément à l'invention, ledit plasmide recombinant est déposé
sous le n" I-900, en date du 25 août 1989, auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur.
sous le n" I-900, en date du 25 août 1989, auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur.
La présente invention a également pour objet un procédé de détection et d'identification rapide d'au moins un groupe etlou une espèce de mycobactéries dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend:
(1) une étape dans laquelle l'on met en contact l'échantillon biolo
gique avec au moins un réactif de diagnostic conforme à l'invention et
(2) une étape dans laquelle on détecte par tout moyen approprié le ou les produits résultant de l'interaction séquence nucléotidique de mycobactérie éventuellement présente-réactif de diagnostic.
(1) une étape dans laquelle l'on met en contact l'échantillon biolo
gique avec au moins un réactif de diagnostic conforme à l'invention et
(2) une étape dans laquelle on détecte par tout moyen approprié le ou les produits résultant de l'interaction séquence nucléotidique de mycobactérie éventuellement présente-réactif de diagnostic.
Selon un mode de mise en oeuvre avantageux de ce procédé, le/les réactifs de diagnostic de l'étape (1) sont une/des paire d'amorces conformes à l'invention et permettent l'obtention de produits d'amplification de la séquence nucléotidique à détecter.
L'étape d'amplification est notamment l'une des techniques d'amplification génétique telles que la méthode dite Qss réplicase (LE;ARDI P.M. et al., Biotechnol., 1988, 6) ou la méthode dite P.C.R (polymerase chain reaction) décrite dans les demandes de brevet européens ne 200 363, ne 201184 et ne 229701 déposées par CETUS CO..
Selon une disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, les produits d'amplification obtenus en (1) sont détectés par séparation électrophorétique.
Par exemple, si l'on observe la présence d'un fragment d'ADN migrant à l'endroit attendu, on peut conclure que l'échantillon analysé contient de l'ADN du groupe de mycobactéries à détecter.
Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, les produits d'amplification obtenus en (1) sont détectés par hybridation entre lesdits produits d'amplification et un réactif de diagnostic conforme à l'invention marqué de manière appropriée.
Un tel procédé a l'avantage de permettre de réaliser un test sensible et spécifique, direct et rapide (moins de 24 heures) de détection d'au moins un groupe de mycobactéries.
Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux du procédé conforme à l'invention, le réactif de diagnostic de l'étape (1) est une sonde de détection conforme à l'invention et permet l'obtention d'hybrides entre la séquence nucléotidique à détecter et ladite sonde.
Une telle séquence permet également d'identifier l'espèce d'une mycobactérie à l'intérieur du groupe du bacille de la tuberculose, en partant d'une culture pure.
La présente invention a, en outre, pour objet un kit, coffret ou ensemble coordonné prêt à l'emploi pour la mise en oeuvre du procédé de détection d'au moins un groupe de mycobactéries conforme à l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend outre des quantités utiles de tampons et de réactifs appropriés pour la mise en oeuvre de ladite détection:
- des doses appropriées d'au moins une paire d'amorces conforme à l'invention; et/ou
- des doses appropriées d'au moins une sonde ou un fragment de
sonde nucléotidique conforme à l'invention.
- des doses appropriées d'au moins une paire d'amorces conforme à l'invention; et/ou
- des doses appropriées d'au moins une sonde ou un fragment de
sonde nucléotidique conforme à l'invention.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention.
ll doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière unelimitation.
Exemple 1: Dépistage des mycobactéries du groupe du bacille de la tuberculose.
a) Construction de la banque génomique M. tuberculosis:
L'ADN génomique de M. tuberculosis H37rv est digéré partiellement par l'endonuciéase de restriction SalI en faisant agir 0,03U d'enzyme par g d'ADN dans un tampon 100 mM NaCl, 50 mM MgCI2, 1 mM dithiothréitol pendant 1 heure à 37 C. L'ADN génomique ainsi digéré est séparé par électrophorèse sur gel d'agarose à 0,6 %, les fragments entre 30 et 40 kb électruélués et précipités en éthanol après extraction au phénol/chloroforme (1/1).
L'ADN génomique de M. tuberculosis H37rv est digéré partiellement par l'endonuciéase de restriction SalI en faisant agir 0,03U d'enzyme par g d'ADN dans un tampon 100 mM NaCl, 50 mM MgCI2, 1 mM dithiothréitol pendant 1 heure à 37 C. L'ADN génomique ainsi digéré est séparé par électrophorèse sur gel d'agarose à 0,6 %, les fragments entre 30 et 40 kb électruélués et précipités en éthanol après extraction au phénol/chloroforme (1/1).
Le vecteur est le cosmide pHC79. R est digéré de la même manière et déphosphorylé pour éviter toute autoligation.
La ligation s'effectue en mélangeant 700 ng de vecteur et 1,5 g de fragments d'ADN 30/40 kb (soit un rapport molaire vecteurfinsert de 1/2) et la réaction est laissée à 140C pendant 18 h après avoir ajouté 2,5U de T4 DNA ligase dans un tampon 0,066 M Tris-HCl pH 7,5,5 mM MgC12, 5 mM dithiothréitol, 1 mM ATP.
Les cosmides recombinants sont encapsidés in vitro et utilisés pour transformer les bactéries HB101. Les bactéries transformées sont incubées 1 h à 370C en milieu LB puis étalées sur milieu sélectif Agar contenant 25 g/ml d'ampicilline.
Les colonies résistantes à l'ampicilline sont toutes testées pour leur sensibilité à la tétracycline; en effet le fragment d'ADN de 30/40 kb est inséré dans le vecteur de manière à inactiver le gène de résistance à la tétracycline (ret) et à conserver le gène de résistance à l'ampicilline (Amp).
b) Criblage de la banque et détermination de la séquence:
R est effectué une mini préparation d'ADN des 150 premières colonies transformantes résistantes à l'ampicilline (Ampr) et sensibles à la tétracycline (tets) selon la technique de lyse alcaline. L'ADN de ces préparations est ensuite digéré par l'endonuciéase de restriction SalI, analysé en électrophorèse sur gel d'agarose à 0,6 % puis transféré sur filtre de nylon. L'ADN est fixé de façon irréversible par 5 mn d'exposition aux UV à 254 nm.
R est effectué une mini préparation d'ADN des 150 premières colonies transformantes résistantes à l'ampicilline (Ampr) et sensibles à la tétracycline (tets) selon la technique de lyse alcaline. L'ADN de ces préparations est ensuite digéré par l'endonuciéase de restriction SalI, analysé en électrophorèse sur gel d'agarose à 0,6 % puis transféré sur filtre de nylon. L'ADN est fixé de façon irréversible par 5 mn d'exposition aux UV à 254 nm.
Ces différents filtres sont hybridés 16 à 18 heures à 68 C dans un mélange contenant un tampon 6X SSC (1X SSC correspond à 0,15M NaCI et 0,015M citrate de Na), 10 % dextran sulfate, 5X Denhardt's (une solution 1X Denhardt's correspondant à 0,02 % de Ficoll, 0,02 % de polyvinylpyrrolidone et 0,02 % de sérum albumine bovine), 10 mM EDTA, 0,5 % SDS, 100 Rglml d'ADN de sperme de saumon; à ce mélange, on ajoute soit 1'ADN génomique total de M. tuberculosis H37rv, soit l'ADN génomique total de M. bovis-BCG radiomarqué au phosphore 32 par multiamorçage.
Après hybridation, les filtres sont lavés deux fois 10 mn avec du tampon 2X SSC à 65eC, une fois 30 mn avec du tampon 2X SSC+O,1 % SDS à 65CC et enfin une fois 10 mn avec du tampon 0,1X SSC à 65 C. Les filtres encore humides sont mis en autoradiographie à -80'C avec écran intensifiant de 1 h à 2 jours.
Les résultats de ces hybridations ont permis d'isoler un clone cosmidique contenant un fragment d'environ 1 kb s'hybridant très fortement avec 1'ADN marqué de M. tuberculosis H37rv et faiblement avec l'ADN marqué de M. bovis-BCG (figure 1).
La figure 1 représente une autoradiographie, après Southem Blot, du clone cosmidique, en utilisant les ADN marqués au 32p : la colonne A correspond à
M. bovis-BCG; la colonne B correspond d M. tuberculosis; la flèche montre le fragment spécifique M. tuberculosis.
M. bovis-BCG; la colonne B correspond d M. tuberculosis; la flèche montre le fragment spécifique M. tuberculosis.
Ce fragment a été cloné dans un vecteur pUC18 et préparé en grande quantité. Ce plasmide est dénommé pMT01.
Ce fragment a été digéré par les enzymes Hindi, KpnI, SmaI et par une double digestion SmaVHindE puis cloné dans des phages M13tnp18 et
M13mp19 et séquencé selon la méthode de Sanger en utilisant la Taq polymérase en présence de d-azaGTP à la place du dGTP.
M13mp19 et séquencé selon la méthode de Sanger en utilisant la Taq polymérase en présence de d-azaGTP à la place du dGTP.
La séquence entière du fragment est représentée à la formule I cidessus.
La comparaison des 1152 nucléotides ainsi déterminés avec l'ensemble de la banque de données de Les Alamos a fait ressortir des homologies de plus de 50 % avec la séquence d'insertion IS3411 (ISHIGURO et col J. Bacteriol 170, 198, 1902-1906). L'homologie a été détectée entre les nucléotides 330 et 1151.
Deux oligonucléotides de 20 mers à I'intérieur de cette séquence homologue ont été synthétisés: ISTB1: ATGTCAGGTC}GITCATCGAG (formule il ci-dessus)
ISTB2: ACAGGCCGAGTTTGGTCATC (formule III ci-dessus)
c) Marquage du plasmide pMT01 par 2-acétyl-amino-fluorène
(AAF):
25 g de plasmide pMT01 ont été marqués selon une procédure
adaptée de celle de TCHEN et col (PNAS 81:1984; 3466-3470). Le taux de substitution obtenu a été de 9,7 %.
ISTB2: ACAGGCCGAGTTTGGTCATC (formule III ci-dessus)
c) Marquage du plasmide pMT01 par 2-acétyl-amino-fluorène
(AAF):
25 g de plasmide pMT01 ont été marqués selon une procédure
adaptée de celle de TCHEN et col (PNAS 81:1984; 3466-3470). Le taux de substitution obtenu a été de 9,7 %.
d) Isolement de l'ADN mycobactérien:
Les extraits biologiques sont traités de manière appropriée puis centrifugés. L'ADN est extrait par remise en suspension du culot avec 50 Il de NaOH 0,1 M contenant du NaCl 2M et du SDS 0,5 %.
Les extraits biologiques sont traités de manière appropriée puis centrifugés. L'ADN est extrait par remise en suspension du culot avec 50 Il de NaOH 0,1 M contenant du NaCl 2M et du SDS 0,5 %.
Le mélange est incubé à 95 C 15 minutes ; au mélange réactionnel, on ajoute 400 1 de Tris-HCl 0,1M pH7. L'ADN est extrait trois fois au phénol/chloroforme, précipité à l'éthanol et repris dans 50 Ill de Tris 10 mM, EDTA 0,1 rnMpH 8.
e) Amplification de 1'ADN:
L'amplification est réalise par la technique d'amplification in vitro selon SAIKI et ai (Science, 1988, 239, 487-491) en utilisant 12,5 pmoles des oligonucléotides ISTB1 et ISTB2 et 50 ng d'ADN de différentes souches de mycobactéries, notamment les oligonucléotides TE I et TB2 tels que décrits dans la Demande de Brevet 89 05057, avec 2 U de Taq polymérase dans un tampon 50 mM KCl, 10 mM Tris
HCl pH 8,3, 2,4 mM MgCl2, 300 CLM de désoxyribonucléotides et 100 llg/ml de gélatine, le volume final de la réaction étant de 100 lil. Les paramètres des étapes de
PCR ont été choisis de la façon suivante: 1,5 mn à 94 C, 2 mn à 50 C, 2mn à 72 C. 40 cycles sont réalisés en utilisant par exemple l'appareil décrit dans le Brevet français n 8808536 déposé par l'Institut Pasteur. Après le dernier cycle, les échantillons sont maintenus à 37 C 10 mn puis stockés à 4 C.
L'amplification est réalise par la technique d'amplification in vitro selon SAIKI et ai (Science, 1988, 239, 487-491) en utilisant 12,5 pmoles des oligonucléotides ISTB1 et ISTB2 et 50 ng d'ADN de différentes souches de mycobactéries, notamment les oligonucléotides TE I et TB2 tels que décrits dans la Demande de Brevet 89 05057, avec 2 U de Taq polymérase dans un tampon 50 mM KCl, 10 mM Tris
HCl pH 8,3, 2,4 mM MgCl2, 300 CLM de désoxyribonucléotides et 100 llg/ml de gélatine, le volume final de la réaction étant de 100 lil. Les paramètres des étapes de
PCR ont été choisis de la façon suivante: 1,5 mn à 94 C, 2 mn à 50 C, 2mn à 72 C. 40 cycles sont réalisés en utilisant par exemple l'appareil décrit dans le Brevet français n 8808536 déposé par l'Institut Pasteur. Après le dernier cycle, les échantillons sont maintenus à 37 C 10 mn puis stockés à 4 C.
f) Analyse des échantillons:
1. En gel d'agarose
10 ml des échantillons amplifiés sont déposés sur un gel d'agarose à 2 % dans un tampon TAE (0,04 M Tris-acétate, 0,001M EDTA) et contenant 1 mg/ml de bromure d'éthydium. Les bandes amplifiées sont visualisées sous UV. La figure 2 montre les différents profils obtenus selon les ADN de mycobactéries. Un fragment d'ADN correspondant à la taille attendue est observé avec les ADN des mycobactéries suivantes : M. tuberculosis (13), M. bovis-BCG (16). Par contre ce fragment n'est pas visible lorsque l'ADN analysé est extrait des souches suivantes : Mycobactenum asiattcum (1), M. avium (2), M.= chelonae (3), M. flavescens (4), M. gordonae (5), M.
1. En gel d'agarose
10 ml des échantillons amplifiés sont déposés sur un gel d'agarose à 2 % dans un tampon TAE (0,04 M Tris-acétate, 0,001M EDTA) et contenant 1 mg/ml de bromure d'éthydium. Les bandes amplifiées sont visualisées sous UV. La figure 2 montre les différents profils obtenus selon les ADN de mycobactéries. Un fragment d'ADN correspondant à la taille attendue est observé avec les ADN des mycobactéries suivantes : M. tuberculosis (13), M. bovis-BCG (16). Par contre ce fragment n'est pas visible lorsque l'ADN analysé est extrait des souches suivantes : Mycobactenum asiattcum (1), M. avium (2), M.= chelonae (3), M. flavescens (4), M. gordonae (5), M.
kansasii (6), M. malmoense (7), M. marinum (8), M. scrofulasceum (9), M. simiae
(10), M. szulgai (11), M. terrae (12), M. xenopi (14), Nocardia (15), Streptomyces antibioticus (17), S. lividans (18), S. viridochromogene (19), S. hydroscopicus (20), S.
(10), M. szulgai (11), M. terrae (12), M. xenopi (14), Nocardia (15), Streptomyces antibioticus (17), S. lividans (18), S. viridochromogene (19), S. hydroscopicus (20), S.
fradiae (21), Micromonospora (22), Eschenchia coli (23).
Ce fragment peut éventuellement être détecté par hybridation avec une sonde correspondant à tout ou partie de IS6020. L'ADN est alors transféré sur une membrane et l'on procède comme décrit en b) ci-dessus
2. En dot blot
10 Cll des échantillons amplifiés sont dénaturés par chauffage à 95 C pendant 2 mn dans 0,2 ml NaOH 0,4 M contenant 25 mM EDTA puis refroidis rapidement sur glace avant d'être déposés dans les puits d'un appareil à filtrer, ajusté avec une membrane de nitrocellulose.
2. En dot blot
10 Cll des échantillons amplifiés sont dénaturés par chauffage à 95 C pendant 2 mn dans 0,2 ml NaOH 0,4 M contenant 25 mM EDTA puis refroidis rapidement sur glace avant d'être déposés dans les puits d'un appareil à filtrer, ajusté avec une membrane de nitrocellulose.
Après lavage des puits avec 100 pi de SSPE, la membrane est chauffée à 800C pendant 1 heure. Le filtre est hybridé 16 à 18 heures à 68'C avec le plasmide put01 marqué à 1'AAF. Après lavages la révélation immunoenzymatique s'effectue selon la technique décrite par MASSE et col (Annales de l'Institut
Pasteur/immunology 136D, 231-243). Seules les espèces appartenant au groupe du bacille de la tuberculose donnent un signal sur la membrane.
Pasteur/immunology 136D, 231-243). Seules les espèces appartenant au groupe du bacille de la tuberculose donnent un signal sur la membrane.
Exemple 2 : Identification des différentes espèces à l'intérieur du groupe du bacille de la tuberculose.
Après culture selon des techniques appropriées, les ADN sont extraits comme décrit au paragraphe ld. Il est effectué une digestion totale par l'enzyme PstI. Ces ADN subissent ensuite une électrophorèse sur gel d'agarose à 0,6 % en TAE avant d'être transférés sur membrane de nitrocellulose selon la technique de Southern.
Une hybridation réalisée dans les conditions décrites di-dessus et utilisant le plasmide pMTO1, ou un plasmide dérivé de celui-ci, marqué par l'acétyl-amino-fluorène permet après immunodétection des hybrides formés d'identifier l'espèce de la mycobactérie comme le montre la figure 3 où l'on distingue 14 fragments pour une souche de M.
tuberculosis (sillon 1) et seulement 2 fragments pour M. bovis-BCG (sillon 2), alors que l'on ne distingue aucun fragment au niveau du sillon 3 (M. avium) .
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention.
Claims (20)
10 20 30 40 50 60
GTCGACACGC CTTCTGCACG GGAAGTCCTT CTGCGGCCAT CGTTGCTATG GCCGCTTACT
CAGCTGTGCG GAAGACGTGC CCTTCAGGAA GACGCCGGTA GCAACGATAC CGGCGAATGA
70 80 90 100 110 120
GCCTTCTAGT CCGTGCGGCT CTCGCAACAG CTCACGGGAC CTTTTTGAGG ATCGCCACTT
CGGAAGATCA GGCACGCCGA GAGCGTTGTC GAGTGCCCTG GAAAAACTCC TAGCGGTGAA
130 140 150 160 170 180
CAGGTCTTGA ACTCGCGGAT GCCCTCATTG GCAACGTTTG CGCCCTGCCT TGGGGCGGCC
GTCCAGAAGT TGAGCGCCTA CGGGAGTAAC CGTTGCAAAC GCGGGACGGA ACCCCGCCGG
190 100 210 220 230 240
GGCAGCCACC AAGTCGAGCA CTTTGCGGCG GAACTACTCG GGGTAACACT TCGGCACGGA
CCGTCGGTGG TTCAGCTCGT GAAACGCCGC CTTGATGAGC CCGATTGTGA AGCCGTGCCT
250 260 270 280 290 300
CACGGCTCGT TCGACGGACG TCGTGACCAG AAGTCGAGCA AACCGACTCC ACTCTAGCTA
GTGCCGAGCA AGCTGCCTGC AGCACTGGTC TTCAGCTCGT TTGGCTGAGG TGAGATCGAT
310 320 330 340 350 360
GTGATACAAG CTTTTTTGTA GCCGCGCGAT GAACCGCCCC GGCATGTCCG GAGACTCCAG
CACTATGTTC GAAAAAACAT CGGCGCGCTA CTTGGCGGGG CCGTACAGGC CTCTGAGGTC
370 380 390 400 410 420
TTCTTGGAAA GGATGGGGTC ATGTCAGGTG GTTCATCGAG GAGGTACCCG CCGGAGCTGC
AAGAACCTTT CCTACCCCAG TACAGTCCAC CAAGTAGCTC CTCCATGGGC GGCCTCGACG
430 440 450 460 470 480
GTGACGGGGC GGTGCGGATG GTCGCAGAGA TCCGCGGTCA GCACGATTCG GAGTGGGCAG
CACTGCCCCG CCACGCCTAC CAGCGTCTCT AGGCGCCAGT CGTGCTAAGC CTCACCCGTC
490 500 510 520 530 540
CGATCAGTGA GGTCGCCCGT GTACTTGGTG TTGGCTGCGG AGACGGTGCG TAAGTGGGTG
GCTAGTCACT CCAGCGGGCA CATGAACCAC AACCGACGCC TCTGCCACGC ATTCACCCAC
550 560 570 580 590 600
CGCCAGGCGC AGGTCGATGC CGGCGCACGG CCCGGGACCA CGACCGAAGA ATCCGCTGAG
GCGGTCCGCG TCCAGCTACG GCCGCGTGCC GGGCCCTGGT GCTGGCTTCT TAGGCGACTC
610 620 630 640 650 660
CTGAAGCGCT TCGGCGGGAC AACGCGAATT GCGAAGGGCG AACGCGATTT TAAAGACCGC
GACTTCGCGA AGCCGCCCTG TTGCGCTTAA CGCTTCCCGC TTGCGCTAAA ATTTCTGGCC
670 680 690 700 710 720
GTCGGCTTTC TTCGCGGCCG AGCTCGACCG GCCAGCACGC TAATTACCCG GTTCATCGCC
CAGCCGAAAG AAGCGCCGGC TCGAGCTGGC CGGTCGTGCG ATTAATGGGC CAAGTAGCGG
730 740 750 760 770 780
GATCATCAGG GCCACCGCGA GGGCCCCGAT GGTTTGCGGT GGGGTGTCGA GTCGATCTGC
CTAGTAGTCC CGGTGGCGCT CCCGGGGCTA CCAAACGCCA CCCCACAGCT CAGCTAGACG
790 800 810 820 830 840
ACACAGCTGA CCGAGCTGGG TGTGCCGATC GCCCATCGAC CTACTACGAC CACATCAACC
TGTGTCGACT GGCTCGACCC ACACGGCTAG CGGGTAGCTG GATGATGCTG GTGTAGTTGG
850 860 870 880 890 900
GGGAGCCCAG CCGCGCGAGC TGCGCGATGG CGAACTCAAG GAGCACATCA GCCGCGTCCA
CCCTCGGGTC GGCGCGCTCG ACGCGCTACC GCTTGAGTTC CTCGTGTAGT CGGCGCAGGT
910 920 930 940 950 960
CGCCGCCAAC TACGGTGTTT ACCGTGCCCG CAAAGTGTGG CTAACCCTGA ACCGTGAGGG
GCGGCGGTTG ATGCCACAAA TGGCACGGGC GTTTCACACC GATTGGGACT TGGCACTCCC
970 980 990 1000 1010 1020
CATCGAGGTG GCCAGATGCA CCGTCGAACG GCTGATGACC AAACTCGGCC TGTCCGGGAC
GTAGCTCCAC CGGTCTACGT GGCAGCTTGC CGACTACTGG TTTGAGCCGG ACAGGCCCTG
1030 1040
1050 1060 1070 1080
CACCCGCGGC AAAGCCCGCA GGACCACGAT CGCTGATCCG GCCACAGCCC GTCCCGCCGA
GTGGGCGCCG TTTCGGGCGT CCTGGTGCTA GCGACTAGGC CGGTGTCGGG CAGGGCGGCT
1090 1100 1110 1120 1130 1140
TCTCGTCCAG CGCCGCTTCG GACCACCAGC ACCTAACCGG CTGTGGGTAG CAGACCTCAC
AGAGCAGGTC GCGGCGAAGC CTGGTGGTCG TGGATTGGCC GACACCCATC GTCTGGAGTG
1150
CTATGTGTCG AC
GATACACAGC TG
3A) Séquence nucléotidique selon la revendication 2, caractérisée en ce qu'elle comprend le fragment 343-1152 de la séquence de formule m ci-dessus.
4 ) Oligonucléotide, caractérisé en ce qu'il est constitué par un fragment d'une séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3.
5v) Oligonucléotide selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il présente la séquence de formule IV suivante:
ATGTCAGGTGGTTCATCGAG (IV).
6 ) Oligonucléotide selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il présente la séquence de formule V suivante:
ACAGGCCGAGTTTGGTCATC (V).
7 ) Produits de traduction et/ou fragments de ceux-ci, caractérisés en ce qu'ils sont codés par une séquence ou un fragment de séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3.
8 ) Procédé de détection d'une séquence répétée spécifique du groupe du bacille de la tuberculose selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il comprend:
(1) une étape dans laquelle on réalise une banque de cosmides recombinants comprenant des fragments d'ADN d'une mycobactérie appropriée supé rieurs à 30 kb; et
(2) une étape dans laquelle on détecte le/les clones cosmidiques contenant au moins une séquence répétée, par hybridation avec un ADN génomique total de mycobactérie appropriée, marqué de manière convenable.
9') Réactif de diagnostic pour la détection d'au moins un groupe de mycobactéries, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une séquence nucléotidique ou un fragment de celle-ci selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 pour la détection des mycobactéries du groupe du bacille de la tuberculose, éventuellement associée à au moins une autre séquence nucléotidique appropriée à la détection d'un autre groupe de mycobactéries et/ou à au moins un marqueur approprié.
10') Réactif selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il correspond à des paires d'amorces pour la synthèse d'un fragment d'ADN ou d'ARN du groupe du bacille de la tuberculose, chaque amorce comprenant une séquence ou un fragment de séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 6.
11') Réactif selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il est constitué par une paire d'amorces comprenant un oligonucléotide de formule W selon la revendication 5 apparié à un oligonucléotide de formule V selon la revendication 6.
12') Réactif selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il correspond à une sonde de détection appropriée d'un fragment d'ADN ou d'ARN du groupe du bacille de la tuberculose.
13') Réactif selon la revendication 12, caractérisé en ce que ladite sonde de détection comprend avantageusement une séquence nucléotidique de formule m selon la revendication 2 ou la revendication 3.
14') Réactif selon la revendication 9 ou la revendication 12, caractérisé en ce que le marqueur est choisi dans le groupe qui comprend notamment les isotopes radioactifs, les enzymes appropriées, les fluorochromes, les marqueurs chimiques appropriés, les haptènes et les anticorps ou les analogues de base appropriées.
15') Famille de plasmides recombinants, caractérisés en ce qu'ils contiennent au moins une séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3.
16') Plasmide selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence nucléotidique de formule m selon la revendication 2 ou un fragment de ceile-ci.
17 ) Plasmide selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'il comprend ladite séquence associée à un vecteur pUC18.
18 ) Plasmide selon la revendication 16 ou la revendication 17, ca ractérisé en ce qu'il a été dénommé pMT0l et en ce qu'il a été déposé sous le n I900, en date du 25 août 1989, auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes tenue par 1'Institut Pasteur.
19 ) Procédé de détection et d'identification rapide d'au moins un groupe et/ou une espèce de mycobactéries dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend:
(1) une étape dans laquelle l'on met en contact l'échantillon biologique avec au moins un réactif de diagnostic selon l'une quelconque des revendications 10 à 14 et
(2) une étape dans laquelle on détecte par tout moyen approprié le ou les produits résultant de l'interaction séquence nucléotidique de mycobactérie éventuellement présente-réactif de diagnostic.
20 ) Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que le/les réactifs de diagnostic de l'étape (1) sont une/des paires d'amorces selon l'une quelconque des revendications 9 à 1 1 et permettent l'obtention de produits d'amplification de la séquence nucléotidique à détecter.
21 ) Procédé selon la revendication 20, caractérisé en ce que les produits d'amplification obtenus en (1) sont détectés par séparation électrophorétique.
22 ) Procédé selon la revendication 20, caractérisé en ce que les produits d'amplification obtenus en (1) sont détectés par hybridation entre lesdits produits d'amplification et un réactif de diagnostic selon l'une quelconque des revendications 9, 12, 13 ou 14.
23 ) Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que le réactif de diagnostic de l'étape (1) est une sonde de détection selon l'une quelconque des revendications 9, 12, 13 ou 14 et permet l'obtention d'hybrides entre la séquence nucléotidique à détecter et ladite sonde.
240) Kit, coffret ou ensemble coordonné prêt à l'emploi pour la mise en oeuvre du procédé de détection d'au moins un groupe et/ou d'une espèce de mycobactéries selon l'une quelconque des revendications 19 à 23, caractérisé en ce qu'il comprend outre des quantités utiles de tampons et de réactifs appropriés pour la mise en oeuvre de ladite détection:
- des doses appropriées d'une paire d'amorces selon l'une quelconque des revendications 9 à 1 1; et/ou
- des doses appropriées d'au moins une sonde ou un fragment de sonde nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 9, 12, 13 ou 14.
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