FR2637804A1 - Pharmaceutical compositions containing a partially N-desulphated heparin derivative having antithrombotic activity - Google Patents

Abstract

The compositions of the invention contain, in their active principle, a heparin derivative having a content of N-sulphate groups which is between 20 and 40% of that of heparin, in combination with a pharmaceutically acceptable vehicle. The heparin derivative is virtually devoid of anticoagulant activity and possesses antithrombotic activity.

Description

COMPOSITIONS PHARMACEUTIQUES CONTENANT UN DERIVE D'HéPARINE PARTIELLEMENT N-DESULFATE A ACTIVITE
ANTITHROMBOTIQUE
L'invention concerne des compositions pharmaceutiques contenant comme principe actif un dérivé d'héparine partiellement N-désulfatée, contenant encore de 20 à 40 de groupements N-sulfates, ayant perdu pratiquement toute activité anticoagulante mais conservé une activité antithrombotique.PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS CONTAINING PARTIALLY N-DESULFATE HEPARINATED DERIVATIVE WITH ACTIVITY
Antithrombotic
The invention relates to pharmaceutical compositions containing as active ingredient a partially N-desulfated heparin derivative, still containing from 20 to 40 N-sulphate groups, having lost substantially all anticoagulant activity but retained antithrombotic activity.

L'héparine est un produit largement utilisé en thérapeutique, notamment pour son activité anticoagulante, celle-ci étant essentiellement liée à son action catalytique sur l'antithrombine III, inhibiteur plasmatique naturel de la coagulation. Des études sur sa structure. ont montré qu'elle était constituée d'enchaînements osidiques dans lesquels se succèdent en alternance des acides uroniques et des-glucosamines, ces motifs osidiques étant diversement fonctionnalisés par des groupements OH, COO , OS03 , NHAC et NHS03 .  Heparin is a product widely used in therapeutics, particularly for its anticoagulant activity, which is essentially linked to its catalytic action on antithrombin III, a natural plasma inhibitor of coagulation. Studies on its structure. have shown that it consisted of osidic chains in which alternating alternating uronic acids and glucosamines, these osidic units being variously functionalized with OH, COO, OSO 3, NHAC and NHSO 3 groups.

D'autres travaux ont également montré que le site minimal de liaison de l'héparine à l'antithrombine III était un pentasaccharide ayant la structure DEFGH ci-dessous dans laquelle sont présents certains groupes fonctionnels, notamment groupes sulfate, critiques ou importants pour la liaison de l'héparine à l'antithrombine III et l'expression d'une activité optimale de cette dernière.

Other studies have also shown that the minimal site of binding of heparin to antithrombin III was a pentasaccharide having the structure DEFGH below in which are present certain functional groups, especially sulfate groups, critical or important for the binding from heparin to antithrombin III and the expression of optimal activity of antithrombin III.

Groupes critiques
Groupes importants
L'héparine ainsi que ses fragments sont utilisés soit pour la prévention des thromboses, soit comme agent curatif dans les états d'hypercoagulabilité. Critical Groups
Important groups
Heparin and its fragments are used either for the prevention of thromboses or as a curative agent in hypercoagulable states.

Des travaux récents ont montré que l'héparine agissait également comme régulateur dans différents systèmes biologiques. L'héparine et de façon moindre ses fragments, possèdent toutefois certains effets secondaires, notamment sur le temps de saignement et sur les plaquettes, et de nombreuses méthodes ont été utilisées pour tenter d'obtenir des dérivés de l'héparine d'emploi plus facile en thérapeutique lorsqu'une activité globale sur la coagulation n'est pas nécessaire.Recent work has shown that heparin also acts as a regulator in different biological systems. Heparin and, to a lesser extent, its fragments, however, possess certain side effects, especially on bleeding time and platelets, and many methods have been used to try to obtain heparin derivatives for easier use. in therapeutics when a global activity on coagulation is not necessary.

Différentes méthodes ont été étudiées en vue d'obtenir des dérivés d'héparine possédant une action anticoagulante déprimée, voire totalement absente, dans des modes de dosage mesurant l'activité anti-facteur Xa et anti-facteur IIa et ayant recours à des techniques amidolytiques ou à des tests de coagulation. On a eu recours notamment pour obtenir de tels dérivés de l'héparine, à des procédés de dépolymérisation, comme la dépolymérisation à l'acide periodique suivie d'une hydrolyse acide ou alcaline, qui détruit préférentiellement le site de fixation de l'héparine à l'antithrombine III, ou encore à divers procédés de désulfatation. Parmi ces derniers, on peut citer les procédés d'hydrolyse en présence d'un acide tel que l'acide acétique ou l'acide chlorhydrique, ou en présence de diméthylsulfoxyde contenant de l'eau ou du méthanol.De nombreux auteurs ont publié leurs travaux à ce sujet et décrit les produits obtenus possédant des degrés de N-désulfatation variables selon le procédé utilisé, la durée de l'hydrolyse et la température à laquelle celle-ci était effectuée. En ce qui concerne l'activité anticoagulante des produits obtenus, s'il apparaît d'une manière générale que cette dernière va en décroissant avec le degré de N-désulfatation, les auteurs donnent toutefois des indications contradictoires sur l'activité anticoagulante des dérivés d'héparine ainsi obtenus. Various methods have been studied with a view to obtaining heparin derivatives having depressed or totally absent anticoagulant action in dosing modes measuring anti-factor Xa and anti-factor IIa activity and using amidolytic techniques. or coagulation tests. In particular, it has been used to obtain such heparin derivatives, for depolymerization processes, such as periodic acid depolymerization followed by acid or alkaline hydrolysis, which preferentially destroys the site of attachment of heparin to antithrombin III, or to various desulfation processes. Among these, there may be mentioned hydrolysis processes in the presence of an acid such as acetic acid or hydrochloric acid, or in the presence of dimethylsulfoxide containing water or methanol.Many authors have published their Work on this subject and describes the products obtained having varying degrees of N-desulfation according to the method used, the duration of the hydrolysis and the temperature at which it was carried out. With regard to the anticoagulant activity of the products obtained, although it generally appears that the latter decreases with the degree of N-desulphatation, the authors give contradictory indications on the anticoagulant activity of the d-derivatives. heparin thus obtained.

Un procédé de N-désulfatation différent a été décrit par L. Levy et J.F. Petracek (Proc. Soc. Exp.  A different N-desulfation process has been described by L. Levy and J. F. Petracek (Proc Soc.Exp.

Biol. Med. 109, 901-905 > . Il consiste à effectuer l'hydrolyse à chaud d'une héparine préalablement mise sous sa forme acide. Une solution d'héparine à 4% a ainsi été passée sur une résine IR 120 (H-) et la solution d'acide héparinique obtenue a été maintenue à 55-C pendant une durée variable, allant de 1,5 heure à 72 heures.Biol. Med. 109, 901-905>. It consists in carrying out the hot hydrolysis of a heparin previously put in its acid form. A solution of heparin at 4% was thus passed over an IR 120 (H-) resin and the heparinic acid solution obtained was maintained at 55 ° C. for a variable duration, ranging from 1.5 hours to 72 hours. .

Le taux de N-désulfatation obtenu varie de 16 à 798 et le taux de O-désulfatation est faible lorsque l'hydrolyse est égale ou inférieure à 24 h alors qu'il peut aller jusqu'à 12% pour une hydrolyse de 72 h. The N-desulfation rate obtained varies from 16 to 798 and the O-desulfation rate is low when the hydrolysis is equal to or less than 24 h while it can go up to 12% for a hydrolysis of 72 h.

Les auteurs, dont les travaux avaient pour objet la préparation d'une héparine radioactive ayant conservé une haute activité anticoagulante, se sont intéressés aux héparines faiblement N-désulfatées dont ils ont effectué la resulfatation à l'aide du complexe trimé thylamine S3503. The authors, whose work focused on the preparation of a radioactive heparin with high anticoagulant activity, focused on the weakly N-desulfated heparins they resulfated using the trimethylamine complex S3503.

Les inventeurs ont maintenant trouvé qu'il était possible d'obtenir par N-désulfatation ménagée un produit ayant pratiquement perdu toute activité anticoagulante mais ayant conservé une importante activité antithrombotique. Cette découverte est d'autant plus inattendue que jusqu a ce jour l'activité antithrombotique avait été liée au maintien d'une certaine activité anticoagulante sur les tests classiques de mesure de l'activité anti-facteur Xa et anti-facteur IIa et que l'on considérait qutil était impossible d'obtenir, par modification des groupes N-, des héparines qui n'aient pas perdu leurs activités biologiques connues ("unfortunately, it is actually impossible to obtain heparins by N-groups modification without loss of the known biological activities" (R. Mastacchi et al. IRCS
Medical Science (1986) Vol. 14, 1013-1014).The inventors have now found that it is possible to obtain by controlled N-desulfation a product having substantially lost any anticoagulant activity but having retained a significant antithrombotic activity. This discovery is all the more unexpected as until now the antithrombotic activity had been linked to the maintenance of a certain anticoagulant activity on the conventional tests for measuring the anti-factor Xa and anti-factor IIa activity and that the It was considered impossible to obtain, by modification of the N groups, heparins which did not lose their known biological activities ("unfortunately, it is actually impossible to obtain heparins by N-groups modification without loss of the known biological activities "(R. Mastacchi et al., IRCS
Medical Science (1986) Vol. 14, 1013-1014).

Un tel produit, préparé selon la technique décrite par L. Levy et al, possède une N-sulfatation résiduelle se situant entre 20 et 40 de celle de l'héparine du commerce, ce qui représente environ 450 à environ 750 pMolesZg de groupements NH2 libres. Such a product, prepared according to the technique described by L. Levy et al, has a residual N-sulfation between 20 and 40 of that of commercial heparin, which represents about 450 to about 750 pMolesZg of free NH2 groups. .

L'invention concerne donc une composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle contient à titre de principe actif une quantité efficace d'un dérivé de l'héparine, dont le taux de groupements
N-sulfates se situe entre 20 et 40% de celui de l'héparine, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, ledit dérivé d'héparine étant pratiquement dépourvu d'activité anticoagulante et possèdant une activité antithrombotique.The invention therefore relates to a pharmaceutical composition characterized in that it contains as active principle an effective amount of a derivative of heparin, the rate of groupings
N-sulphates is between 20 and 40% of that of heparin, in combination with a pharmaceutically acceptable vehicle, said heparin derivative being substantially devoid of anticoagulant activity and having antithrombotic activity.

Les inventeurs ont, en effet, constaté que lorsque le taux de groupements N-sulfates tend vers 0 l'activité antithrombotique tend à disparaitre complètement alors que lorsque ce taux augmente au-delà de 40% une activité anticoagulante apparait qui va en croissant avec la proportion de groupements N-sulfates. Les taux de 20 à 40% de groupements N-sulfates, soit environ 450 à 750 pMoles/g de groupements NH2 libres, constituent donc une fourchette particulièrement remarquable. The inventors have indeed found that when the level of N-sulphate groups tends to 0 antithrombotic activity tends to disappear completely while when this rate increases beyond 40% anticoagulant activity appears that increases with the proportion of N-sulphate groups. The levels of 20 to 40% of N-sulphate groups, ie approximately 450 to 750 pMoles / g of free NH 2 groups, therefore constitute a particularly remarkable range.

Selon un mode particulièrement avantageux de l'invention, le taux de groupements N-sulfates du dérivé de l'héparine constituant le principe actif de la composition pharmaceutique est d'environ 25% et l'activité anticoagulante est inférieure à 0,1 u/mg lorsqu'elle est mesurée selon une méthode amidolytique en utilisant un substrat chromogène. Le substrat S 2238 (Kabi-Vitrum, Suède) permet de mesurer l'activité antifacteur fIa et le substrat S 2222 (Kabi-Vitrum, Suède) permet de mesurer l'activité anti-facteur Xa du dérivé de l'héparine. On peut également avoir recours pour mesurer l'action anticoagulante à une méthode de coagulation, comme celle du Heptest (Ces diverses méthodes sont décrites dans la brochure de la firme Hemachem,
St-Louis, USA, et dans E. Sache et al. Thromb. Res. 25, 443, 458 (1982). According to a particularly advantageous embodiment of the invention, the level of N-sulphate groups of the heparin derivative constituting the active principle of the pharmaceutical composition is about 25% and the anticoagulant activity is less than 0.1 u / mg when measured by an amidolytic method using a chromogenic substrate. The substrate S 2238 (Kabi-Vitrum, Sweden) makes it possible to measure the antifactor activity fIa and the substrate S 2222 (Kabi-Vitrum, Sweden) makes it possible to measure the anti-factor Xa activity of the heparin derivative. It may also be used to measure the anticoagulant action to a coagulation method, such as that of Heptest (These various methods are described in the brochure of the firm Hemachem,
St Louis, USA, and in E. Sache et al. Thromb. Res. 25, 443, 458 (1982).

On peut aussi doser l'activité anticoagulante globale par la méthode de la Pharmacopée Américaine (U.S. Pharmacopoeia National Formulary USP XXI, NF 16, 1985 p. 480-482). Global anticoagulant activity can also be assayed by the method of the American Pharmacopoeia (U.S. Pharmacopoeia National Formulary USP XXI, NF 16, 1985 pp. 480-482).

Dans un autre aspect de l'invention, le dérivé de l'héparine constituant le principe actif de la composition pharmaceutique, dont le taux de groupements
N-sulfates se situe entre 20 et 40%, est un fragment de chaîne héparinique d'un poids moléculaire moyen pouvant se situer entre 2.000 et 8.000 daltons, de préférence aux environs de 5.000 daltons.In another aspect of the invention, the heparin derivative constituting the active principle of the pharmaceutical composition, the grouping rate
N-sulfates is between 20 and 40%, is a heparin chain fragment with an average molecular weight of between 2,000 and 8,000 daltons, preferably around 5,000 daltons.

De manière avantageuse, la composition pharmaceutique est sous forme lyophylisée, accompagnée d'un solvant pour préparation injectable. Elle peut également être sous forme d'un soluté injectable stérile et apyrogène prêt à l'emploi, pour administration par voie intraveineuse, intramusculaire ou sous-cutanée. Advantageously, the pharmaceutical composition is in lyophilized form, accompanied by a solvent for injectable preparation. It may also be in the form of a ready-to-use, sterile, pyrogen-free injectable solution for intravenous, intramuscular or subcutaneous administration.

Selon un autre mode avantageux de l'invention la composition pharmaceutique est constituée du dérivé héparinique associé à des excipients pharmaceutiques pour administration par voie orale sous forme de comprimés, gélules ou tablettes. Le dérivé héparinique peut également être associé à des excipients pharmaceutiques appropriés pour administration topique sous forme de pommade, gel ou mousse. According to another advantageous embodiment of the invention the pharmaceutical composition consists of the heparin derivative associated with pharmaceutical excipients for oral administration in the form of tablets, capsules or tablets. The heparin derivative may also be combined with pharmaceutical excipients suitable for topical administration as an ointment, gel or mousse.

Dans un aspect particulier de l'invention, lorsque la composition pharmaceutique est sous forme de soluté injectable, le dérivé héparinique est présent à la concentration de 10 mg à 100 mg par ml de solution lorsque la composition est destinée à l'administration par voie intraveineuse, et à la concentration de 10 mg à 150 mg par ml de solution lorsque la composition est destinée à l'administration par voie intramusculaire ou sous-cutanée. In a particular aspect of the invention, when the pharmaceutical composition is in the form of an injectable solution, the heparin derivative is present at the concentration of 10 mg to 100 mg per ml of solution when the composition is intended for intravenous administration. and at a concentration of 10 mg to 150 mg per ml of solution when the composition is for intramuscular or subcutaneous administration.

Dans un autre aspect particulier de l'invention lorsque la composition pharmaceutique est destinée à l'administration orale elle contient par unité de prise de 50 mg à 5 g de principe actif. In another particular aspect of the invention, when the pharmaceutical composition is intended for oral administration, it contains, per unit dose, from 50 mg to 5 g of active principle.

L'invention vise également l'utilisation d'un dérivé d'héparine dont le taux de groupements
N-sulfates se situe entre 20 et 408 de celui de l'héparine et qui est pratiquement dépourvu d'activité anticoagulante pour la préparation des compositions pharmaceutiques à activité antithrombotique telles que définies ci-dessus.The invention also relates to the use of a heparin derivative whose level of groupings
N-sulphates is between 20 and 408 of that of heparin and which is substantially devoid of anticoagulant activity for the preparation of pharmaceutical compositions with antithrombotic activity as defined above.

Pour obtenir le dérivé de l'héparine constituant le principe actif de la composition pharmaceutique de l'invention, on met l'héparine du commerce sous sa forme d'acide héparinique en la faisant passer, par exemple, sur une colonne de résine échangeuse d'ions de type Dowex-50W-8. La colonne est éluée à l'eau distillée et déminéralisée et la solution récupérée est maintenue à la température de 50*C+2 pendant une durée de 12 à 24 heures. Le pH de la solution est ensuite ramené à 6,5-8,0 de préférence 7,0 par une solution de soude. Le produit obtenu est dialysé pendant une duree comprise entre 120 et 165 h de préférence 144 h, puis lyophilisé. In order to obtain the heparin derivative constituting the active principle of the pharmaceutical composition of the invention, the commercial heparin is put in its heparinic acid form by passing it, for example, over a column of exchange resin. Dowex-50W-8 ions. The column is eluted with distilled and demineralized water and the recovered solution is maintained at a temperature of 50 ° C + 2 for a period of 12 to 24 hours. The pH of the solution is then reduced to 6.5-8.0, preferably 7.0, with sodium hydroxide solution. The product obtained is dialyzed for a duration of between 120 and 165 hours, preferably 144 hours, and then freeze-dried.

Le dérivé ainsi obtenu possède un taux de
N-désulfatation compris entre 20 et 40%. Il peut encore être soumis à une étape supplémentaire de dépolymérisation, par exemple à l'acide nitreux selon la méthode décrite dans le brevet EP 0076279.The derivative thus obtained has a rate of
N-desulfation between 20 and 40%. It may also be subjected to a further depolymerization step, for example with nitrous acid according to the method described in patent EP 0076279.

La composition pharmaceutique de l'invention constitue un médicament d'un grand intérêt. En effet, il peut exercer une activité antithrombotique sans exercer dtaction anticoagulante. Par ailleurs, aux doses antithrombotiques, il ne provoque que peu ou pas d'allongement du temps de saignement et il n'a pas d'action sur l'agrégation plaquettaire. -Il pourra donc avantageusement être utilisé dans certaines pathologies dans lesquelles l'héparine et ses dérivés interviennent comme régulateur lorsque l'on souhaite conserver une action antithrombotique tout en évitant une activité globale sur la coagulation. C'est le cas, par exemple de l'athérosclérose ou comme traitements post-opératoires après certains types de chirurgie cardiovasculaire telles que les angioplasties. The pharmaceutical composition of the invention is a drug of great interest. Indeed, it can exert antithrombotic activity without exerting anticoagulant action. Moreover, at antithrombotic doses, it causes little or no increase in bleeding time and has no action on platelet aggregation. It can therefore advantageously be used in certain pathologies in which heparin and its derivatives act as a regulator when it is desired to maintain an antithrombotic action while avoiding a global activity on coagulation. This is the case, for example atherosclerosis or as post-operative treatments after certain types of cardiovascular surgery such as angioplasty.

La présente invention ne se limite pas aux aspects particuliers qui viennent d'être décrits, elle en englobe au contraire toutes les variantes et elle sera mieux comprise à l'aide des exemples d'applications qui vont suivre et, en se référant à la figure unique qui représente le spectre RMN C13 d'un dérivé
N-désulfaté (a) et d'héparine (b). The present invention is not limited to the particular aspects which have just been described, it encompasses all the variants and it will be better understood using the following examples of applications and, with reference to FIG. unique that represents the C13 NMR spectrum of a derivative
N-desulfated (a) and heparin (b).

EXEMPLE 1
Préparation d'un dérivé N-désulfaté possédant environ 25% de groupements N-sulfates ou IC 1771.EXAMPLE 1
Preparation of N-desulfated derivative having about 25% N-sulfates or IC 1771.

L'héparine utilisée comme matière première de départ est une héparine injectable du commerce dont le rapport activité antiFXa sur activité Pharmacopée (USP) de l'héparine utilisée est voisin de 1,0. Le titre
USP de cette héparine est compris entre 160 et 170 ulmg. The heparin used as starting material is a commercially available heparin for injection, the ratio of anti-Factor activity pharmacopeia (USP) of heparin used is close to 1.0. The title
USP of this heparin is between 160 and 170 ulmg.

Les titres exprimés en activité amidolytique (aussi bien sur substrat synthétique S-2238 (activité anti Fila) que
S-2222 (activité antiFXa) (source commerciale de ces substrats : Kabi-Vitrum) sont compris entre 170 et 200 u/mg. L'activité antiFXa mesurée par une méthode coagulométrique du Heptest (source commerciale
Haemachem, USA) est d'environ 180 ulmg. Le poids moléculaire (poids moléculaire moyen en poids, Mw) est de 17.500. La teneur en groupes N-sulfates de cette héparine (dosée par la méthode de Inoue et Nagasawa,
Anal. Biochem. 1976, 71, 46-52, selon le protocole A de ces auteurs) est pris comme étant égal à 100. Titers expressed as amidolytic activity (both on synthetic substrate S-2238 (anti-Fila activity) and
S-2222 (antiFXa activity) (commercial source of these substrates: Kabi-Vitrum) are between 170 and 200 u / mg. AntiFXa activity measured by a coagulometric method of Heptest (commercial source
Haemachem, USA) is about 180 ulmg. The molecular weight (weight average molecular weight, Mw) is 17,500. The N-sulfate content of this heparin (determined by the Inoue and Nagasawa method,
Anal. Biochem. 1976, 71, 46-52, according to protocol A of these authors) is taken as being equal to 100.

10g d'héparine injectable, sous forme de sel de sodium, sont mis en solution dans 100 ml d'eau distillée puis déminéralisée à température ambiante (environ 20oc). Cette solution est passée sur une colonne de résine échangeuse d'ions de type Dowex-50W-XB (100-200 mess) qui a préalablement été mise sous sa forme acide. Les dimensions de cette colonne sont de 3x38 cm. L'élution s'effectue par l'eau (distillée et déminéralisée) jusqu'à récupération d'un volume de 500 ml. A partir de ce volume, on vérifie que l'éluat ne contient plus d'héparine. Ce contrôle s'effectue par polarimétrie (lecture à 365 nm; ligne spectrale du mercure), La solution récupérée (500 ml) est mise à incuber 24 heures à 50' C.La solution, de pH environ 1,3, est ajustée à pH 7,0 par une solution de soude 4N et finement ajustée par de la soude 0ff1N. Cette solution est ensuite dialysée contre de l'eau distillée (144 heures) puis mise à lyophiliser. Le produit ainsi obtenu est désigné IC 1771. 10 g of injectable heparin, in the form of sodium salt, are dissolved in 100 ml of distilled water and then demineralized at room temperature (approximately 20oc). This solution is passed through a column of Dowex-50W-XB (100-200 mess) type ion exchange resin which has previously been put in its acid form. The dimensions of this column are 3x38 cm. The elution is carried out by water (distilled and demineralized) until recovery of a volume of 500 ml. From this volume, it is verified that the eluate no longer contains heparin. This control is carried out by polarimetry (reading at 365 nm, spectral line of mercury). The solution recovered (500 ml) is incubated for 24 hours at 50 ° C.The solution, of pH about 1.3, is adjusted to pH 7.0 with 4N sodium hydroxide solution and finely adjusted with 0ff1N sodium hydroxide. This solution is then dialyzed against distilled water (144 hours) and then freeze-dried. The product thus obtained is designated IC 1771.

Ce produit possède les caractéristiques suivantes - Poids moléculaire moyen (Mw > en poids : 14.700 - Teneur en groupes N-sulfates, exprimée en pourcentage
par rapport à l'héparine de départ : 27 % - Activité antiFIIa, sur substrat S-2238 : < 0,1 u/mg - Activité antiFXa, sur substrat S-2222 : < 0,1 u/mg - Méthode Heptest (activité antiFXa) : < 1,0 u/mg - Titre USP : < 2,0 u/mg
L'étude par RMN (C13) a permis d'obtenir le spectre de la figure unique qui confirme que IC t771 présente les caractéristiques d'une héparine partiellement N-desulfatée.This product has the following characteristics - Average molecular weight (Mw> by weight: 14,700 - N-sulphate content, expressed as a percentage
compared with the starting heparin: 27% - AntiFIIa activity, on substrate S-2238: <0.1 u / mg - AntiFXa activity, on substrate S-2222: <0.1 u / mg - Heptest method (activity antiFXa): <1.0 u / mg - USP titre: <2.0 u / mg
The NMR (C13) study made it possible to obtain the spectrum of the single figure which confirms that IC t771 has the characteristics of a partially N-desulfated heparin.

Le spectre montre des signaux à 5 99,5 et 60,6 ppm correspondant respectivement aux C1 et C2 des résidus N-sulfo-glucosamine de l'héparine; l'apparition de nouveaux signaux {6 93,8 et 57 ppm) correspondant aux C1 et C2 des résidus glucosamine dépourvus de groupes
N-sulfate, la présence d'un signal à 6 65,6 ppm attribue au C3 de la glucosamine dépourvue de groupement
N-sulfate; une légère modification des signaux correspondant au C6 de la glucosamine lorsqu'il possède (o 69,1 ppm) ou lorsqu'il est dépourvu (6 62,5 ppm) de groupement 6-0-sulfate; une légère modification des signaux correspondant au C1 de l'acide iduronîque selon qu'il est sulfaté (5 101,8 ppm) ou non sulfaté (6 104 ppm). The spectrum shows signals at 99.5 and 60.6 ppm respectively corresponding to C1 and C2 of the N-sulfo-glucosamine residues of heparin; the appearance of new signals (6 93.8 and 57 ppm) corresponding to C1 and C2 of glucosamine residues without groups
N-sulfate, the presence of a signal at 65.6 ppm attributes to C3 glucosamine lacking a grouping
N-sulfate; a slight modification of the signals corresponding to the C6 of glucosamine when it has (o 69.1 ppm) or when it is deficient (6.62.5 ppm) of 6-0-sulfate group; a slight modification of the signals corresponding to the C1 of the iduronic acid according to whether it is sulfated (101.8 ppm) or not sulphated (6 104 ppm).

EXEMPLE 2 :
Préparation d'un dérivé N-désulfaté possédant environ 40E de groupements N-sulfates ou
IC 1985.EXAMPLE 2
Preparation of N-desulfated derivative having about 40E of N-sulphate or
IC 1985.

En procédant comme pour l'exemple 1 mais en laissant incuber la solution héparinique à 50'C pendant 13 heures, on obtient IC 1985 qui possède les caractéristiques suivantes - Poids moléculaire moyen (Mw) en poids : 15.600 - Teneur en groupes N-sulfates exprimée en
z par rapport à l'héparine de départ : 38 - Activité anti-facteur IIa (S-2238) : C < 1 u/mg - Activité anti-facteur Xa (S2222) : < 1 u/mg - Méthode Heptest (activité anti
facteur Xa) : 3 u/mg - Méthode pharmacopée USP : 3 u/mg
Le spectre de RMN (C13)confirme que le produit présente les caractéristiques d'une héparine partiellement N-désulfatée.By proceeding as in Example 1 but allowing the heparin solution to incubate at 50 ° C. for 13 hours, IC 1985 is obtained which has the following characteristics: - Average molecular weight (Mw) by weight: 15,600 - Content in N-sulphate groups expressed in
z relative to the starting heparin: 38 - Anti-factor IIa activity (S-2238): C <1 u / mg - Anti-factor Xa activity (S2222): <1 u / mg - Heptest method (anti-inflammatory activity)
factor Xa): 3 u / mg - Pharmacopoeia method USP: 3 u / mg
The NMR spectrum (C13) confirms that the product has the characteristics of a partially N-desulfated heparin.

EXEMPLE 3
Préparation d'un dérivé héparinique dépolymérisé ou IC 1833.EXAMPLE 3
Preparation of a depolymerized heparin derivative or IC 1833.

Le produit de départ est le produit de l'exemple 1 ou IC 1771. The starting material is the product of Example 1 or IC 1771.

1 g de IC 1771 est dissous dans 50 ml d'acide acétique à 1%. On laisse sous agitation et on ajoute 8 ml d'une solution aqueuse de nitrite de sodium à 0.4%. On laisse agiter pendant 1 heure à température ambiante. On met la solution à congeler, qui est ensuite lyophilisée. 1 g of IC 1771 is dissolved in 50 ml of 1% acetic acid. The mixture is left stirring and 8 ml of a 0.4% aqueous sodium nitrite solution are added. Stirring is allowed for 1 hour at room temperature. The solution is frozen, which is then lyophilized.

Les caractéristiques de cette préparation sont les suivantes - Poids moléculaire moyen < Mw) en poids : 4.900 - Teneur en groupes N-sulfatés : 27% - Activité antiFIIa sur substrat S-2238 : < OrI u/mg - Activité antiFXa sur substrat S-2222 : < 0,1 u/mg - Méthode Heptest (activité antiFXa) : < 0,13 u/mg - Titre USP : < 3 u/mg
En procédant comme dans les exemples 1 et 2 ci-dessous, mais en laissant la solution héparinique incuber pendant des durées moins longues, on a obtenu des produits dont le taux de N-sulfatation est plus élevé mais qui possèdent encore une activité anticoagulante. Les résultats figurent dans le tableau cidessous.The characteristics of this preparation are as follows: - Average molecular weight <Mw) by weight: 4.900 - Content in N-sulfated groups: 27% - AntiFIIa activity on substrate S-2238: <OrI u / mg - AntiFXa activity on substrate S- 2222: <0.1 u / mg - Heptest method (antiFXa activity): <0.13 u / mg - USP titre: <3 u / mg
Proceeding as in Examples 1 and 2 below, but allowing the heparinic solution to incubate for shorter periods of time, products with higher levels of N-sulfation were obtained but still had anticoagulant activity. The results are shown in the table below.

Teneur en Activité Heptest Dosage USP
Inactivation PM N-sulfate. Amidolytique (U/mg) (U/mg) thermique (% par rapport S-2238 8-2222
(heures) à l'héparine)
3 16 800 90 36 36 85 97
6 16 800 62 9.7 1.6 30 25
8 15 900 57 2.6 1.3 20 20 10 15 900 46 1.2 < 1.0 13 9
EXEMPLE 4
Etudes pharmacologiques
A - L'activité antithrombotique des dérivés de l'héparine a été etudiée chez le lapin sur un modèle de thrombose veineuse induite par stase selon Wessler et al et modifié par Fareed et al (Sem. Thromb. Hemost. 11, 155-175, 1985).Activity Content Heptest Dosage USP
Inactivation PM N-sulfate. Amidolytic (U / mg) (U / mg) thermal (% relative to S-2238 8-2222
(hours) with heparin)
3 16 800 90 36 36 85 97
6 16 800 62 9.7 1.6 30 25
8 15 900 57 2.6 1.3 20 20 10 15 900 46 1.2 <1.0 13 9
EXAMPLE 4
Pharmacological studies
A - The antithrombotic activity of heparin derivatives was studied in rabbits on a model of stasis-induced venous thrombosis according to Wessler et al and modified by Fareed et al (Sem., Thromb, Hemost., 11, 155-175, 1985).

Les animaux sont anesthésiés avec 70 mglkg de Ketaset (R) Bristol Lab, Syracuse, NY) par voie intramusculaire. Par une technique chirurgicale, on isole une longueur de 2 cm sur les veines jugulaires droite et gauche. On injecte par voie intraveineuse dans la veine marginale de l'oreille le produit à tester, 5 minutes exactement avant l'injection d'une substance thrombogénique, par exemple un mélange de complexe concentré prothrombonique et de venin de vipère Russel (PCCIRW ) ou encore le Feiba, concentré de complexe prothrombonique humain (Immuno AG. Vienne - Autriche).Au bout de 20 secondes, on effectue la ligature de la veine jugulaire, et après 10 mn de stase, on retire les segments de veine que l'on place dans le sérum physiologique, puis on évalue le degré de formation de caillot selon une échelle de O à 4 (4 représente un caillot unique sans érythrocytes libres) (a) Action de IC 1771. Utilisation de Feiba comme stimulus thrombogène. The animals are anesthetized with 70 mglkg Ketaset (R) Bristol Lab, Syracuse, NY) intramuscularly. By a surgical technique, a length of 2 cm is isolated on the right and left jugular veins. The product to be tested is injected intravenously into the marginal vein of the ear, exactly 5 minutes before the injection of a thrombogenic substance, for example a mixture of prothrombone concentrate complex and Russel viper venom (PCCIRW). Feiba, a human prothrombin complex concentrate (Immuno AG, Vienna, Austria). After 20 seconds, ligation of the jugular vein is performed, and after 10 minutes of stasis the vein segments are removed. in saline, then evaluate the degree of clot formation on a scale of 0 to 4 (4 represents a single clot without free erythrocytes) (a) Action of IC 1771. Use of Feiba as a thrombogenic stimulus.

Feiba est utilisé à la dose de 5,0 u/kg. Feiba is used at a dose of 5.0 u / kg.

Les résultats exprimés représentent la moyenne du chiffrage des caillots des veines jugulaires droite et gauche. L'expérience a porté sur 6 animaux qui reçoivent par voie intraveineuse des doses décroissantes du produit à tester.The results expressed represent the average of the clots of the right and left jugular veins. The experiment involved 6 animals receiving intravenously decreasing doses of the test product.

Dose Moyenne
(mgJkg) (+s)
2,0 0,21 t 0,32
1,0 0,73 + 0,92
0,5 1,58 + 0,83
0,25 3,85 t 115
0,12 4,89 + 1,00
0 6,46 + 0,94
On observe une bonne activité à la dose de 1 mg/kg ou la formation de caillot est minime.Average dose
(mgJkg) (+ s)
2.0 0.21 t 0.32
1.0 0.73 + 0.92
0.5 1.58 + 0.83
0.25 3.85 t 115
0.19 4.89 + 1.00
0 6.46 + 0.94
Good activity is observed at the dose of 1 mg / kg or clot formation is minimal.

(b) Action de IC 1771 : Utilisation de PCC/RW comme stimulus thrombogène.(b) Action of IC 1771: Use of PCC / RW as a thrombogenic stimulus.

L'expérience est conduite comme indiqué en (a). Elle porte sur 10 animaux par dose. Le PCC de marque Konyne vendu par Cutter Laboratory, Berkeley, et le venin de vipère Russel, provenant de Sigma Chemicals Co,
St-Louis Missouri sont administrés séparément à l'animal à la suite l'un de l'autre. La concentration circulante est de 25 u/kg pour PCC et 0,01 u/kg pour RVV.The experiment is conducted as indicated in (a). It relates to 10 animals per dose. The Konyne brand PCC sold by Cutter Laboratory, Berkeley, and Russel viper venom, from Sigma Chemicals Co,
St. Louis Missouri are administered separately to the animal following each other. The circulating concentration is 25 u / kg for PCC and 0.01 u / kg for RVV.

Les résultats obtenus sont les suivants
Dose Moyenne
mg/kg (tus)
1 3,87 + 0,92
2,5 1,05 + 0,78 0 6,62 f ±0,84
On constate donc dans les deux expériences (a) et (b) une bonne activité antithrombotique qui est dose/dépendante.The results obtained are as follows
Average dose
mg / kg (tus)
1 3.87 + 0.92
2.5 1.05 + 0.78 0.62 f 0.84
Thus, in both experiments (a) and (b) there is good antithrombotic activity which is dose-dependent.

(c) Action de IC 1833 - Stimulus thrombogène PCC/RVV. (c) Action of IC 1833 - CCV / RVV Thrombogenic Stimulus.

Les résultats obtenus avec IC 1833 figurent dans le tableau ci-dessous. Le stimulus thrombogène utilisé a été le PCC/RVV (PCC de marque
Preconativ vendu par Kabi Vitrum, Suède; RVV comme indiqué ci-dessus). Le produit à tester est administré par voie intraveineuse à des doses décroissantes :
Dose Moyenne pg/kg
500 0,62
250 1 r 25
190 3,75
50 3t75
O 3,75
En conclusion, à la dose de 500 g/kg, IC 1833 possède une bonne activité antithrombotique.The results obtained with IC 1833 are shown in the table below. The thrombogenic stimulus used was PCC / RVV (brand name PCC)
Preconativ sold by Kabi Vitrum, Sweden; RVV as indicated above). The product to be tested is administered intravenously in decreasing doses:
Average dose pg / kg
500 0.62
250 1 r 25
190 3.75
50 3t75
O 3.75
In conclusion, at a dose of 500 g / kg, IC 1833 has good antithrombotic activity.

(d) Action d'un dérivé héparinique totalement
N-désulfaté.(d) Action of a heparin derivative totally
N-desulfated.

Un produit totalement N-désulfaté, N-DSH, a été testé dans le même modèlé, en utilisant comme stimulus thrombogène PCC/RVV et Feiba. Les conditions expérimentales sont les mêmes que dans les expériences décrites ci-dessus. Elles ont porté sur des doses décroissantes allant de 1 mg/kg à 125 pg/kg. Aucune activité antithrombotique du produit testé n'a pu être mise en évidence. A completely N-desulfated product, N-DSH, was tested in the same model, using as PCC / RVV and Feiba thrombogenic stimulus. The experimental conditions are the same as in the experiments described above. They involved decreasing doses ranging from 1 mg / kg to 125 μg / kg. No antithrombotic activity of the tested product could be demonstrated.

B - Influence des dérivés hépariniques de l'invention sur le temps de saignement. B - Influence of heparinic derivatives of the invention on the bleeding time.

Le temps de saignement a été mesuré sur la queue du rat selon la technique de E. Dejana et al. The bleeding time was measured on the tail of the rat according to the technique of E. Dejana et al.

(Thrombos. Haemost. 48, 108-111, 1982) en utilisant un dispositif pour incisions standardisées de type Template (Hemakit Inc. Malden USA).(Thrombos, Haemost, 48, 108-111, 1982) using a template-type incision device (Hemakit Inc. Malden USA).

Tous les tests ont été effectués 15 minutes après que les animaux aient reçu le traitement par voie intraveineuse. Pour chaque test 10 animaux ont été utilisés. Les résultats donnés représentent la moyenne + sm (erreur type de la moyenne) du temps de saignement exprimé en secondes. All tests were performed 15 minutes after the animals received intravenous treatment. For each test 10 animals were used. The results given represent the average + sm (standard error of the mean) of the bleeding time expressed in seconds.

IC 1771
Traitement : Temps de saignement tec.) sérum physiologique 120,8 t 4,3
Héparine du commerce 1 mg/kg 648,0 + 48,9
IC 1771 1 mg/kg 150,0 t 8,3
IC 1771 1,5 mg/kg 250,0 t 18,9
IC 1771 5 mg/kg 363,5 t 18,4 Il 1771 10 mg/kg 301,0
On constate qu'à la dose de 1 mg/kg qui est la dose antithrombotique active, le temps de saignement est le même que celui du contrôle, ce qui n'est pas le cas pour l'héparine et que même à la dose de 10 mg/kg le temps de saignement est très peu augmenté par rapport au contrôle.IC 1771
Treatment: Bleeding time tec.) Saline 120.8 t 4.3
Commercial heparin 1 mg / kg 648.0 + 48.9
IC 1771 1 mg / kg 150.0 t 8.3
IC 1771 1.5 mg / kg 250.0 t 18.9
IC 1771 5 mg / kg 363.5 t 18.4 Il 1771 10 mg / kg 301.0
It is observed that at the dose of 1 mg / kg which is the active antithrombotic dose, the bleeding time is the same as that of the control, which is not the case for heparin and that even at the dose of 10 mg / kg bleeding time is very little increased compared to control.

C - Influence des dérivés hépariniques de l'invention sur l'agrégation des plaquettes.C - Influence of the Heparin Derivatives of the Invention on the Aggregation of Platelets

Les études ont été effectuées en utilisant un Agregomètre Icare (Marseille, France) couplé à un enregistreur Speedomax XL modèle 680 (Meci. Paris,
France). L'agrégation est induite par addition d'ADP à du plasma riche en plaquettes ( PRP) contenant le produit à tester. IC 1771 a été testé comparativement à l'héparine du commerce, cette dernière provoquant une importante augmentation de l'agrégation plaquettaire.The studies were carried out using an Icare Aggregator (Marseille, France) coupled to a Speedomax XL model 680 recorder (Meci.
La France). Aggregation is induced by the addition of ADP to platelet rich plasma (PRP) containing the product to be tested. IC 1771 was tested in comparison to commercial heparin, the latter causing a significant increase in platelet aggregation.

Plus précisément on opère de la manière suivante
On ajoute 0,1 ml du soluté physiologique contrôle, ou des produits à tester à 0,9 ml de PRP.More precisely, the procedure is as follows
0.1 ml of the control physiological saline or test products are added to 0.9 ml of PRP.

On induit l'agrégation plaquettaire par addition, à 200p1 de chacun de ces mélanges, de SOiji d'ADP (1,38Moles/l dans O,15M tampon véronal-acétate, pH 7,3-tampon de Michaelis). Platelet aggregation was induced by adding, to 200 μl of each of these mixtures, SOIJ of ADP (1.38 mol / l in O, 15M veronal-acetate buffer, pH 7.3-Michaelis buffer).

L'agrégation plaquettaire est suivie par modification de la densité optique dans chacun des mélanges, en fonction du temps. Ces expériences ont montré que IC 1771 ne produit aucune augmentation de l'agrégation plaquettaire comparativement au contre, meme lorsque le produit est utilisé à une dose 80 fois supérieure en poids à celle utilisée pour l'héparine et conduisant à une augmentation de l'agrégation. Platelet aggregation is monitored by changing the optical density in each of the mixtures as a function of time. These experiments showed that IC 1771 produced no increase in platelet aggregation compared to the counter, even when the product was used at a dose 80 times higher by weight than that used for heparin and leading to an increase in aggregation. .

EXEMPLE :
Compositions pharmaceutiques :
Composition pour utilisation par voie sous-cutanée (a) Dérivé IC 1771 150 mg
Eau pour préparation injectable qsp 1 ml
sans adjuvant ni conservateur (b) Dérivé IC 1771 50 mg
Eau pour préparation injectable qsp 0.5 ml
sans adjuvant ni conservateur
Composition pour utilisation par voie intraveineuse
Dérivé IC 1771 150 mg
Alcool benzylique 45 mg
Chlorure de sodium qsp isotonie
Eau pour préparation injectable qsp 5 ml EXAMPLE:
Pharmaceutical compositions:
Composition for subcutaneous use (a) Derivative IC 1771 150 mg
Water for injection qs 1 ml
without adjuvant or preservative (b) Derivative IC 1771 50 mg
Water for injection qs 0.5 ml
without adjuvant or preservative
Composition for intravenous use
Derivative IC 1771 150 mg
Benzyl alcohol 45 mg
Sodium chloride qsp isotonia
Water for injection qs 5 ml

Claims (10)

REVENDICATIONS 1. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle contient à titre de principe actif une quantité efficace d'un dérivé de l'héparine dont le taux de groupements N-sulfates se situe entre 20 et 40% de celui de I'héparinei en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, ledit dérivé d'héparine étant pratiquement dépourvu d'activité anticoagulante et possèdant une activité antithrombotique. 1. A pharmaceutical composition characterized in that it contains as active principle an effective amount of a heparin derivative whose N-sulfates group level is between 20 and 40% of that of heparin in combination with a pharmaceutically acceptable carrier, said heparin derivative being substantially devoid of anticoagulant activity and having antithrombotic activity. 2. Composition pharmaceutique selon la revendication 1, caractérisée en ce que le taux de groupements N-sulfates est d'environ 25% et l'activité anticoagulante inférieure à 0,1 u/mg (activité amidolytique). 2. Pharmaceutical composition according to claim 1, characterized in that the level of N-sulphate groups is about 25% and the anticoagulant activity less than 0.1 u / mg (amidolytic activity). 3. Composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que le dérivé de l'héparine dont le taux de groupements 3. Pharmaceutical composition according to any one of claims 1 or 2, characterized in that the derivative of heparin whose rate of groupings N-sulfates se situe entre 20 et 40 est un fragment de chaînes hépariniques dont le poids moléculaire moyen se situe entre 2000 et 8000 Da, de préférence aux environs de 5000 Da.N-sulfates is between 20 and 40 is a fragment of heparin chains whose average molecular weight is between 2000 and 8000 Da, preferably around 5000 Da. 4. Composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une préparation sous forme lyophilisée. 4. Pharmaceutical composition according to any one of claims 1 to 3, characterized in that it is a preparation in freeze-dried form. 5. Composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'il s'agit d'un soluté pour préparation injectable, stérile et apyrogène. 5. Pharmaceutical composition according to any one of claims 1 to 3, characterized in that it is a solute for injectable preparation, sterile and pyrogen-free. 6. Composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que le principe actif est associé à des excipients pharmaceutiques pour l'administration par voie orale sous forme de comprimés, gélules, tablettes, ou par voie topique sous forme de pommade, de gel ou de mousse.  6. Pharmaceutical composition according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the active ingredient is combined with pharmaceutical excipients for oral administration in the form of tablets, capsules, tablets, or topically in form. ointment, gel or foam. 7. Composition pharmaceutique selon la revendication 5, caractérisée en ce qu'elle contient de 10 à 100 mg/ml du principe actif1 lorsqu'il s'agit d'un soluté administrable par voie intraveineuse, et de 10à 150 mg/ml de principe actif lorsqu'il s'agit d'un soluté administrable par voie sous-cutanée. 7. Pharmaceutical composition according to claim 5, characterized in that it contains from 10 to 100 mg / ml of the active ingredient1 when it is an intravenous solution, and from 10 to 150 mg / ml of principle. active when it is a solution that can be administered subcutaneously. 8. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 4 ou 6, caractérisée en ce qu'elle contient par unité de prise de 50 mg à 5 g de principe actif. 8. Pharmaceutical composition according to one of claims 4 or 6, characterized in that it contains per unit dose of 50 mg to 5 g of active ingredient. 9. Composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que le dérivé d'héparine est obtenu en mettant l'héparine du commerce sous sa forme acide hépainique à l'aide d'une colonne de résine échangeuse d'ions, en bruant ladite colonne à l'eau distillée et déminéralisée et en récupérant la solution qui est ensuite maintenue à la température de 50'C i 2 pendant une durée de 12 à 24 h, en ramenant le pH de la solution à 6i5-8,opar une solution de soude, en dialysant pendant une durée comprise entre 120 et 165 h. puis en lyophilisant. 9. Pharmaceutical composition according to any one of claims 1 to 8, characterized in that the heparin derivative is obtained by placing the commercial heparin in its hepatic acid form with the aid of a resin exchange column. ions, by beating said column with distilled and demineralized water and recovering the solution which is then maintained at a temperature of 50.degree. C. for a period of 12 to 24 hours, by reducing the pH of the solution to 6.degree. -8, opar a soda solution, dialyzing for a period of between 120 and 165 h. then freeze-drying. 10. - Utilisation d'un dérivé d'héparine dont le taux de groupements N-sulfates se situe entre 20 et 40 de celui de l'héparine et qui est pratiquement dépourvu d'activité anticoagulante pour la préparation des compositions pharmaceutiques selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 à activité antithrombotique.  10. - Use of a heparin derivative whose N-sulphate group level is between 20 and 40 of that of heparin and which is practically devoid of anticoagulant activity for the preparation of the pharmaceutical compositions according to one of the following: any of claims 1 to 9 with antithrombotic activity.