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Abstract

A hybrid protein containing sequences derived respectively from the MalE protein and the CD4 protein of the T lymphocytes. Said protein comprises more particularly the soluble N-terminal part of the CD4 protein. It is designed for use in the production of drugs for combatting AIDS.

Description

PROTEINE HYBRIDE MalE-CD4 OU POLYPEPTIDE CD4 ISSU DE
LA PROTEINE HYBRIDE AYANT DES PROPRIETES
NEUTRALISANTES VIS-A-VIS DES VIRUS HIV
L'invention est relative à des polypeptides résultant de la fusion entre, d'une part, au moins une partie de la molécule CD4 (également dénommée T4), plus particulièrement celle comportant la région proche de son extrémité N-terminale qui contient un site de fixation pour les virus HIV et, d'autre part, une protéine périplasmique bactérienne affine du maltose (MalE).Elle concerne encore plus particulièrement des polypeptides hybrides de ce type, voire même la susdite partie de molécule CD4 séparée à partir de tels polypeptides hybrides, plus particulièrement lorsque ces divers polypeptides consistent en des produits d'expression dans E. coli de séquences d'ADN correspondantes sous le contrôle d'éléments de régulation appropriés, ces produits d'expression ayant été exportés dans le périplasme bactérien, extraits et purifiés, de préférence en une seule étape sur colonne d'affinité et, le cas échéant, traité par des protéases choisies pour récupérer un polypeptide dont l'essentiel de la séquence consiste en celle de la protéine CD4'ou de la susdite partie de protéine CD4, à partir de ces polypeptides hybrides.HYBRID PROTEIN MalE-CD4 OR CD4 POLYPEPTIDE FROM
HYBRID PROTEIN WITH PROPERTIES
NEUTRALIZING FOR HIV VIRUSES
The invention relates to polypeptides resulting from the fusion between, on the one hand, at least a part of the CD4 molecule (also called T4), more particularly that comprising the region near its N-terminal end which contains a site. of binding for HIV viruses and, on the other hand, a bacterial periplasmic protein affine maltose (MalE). It relates even more particularly to hybrid polypeptides of this type, or even the aforementioned part of CD4 molecule separated from such polypeptides hybrids, more particularly when these various polypeptides consist of expression products in E. coli of corresponding DNA sequences under the control of appropriate regulatory elements, these expression products having been exported into the bacterial periplasm, extracts and purified, preferably in a single step on affinity column and, if necessary, treated with proteases chosen to recover er a polypeptide the essential sequence of which consists of that of the CD4 protein or of the above-mentioned part of CD4 protein, from these hybrid polypeptides.

I1 est entendu que dans ce texte l'abréviation
HIV se rapporte à tout rétrovirus susceptible d'induire un SIDA chez l'hôte, notamment l'homme. A ce titre, HIV se rapporte à HIV1, HIV2 ou à tous variants pathogènes de ces derniers. Les chiffres entourés de signes entre parenthèses renvoient à la bibliographie jointe au présent texte. It is understood that in this text the abbreviation
HIV relates to any retrovirus capable of inducing AIDS in the host, in particular humans. As such, HIV refers to HIV1, HIV2 or any pathogenic variants thereof. The figures surrounded by signs in parentheses refer to the bibliography attached to this text.

La protéine CD4 est une glycoprotéine intégrale de la membrane des lymphocytes T (helper/inducer). La partie externe (située du côté N-terminal) se compose de quatre domaines semblables à ceux des chaînes légères des immunoglobulines. Elle est suivie d'une partie transmembranaire et d'une partie cytoplasmique (1). Cette protéine sert de récepteur pour le virus
HIV (responsable du SIDA) pàr le biais d'une interaction avec la protéine virale gp120 (2 > . Il a été montré que les deux premiers domaines (qui sont dépourvus de sites de glycosylation) contiennent le site de liaison à gap120 ainsi que ceux des anticorps monoclonaux anti-CD4, nommés IOT4 et sKT4A et possédant un pouvoir neutralisant sur l'infectivité virale (3), (4), (5).Il a été montré qu'une protéine tronquée, contenant ces deux domaines, et secrétée par des cellules eucaryotes a la faculté d'inhiber l'infection virale dans des tests in vitro (3), (4), (6), (7), (8), (9) et chez le singe rhésus (10).The CD4 protein is an integral glycoprotein of the T-cell membrane (helper / inducer). The outer part (located on the N-terminal side) consists of four domains similar to those of the light chains of immunoglobulins. It is followed by a transmembrane part and a cytoplasmic part (1). This protein serves as a receptor for the virus
HIV (responsible for AIDS) through an interaction with the viral protein gp120 (2>. It has been shown that the first two domains (which have no glycosylation sites) contain the binding site to gap120 as well as those monoclonal anti-CD4 antibodies, named IOT4 and sKT4A and having a neutralizing power on viral infectivity (3), (4), (5). It has been shown that a truncated protein, containing these two domains, and secreted by eukaryotic cells has the ability to inhibit viral infection in in vitro tests (3), (4), (6), (7), (8), (9) and in rhesus monkeys (10) .

Un procédé permettant de faire exprimer dans E. A method for expressing in E.

coli un rédepteur CD4 fonctionnel fusionné à la protéine bactérienne périplasmique MalE, affine pour le maltose et les maltodextrines, a déjà été exposé dans la demande 'de brevet européen publiée le 18 janvier 1989 sous le n 299.810. Il permet la réalisation de fusions entre le gène MalE et d'autres gènes bactériens qui ont déjà été réalisées (11), (12). Les protéines hybrides obtenues conservent les fonctions des deux composants. De plus, elles sont susceptibles d'être exportées dans le périplasme.coli a functional CD4 re-receptor fused to the periplasmic bacterial protein MalE, affine for maltose and maltodextrins, has already been described in the European patent application published on January 18, 1989 under the number 299.810. It enables fuses between the MalE gene and other bacterial genes which have already been carried out (11), (12) to be carried out. The hybrid proteins obtained retain the functions of the two components. In addition, they are likely to be exported to the periplasm.

L'invention met à profit le fait que cet environnement parait dans les bactéries gram négatif, dont en particulier E. coli, favoriser à la fois l'établissement des ponts disulfure importants pour l'activité biologique de CD4, et plus particulièrement de la partie N-terminale de cette dernière.The invention takes advantage of the fact that this environment appears in gram negative bacteria, including in particular E. coli, to promote both the establishment of disulfide bridges important for the biological activity of CD4, and more particularly of the part N-terminal of the latter.

Les protéines hybrides peuvent aussi être exprimées dans des cellules eucaryotes telles que la lignée C1102 (fibrioblastes embryonnaires de hamster) quand elles sont tranféctées par des constructions associant les gènes MalE et CD4 fusionnés à des signaux de transcription propres aux cellules eucaryotes (par exemple origine de réplication et signaux de polyadénylation du virus Su40), On applique pour cela des techniques connues de l'homme de l'art. Hybrid proteins can also be expressed in eukaryotic cells such as the C1102 line (hamster embryonic fibrioblasts) when they are transfected by constructs associating the MalE and CD4 genes fused to transcription signals specific to eukaryotic cells (for example origin of replication and polyadenylation signals of the virus Su40). Techniques known to those skilled in the art are applied for this.

Le procédé décrit dans le brevet permet d'envisager à court terme une production massive de telles protéines hybrides. Les étapes de purification sont simples et rapides. En effet, comme la protéine
MalE, la protéine hybride est susceptible d'être produite en abondance et d'être purifiée en une étape sur colonne d'amylose avec élution par le maltose à pH neutre.The process described in the patent makes it possible to envisage in the short term a massive production of such hybrid proteins. The purification steps are simple and quick. Indeed, like protein
MalE, the hybrid protein is likely to be produced in abundance and to be purified in one stage on an amylose column with elution by maltose at neutral pH.

Il est apparu, conformément à la présente invention, que cette technique permettait d'ores et déjà, en ce qui concerne plus particulièrment la protéine CD4, une évaluation de son pouvoir thérapeutique, qu'elle soit à l'état hybride ou non, et donnait accès à certaines études telles que sélection de mutants CD4 ayant des propriétés modifiées (stabilité, interaction avec le virus ...), évaluation du pouvoir thérapeutique de parties de la molécule CD4. It appeared, in accordance with the present invention, that this technique already allows, with regard more particularly to the CD4 protein, an evaluation of its therapeutic power, whether it is in the hybrid state or not, and gave access to certain studies such as selection of CD4 mutants with modified properties (stability, interaction with the virus, etc.), evaluation of the therapeutic power of parts of the CD4 molecule.

L'invention concerne plus particulièrement un polypeptide hybride contenant une chaîne peptidique dérivée de la protéine CD4 fusionnée, en amont de son extrémité N-terminale avec une première séquence et, le cas échéant, en aval de son extrémité C-terminale, avec une seconde séquence, respectivement issues de la protéine MalE, ce polypeptide hybride étant plus particulièrement caractérisé
- en ce que la chaîne peptidique dérivée de la protéine CD4 contient au moins la partie de région Nterminale de cette protéine qui comprend elle-même un site de fixation du virus HIV et
- en ce que ladite première séquence issue de
MalE et, le cas échéant, la seconde présentent lorsque l'on a recours à des techniques de production par génie génétique pour la production de la protéine hybride, des longueurs suffisantes pour que le polypeptide hybride conserve à la fois les propriétés de la protéine MalE eu égard à son transport dans le micro-organisme transfecté alors utilisé, notamment E.The invention relates more particularly to a hybrid polypeptide containing a peptide chain derived from the fused CD4 protein, upstream from its N-terminal end with a first sequence and, where appropriate, downstream from its C-terminal end, with a second sequence, respectively derived from the MalE protein, this hybrid polypeptide being more particularly characterized
- in that the peptide chain derived from the CD4 protein contains at least the Nterminal region part of this protein which itself comprises a binding site for the HIV virus and
- in that said first sequence resulting from
MalE and, where appropriate, the second present, when genetic engineering production techniques are used for the production of the hybrid protein, sufficient lengths for the hybrid polypeptide to retain both the properties of the MalE protein with regard to its transport in the transfected microorganism then used, in particular E.

coli hors du cytoplasme et d'exportation dans le périplasme de cet organisme et l'affinité spécifique de MalE pour le maltase ou l'amylose.coli out of the cytoplasm and exported into the periplasm of this organism and the specific affinity of MalE for maltase or amylose.

Un polypeptide préféré de l'invention est dépourvu de la susdite seconde chaîne. Il a en effet été constaté que ces derniers types de polypeptides hybrides étaient beaucoup mieux tolérés par les bactéries en culture qui les produisent que ceux dans lesquels la séquence issue de CD4 était intercalée entre les deux chaînes précédemment indiquées. Il est remarquable aussi que l'activité propre à la protéine
CD4 soit conservée, alors même que celle-ci est fusionnée avec la chaîne issue de MalE au niveau de sa propre extrémité N-terminale, dont on sait qu'elle est elle-même proche d'un site de fixation sur les virus du type HIV.A preferred polypeptide of the invention is devoid of the above second chain. It has in fact been found that these latter types of hybrid polypeptides are much better tolerated by the bacteria in culture which produce them than those in which the sequence derived from CD4 was inserted between the two chains previously indicated. It is also remarkable that the activity specific to the protein
CD4 is kept, even though it is fused with the chain from MalE at its own N-terminal end, which we know is itself close to a binding site on viruses of the type HIV.

En particulier le polypeptide selon l'invention contient au moins la région VI de la protéine CD4, voire aussi la région V2.  In particular, the polypeptide according to the invention contains at least region VI of the CD4 protein, or even also region V2.

L'invention concerne plus particulièrement encore les polypeptides hybrides tels que définis ci-dessus, lorsqu'ils ont été produits dans une bactérie gram négatif dont E. coli dans les conditons rappelées plus haut, ou encore un polypeptide dérivé du précédent, après séparation des chaînes contenant les séquences issues de MalE. The invention relates more particularly still to the hybrid polypeptides as defined above, when they have been produced in a gram negative bacterium including E. coli in the conditions mentioned above, or alternatively a polypeptide derived from the above, after separation of the strings containing the sequences from MalE.

Les polypeptides selon l'invention peuvent être produits notamment par les techniques décrites dans la demande de brevet européen nO 299.810, à laquelle il a été fait référence dans ce qui précède. Ce sont les mêmes techniques qui ont été mises en oeuvre dans les exemples qui suivent. D'autres caractéristiques de l'invention résultent encore de la description de ces exemples considérée en combinaison avec - la fig. 1 qui montre de façon schématique les parties essentielles de la protéine CD4, et leur relation à l'égard de la membrane des lympohocytes qui normalement la portent, - la fig. 2 qui fournit des représentations schématiques de polypeptides conformes à l'invention et des constructions des plasmides correspondants qui permettent la production dans E. coli de tels polypeptides. The polypeptides according to the invention can be produced in particular by the techniques described in European patent application No. 299,810, to which reference has been made in the foregoing. These are the same techniques which have been used in the examples which follow. Other characteristics of the invention also result from the description of these examples considered in combination with - FIG. 1 which shows schematically the essential parts of the CD4 protein, and their relationship with respect to the membrane of the lympohocytes which normally carry it, - FIG. 2 which provides schematic representations of polypeptides according to the invention and constructs of the corresponding plasmids which allow the production in E. coli of such polypeptides.

Il est fait référence à l'article de P.J. Maddon et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 84, pp. Reference is made to the article by P.J. Maddon et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 84, pp.

9155-9159, December 1987, Immunology, avec la correction apportée par Littman et al, Cell 55, 541, 1988, pour ce qui est de la séquence peptidique de la protéine CD4 et la numérotation de ces aminoacides, telle qu'elle est employée dans le présent texte.9155-9159, December 1987, Immunology, with the correction made by Littman et al, Cell 55, 541, 1988, with regard to the peptide sequence of the CD4 protein and the numbering of these amino acids, as used in this text.

La structure globale de la protéine CD4 est montrée schématiquement dans la fig. 1, dans laquelle: - la partie représentée par un trait épaissi -(et à laquelle renvoie la flèche partant de HIV) correspond au site de fixation auquel il est plus particulièrement fait référence dans le présent texte, - les désignations à droite de la représentation schématique de la protéine se réfèrent aux différentes parties de la protéine (VI, V2, V3 et V4), ainsi qu'aux positions des sites de la protéine CD4 reconnus par les anticorps monoclonaux identifiés dans la figure, - les lettres "G" font référence aux sites normalement glycosylés de la protéine CD4 et - les lettres E, M et C aux régions respectivement extracellulaires (E), membranaires (M) et cytoplasmiques (C) de la. protéine CD4. The overall structure of the CD4 protein is shown schematically in FIG. 1, in which: - the part represented by a thickened line - (and to which the arrow starting from HIV refers) corresponds to the fixation site to which reference is more particularly made in the present text, - the designations to the right of the representation schematic of the protein refer to the different parts of the protein (VI, V2, V3 and V4), as well as to the positions of the CD4 protein sites recognized by the monoclonal antibodies identified in the figure, - the letters "G" are reference to the normally glycosylated sites of the CD4 protein and - the letters E, M and C to the respectively extracellular (E), membrane (M) and cytoplasmic (C) regions of the. CD4 protein.

Expression et localisation
Deux vecteurs d'expression portant un gène chimérique (fig. 1) ont été construits. Le premier détermine -une protéine hybride (CIMER) où les 177 acides aminés de la partie N-terminale de CD4 sont fusionnés à l'extrémité C-terminale de MalE (369 acides aminés). Le second code pour une protéine hybride (CISREM) comprenant le même fragment de CD4 fusionné cette fois à l'extrémité N-terminale de la protéine MalE. Dans ce dernier cas, afin de faciliter l'exportation dans le périplasme, la partie Nterminale de CD4 a été elle-même fusionnée au peptide signal de MalE : la partie soluble de CD4 se trouve donc entre le peptide signal de MalE et la protéine mature (voir fig. 1).Expression and localization
Two expression vectors carrying a chimeric gene (fig. 1) were constructed. The first determines a hybrid protein (CIMER) where the 177 amino acids of the N-terminal part of CD4 are fused to the C-terminal end of MalE (369 amino acids). The second code for a hybrid protein (CISREM) comprising the same CD4 fragment fused this time to the N-terminal end of the MalE protein. In the latter case, in order to facilitate export into the periplasm, the Nterminal part of CD4 was itself fused with the signal peptide of MalE: the soluble part of CD4 is therefore found between the signal peptide of MalE and the mature protein (see fig. 1).

Les constructions en cause sont schématiquement représentées dans la fig. 2 : on en rappelle -ci-après les caractéristiques principales (appréciées en combinaison avec la fig. 2).  The constructions in question are schematically represented in FIG. 2: the main characteristics are recalled hereinafter (appreciated in combination with FIG. 2).

Fusion MalE-CD4 = CIMER
Un fragment d'ADN (Fnu4H-NdeI) contenant les codons -4 à +177 du gène CD4 a été inséré dans un plasmide (dérivé de pBR322) portant les gènes de résistance à l'ampicilline et à la tétracycline, le gène lac1 et le gène MalE placé sous le contrôle du promoteur tac (inductible à 1'IPTG). Un adaptateur a été inséré à l'extrémité distale de MalE, si bien que l'insertion de CD4 se situe en phase au niveau du dernier codon de malt. La structure de la protéine est indiquée au-dessus du schéma représentant celle du plasmide.Fusion MalE-CD4 = CIMER
A DNA fragment (Fnu4H-NdeI) containing the codons -4 to +177 of the CD4 gene was inserted into a plasmid (derived from pBR322) carrying the genes for resistance to ampicillin and to tetracycline, the gene lac1 and the MalE gene placed under the control of the tac promoter (inducible to IPTG). An adapter was inserted at the distal end of MalE, so that the insertion of CD4 is in phase at the last malt codon. The structure of the protein is indicated above the diagram representing that of the plasmid.

Fusion CD4-MalE = CISREM
Dans un premier temps, le même fragment de CD4 a été inséré en aval de la séquence signal de malE (après le 27ème codon de la protéine mature). Dans un deuxième temps, la totalité de malE (codons -2 à +370) a été insérée en phase après le 177ème codon de CD4.CD4-MalE fusion = CISREM
First, the same CD4 fragment was inserted downstream of the malE signal sequence (after the 27th codon of the mature protein). In a second step, all of malE (codons -2 to +370) was inserted in phase after the 177th codon of CD4.

Le reste du plasmide (résistances å l'ampicilline et à la tétracycline, gène lacN et promoteur tac) sont identiques au précédent. La structure de la protéine est indiquée au-dessus du schéma représentant celle du plasmide.The rest of the plasmid (resistance to ampicillin and tetracycline, lacN gene and tac promoter) are identical to the previous one. The structure of the protein is indicated above the diagram representing that of the plasmid.

Dans les deux cas, la transcription des gènes chimériques est placée sous le contrôle du promoteur tac (13). Elle est insensible à la répression catabolique et peut être induite à volonté par l'addition d'IPTG (Isopropyl B-D-thiogalactoside) : la présence sur le plasmide du gène lace (qui détermine un répresseur se fixant au promoteur tac) assure un faible niveau d'expression en absence d'inducteur. In both cases, the transcription of the chimeric genes is placed under the control of the tac promoter (13). It is insensitive to catabolic repression and can be induced at will by the addition of IPTG (Isopropyl BD-thiogalactoside): the presence on the plasmid of the lace gene (which determines a repressor binding to the tac promoter) ensures a low level expression without an inducer.

Pour favoriser la production d'une protéine stable, l'on a eu recours à des souches d'E. coli portant les mutations loir et degp qui inactivent respectivement des protéases cytoplasmiques et périplasmiques (14), (15). Lorsque les cellules porteuses des vecteurs d'expression sont induites pendant trois ou quatre générations à 300C, elles produisent une protéine majoritairement exportée (CIMER) ou partiellement exportée (CISREM) dans le périplasme, identifiable par sa taille (60 KD), et par les anticorps spécifiques dirigés contre ses déterminants antigéniques MalE et CD4. To promote the production of a stable protein, strains of E. coli carrying the dormouse and degp mutations which inactivate cytoplasmic and periplasmic proteases respectively (14), (15). When the cells carrying the expression vectors are induced for three or four generations at 300C, they produce a protein mainly exported (CIMER) or partially exported (CISREM) in the periplasm, identifiable by its size (60 KD), and by specific antibodies directed against its antigenic determinants MalE and CD4.

La fraction de molécules synthétisées qui présentent des tailles intermédiaires entre la protéine hybride complète et la protéine MalE, probablement des produits de dégradation ou d'expression abortive, n'a représenté qu'une proportion minoritaire des protéines hybrides produites. The fraction of synthesized molecules which have intermediate sizes between the complete hybrid protein and the MalE protein, probably degradation or abortive expression products, represented only a minority proportion of the hybrid proteins produced.

Dans des conditions de faible expression (niveau non induit), les protéines de fusion sont capables de complémenter une souche délétée pour MalE (croissance normale en milieu synthétique contenant du maltose comme unique source de carbone). Dans des conditions de pleine induction, la surproduction de CISREM tend à devenir toxique pour les bactéries alors que celle de
CIMER ne l'est pas. Nous avons purifié cette dernière protéine et étudié ses propriétés,
Il a été montré que les deux constituants des protéines hybrides purifiées, et plus particulièrement de la protéine CIMER sur colonne d'amylose conservent leurs fonctions respectives.Under low expression conditions (non-induced level), the fusion proteins are capable of complementing a strain deleted for MalE (normal growth in synthetic medium containing maltose as the sole carbon source). Under full induction conditions, the overproduction of CISREM tends to become toxic to bacteria while that of
CIMER is not. We purified this last protein and studied its properties,
It has been shown that the two constituents of the purified hybrid proteins, and more particularly of the CIMER protein on an amylose column, retain their respective functions.

1 - La partie MalE conserve son site de reconnaissance du maltose et des maltodextrines. 1 - The MalE part retains its recognition site for maltose and maltodextrins.

Le passage du contenu périplasmique (choc osmotique) sur colonne d'amylose conduit à la fixation spécifique d'une fraction des protéines périplasmiques à l'amylose. Cette fraction peut être éluée de la colonne par du maltose et purifiée en une seule étape avec un rendement de l'ordre de 500 ug de protéine hybride par g de bactéries. The passage of the periplasmic content (osmotic shock) on an amyloidosis column leads to the specific fixation of a fraction of the periplasmic proteins to amyloidosis. This fraction can be eluted from the column with maltose and purified in a single step with a yield of the order of 500 μg of hybrid protein per g of bacteria.

Cette population moléculaire, affine pour l'amylose et le maltose, présente sur gel de polyacrylamide-SDS la masse moléculaire apparente de 60 kD attendue pour la protéine hybride et est reconnue par des anticorps polyclonaux anti MalE et monoclonaux anti-CD4. Le poids moléculaire de 60 kD (indiqué ci-dessus) a été apprécié par comparaison des distances de migration sur gel respectivement de la protéine hybride et de protéines de référence de poids moléculaires élevés connus, dans les conditions décrites à propos de la mise en oeuvre du kit de haut poids moléculaire Amersham RAINBOW. Les susdites protéines de référence étaient constituées par les proteines suivantes - phosphorylase 92.500 daltons, - ovalbumine 46.000 daltons, - sérumaîbumine bovine 69.000 daltons, - lyzosyme 14.300 daltons. This molecular population, affine for amylose and maltose, present on polyacrylamide-SDS gel the apparent molecular mass of 60 kD expected for the hybrid protein and is recognized by anti-MalE polyclonal and anti-CD4 monoclonal antibodies. The molecular weight of 60 kD (indicated above) was assessed by comparison of the gel migration distances of the hybrid protein and of known high molecular weight reference proteins respectively, under the conditions described in connection with the implementation. from the Amersham RAINBOW high molecular weight kit. The above-mentioned reference proteins consisted of the following proteins - phosphorylase 92,500 daltons, - ovalbumin 46,000 daltons, - bovine serum albumin 69,000 daltons, - lyzosyme 14,300 daltons.

2 - La Dartie CD4 de la Drotéine hybride est capable de lier les particules virales HIV par l'intermédiaire de leur protéine d'enveloppe ail20.  2 - The Dartie CD4 of the hybrid Drotein is capable of binding the HIV viral particles via their envelope protein ail20.

i. Des expériences mettant en oeuvre des anticorps monoclonaux "neutralisants" montrent que ces derniers (IOT4 et OKT4A déjà mentionnés) réagissent avec la protéine hybride en tests ELISA ou par immunoprécipitation aux mêmes concentrations que le
CD4 soluble purifié a partir des cellules de mammifères.i. Experiments using “neutralizing” monoclonal antibodies show that the latter (IOT4 and OKT4A already mentioned) react with the hybrid protein in ELISA tests or by immunoprecipitation at the same concentrations as the
Soluble CD4 purified from mammalian cells.

ii. Une interaction directe entre la protéine hybride et une protéine purifiée gpl20 ou gp160 de
HIV1 a pu être mise en évidence par coimmunoprécipitation et par immunotransfert;
iii. Finalement la mise en présence de la protéine hybride avec des particules virales "neutralisent" ces dernières. Cela est mis en évidence dans un test où le pouvoir infectieux du virus HIV1 sur les cellules de la lignée lymphocytaire CEM est mesurée par l'activité de la trasncriptase réverse et la cytotoxicité. La préincubation du virus avec une concentration de CIMER de 1 pg/ml a le même pouvoir neutralisant que l'utilisation d'azidothymidine (ou
AZT, l'un des agents anti-HIV le plus utilisé) à la concentration de 10 nM.On observe une inhibition supérieure à 90 % du virus à partir de concentrations de CIMER supérieures à 10 vg/ml. Ces résultats sont en bon accord avec ceux obtenus avec du CD4 soluble produit par d'autres méthodes (3), (7), (8), (9).ii. A direct interaction between the hybrid protein and a purified protein gpl20 or gp160 from
HIV1 could be demonstrated by co-immunoprecipitation and by immunoblotting;
iii. Finally, bringing the hybrid protein into contact with viral particles "neutralize" the latter. This is demonstrated in a test where the infectious power of the HIV1 virus on cells of the CEM lymphocyte line is measured by the activity of reverse trasncriptase and cytotoxicity. Preincubation of the virus with a CIMER concentration of 1 pg / ml has the same neutralizing power as the use of azidothymidine (or
AZT, one of the most used anti-HIV agents) at a concentration of 10 nM. An inhibition greater than 90% of the virus is observed from concentrations of CIMER greater than 10 μg / ml. These results are in good agreement with those obtained with soluble CD4 produced by other methods (3), (7), (8), (9).

Toutes ces données convergentes indiquent que la composante CD4 de la protéine hybride a conservé une configuration lui permettant de se lier avec la particule virale entière. Il est probable en particulier que les ponts disulfure de CD4 se sont formés correctement. All these convergent data indicate that the CD4 component of the hybrid protein has retained a configuration allowing it to bind with the entire viral particle. In particular, it is likely that the CD4 disulfide bridges have formed correctly.

En utilisant la construction MalE-T4 décrite dans la demande de brevet européen nO 299.810, il a aussi été montré que la protéine hybride MalE-T4, exprimée, purifiable en une seule étape par affinité sur une colonne d'amylose, à partir de bactéries soniquées ou à partir d'un choc osmotique, possède les propriétés suivantes
1) Elle est reconnue par des anticorps polyclonaux dirigés contre MalE et par des anticorps monoclonaux (IOT4, OKT4, OKT4A) dirigés contre CD4 (alias T4). By using the MalE-T4 construct described in European patent application No. 299,810, it has also been shown that the hybrid protein MalE-T4, expressed, purifiable in a single step by affinity on an amylose column, from bacteria sonicated or from osmotic shock, has the following properties
1) It is recognized by polyclonal antibodies directed against MalE and by monoclonal antibodies (IOT4, OKT4, OKT4A) directed against CD4 (alias T4).

2) Elle interagit avec les protéines virales gpl20 et gpl60. Ceci a été montré de trois manieres
a) expériences de "dot blot" (protéines natives),
b) co-immunoprécipitation du complexe MalE
T4:gp160 (protéines natives) par des anticorps polyclonaux dirigés contre MalE ou gp160,
c) rétention de gpl60 par la protéine hybride ("dénaturée") fixée sur nitrocellulose ("Western Blot" incubé avec gp160 et révélé par des anticorps dirigés contre gpl60). 2) It interacts with the viral proteins gpl20 and gpl60. This has been shown in three ways
a) dot blot experiments (native proteins),
b) co-immunoprecipitation of the MalE complex
T4: gp160 (native proteins) by polyclonal antibodies directed against MalE or gp160,
c) retention of gpl60 by the hybrid protein ("denatured") fixed on nitrocellulose ("Western Blot" incubated with gp160 and revealed by antibodies directed against gpl60).

3) Elle est capable d'inactiver le virus HIV1 dans un test in vitro. La préincubation du virus avec des concentrations croissantes de la protéine fusion (0, 2, 20 et 50 ug/ml) aboutit a une inhibition croissante- du virus (0, 55, 90 et 100 %) pour sa capacité à se répliquer dans des cellules de la lignée
CEM (les chiffres indiqués se rapportent à l'inhibition de l'activité transcriptase réverse au bout de 15 jours). La protéine MalE, purifiée et utilisée dans des conditions identiques ne produit aucune inhibition de la réplication virale.3) It is capable of inactivating the HIV1 virus in an in vitro test. Preincubation of the virus with increasing concentrations of the fusion protein (0, 2, 20 and 50 µg / ml) results in increasing inhibition of the virus (0, 55, 90 and 100%) for its ability to replicate in lineage cells
CEM (the figures given relate to the inhibition of reverse transcriptase activity after 15 days). The MalE protein, purified and used under identical conditions, does not inhibit viral replication.

Les protéines hybrides, résultats de fusions entre le gène bactérien malE et une fraction du gène
CD4 humain, et exprimées dans E. coli conservent donc les propriétés des deux composants, notamment le pouvoir neutralisant de CD4 envers le virus HIV, notamment HIVI. Hybrid proteins, results of fusions between the bacterial gene malE and a fraction of the gene
Human CD4, and expressed in E. coli therefore retain the properties of the two components, in particular the neutralizing power of CD4 towards the HIV virus, in particular HIVI.

L'invention concerne donc aussi les compositions destinées a l'usage thérapeutique in vivo, contenant, en association avec un véhicule pharmaceutique approprié au mode d'administration choisi, notamment par voie parentérale, une dose efficace pour neutraliser in vivo un rétrovirus appartenant à la classe des HIV, du polypeptide hybride MalE-CD4, tel que défini ci-dessus ou du peptide soluble CD4 dérivé du susdit polypeptide hybride, apurés clivage et séparation de ses séquences MalE. La susdite dose efficace peut être variable d'un patient à l'autre et devrait chaque fois être appréciée par le clinicien.A titre purement indicatif, et sans pour autant restreindre la portée de l'invention, les doses quotidiennes devraient se situer entre 100 pg et 10 g, par exemple être de l'ordre de 1 gramme. The invention therefore also relates to compositions intended for therapeutic use in vivo, containing, in association with a pharmaceutical vehicle suitable for the chosen mode of administration, in particular parenterally, a dose effective for neutralizing in retrovirus a retrovirus belonging to the class of HIV, of the hybrid polypeptide MalE-CD4, as defined above or of the soluble peptide CD4 derived from the above-mentioned hybrid polypeptide, after cleavage and separation of its MalE sequences. The above effective dose can be variable from one patient to another and should each time be appreciated by the clinician. For information only, and without limiting the scope of the invention, daily doses should be between 100 pg and 10 g, for example being of the order of 1 gram.

Les protéines hybrides selon l'invention peuvent être produites en grande quantité. L'utilisation d'E. The hybrid proteins according to the invention can be produced in large quantities. The use of.

coli en tant qu'agent d'expression de CD4 rend envisageable l'introduction de modifications au niveau du gène CD4 et la mise au point de techniques de sélection permettant d'isoler des mutants plus efficaces encore. Ces protéines hybrides autorisent aussi des études de structure de CD4, par exemple par des rayons X. Elles peuvent également être appliquées, après fixation sur une colonne affine, notamment à base de maltose polymérisé ou d'amylose, à la purification de virus HIV contenu dans un milieu de culture, notamment par rétention sélective du virus à l'occasion de la mise en contact d'un tel milieu avec une telle colonne affine.coli as a CD4 expression agent makes it possible to envisage the introduction of modifications at the level of the CD4 gene and the development of selection techniques making it possible to isolate even more efficient mutants. These hybrid proteins also allow studies of CD4 structure, for example by X-rays. They can also be applied, after fixation on an affine column, in particular based on polymerized maltose or amylose, to the purification of HIV virus contained in a culture medium, in particular by selective retention of the virus when such a medium is brought into contact with such an affine column.

L'invention concerne également un procédé de détection in vivo de la présence éventuelle de virus
HIV ou d'antigènes de ce virus dans un échantillon biologique, ce procédé comprenant la mise en contact de cet échantillon biologique avec un polypeptide hybride ou non, tel que défini plus haut, dans des conditions autorisant la fixation de ce polypeptide sur l'HIV ou l'antigène d'HIV éventuellement présent et la détection du complexe éventuellement produit. The invention also relates to a method for in vivo detection of the possible presence of viruses
HIV or antigens of this virus in a biological sample, this process comprising bringing this biological sample into contact with a hybrid or non-hybrid polypeptide, as defined above, under conditions allowing the binding of this polypeptide to HIV or the HIV antigen possibly present and the detection of the complex possibly produced.

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Claims (9)

REVENDICATIONS 1. Polypeptide hybride contenant une chaîne peptidique dérivée de la protéine CD4 fusionnée, en amont de son extrémité N-terminale avec une première séquence et, le cas échéant, en aval de son extrémité 1. Hybrid polypeptide containing a peptide chain derived from the fused CD4 protein, upstream from its N-terminal end with a first sequence and, where appropriate, downstream from its end C-terminale, avec une seconde séquence, respectivement issues de la protéine MalE, ce polypeptide hybride étant plus particulièrement caractériséC-terminal, with a second sequence, respectively originating from the protein MalE, this hybrid polypeptide being more particularly characterized - en ce que la chaîne peptidique dérivée de la protéine CD4 contient au moins la partie de région Nterminale de cette protéine qui comprend elle-même un site de fixation du virus HIV et - in that the peptide chain derived from the CD4 protein contains at least the Nterminal region part of this protein which itself comprises a binding site for the HIV virus and - en ce que ladite première séquence issue de - in that said first sequence resulting from MalE et, le cas échéant, la seconde présentent lorsque l'on a recours a des techniques de production par génie génétique pour la production de la protéine hybride, des longueurs suffisantes pour que le polypeptide hybride conserve à la fois les propriétés de la protéine MalE eu égard à son transport dans le micro-organisme transfecté alors utilisé, notamment E.MalE and, where appropriate, the second present, when genetic engineering production techniques are used for the production of the hybrid protein, sufficient lengths for the hybrid polypeptide to retain both the properties of the MalE protein with regard to its transport in the transfected microorganism then used, in particular E. coli hors du cytoplasme et d'exportation dans le périplasme de cet organisme et l'affinité spécifique de MalE pour le maltose ou l'amylose.coli out of the cytoplasm and exported into the periplasm of this organism and the specific affinity of MalE for maltose or amylose. 2. Polypeptide hybride selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est dépourvu de la susdite seconde chaîne. 2. Hybrid polypeptide according to claim 1, characterized in that it is devoid of the said second chain. 3. Polypeptide selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce qu'il contient la partie dite soluble de la protéine CD4, notamment la région N-terminale de la protéine CD4. 3. Polypeptide according to claim 1 or claim 2, characterized in that it contains the so-called soluble part of the CD4 protein, in particular the N-terminal region of the CD4 protein. 4. Polypeptide selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il contient la région V1 de la protéine CD4.  4. Polypeptide according to claim 3, characterized in that it contains the V1 region of the CD4 protein. 5. Polypeptide selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il contient les régions V1 et V2, notamment la séquence d'aminoacides 1-177 de la protéine CD4. 5. Polypeptide according to claim 3, characterized in that it contains the V1 and V2 regions, in particular the amino acid sequence 1-177 of the CD4 protein. 6. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il consiste en un produit d'expression dans des hôtes tels que cellules eucaryotes ou bactéries telles que les gram négatif, par exemple des bactéries E. coli, transformé avec un acide nucléique recombinant contenant une séquence nucléique codant pour ledit polypeptide et, associé avec celle-ci,des éléments de régulation autorisant son expression dans un hôte, lorsque ces bactéries sont mises en culture, ce produit ayant été purifié par un procédé comprenant la mise en contact dudit polypeptide préalablement extrait de ces E. coli avec un polymère insoluble de a(l-4)glucose ou d'amylose, et la récupération du susdit polypeptide alors fixé sur le polymère, après séparation des produits non fixés. 6. Polypeptide according to any one of claims 1 to 5, characterized in that it consists of an expression product in hosts such as eukaryotic cells or bacteria such as gram negative, for example E. coli bacteria, transformed with a recombinant nucleic acid containing a nucleic sequence coding for said polypeptide and, associated therewith, regulatory elements allowing its expression in a host, when these bacteria are cultured, this product having been purified by a process comprising bringing said polypeptide previously extracted from these E. coli into contact with an insoluble polymer of a (1-4) glucose or amylose, and recovering the above-mentioned polypeptide then fixed on the polymer, after separation of the non-fixed products. 7. Polypeptide dérivé du polypeptide selon la revendication 6, comportant uniquement la chaîne peptidique issue de la protéine CD4, telle qu'elle est obtenue après clivage et séparation de la séquence ou des séquences issues de MalE. 7. A polypeptide derived from the polypeptide according to claim 6, comprising only the peptide chain derived from the CD4 protein, as it is obtained after cleavage and separation of the sequence or sequences derived from MalE. 8. Composition apte à neutraliser un virus HIV in vivo et contenant, en association avec un véhicule physiologiquement acceptable pour l'hôte auquel il est administré, le polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, en une dose efficace pour lui conférer cette aptitude. 8. Composition capable of neutralizing an HIV virus in vivo and containing, in association with a vehicle physiologically acceptable for the host to which it is administered, the polypeptide according to any one of claims 1 to 7, in a dose effective to give it this aptitude. 9. Procédé de détection in vitro d'un HIV ou d'antigène de HIV, notamment de sa glycoprotéine d'enveloppe, éventuellement contenus dans, un échantillon biologique, caractérisé par la mise en contact de cet échantillon biologique avec un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 a 7, dans des conditions autorisant la fixation de ce polypeptide sur l'HIV ou l'antigène d'HIV éventuellement présent et la détection du complexe éventuellement produit.  9. Method for in vitro detection of an HIV or of an HIV antigen, in particular of its envelope glycoprotein, possibly contained in a biological sample, characterized by bringing this biological sample into contact with a polypeptide according to any one of claims 1 to 7, under conditions authorizing the fixing of this polypeptide on HIV or the HIV antigen possibly present and the detection of the complex possibly produced.