FR2634784A1 - Immortalised intestinal epithelial cell lines, process for preparing them and their applications as system for producing growth factors and as model for studying functional and cancerous digestive physiopathology - Google Patents
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Abstract
Description
La présente invention est relative & des lignées de cellules épithéliales intestinales immortali suées, b leurs procédés de préparation et & leurs applica tions en tant que système de production de facteurs de croissance et en tant que modèle d'étude de la physiopathologie digestive fonctionnelle et cancéreuse. The present invention relates to immortalized intestinal epithelial cell lines, processes for their preparation and their applications as a growth factor production system and as a model for the study of functional and cancerous gastrointestinal pathophysiology. .
Il est difficile, à l'heure actuelle, de disposer de systèmes permettant l'analyse des manifestations génomiques, immunologiques et biochimiques tant des méca mises physiologiques de prolifération cellulaire intesti- nale, de différenciation et de vieillissement des cellules intestinales que d'une tumeur d'origine intestinale. It is difficult at present to have systems for the analysis of genomic, immunological and biochemical manifestations of both the physiological mechanisms of intestinal cell proliferation, differentiation and aging of intestinal cells and of a tumor. of intestinal origin.
En dépit des travaux effectués dans le domaine de la culture de cellules, l'étude des cellules digestives normales est encore difficile à l'heure actuelle en rai son
- de la faible prolifération et de la durée de vie limitée de ces cellules en culture, conduisant, de plus, å des changements phénotypiques considérables avant que le vieillissement cellulaire ne se produise
- la dépendance de ces cellules vis-a-vis des facteurs de croissance, tels que l'insuline, 1'EGF et la gastrine
- la nécessité de cultiver ces cellules épithéliales en présence de cellules mésenchymateuses ou de fi broblastes. Despite the work done in the field of cell culture, the study of normal digestive cells is still difficult at the moment because of
- the low proliferation and limited lifespan of these cells in culture, leading, in addition, to considerable phenotypic changes before cellular aging occurs
the dependence of these cells on growth factors, such as insulin, EGF and gastrin
the need to cultivate these epithelial cells in the presence of mesenchymal cells or fibroblasts.
En particulier, en ce qui concerne le tractus digestif, il est connu que ces cancers sont très fréquents dans l'épithélium de l'estomac et du colon chez 1'Homme l'étude de ces différents cancers est effectuée, à l'heure actuelle, a partir de cellules cancéreuses caractérisées par des remaniements chromosomiques très importants et une derégulation complète de l'expression génétique et phénotypique des cellules gastriques et intestinales. In particular, with regard to the digestive tract, it is known that these cancers are very frequent in the epithelium of the stomach and the colon in humans, the study of these different cancers is carried out, at the present time. , from cancer cells characterized by very important chromosomal rearrangements and complete dysregulation of the genetic and phenotypic expression of gastric and intestinal cells.
Certains de ces inconvénients ont été contournés par l'établissement de lignées cellulaires cancéreuses de cellules épithéliales d'origine intestinale (ZWEIBAUM A. Some of these disadvantages have been circumvented by the establishment of intestinal epithelial cell cancer cell lines (ZWEIBAUM A.
et al., Handbook of physiology, Intestinal transport of the
Gastrointestinal system, Am. Physiol. Soc., 1988 ; MARTIN
F. et al., Int. J. Cancer, 1983, 32, 623-627).et al., Handbook of Physiology, Intestinal Transport of the
Gastrointestinal system, Am. Physiol. Soc., 1988; MARTIN
F. et al., Int. J. Cancer, 1983, 32, 623-627).
Des lignées spontanément immortalisées ont été mises en évidence (QUARONI A. et al., 1979, J. Cell. Biol., 80, 248-265 ; NEGREL R. et al., 1983, Exp. Cell. Res., 143, 427-437 ; BLAY J. et al., 1984, Cell. Biol. Inter. Rep., 8, 551-560). Le mécanisme de la division cellulaire et de l'immortalisation de ces cellules est inconnu ; ces lignées ne peuvent donc pas entre utilisées comme modèle d'étude. Spontaneously immortalized lines have been demonstrated (QUARONI A. et al., 1979, J. Cell Biol., 80, 248-265, NEGREL R. et al., 1983, Exp Cell Res., 143, 427-437, BLAY J. et al., 1984, Cell Biol Inter, Rep., 8, 551-560). The mechanism of cell division and immortalization of these cells is unknown; these lines can not therefore be used as a study model.
Les modèles d'étude antérieurement décrits ont pour inconvénient de présenter des anomalies chromosomiques et un dysfonctionnement (proto)oncogénique, excluant a possibilité d'une comparaison avec le programme génétique intrinsèque des cellules normales (MONNAT M. et al., Int. Previously described study models have the disadvantage of presenting chromosomal abnormalities and (proto) oncogenic dysfunction, precluding the possibility of comparison with the intrinsic genetic program of normal cells (MONNAT M. et al., Int.
J. Cancer, 1987, 40, 293-299).J. Cancer, 1987, 40, 293-299).
De plus, ces modèles ne sont pas assez sélectifs. Moreover, these models are not selective enough.
Les Inventeurs se sont, en conséquence, donné pour but de pourvoir à un nouveau modèle d'étude des cellules épithéliales intestinales, ne présentant pas les inconvénients des modèles antérieurs, ledit modèle permettant l'étude des manifestations physiologiques, physiopathologiques des cellules épithéliales intestinales normales ainsi que l'analyse des manifestations génomiques, immunologiques et biochimiques inhérentes a la progression tumorale. The inventors have therefore been intended to provide a new model for studying intestinal epithelial cells, not having the disadvantages of prior models, said model allowing the study of the physiological, physiopathological manifestations of normal intestinal epithelial cells. as well as the analysis of the genomic, immunological and biochemical manifestations inherent to tumor progression.
La lignée cellulaire, selon l'invention, présente des applications tant dans l'étude de la fonction, que dans la différenciation des cellules épithéliales intestinales. The cell line according to the invention has applications both in the study of function and in the differentiation of intestinal epithelial cells.
La présente invention a pour objet une lignée de cellules épithéliales intestinales de mammifère, caractérisée en ce qu'elle est obtenue par transfection de cellules épithéliales intestinales fétales de mammifère, par un (proto)oncog8ne viral ou cellulaire immortalisant approprié, en ce que la lignée ainsi transfectée est immortali sée et en ce qu'elle n'est pas tumorigène. The subject of the present invention is a mammalian intestinal epithelial cell line, characterized in that it is obtained by transfection of mammalian mammalian intestinal epithelial cells with an appropriate immortalizing viral (proto) oncogenic agent, in that the thus transfected is immortalized and in that it is not tumorigenic.
Conformément à l'invention, le (proto)oncogène viral ou cellulaire immortalisant est sélectionné dans le groupe qui comprend notamment, l'oncogène E1A de l'adénovirus 2 humain, l'oncogène E1A de l'adénovirus 5 humain, l'oncogène large T de polyome, l'oncogène large T de SV40, l'oncogène v-myc, l'oncogène c-myc et l'oncogène p53. According to the invention, the immortalizing (proto) viral or cell oncogene is selected from the group which comprises, in particular, the human adenovirus 2 E1A oncogene, the human adenovirus 5 E1A oncogene, and the large oncogene. Polyoma T, SV40 broad T oncogene, v-myc oncogene, c-myc oncogene and p53 oncogene.
Selon un mode de réalisation avantageux, la lignée cellulaire est obtenue par transfection de cellules épithéliales intestinales fétales d'origine murine par
L'oncogène E1A de l'adénovirus 2 humain.According to an advantageous embodiment, the cell line is obtained by transfection of fetal intestinal epithelial cells of murine origin by
The oncogene E1A of human adenovirus 2.
Cette lignée cellulaire a été dénommée SLC-11 par les Inventeurs. This cell line has been called SLC-11 by the inventors.
Conformément à l'invention, ladite lignée a été déposée sous le n 1-791 en date du 22 juillet 1988 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes tenue par l'Institut Pasteur. In accordance with the invention, said line was deposited under No. 1-791 dated July 22, 1988, with the National Collection of Microorganism Cultures held by the Institut Pasteur.
Ladite lignée SLC-11 est immortelle et proche des cellules normales de l'épithélium intestinal, non tumorigène et possède une activité de prolifération illimitée. Said line SLC-11 is immortal and close to the normal cells of the intestinal epithelium, non-tumorigenic and has unlimited proliferation activity.
La présente invention a également pour objet un procédé d'obtention de la lignée cellulaire selon l'invention, caractérisé en ce qu'on isole les cellules épithéliales intestinales à partir de foetus de mammifère, en ce que l'on électro-perméabilise lesdites cellules et en ce qu'son les transfecte par un (proto)oncogène viral ou cellulaire iomortalivant approprié. The subject of the present invention is also a process for obtaining the cell line according to the invention, characterized in that the intestinal epithelial cells are isolated from mammalian fetuses, in that said cells are electro-permeabilized. and that they are transfected with a suitable viral or cell-mediated (proto) oncogene.
Selon un mode de mise en oeuvre avantageux, l'oncogène viral iortalisant est sélectionné dans le groupe qui comprend notamment 1'oncogène E1A de l'adénovirus 2 humain, l'oncogène ElA de l'adénovirus 5 humain, l'oncogène large T de polyome, l'oncogène large T du SV40, l'oncogène v-myc, l'oncogène c-myc et l'oncogène p53. According to an advantageous embodiment, the viralizing oncogene is selected from the group which comprises, in particular, the human adenovirus 2 E1A oncogene, the human adenovirus 5 ElA oncogene, the polyoma, SV40 broad T oncogene, v-myc oncogene, c-myc oncogene and p53 oncogene.
En ce qui concerne les oncogènes large T, on peut utiliser différents plasmides recombinés avec lesdits oncogènes. Ceux-ci sont ainsi inclus dans différentes constructions. For broad T oncogenes, different recombinant plasmids with said oncogenes can be used. These are thus included in different constructions.
En particulier, il existe un mutant NG18 du polyome, codant uniquement pour la région large T du virus il existe également une construction de SV40 qui s'appelle
PAS, dite SV40 (Ori-), car délétée de son origine de réplication.In particular, there is a mutant NG18 of the polyoma, coding only for the broad region T of the virus. There is also an SV40 construct called
PAS, called SV40 (Ori-), because it has been deleted from its origin of replication.
Lesdits oncogènes sont recombinés, de manière connue, dans des plasmides appropriés. L'oncogène EA1 est recombiné dans le plasmide pUCl3, l'oncogène large T de polyome est recombiné dans le plasmide pBR 322, l'oncogène large T du SV40 est recombiné dans le plasmide pUC13. Said oncogenes are recombined, in known manner, into appropriate plasmids. The EA1 oncogene is recombined in the plasmid pUC13, the polyoma T broad oncogene is recombined in the plasmid pBR 322, the SV40 broad T oncogene is recombined in the plasmid pUC13.
La présente invention a également pour objet l'application de la lignée conforme à l'invention en tant que système de production de protéines spécifiquès de l'épithélium intestinal, tels que les facteurs de croissance. The present invention also relates to the application of the line according to the invention as a system for producing specific proteins of the intestinal epithelium, such as growth factors.
Ledit système permet la production en quantités importantes de protéines spécifiques de l'épithélium intestinal, telles que les facteurs de croissance, lesdites protéines étant excrétées dans le milieu de culture. Said system allows the production in large quantities of specific proteins of the intestinal epithelium, such as growth factors, said proteins being excreted in the culture medium.
La présente invention a également pour objet un procédé d'obtention desdites protéines spécifiques de l'épithélium intestinal, caractérisé en ce qu'on cultive la lignée cellulaire, conforme à l'invention sur un milieu approprié à base de sels inorganiques, de glucose, de rouge de phénol, d'amino-acides, de vitamines, et comprenant, en outre de l'insuline et/ou de la transferrine et/ou de la toxine cholérique et/ou du facteur de croissance épithéliale (EGF) et/ou des extraits hypophysaires et/ou de la dexaméthasone et/ou du sélénium et/ou des albumines sériques, pendant un temps approprié, en ce qu'on extrait lesdites protéines du milieu de culture et en ce qu'on les purifie. The subject of the present invention is also a process for obtaining said specific proteins from the intestinal epithelium, characterized in that the cell line according to the invention is cultured on a suitable medium based on inorganic salts, glucose, phenol red, amino acids, vitamins, and further comprising insulin and / or transferrin and / or cholera toxin and / or epithelial growth factor (EGF) and / or pituitary extracts and / or dexamethasone and / or selenium and / or serum albumin, for a suitable time, in that said proteins are extracted from the culture medium and in that they are purified.
La présente invention a également pour objet l'application de la lignée conforme à l'invention en tant que modèle d'étude et d'identification des systèmes biochimiques dont l'expression nucléaire, cytoplasmique ou membranaire est impliquée dans la prolifération et la différenciation cellulaires des cellules épithéliales intestinales. The present invention also relates to the application of the line according to the invention as a model for the study and identification of biochemical systems whose nuclear, cytoplasmic or membrane expression is involved in cell proliferation and differentiation. intestinal epithelial cells.
Conformément à la présente invention, pour une telle application, ladite lignée cellulaire est mise en oeuvre dans une méthode d'étude et d'identification des systèmes biochimiques dont l'expression nucléaire, cytoplasmique ou membranaire est impliquée dans la prolifération et la différenciation cellulaire des cellules épithéliales intestinales, qui est caractérisée en ce que
(1) ladite lignée est cultivée sur un milieu à base de sels inorganiques de glucose, de rouge de phénol, d'amino-acides, de vitamines, comprenant, en outre de l'insuline et/ou de la transferrine et/ou de la toxine cholérique et/ou du facteur de croissance épithéliale (EGF) et/ou des extraits hypophysaires et/ou de la dexaméthasone et/ou du sélénium et/ou des albumines sériques, pendant un temps approprié,
(2) on ajoute éventuellement dans ledit milieu des inducteurs chimiques,
(3) on cultive ladite lignée sur un support approprié.According to the present invention, for such an application, said cell line is used in a method for studying and identifying biochemical systems whose nuclear, cytoplasmic or membrane expression is involved in the proliferation and differentiation of cells. intestinal epithelial cells, which is characterized in that
(1) said line is cultured on a medium based on inorganic salts of glucose, phenol red, amino acids, vitamins, comprising, in addition to insulin and / or transferrin and / or cholera toxin and / or epithelial growth factor (EGF) and / or pituitary extracts and / or dexamethasone and / or selenium and / or serum albumin, for a suitable time,
(2) chemical inducers are optionally added to said medium,
(3) culturing said line on a suitable support.
Les inducteurs chimiques utilisés sont connus et agissent au niveau membranaire ou nucléaire et induisent une différenciation cellulaire. The chemical inducers used are known and act at the membrane or nuclear level and induce cell differentiation.
On peut citer, comme inducteur chimique, et ce de manière non limitative, le DMSO, le butyrate de métal alcalin ou alcalino-terreux, le phorbolmyristate acétate (PMA), le tétradécanoyl phorbolacétate (TPA), l'acide réti nique. Non-limiting chemical initiators include DMSO, alkali metal or alkaline earth metal butyrate, phorbolmyristate acetate (PMA), tetradecanoyl phorbolacetate (TPA), reticylic acid.
Selon un autre aspect de ladite méthode, le support est constitué de cellules vivantes en co-culture, prises notamment dans le groupe qui comprend les cellules mésenchymateuses et les fibroblastes d'origine intestinale. According to another aspect of said method, the support consists of living cells in co-culture, taken in particular in the group which comprises mesenchymal cells and fibroblasts of intestinal origin.
Selon encore un autre aspect de ladite méthode, ledit support est constitué d'une matrice extracellulaire appropriée secrétée par des cellules de l'endothélium de cornée de boeuf et/ou des boîtes de culture surfactées par des facteurs d'adhésion cellulaire : laminine et/ou fibronectine et/ou collagène et/ou glycosaminoglycanes. According to yet another aspect of said method, said support consists of an appropriate extracellular matrix secreted by cells of the endothelium of ox cornea and / or culture dishes surfacted by cell adhesion factors: laminin and / or fibronectin and / or collagen and / or glycosaminoglycans.
Ladite méthode permet d'étudier des facteurs de croissance ou d'interférence (lymphokines) capables de réguler la prolifération et la différenciation des cellules intestinales. Said method makes it possible to study growth or interference factors (lymphokines) capable of regulating the proliferation and differentiation of intestinal cells.
Elles permet également d'étudier l'expression des (proto)oncogènes cellulaires impliqués dans la prolifération et la différenciation cellulaire. It also makes it possible to study the expression of cellular (proto) oncogenes involved in cell proliferation and differentiation.
Elle permet, en outre, l'étude du métabolisme et de la toxicité de substances diverses qui peuvent être ingérées, notamment de médicaments, d'aliments. It also allows the study of the metabolism and toxicity of various substances that can be ingested, including drugs, food.
Elle permet, de plus, l'étude des cellules épithéliales présentant un déficit génétique, par exemple, dans la mucoviscidose
Selon encore un autre aspect de ladite méthode, elle comprend en outre une étape de transformation de ladite lignée traitée obtenue, en cellules tumorales par
(4) transfection secondaire par un (proto)oncogène cellulaire normal ou muté approprié et
(5) sélection en milieu de culture contenant un antibiotique approprié.It also allows the study of epithelial cells presenting a genetic deficit, for example, in cystic fibrosis
According to yet another aspect of said method, it further comprises a step of transforming said obtained treated line into tumor cells by
(4) secondary transfection with a suitable normal or mutated (proto) cell oncogene and
(5) selection in culture medium containing a suitable antibiotic.
Selon une disposition avantageuse de cette méthode, ledit oncogène cellulaire est choisi parmi les onco gène s connus pour être fréquemment exprimés dans les cancers coliques chez l'Homme, comme c'est le cas, notamment de l'oncogène ras, l'oncogène myc, l'oncogène fos. According to an advantageous arrangement of this method, said cellular oncogene is chosen from onc genes known to be frequently expressed in colonic cancers in humans, as is the case, in particular of the oncogene ras, the myc oncogene. , the oncogene fos.
Selon une autre disposition ledit oncogène cellulaire est recombiné dans un plasmide porteur d'une ré gion régulatrice et d'un marqueur de sélection, notamment un gène de résistance a un antibiotique. According to another provision, said cellular oncogene is recombined in a plasmid carrying a regulatory region and a selection marker, in particular a gene for resistance to an antibiotic.
Selon encore une autre disposition, l'antibiotique est la néomycine et/ou l'un de ses analogues. According to yet another provision, the antibiotic is neomycin and / or one of its analogues.
Selon une modalité avantageuse de cette disposition, l'antibiotique est de la généticine. According to an advantageous modality of this provision, the antibiotic is geneticin.
La lignée cellulaire conforme à l'invention, transformée selon le procédé décrit ci-dessus, est un modèle d'étude adapté aux médicaments anticancéreux et permet de réaliser une comparaison entre les deux modèles (lignées non transformées versus lignées transformées). The cell line according to the invention, transformed according to the method described above, is a study model adapted to anticancer drugs and makes it possible to make a comparison between the two models (non-transformed lines versus transformed lines).
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre de la présente invention. In addition to the foregoing, the invention further comprises other arrangements, which will become apparent from the following description, which refers to examples of implementation of the present invention.
Il doit etre bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. It should be understood, however, that these examples are given solely by way of illustration of the subject of the invention, of which they in no way constitute a limitation.
Exemple 1 : Préparation d'une lignée cellulaire conforme a l'invention, avec comme oncogène immortalisant, l'oncogène
E1A de l'adénovirus 2 humain
Des cellules épithéliales intestinales sont obtenues à partir de foetus de rat Wistar a 19 jours de gestation, par le procédé décrit dans CHASTRE E. et al.EXAMPLE 1 Preparation of a Cell Line According to the Invention with the Oncogene as Oncogenic Immortalizer
E1A of human adenovirus 2
Intestinal epithelial cells are obtained from Wistar rat fetus at 19 days of gestation, by the method described in CHASTRE E. et al.
(Endocrinol., 1987, 121, 2211-2221). Les cellules isolées sont alors lavées et mises en suspension dans un milieu S
MEM (Gibco) contenant 0,5 t de SVF (sérum de veau fêtai), supplémenté en antibiotique (100 unités de pénicilline et 100 pg de streptomycine) et 4 mM de L-glutamine et un minimum d'ions Ca2+ libres (milieu dit d'électro-perméabilisation, faible concentration ionique). Les cellules ir.testi- nales (107/ml) sont mises en contact pendant 10 minutes å C avec le plasmide E1A Ad2 - pUC13 (oncogène E1A de l'adénovirus 2 humain recombiné dans le plasmide pUC13), a une concentration de 25 pg/ml. (Endocrinol., 1987, 121, 2211-2221). The isolated cells are then washed and suspended in a medium S
MEM (Gibco) containing 0.5 t of SVF (feasted calf serum), supplemented with antibiotic (100 units of penicillin and 100 μg of streptomycin) and 4 mM of L-glutamine and a minimum of free Ca 2+ ions (said medium). electro-permeabilization, low ion concentration). The antigen cells (107 / ml) are contacted for 10 minutes with the plasmid E1A Ad2-pUC13 (recombinant human adenovirus 2 E1A oncogene in plasmid pUC13) at a concentration of 25 μg. / ml.
Les cellules sont perméabilisées en les plaçant entre les deux électrodes d'un électro-pulsateur (8 chocs de 100 ps & 1000-1500 V). Les cellules traitées sont maintenues 10 minutes dans la glace après les chocs, puis incubées 20 minutes a 37'C dans un incubateur a C02. The cells are permeabilized by placing them between the two electrodes of an electro-pulsator (8 shocks of 100 ps & 1000-1500 V). The treated cells are kept for 10 minutes in the ice after the shocks, then incubated for 20 minutes at 37 ° C. in a CO 2 incubator.
Après les chocs électriques, l'augmentation de la perméabilité des cellules peut être visualise par le test d'exclusion au bleu Trypan, ladite augmentation étant obtenue chez 50 % des cellules. After the electric shocks, the increase of the permeability of the cells can be visualized by the Trypan blue exclusion test, said increase being obtained in 50% of the cells.
Les cellules sont ensuite diluées dans un milieu de culture classique. The cells are then diluted in a conventional culture medium.
Les cellules transfectées sont sélectionnées selon leurs caractéristiques morphologiques : elles présen- tent une morpholige épithéliale de cellules polygonales adJacentes. On obtient ainsi la lignée SLC-11. The transfected cells are selected according to their morphological characteristics: they have an epithelial morpholysis of adJacent polygonal cells. The SLC-11 line is thus obtained.
Exemple 2 : Préparation d'une autre lignée cellulaire conforme à l'invention, avec comme oncogène immortalisant, l'oncogène E1A de l'adénovirus 2 humain
Des cellules épithéliales intestinales sont obtenues à partir de foetus humain porteur d'une maladie génétique dont la cible est l'épithélium intestinal, la mucoviscidose, par exemple. Les cellules isolées sont alors lavées et mises en suspension dans un milieu S-MEM (Gibco) contenant 0,5 % de SVF (sérum de veau fatal), supplémenté en antibiotique (100 unités de pénicilline et 100 mg de streptomycine) et 4 mM de L-glutamine et un minimum d'ions
Ca2+ libres (milieu dit d'électro-perméabilisation, faible concentration ionique). Les cellules intestinales (107/ml) sont mises en contact pendant 10 minutes à 4 C avec le plasmide E1A Ad2 - pUC13 (oncogène ElA de l'adénovirus 2 humain recombiné dans le plasmide pUC13), à une concentra- tion de 25 g/ml. Example 2 Preparation of Another Cell Line According to the Invention with the Immortalizing Oncogene, the Oncogene E1A of Human Adenovirus 2
Intestinal epithelial cells are obtained from human fetuses carrying a genetic disease whose target is the intestinal epithelium, cystic fibrosis, for example. The isolated cells are then washed and suspended in an S-MEM medium (Gibco) containing 0.5% of FCS (fatal calf serum), supplemented with antibiotic (100 units of penicillin and 100 mg of streptomycin) and 4 mM. L-glutamine and a minimum of ions
Free Ca2 + (so-called electro-permeabilization medium, low ion concentration). The intestinal cells (107 / ml) are contacted for 10 minutes at 4 ° C. with the plasmid E1A Ad2-pUC13 (recombinant human adenovirus 2 ElA oncogene in the plasmid pUC13) at a concentration of 25 g / ml. ml.
Les cellules sont perméabilisées en les plaçant entre les deux électrodes d'un électro-pulsateur (8 chocs de 100 ps a 1000-1500 V). Les cellules traitées sont main tenues 10 minutes dans la glace après les chocs, puis incubées 20 minutes à 37 C dans un incubateur à CO2. The cells are permeabilized by placing them between the two electrodes of an electro-pulsator (8 shocks of 100 ps at 1000-1500 V). The treated cells are held for 10 minutes in the ice after the shocks, then incubated for 20 minutes at 37 ° C. in a CO2 incubator.
Après les chocs électriques, l'augmentation de la perméabilité des cellules peut être visualisée par le test d'exclusion au bleu Trypan, ladite augmentation étant obtenue chez 50 % des cellules. After the electric shocks, the increase of the permeability of the cells can be visualized by the Trypan blue exclusion test, said increase being obtained in 50% of the cells.
Les cellules sont ensuite diluées dans un milieu de culture classique. The cells are then diluted in a conventional culture medium.
De telles cellules permettent une analyse dynamique de la cellule pathologique, non seulement au niveau des sécrétions hydro-electrolytiques mais aussi de l'expression du gène responsable de la maladie, dans des conditions de viabilité cellulaire optimale. Such cells allow a dynamic analysis of the pathological cell, not only at the level of the hydroelectrolytic secretions but also the expression of the gene responsible for the disease, under conditions of optimal cell viability.
Exemple 3 : Préparation d'une lignée cellulaire avec comme oncogène immortalisant, l'oncogène large T de polyome
On procède comme dans l'exemple 1, en utilisant le plasmide recombinant Py NG18-pBR 322 (oncogène large T de polyome présent chez le mutant NG18 de polyome, recombine dans le plasmide pBR 322).Example 3 Preparation of a cell line with immortalizing oncogene, the polyoma wide T oncogene
The procedure is as in Example 1, using the recombinant plasmid Py NG18-pBR 322 (large polyoma T oncogene present in mutant NG18 polyoma, recombinant in plasmid pBR 322).
Exemple 4 : Préparation d'une lignée cellulaire avec comme oncogène immortalisant, l'oncogène large T de SV40
On procède comme dans l'exemple 1, en utilisant le plasmide recombinant SV40 LP-pUC13 (oncogène large T de SV4O, recombiné dans le plasmide pUC13). EXAMPLE 4 Preparation of a Cell Line With As Immortalizing Oncogene, SV40 Wide T Oncogene
The procedure is as in Example 1, using the recombinant plasmid SV40 LP-pUC13 (SV4O broad T oncogene, recombined in the plasmid pUC13).
Exemple 5 : Caractéristiques de la lignée SLC-11
La lignée cellulaire obtenue dans l'exemple 1 possède des caractéristiques de l'épithélium intestinal d'origine.Example 5 Characteristics of the SLC-11 Line
The cell line obtained in Example 1 has characteristics of the original intestinal epithelium.
1 ), Morphologle
- Les cellules SLC-11 ont une morphologie épithéliale tant au microscope à contraste de phase qu'au microscope électronique et entretiennent des jonctions de contact serres entre elles. Ces cellules présentent une morphologie épithéliale de cellules polygonales adjacentes. 1), Morphologle
SLC-11 cells have epithelial morphology under both the phase contrast microscope and the electron microscope and maintain tight contact junctions with each other. These cells have an epithelial morphology of adjacent polygonal cells.
Les cellules SLC-11 ne forment que des monocouches et poussent à basse densité d'ensemencement, puisqu'on a pu cloner ces cellules. SLC-11 cells only form monolayers and grow at low seeding density, since these cells could be cloned.
- Etude des courbes de croissance
Le taux de croissance des cellules SLC-11 a été déterminé au 9ème, 20ème, 26ème, 44ème et 47ème passage.- Study of growth curves
The growth rate of SLC-11 cells was determined at the 9th, 20th, 26th, 44th and 47th passages.
Les cellules SLC-11 ont été mises en milieu de culture à une concentration de 5.10' cellules/5 ml de milieu de culture dans des boites de 25 cm2. The SLC-11 cells were placed in culture medium at a concentration of 5 × 10 7 cells / 5 ml of culture medium in 25 cm 2 dishes.
Le milieu est changé tous les deux jours. Les cellules sont comptées dans deux boîtes à 24 heures d'intervalle. A chacun des passages, on étudie la croissance de cellules par comptage cellulaire pendant la phase de croissance exponentielle et jusqu'a obtention de la confluence, caractérisée par une inhibition de contact et un arrêt de la prolifération cellulaire. The middle is changed every two days. The cells are counted in two boxes at 24-hour intervals. At each of the passages, cell growth is studied by cell counting during the exponential growth phase and until confluence is achieved, characterized by contact inhibition and arrest of cell proliferation.
La période de doublement de la population cellulaire est de 17 heures, pendant la phase de croissance exponentielle. The doubling period of the cell population is 17 hours, during the exponential growth phase.
Les caractéristiques ultrastructurales de ces cellules incluent la présence de grandes et nombreuses mitochondries, la présence de microvilli allongés et rares sur toute la surface du milieu et de fréquents contacts cellules-cellules. The ultrastructural features of these cells include the presence of large and numerous mitochondria, the presence of elongated and rare microvilli throughout the entire surface of the medium, and frequent cell-cell contacts.
2) Immortalité des cellules
Les cellules SLC-11 sont immortalisées par l'oncogène viral ElA, comme le montre l'analyse des ARNm transcrits par Northern blot et l'identification des oncoprotéines codées par le gène E1A, révélées par ;mmunofluorescence indirecte dans le noyau des cellules intestinales
SLC-11.2) Immortality of cells
The SLC-11 cells are immortalized by the viral ElA oncogene, as shown by the analysis of Northern blot transcribed mRNAs and the identification of oncoproteins encoded by the E1A gene, revealed by indirect immunofluorescence in the intestinal cell nucleus.
SLC-11.
- Analyse Northern blot
L'ARN total est extrait à partir de 108 cellules SLC-11 en croissance exponentielle, en utilisant le procédé au thiocyanate de guanidine de CHIRGWIN (Biochem., 1979, 18, 5294-5299). - Northern blot analysis
Total RNA was extracted from 108 SLC-11 cells in exponential growth, using the guanidine thiocyanate method of CHIRGWIN (Biochem., 1979, 18, 5294-5299).
L'ARN est fractionné par électrophorèse sur un gel d'agarose a 1,5 % dans 2,2 n de formaldéhyde et trans féré sur des filtres de nitrocellulose. The RNA is fractionated by electrophoresis on a 1.5% agarose gel in 2.2% formaldehyde and transferred to nitrocellulose filters.
L'hybridation est réalisée par une sonde correspondant au gène E1A marqué au 32P, multiamorce, ayant une activité spécifique de 0,7.10 cpm/pg d'ADN. The hybridization is carried out by a probe corresponding to the 32P-labeled, multi-primer E1A gene, having a specific activity of 0.7 × 10 cpm / μg of DNA.
Les filtres de nitrocellulose sont lavés deux fois à température ambiante avec un tampon SSC, puis & 50-C pendant une heure dans un tampon SSC-SDS à 0,1 %. The nitrocellulose filters are washed twice at room temperature with SSC buffer and then at 50 ° C for one hour in 0.1% SSC-SDS buffer.
La Figure 1 montre l'analyse par Northern blot des ARNm de la lignée SLC-11 (pistes c et d, 15 et 5 pg d'ARN, respectivement), en comparaison avec la lignée 293 transformée par l'adénovirus 5 (témoin positif), qui a la propriété de présenter de grandes quantités d'ÀRN d'ElA 13S et 12S (piste b, 7 pg d'ARN), alors que les cellules SLC-11 présentent un ARNm 15S de taille supérieure. Figure 1 shows the Northern blot analysis of the SLC-11 line mRNAs (lanes c and d, 15 and 5 μg of RNA, respectively), compared with the 293 line transformed with adenovirus 5 (positive control ), which has the property of presenting large amounts of 13S and 12S ElRNAs (lane b, 7μg of RNA), whereas SLC-11 cells have a larger size 15S mRNA.
Dans des fibroblastes d'embryons de rat FR 3T3, utilisés comme témoins négatifs, aucune hybridation ne se produit entre la sonde E1A marquée et les ARN (piste a, 7 pg d'ARN). In FR 3T3 rat embryo fibroblasts used as negative controls, no hybridization occurs between the labeled E1A probe and the RNAs (lane a, 7 μg RNA).
L'hybridation avec la sonde est évidente avec le contrôle positif (piste b) et avec la lignée SLC-11 (piste c). Hybridization with the probe is evident with the positive control (lane b) and with line SLC-11 (lane c).
- Longévité de la culture
Les cellules SLC-11 ont les propriétés de cellules épithéliales immortelles, elles sont en culture depuis deux ans, et 77 passages ont déjà été effectués.- Longevity of culture
SLC-11 cells have the properties of immortal epithelial cells, they have been cultured for two years, and 77 passages have already been made.
- Immunofluorescence indirecte correspondant a la présence de la protéine nucléaire codée par le gène EiA. - Indirect immunofluorescence corresponding to the presence of the nuclear protein encoded by the EiA gene.
Des cellules SLC-11 en confluence sont fixées dans du paraformaldéhyde a 3 % et perméabilisées avec du
Triton X-100 (marque déposée) a 0,1 8, incubées avec un anticorps monoclonal 73, spécifique des protéines de la région antérieure E1A de l'adénovirus 2, puis avec des IgG anti-souris, marquées à la fluorescéine, comme deuxième anticorps. SLC-11 cells in confluence are fixed in 3% paraformaldehyde and permeabilized with
Triton X-100 (registered trademark) at 0.18, incubated with a monoclonal antibody 73, specific for the proteins of the anterior region E1A of adenovirus 2, then with anti-mouse IgG, labeled with fluorescein, as a second antibody.
Chaque incubation est de trente minutes à température ambiante. Each incubation is thirty minutes at room temperature.
Les préparations sont observées à l'aide d'un microscope a épifluorescence. The preparations are observed using an epifluorescence microscope.
En accord avec le Northern blot ( détection de 1'ARNm 15S codé par le gène E1A de l'adénovirus 2 dans les cellules SLC-11), l'anticorps 73 détecte les antigènes E1A dans le noyau de la population totale de cellules SLC-11 entre le passage 15 et le passage 32 (figure 2A). In accordance with Northern blot (detection of 15S mRNA encoded by the adenovirus 2 E1A gene in SLC-11 cells), antibody 73 detects E1A antigens in the nucleus of the total population of SLC-11 cells. 11 between the passage 15 and the passage 32 (Figure 2A).
L'oncogène E1A est donc bien intégré de façon fonctionnelle dans le patrimoine génétique des cellules
SLC-11.The oncogene E1A is therefore well integrated functionally in the genetic heritage of cells
SLC-11.
3) Mise en évidence de substances caractéris- tiques de l'épithélium intestinal dans les cellules
SLC-11 :
Les cellules SLC-11 présentent certaines des caractéristiques des cellules épithéliales normales, en particulier, la présence de villine cytoplasmique, d'enképhalinase et de récepteurs membranaires fonctionnels du VIP et des catécholamines.
3) Demonstration of substances characteristic of the intestinal epithelium in the cells
SLC-11:
SLC-11 cells exhibit some of the characteristics of normal epithelial cells, in particular, the presence of cytoplasmic villin, enkephalinase, and functional membrane receptors of VIP and catecholamines.
Dans l'intestin mature, l'enképhalinase et la villine, protéine du cytosquelette sont localisées dans la bordure en brosse apicale, longeant le lumen. In the mature intestine, enkephalinase and villin, a cytoskeletal protein, are localized in the apical brush border, skirting the lumen.
- Villine
Les cellules sont fixées dans du paraformaldéhyde à 3 4 et perméabilisées avec du Triton-X100 (marque déposée) à 0,1 %, incubées avec des anticorps polyclonaux de la villine pAb 1-120 et ensuite avec, comme second anticorps, une lgG anti-lapin couplée à de la rhodamine.- Villine
The cells are fixed in 34% paraformaldehyde and permeabilized with 0.1% Triton-X100 (registered trademark), incubated with polyclonal villin antibodies pAb 1-120 and then with a second anti-IgG antibody. -lapin coupled with rhodamine.
Chaque incubation est de trente minutes å température ambiante. Each incubation is thirty minutes at room temperature.
Au microscope à épifluorescence, une immunofluorescence est détectée après le 3ème passage et au 25ème passage dans le cytoplasme des cellules SLC-11 (figure 2B). Under the epifluorescence microscope, immunofluorescence is detected after the third passage and at the 25th passage in the cytoplasm of the SLC-11 cells (FIG. 2B).
- Enképhalinase
On procède comme pour la villine, le premier anticorps étant l'anticorps 85A2, contre l'enképhalinase de la bordure en brosse rénale de lapin.- Enkephalinase
The procedure is as for villin, the first antibody being the 85A2 antibody, against enkephalinase rabbit kidney brush border.
Les cellules SLC-11 sont colorées positivement (figure 2C), confirmant ainsi la nature épithéliale de ces cellules intestinales immortelles. SLC-11 cells are stained positively (Figure 2C), thus confirming the epithelial nature of these immortal intestinal cells.
- VIP
La présence de récepteurs fonctionnels au VIP est mise en évidence par la production d'AMP cyclique. Le
VIP est un neurotransmetteur connu pour réguler les sécrétions d'eau et d'électrolytes de l'épithélium intestinal.- VIP
The presence of functional receptors in VIP is evidenced by the production of cyclic AMP. The
VIP is a neurotransmitter known to regulate the secretions of water and electrolytes from the intestinal epithelium.
L'AMPc est mesurée dans des cellules SLC-11 (3 å 6.104 cellules/ml), après trente minutes d'incubation à 20'C dans 0,5 ml de tampon Tris-HCl 35 mM (pH 7,5) contenant 1 mM d'IBMX comme inhibiteur de la phosphodiestérase, 1,4 % d'albumine bovine sérique et 50 mM de NaCl. The cAMP is measured in SLC-11 cells (3 to 6.104 cells / ml), after thirty minutes of incubation at 20 ° C. in 0.5 ml of 35 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing 1 mM of IBMX as phosphodiesterase inhibitor, 1.4% serum bovine albumin and 50 mM NaCl.
L'AMPc est déterminée par RIA. CAMP is determined by RIA.
Comme montré dans le Tableau I, ci-après, les cellules SLC-11 sont sensibles au VIP et à l'isoprotérénol. As shown in Table I, below, SLC-11 cells are sensitive to VIP and isoproterenol.
Les stimulations maximales par 0,1 M de VIP et 1 pM d'isoprotérénol sont, respectivement, 4,5 et 9 fois supérieures à l'activité basale.The maximal stimulations by 0.1 M of VIP and 1 μM of isoproterenol are, respectively, 4.5 and 9 times greater than the basal activity.
TABLEAU I
<tb> ADDITIONS <SEP> AMPc <SEP> S/B <SEP> ECso <SEP>
<tb> <SEP> (pmol/106 <SEP> cellules)
<tb> <SEP> RIEN <SEP> 28 <SEP> + <SEP> 5
<tb> VIP <SEP> VIP <SEP> (0,1 <SEP> M) <SEP> 126 <SEP> + <SEP> 6 <SEP> 4,5 <SEP> 0,3 <SEP> nM
<tb> ISO <SEP> ISO <SEP> (1 <SEP> pM) <SEP> 251 <SEP> + <SEP> 11 <SEP> 9 <SEP> 0,1 <SEP> pM <SEP>
<tb>
Les taux d'AMPc présentés dans le tableau I et le rapport stimulation/production basale (S/B) sont la moyenne de onze expériences effectuées en double. <tb> ADDITIONS <SEP> AMPc <SEP> S / B <SEP> ECso <SEP>
<tb><SEP> (pmol / 106 <SEP> cells)
<tb><SEP> NOTHING <SEP> 28 <SEP> + <SEP> 5
<tb> VIP <SEP> VIP <SEP> (0.1 <SEP> M) <SEP> 126 <SEP> + <SEP> 6 <SEP> 4.5 <SEP> 0.3 <SEP> nM
<tb> ISO <SEP> ISO <SEP> (1 <SEP> pM) <SEP> 251 <SEP> + <SEP> 11 <SEP> 9 <SEP> 0.1 <SEP> pM <SEP>
<Tb>
The cAMP levels shown in Table I and the basal stimulation / production ratio (S / B) are the average of eleven duplicate experiments.
Dans les mêmes conditions les agents suivants ne peuvent pas élever la production d'AMPc dans les cellules SLC-11 : lmM d'histamine, 0,1-1 M de peptide inhibiteur gastrique (GIP), du glucagon pancréatique, de l'oxyntomoduline et des peptides apparentés au glucagon tels que GLP-1, TGLP-1 et GLP-2. Under the same conditions the following agents can not elevate cAMP production in SLC-11 cells: 1mM histamine, 0.1-1M gastric inhibitory peptide (GIP), pancreatic glucagon, oxyntomodulin and glucagon-related peptides such as GLP-1, TGLP-1 and GLP-2.
Le VIP stimule l'activité de l'adénylate cyclase dans les cellules SLC-11, avec une puissance ECso = 0,3 nM, versus 0,25 nM dans l'épithélium intestinal d'origine. VIP stimulates the activity of adenylate cyclase in SLC-11 cells, with ECso power = 0.3 nM, versus 0.25 nM in the original intestinal epithelium.
4) Tumorigénicité :
Ces cellules ne sont pas tumorigènes chez la souris nude et les rats Wistar syngenéiques
- environ 107 cellules dans 100 ;1 de tampon
PBS sont injectées en sous-cutanée a 30 souris nude athymiques agées de 4 à 6 semaines et à il rats Wistar nouveaux-nés syngénéiques agés de 4 jours
- chez la souris, la tumorigénicité est activée par de l'estradiol implanté en sous-cutanée (implant à 0,1 mg) ;
- comme témoin positif on utilise 2.106 cellules issues de la lignée cellulaire tumorale de rats PROb, injectés aux souris nude dans les mêmes conditions
- tous les animaux sont controlés toutes les semaines pendant douze mois.4) Tumorigenicity:
These cells are not tumorigenic in nude mice and syngeneic Wistar rats
approximately 107 cells in 100 μl of buffer
PBS are injected subcutaneously into 30 athymic nude mice aged 4 to 6 weeks old and to Wistar rats with syngeneic newborns aged 4 days.
in mice, tumorigenicity is activated by estradiol implanted subcutaneously (0.1 mg implant);
as a positive control, 2.10 6 cells originating from the tumor cell line of PROb rats, injected into the nude mice under the same conditions, are used
- all animals are checked every week for twelve months.
Il n'y a pas formation de tumeur en présence de cellules SLC-11 même après un traitement prolongé à l'estradiol. Tout les animaux sont en vie un an après les injections. Les témoins positifs présentent la formation d'une tumeur dans les quatre semaines qui suivent. There is no tumor formation in the presence of SLC-11 cells even after prolonged treatment with estradiol. All animals are alive one year after the injections. Positive controls show the formation of a tumor within four weeks.
5) ryotype :
Ces cellules sont cultivées sur milieu DMEM additionné de sérum foetal de veau à 10 % inactivé par la chaleur ; au 118me passage, l'analyse du caryotype montre un remaniement minime de la carte chromosomique : les cellules sont diploïdes ; les modifications incluent une tri somie du chromosome 3 et une translocation impliquant les chromosomes 13 et 8.5) ryotype:
These cells are cultured on DMEM medium supplemented with heat-inactivated 10% fetal calf serum; in the 118th passage, the karyotype analysis shows a minimal reworking of the chromosomal map: the cells are diploid; the modifications include chromosome 3 somose sorting and translocation involving chromosomes 13 and 8.
Exemple 6 : Application à l'identification des systèmes biochimiques
(1) On cultive les cellules SLC-11 sur un milieu, conforme & l'invention, par exemple, un milieu DMEM comprenant de l'insuline, de la toxine cholérique, de l-'EGF et des extraits hypophysaires, de la dexaméthasone, de la transferrine, du sélénium et des albumines sériques, pendant un temps approprié.Example 6: Application to the identification of biochemical systems
(1) SLC-11 cells are cultured on a medium according to the invention, for example a DMEM medium comprising insulin, cholera toxin, EGF and pituitary extracts, dexamethasone , transferrin, selenium and serum albumin, for a suitable time.
(2) On ajoute, dans le milieu de culture, du butyrate de sodium, à une concentration comprise entre 1 mM et 5mM ; le temps d'expositicn des cellules au butyrate de sodium peut varier entre une et trois semaines. (2) Sodium butyrate is added to the culture medium at a concentration of between 1mM and 5mM; the exposure time of the cells to sodium butyrate can vary between one and three weeks.
(3) On co-cultive, lesdites cellules traitées par le butyrate de sodium, en présence de mésenchyme d'origine intestinale. Ces cellules peuvent être entretenues deux à trois semaines sur des monocouches de cellules mésenchymateuses. (3) The cells treated with sodium butyrate are co-cultured in the presence of intestinal mesenchyme. These cells can be maintained for two to three weeks on monolayers of mesenchymal cells.
Exemple 7 : Transformation des cellules SLC-11 en cellules cancéreuses (transfection par électro-perméabilisation)
Les étapes (1), (2) et (3) sont réalisées comme dans l'exemple 6, puis
(4) On transforme éventuellement la lignée
SLC-11 en cellule tumorale en procédant à une transfection cellulaire par un oncogène cellulaire tel que l'oncogène ras, myc ou fos, recombiné dans un plasmide porteur d'une région régulatrice et d'un marqueur de sélection, par électro-perméabilisation ; les conditions de la seconde transfection par électro-perméabilisation seront ajustées aux caractéristiques de la cellule SLC-11, quant à sa perméabilisation et å la conservation de son intégrité cellulaire, a la suite des chocs électriques.EXAMPLE 7 Transformation of SLC-11 Cells into Cancer Cells (Transfection by Electro-Permeabilization)
Steps (1), (2) and (3) are performed as in Example 6, and then
(4) The lineage may be transformed
SLC-11 in a tumor cell by carrying out a cellular transfection with a cellular oncogene such as the ras, myc or fos oncogene, recombined in a plasmid carrying a regulatory region and a selection marker, by electro-permeabilization; the conditions of the second transfection by electro-permeabilization will be adjusted to the characteristics of the SLC-11 cell, as to its permeabilization and the preservation of its cellular integrity, following electric shocks.
(5) Les cellules transfectées sont sélectionnées par la généticine. Seules les cellules SLC-11 qui ont été transfectées par le deuxième plasmide seront capables de proliférer en présence de cet antibiotique. (5) Transfected cells are selected by geneticin. Only SLC-11 cells that have been transfected with the second plasmid will be able to proliferate in the presence of this antibiotic.
Exemple 8 : Transformation des cellules SLC-11 en cellules cancéreuses (transfection par précipitation)
On procède comme dans l'exemple 7, la transfection cellulaire étant réalisée par précipitation par le phosphate de calcium ou le polybrène. EXAMPLE 8 Transformation of SLC-11 Cells into Cancer Cells (Precipitation Transfection)
The procedure is as in Example 7, the cellular transfection being carried out by precipitation with calcium phosphate or polybrene.
Exemple 9 : Application à la production de facteurs de croissance
Les cellules intestinales immortalisées sont cultivées en milieu défini dans des flacons de culture de 150 cm2. Pendant la phase de croissance exponentielle et après la phase de confluence, les milieux de culture sont récupérés et testés quant à leur effet mitotique sur des cellules intestinales humaines HT-29 quiescentes. Ceci permet de mettre en évidence les facteurs de croissances endo gènes sécrétés par les cellules de ltépithélium lntesti- nale. Les cellules HT-29 sont issues d'une lignée de colon humain et sont rendues quiescentes par privation totale de sérum de veau foetal pendant 2-3 jours. L'activité mitotique est mesurée par l'incorporation de la 3H-thymidine dans l'ADN.Example 9: Application to the Production of Growth Factors
The immortalized intestinal cells are cultured in a defined medium in culture flasks of 150 cm 2. During the exponential growth phase and after the confluence phase, the culture media are recovered and tested for their mitotic effect on quiescent human HT-29 intestinal cells. This makes it possible to highlight the endogenous growth factors secreted by the cells of the epithelial epithelium. The HT-29 cells are derived from a human colon line and are rendered quiescent by total deprivation of fetal calf serum for 2-3 days. Mitotic activity is measured by the incorporation of 3H-thymidine into the DNA.
Les facteurs de croissance produits seront isolés et purifiés à l'aide de méthodes biochimiques classiques utilisant la chromatographie de filtration sur gel, échangeuse d'ions, 1'HPLC (high performance liquid chromatography) et l'électrophorèse en gel de polyacrylamide. The growth factors produced will be isolated and purified using conventional biochemical methods using gel filtration chromatography, ion exchange, HPLC (high performance liquid chromatography) and polyacrylamide gel electrophoresis.
Lesdits facteurs peuvent jouer un rôle très important dans différentes pathologies consécutives a des résections massives de l'intestin (accidentés de la route, traumatismes, maladie de Crohn, cancer) ainsi que pour la réanimation des nouveaux-nes prématurés. These factors can play a very important role in various pathologies resulting from massive bowel resections (road accidents, trauma, Crohn's disease, cancer) as well as for the resuscitation of premature newborns.
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de réalisation, de mise en oeuvre et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite : elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée de la présente invention. As is apparent from the foregoing, the invention is not limited to those of its embodiments, implementation and application which have been described more explicitly: it embraces all the contrary. variants that may come to the attention of the skilled artisan without departing from the scope or scope of the present invention.
Claims (9)
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| FR8810361A FR2634784A1 (en) | 1988-08-01 | 1988-08-01 | Immortalised intestinal epithelial cell lines, process for preparing them and their applications as system for producing growth factors and as model for studying functional and cancerous digestive physiopathology |
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