FR2625565A1

FR2625565A1 - Improved chemiluminescent esters, thioesters and amides, and analyses employing them

Info

Publication number: FR2625565A1
Application number: FR8817502A
Authority: FR
Inventors: Frank Mccapra; Iraj Beheshti; Russell C Hart; Harlen Koelling; Ashokkumar Patel; Kastooriranganath Ramakrishnan
Original assignee: London Diagnostics Inc
Current assignee: London Diagnostics Inc
Priority date: 1987-12-31
Filing date: 1988-12-30
Publication date: 1989-07-07
Also published as: ZA8919B

Abstract

Chemiluminescent compounds exhibiting an increased stability in aqueous solution. The chemiluminescent group is an ester, thioester or amide in which the ester, thioester or amide bond is situated between 1 a heterocyclic ring system or a nucleus containing a carbon atom to which the bond is attached, the heteroatom being in an oxidation state which makes this carbon atom sensitive to attack by a peroxide or molecular oxygen to form an intermediate which degrades to give rise to chemiluminescence, and 2 an aryl ring system or nucleus containing at least one substituted hexagonal nucleus bearing two or more than two substituents, at least two of these substituents blocking, by steric hindrance, the hydrolysis of the said bond. Application: compositions and analytical kits containing the said chemiluminescent groups, intended for analyses using specific bonding.

Description

La présente invention a pour objet des analyses et immuno-essais utilisant comme marqueur des conjugués chimioluminescents. The present invention relates to analyzes and immunoassays using chemiluminescent conjugates as a marker.

Certains composés émettent de la lumière ou "entrent en chimioluminescence" par traitement avec un peroxyde ou de l'oxygène moléculaire å pH élevé. La lumière est produite par la dégradation d'un intermédiaire chimique qui est formé par 1 'attaque du peroxyde ou de l'oxygène moléculaire au niveau d'un centre carboné hybridé sp2 ou sp3. Le centre .carboné qui est attaqué peut constituer une partie d'une chaîne, d'un noyau ou d'un système cyclique. Some compounds emit light or "go into chemiluminescence" by treatment with high pH peroxide or molecular oxygen. Light is produced by the degradation of a chemical intermediate which is formed by attack of peroxide or molecular oxygen at a sp2 or sp3 hybridized carbon center. The carbon center which is attacked can constitute a part of a chain, of a nucleus or of a cyclic system.

Les caractéristiques et le comportement de certains de ces composés chimioluminescents sont décrits plus en détail par McCapra dans "Chemiluminescence of
Organic Compounds", dans Proqress in Oraanic Chemistrv, volume 8, Carruthers and Sutherland ed. (Wiley & Sons 1973), qui est cité å titre de référence dans le présent mémoire.The characteristics and behavior of some of these chemiluminescent compounds are described in more detail by McCapra in "Chemiluminescence of
Organic Compounds ", in Proqress in Oraanic Chemistrv, volume 8, Carruthers and Sutherland ed. (Wiley & Sons 1973), which is cited for reference in this memoir.

Des composés chimioluminescents ont été utilisés comme marqueurs dans des analyses expérimentales, comprenant des immuno-essais, depuis de nombreuses années. Chemiluminescent compounds have been used as markers in experimental assays, including immunoassays, for many years.

Des exemples d'une telle utilisation peuvent être trouves dans les brevets des Etats-Unis d'Amérique Ne 4 383 031, 4 380 580, 4 226 993 et de nombreux autres brevets.Examples of such use can be found in United States Patent Nos. 4,383,031, 4,380,580, 4,226,993 and many other patents.

Cependant, en général, ces composés n'ont pas été utilisés dans des analyses commerciales en raison de leur manque de stabilité dans des solutions aqueuses. Ce manque de stabilité est particulièrement important pour la souscatégorie de composés chimioluminescents comprenant certains esters, thioesters et amides. Ces composes réagissent conformément à la réaction générale représentée ci-dessous pour les esters

dans laquelle A représente un noyau ou système cyclique aryle et B représente un noyau ou système cyclique hétérocyclique. Les composés de cette sous-catégorie tendent à "perdre leur chimioluminescence" en raison de l'hydrolyse prématurée de la liaison ester, thioester ou amide. Une fois la liaison hydrolysée, le composé n'engendre plus efficacement de chimioluminescence.Si le composé est utilisé comme marqueur dans une analyse, le marqueur perd progressivement sa capacité à entrer en chimioluminescence, donnant ainsi des résultats analytiques non fiables.In general, however, these compounds have not been used in commercial analyzes due to their lack of stability in aqueous solutions. This lack of stability is particularly important for the subcategory of chemiluminescent compounds including certain esters, thioesters and amides. These compounds react in accordance with the general reaction shown below for the esters

wherein A represents an aryl ring or ring system and B represents a heterocyclic ring or ring system. Compounds in this subcategory tend to "lose their chemiluminescence" due to the premature hydrolysis of the ester, thioester or amide bond. Once the bond is hydrolyzed, the compound no longer effectively produces chemiluminescence. If the compound is used as a marker in an analysis, the marker gradually loses its ability to enter chemiluminescence, thus giving unreliable analytical results.

En conséquence, il est souhaitable de proposer des esters, thioesters et amides chimioluminescents, destinés à être utilisés dans des analyses, qui ne soient pas aussi sensibles à l'hydrolyse et présentent ainsi une stabilité accrue en solution aqueuse. Consequently, it is desirable to provide chemiluminescent esters, thioesters and amides, intended for use in analyzes, which are not as sensitive to hydrolysis and thus exhibit increased stability in aqueous solution.

Conformément à la présente invention, il est révélé des analyses par liaison spécifique qui utilisent un composé, c'est-à-dire un groupement, chimioluminescent qui possède une stabilité accrue en solution aqueuse. Le groupement chimioluminescent est un ester, thioester ou amide dans lequel la liaison ester, thioester ou amide est située entre (1) un noyau ou système cyclique hetérocyclique contenant un atome de carbone auquel la liaison est fixée, l'hétéro-atome à l'intérieur du noyau ou système cyclique hétérocyclique étant à un état d'oxydation qui rend cet atome de carbone sensible à l'attaque par un peroxyde ou de l'oxygène moléculaire pour former un intermédiaire qui se dégrade pour engendrer une chimioluminescence, et (2) un noyau ou système cyclique aryle. Le noyau ou système cyclique aryle contient au moins un noyau hexagonal substitué.Le noyau hexagonal substitué porte deux ou plus de deux substituants, dont au moins deux bloquent par encombrement stérique l'hydrolyse de ladite liaison. Un ou plusieurs des substituants qui bloquent par encombrement stérique l'hydrolyse de ladite liaison peuvent être un groupe électrophile. Le noyau hexagonal substitué peut porter un ou plusieurs substituants supplémentaires, en plus des substituants qui bloquent par encombrement stérique l'hydrolyse de la liaison. Ces substituants supplémentaires peuvent également être des groupes électrophiles. According to the present invention, specific binding analyzes are disclosed which use a compound, i.e., a chemiluminescent moiety which has increased stability in aqueous solution. The chemiluminescent group is an ester, thioester or amide in which the ester, thioester or amide bond is located between (1) a heterocyclic ring or ring system containing a carbon atom to which the bond is attached, the hetero atom to the inside the ring or heterocyclic ring system being in an oxidation state which makes this carbon atom sensitive to attack by a peroxide or molecular oxygen to form an intermediate which degrades to generate chemiluminescence, and (2) an aryl ring or ring system. The aryl ring or ring system contains at least one substituted hexagonal ring. The substituted hexagonal ring carries two or more of two substituents, at least two of which hinder hydrolysis of said bond by steric hindrance. One or more of the substituents which block by steric hindrance the hydrolysis of said bond can be an electrophilic group. The substituted hexagonal ring can carry one or more additional substituents, in addition to the substituents which block by steric hindrance the hydrolysis of the bond. These additional substituents can also be electrophilic groups.

L'atome de carbone dans le noyau ou système cyclique hétérocyclique, auquel la liaison est fixée, peut porter egalement un substituant secondaire de formule RnX, dans laquelle X est choisi dans le groupe comprenant O, N,
S et C, R représentant n'importe quel groupe et n étant un nombre choisi de manière que X possède une valence convenable. I1 est décrit d'autres groupements chimioluminescents qui sont caractérisés par la présence d'un noyau ou système cyclique hétérocyclique et d'un substituant secondaire de formule RnX-, la liaison ester, thioester ou amide - étant située entre le noyau ou système cyclique hét8rocyclique et un groupe partant. Les groupements chimioluminescents décrits peuvent également comprendre des substituants en positions péri à l'intérieur du noyau ou système cyclique hétérocyclique.The carbon atom in the heterocyclic ring or ring system, to which the bond is attached, can also carry a secondary substituent of formula RnX, in which X is chosen from the group comprising O, N,
S and C, R representing any group and n being a number chosen so that X has a suitable valence. I1 is described of other chemiluminescent groups which are characterized by the presence of a heterocyclic ring or ring system and of a secondary substituent of formula RnX-, the ester, thioester or amide bond - being located between the ring or heterocyclic ring system and a leaving group. The chemiluminescent groups described can also comprise substituents in positions peri inside the ring or heterocyclic ring system.

De même, conformément à la présente invention, il est décrit des compositions comprenant ces groupements chimioluminescents et des kits analytiques renfermant ces groupements chimioluminescents. Likewise, in accordance with the present invention, there are described compositions comprising these chemiluminescent groups and analytical kits containing these chemiluminescent groups.

D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention ressortiront de la description détaillée qui va suivre, faite en regard des dessins annexés sur lesquels figurent les abréviations suivantes, destinées à identifier différents groupements
"P" représente un ester phénylique d'acridinium
"DM" représente un ester (2,6-diméthyl)- phénylique d'acridinium
"DMC" représente un ester (2,6-diméthoxy-3chlorosulfonyl) phénylique d'acridinium ;
"DM5" représente un ester (2,6-diméthyl-3 chlorosulfonyl) phénylique d'acridinium ;
"DMN" représente un ester (2,6-diméthyl-4nitro)phénylique d'acridinium
"Quat" représente un ester (2,6-diméthyl-4triméthylammonio)phénylique d'acridinium ; acridinium
"DMB" représente un ester (2,6-diméthyl-4bromo)phénylique d'acridinium
"C2" ou "C2NHS" représente un ester 4-(2succinimidylcarboxyéthyl)phénylique d'acridinium ; acridinium
"DME" représente un ester (2,6-diméthoxy-3chlorosulfonyl)phénylique de 9-éthoxy-acridane ; et
"TA" signifie température ambiante.Other characteristics and advantages of the present invention will emerge from the detailed description which follows, given with reference to the appended drawings in which the following abbreviations appear, intended to identify different groupings
"P" represents a phenyl ester of acridinium
"DM" represents a (2,6-dimethyl) - acridinium phenyl ester
"DMC" represents an acridinium (2,6-dimethoxy-3chlorosulfonyl) phenyl ester;
"DM5" represents an acridinium (2,6-dimethyl-3-chlorosulfonyl) phenyl ester;
"DMN" represents an acridinium (2,6-dimethyl-4nitro) phenyl ester
"Quat" represents an acridinium (2,6-dimethyl-4trimethylammonio) phenyl ester; acridinium
"DMB" represents an acridinium (2,6-dimethyl-4bromo) phenyl ester
"C2" or "C2NHS" represents a 4- (2succinimidylcarboxyethyl) phenyl ester of acridinium; acridinium
"DME" represents a (2,6-dimethoxy-3chlorosulfonyl) phenyl ester of 9-ethoxy-acridane; and
"TA" means room temperature.

- La figure 1 est un graphique représentant les résultats de stabilité comparative de différents esters de
N-méthylacridinium dans un tampon au phosphate à pH 6,3, à 35C. - Figure 1 is a graph representing the results of comparative stability of different esters of
N-methylacridinium in a phosphate buffer at pH 6.3, at 35C.

- La figure 2 est un graphique représentant les résultats de stabilité comparative de différents esters de
N-méthylacridinium dans un tampon au phosphate à pH 6,3, à 45 C.- Figure 2 is a graph representing the results of comparative stability of different esters of
N-methylacridinium in a phosphate buffer at pH 6.3, at 45 C.

-La figure 3 est un graphique représentant les résultats de stabilité comparative de différents esters de
N-méthylacridinium dans un tampon au phosphate à pH 8,0, à 35 C.FIG. 3 is a graph representing the results of comparative stability of different esters of
N-methylacridinium in phosphate buffer at pH 8.0 at 35 C.

- La figure 4 est un graphique représentant les résultats de stabilité comparative de différents esters de N-methylacridinium dans un tampon au phosphate à pH 8,0, à 45 C. - Figure 4 is a graph representing the results of comparative stability of different N-methylacridinium esters in a phosphate buffer at pH 8.0, at 45 C.

- La figure 5 est un graphique représentant les résultats de stabilité comparative de conjugués IgG-esters
DMN, DMC et C2NHS dans un tampon standard au phosphate à pH 6,3, à 4 C. - Figure 5 is a graph showing the results of comparative stability of IgG-ester conjugates
DMN, DMC and C2NHS in standard phosphate buffer at pH 6.3 at 4 C.

- La figure 6 est un graphique représentant les resultats de stabilité comparative de conjugués IgG-esters DXN, DMC et C2NHS dans un tampon standard au phosphate à pH 7,3, à 4 C. - Figure 6 is a graph representing the results of comparative stability of IgG-DXN, DMC and C2NHS conjugates in a standard phosphate buffer at pH 7.3, at 4 C.

- La figure 7 est un graphique représentant les résultats de stabilité comparative de conjugués IgG-esters
DMN, DMC et C2NHS dans un tampon standard au phosphate à pH 8,0, à 4 C.- Figure 7 is a graph showing the results of comparative stability of IgG-ester conjugates
DMN, DMC and C2NHS in standard phosphate buffer at pH 8.0 at 4 C.

- La figure 8 est un graphique représentant les résultats de stabilité comparative de conjugués IgG-esters
DMN, DMC et C2NHS dans un tampon standard au phosphate, en l'absence d'IgG de mouton, à pH 6,3, à 4 C. - Figure 8 is a graph showing the results of comparative stability of IgG-ester conjugates
DMN, DMC and C2NHS in standard phosphate buffer, in the absence of sheep IgG, pH 6.3, at 4 C.

- La figure 9 est un graphique représentant les résultats de stabilité comparative de conjugués IgG-esters
DMN, DMC et C2NHS dans un tampon standard au phosphate, en l'absence d'IgG de mouton, à pH 7,3, à 4C. - Figure 9 is a graph showing the results of comparative stability of IgG-ester conjugates
DMN, DMC and C2NHS in standard phosphate buffer, in the absence of sheep IgG, pH 7.3, at 4C.

- La figure 10 est un graphique représentant les résultats de stabilité comparative de conjugués IgGesters DMN, DMC et C2NHS dans un tampon standard au phosphate, en l'absence d'IgG de mouton, à pH 8,0, à 4 C. - Figure 10 is a graph showing the results of comparative stability of IgGesters DMN, DMC and C2NHS conjugates in standard phosphate buffer, in the absence of sheep IgG, at pH 8.0, at 4 C.

- La figure ll est un graphique représentant les résultats de stabilité comparative de conjugués IgGesters DMN, DMC et C2NHS dans un tampon standard au phosphate, en l'absence d'IgG de mouton et en présence de 0,1% de sérum-albumine bovine (à la place de la sérumalbumine humaine) à pH 6,3, à 4-C. FIG. 11 is a graph representing the results of comparative stability of IgGesters DMN, DMC and C2NHS conjugates in a standard phosphate buffer, in the absence of sheep IgG and in the presence of 0.1% bovine serum albumin (in place of human serum albumin) at pH 6.3, at 4-C.

- La figure 12 est un graphique représentant les résultats de stabilité comparative de conjugués IgGesters DMN, DMC et C2NHS dans un tampon standard au phosphate, en l'absence d'IgG de mouton et en présence de 0,1% de sérum-albumine bovine (å la place de la sérum albumine humaine) à pH 7,3, à 4'C. - Figure 12 is a graph showing the results of comparative stability of IgGesters DMN, DMC and C2NHS conjugates in standard phosphate buffer, in the absence of sheep IgG and in the presence of 0.1% bovine serum albumin (in place of human albumin serum) at pH 7.3, at 4 ° C.

- La figure 13 est un graphique représentant les résultats de stabilité comparative de conjugués IgGesters DMN, DMC- et C2NHS dans un tampon standard au phosphate, en l'absence d'IgG de mouton et en présence de 0,1% de sérum-albumine bovine (à la place de la sérumalbumine humaine) à pH 8,0, à 4 C. - Figure 13 is a graph showing the results of comparative stability of IgGesters DMN, DMC- and C2NHS conjugates in standard phosphate buffer, in the absence of sheep IgG and in the presence of 0.1% serum albumin bovine (in place of human serum albumin) at pH 8.0, at 4 C.

- La figure 14 est un graphique représentant les résultats de stabilité comparative du conjugué ester
C2NHS-IgG dans un tampon standard au phosphate à température ambiante, à pH 6,3, 7,3 et 8,0.- Figure 14 is a graph showing the results of comparative stability of the ester conjugate
C2NHS-IgG in standard phosphate buffer at room temperature, pH 6.3, 7.3 and 8.0.

- La figure 15 est un graphique représentant les résultats de stabilité comparative du conjugué DMN-IgG dans un tampon standard au phosphate à température ambiante, à pH 6,3, 7,3 et 8,0. FIG. 15 is a graph representing the results of comparative stability of the DMN-IgG conjugate in a standard phosphate buffer at room temperature, at pH 6.3, 7.3 and 8.0.

- La figure 16 est un graphique représentant les résultats de stabilité comparative du conjugué DMC-IgG dans un tampon standard au phosphate à température ambiante, à pH 6,3, 7,3 et 8,0. - Figure 16 is a graph showing the results of comparative stability of the DMC-IgG conjugate in a standard phosphate buffer at room temperature, pH 6.3, 7.3 and 8.0.

- La figure 17 est un graphique représentant les résultats de stabilité comparative du conjugué ester
C2NHS-IgG dans un tampon standard au phosphate à 37 C, à pH 6,3, 7,3 et 8,0.- Figure 17 is a graph showing the results of comparative stability of the ester conjugate
C2NHS-IgG in standard phosphate buffer at 37 C, pH 6.3, 7.3 and 8.0.

- La figure 18 est un graphique représentant les résultats de stabilité comparative du conjugué DMC-IgG dans un tampon standard au.phosphate à 37'C, à pH 6,3, 7,3 et 8,0. FIG. 18 is a graph representing the results of comparative stability of the DMC-IgG conjugate in a standard phosphate buffer at 37 ° C., at pH 6.3, 7.3 and 8.0.

- La figure 19 est un graphique représentant les résultats de stabilité comparative du conjugué DMN-IgG (produit avec un excès molaire de marqueur égal à 20x) dans un tampon standard au phosphate à 37*C, à pH 6,3, 7,3 et 8,0. FIG. 19 is a graph representing the results of comparative stability of the DMN-IgG conjugate (produced with a molar excess of marker equal to 20 ×) in a standard phosphate buffer at 37 ° C., at pH 6.3, 7.3 and 8.0.

- la figure 20 est un graphique représentant les résultats de stabilité comparative du conjugué DMN-IgG (produit avec un excès molaire, de marqueur égal à 5x) dans du tampon standard au phosphate à 37-C, à pH 6,3, 7,3 et 8,0. FIG. 20 is a graph representing the results of comparative stability of the DMN-IgG conjugate (produced with a molar excess, of marker equal to 5 ×) in standard phosphate buffer at 37 ° C., at pH 6.3, 7, 3 and 8.0.

- La figure 21 est un graphique représentant les résultats de stabilité comparative de conjugués esters
DMN, DMC et C2NHS-IgG dans un tampon à l'azide à pH 6,9, à 37 C.- Figure 21 is a graph representing the results of comparative stability of ester conjugates
DMN, DMC and C2NHS-IgG in an azide buffer at pH 6.9, at 37 C.

- La figure 22 est un graphique représentant les résultats de stabilité comparative de conjugués esters
DMN, DMC et C2NHS-IgG dans un tampon à l'azide à pH 7,0, à 37 C. - Figure 22 is a graph representing the results of comparative stability of ester conjugates
DMN, DMC and C2NHS-IgG in azide buffer at pH 7.0 at 37 C.

- La figure 23 est un graphique représentant les résultats de stabilité comparative de conjugués esters
DMN, DMC et C2NHS-IgG dans un tampon à l'azide à pH 7,3, à 37 C.- Figure 23 is a graph representing the results of comparative stability of ester conjugates
DMN, DMC and C2NHS-IgG in azide buffer at pH 7.3 at 37 C.

- La figure 24 est un graphique représentant les résultats de stabilité comparative de conjugués esters
DMN, DMC et C2NHS-IgG dans un tampon à l'azide à pH 8,0, à 37 C.- Figure 24 is a graph showing the results of comparative stability of ester conjugates
DMN, DMC and C2NHS-IgG in azide buffer at pH 8.0 at 37 C.

- La figure 25 est un graphique représentant les résultats de stabilité comparative de conjugués esters
DMN, DMC et C2NHS-IgG dans un tampon à l'azide à pH 6,3, à 37 C. - Figure 25 is a graph showing the results of comparative stability of ester conjugates
DMN, DMC and C2NHS-IgG in azide buffer at pH 6.3 at 37 C.

- La figure 26 est un graphique représentant les résultats de stabilité comparative de conjugués esters
DMN et C2NHS-IgG dans un tampon à l'azide à pH 5,9, à température ambiante et à 4 C.- Figure 26 is a graph representing the results of comparative stability of ester conjugates
DMN and C2NHS-IgG in an azide buffer at pH 5.9, at room temperature and at 4 C.

- La figure 27 est un graphique représentant les résultats de stabilité comparative d'esters phénylique, (2,6-diméthyl)phénylique et (2, 6-diméthyl-4-nitro) phényli- que de N-méthyl-acridane dans un tampon au phosphate à pH 6,3, à 35 C. FIG. 27 is a graph representing the results of comparative stability of phenyl, (2,6-dimethyl) phenyl and (2,6-dimethyl-4-nitro) phenyl esters of N-methyl-acridane in a buffer with phosphate at pH 6.3, at 35 C.

- La figure 28 est un graphique représentant les résultats de stabilité comparative d'esters phénylique, (2,6-diméthyl)phénylique et et (2,6-diméthyl-4-nitro)phényli- que de N-méthyl-acridane dans un tampon au phosphate a pH 6,3, à 45 C. FIG. 28 is a graph representing the results of comparative stability of phenyl, (2,6-dimethyl) phenyl and and (2,6-dimethyl-4-nitro) phenyl esters of N-methyl-acridane in a phosphate buffer at pH 6.3, at 45 C.

- La figure 29 est un graphique représentant les résultats de stabilité comparative d'esters phénylique, (2, 6-diméthyl)phénylique et (2,6-diméthyl-4-nitro)phényli- que de N-méthyl-acridane dans un tampon au phosphate à pH 8,0, à 35 C. FIG. 29 is a graph representing the results of comparative stability of phenyl, (2,6-dimethyl) phenyl and (2,6-dimethyl-4-nitro) phenyl esters of N-methyl-acridane in a buffer with phosphate at pH 8.0, at 35 C.

- La figure 30 est un graphique représentant les résultats de stabilité comparative d'esters phénylique, (2,6-diméthyl)phénylique et (2,6-diméthyl-4-nitro)phénylique de N-méthyl-acridane dans un tampon au phosphate à pH 8,0, à 45'C. - Figure 30 is a graph showing the results of comparative stability of phenyl, (2,6-dimethyl) phenyl and (2,6-dimethyl-4-nitro) phenyl esters of N-methyl-acridane in phosphate buffer at pH 8.0, at 45 ° C.

- La figure 31 est un spectre UV-lumière visible du N-méthyl-acridane-9-éthoxy-9-carboxylate de (2,6-diméthoxy-3-chlorosulfonyl)phényle. - Figure 31 is a visible UV-light spectrum of N-methyl-acridane-9-ethoxy-9-carboxylate of (2,6-dimethoxy-3-chlorosulfonyl) phenyl.

- La figure 32 est un spectre de masse par bombardement atomique rapide du N-méthyl-acridane-9-éthoxy9-carboxylate de (2,6-diméthoxy-3-chlorosulfonyl)phényle. - Figure 32 is a mass spectrum by rapid atomic bombardment of N-methyl-acridane-9-ethoxy9-carboxylate of (2,6-dimethoxy-3-chlorosulfonyl) phenyl.

La figure 33 est un spectre RMN des protons à 300 MHZ du N-méthyl-acridane-9-méthoxy-9-carboxylat de (2,6-diméthoxy-3-chlorosulfonyl)phényle. FIG. 33 is an NMR spectrum of the protons at 300 MHz of the N-methyl-acridane-9-methoxy-9-carboxylate of (2,6-dimethoxy-3-chlorosulfonyl) phenyl.

- La figure 34 est un spectre RMN des protons à 300 MHz du N-méthyl-acridane-9-méthoxy-9-carboxylate de (2,6-diméthyl-3-chlorosulfonyl)phényle. - Figure 34 is an NMR spectrum of protons at 300 MHz of N-methyl-acridane-9-methoxy-9-carboxylate of (2,6-dimethyl-3-chlorosulfonyl) phenyl.

- La figure 35 est un graphique d'une analyse d'échantillons de TSH de référence utilisant comme marqueur du N-méthyl-acridane-9-éthoxy-9-carboxylate de (2,6diméthoxy-3-chlorosulfonyl)phényle. - Figure 35 is a graph of an analysis of reference TSH samples using as marker (2,6-dimethoxy-3-chlorosulfonyl) phenyl N-methyl-acridane-9-ethoxy-9-carboxylate.

- La figure 36 est un graphique représentant les résultats de stabilité comparative du DMC et du DME dans un tampon au bicarbonate (0,1M de bicarbonate, 9,6, à 25-C. - Figure 36 is a graph showing the results of comparative stability of DMC and DME in bicarbonate buffer (0.1M bicarbonate, 9.6, at 25-C.

- la figure 37 est un graphique représentant les résultats de stabilité comparative de conjugués DMC et DNE-TSH dans un tampon de dilution renfermant un anticorps anti-TSH (100mM de phosphate, 150mM de NaCl, 0,001% de
Thimerosal, 0,4% de sérum-albumine bovine, 0,1 mg/ml de gamma-globuline murine, 0,1 mg/ml de gamma-globuline de chèvre) à pH 6,0, à 25C. FIG. 37 is a graph representing the results of comparative stability of DMC and DNE-TSH conjugates in a dilution buffer containing an anti-TSH antibody (100 mM of phosphate, 150 mM of NaCl, 0.001% of
Thimerosal, 0.4% bovine serum albumin, 0.1 mg / ml murine gamma globulin, 0.1 mg / ml goat gamma globulin) at pH 6.0, at 25C.

- La figure 38 est un graphique représentant les résultats de stabilité comparative de conjugués DMC et
DME-TSH dans un tampon de dilution renfermant un anticorps anti-TSH, à pH 6,0, à 30 C.FIG. 38 is a graph representing the results of comparative stability of DMC conjugates and
DME-TSH in a dilution buffer containing an anti-TSH antibody, pH 6.0, at 30 C.

- La figure 39 est un graphique représentant les résultats de stabilité comparative de conjugués DMC et
DME-TSH dans un tampon de dilution renfermant un anticorps anti-TSH a pH 6,0, à 35 C; et
- La figure 40 est un spectre RMN des protons à 300 MHz du 1,3-diméthyl-N-méthyl-acridane-9-méthoxy-9- carboxylate de phényle.FIG. 39 is a graph representing the results of comparative stability of DMC conjugates and
DME-TSH in a dilution buffer containing an anti-TSH antibody at pH 6.0, at 35 C; and
- Figure 40 is an NMR spectrum of protons at 300 MHz of phenyl 1,3-dimethyl-N-methyl-acridane-9-methoxy-9-carboxylate.

Les groupements chimioluminescents de la présente invention répondent a l'une ou l'autre des deux formules schématiques suivantes

The chemiluminescent groups of the present invention correspond to one or the other of the following two schematic formulas

Dans les formules schématiques, la partie "L" encadrée par des pointillés contient la "liaison" ester, thioester ou amide qui est située entre deux noyaux ou systèmes cycliques substitués représentés par le cercle désigné par "Q" et le cadre en traits pleins désigné par "R3". La nature de la liaison L, qu'il s'agisse d'un ester, d'un thioester ou d'un amide, est déterminée par la nature de
R4, représentant respectivement -O-, -S- ou -N(S02CF3). De préférence, la liaison est une liaison ester.In the schematic formulas, the part "L" framed by dotted lines contains the "bond" ester, thioester or amide which is located between two nuclei or substituted cyclic systems represented by the circle designated by "Q" and the frame in solid lines designated with "R3". The nature of the L bond, whether it is an ester, a thioester or an amide, is determined by the nature of
R4, representing respectively -O-, -S- or -N (S02CF3). Preferably, the bond is an ester bond.

Q est un noyau ou système cyclique hétérocyclique auquel la liaison ester, thioester ou amide L est fixée au niveau d'un atome de carbone a l'intérieur du noyau ou système cyclique hétérocyclique qui (1) est hybridé sp2, sp3 et (2) est sensible à une attaque par un peroxyde ou de l'oxygène moléculaire pour former un intermédiaire qui se dégrade pour engendrer une chimioluminescence. La possibilité de rendre sensible l'atome de carbone à une telle attaque est déterminée par l'état d'oxydation de l'hétéro- atome à l'intérieur du noyau ou système cyclique hétérocyclique.Si l'atome de carbone auquel la liaison est fixée est hybridé sp2, l'hétéro-atome doit être à un état positif d'oxydation (ctest-à-dire avoir une charge positive ; par exemple, telle qu'elle est obtenue par une
N-alkylation ou N-oxydation). Si l'atome de carbone auquel est fixée la liaison est hybridé sp3, l'hétéro-atome doit être a l'état neutre d'oxydation (c'est-à-dire dépourvu de charge).Lorsque l'hétéro-atome est l'azote, des états convenables d'oxydation peuvent seulement être atteints si l'atome d'azote est substitué avec un groupe alkyle (y compris un groupe fonctionnalisé), un groupe aryle (y compris un groupe fonctionnalisé), un groupe O- (si l'atome d'azote est à un état positif d'oxydation) ou OH (si l'atome d'azote est à l'état neutre d'oxydation). Lorsque l'hétéro-atome est à ses états "convenable" d'oxydation, l'atome de carbone est sensible à l'attaque par un peroxyde ou de l'oxygène moléculaire pour produire l'intermédiaire chimioluminescent.Q is a heterocyclic ring or ring system to which the ester, thioester or amide bond L is attached at the level of a carbon atom inside the heterocyclic ring or ring system which (1) is hybridized sp2, sp3 and (2) is sensitive to attack by a peroxide or molecular oxygen to form an intermediate which degrades to generate chemiluminescence. The possibility of making the carbon atom sensitive to such an attack is determined by the oxidation state of the hetero atom inside the heterocyclic ring or ring system. If the carbon atom to which the bond is fixed is sp2 hybridized, the hetero atom must be in a positive oxidation state (i.e. have a positive charge; for example, as obtained by a
N-alkylation or N-oxidation). If the carbon atom to which the bond is attached is sp3 hybridized, the hetero atom must be in the neutral oxidation state (i.e. free of charge). When the hetero atom is nitrogen, suitable oxidation states can only be reached if the nitrogen atom is substituted with an alkyl group (including a functionalized group), an aryl group (including a functionalized group), an O- group (if the nitrogen atom is in a positive oxidation state) or OH (if the nitrogen atom is in the neutral oxidation state). When the hetero atom is in its "suitable" oxidation states, the carbon atom is sensitive to attack by a peroxide or molecular oxygen to produce the chemiluminescent intermediate.

Des noyaux ou systèmes cycliques hétérocycliques dans lesquels l'hétéro-atome est à un état positif d'oxydation comprennent, sans limitation, l'acridinium, le benz (a)acridinium, le benz(b)acridinium, le benz [c) acridi- nium, un cation 1,2,4-triazole, un cation isoxazole, un cation isothiazole, un cation 1,2-azole, un cation imidazole, un cation benzimidazole, le quinolinium, l'isoquinolinium, le quinolizinium, un quinolinium à substitution cyclique, le pyridinium, le pyrimidinium, le pyridazinium, le pyrazinium, le phénanthridinium et le quinoxalinium. Des noyaux ou systèmes cycliques dans lesquels 1'hétéro-atome est a l'état neutre d'oxydation comprennent les formes réduites des noyaux ou systèmes cycliques précités.Ces noyaux ou systèmes cycliques sont dérivés des noyaux ou systèmes cycliques suivants
Série de l'acridine Série de l'azole

Heterocyclic rings or rings in which the hetero atom is in a positive oxidation state include, without limitation, acridinium, benz (a) acridinium, benz (b) acridinium, benz [c) acridi - nium, a 1,2,4-triazole cation, an isoxazole cation, an isothiazole cation, a 1,2-azole cation, an imidazole cation, a benzimidazole cation, quinolinium, isoquinolinium, quinolizinium, quinolinium to cyclic substitution, pyridinium, pyrimidinium, pyridazinium, pyrazinium, phenanthridinium and quinoxalinium. Ring or ring systems in which the hetero atom is in the neutral oxidation state include the reduced forms of the above ring or ring systems. These ring or ring systems are derived from the following ring or ring systems
Acridine series Azole series

Acridine

Acridine

Brenz[a]acridine

Brenz [a] acridine

Benz[b]acridine

Benz [b] acridine

Benz[c]acridine

1,2,4-triazole

Isoxazole

Benz [c] acridine

1,2,4-triazole

Isoxazole

Isothiazole

1,2-azole

Imidazole

Isothiazole

1,2-azole

Imidazole

Benzimidazole
Série de la quinoléine

Benzimidazole
Quinoline series

Quinoléine

Quinoline

Isoquinoléine

Isoquinoline

Cations quinolinium

Quinolinium cations

Quinoléines à substitution cyclique en C3, C4, C5
Série de la pyridine/pyrimidine Divers

C3, C4, C5 cyclically substituted quinolines
Miscellaneous Pyridine / Pyrimidine Series

Pyridine

Pyridine

Pyrimidine

Pyrimidine

Pyridazine

Pirazines

Pyridazine

Pirazines

Phénanthridine

Phenanthridine

Quinoxaline
Le noyau ou système cyclique hétérocylique peut être dépourvu de substituants accessoires, non représentés sur les formules schématiques. En variante, le noyau ou système cyclique hétérocyclique peut être substitué facultativement à n'importe quelle position, y compris sur l'hetero-atome, avec des groupes représentés sur la formule schématique. Ces noyaux et systèmes cycliques, qu'ils soient facultativement substitués ou bien dépourvus de ces substituants accessoires, sont considérés dans la présente invention comme étant désignés par l'expression "noyau ou système cyclique hétérocyclique".Quinoxaline
The heterocylic ring or ring system can be devoid of accessory substituents, not shown in the schematic formulas. Alternatively, the heterocyclic ring or ring system may be optionally substituted at any position, including on the hetero atom, with groups represented in the schematic formula. These rings and ring systems, whether they are optionally substituted or devoid of these accessory substituents, are considered in the present invention as being designated by the expression "ring or heterocyclic ring system".

Les substitutions accessoires possibles peuvent être fonctionnelles ou non fonctionnelles. Les substitutions accessoires fonctionnelles comprennent celles destinées à produire des interactions péri autour de la liaison L, accroître la solubilité du groupement, accroître l'efficacité de chimioluminescence du groupement et, de préférence, fixer le groupement à une protéine ou à une autre matière. Des groupes utiles pour la fixation du groupement a une protéine ou une autre matière comprennent, mais à titre non limitatif, des chaînes alkyle, alcényle, alcynyle, alkylamino, oxoalkyle, thioalkyle ou alkyloxocarbonyle (ramifiées ou non ramifiées), facultativement fonctionnalisées, ou des groupes aryle facultativement fonctionnalisées. Les groupes aryle peuvent être reliés aux noyaux ou systèmes cycliques hétérocycliques par une chaîne alkyle, alcényle, alcynyle, alkylamino, oxoalkyle, thioalkyle ou alkyloxocarbonyle. D'autres chaînes, en plus de celles énumérées, sont bien connues dans la pratique. Possible accessory substitutions may be functional or non-functional. Functional accessory substitutions include those intended to produce peri-interactions around the L-bond, increase the solubility of the moiety, increase the chemiluminescence efficiency of the moiety, and preferably attach the moiety to a protein or other material. Groups useful for attaching the moiety to a protein or other material include, but are not limited to, optionally functionalized, branched or unbranched alkyl, alkenyl, alkynyl, alkamyl, alkylamino, oxoalkyl, thioalkyl or alkyloxocarbonyl chains, or optionally functionalized aryl groups. The aryl groups can be linked to the rings or heterocyclic ring systems by an alkyl, alkenyl, alkynyl, alkylamino, oxoalkyl, thioalkyl or alkyloxocarbonyl chain. Other chains, in addition to those listed, are well known in the art.

Des fonctionnalités accessoires comprennent, à titre non limitatif, n'importe laquelle des fonctionnalités suivantes
-CO2R, dans laquelle R représente un atome d'hydrogène, un groupe alkyle ou aryle

Ancillary features include, but are not limited to, any of the following features
-CO2R, in which R represents a hydrogen atom, an alkyl or aryl group

dans laquelle R représente un résidu d'un alcool fonctionnel
-S02C1
-NCS

in which R represents a residue of a functional alcohol
-S02C1
-NCS

- N(CH3)(CH2)mCl, dans laquelle m est supérieur ou égal à 1
- N3 et d'autres fonctionnalités photolabiles
- NH2, ou des ions, des sucres, des polyamines et des composés polyoxyliques (par exemple polyoxyéthylène, polyoxybutylène, etc.). D'autres chaînes, groupes et fonctionnalités utiles pour la fixation des composés de la présente invention à une protéine sont décrits par Ji dans "Bifunctional Reagents", Meth. Enzymology 91:580 (1983), qui est cité å titre de référence dans le présent mémoire.Des procédés de jonction de ces groupes de fixation à une protéine et à d'autres matières utilisent la liaison covalente et des forces chimiques faibles et sont bien connues dans la pratique.- N (CH3) (CH2) mCl, in which m is greater than or equal to 1
- N3 and other photolabile functionalities
- NH2, or ions, sugars, polyamines and polyoxylic compounds (for example polyoxyethylene, polyoxybutylene, etc.). Other chains, groups and functionalities useful for binding the compounds of the present invention to a protein are described by Ji in "Bifunctional Reagents", Meth. Enzymology 91: 580 (1983), which is cited for reference herein. Methods of joining these binding groups to protein and other materials use covalent bonding and weak chemical forces and are well known in practice.

Les substituants péri, qui peuvent provoquer des interactions péri, comprennent n'importe quel groupe qui peut provoquer un encombrement stérique par rapport à l'atome de carbone auquel la liaison ester, thioester ou amide est fixée et/ou par rapport à l'atome de carbone à l'intérieur de la liaison ester, thioester ou amide. Les substituants péri préférés comprennent des groupes alkyle courts (par exemple méthyle, éthyle) et des groupes aryle (par exemple phényle). Les substituants péri, s'ils sont présents, sont situés sur des atomes de carbone à l'intérieur du noyau ou système cyclique hétérocyclique qui sont "adjacents" à l'atome de carbone auquel la liaison ester, thioester ou amide est fixée. Les groupements peuvent comprendre plus d'un substituant péri.Par exemple, des substituants péri peuvent être placés dans les positions suivantes
(a) dans des acridiniums et acridanes : sur C1
et C8
(b) dans des phénanthridiniums et phénanthridi
niums réduits : sur C7 ; et
(c) dans des quinoliniums et quinoliniums
réduits : sur C3.Peri substituents, which can cause peri interactions, include any group which can cause steric hindrance from the carbon atom to which the ester, thioester or amide bond is attached and / or from the atom of carbon inside the ester, thioester or amide bond. Preferred peri substituents include short alkyl groups (e.g. methyl, ethyl) and aryl groups (e.g. phenyl). The peri substituents, if present, are located on carbon atoms within the heterocyclic ring or ring system which are "adjacent" to the carbon atom to which the ester, thioester or amide bond is attached. Groupings can include more than one peri substituent; for example, peri substituents can be placed in the following positions
(a) in acridiniums and acridanes: on C1
and C8
(b) in phenanthridiniums and phenanthrid
reduced niums: on C7; and
(c) in quinoliniums and quinoliniums
reduced: on C3.

Le noyau ou système cyclique aryle, représenté par R3, comprend au moins un noyau hexagonal substitué. La liaison ester, amide ou thioester est directement fixée à ce noyau hexagonal. R3 peut représenter, mais à titre non limitatif, les groupes phényle, naphtalène et anthracène, qui répondent aux formules structurales suivantes

The aryl ring or ring system, represented by R3, comprises at least one substituted hexagonal ring. The ester, amide or thioester bond is directly attached to this hexagonal nucleus. R3 can represent, but is not limited to, phenyl, naphthalene and anthracene groups, which correspond to the following structural formulas

Naphtalène

Naphthalene

Anthracènes

Anthracene

Phényle
R3 peut être substitué à n'importe quelle position, y compris, mais à titre non limitatif, aux positions décrites ci-dessous pour Rl, R2 et R2'. Une substitution, y compris
R1, R2 et R2', peut également être utilisée pour fixer le groupement à une protéine ou une autre matière. Des groupes appropriés à cet effet sont décrits ci-dessous.Phenyl
R3 can be substituted at any position, including, but not limited to, the positions described below for R1, R2 and R2 '. A substitution, including
R1, R2 and R2 ', can also be used to attach the group to a protein or other material. Suitable groups for this purpose are described below.

R2 et R2' sont des groupes volumineux qui sont situés sur R3 de manière à empêcher par encombrement stérique l'hydrolyse de la liaison L entre R3 et le noyau ou système cyclique hétérocyclique Q. De préférence, lorsque R3 est un noyau phényle avec la liaison ester fixée en position 1, R2 et R2' sont situés en positions 2 et 6 (ortho).R2 et R2' peuvent être identiques ou différer l'un de l'autre, l'un ou l'autre pouvant représenter
un groupe alkyle ou un groupe alkyle faculta
tivement fonctionnalisé
un groupe aryle ou un groupe aryle facultative
ment fonctionnalisé
- un groupe OR, dans lequel R représente un
groupe alkyle ou aryle
- un groupe NR2, dans lequel R représente un
groupe alkyle ou aryle
- un groupe NR3+, dans lequel R représente un
groupe alkyle ou aryle
- un groupe COO
- un groupe COOH
- un groupe COOR, dans lequel R représente un
groupe alkyle ou aryle
- un groupe COR, dans lequel R représente un
groupe alkyle ou aryle
- un groupe (CF2)nCF3, dans lequel n a une
valeur de 0 à 10
- un groupe CN
- un groupe NH3+
- un groupe NO2
- un groupe N(CH3)3+
- un groupe SR, dans lequel R représente un
groupe alkyle ou aryle
- un groupe SR2+, dans lequel R représente un
groupe alkyle ou aryle
- un groupe S02R, dans lequel R représente un
groupe alkyle ou aryle
un halogène.R2 and R2 'are large groups which are located on R3 so as to prevent by steric hindrance the hydrolysis of the bond L between R3 and the heterocyclic ring or ring system Q. Preferably, when R3 is a phenyl ring with the link ester fixed in position 1, R2 and R2 'are located in positions 2 and 6 (ortho). R2 and R2' may be the same or differ from each other, either of which may represent
an alkyl group or an optional alkyl group
tively functionalized
an aryl group or an optional aryl group
functionally functional
- an OR group, in which R represents a
alkyl or aryl group
- a group NR2, in which R represents a
alkyl or aryl group
- a group NR3 +, in which R represents a
alkyl or aryl group
- a COO group
- a COOH group
- a COOR group, in which R represents a
alkyl or aryl group
- a COR group, in which R represents a
alkyl or aryl group
- a group (CF2) nCF3, in which has a
value from 0 to 10
- a CN group
- an NH3 + group
- a NO2 group
- a group N (CH3) 3+
- a group SR, in which R represents a
alkyl or aryl group
- a group SR2 +, in which R represents a
alkyl or aryl group
- a group S02R, in which R represents a
alkyl or aryl group
halogen.

L'encombrement stérique requis peut également être fourni par d'autres noyaux à l'intérieur d'un groupement R3 polycyclique, qui sont "adjacents" au noyau hexagonal auquel la liaison ester est fixée. Par exemple, si R3 représente un groupe naphtalène et si une liaison ester est fixée en position 1, R2 peut être un groupe méthyle en position 2 et R2' est le noyau "adjacent" contenant 7 à 10 atomes de carbone. Dans de tels cas, le noyau adjacent est considéré dans la présente invention comme étant un substituant (sur le noyau hexagonal à l'intérieur de R3) qui bloque par encombrement stérique l'hydrolyse de la liaison. The steric hindrance required may also be provided by other nuclei within a polycyclic R3 group, which are "adjacent" to the hexagonal nucleus to which the ester link is attached. For example, if R3 represents a naphthalene group and if an ester bond is attached in position 1, R2 can be a methyl group in position 2 and R2 'is the "adjacent" nucleus containing 7 to 10 carbon atoms. In such cases, the adjacent nucleus is considered in the present invention to be a substituent (on the hexagonal nucleus inside R3) which blocks the hydrolysis of the bond by steric hindrance.

R1 peut être tout groupe électrophile sur R3, mais est de préférence choisi entre -No2, -SO2Cl, -Br, -N(CH3)3+ et -H. Telle qu'elle est utilisée tout au long de ce mémoire descriptif et des revendications annexées, l'expression "groupe électrophile" désigne tout groupe qui possède une valeur sigmap supérieure ou égale à 0,0. Des tables de valeurs sigmap pour différents groupes peuvent être trouvées dans l'article de Hansch et collaborateurs,
J. Med. Chem. 16(11):1209-1213 (1977) et l'article de
Hansch et Leo, "Substituent Constants for Correlation
Analysis in Chemistry and Biology", ch. 6, pp. 49-52 (John
Wiley & Sons, New York 1979), tous deux étant cités à titre de référence dans le présent mémoire.R1 can be any electrophilic group on R3, but is preferably chosen between -No2, -SO2Cl, -Br, -N (CH3) 3+ and -H. As used throughout this specification and the appended claims, the term "electrophilic group" refers to any group which has a sigmap value greater than or equal to 0.0. Tables of sigmap values for different groups can be found in the article by Hansch et al,
J. Med. Chem. 16 (11): 1209-1213 (1977) and the article by
Hansch and Leo, "Substitute Constants for Correlation
Analysis in Chemistry and Biology ", ch. 6, pp. 49-52 (John
Wiley & Sons, New York 1979), both of which are cited as references in this brief.

Pour certains groupements, R1 et l'un des groupes R2 et R2', ou bien ces deux groupes, sont des groupes électrophiles (qui peuvent être identiques ou différents l'un de l'autre). Si plus d'un groupe parmi R1,
R2 et R2' sont des groupes électrophiles, il est préféré que la valeur sigmap additive pour les seuls groupes qui sont des groupes électrophiles (c'est-à-dire en excluant les groupes ayant des valeurs de sigmap inférieures à 0,0) soit inférieure ou égale à environ 1,0. Certains groupements ayant une valeur sigmap additive supérieure à 1,0 sont instables.For certain groups, R1 and one of the groups R2 and R2 ′, or else these two groups, are electrophilic groups (which may be the same or different from each other). If more than one group among R1,
R2 and R2 'are electrophilic groups, it is preferred that the additive sigmap value for the only groups which are electrophilic groups (i.e. excluding groups with sigmap values less than 0.0) be less than or equal to about 1.0. Some groupings with an additive sigmap value greater than 1.0 are unstable.

Les groupements de la présente invention peuvent également être fixés à une protéine ou à une autre matière par des substituants sur R3. Certains groupes électrophiles peuvent être utilisés comme moyens de fixation. Parmi les groupes électrophiles appréciés, un groupe 502 Cl peut être utilisé pour fixer un groupement à. The groups of the present invention can also be attached to a protein or another material by substituents on R3. Certain electrophilic groups can be used as fixing means. Among the preferred electrophilic groups, a 502 Cl group can be used to attach a group to.

une protéine ou une autre matière. En variante, n'importe lequel des groupes précités pour la fixation au noyau ou système cyclique hétérocyclique Q peut également être utilisé s'il peut être fixé à titre de substituant du groupe R3. Des procédés de jonction de ces groupes de fixation à une protéine et à d'autres matières utilisent à la fois la liaison covalente et des forces chimiques faibles et sont bien connus dans la pratique.protein or other matter. Alternatively, any of the above groups for attachment to the ring or heterocyclic ring system Q may also be used if it can be attached as a substituent of the group R3. Methods of joining these binding groups to protein and other materials use both covalent bonding and weak chemical forces and are well known in the art.

Dans la formule schématique II ci-dessus, Z représente un substituant secondaire fixé à l'atome de carbone auquel la liaison ester, thioester ou amide est fixée lorsque cet atome de carbone est hybridé sp3. Z peut représenter, mais à titre non limitatif
-H
- un halogène
- CN
- OR
- NR2
- NR3+
- SR - SR2+
- S2R
- NRCO2R
- NHNR2
- NRNR2
- NHOR
- ONR2
- CR(CN)2
- CR(COR)2
- CR2N 2
- CsCOR
En général, outre un atome d'hydrogène et un halogène, Z peut représenter n'importe quel groupe nucléophile de formule générale RnX, dans laquelle X représente O, N, S ou C (avec des variations appropriées de n pour tenir compte des variations de valence dans X) et dans laquelle
R représente n'importe quel substituant (de préférence un groupe alkyle, un groupe aryle, un amino-acide ou un sucre, facultativement substitué), plusieurs groupes R pouvant facultativement former des structures cycliques (par exemple dans les groupes Z :

In the schematic formula II above, Z represents a secondary substituent attached to the carbon atom to which the ester, thioester or amide bond is attached when this carbon atom is sp3 hybridized. Z can represent, but not limited to
-H
- halogen
- CN
- GOLD
- NR2
- NR3 +
- SR - SR2 +
- S2R
- NRCO2R
- NHNR2
- NRNR2
- NHOR
- ONR2
- CR (CN) 2
- CR (COR) 2
- CR2N 2
- CsCOR
In general, in addition to a hydrogen atom and a halogen, Z can represent any nucleophilic group of general formula RnX, in which X represents O, N, S or C (with appropriate variations of n to take account of variations of valence in X) and in which
R represents any substituent (preferably an alkyl group, an aryl group, an amino acid or a sugar, optionally substituted), several R groups can optionally form cyclic structures (for example in groups Z:

Rn et RnX peuvent également être (ou être dérivés de) un médicament ou une molécule stéroïdienne.Rn and RnX can also be (or be derived from) a steroid drug or molecule.

Dans des composés dans lesquels Z représente un groupe de formule RnX, Z sert de groupement de "blocage" qui inhibe ou empêche l'hydrolyse de la liaison ester, thioester ou amide, réduisant ainsi la probabilité d'instabilité de ces composés. L'effet de blocage est provoqué (1) par l'encombrement stérique du groupe RnX qui bloque physiquement l'attaque par des composés chimiques qui induiraient ou augmenteraient l'hydrolyse de la liaison ester, thioester ou amide (par exemple des composés qui formeraient une pseudo-base au niveau du neuvième atome de carbone d'un composé d'acridinium), et (2) par des effets électroniques produits par le passage de l'hybridation sp2 à l'hybridation sp3 de l'atome de carbone (qui rend le comportement de la liaison ester, thioester ou amide plus analogue à celui d'un ester, thioester ou amide aliphati que). Lorsque les composés renfermant un groupe RnX sont amenés à engendrer une chimioluminescence, ils doivent tout d'abord être traités avec un acide qui clive le groupe RnX, permettant ainsi l'induction de la réaction de chimioluminescence par addition d'un peroxyde, d'une base ou d'un autre inducteur (un traitement avec un acide n'est pas requis pour des composés dans lesquels Z représente H ou un halogène).Le caractère et la structure du groupe RnX sont limités par deux facteurs seulement : (1) les dimensions du groupe RnX doivent être telles que le groupe puisse être ajouté à des composés de la présente invention au cours de la synthèse décrite ci-dessous ou bien par d'autres procédés de synthèse (c'est-à-dire que le composé de formule RnXH, duquel dérive le groupe RnX au cours de la synthèse, ne peut être volumineux au point que des effets stériques rendent impossible la synthèse à partir de ce composé d'un composé de la présente invention renfermant un tel groupe RnX), et (2) le groupe RnX doit présenter un caractère stérique et chimique tel qu'il puisse être clivé de la molécule avec un acide avant l'induction de la réaction chimioluminescente. In compounds in which Z represents a group of formula RnX, Z serves as a "blocking" group which inhibits or prevents hydrolysis of the ester, thioester or amide bond, thus reducing the probability of instability of these compounds. The blocking effect is caused (1) by the steric hindrance of the RnX group which physically blocks the attack by chemical compounds which would induce or increase the hydrolysis of the ester, thioester or amide bond (for example compounds which would form a pseudo-base at the level of the ninth carbon atom of an acridinium compound), and (2) by electronic effects produced by the transition from sp2 hybridization to sp3 hybridization of the carbon atom (which makes the behavior of the ester, thioester or amide bond more analogous to that of an aliphatic ester, thioester or amide). When the compounds containing an RnX group are caused to generate chemiluminescence, they must first of all be treated with an acid which cleaves the RnX group, thus allowing the induction of the chemiluminescence reaction by the addition of a peroxide, a base or other inducer (treatment with an acid is not required for compounds in which Z represents H or a halogen). The character and structure of the RnX group are limited by only two factors: (1) the dimensions of the RnX group must be such that the group can be added to compounds of the present invention during the synthesis described below or else by other synthetic methods (i.e. the compound of formula RnXH, from which the RnX group is derived during synthesis, cannot be so large that steric effects make synthesis from this compound of a compound of the present invention containing such an RnX group impossible, and (2) the gro upe RnX must have a steric and chemical character such that it can be cleaved from the molecule with an acid before the induction of the chemiluminescent reaction.

D'autres groupements de la présente invention répondent à la formule schématique suivante

dans laquelle Q, Z, L et R4 répondent aux définitions précitées et R5 est n'importe quel groupe partant. Outre les groupements dans lesquels R5 représente la somme
R1+R2+R2'+R3 (de la manière décrite précédemment dans la formule schématique II), des groupements appréciés comprennent des groupements dans lesquels R5 représente un noyau ou système cyclique aryle qui est substitué ou non substitué. Ces groupements peuvent également comprendre des substituants péri, de la manière décrite précédemment.Le
N-méthyl-1,3-diméthylacridane-9-méthoxy-9-carboxylate de phényle, qui répond à la formule suivante

est un groupement apprécié qui porte un groupe Z/RnX (CH30- sur C9), porte un substituant péri (CH3- sur C1) et est un ester de phényle non substitué.Other groups of the present invention correspond to the following schematic formula

in which Q, Z, L and R4 meet the above definitions and R5 is any leaving group. Besides the groupings in which R5 represents the sum
R1 + R2 + R2 '+ R3 (as previously described in Schematic Formula II), preferred groups include groups in which R5 represents an aryl ring or ring system which is substituted or unsubstituted. These groups can also include peri substituents, as described above.
Phenyl N-methyl-1,3-dimethylacridane-9-methoxy-9-carboxylate, which corresponds to the following formula

is a preferred group which carries a Z / RnX group (CH30- on C9), carries a peri substituent (CH3- on C1) and is an unsubstituted phenyl ester.

dans laquelle S02-R"-Y est un groupe partant, Q, Z, L et R4 répondent aux définitions précitées, R' et R" sont choisis entre des groupes alkyle, alkylène, aryle, alkyle facultativement substitué, alkylène facultativement substitué, aryle facultativement substitué, alkyloxy, aryloxy, halogéno, amino facultativement protégé, aminohydroxy substitué, hydroxy protégé, oxo, thio, imino, mercapto facultativement substitué, un noyau hétérocyclique et un groupe hétéroalkyle, et Y est choisi entre l'hydrogène, un groupe carboxy, un halogénure de carbonyle, un halogénure de sulfonyle, des groupes carboalkyoxy, carboxamido, carboaryloxy, cyano, carboximido, isocyanato, isothiocyanato, sulfo, N-succinimidycarboxy et N-maléimide. Ces groupements peuvent comprendre également des substituants péri, de la manière décrite précédemment. Other groups of the present invention correspond to the following schematic formula

in which SO2-R "-Y is a leaving group, Q, Z, L and R4 correspond to the above definitions, R 'and R" are chosen from alkyl, alkylene, aryl, optionally substituted alkyl, optionally substituted alkylene, aryl optionally substituted, alkyloxy, aryloxy, halo, optionally protected amino, substituted aminohydroxy, protected hydroxy, oxo, thio, imino, optionally substituted mercapto, a heterocyclic ring and a heteroalkyl group, and Y is chosen from hydrogen, a carboxy group, carbonyl halide, sulfonyl halide, carboalkyoxy, carboxamido, carboaryloxy, cyano, carboximido, isocyanato, isothiocyanato, sulfo, N-succinimidycarboxy and N-maleimide groups. These groups can also include peri substituents, as described above.

D'autres groupements encore de la présente invention répondent à la formule schématique suivante :

dans laquelle V-R"' est un groupe partant, Q, Z et L répondent aux définitions précitées, V représente le groupe aliphatique ou aromatique, R"' représente un groupe qui est utile pour la fixation du groupement à -une protéine ou d'autres membres de liaison spécifique (de la manière décrite précédemment). Ces groupements peuvent comprendre également des substituants péri, de la manière décrite précédemment.Still other groups of the present invention correspond to the following schematic formula:

in which VR "'is a leaving group, Q, Z and L meet the above definitions, V represents the aliphatic or aromatic group, R"' represents a group which is useful for the attachment of the group to a protein or others specific link members (as previously described). These groups can also include peri substituents, as described above.

dans laquelle Q, Z et L répondent aux définitions précitées, W est un groupe partant et SW représente un groupe sulfonamido ou sulfocarbonyle. Ces groupements peuvent comprendre également des substituants péri, de la manière décrite précédemment.Other groups of the present invention correspond to the following schematic formula

in which Q, Z and L meet the above definitions, W is a leaving group and SW represents a sulfonamido or sulfocarbonyl group. These groups can also include peri substituents, as described above.

Les groupements chimioluminescents perfectionnés décrits ci-dessus sont utiles dans une large gamme d'analyses par liaison spécifique destinées à déterminer la présence d'un analyte dans un échantillon. Le terme "présence" désigne dans la présente invention la détection qualitative et/ou quantitative d'un analyte. Ces analyses peuvent s'adresser à n'importe quel analyte qui peut être détecté par l'utilisation du groupement chimioluminescent perfectionné, conjointement avec des réactions de liaison spécifique. Ces analyses comprennent, sans limitation, des immuno-essais, des analyses de liaison de protéines et des analyses d'hybridation d'acides nucléiques. The improved chemiluminescent moieties described above are useful in a wide range of specific binding assays to determine the presence of an analyte in a sample. The term "presence" denotes in the present invention the qualitative and / or quantitative detection of an analyte. These analyzes can be directed to any analyte which can be detected by the use of the improved chemiluminescent group, together with specific binding reactions. These assays include, without limitation, immunoassays, protein binding assays, and nucleic acid hybridization assays.

Dans un immuno-essai classique, l'analyte est immunoréactif et sa présence dans un échantillon peut être déterminée par sa réaction immunologique avec un réactif analytique. Dans une analyse classique de liaison de protéines, la présence d'un analyte dans un échantillon est déterminée par la réactivité de liaison spécifique de l'analyte avec un réactif analytique, cette réactivité étant autre qu'une réactivité immunologique. Des exemples de cette réactivité comprennent la reconnaissance enzymesubstrat et l'affinité de liaison de l'avidine pour la biotine. Dans l'analyse classique d'hybridation d'acides nucléiques, la présence d'un analyte dans un échantillon est déterminée par une réaction d'hybridation de l'analyte avec un réactif analytique.L'acide nucléique représentant l'analyte (présent habituellement sous forme d'ADN ou d'ARN bicaténaire) est habituellement converti tout d'abord en une forme monocaténaire et est immobilisé sur un support (par exemple un papier à base de nitrocellulose). L'acide nucléique servant d'analyte peut en variante être soumis à une électrophorèse dans une matrice de gel. Puis, l'analyte immobilisé peut être hybridé (ctest-à-dire lié spécifiquement) au moyen d'une séquence complémentaire d'acide nucléique. In a conventional immunoassay, the analyte is immunoreactive and its presence in a sample can be determined by its immunological reaction with an analytical reagent. In a conventional protein binding assay, the presence of an analyte in a sample is determined by the specific binding reactivity of the analyte with an analytical reagent, this reactivity being other than an immunological reactivity. Examples of this reactivity include enzyme substrate recognition and the binding affinity of avidin for biotin. In conventional nucleic acid hybridization analysis, the presence of an analyte in a sample is determined by a hybridization reaction of the analyte with an analytical reagent.The nucleic acid representing the analyte (usually present in the form of double-stranded DNA or RNA) is usually first converted into a single-stranded form and is immobilized on a support (for example nitrocellulose-based paper). Alternatively, the nucleic acid serving as the analyte can be subjected to electrophoresis in a gel matrix. Then, the immobilized analyte can be hybridized (i.e. specifically linked) using a complementary nucleic acid sequence.

Les analyses précitées par liaison spécifique peuvent être effectuées suivant des modèles analytiques très divers. Ces modèles analytiques se répartissent en deux catégories principales. Dans la première catégorie, l'analyse utilise un conjugué chimioluminescent qui comprend le groupement chimioluminescent perfectionné fixé à une matière à liaison spécifique. L'expression "matière à liaison spécifique" désigne dans la présente invention n'importe quelle matière qui se lie spécifiquement par une réaction immunologique, une réaction de liaison de protéines, une réaction d'hybridation d'acide nucléique et toute autre réaction dans laquelle la matière réagit spécifiquement avec une classe restreinte de composés biologiques, biochimiques ou chimiques.Dans cette catégorie d'analyses, le conjugué chimioluminescent participe à une réaction de liaison spécifique et la présence d'un analyte dans l'échantillon est proportionnelle à la formation d'un ou plusieurs produits de réaction de liaison spécifique contenant le conjugué chimioluminescent. L'analyse est effectuée en laissant les réactions de liaison spécifique requises se produire dans des conditions réactionnelles convenables. La formation de produits de réaction de liaison spécifique contenant le conjugué chimioluminescent est déterminée en mesurant la chimioluminescence de ces produits contenant le conjugué chimioluminescent ou bien en mesurant la chimioluminescence d'un conjugué chimioluminescent n'ayant pas réagi ou ayant partiellement réagi, non présent dans ces produits. The above analyzes by specific binding can be carried out according to very diverse analytical models. These analytical models fall into two main categories. In the first category, the analysis uses a chemiluminescent conjugate which includes the improved chemiluminescent group attached to a specific binding material. The term "specific binding material" denotes in the present invention any material which specifically binds by an immunological reaction, a protein binding reaction, a nucleic acid hybridization reaction and any other reaction in which the material reacts specifically with a restricted class of biological, biochemical or chemical compounds. In this category of analyzes, the chemiluminescent conjugate participates in a specific binding reaction and the presence of an analyte in the sample is proportional to the formation of one or more specific binding reaction products containing the chemiluminescent conjugate. Analysis is carried out by allowing the required specific binding reactions to occur under suitable reaction conditions. The formation of specific binding reaction products containing the chemiluminescent conjugate is determined by measuring the chemiluminescence of these products containing the chemiluminescent conjugate or by measuring the chemiluminescence of an unreacted or partially reacted chemiluminescent conjugate, not present in these products.

Cette première catégorie de modèles analytiques est illustrée par les analyses en sandwich, les analyses compétitives, les analyses d'antigènes de surface, les analyses par saturations successives, les analyses par déplacements compétitifs et les analyses par extinction. This first category of analytical models is illustrated by sandwich analyzes, competitive analyzes, surface antigen analyzes, successive saturation analyzes, competitive displacement analyzes and extinction analyzes.

Dans un modèle en sandwich, la matière à liaison spécifique à laquelle est fixé le groupement chimioluminescent, peut se lier spécifiquement à l'analyte. L'analyse utilise en outre un corps réactionnel qui peut se lier spécifiquement à l'analyte pour former un complexe corps réactionnel-analyte-conjugué chimioluminescent. Le corps réactionnel peut être fixé à une phase solide, comprenant, à titre non limitatif, des bandelettes, des perles, des tubes, des feuilles de papier ou de polymère. Dans de tels cas, la présence de l'analyte dans un échantillon est proportionnelle à la chimioluminescence de la phase solide une fois les réactions de liaison spécifique terminées.Ces modèles analytiques sont décrits plus en détail dans les brevets des Etats-Unis d'Amérique N 4 652 533, N 4 383 031, N 4 380 580 et N 4 226 993, qui sont cités à titre de référence dans le présent mémoire. In a sandwich model, the specific binding material to which the chemiluminescent group is attached, can specifically bind to the analyte. The assay further uses a reactant which can specifically bind to the analyte to form a reactant-analyte-chemiluminescent conjugate complex. The reaction body can be attached to a solid phase, comprising, without limitation, strips, beads, tubes, sheets of paper or of polymer. In such cases, the presence of the analyte in a sample is proportional to the chemiluminescence of the solid phase after the specific binding reactions are completed. These analytical models are described in more detail in United States patents N 4,652,533, N 4,383,031, N 4,380,580 and N 4,226,993, which are cited for reference in this specification.

Dans un modèle par compétition, l'analyse utilise un corps réactionnel qui peut se lier spécifiquement à l'analyte pour former un complexe analyte-corps réactionnel et à la matière à liaison spécifique, à laquelle est fixé le groupement chimioluminescent, pour former un complexe conjugué chimioluminescent-corps réactionnel. Le corps réactionnel peut être fixé à une phase solide ou bien, en variante, des produits de réaction contenant le corps réactionnel peuvent être précipités au moyen d'un second anticorps ou par d'autres procédés connus. Dans ce modele par compétition, la présence de l'analyte est "proportionnelle", c'est-à-dire inversement proportionnelle, à la chimioluminescence de la phase solide ou du précipité. Une autre description de ce modèle analytique peut être trouvée dans les brevets des Etats
Unis d'Amérique précités.In a competitive model, the analysis uses a reaction body which can specifically bind to the analyte to form an analyte-reaction body complex and to the specific binding material, to which the chemiluminescent group is attached, to form a complex. chemiluminescent-reactant conjugate. The reactant can be attached to a solid phase or, alternatively, reaction products containing the reactant can be precipitated by means of a second antibody or by other known methods. In this competitive model, the presence of the analyte is "proportional", that is to say inversely proportional, to the chemiluminescence of the solid phase or of the precipitate. Another description of this analytical model can be found in state patents
United States of America cited above.

Dans un autre modèle analytique, l'analyte peut être présent sur, ou être lié à, un composé biologique, biochimique ou chimique plus volumineux. Ce type de modèle est illustré par une analyse d'antigènes de surface. Dans ce modèle, la matière à liaison spécifique peut se lier spécifiquement à l'analyte et la présence de l'analyte est proportionnelle au complexe analyte-conjugué chimioluminescent formé à titre de produit de réaction. Cela est illustré. par la fixation du groupement chimioluminescent à un anticorps qui est spécifique d'un antigène de surface présent sur une cellule. La présence de l'antigène de surface cellulaire est indiquée par la chimioluminescence des cellules une fois la réaction terminée.Les cellules proprement dites peuvent être utilisées conjointement avec un système de filtration pour séparer le complexe analyteconjugué chimioluminescent qui est formé sur la surface de la cellule à partir du conjugué chimioluminescent n'ayant pas réagi. Cela est décrit plus en détail dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique N 4 652 533. In another analytical model, the analyte may be present on, or be linked to, a larger biological, biochemical or chemical compound. This type of model is illustrated by an analysis of surface antigens. In this model, the specific binding material can specifically bind to the analyte and the presence of the analyte is proportional to the analyte-chemiluminescent conjugate complex formed as the reaction product. This is illustrated. by attaching the chemiluminescent moiety to an antibody which is specific for a surface antigen present on a cell. The presence of the cell surface antigen is indicated by the chemiluminescence of the cells upon completion of the reaction. The cells themselves can be used in conjunction with a filtration system to separate the chemiluminescent conjugate analytical complex that is formed on the cell surface. from the unreacted chemiluminescent conjugate. This is described in more detail in U.S. Patent No. 4,652,533.

Le groupement chimioluminescent perfectionné peut être utilisé en plus des modèles analytiques additionnels connus dans la pratique, comprenant, à titre non limitatif, la saturation séquentielle et le déplacement compétitif, deux modèles utilisant un conjugué chimioluminescent, dans lesquels (1) la matière à liaison spécifique, à laquelle est fixé le groupement, et (2) l'analyte se lient spécifiquement à un corps réactionnel. The improved chemiluminescent group can be used in addition to the additional analytical models known in the art, comprising, without limitation, sequential saturation and competitive displacement, two models using a chemiluminescent conjugate, in which (1) the specific binding material , to which the group is attached, and (2) the analyte bind specifically to a reactant.

Dans le cas de la saturation séquentielle, on fait réagir tout d'abord l'analyte avec le corps réactionnel, puis on fait réagir le conjugué chimioluminescent avec le corps réactionnel n'ayant pas réagi restant. Dans le cas du déplacement compétitif, le conjugué chimioluminescent déplace de manière compétitive l'analyte qui s'est déjà lié au corps réactionnel.In the case of sequential saturation, the analyte is first reacted with the reactant, then the chemiluminescent conjugate is reacted with the remaining unreacted reactant. In the case of competitive displacement, the chemiluminescent conjugate competitively displaces the analyte which has already bonded to the reaction body.

Dans un modèle par extinction, l'analyse utilise un corps réactionnel qui peut se lier spécifiquement à l'analyte pour former un complexe analyte-corps réactionnel, et à la matière à liaison spécifique, à laquelle est fixé le groupement chimioluminescent, pour former un complexe conjugué chimioluminescent-corps réactionnel. Un groupement d'extinction est fixé au corps réactionnel. Lorsqu'il est amené à proximité immédiate du groupement chimioluminescent, le groupement d'extinction diminue ou éteint la chimioluminescence du groupement chimioluminescent. Dans ce modèle par extinction, la présence de l'analyte est proportionnelle à la chimioluminescence du groupement chimioluminescent.Une description plus détaillée de ce modèle peut être trouvée dans les brevets des Etats-Unis d'Amérique N 4 220 450 et N 4 277 437, qui sont cités à titre de référence dans le présent mémoire. In an extinction model, the analysis uses a reaction body which can specifically bind to the analyte to form an analyte-reaction body complex, and to the specific binding material, to which the chemiluminescent group is attached, to form a chemiluminescent-reaction body conjugate complex. An extinguishing group is attached to the reaction body. When brought into immediate proximity to the chemiluminescent group, the extinction group decreases or extinguishes the chemiluminescence of the chemiluminescent group. In this extinction model, the presence of the analyte is proportional to the chemiluminescence of the chemiluminescent group. A more detailed description of this model can be found in United States patents N 4,220,450 and N 4,277,437 , which are cited for reference in this specification.

En ce qui concerne les modèles analytiques décrits ci-dessus et dans les modèles décrits ci-dessous, l'ordre dans lequel les réactifs analytiques sont ajoutés et amenés à réagir peut varier largement, comme cela est bien connu dans la pratique. Par exemple, dans une analyse en sandwich, le corps réactionnel lié à une phase solide peut être amené à réagir avec un analyte présent dans un échantillon et, après cette réaction, la phase solide contenant l'analyte complexé peut être séparée de l'echan- tillon restant. Après cette étape de séparation, le conjugué chimioluminescent peut être amené à réagir avec le compl-exe sur la phase solide. En variante, la phase solide, l'échantillon et le conjugué chimioluminescent peuvent être ajoutés les uns aux autres simultanément et amenés à réagir avant séparation.A titre d'autres variantes, moins appréciées, l'analyte présent dans l'échantillon et le conjugué chimioluminescent peuvent être amenés à réagir avant l'addition du corps réactionnel sur la phase solide. With respect to the analytical models described above and in the models described below, the order in which the analytical reagents are added and caused to react can vary widely, as is well known in the art. For example, in a sandwich analysis, the reactant bound to a solid phase can be reacted with an analyte present in a sample and, after this reaction, the solid phase containing the complexed analyte can be separated from the mechan - tillon remaining. After this separation step, the chemiluminescent conjugate can be reacted with the complex on the solid phase. Alternatively, the solid phase, the sample and the chemiluminescent conjugate can be added to each other simultaneously and reacted before separation. As other less preferred variants, the analyte present in the sample and the conjugate chemiluminescent can be brought to react before the addition of the reactant on the solid phase.

Des variantes similaires concernant les étapes de mélange et de réaction sont possibles pour des modèles analytiques par compétition, ainsi que pour d'autres modèles connus dans la pratique. L'expression "permettre dans des conditions convenables une formation notable" de produits de réaction de liaison spécifique désigne dans le présent mémoire les nombreuses variantes différentes concernant l'ordre d'addition et de réaction des réactifs analytiques.Similar variations regarding the mixing and reaction steps are possible for competitive analytical models, as well as for other models known in the art. The term "to allow significant formation under suitable conditions" of specific binding reaction products in this specification means the many different variations regarding the order of addition and reaction of the analytical reagents.

Dans la deuxième catégorie de modèles analytiques, l'analyse utilise un groupement chimioluminescent perfectionné non conjugué. La présence de l'analyte dans l'échantillon est proportionnelle à la formation d'un ou plusieurs produits de réaction de liaison spécifique qui ne contiennent pas eux-mêmes le groupement chimioluminescent. In the second category of analytical models, the analysis uses an advanced unconjugated chemiluminescent group. The presence of the analyte in the sample is proportional to the formation of one or more specific binding reaction products which do not themselves contain the chemiluminescent group.

Au lieu de cela, le groupement chimioluminescent entre en chimioluminescence proportionnellement à la formation de ces produits de réaction.Instead, the chemiluminescent group enters chemiluminescence in proportion to the formation of these reaction products.

Dans un exemple de cette deuxième catégorie de modèles, l'analyse utilise un corps réactionnel capable de se lier å l'analyte pour former un complexe analyte-corps réactionnel qui provoque l'entrée en chimioluminescence du groupement chimioluminescent. Cela est illustré par une analyse enzyme-substrat simple dans laquelle l'analyte est le glucose, servant de substrat, et le corps réactionnel est l'enzyme appelé glucose-oxydase. La formation du complexe enzyme-substrat active le groupement chimioluminescent. Cette analyse enzyme-substrat pour le glucose est décrite dans les brevets des Etats-Unis d'Amérique N 3 964 870 et Ne 4 427 770, tous deux cités à titre de référence dans le présent mémoire.Cette analyse enzymesubstrat est une analyse par liaison spécifique en ce sens que le substrat se lie spécifiquement au site actif de l'enzyme pratiquement de la même manière qu'un antigène se lie à un anticorps. Dans cette analyse, l'enzyme se lie spécifiquement au substrat, ayant pour résultat la production d'un peroxyde qui, à son tour, provoque l'entrée en chimioluminescence du groupement chimioluminescent. In an example of this second category of models, the analysis uses a reaction body capable of binding to the analyte to form an analyte-reaction body complex which causes the chemiluminescent group to enter chemiluminescence. This is illustrated by a simple enzyme-substrate analysis in which the analyte is glucose, serving as the substrate, and the reaction body is the enzyme called glucose oxidase. The formation of the enzyme-substrate complex activates the chemiluminescent group. This enzyme-substrate analysis for glucose is described in U.S. Pat. Nos. 3,964,870 and Ne 4,427,770, both cited by reference in this specification. This enzyme substrate analysis is a bond analysis specific in that the substrate specifically binds to the active site of the enzyme in much the same way as an antigen binds to an antibody. In this analysis, the enzyme specifically binds to the substrate, resulting in the production of a peroxide which, in turn, causes the chemiluminescent group to enter chemiluminescence.

Les analyses faisant également partie de la deuxième catégorie d'analyses sont celles dans lesquelles la formation des produits de réaction active ou inhibe l'entrée en chimioluminescence du groupement chimioluminescent d'une manière moins directe. Dans cette analyse, un premier corps réactionnel, qui présente une réaction croisée avec l'analyte, est fixé à un enzyme, tel que la glucose-oxydase, à proximité de son site actif. Un second corps réactionnel qui est spécifique de l'analyte et de la matière immunoréactive est ajouté à l'échantillon et l'enzyme modifié en présence du substrat (å savoir le glucose).Lorsque le second corps réactionnel se lie au premier corps réactionnel situé à proximité du site actif sur l'enzyme, le second corps réactionnel bloque le site actif de manière que le substrat ne puisse se lier a l'enzyme au niveau du site actif ou que la liaison du substrat au niveau du site actif soit notablement réduite. The analyzes also belonging to the second category of analyzes are those in which the formation of reaction products activates or inhibits the entry into chemiluminescence of the chemiluminescent group in a less direct manner. In this analysis, a first reactant, which cross-reacts with the analyte, is attached to an enzyme, such as glucose oxidase, near its active site. A second reaction body which is specific for the analyte and immunoreactive material is added to the sample and the enzyme modified in the presence of the substrate (i.e. glucose). When the second reaction body binds to the first reaction body located near the active site on the enzyme, the second reaction body blocks the active site so that the substrate cannot bind to the enzyme at the active site or that the binding of the substrate at the active site is significantly reduced .

Le second corps réactionnel bloquant l'enzyme de cette manière inhibe la production d'un peroxyde par l'enzyme qui aurait, à son tour, activé le groupement chimioluminescent.The second reaction blocking the enzyme in this way inhibits the production of a peroxide by the enzyme which, in turn, would have activated the chemiluminescent group.

Cependant, l'analyte présent dans l'ëchantillon fixe le second corps réactionnel, empêchant ainsi le second corps réactionnel d'inhiber la production de peroxyde. La présence de l'analyte est proportionnelle à la chimioluminescence du groupement.However, the analyte present in the sample fixes the second reaction body, thereby preventing the second reaction body from inhibiting the production of peroxide. The presence of the analyte is proportional to the chemiluminescence of the group.

Les analyses placées dans les deux catégories précitées de modèles analytiques peuvent être hétérogènes ou homogènes. Dans des analyses hétérogènes, les produits de réaction, dont la formation est proportionnelle à la présence d'analyte dans l'échantillon, sont séparés des autres produits de la réaction. La séparation peut être effectuée par n'importe quel moyen, comprenant, à titre non limitatif, la séparation d'une phase liquide d'une phase solide par filtration, microfiltration, double précipitation d'anticorps, centrifugation, chromatographie d'exclusion dimensionnelle, enlèvement d'une phase solide (par exemple une bandelette) d'une solution d'échantillon, ou électrophorèse. Par exemple, dans une analyse en sandwich, le complexe corps réactionnel-conjugué chimioluminescent est séparé du conjugué chimioluminescent n'ayant pas réagi. The analyzes placed in the two aforementioned categories of analytical models can be heterogeneous or homogeneous. In heterogeneous analyzes, the reaction products, the formation of which is proportional to the presence of analyte in the sample, are separated from the other reaction products. The separation can be carried out by any means, including, without limitation, the separation of a liquid phase from a solid phase by filtration, microfiltration, double precipitation of antibodies, centrifugation, dimensional exclusion chromatography, removal of a solid phase (for example a strip) from a sample solution, or electrophoresis. For example, in a sandwich analysis, the reaction body-chemiluminescent conjugate complex is separated from the unreacted chemiluminescent conjugate.

Dans une analyse d'antigènes de surface, le complexe analyte-conjugué chimioluminescent est séparé du conjugué chimioluminescent n'ayant pas réagi. Dans une analyse par comp4tition, le complexe corps réactionnel-conjugué chimioluminescent est séparé du conjugué chimioluminescent n'ayant pas réagi. Dans une analyse par saturation séquentielle et dans une analyse par déplacement compétitif, le complexe corps réactionnel-conjugué chimioluminescent est séparé du conjugué chimioluminescent n'ayant pas réagi. En variante dans des analyses homogènes, les produits de réaction ne sont pas séparés.Après avoir laissé réagir les réactifs analytiques, il est possible de mesurer la chimioluminescence dans le mélange analytique total, que ce mélange soit en solution, sur une phase solide ou bien réparti entre différentes membranes constituant les couches d'une bandelette ou d'un autre support solide. L'analyse du glucose au moyen de glucoseoxydase et d'un groupement chimioluminescent représente une analyse homogène simple dans laquelle une séparation est inutile. L'analyse par extinction illustre une analyse homogène plus complexe dans laquelle une séparation est inutile. Il est envisagé que l'une ou l'autre catégorie de modèles analytiques puisse donner lieu à des modèles hétérogènes ou homogènes.In a surface antigen analysis, the analyte-chemiluminescent conjugate complex is separated from the unreacted chemiluminescent conjugate. In a competitive analysis, the reactant-chemiluminescent conjugate complex is separated from the unreacted chemiluminescent conjugate. In a sequential saturation analysis and in a competitive displacement analysis, the reactant-chemiluminescent conjugate complex is separated from the unreacted chemiluminescent conjugate. As a variant in homogeneous analyzes, the reaction products are not separated. After having allowed the analytical reagents to react, it is possible to measure the chemiluminescence in the total analytical mixture, whether this mixture is in solution, on a solid phase or else distributed between different membranes constituting the layers of a strip or other solid support. The analysis of glucose using glucose oxidase and a chemiluminescent group represents a simple homogeneous analysis in which separation is unnecessary. Extinction analysis illustrates a more complex homogeneous analysis in which separation is unnecessary. It is envisaged that one or the other category of analytical models may give rise to heterogeneous or homogeneous models.

Enfin, l'expression "mesurer la chimioluminescence" désigne, lorsque cela est pertinent, l'acte consistant à séparer les produits de reaction de liaison spécifique, dont la formation est proportionnelle à la presence d'analyte dans l'échantillon, des autres produits de réaction. Elle désigne également, lorsque cela est pertinent, les actes consistant (l) à traiter le groupement chimioluminescent avec un acide pour séparer un groupe Z (à savoir RnX) du groupement et/ou (2) à induire la chimioluminescence du groupement chimioluminescent dans le cas des modèles analytiques dans lesquels la formation des produits de réaction n'active pas elle-même le groupement chimioluminescent. Finally, the expression "measuring chemiluminescence" designates, where relevant, the act of separating the specific binding reaction products, the formation of which is proportional to the presence of analyte in the sample, from the other products. of reaction. It also designates, where relevant, the acts consisting in (l) treating the chemiluminescent group with an acid to separate a group Z (namely RnX) from the group and / or (2) in inducing chemiluminescence of the chemiluminescent group in the case of analytical models in which the formation of reaction products does not itself activate the chemiluminescent group.

SYNTHESE DES GROUPEMEMTS
Les exemples suivants illustrent la synthèse de certains groupements chimioluminescents de la présente invention.SYNTHESIS OF THE GROUPEMEMTS
The following examples illustrate the synthesis of certain chemiluminescent groups of the present invention.

Exemple 1
Un groupement chimioluminescent apprécié de la présente invention est le fluorosulfonate (ou d'autres ions complémentaires tels que les ions chlorure, trifluoracétate, sulfate, etc.), de 3-(3-succinimidyloxy carbonyl) propyloxy-N-méthyl-acridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthyl-4-nitro)phényle qui répond à la formule suivante

Example 1
A preferred chemiluminescent group of the present invention is fluorosulfonate (or other complementary ions such as chloride ions, trifluoroacetate, sulfate, etc.) of 3- (3-succinimidyloxy carbonyl) propyloxy-N-methyl-acridinium-9 (2,6-dimethyl-4-nitro) phenylcarboxylate which corresponds to the following formula

Le fluorosulfonate de 3-(3-succinimidyloxycarbonyl) propyloxy-N-méthyl-acridinium-9-carboxylate de (2,6diméthyl-4-nitro)phényle est synthétisé conformément au schéma suivant

3- (3-succinimidyloxycarbonyl) propyloxy-N-methyl-acridinium-9-carboxylate fluorosulfonate (2,6-dimethyl-4-nitro) phenyl is synthesized according to the following scheme

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La condensation de l'isatine (1) avec le résorcinol (2) donne l'acide 3-hydroxyacridine-9-carboxylique (3). La réaction avec le 4-bromobutyrate de benzyle donne l'ester (4) avec le groupe 3-hydroxy éthérifié.L'hydrolyse au moyen d'une base élimine les deux groupes benzyle, ayant pour résultat l'acide dicarboxylique (5). La rebenzylation sélective dé la fonction carboxylique du groupe propyloxy donne l'acide 9-carboxylique (6). L'estérification avec le 2,6-diméthyl-4-nitrophénol et la méthylation de l'azote de l'acridine donne le composé (8). L'élimination de la protection du groupe carboxyle avec HBr et la condensation avec le N-hydroxysuccinimide au moyen de DCC donne le fluorosulfonate de 5- (3-succinimidyloxycarbonyl) propyloxy-
N-méthyl-acridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthyl-4- nitro)phényle. Ces réactions sont décrites plus en détail ci-dessous.The condensation of isatin (1) with resorcinol (2) gives 3-hydroxyacridine-9-carboxylic acid (3). Reaction with benzyl 4-bromobutyrate gives the ester (4) with the etherified 3-hydroxy group. Hydrolysis using a base removes the two benzyl groups, resulting in dicarboxylic acid (5). Selective rebenzylation of the carboxyl function of the propyloxy group gives 9-carboxylic acid (6). Esterification with 2,6-dimethyl-4-nitrophenol and methylation of nitrogen from acridine gives compound (8). Removal of the protection of the carboxyl group with HBr and condensation with the N-hydroxysuccinimide by means of DCC gives 5- (3-succinimidyloxycarbonyl) propyloxy- fluorosulfonate.
(2,6-dimethyl-4-nitro) phenyl N-methyl-acridinium-9-carboxylate. These reactions are described in more detail below.

Du chlorure de 4-bromobutyryle (13,8 g, 75 mmoles) a été introduit dans un ballon à fond rond de 100 ml. Le ballon a été refroidi à -20 C au moyen d'un bain de neige carbonique/tétrachlorure de carbone. De l'acétate d'éthyle (50 ml) contenant de la N-méthylmorpholine (7,58 g, 75 mmoles, 8,2 ml) a été ajouté avec soin. Au moyen d'une ampoule à robinet, de l'alcool benzylique (6,97 g, 6,67 ml, 6,64 mmoles) a été ajouté goutte à goutte. Après l'addition, le bain a été enlevé et le mélange a été agité pendant 2 heures. Le produit a été transféré dans une ampoule à décanter en utilisant de l'acétate d'éthyle (50 ml), a été lavé une fois avec du bicarbonate de sodium (10 %), puis à deux reprises avec de l'eau et a été déshydraté avec du sulfate de sodium anhydre.L'évaporation des solvants a donné du 4-bromobutyrate de benzyle sous forme d'une huile (rendement = 91 %). 4-Bromobutyryl chloride (13.8 g, 75 mmol) was introduced into a 100 ml round bottom flask. The flask was cooled to -20 ° C using a dry ice / carbon tetrachloride bath. Ethyl acetate (50 ml) containing N-methylmorpholine (7.58 g, 75 mmol, 8.2 ml) was carefully added. Using a dropping funnel, benzyl alcohol (6.97 g, 6.67 ml, 6.64 mmol) was added dropwise. After the addition, the bath was removed and the mixture was stirred for 2 hours. The product was transferred to a separatory funnel using ethyl acetate (50 ml), was washed once with sodium bicarbonate (10%), then twice with water and a was dried with anhydrous sodium sulfate. Evaporation of the solvents gave benzyl 4-bromobutyrate as an oil (yield = 91%).

De l'isatine (1) (1,88 g) a été ajoutée lentement à une solution d'hydroxyde de potassium (5,07 g, 0,09 mole) dissoute dans de l'eau (3,5 ml). Le réacteur a été chauffé à environ 50 C dans un bain d'huile. Une quantité supplémentaire d'environ 10 ml d'eau a été ajoutée goutte à goutte. Du résorcinol (2) (10 g, 0,089 mole) a été ajouté et la température a été portée à 100C tout en poursuivant l'agitation, ayant pour résultat la formation d'un mélange fondu. Une quantité supplémentaire d'isatine (1) (1,88 g) a été ajoutée. Le réacteur (ballon à fond rond et à 3 cols) a été relié à un dispositif d'admission d'azote et la vapeur d'eau a été éliminée par balayage avec le courant d'azote. Le mélange a été agité pendant 4 heures à 125'C.De l'eau (70 ml) a été ajoutée et le contenu a été dissous par agitation continue. Après transfert du mélange dans un ERLENMEYER, le volume a été porté à 200 ml avec de l'eau. Le pH a été ajusté à 2,0 au moyen d'acide chlorhydrique concentré. La filtration et le lavage des substances solides avec de l'eau ont donné l'acide acridine-carboxylique brut. Puis celui-ci a été dissous dans NaOH 2N (100 ml) et la solution a été filtrée à travers de la Celite. Le culot de Celite a été lavé avec 200 ml de NaOH 1N. Le filtrat a été acidifié au moyen de
HCl concentré à pH 2,0. Le précipité d'acide 2-bydroxy- acridine-9-carboxylique (3) a été filtré, lavé avec de l'eau et déshydraté sous vide sur P205 (rendement = 42 %).Isatin (1) (1.88 g) was added slowly to a solution of potassium hydroxide (5.07 g, 0.09 mole) dissolved in water (3.5 ml). The reactor was heated to about 50 ° C in an oil bath. An additional approximately 10 ml of water was added dropwise. Resorcinol (2) (10 g, 0.089 mole) was added and the temperature was brought to 100C while continuing to stir, resulting in the formation of a molten mixture. An additional amount of isatin (1) (1.88 g) was added. The reactor (round bottom flask with 3 necks) was connected to a nitrogen inlet device and the water vapor was removed by sweeping with the stream of nitrogen. The mixture was stirred for 4 hours at 125 ° C. Water (70 ml) was added and the contents were dissolved by continuous stirring. After transfer of the mixture to an ERLENMEYER, the volume was brought to 200 ml with water. The pH was adjusted to 2.0 using concentrated hydrochloric acid. Filtration and washing of the solids with water gave the crude acridine carboxylic acid. Then this was dissolved in 2N NaOH (100 ml) and the solution was filtered through Celite. The Celite pellet was washed with 200 ml of 1N NaOH. The filtrate was acidified using
Concentrated HCl at pH 2.0. The precipitate of 2-bydroxy-acridine-9-carboxylic acid (3) was filtered, washed with water and dried in vacuo over P205 (yield = 42%).

L'acide 3-hydroxy-9-acridine-carboxylique (3) (4 g, 0,017 mole), du 4-bromobutyrate de benzyle (14,6 g, 0,057 mole) et du carbonate de césium (22,16 g, 0,068 mole) ont été dissous dans du DMSO (125 ml) dans un ballon à fond rond de 250 ml. Le ballon a été chauffé à environ 50C dans un bain d'huile. Après agitation du mélange à cette température pendant 1 heure, le mélange a été versé dans de l'éau (1 litre). Le produit précipité a été soumis à une extraction avec du chloroforme après avoir rendu basique ia suspension aqueuse au moyen de bicarbonate de sodium.La déshydratation et l'évaporation du chloroforme ont donné le -3-(3-benzyloxyzarbonyl)propyloxy-9-(3-benzylOxyzarbonyl- propyl) -acridine-carboxylate (4) qui a été chromatographié sur une colonne de gel de silice en utilisant du chloroforme comme solvant. Les fractions ayant un Rf égal à 0,36 par CCX avec un mélange CHC13/EtOAc dans le rapport 9/1 ont été rassemblées. Les solvants ont été évaporés (rendement = 55 %). 3-hydroxy-9-acridine-carboxylic acid (3) (4 g, 0.017 mole), benzyl 4-bromobutyrate (14.6 g, 0.057 mole) and cesium carbonate (22.16 g, 0.068 mole) were dissolved in DMSO (125 ml) in a 250 ml round bottom flask. The flask was heated to about 50C in an oil bath. After stirring the mixture at this temperature for 1 hour, the mixture was poured into water (1 liter). The precipitated product was extracted with chloroform after making the aqueous suspension basic with sodium bicarbonate. Dehydration and evaporation of the chloroform gave -3- (3-benzyloxyzarbonyl) propyloxy-9- ( 3-benzylOxyzarbonyl-propyl) -acridine-carboxylate (4) which was chromatographed on a column of silica gel using chloroform as solvent. The fractions having an Rf equal to 0.36 by CCX with a CHCl3 / EtOAc mixture in the 9/1 ratio were combined. The solvents were evaporated (yield = 55%).

Le 3-(3-benzyloxycarbonyl)propyloxy-9-(3 benzyloxycarbonylpropyl) -acridine-carboxylate (4) (4,93 g, 8,3 mmoles) a été ajouté à un mélange de NaOH 2N (300 ml) et de méthanol (300 ml). Le mélange a été agité à température ambiante pendant 48 heures. Le méthanol a été éliminé sur un évaporateur rotatif et la solution a été acidifiée au moyen d'acide chlorhydrique concentré à pH 6,0. Les substances solides précipitées ont été filtrées, lavées à l'eau et dissoutes dans l'acétate d'éthyle. La solution a été déshydratée, puis les solvants ont été évaporés, donnant de l'acide 3-(3-carboxy)propyloxyacridine-9-carboxylique (5) (rendement = 92,8 %). 3- (3-benzyloxycarbonyl) propyloxy-9- (3 benzyloxycarbonylpropyl) -acridine-carboxylate (4) (4.93 g, 8.3 mmol) was added to a mixture of 2N NaOH (300 ml) and methanol (300 ml). The mixture was stirred at room temperature for 48 hours. The methanol was removed on a rotary evaporator and the solution was acidified using concentrated hydrochloric acid to pH 6.0. The precipitated solids were filtered, washed with water and dissolved in ethyl acetate. The solution was dried, then the solvents were evaporated, giving 3- (3-carboxy) propyloxyacridine-9-carboxylic acid (5) (yield = 92.8%).

L'acide 3-(3-carboxy)propyloxy-acridine-9carboxylique (5) (1,5 g, 4,6 mmoles) a été dissous à chaud dans de la DMAP (80 ml, 1,3-diméthyl-3, 4,5,6-tétrahydro- 2('IH)-pyrimidone). De l'alcool benzylique (0,5 ml, 0,52 g, 4,8 mmoles), du 1,3-dicyclohexylcarbodiimide (1,04 g, 5,Q mmoles) et de la N,N-diméthylaminopyridine (0,2 g, 1,6 mmole) ont été ajoutés au mélange réactionnel qui a été préalablement refroidi dans un bain de neige carbonique/CCl4. Le mélange a été agité pendant 15 heures au moyen d'un dispositif d'admission d'azote à température ambiante. Le mélange a été ajouté à une solution de chlorure de sodium saturée (320 ml). L'acide 3-(3-benzyl oxycarbonyl) propyloxy-acridine-9-carboxylique (6) a été filtré et a été lavé avec une petite quantité d'eau. Le produit a été chromatographié sur une colonne de gel de silice en utilisant comme solvant un mélange CHCl3/MeOH dans le rapport 95/5 (rendement = 26 %). The 3- (3-carboxy) propyloxy-acridine-9carboxylic acid (5) (1.5 g, 4.6 mmol) was dissolved hot in DMAP (80 ml, 1,3-dimethyl-3, 4,5,6-tetrahydro-2 ('1H) -pyrimidone). Benzyl alcohol (0.5 ml, 0.52 g, 4.8 mmol), 1,3-dicyclohexylcarbodiimide (1.04 g, 5, Q mmoles) and N, N-dimethylaminopyridine (0, 2 g, 1.6 mmol) were added to the reaction mixture which was previously cooled in a dry ice / CCl4 bath. The mixture was stirred for 15 hours using a nitrogen admission device at room temperature. The mixture was added to a saturated sodium chloride solution (320 ml). 3- (3-Benzyl oxycarbonyl) propyloxy-acridine-9-carboxylic acid (6) was filtered and washed with a small amount of water. The product was chromatographed on a column of silica gel using as solvent CHCl3 / MeOH mixture in the ratio 95/5 (yield = 26%).

L'acide 3-(3-benzyloxycarbonyl)propyloxyacridine-9-carboxylique (6) (0,5 g, 1,2 mmole) et du chlorure de para-toluenesulfonyle (0,46 g, 2,4 mmoles) ont été dissous dans de la pyridine (20 ml). La solution a été refroidie dans un bain de neige carbonique/CCl4 pendant 15 minutes. Du 2,6-diméthyl-4-nitrophénol (0,2 g, 1,2 mmole) a été ajouté, le bain de refroidissement a été enlevé et le mélange a été agité pendant 15 heures à température ambiante. Celui-ci a été ajouté à de l'eau (450 ml) et le pH a été ajusté à 2,0 au moyen d'acide chlorhydrique concentré. Le produit a été filtré, lavé à l'eau et déshydraté sous vide. Le produit brut a été chromatographié sur une colonne de gel de silice en utilisant du chloroforme comme solvant.Les fractions ayant un Rf égal à 0,8 par CCM au moyen d'un mélange CHC13/EtOAc dans le rapport 1:1 ont été rassemblées. L'évaporation du solvant a donné du 3-(3-benzyloxycarbonyl)pr0pyloxy- acridine-9-carboxylate de (2,6-diméthyl-4-nitro)phényle (7) (rendement = 47 %). 3- (3-Benzyloxycarbonyl) propyloxyacridine-9-carboxylic acid (6) (0.5 g, 1.2 mmol) and para-toluenesulfonyl chloride (0.46 g, 2.4 mmol) were dissolved in pyridine (20 ml). The solution was cooled in a dry ice / CCl4 bath for 15 minutes. 2,6-dimethyl-4-nitrophenol (0.2 g, 1.2 mmol) was added, the cooling bath was removed and the mixture was stirred for 15 hours at room temperature. This was added to water (450 ml) and the pH was adjusted to 2.0 using concentrated hydrochloric acid. The product was filtered, washed with water and dried in vacuo. The crude product was chromatographed on a silica gel column using chloroform as solvent. The fractions having an Rf equal to 0.8 by TLC using a CHCl 3 / EtOAc mixture in the ratio 1: 1 were combined . Evaporation of the solvent gave 3- (3-benzyloxycarbonyl) propyloxy-acridine-9-carboxylate (2,6-dimethyl-4-nitro) phenyl (7) (yield = 47%).

L'acridine (7) (0,32 g, 0,56 mmole) a été dissoute dans du chlorure de méthylène anhydre (4 ml) et du fluorosulfate de méthyle (0,27 ml, 3,36 mmoles, 6 équivalents molaires) a été ajouté. Le mélange a été agité pendant 15 heures à température ambiante. De l'éther anhydre (20 ml) a été ajouté. Le fluorosulfonate de 3-(3 benzyloxycarbonyl) propyloxy-acridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthyl-4-nitro)phényle (8) a été filtré et lavé à l'éther (50 mil). Le rendement était quantitatif. Acridine (7) (0.32 g, 0.56 mmol) was dissolved in anhydrous methylene chloride (4 ml) and methyl fluorosulfate (0.27 ml, 3.36 mmol, 6 molar equivalents) has been added. The mixture was stirred for 15 hours at room temperature. Anhydrous ether (20 ml) was added. The 3- (3 benzyloxycarbonyl) propyloxy-acridinium-9-carboxylate fluorosulfonate (2,6-dimethyl-4-nitro) phenyl (8) was filtered and washed with ether (50 mil). The yield was quantitative.

L'ester d'acridinium protégé par un groupe benzyle (8) (250 ng) a été traité avec un mélange HBr 30 %/acide acétique (3 ml) pendant 2 heures à 55 C. De l'éther anhydre (20 ml) a été ajouté pour précipiter le produit. La filtration et le lavage des substances solides avec de l'éther ont donné du fluorosulfonate de 3-(3 carboxyl) propyloxy-acridinium-9-carboxylate de (2,6 diméthyl-4-nitro)phényle (9). La cristallisation dans I'acétonitrile a donné le composé pur (rendement = 80 %). The benzyl group protected acridinium ester (8) (250 ng) was treated with a 30% HBr / acetic acid mixture (3 ml) for 2 hours at 55 C. Anhydrous ether (20 ml) was added to precipitate the product. Filtration and washing of the solids with ether gave 3- (3-carboxyl) propyloxy-acridinium-9-carboxylate (2,6 dimethyl-4-nitro) phenyl (9) fluorosulfonate. Crystallization from acetonitrile gave the pure compound (yield = 80%).

L'acridinium débarrassé de sa protection (9) (67 mg, 0,13 mmole), dans un ballon à fond rond et à 2 cols de 50 ml, a été dissous dans de l'acétonitrile anhydre (10 ml). Du dicyclohexylcarbodiimide (DCC, 33 mg, 0,16 mmole) a été ajouté et le mélange a été agité pendant 45 minutes à température ambiante. Du N-hydroxysuccinimide (17 mg, 0,15 mmole) a été ajouté et la réaction a été poursuivie pendant 2,5 heures. Une quantité supplémentaire de DCC (14 mg) et de N-hydroxysuccinimide (8 mg) a été ajoutée et les mêmes quantités ont été ajoutées à nouveau au bout de 1,5 heure. 1,5 heure après la dernière addition, de l'acide acétique cristallisable (1,7 litre) a été ajouté pour désactiver le DCC en excès. Le solvant a été éliminé sous vide. The acridinium stripped of its protection (9) (67 mg, 0.13 mmol), in a round-bottomed flask with 2 necks of 50 ml, was dissolved in anhydrous acetonitrile (10 ml). Dicyclohexylcarbodiimide (DCC, 33 mg, 0.16 mmol) was added and the mixture was stirred for 45 minutes at room temperature. N-hydroxysuccinimide (17 mg, 0.15 mmol) was added and the reaction was continued for 2.5 hours. An additional amount of DCC (14 mg) and N-hydroxysuccinimide (8 mg) was added and the same amounts were added again after 1.5 hours. 1.5 hours after the last addition, glacial acetic acid (1.7 liters) was added to deactivate excess DCC. The solvent was removed in vacuo.

Le produit brut a été purifié sur une colonne de CLHP semi-prêparative Dynamax C18 (disponible dans le commerce auprès de Rainin Instrument Co., Inc. Woburn,
Massachusetts) en utilisant un mélange CH3CN/H2O (0,1 % d'acide trifluoracétique) dans le rapport 60/40, comme phase mobile à un débit de 1,8 ml/min en utilisant pour la détection la longueur d'onde de 360 nm. La fraction au temps de rétention égale à 9,4 minutes a été recueillie et les solvants ont été éliminés sous vide. Le fluorosulfonate de 3- (3-succinimidyloxycarbonyl ) propyloxy-acridinium-9- carboxylate de (2,6-diméthyl-4-nitro)phényle (10) a été déshydraté sous vide dans un dessiccateur contenant de l'anhydride phosphorique (rendement = 33 %). SM : FAB, matrice de thioglycérol, 586 (M+).CLHP : Dynamax C18
Rainin (10 mm x 25 mm), mélange CH3CN/H2O (0,1 % d'acide trifluoracétique) dans le rapport 60:40, débit 1,8 ml/min, temps de rétention 9,4 minutes, détecté à 360 nm. The crude product was purified on a Dynamax C18 semi-preparative HPLC column (commercially available from Rainin Instrument Co., Inc. Woburn,
Massachusetts) using a CH3CN / H2O mixture (0.1% trifluoroacetic acid) in the 60/40 ratio, as mobile phase at a flow rate of 1.8 ml / min using for the detection the wavelength of 360 nm. The fraction with a retention time of 9.4 minutes was collected and the solvents were removed in vacuo. 3- (3-succinimidyloxycarbonyl) propyloxy-acridinium-9-carboxylate (2,6-dimethyl-4-nitro) phenyl (10) fluorosulfonate was dehydrated in vacuo in a desiccator containing phosphoric anhydride (yield = 33%). MS: FAB, thioglycerol matrix, 586 (M +). HPLC: Dynamax C18
Rainin (10 mm x 25 mm), CH3CN / H2O mixture (0.1% trifluoroacetic acid) in the ratio 60:40, flow rate 1.8 ml / min, retention time 9.4 minutes, detected at 360 nm .

Exemple 2
Un autre groupement apprécié de la présente invention est le fluorosulfonate de N-méthyl-acridinium-9carboxylate de (2,6-diméthoxy-3-chlorosulfonyl)phényle qui répond à la formule suivante

Example 2
Another appreciated group of the present invention is the fluorosulfonate of N-methyl-acridinium-9 (2,6-dimethoxy-3-chlorosulfonyl) phenylcarboxylate which corresponds to the following formula

Le fluorosulfonate de N-méthyl-acridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthoxy-3-chlorosulfonyl)phényle est synthétisé conformément au schéma. suivant

N-methyl-acridinium-9-carboxylate (2,6-dimethoxy-3-chlorosulfonyl) phenyl fluorosulfonate is synthesized according to the scheme. following

L'estérification de l'acide acridine-9-carboxylique . (11) avec le 2,6-diméthoxyphénol (12) par l'intermédiaire du chlorure d'acide donne l'ester (13). La méthylation de l'azote de 1'acridine avec le fluorosulfate de méthyle et la chlorosulfonation ultérieure avec l'acide chlorosulfonique donnent le marqueur (15). Ces réactions sont décrites plus en détail ci-dessous.Esterification of acridine-9-carboxylic acid. (11) with 2,6-dimethoxyphenol (12) via the acid chloride gives the ester (13). Methylation of acridine nitrogen with methyl fluorosulfate and subsequent chlorosulfonation with chlorosulfonic acid gives the marker (15). These reactions are described in more detail below.

De. l'acide acridine-9-carboxylique (11) (6,10 g, 0,027 mole) dans un ballon à fond de 250 ml a été mélangé à du chlorure de thionyle (130 ml) et le mélange a été chauffé au reflux pendant 2 heures sous agitation. Le chlorure de thionyle en excès a été éliminé dans un évaporateur rotatif. Le résidu a été traité avec du benzène (75 ml) et le solvant a été évaporé sous vide pour éliminer les traces de chlorure de thionyle. Le résidu de chlorure d'acridine-9-carbonyle (11) a été mélangé à de la pyridine (130 ml) et du 2,6-diméthoxyphénol (12) (4,16 g, 0,027 mole) a été ajouté. Le mélange a été chauffé en utilisant un bain d'eau (environ 60çC) pour dissoudre la totalité des substances solides. Après 15 heures d'agitation à température ambiante, le mélange a été versé dans 1 litre d'eau. La suspension a été acidifiée avec de l'acide chlorhydrique concentré à pH 2,0. Le produit solide a été filtré, lavé à l'eau et dissous dans le chloroforme. Acridine-9-carboxylic acid (11) (6.10 g, 0.027 mole) in a 250 ml bottom flask was mixed with thionyl chloride (130 ml) and the mixture was heated to reflux for 2 hours with stirring. The excess thionyl chloride was removed in a rotary evaporator. The residue was treated with benzene (75 ml) and the solvent was evaporated in vacuo to remove traces of thionyl chloride. The acridin-9-carbonyl chloride residue (11) was mixed with pyridine (130 ml) and 2,6-dimethoxyphenol (12) (4.16 g, 0.027 mole) was added. The mixture was heated using a water bath (about 60 ° C) to dissolve all of the solid substances. After 15 hours of stirring at room temperature, the mixture was poured into 1 liter of water. The suspension was acidified with concentrated hydrochloric acid to pH 2.0. The solid product was filtered, washed with water and dissolved in chloroform.

La déshydratation (sulfate de sodium anhydre) et l'évaporation du chloroforme ont donné de l'acridine-9-carboxylate de (2,6-diméthoxy)phényle (13). Celui-ci a été chromatographié sur une colonne de gel de silice en utilisant comme solvant un mélange CHC13/EtOAc dans le rapport 98:2. Les fractions ayant un Rf égal à 0,19 par CCM au moyen du même solvant ont été rassemblées et l'évaporation des solvants a donné l'ester pur (13) (rendement = 30 %).Dehydration (anhydrous sodium sulfate) and evaporation of chloroform gave (2,6-dimethoxy) phenyl acridin-9-carboxylate (13). This was chromatographed on a column of silica gel using a CHCl 3 / EtOAc mixture in the ratio 98: 2 as solvent. The fractions having an Rf equal to 0.19 by TLC using the same solvent were combined and evaporation of the solvents gave the pure ester (13) (yield = 30%).

De l'acridine-9-carboxylate de (2,6-diméthoxy)phényle (13) (2,01 g, 5,6 mmoles) a été dissous dans du dichlorométhane (110 ml, anhydre) dans un ballon à fond rond de 250 ml. Du fluorosulfate de méthyle (4,60 ml, 6,48 g, 56 mmoles) a été ajouté et le mélange a été agité à température ambiante pendant 15 heures. De l'éther anhydre (100 ml) a été ajouté et les substances solides précipitées de couleur jaune brillant ont été filtrées après agitation de la suspension pendant 0,5 heure. La substance solide a été lavée soigneusement avec de l'éther (environ 100 ml), puis avec du pentane (50 ml). L'acridinium a été recristallisé dans l'acétonitrile, donnant du fluorosulfonate d' acridinium-9-carboxylate de 2,6-diméthoxyphényle (14) (rendement = 81 %). (2,6-dimethoxy) phenyl (13) acridine-9-carboxylate (2.01 g, 5.6 mmol) was dissolved in dichloromethane (110 ml, anhydrous) in a round bottom flask. 250 ml. Methyl fluorosulfate (4.60 ml, 6.48 g, 56 mmol) was added and the mixture was stirred at room temperature for 15 hours. Anhydrous ether (100 ml) was added and the bright yellow precipitated solids were filtered after stirring the suspension for 0.5 hour. The solid was washed thoroughly with ether (about 100 ml), then with pentane (50 ml). The acridinium was recrystallized from acetonitrile, giving acridinium-9-carboxylate 2,6-dimethoxyphenyl (14) fluorosulfonate (yield = 81%).

Dans un ballon sec à fond rond et à deux cols de 25 ml, on a introduit le fluorosulfonate de lo-méthyl- acridinium-9-carboxylate de (2 , 6-diméthoxy) phényle (14) (101,7 mg, 0,215 mole), un barreau magnétique d'agitation et du CH2C12 (5 ml). La suspension a été agitée et refroidie à -20C dans un bain de CC14/neige carbonique. De l'acide chlorosulfonique (72 1, 0,125 g, 1,07 mmole) a été ajouté et l'agitation a été poursuivie à -20'C pendant 30 minutes. Puis on a laissé le mélange réactionnel se réchauffer lentement à température ambiante et on l'a agité pendant un temps supplémentaire de 2 heures.De l'éther anhydre (5 ml) a été introduit dans le réacteur, provoquant la formation d'un précipité de couleur jaune clair. Celuici a été filtré et lavé soigneusement à l'éther. La déshydratation sous vide a donné le fluorosulfonate d'acridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthoxy-3-chlorosulfonyl)phényle (15) (rendement = 93,4 %). SM : FAB, matrice de dithiothréitol/dithioérythritol, 472 (M+). Lo (methyl-acridinium-9-carboxylate (14,6-dimethoxy) phenyl (14) fluorosulfonate (14) (101.7 mg, 0.215 mole) was introduced into a 25 ml round-bottomed flask with two necks ), a magnetic stir bar and CH2C12 (5 ml). The suspension was stirred and cooled to -20C in a CC14 / dry ice bath. Chlorosulfonic acid (72 L, 0.125 g, 1.07 mmol) was added and stirring was continued at -20 ° C for 30 minutes. The reaction mixture was then allowed to warm up slowly to room temperature and stirred for an additional 2 hours. Anhydrous ether (5 ml) was added to the reactor, causing a precipitate to form. light yellow in color. This was filtered and washed thoroughly with ether. Dehydration in vacuo gave (2,6-dimethoxy-3-chlorosulfonyl) phenyl (15) acridinium-9-carboxylate fluorosulfonate (yield = 93.4%). MS: FAB, dithiothreitol / dithioerythritol matrix, 472 (M +).

Exemple 3
Un autre groupement apprécié de la présente invention est le fluorosulfonate de N-méthyl-acridinium-9carboxylate de (2,6-diméthyl-4-bromo)phényle qui répond à la formule suivante

Example 3
Another appreciated group of the present invention is the fluorosulfonate of N-methyl-acridinium-9 (2,6-dimethyl-4-bromo) phenylcarboxylate which corresponds to the following formula

Du fluorosulfonate de N-méthyl-acridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthyl-4-bromo)phényle a été synthétise par le même procédé d'estérification que le fluorosulfonate de Nméthyl-acridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthoxy-3chlorosulfonyl)phényle, le phénol substitué utilisé dans la synthèse du fluorosulfonate de N-méthyl-acridinium-9carboxylate de (2,6-diméthoxy-3-chlorosulfonyl)phényle étant remplacé par le 2,6-diméthyl-4-bromophénol.N-methyl-acridinium-9-carboxylate (2,6-dimethyl-4-bromo) phenyl fluorosulfonate was synthesized by the same esterification process as N-methyl-acridinium-9-carboxylate fluorosulfonate (2, 6-dimethoxy-3chlorosulfonyl) phenyl, the substituted phenol used in the synthesis of N-methyl-acridinium-9 (2,6-dimethoxy-3-chlorosulfonyl) phenyl fluorosulfonate being replaced by 2,6-dimethyl-4- bromophenol.

Exemple 4
Un autre groupement apprécié de la présente invention est le fluorosulfonate de N-méthyl-acridinium-9carboxylate de (2,6-diméthyl-3-chlorosulfonyl)phényle qui répond à la formule suivante

Example 4
Another appreciated group of the present invention is the fluorosulfonate of N-methyl-acridinium-9 (2,6-dimethyl-3-chlorosulfonyl) phenylcarboxylate which corresponds to the following formula

Le fluorosulfonate de N-méthyl-acridinium-9-carboxylate de (2, 6-diméthyl-3-chlorosuîfonyl) phényle a été synthétisé par le même procédé que le fluorosulfonate de N-méthylacridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthoxy-3-chloro- sulfonyl)phényle, le 2,6-diméthoxyphénol étant remplacé par le 2,6-diméthylphénol dans l'étape d'estérification.(2,6-dimethyl-3-chlorosulfonyl) phenyl N-methyl-acridinium-9-carboxylate fluorosulfonate was synthesized by the same process as N-methylacridinium-9-carboxylate (2,6-dimethoxy) fluorosulfonate -3-chlorosulfonyl) phenyl, 2,6-dimethoxyphenol being replaced by 2,6-dimethylphenol in the esterification step.

Exemple 5
Un autre groupement de la présente invention est le 3-(3-succinimidyloxycarbonyl)propionyloxy-9, 10- dihydro-N-méthyl-acridane-9-carboxylate de (2,6-diméthyl4-nitro)phényle qui répond à la formule suivante

Example 5
Another group of the present invention is 3- (3-succinimidyloxycarbonyl) propionyloxy-9,10-dihydro-N-methyl-acridane-9-carboxylate of (2,6-dimethyl4-nitro) phenyl which corresponds to the following formula

Le 3- (3-succinimidyloxycarbonyl)propyloxy-9, 10-dihydro-N- méthyl-acridane-9-carboxylate de (2,6-diméthyl-4-nitro)phényle a été synthétisé à partir de l'acide dérivé de l'acridinium (9). La réduction de l'acide (9) avec le cyanoborohydrure de sodium donne l'acridane qui est ensuite transformé en l'ester de NHS par le procédé utilisant un anhydride mixte. Ces réactions sont décrites plus en détail ci-dessous.3- (3-succinimidyloxycarbonyl) propyloxy-9,10-dihydro-N-methyl-acridane-9-carboxylate (2,6-dimethyl-4-nitro) phenyl was synthesized from the acid derived from l 'acridinium (9). Reduction of the acid (9) with sodium cyanoborohydride gives the acridane which is then transformed into the NHS ester by the process using a mixed anhydride. These reactions are described in more detail below.

L'acide dérivé de l'acridinium (9) (210 mg, 0,37 mmole) a été dissous dans un mélange dans le rapport 1:1 d'acétonitrile et de tampon au phosphate 0,1M, à pH 5,2 (60 ml). Une solution de cyanoborohydrure de sodium (190 mg) dans l'acétonitrile (5 ml) a été ajoutée goutte à goutte à la solution d'acridinium. Cela a eu pour résultat la disparition de la couleur jaune de la solution. The acid derived from acridinium (9) (210 mg, 0.37 mmol) was dissolved in a 1: 1 mixture of acetonitrile and 0.1M phosphate buffer, pH 5.2 ( 60 ml). A solution of sodium cyanoborohydride (190 mg) in acetonitrile (5 ml) was added dropwise to the acridinium solution. This resulted in the disappearance of the yellow color from the solution.

L'agitation a été poursuivie pendant 15 minutes. De l'acétonitrile (100 ml) a été ajouté et les solutions ont été éliminées dans un évaporateur rotatif. Le résidu, sous forme d'une suspension dans l'eau, a été soumis à une extraction par l'acétate d'éthyle. La phase organique a été lavée a l'eau et déshydratée. L'élimination des solvants a donné du 3-(3-carboxy)propyloxy-9,10-dihydro-acridane-9- carboxylate de (2,6-diméthyl-4-nitro)phényle (rendement = 90 %).Stirring was continued for 15 minutes. Acetonitrile (100 ml) was added and the solutions were removed in a rotary evaporator. The residue, as a suspension in water, was extracted with ethyl acetate. The organic phase was washed with water and dried. Removal of the solvents gave 3- (3-carboxy) propyloxy-9,10-dihydro-acridane-9-carboxylate of (2,6-dimethyl-4-nitro) phenyl (yield = 90%).

L'acide dérivé de l'acridane (125 mg, 0,255 mmole) et de la N-méthylmorpholine (28 1) ont été dissous dans de l'acétonitrile anhydre (15 ml). Le mélange a été refroidi dans un bain de CCl4/neige carbonique, sous atmosphère d'azote. Du chloroformiate d'isobutyle (35 1) a été ajouté, le mélange a été agité pendant 3 minutes et du
N-hydroxysuccinimide (35 mg), dissous dans l'acétonitrile (2 ml), a été ajouté. Après agitation à -20 C pendant 15 minutes, on a enlevé le bain de CCl4/neige carbonique et on a laissé le mélange réactionnel se réchauffer à température ambiante. Au bout de 2 heures, les solvants ont été évaporés et le résidu soumis à une extraction par l'acétate d'éthyle. Le chlorhydrate de N-méthylmorpholine insoluble a été éliminé par filtration. Le filtrat a été concentré et de l'hexane (20 ml) a été ajouté. Le refroidissement a pour résultat la cristallisation de 3-(3succinimidyloxycarbonyl)propyloxy-9,10-dihydro-N-méthylacridane-9-carboxylate de. (2, 6-diméthyl-4-nitro) phényle'. The acid derived from acridane (125 mg, 0.255 mmol) and N-methylmorpholine (28 L) were dissolved in anhydrous acetonitrile (15 ml). The mixture was cooled in a CCl4 / dry ice bath, under a nitrogen atmosphere. Isobutyl chloroformate (35 L) was added, the mixture was stirred for 3 minutes and
N-hydroxysuccinimide (35 mg), dissolved in acetonitrile (2 ml), was added. After stirring at -20 ° C for 15 minutes, the CCl4 / dry ice bath was removed and the reaction mixture was allowed to warm to room temperature. After 2 hours, the solvents were evaporated and the residue subjected to extraction with ethyl acetate. The insoluble N-methylmorpholine hydrochloride was removed by filtration. The filtrate was concentrated and hexane (20 ml) was added. Cooling results in the crystallization of 3- (3succinimidyloxycarbonyl) propyloxy-9,10-dihydro-N-methylacridane-9-carboxylate. (2,6-dimethyl-4-nitro) phenyl '.

Les cristaux ont été finalement filtrés et lavés à l'hexane (rendement = 70 %). SM : FAB, matrice de dithiothréitol/dithioérythritol, 588 (M+ +1), CLHP : Novapak C18 Waters (3,9 mm x 15 mm) (disponible dans le commerce auprès de Millipore Corporation, Waters Chromatography Division,
Milford, Xassachusetts), mélange CH3CN/H2O (0,1 % d'acide trifluoracétique) dans le rapport 60:40, débit 1,0 ml/min, temps de rétention 6,34 minutes, détecté à 280 nm.The crystals were finally filtered and washed with hexane (yield = 70%). MS: FAB, dithiothreitol / dithioerythritol matrix, 588 (M + +1), HPLC: Novapak C18 Waters (3.9 mm x 15 mm) (commercially available from Millipore Corporation, Waters Chromatography Division,
Milford, Xassachusetts), CH3CN / H2O mixture (0.1% trifluoroacetic acid) in the ratio 60:40, flow rate 1.0 ml / min, retention time 6.34 minutes, detected at 280 nm.

Exemple 6
Un autre groupement de la présente invention est le chlorhydrate de chlorure de 3-oxo-butyrimidate de Nméthyl-acridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthyl-4nitro)phényle, qui répond à la formule suivante

Example 6
Another group of the present invention is the hydrochloride of 3-oxo-butyrimidate of N-methyl-acridinium-9-carboxylate of (2,6-dimethyl-4nitro) phenyl, which corresponds to the following formula

Le chlorhydrate de chlorure de 3-oxo-butyrimidate de Nméthyl-acridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthyl-4- nitro)phényle est synthétisé conformément au schéma suivant

N-methyl-acridinium-9-carboxylate (2,6-dimethyl-4-nitro) phenyl 3-oxo-butyrimidate hydrochloride hydrochloride is synthesized according to the following scheme

La réaction de 1'acide 3-hydroxy-9-acridine-carboxylique (16) avec le 4-bromobutyronitrile donne un ester (17).The reaction of 3-hydroxy-9-acridine-carboxylic acid (16) with 4-bromobutyronitrile gives an ester (17).

L'hydrolyse de l'ester et la réestérification avec le 2,6diméthyl-4-nitrophénol donne le composé (19). La méthylation avec le fluorosulfate de méthyle et la transformation du groupe cyano en l'imidate au moyen d'acide chlorhydrique gazeux et de méthanol donne le chlorhydrate de chlorure de 3-oxo-butyrimidate de N-méthyl-acridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthyl-4-nitro)phényle (21). Ces réactions sont décrites plus en détail ci-dessous.Hydrolysis of the ester and reesterification with 2,6dimethyl-4-nitrophenol gives compound (19). Methylation with methyl fluorosulfate and transformation of the cyano group into the imidate by means of gaseous hydrochloric acid and methanol gives the hydrochloride of N-methyl-acridinium-9-carboxylate 3-oxo-butyrimidate. 2,6-dimethyl-4-nitro) phenyl (21). These reactions are described in more detail below.

De 1 'acide 3-hydroxy-9-acridine-carboxylique (16) (2 g, 8,4 mmoles), du 4-bromobutyronitrile (5,87 ml, 8,74 g, 34 mmoles) et du carbonate de césium (11,08 g, 34 mmoles) ont été dissous dans du DMSO anhydre (50 ml) dans un ballon à fond rond de 100 ml. Le mélange a été chauffé à environ 50ec dans un bain d'eau, sous agitation. 3-hydroxy-9-acridine-carboxylic acid (16) (2 g, 8.4 mmol), 4-bromobutyronitrile (5.87 ml, 8.74 g, 34 mmol) and cesium carbonate ( 11.08 g, 34 mmol) were dissolved in anhydrous DMSO (50 ml) in a 100 ml round bottom flask. The mixture was heated to about 50 ° C in a water bath, with stirring.

Au bout de 3 heures, le mélange a été versé dans de l'eau (600 ml). Les substances solides ont été filtrées et ont été dissoutes dans le chloroforme. La déshydratation et l'évaporation du solvant ont donné l'ester (3-cyano)propylique de l'acide 3-(3-cyano)propoxy-acridine-9carboxylique (17). Puis celui-ci a été dissous dans le toluène (50 ml) et du cyclohexane (150 ml) a été ajouté. Le produit pur (17) s'est séparé, puis a été filtré et déshydraté. Le produit déshydraté a été purifié par chromatographie sur couche mince en utilisant de l'acétate d'éthyle comme phase mobile (Rf = 0,58) (rendement = 78,6 %).After 3 hours, the mixture was poured into water (600 ml). The solids were filtered and dissolved in chloroform. Dehydration and evaporation of the solvent gave 3- (3-cyano) propoxy-acridine-9carboxylic acid (3-cyano) propyl ester (17). Then this was dissolved in toluene (50 ml) and cyclohexane (150 ml) was added. The pure product (17) separated, then was filtered and dried. The dehydrated product was purified by thin layer chromatography using ethyl acetate as mobile phase (Rf = 0.58) (yield = 78.6%).

L'ester cyanopropylique (17) (3,73 g, 10 nimolès) a été dissous dans un mélange de NaOH 0,5N (90 ml) et de méthanol (90 ml) et a été agité dans un bain d'eau 6a-c en utilisant un condenseur à reflux pendant 2,5 heures. Le méthanol a été éliminé dans un évaporateur rotatif et le produit a été soumis à une extraction avec de l'acétate d'éthyle après acidification de la phase aqueuse au moyen d'acide chlorhydrique concentré. La déshydratation et l'évaporation du solvant ont donné l'acide 3-(3 cyano) propoxy-acridine-9-carboxylique (18) (rendement = 80 %). The cyanopropyl ester (17) (3.73 g, 10 nimoles) was dissolved in a mixture of 0.5N NaOH (90 ml) and methanol (90 ml) and was stirred in a water bath 6a- c using a reflux condenser for 2.5 hours. The methanol was removed in a rotary evaporator and the product was extracted with ethyl acetate after acidification of the aqueous phase with concentrated hydrochloric acid. Dehydration and evaporation of the solvent gave 3- (3 cyano) propoxy-acridine-9-carboxylic acid (18) (yield = 80%).

L'acide carboxylique (18) (4,62 g, 15 mmoles) a été dissous dans de la pyridine (130 ml) et la solution a été refroidie dans un bain CC14/neige carbonique. Du chlorure de para-toluenesulfonyle (5,8 g, 30 mmoles) a été ajouté et le bain a été enlevé. Après 15 minutes d'agitation à température ambiante, du 2,6-diméthyl-4-nitrophénol (2,8 g, 16,8 mmoles) a été ajouté. Au bout de 18 heures à température ambiante, de l'eau (10 ml) a été ajoutée et les solvants ont été éliminés sous vide.Le résidu a été dissous dans du chloroforme (200 ml) et la phase organique a été lavée avec une solution de bicarbonate de sodium saturée (2 x 100 ml), de l'eau (2 x 100 ml), HC1 1N (1 x 100 ml) et, finalement, avec de l'eau (2 x 100 ml). La déshydratation et l'évaporation du solvant ont donné du 3 (3-cyano)propoxy-acridine-9-carboxylate de (2,6-diméthyl-4- nitro)phényle (19) qui a été chromatographié dans une colonne de gel de silice en utilisant comme solvant un mélange acétate d'éthyle/hexane (7:3) (rendement = 74,5 %). The carboxylic acid (18) (4.62 g, 15 mmol) was dissolved in pyridine (130 ml) and the solution was cooled in a CC14 / dry ice bath. Para-toluenesulfonyl chloride (5.8 g, 30 mmol) was added and the bath was removed. After 15 minutes of stirring at room temperature, 2,6-dimethyl-4-nitrophenol (2.8 g, 16.8 mmol) was added. After 18 hours at room temperature, water (10 ml) was added and the solvents were removed in vacuo. The residue was dissolved in chloroform (200 ml) and the organic phase was washed with a saturated sodium bicarbonate solution (2 x 100 ml), water (2 x 100 ml), 1N HC1 (1 x 100 ml) and, finally, with water (2 x 100 ml). Dehydration and evaporation of the solvent gave (2,6-dimethyl-4-nitro) phenyl (19) 3 (3-cyano) propoxy-acridine-9-carboxylate (19) which was chromatographed in a gel column. silica using as solvent a mixture of ethyl acetate / hexane (7: 3) (yield = 74.5%).

L'ester (19) (1,6 g, 3,52 mmoles) a été dissous dans du chlorure de méthylène anhydre (50 ml) et, sous atmosphère d'azote, du fluorosulfate de méthyle (1,6 ml, 17,6 mmoles) a été ajouté. La solution a été agitée à température ambiante pendant 20 heures. De l'éther anhydre (100 ml) a été ajouté et le fluorosulfonate de 3-(3cyano) propoxy-acridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthyl-4- nitro)phényle (20) a été filtré, lavé à l'éther et déshydraté sous vide (rendement = 84,7 %). Ester (19) (1.6 g, 3.52 mmol) was dissolved in anhydrous methylene chloride (50 ml) and, under nitrogen, methyl fluorosulfate (1.6 ml, 17, 6 mmoles) has been added. The solution was stirred at room temperature for 20 hours. Anhydrous ether (100 ml) was added and the 3- (3cyano) propoxy-acridinium-9-carboxylate fluorosulfonate (2,6-dimethyl-4-nitro) phenyl (20) was filtered, washed with ether and dehydrated under vacuum (yield = 84.7%).

L'ester d'acridinium (20) (4 mg, 7,4 x 10-3 mmoles) 'a été dissous dans du méthanol (0,5 ml) dans un ballon à 2 cols de 5 ml. On a fait barboter soigneuse- ment de l'acide chlorhydrique gazeux anhydre pendant 10 minutes. De l'éther anhydre (3 ml) a été ajouté. Le chlorhydrate de chlorure de 3-oxo-butyrimidate de N-méthylacridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthyl-4-nitro)phényle (21) a été séparé et lavé à l'éther. La substance solide a été déshydratée sous vide et a été entreposée dans un dessiccateur contenant de l'anhydride phosphorique. The acridinium ester (20) (4 mg, 7.4 x 10-3 mmol) was dissolved in methanol (0.5 ml) in a 2-necked 5 ml flask. Anhydrous gaseous hydrochloric acid was bubbled carefully for 10 minutes. Anhydrous ether (3 ml) was added. The 3-oxo-butyrimidate hydrochloride chloride of (2,6-dimethyl-4-nitro) phenyl N-methylacridinium-9-carboxylate (21) was separated and washed with ether. The solid was dried in vacuo and stored in a desiccator containing phosphoric anhydride.

ExemDle 7
Un autre groupement de la présente invention est le fluorosulfonate de N-méthylphénanthridinium-6- carboxylate de (2,6-diméthyl-4-nitro)phényle qui répond à la formule suivante

EXAMPLE 7
Another group of the present invention is N-methylphenanthridinium-6-carboxylate (2,6-dimethyl-4-nitro) phenyl fluorosulfonate which corresponds to the following formula

Le fluorosulfonate de N-méthylphénanthridinium-6carboxylate de (2,6-diméthyl-4-nitro)phényle est synthétisé conformément au schéma suivant

N-methylphenanthridinium-6 (2,6-dimethyl-4-nitro) phenylcarboxylate fluorosulfonate is synthesized according to the following scheme

Du 2-aminobiphényle (16,9 g, 0,1 mole) a été dissous dans de la pyridine anhydre (30 ml) et de l'anhydride acétique (lu,5 ml, 0,11 mole) a été ajouté. La solution a été agitée brièvement par secousses, a été refroidie à température ambiante et laissée au repos pendant 15 heures.Après l'addition d'eau (50 ml), le Nacétyl-2-aminobiphényle (22) a été séparé par filtration et recristallisé dans une solution aqueuse d'éthanol, donnant 19,6 g d'aiguilles de couleur blanche (rendement = 93 %). 2-Aminobiphenyl (16.9 g, 0.1 mole) was dissolved in anhydrous pyridine (30 ml) and acetic anhydride (lu, 5 ml, 0.11 mole) was added. The solution was briefly shaken, cooled to room temperature and allowed to stand for 15 hours. After the addition of water (50 ml), Nacetyl-2-aminobiphenyl (22) was separated by filtration and recrystallized from an aqueous ethanol solution, giving 19.6 g of white needles (yield = 93%).

Le N-acétyl-2-aminobiphényle (22) (19 g, 0,09 mole) a été chauffé doucement au reflux avec du chlorure de phophoryle fraîchement distillé (45 ml, 0,49 mole) pendant 80 minutes. Puis la solution a été refroidie dans de la glace et le précipité (chlorhydrate de 6-méthylphénanthridine) a été séparé par filtration, dissous dans l'eau et rendu alcalin au moyen d'ammoniaque. The N-acetyl-2-aminobiphenyl (22) (19 g, 0.09 mole) was gently heated at reflux with freshly distilled phophoryl chloride (45 ml, 0.49 mole) for 80 minutes. The solution was then cooled in ice and the precipitate (6-methylphenanthridine hydrochloride) was separated by filtration, dissolved in water and made alkaline with ammonia.

Puis lNa solution a été soumise à une extraction avec de l'éther (4 x 75 ml). L'extrait a été déshydraté sur du sulfate de sodium et l'éther a été éliminé sous vide.Then the solution was extracted with ether (4 x 75 ml). The extract was dried over sodium sulfate and the ether was removed in vacuo.

L'huile de couleur jaune résultante a été dissoute dans du cyclohexane bouillant (400 ml) et, par refroidissement, a donné des aiguilles blanches de 6-méthylphénanthridine (23) (rendement = 63 %).The resulting yellow oil was dissolved in boiling cyclohexane (400 ml) and, upon cooling, gave white needles of 6-methylphenanthridine (23) (yield = 63%).

La 6-(2-hydroxy-l-hydroxyméthyléthyl)phénanthridine (24) a été préparée en traitant la 6méthylphénanthridine (23) avec du formaldéhyde suivant le procédé de Morgan et Walls, J. Chem. Soc. 34:2447 (1931), qui est cité à titre de référence dans le présent mémoire. Des aiguilles blanches de 6-(2-hydroxy-1hydroxyméthyléthyl)-phénanthridine (24) se sont formées (rendement = 57%).. 6- (2-hydroxy-1-hydroxymethylethyl) phenanthridine (24) was prepared by treating 6methylphenanthridine (23) with formaldehyde according to the method of Morgan and Walls, J. Chem. Soc. 34: 2447 (1931), which is cited for reference in this memo. White needles of 6- (2-hydroxy-1hydroxymethylethyl) phenanthridine (24) were formed (yield = 57%).

Un mélange de 6- (2-hydroxy-l-hydroxyméthyl) - phénanthridine (24) (6 g, 31 mmoles) et de dioxyde de sélénium finement pulvérisé (3,8 g, 34 mmoles) a été chauffé au reflux dans l'acétate d'éthyle (125 ml) pendant 10 heures. Puis la solution de couleur rouge fonce a. été filtrée à chaud à travers de la Celite, avant évaporation à siccité. La substance solide résultante a été digérée dans de l'acide chlorhydrique 1M chaud (125 ml), a été filtrée et partiellement neutralisée avec du bicarbonate de sodium. A mixture of 6- (2-hydroxy-1-hydroxymethyl) - phenanthridine (24) (6 g, 31 mmol) and finely pulverized selenium dioxide (3.8 g, 34 mmol) was heated to reflux in ethyl acetate (125 ml) for 10 hours. Then the red solution darkens a. was filtered hot through Celite, before evaporation to dryness. The resulting solid was digested in hot 1M hydrochloric acid (125 ml), filtered and partially neutralized with sodium bicarbonate.

Le précipité initial de couleur rouge a été éliminé par filtration avant neutralisation totale de la solution. La substance solide résultante de couleur jaune pâle a été séparée par filtration et recristallisée dans un mélange acétone/éther de pétrole, donnant 2,7 g de 6-formylphénanthridine (rendement = 42%).The initial red-colored precipitate was removed by filtration before total neutralization of the solution. The resulting pale yellow solid was separated by filtration and recrystallized from an acetone / petroleum ether mixture, yielding 2.7 g of 6-formylphenanthridine (yield = 42%).

La 6-carboxyphénanthridine (25) a été préparée par oxydation à l'acide chromique de la 6-formylphénanthridine suivant le procédé de Morgan et Walls, J. Chem. Soc. 6-carboxyphenanthridine (25) was prepared by chromic acid oxidation of 6-formylphenanthridine according to the method of Morgan and Walls, J. Chem. Soc.

34:2447 (1931) qui est cité à titre de référence dans le présent mémoire. Une poudre blanche du produit (25) s'est formée (rendement égal = 60%).34: 2447 (1931) which is cited for reference in this memo. A white powder of the product (25) was formed (equal yield = 60%).

De la 6-carboxyphénanthridine (25) (662 mg, 3 mmoles) a été dissoute dans de la pyridine anhydre (14 ml) et refroidie à 0C. Du chlorure de p-toluènesulfonyle (1,15 g, 6 mmoles) a été ajouté, suivi par du 2,6-diméthyl4-nitrophénol (501 mg, 3 mmoles) et le mélange a été laissé au repos pendant une nuit à 4'C. La solution résultante de couleur brune a été agitée dans un mélange de glace et d'eau. Le précipité a été séparé par filtration et a été chromatographié sur du gel de silice en utilisant un mélange chloroforme/hexane (1:1) pour obtenir du phénanthridine-6-carboxylate de (2,6-diméthyl-4-nitro)phényle (26) (rendement 60%). 6-carboxyphenanthridine (25) (662 mg, 3 mmol) was dissolved in anhydrous pyridine (14 ml) and cooled to 0C. P-toluenesulfonyl chloride (1.15 g, 6 mmol) was added, followed by 2,6-dimethyl4-nitrophenol (501 mg, 3 mmol) and the mixture was allowed to stand overnight at 4 ' vs. The resulting brown solution was stirred in a mixture of ice and water. The precipitate was separated by filtration and was chromatographed on silica gel using a chloroform / hexane mixture (1: 1) to obtain phenanthridine-6-carboxylate of (2,6-dimethyl-4-nitro) phenyl ( 26) (yield 60%).

L'ester (26) (369 mg, 1 mmole) a été mis en suspension dans du chlorure de méthylène anhydre (5 ml) dans un ballon sec à fond rond à deux cols de 25 ml. La suspension a été refroidie dans un bain de neige carbonique/CC14, sous atmosphère d'azote. De l'acide chlorosulfoné (342 1, 6 mmoles) a été ajouté et l'agitation a été poursuivie å -20-C pendant 30 minutes. Puis on a laissé le mélange se réchauffer lentement à température ambiante et on l'a agité pendant un temps supplémentaire de 2 heures. Ester (26) (369 mg, 1 mmol) was suspended in anhydrous methylene chloride (5 ml) in a dry round bottom flask with two 25 ml necks. The suspension was cooled in a dry ice / CC14 bath, under a nitrogen atmosphere. Chlorosulfonated acid (342 1.6 mmol) was added and stirring was continued at -20-C for 30 minutes. The mixture was then allowed to warm slowly to room temperature and stirred for an additional 2 hours.

De l'éther anhydre (20 ml) a été ajouté et les substances solides précipitées ont été filtrées et lavées à l'éther.Anhydrous ether (20 ml) was added and the precipitated solids were filtered and washed with ether.

La déshydratation a donné du fluorosulfonate de N-méthyl phénanthridinium-6-carboxylate de (2,6-diméthyl-4-nitro)phényle (27) (rendement = 90%).Dehydration gave (2,6-dimethyl-4-nitro) phenyl (27) N-methyl phenanthridinium-6-carboxylate fluorosulfonate (27) (yield = 90%).

Exe=Dle 8
Un autre groupement de la présente invention est le fluorosulfonate de 5,6-dihydro-N-méthylphénanthridi- nium-6-carboxylate de (2,6-diméthyl-4-nitro)phényle qui répond a la formule suivante

Exe = Dle 8
Another group of the present invention is the 5,6-dihydro-N-methylphenanthridinium-6-carboxylate (2,6-dimethyl-4-nitro) phenyl fluorosulfonate which corresponds to the following formula

Le fluorosulfonate de 5,6-dihydro-N-méthylphénanthridinium-6-carboxylate de (2,6-diméthyl-4-nitro)phényle est synthétisé à partir de l'analogue de phénanthridinium non réduit (27). Le phénanthridinium (27) (398 mg, 0,8 mmole) a été dissous dans un mélange dans le rapport 1:1 d'acétonitrile et de tampon au phosphate 0,1 M, à pH 5,2 (80 ml). Une solution de cyanoborohydrure de sodium (410 mg) dans l'acétonitrile (10 ml) a été ajoutée goutte à goutte à la solution de phénanthridinium.Cela a eu pour résultat la disparition de la couleur jaune de la solution. L'agitation a été poursuivie pendant 15 minutes. The 5,6-dihydro-N-methylphenanthridinium-6-carboxylate (2,6-dimethyl-4-nitro) phenyl fluorosulfonate is synthesized from the unreduced phenanthridinium analog (27). Phenanthridinium (27) (398 mg, 0.8 mmol) was dissolved in a 1: 1 mixture of acetonitrile and 0.1 M phosphate buffer, pH 5.2 (80 ml). A solution of sodium cyanoborohydride (410 mg) in acetonitrile (10 ml) was added dropwise to the phenanthridinium solution, resulting in the disappearance of the yellow color from the solution. Stirring was continued for 15 minutes.

De l'acétonitrile (100 ml) a été ajouté et les solvants ont été éliminés dans un évaporateur rotatif. Le résidu a été mis en suspension dans l'eau et soumis à une extraction avec de l'acétate d'éthyle. La phase organique a été lavée et déshydratée. L'élimination des solvants a donné du fluorosulfonate de 5, 6-dihydro-N-méthyîphénanthridinium-6- carboxylate de (2, 6-diméthyl-4-nitro)phényle (rendement = 90%).Acetonitrile (100 ml) was added and the solvents were removed in a rotary evaporator. The residue was suspended in water and extracted with ethyl acetate. The organic phase was washed and dried. Removal of the solvents gave 5,6-dihydro-N-methylphenanthridinium-6-carboxylate (2,6-dimethyl-4-nitro) phenyl fluorosulfonate (yield = 90%).

Exemple 9
Un autre groupement dans la présente invention est le fluorosulfonate de 2-phényl-N-méthyl-quinolinium-4carboxylate de (2,6-diméthoxy-3-chlorosulfonylphényle), qui répond à la formule suivante

le fluorosulfonate de 2-phényl-N-méthyl-quinolinium-4- carboxylate de (2,6-diméthoxy-3 (2,6-diméthoxy-3-chlorosulfonylphényle) est synthétisé conformément au schéma suivant

Example 9
Another group in the present invention is 2-phenyl-N-methyl-quinolinium-4 (2,6-dimethoxy-3-chlorosulfonylphenyl) fluorosulfonate, which corresponds to the following formula

2-phenyl-N-methyl-quinolinium-4-carboxylate (2,6-dimethoxy-3 (2,6-dimethoxy-3-chlorosulfonylphenyl)) fluorosulfonate is synthesized according to the following scheme

De l'acétophénone (29) (120 g, 1 mole) et de l'isatine (30) (147 g, 1 mole) ont été chauffées au reflux pendant 10 heures dans de l'eau et de méthanol, avec de l'hydroxyde de potassium (17 g). L'acide 2-phényl-quinoléine-4-carboxylique (31) a été séparé de méthanol sous forme d'aiguilles de couleur blanche (rendement 84%). Acetophenone (29) (120 g, 1 mole) and isatin (30) (147 g, 1 mole) were heated at reflux for 10 hours in water and methanol, with potassium hydroxide (17 g). The 2-phenyl-quinoline-4-carboxylic acid (31) was separated from methanol in the form of white needles (yield 84%).

L'acide 2-phényl-quinoléine-carboxylique (31) (735 mg, 3 mmoles) a été dissous dans de la pyridine anhydre (14 ml) et refroidi dans un bain d'eau et de glace. Du chlorure de p-toluènesulfonyle (1,15 g, 6 mmoles) a été ajouté et le mélange a été agité pendant 15 minutes. The 2-phenyl-quinoline carboxylic acid (31) (735 mg, 3 mmol) was dissolved in anhydrous pyridine (14 ml) and cooled in an ice and water bath. P-toluenesulfonyl chloride (1.15 g, 6 mmol) was added and the mixture was stirred for 15 minutes.

Du 2,6-diméthoxyphénol (462 mg, 3 mmoles) a été ajouté et le mélange a été agité à température ambiante pendant 15 heures. La solution a été versée dans un mélange d'eau et de glace (300 ml) et le 2-phényl-quinoléine-4-carboxylate de (2,6-diméthoxy)phényle (32) a été filtré. Les substances solides ont été déshydratées et purifiées sur une colonne de gel de silice en utilisant un mélange chloroforme/hexane (1:1) (rendement = 50%).2,6-Dimethoxyphenol (462 mg, 3 mmol) was added and the mixture was stirred at room temperature for 15 hours. The solution was poured into a mixture of water and ice (300 ml) and the (2,6-dimethoxy) phenyl (32) 2-phenyl-quinoline-4-carboxylate (32) was filtered. The solids were dried and purified on a silica gel column using a chloroform / hexane mixture (1: 1) (yield = 50%).

L'ester (32) (381 g, 1 mmole) a été dissous dans du chlorure de méthylène anhydre (3 ml) et du fluorosulfate de méthyle (492 1, 0,69 g, 6 mmoles) a été ajouté. Après 15 heures d'agitation a température ambiante sous atmosphère d'azote, de l'éther anhydre (20 ml) a été ajouté. Le fluorosulfonate de 2-phényl-N-méthyl-quinoléine- 4-carboxylate de (2,6-diméthoxy)phényle (33) a été filtré, lavé à l'éther et déshydraté (rendement = 95%). Ester (32) (381 g, 1 mmol) was dissolved in anhydrous methylene chloride (3 ml) and methyl fluorosulfate (492 1, 0.69 g, 6 mmol) was added. After 15 hours of stirring at room temperature under a nitrogen atmosphere, anhydrous ether (20 ml) was added. The 2,6-dimethoxy) phenyl (33) 2-phenyl-N-methyl-quinoline-4-carboxylate fluorosulfonate (33) was filtered, washed with ether and dried (yield = 95%).

L'ester (33) (200 mg, 0,4 mmole) a été mis en suspension dans du chlorure de méthylène anhydre (5 ml), dans un ballon sec à fond rond et à deux cols de 25 ml. La suspension a été refroidie dans un bain de neige carbonique/CCl4, sous atmosphere d'azote. De l'acide chlorosulfonique (144 1, 2 mmoles) a été ajouté et l'agitation a été poursuivie à -20iC pendant 0,5 heure. Puis on a laissé le mélange. se réchauffer lentement a température ambiante et on l'a agité pendant un temps supplémentaire de 2 heures. De l'éther anhydre (20 ml) a été ajouté et le fluorosulfonate de 2-phényl-N-méthyl-quinolinium-4carboxylate de (2,6-diméthoxy-3-chlorosulfonyl)phényle (34) a été filtré, lavé å l'éther et déshydraté (rende ment.= 90%). The ester (33) (200 mg, 0.4 mmol) was suspended in anhydrous methylene chloride (5 ml), in a dry round bottom flask with two 25 ml necks. The suspension was cooled in a dry ice / CCl4 bath, under a nitrogen atmosphere. Chlorosulfonic acid (144 1.2 mmol) was added and stirring was continued at -20 ° C for 0.5 hour. Then we left the mixture. warm slowly to room temperature and stirred for an additional 2 hours. Dry ether (20 ml) was added and 2-phenyl-N-methyl-quinolinium-4 (2,6-dimethoxy-3-chlorosulfonyl) phenylcarboxylate (34) fluorosulfonate (34) was filtered, washed in l 'ether and dehydrated (yield = 90%).

Exemple 10
Un autre groupement de la présente invention est le 2-phényl-1,4-dihydro-N-méthyl-quinoléine-4-carboxylate de (2,6-diméthyl-4-bromo)phényle qui répond à la formule suivante

Example 10
Another group of the present invention is the (2,6-dimethyl-4-bromo) phenyl 2-phenyl-1,4-dihydro-N-methyl-quinoline-4-carboxylate which corresponds to the following formula

Le 2-phényl-1,4-dihydro-N-méthyl-quinoléine-4- carboxylate de (2,6-diméthyl-4-bromo)phényle a été synthétisé à partir du 2-phényl-N-méthyl-quinolinium-4- carboxylate de (2, 6-diméthyl-4-bromo) phényle par réduction avec du cyanoborohydrure de sodium. Le quinolinium non réduit a été obtenu par le même mode opératoire que le groupement (2, 6-diméthyl-4-bromo) phénylacridinium décrit ci-dessus, 1'acridine étant remplacée par la quinoléine. (2,6-dimethyl-4-bromo) phenyl 2-phenyl-1,4-dihydro-N-methyl-quinoline-4-carboxylate was synthesized from 2-phenyl-N-methyl-quinolinium-4 - (2,6-dimethyl-4-bromo) phenyl carboxylate by reduction with sodium cyanoborohydride. Unreduced quinolinium was obtained by the same procedure as the (2,6-dimethyl-4-bromo) phenylacridinium group described above, acridine being replaced by quinoline.

L'ester de quinolinium (500 mg, 0,9 mmole) a été dissous dans un mélange dans le rapport 1:1 d'acétonitrile et de tampon au phosphate 0,1M à pH 5,2 (80 ml). Une solution de cyanoborohydrure de sodium (56 mg, 0,9 mmole) dans un mélange d'acétonitrile/tampon (10 ml) a été ajoutée. Après agitation pendant 2 minutes, le mélange a été acidifié à pH 2,0 et de ltacétonitrile (100 ml) a été ajouté. Les solvants ont été éliminés dans un évaporateur rotatif. Le résidu a été mis en suspension dans l'eau.et a été soumis à une extraction avec de l'acétate d'éthyle.La déshydratation et l'évaporation de l'acétate d'éthyle ont donné du 2-phényl-1,4-dihydro-N-méthyl-quinoléine-4- carboxylate de (2,6-diméthyl-4-bromopphényle (rendement = 70%). The quinolinium ester (500 mg, 0.9 mmol) was dissolved in a 1: 1 mixture of acetonitrile and 0.1M phosphate buffer pH 5.2 (80 ml). A solution of sodium cyanoborohydride (56 mg, 0.9 mmol) in an acetonitrile / buffer mixture (10 ml) was added. After stirring for 2 minutes, the mixture was acidified to pH 2.0 and acetonitrile (100 ml) was added. The solvents were removed in a rotary evaporator. The residue was suspended in water. And was extracted with ethyl acetate. Dehydration and evaporation of ethyl acetate gave 2-phenyl-1, 4-dihydro-N-methyl-quinoline-4-carboxylate (2,6-dimethyl-4-bromopphenyl (yield = 70%).

Exemr > le 11
Un autre groupement de la présente invention est le 2-phényl-1,2,3,4-tétrahydro-N-méthyl-quinoléine-4- carboxylate de (2,6-diméthyl-4-bromo)phényle, qui répond à la formule

Example> 11
Another group of the present invention is 2-phenyl-1,2,3,4-tetrahydro-N-methyl-quinoline-4-carboxylate of (2,6-dimethyl-4-bromo) phenyl, which responds to the formula

Le 2-phényl-1,2,3,4-tétrahyro-N-méthyl- quinoléine-4-carbqxylate de (2,6-diméthyl-4-bromo)phényle a été synthétisé à partir du 2-phényl-N-méthyl-quinolinium-4carboxylate de (2,6-diméthyl-4-bromo)phényle par réduction avec le cyanoborohydrure de sodium. Le quinolinium non réduit a été obtenu par le même mode -opératoire que le composé de (2,6-diméthyl-4-bromo)phénylacridinium décrit ci-dessus, l'acridine étant remplacée par la quinoléine. 2-phenyl-1,2,3,4-tetrahyro-N-methyl-quinoline-4-carbqxylate (2,6-dimethyl-4-bromo) phenyl was synthesized from 2-phenyl-N-methyl (2,6-dimethyl-4-bromo) phenylquinolinium-4carboxylate by reduction with sodium cyanoborohydride. Unreduced quinolinium was obtained by the same procedure as the (2,6-dimethyl-4-bromo) phenylacridinium compound described above, acridine being replaced by quinoline.

L'ester de quinolinium (500 mg, 0,9 mmole) a été dissous dans un mélange dans le rapport 1:1 d'acétonitrile et de tampon au phosphate (0,lM à pH 5,2 (80 ml). Une solution de cyanoborohydrure de sodium (560 mg, 9,0 mmoles) dans un mélange acétonitrile/tampon (20 ml) a été ajoutée;
Après agitation pendant 30 minutes, le mélange a été acidifié à pH 2,0 avec de l'acide chlorhydrique 0,1N et a été agité pendant un temps supplémentaire de 5 minutes. De l'acétonitrile (100 ml) a été ajouté et les solvants ont été éliminés dans un évaporateur rotatif. Le résidu a été mis en suspension dans l'eau et a été soumis å une extraction avec de l'acétate d'éthyle.La déshydratation et l'évaporation de l'acétate d'éthyle ont donné du 2-phényl 1,2,3, 4-tétrahydro-N-méthyl-quinoléine-4-carboxylate de (2,6-diméthyl-4-bromo)phényle (rendement = 80%).The quinolinium ester (500 mg, 0.9 mmol) was dissolved in a 1: 1 mixture of acetonitrile and phosphate buffer (0.1 µM at pH 5.2 (80 ml). sodium cyanoborohydride (560 mg, 9.0 mmol) in an acetonitrile / buffer mixture (20 ml) was added;
After stirring for 30 minutes, the mixture was acidified to pH 2.0 with 0.1N hydrochloric acid and was stirred for an additional 5 minutes. Acetonitrile (100 ml) was added and the solvents were removed in a rotary evaporator. The residue was suspended in water and extracted with ethyl acetate. Dehydration and evaporation of ethyl acetate gave 2-phenyl 1,2, 3,4-tetrahydro-N-methyl-quinoline-4-carboxylate (2,6-dimethyl-4-bromo) phenyl (yield = 80%).

Exemple 12
Un autre groupement apprécié de la présente invention est le difluorosulfonate de N-méthylacridinium-9carboxylate de (2,6-diméthyl-4-triméthylammonio)phényle qui répond à la formule suivante

le difluorosulfonate de N-méthylacridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthyl-4-triméthylammonio)phényle est synthétisé conformément au schéma suivant

Example 12
Another appreciated group of the present invention is the difluorosulfonate of N-methylacridinium-9carboxylate of (2,6-dimethyl-4-trimethylammonio) phenyl which corresponds to the following formula

(2,6-dimethyl-4-trimethylammonio) phenyl N-methylacridinium-9-carboxylate difluorosulfonate is synthesized according to the following scheme

Le N-méthylacridinium-9-carboxylate de (2,6 diméthyl-4-triméthylammonio)phényle (35) a été obtenu par estérification de l'acide acridine-9-carboxylique avec le 2,6-diméthyl-4-nitrophénol (36). Le produit (37) a été réduit en l'acridine-9-carboxylate de (2,6-diméthyl-4 amino)phényle (38) au moyen de zinc.Deux groupes méthyle ont été introduits sur le groupe amino par traitement avec l'ioduré de méthyle. Puis la transformation en dérivé quaternaire et la formation d'acridinium ont été effectuées en utilisant du fluorosulfate de méthyle. Ces réactions sont décrites plus en détail ci-dessous. The (2,6 dimethyl-4-trimethylammonio) phenyl (35) N-methylacridinium-9-carboxylate (35) was obtained by esterification of acridine-9-carboxylic acid with 2,6-dimethyl-4-nitrophenol (36 ). The product (37) was reduced to (2,6-dimethyl-4 amino) phenyl (38) acridine-9-carboxylate by means of zinc. Two methyl groups were introduced onto the amino group by treatment with l 'methyl iodide. Then the transformation into a quaternary derivative and the formation of acridinium were carried out using methyl fluorosulfate. These reactions are described in more detail below.

De l'acide acridine-9-carboxylique (35) (3,05 g, 0,014 mole) dans un ballon à fond rond de 250 ml a été mélangé à du chlorure de thionyle (65 ml) et le mélange a été chauffé au reflux pendant 2 heures sous agitation. Le chlorure de thionyle en excès a été éliminé dans un évaporateur rotatif. Le résidu a été traité avec du benzène (75 ml) et le solvant a été évacué sous vide pour éliminer les traces de chlorure de thionyle. Le résidu de chlorure d'acridine-9-carbonyle a été mélangé à de la pyridine (65 ml) et du 2,6-diméthyl-4-nitrophénol (36) (2,25 g, 0,014 mole) a été ajouté. Le mélange a été chauffé en utilisant un bain d'eau (environ 60'C ) pour dissoudre la totalité des substances solides. Au bout de 15 heures d'agitation à température ambiante, le mélange a été versé dans 1 litre d'eau.La suspension a été acidifiée avec de l'acide chlorhydrique concentré à pH 2,0. Le produit solide a été filtré, lavé à l'eau et dissous dans le chloroforme. Acridine-9-carboxylic acid (35) (3.05 g, 0.014 mole) in a 250 ml round bottom flask was mixed with thionyl chloride (65 ml) and the mixture was heated to reflux for 2 hours with stirring. The excess thionyl chloride was removed in a rotary evaporator. The residue was treated with benzene (75 ml) and the solvent was removed in vacuo to remove traces of thionyl chloride. The residue of acridine-9-carbonyl chloride was mixed with pyridine (65 ml) and 2,6-dimethyl-4-nitrophenol (36) (2.25 g, 0.014 mole) was added. The mixture was heated using a water bath (about 60 ° C) to dissolve all of the solids. After 15 hours of stirring at room temperature, the mixture was poured into 1 liter of water. The suspension was acidified with concentrated hydrochloric acid to pH 2.0. The solid product was filtered, washed with water and dissolved in chloroform.

La déshydratation (sulfate de sodium anhydre) et l'évaporation du chloroforme ont donné l'ester brut).Dehydration (anhydrous sodium sulfate) and evaporation of chloroform gave the crude ester).

L'ester brut a été chromatographié sur une colonne de gel de silice en utilisant comme solvant un mélange CHC13/EtOAc dans le rapport de 98:2. Les fractions ayant un Rf égal à 0,6 par CCM avec le même solvant ont été rassemblees et l'évaporation des solvants a donné l'acridi- ne-9-carboxylate de (2, 6-diméthyl-4-nitro)phényle (37) (rendement = 30%). The crude ester was chromatographed on a column of silica gel, using a CHCl 3 / EtOAc mixture in the ratio of 98: 2 as solvent. The fractions having an Rf equal to 0.6 by TLC with the same solvent were combined and the evaporation of the solvents gave the acridin-9-carboxylate of (2,6-dimethyl-4-nitro) phenyl ( 37) (yield = 30%).

L'ester de (2,6-diméthyl-4-nitro)phényle (37) (1,16 g, 3,1 mmoles) a été dissous dans de l'acide acétique (50 ml) par chauffage dans un bain d'huiie à environ 65'C. The (2,6-dimethyl-4-nitro) phenyl ester (37) (1.16 g, 3.1 mmol) was dissolved in acetic acid (50 ml) by heating in a water bath. oil at around 65'C.

Du chlorure stanneux (1,5 g) a été dissous dans de l'acide chlorhydrique concentré (10 ml) et a été ajouté à la solution d'ester. Le mélange a été agité pendant 45 minutes, puis a été versé dans de l'eau (750 ml). L'extraction avec du chloroforme (3 x 200 ml) a éliminé l'ester de (2,6-diméthyl-4-nitro)phényle n'ayant pas réagi. La phase aqueuse a été rendue basique avec du bicarbonate de sodium et a été soumise à une extraction avec du chloroforme (4 x 200 ml). La déshydratation et l'évaporation du chloroforme ont donné de l'acridine-9-carboxylate de (2,6diméthyl-4-amino)phényle (38) (rendement = 25%).Stannous chloride (1.5 g) was dissolved in concentrated hydrochloric acid (10 ml) and was added to the ester solution. The mixture was stirred for 45 minutes, then was poured into water (750 ml). Extraction with chloroform (3 x 200 ml) removed the unreacted (2,6-dimethyl-4-nitro) phenyl ester. The aqueous phase was made basic with sodium bicarbonate and was extracted with chloroform (4 x 200 ml). Dehydration and evaporation of the chloroform gave (2,6dimethyl-4-amino) phenyl (38) acridin-9-carboxylate (yield = 25%).

L'amino-ester (38) (64 mg, 0,18 mmole) a été dissous dans du nitrométhane (5 ml). De l'iodure de méthyle (1 ml) et de la pyridine (0,1 ml) ont été ajoutés. Le mélange a été agité à température ambiante pendant 15 heures. Du méthanol (2 ml) a été -ajouté, puis le mélange a été agité pendant un temps supplémentaire de 2 heures. Les solvants ont été évaporés et le résidu a été traité avec de l'eau (10 ml), puis a été soumis à une extraction avec du chloroforme (4 x 20 ml) après avoir rendu la solution basique. La déshydratation et l'évaporation du chloroforme ont donné de l'acridine-9-carboxylate de (2,6-diméthyl-4diméthylamino)phényle (39) (rendement = 50%). The amino ester (38) (64 mg, 0.18 mmol) was dissolved in nitromethane (5 ml). Methyl iodide (1 ml) and pyridine (0.1 ml) were added. The mixture was stirred at room temperature for 15 hours. Methanol (2 ml) was added, then the mixture was stirred for an additional 2 hours. The solvents were evaporated and the residue was treated with water (10 ml), then was extracted with chloroform (4 x 20 ml) after making the solution basic. Dehydration and evaporation of the chloroform gave (2,6-dimethyl-4dimethylamino) phenyl acridin-9-carboxylate (39) (yield = 50%).

Le diméthylamino-éther (39) (154 mg, 0,41 mmole) a été dissous dans du chlorure de méthylène (2 ml). Dimethylamino ether (39) (154 mg, 0.41 mmol) was dissolved in methylene chloride (2 ml).

Du fluorosulfate de méthyle (265 ml, 3,28 mmoles) a été ajouté et le mélange a été agité à température ambiante pendant 15 heures. De l'éther anhydre (15 mî) a été ajouté et les substances solides précipitées ont été filtrées et lavées à l'éther. La déshydratation a donné du N-méthyl acridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthyl-4-triméthylam- monio)phényle (40) (rendement = 50%). SM. FAB, matrice de thioglycérol, m/e 400 (M+).Methyl fluorosulfate (265 ml, 3.28 mmol) was added and the mixture was stirred at room temperature for 15 hours. Anhydrous ether (15 ml) was added and the precipitated solids were filtered and washed with ether. Dehydration gave (2,6-dimethyl-4-trimethylammonio) phenyl (40) N-methyl acridinium-9-carboxylate (yield = 50%). SM. FAB, thioglycerol matrix, m / e 400 (M +).

MARQUAGE D'UNE PROTEINE D'UNE AUTRE XATIERE
AVEC DES GROUPEMENTS CHIMIOLUMINESCENTS
Exemple 13
Un conjugué de la présente invention comprend de la progestérone liée à un produit d'addition du ss-D- thioglucose sur le fluorosulfonate de N-méthylacridinium-9carboxylate de (2,6-diméthoxy-3-chlorosulfonyl)phényle. Le conjugué de progestérone au produit d'addition du ss-D- thioglucose sur le fluorosulfonate de N-méthylacridinium-9carboxylate de (2,6-diméthoxy-3-chlorosulfonyl)phényle répond à la formule suivante

LABELING OF A PROTEIN FROM ANOTHER XATIER
WITH CHEMOLUMINESCENT GROUPS
Example 13
A conjugate of the present invention comprises progesterone linked to an adduct of ss-D-thioglucose on (2,6-dimethoxy-3-chlorosulfonyl) phenyl N-methylacridinium-9carboxylate fluorosulfonate. The conjugate of progesterone to the adduct of ss-D-thioglucose on the fluorosulfonate of N-methylacridinium-9carboxylate of (2,6-dimethoxy-3-chlorosulfonyl) phenyl corresponds to the following formula

Le conjugué de progestérone est synthétisé conformément au schéma suivant

The progesterone conjugate is synthesized according to the following scheme

Du 3,5-diméthoxy-4-hydroxybenzamide (41) (3,0 g, 15,2 mmoles) a été dissous dans de la pyridine anhydre (15 ml) et la solution a été refroidie dans un bain de neige carbonique/CC14.Du chlorure d'acétyle (1,4 ml, 1,54 g, 19,7 mmoles) a été ajouté et le mélange a été maintenu sous agitation à température ambiante pendant 2 heures. Du méthanol (1 ml) et de l'eau (5 ml) ont été ajoutés et les solvants ont été éliminés sous pression réduite. Le résidu a été traité avec de l'eau (50 ml) acidifiée avec de l'acide chlorhydrique dilué et a été soumis à une extraction avec de l'acétate d'éthyle. Le lavage à l'eau, la déshydratation et l'évaporation de l'acétate d'éthyle ont donné de l'acétate de 2,6-diméthoxy4-carboxamidophényle (42) (2,2 g) qui a été recristallisé dans l'acétate d'éthyle (rendement = 60%). 3,5-dimethoxy-4-hydroxybenzamide (41) (3.0 g, 15.2 mmol) was dissolved in anhydrous pyridine (15 ml) and the solution was cooled in a dry ice / CC14 bath Acetyl chloride (1.4 ml, 1.54 g, 19.7 mmol) was added and the mixture was stirred at room temperature for 2 hours. Methanol (1 ml) and water (5 ml) were added and the solvents were removed under reduced pressure. The residue was treated with water (50 ml) acidified with dilute hydrochloric acid and was extracted with ethyl acetate. Washing with water, dehydration and evaporation of ethyl acetate gave 2,6-dimethoxy4-carboxamidophenyl acetate (42) (2.2 g) which was recrystallized from ethyl acetate (yield = 60%).

L'acétate de phényle (42) (1,27 g, 5,33 mmoles) a été dissous dans le tétrahydrofuranne anhydre (125 ml). Phenyl acetate (42) (1.27 g, 5.33 mmol) was dissolved in anhydrous tetrahydrofuran (125 ml).

Une solution de diborane dans le THF (1,0 M, 10,9 ml, 10,9 mmoles) a été ajoutée et le mélange a été chauffé au reflux pendant 4 heures. Après refroidissement à température ambiante, de l'eau (2 ml) et de l'acide chlorhydrique (1,0 N, 5 ml) ont été ajoutés. Après agitation pendant 30 minutes, les solvants ont été éliminés sous vide. Le résidu a été soumis à l'extraction avec du chloroforme. Puis le chloroforme a été déshydraté et éliminé sous vide. Le 2,6diméthoxy-4-aminométhylphénol (43) a été utilisé dans l'étape suivante sans autre purification.A solution of diborane in THF (1.0 M, 10.9 ml, 10.9 mmol) was added and the mixture was heated at reflux for 4 hours. After cooling to room temperature, water (2 ml) and hydrochloric acid (1.0 N, 5 ml) were added. After stirring for 30 minutes, the solvents were removed in vacuo. The residue was extracted with chloroform. Then the chloroform was dried and removed in vacuo. 2,6dimethoxy-4-aminomethylphenol (43) was used in the next step without further purification.

Du chloroformiate de benzyle (1,050 ml, 1,25 g, 7,3 mmoles) a été ajouté à une solution de l'amine brute (43) dans la pyridine anhydre (10 ml) et le mélange a été agité pendant 3 heures à température ambiante. De l'eau (5 ml) a été ajoutée et les solvants ont été éliminés sous vide. De l'eau (30 ml) a été ajoutée au résidu et le mélange a été acidifié au moyen de HC1 dilué. L'extraction avec de l'acétate d'éthyle, le lavage à l'eau, la déshydra tation et l'évaporation du solvant ont donné du 2,6diméthoxy-4- (benzyloxycarbonylamino) méthylphénol (44) sous forme d'une huile (rendement = 70% au total). Benzyl chloroformate (1.050 ml, 1.25 g, 7.3 mmol) was added to a solution of the crude amine (43) in anhydrous pyridine (10 ml) and the mixture was stirred for 3 hours at ambient temperature. Water (5 ml) was added and the solvents were removed in vacuo. Water (30 ml) was added to the residue and the mixture was acidified with dilute HCl. Extraction with ethyl acetate, washing with water, dehydration and evaporation of the solvent gave 2,6-dimethoxy-4- (benzyloxycarbonylamino) methylphenol (44) as an oil (yield = 70% in total).

De l'acide acridine-9-carboxylique (754 mg, 3,38 mmoles) a été dissous dans de la pyridine anhydre (14 ml). Du chlorure de p-toluènesulfonyle (1,28 g, 6,76 mmoles) a été ajouté et le mélange a été agité a température ambiante pendant 30 minutes. Du 2,6-diméthoxy4-(benzyloxycarbonylamino)méthylphénol (44) (1,18 g, 3,76 mmoles) a été ajouté et le mélange a été agité à température ambiante pendant 15 heures. De l'eau (10 ml) a été ajoutée et les solvants ont été éliminés sous vide. Le résidu a été dissous dans le chloroforme et la phase chloroformique a été lavée successivement avec de l'eau,
HCl 0,1 N et une solution de bicarbonate de sodium.La déshydratation et l'évaporation du chloroforme ont donné lester brut qui a été chromatographié sur une colonne de gel de silice en utilisant comme solvant un mélange CHCl3/acétate d'éthyle dans le rapport 1:1. L'évaporation des solvants des fractions rassemblées a donné de l'acridine-9-carboxylate de [2,6-diméthoxy-4-(benzyloxycarbonyl- amino)méthyl)phényle (45) (rendement = 22%).Acridine-9-carboxylic acid (754 mg, 3.38 mmol) was dissolved in anhydrous pyridine (14 ml). P-toluenesulfonyl chloride (1.28 g, 6.76 mmol) was added and the mixture was stirred at room temperature for 30 minutes. 2,6-Dimethoxy4- (benzyloxycarbonylamino) methylphenol (44) (1.18 g, 3.76 mmol) was added and the mixture was stirred at room temperature for 15 hours. Water (10 ml) was added and the solvents were removed in vacuo. The residue was dissolved in chloroform and the chloroform phase was washed successively with water,
0.1 N HCl and a solution of sodium bicarbonate. Dehydration and evaporation of the chloroform gave the crude ester which was chromatographed on a column of silica gel using a mixture of CHCl3 / ethyl acetate in the solvent. 1: 1 ratio. Evaporation of the solvents from the combined fractions gave acridin-9-carboxylate of [2,6-dimethoxy-4- (benzyloxycarbonylamino) methyl) phenyl (45) (yield = 22%).

L'acridine (45) (296 mg, 0,57 mmole) a été dissoute dans du chlorure de méthylène anhydre (5 ml). Du fluorosulfate de méthyle (277 1, 3,4 mmoles) a été ajouté et le mélange a été agité à température ambiante pendant 5 heures. De l'éther anhydre (25 ml) a été ajouté et le fluorosulfonate d'acridinium-9-carboxylate de [2,6diméthoxy-4-(benzyloxycarbonylamino)méthyl]phényle précipité (46) a eté filtré, lavé à l'éther et déshydraté (rendement = 998). The acridine (45) (296 mg, 0.57 mmol) was dissolved in anhydrous methylene chloride (5 ml). Methyl fluorosulfate (277 l, 3.4 mmol) was added and the mixture was stirred at room temperature for 5 hours. Anhydrous ether (25 ml) was added and the precipitated [2,6dimethoxy-4- (benzyloxycarbonylamino) methyl] phenyl acridinium-9-carboxylate fluorosulfonate (46) was filtered, washed with ether and dehydrated (yield = 998).

L'acridinium (46) (107 mg, 0,169 mmole) a été mis en suspension dans du chlorure de méthylène anhydre (2 ml). De l'acide chlorosulfonique (53 1, 92 mg, 0,797 mmole) a été ajouté, puis le ballon a été refroidi dans un bain de neige carbonique/CC14. Le contenu du ballon a été agité pendant 30 minutes et le bain a été enlevé. The acridinium (46) (107 mg, 0.169 mmol) was suspended in anhydrous methylene chloride (2 ml). Chlorosulfonic acid (53.192 mg, 0.797 mmol) was added, then the flask was cooled in a dry ice / CC14 bath. The contents of the flask were stirred for 30 minutes and the bath was removed.

Après une agitation supplémentaire à température ambiante pendant 1,5 heure, de l'éther anhydre (2Oml) a été ajouté.After further stirring at room temperature for 1.5 hours, anhydrous ether (2Oml) was added.

Le produit précipité a été filtré et déshydraté sous vide.The precipitated product was filtered and dried in vacuo.

Le fluorosulfonate d-'acridinium-9-carboxylate de 2,6diméthoxy-4-aminométhyl-3-chlorosulfonyl)phényle (41) a été utilisé directement dans la réaction suivante.The 2,6-dimethoxy-4-aminomethyl-3-chlorosulfonyl) phenyl (41) acridinium-9-carboxylate fluorosulfonate (41) was used directly in the following reaction.

Le chlorure de sulfonyle (47) (129 mg) a été agité à température ambiante dans un mélange de méthanol (12,5 ml) et d'eau (12,5 ml) pendant 3 heures. De l'acétonitrile (35 ml) a été ajouté et les solvants ont été évaporés. Le résidu a été déshydraté sous vide sur de l'anhydride phosphorique. Le fluorosulfonate d'acridinium9-carboxylate de (2,6-diméthoxy-4-aminométhyl-3-oxo- sulfonyl)phényle (48) a été utilisé directement pour la réaction suivante. The sulfonyl chloride (47) (129 mg) was stirred at room temperature in a mixture of methanol (12.5 ml) and water (12.5 ml) for 3 hours. Acetonitrile (35 ml) was added and the solvents were evaporated. The residue was dried in vacuo over phosphoric anhydride. Acridinium 9-carboxylate fluorosulfonate (2,6-dimethoxy-4-aminomethyl-3-oxo-sulfonyl) phenyl (48) was used directly for the following reaction.

De l'hémisuccinate de progestérone (90 mg, 0,209 mmole) et de la N-méthylmorpholine (22 1, 209 mmoles) ont été dissous dans du DMF anhydre (2 ml). La solution a été refroidie dans un bain de neige carboni que/CCî4 et du chloroformiate d'isobutyle (30 1, 0,229 mmole) a été ajouté. Au bout de 2 minutes, une solution de l'acridinium (42) (101 mg, 0,143 mmole) dans le diméthylsulfoxyde (2 ml) contenant de la N-méthylmorpholine (3,14 1, 0,28 mmole) a été ajoutée. L'agitation a été poursuivie à -20'C pendant 10 minutes et le bain de refroidissement a été enlevé. Après agitation à température ambiante pendant 7 heures, trois gouttes d'eau ont été ajoutés. Les solvants ont été éliminés sous vide et de l'acétate d'éthyle a été ajouté au résidu. Le précipité huileux a été lavé à plusieurs reprises avec de l'acétate d'éthyle par trituration avec de l'acétonitrile (2 ml), l'huile s'est séparée sous forme de substances solides. Le produit a. été purifié par CLHP en utilisant une colonne semi-preparative Dynamax C18 (10 mm x 250 mm) (disponible dans le commerce auprès de Rainin Instrument Co., Inc.,
Woburn, Massachusetts) en utilisant comme phase mobile un mélange CH3CN/H2O (0,1% d'acide trifluoracétique) dans le rapport 55/45, à un débit de 2,75 ml/min. Le pic apparaissant au temps de rétention de 6,00 minutes a été recueilli.Progesterone hemisuccinate (90 mg, 0.209 mmol) and N-methylmorpholine (22 1, 209 mmol) were dissolved in anhydrous DMF (2 ml). The solution was cooled in a carbon dioxide / CCl4 snow bath and isobutyl chloroformate (30 1, 0.229 mmol) was added. After 2 minutes, a solution of acridinium (42) (101 mg, 0.143 mmol) in dimethyl sulfoxide (2 ml) containing N-methylmorpholine (3.14 1, 0.28 mmol) was added. Stirring was continued at -20 ° C for 10 minutes and the cooling bath was removed. After stirring at room temperature for 7 hours, three drops of water were added. The solvents were removed in vacuo and ethyl acetate was added to the residue. The oily precipitate was washed several times with ethyl acetate by trituration with acetonitrile (2 ml), the oil separated in the form of solid substances. The product a. was purified by HPLC using a Dynamax C18 semi-preparative column (10 mm x 250 mm) (commercially available from Rainin Instrument Co., Inc.,
Woburn, Massachusetts) using as a mobile phase a CH3CN / H2O mixture (0.1% trifluoroacetic acid) in the ratio 55/45, at a flow rate of 2.75 ml / min. The peak appearing at the retention time of 6.00 minutes was collected.

L'évaporation des solvants a donné le conjugué (49) (rendement = 30%). SM : FAB, matrice de thioglycérol,895 (M+, sans aucun ion complémentaire).Evaporation of the solvents gave the conjugate (49) (yield = 30%). MS: FAB, thioglycerol matrix, 895 (M +, without any additional ions).

Le conjugué de progestérone (49) (1,1 mg) dans un mélange de CH3CN (1 ml) et H20 (200 1) a été traité avec du 8-D-thioglucose (0,29 mg) sous forme d'une solution dans l'eau (72 1). Au bout de 10 minutes, les solvants ont été totalement éliminés sous vide, donnant le produit d'addition de p-D-thioglucose représenté ci-dessus. The progesterone conjugate (49) (1.1 mg) in a mixture of CH3CN (1 ml) and H2O (200 1) was treated with 8-D-thioglucose (0.29 mg) as a solution in water (72 1). After 10 minutes, the solvents were completely removed in vacuo, giving the p-D-thioglucose adduct shown above.

ExemDle 14
Le mode opératoire suivant pour la fixation à une protéine peut s'appliquer de manière générale à des groupements de la présente invention.Example 14
The following procedure for attachment to a protein can generally be applied to groups of the present invention.

De l'IgG de souris (Sigma, 1 mg) a été dissoute dans 0,9 ml de tampon au phosphate (100 mM, pH 8,0, 150 mM). Puis la solution a été divisée en trois portions égales de 0,33 mg/0,3 ml (0,0022 mole). Environ 0,3 mg d'un groupement de la présente invention a été dissous dans environ 0,4 ml de DMF de manière à obtenir 0,022 mole de groupement dans 15 1 de DMF. Mouse IgG (Sigma, 1 mg) was dissolved in 0.9 ml phosphate buffer (100 mM, pH 8.0, 150 mM). Then the solution was divided into three equal portions of 0.33 mg / 0.3 ml (0.0022 mole). About 0.3 mg of a group of the present invention was dissolved in about 0.4 ml of DMF so as to obtain 0.022 mole of group in 15 l of DMF.

0,022 mole du composé de la présente invention a été mélangée à 0,0022 mole de IgG dans un tube de microcentrifugation en matière plastique. Au bout de 15 minutes, une quantité supplémentaire de 0,022 mole de compose a été introduite dans le tube de microcentrifugation (le rapport molaire du composé à la protéine était égal à 20:1). Après un temps supplémentaire de 15 minutes, les quantités en excès du composé de la présente invention ont été désactivées avec une solution de chlorhydrate de lysine (10 1 dans 100 mM de tampon Pi, i pH 8,0) pendant 15 minutes. 0.022 mole of the compound of the present invention was mixed with 0.0022 mole of IgG in a plastic microcentrifuge tube. After 15 minutes, an additional 0.022 mole of compound was added to the microcentrifuge tube (the molar ratio of compound to protein was 20: 1). After an additional 15 minutes, the excess amounts of the compound of the present invention were quenched with a solution of lysine hydrochloride (10 1 in 100 mM Pi buffer, i pH 8.0) for 15 minutes.

En variante1 les aliquotes de 0,0055 mole du composé de la présente invention ont été utilisées à la place de portions de 0,022 mole (le .rapport molaire du composé à la protéine est égal i 5:1). Alternatively, the 0.0055 mole aliquots of the compound of the present invention were used in place of 0.022 mole portions (the molar ratio of the compound to protein is equal to 5: 1).

Des colonnes en verre Biorad (1 cm x 50 cm) (disponibles dans le commerce auprès de Biorad, Chemical
Division, Richmond, Californie) ont été garnies avec du
Sephadex G-50-80 préalablement gonflé et désaéré dans du tampon au phosphate (100 mM, pH 6,3, 150 mM de NaCl, 0,001% de TMS) à un volume de lit de 45 ml. La solution réactionnelle a été passée à travers les colonnes à un débit de 0,3-0,4 ml/min. Des fractions de 0,5 ml ont été recueillies. Les fractions protéiques marquées ont été détectées en diluant 20 1 de chaque fractions 1 ml et en déterminant la chimioluminescence produite avec 30 1 de la solution diluée. Puis les fractions marquées ont été rassemblées.Biorad glass columns (1 cm x 50 cm) (commercially available from Biorad, Chemical
Division, Richmond, California) were topped with
Sephadex G-50-80 previously swollen and deaerated in phosphate buffer (100 mM, pH 6.3, 150 mM NaCl, 0.001% TMS) at a bed volume of 45 ml. The reaction solution was passed through the columns at a flow rate of 0.3-0.4 ml / min. 0.5 ml fractions were collected. The labeled protein fractions were detected by diluting 20 l of each 1 ml fraction and determining the chemiluminescence produced with 30 l of the diluted solution. Then the marked fractions were collected.

Les fractions de conjugués rassemblées ont été dialysées pour améliorer la pureté du conjugué immunoréactif. Les fractions rassemblées ont été dialysées contre 500 ml de tampon au phosphate à pH 6,3 (100 mM, pH 6,3, 150 mM de NaCi, 0,001% de TMS) en un temps de 24 heures, avec trois changements de tampon. The combined conjugate fractions were dialyzed to improve the purity of the immunoreactive conjugate. The combined fractions were dialyzed against 500 ml of phosphate buffer at pH 6.3 (100 mM, pH 6.3, 150 mM NaCl, 0.001% TMS) over 24 hours, with three changes of buffer.

Exemple 15
Des groupements contenant un noyau ou système cyclique hétérocyclique non réduit peuvent être transformés en leurs formes réduites équivalentes bien que ces groupements non réduits soient fixés à une protéine ou une autre matière. Cela peut être effectué en utilisant un agent réducteur tel que le cyanoborohydrure de sodium. Le procédé de production d'un conjugué acridinium/IgG est décrit ci-dessous. Le même mode opératoire peut être appliqué à la réduction d'autres conjugués. Example 15
Groups containing an unreduced heterocyclic ring or ring system can be transformed into their equivalent reduced forms although these unreduced groups are attached to a protein or other material. This can be done using a reducing agent such as sodium cyanoborohydride. The process for producing an acridinium / IgG conjugate is described below. The same procedure can be applied to the reduction of other conjugates.

L'IgG marquée avec un dérivé d'acridinium reprEsentatif (100 g) dans du tampon au phosphate (400 1) (pH 6,0, 100 mM, 150 mM de NaCi, 0,001% de Thimerosal) a été traitée avec une solution fraîchement préparée (10 1) contenant du cyanoborohydrure de sodium (10'7 mole). Après deux heures d'incubation & température ambiante, la transformation du marqueur & base d'acridinium présent sur l'anticorps en acridane est totale, comme permettent de le constater les spectres W-lumière visible indiquant l'apparition d'une bande a 280 nm et la disparition de la bande 9 360 nm. Ces formes réduites conservaient toutes leurs propriétés immunologiques. IgG labeled with a representative acridinium derivative (100 g) in phosphate buffer (400 l) (pH 6.0, 100 mM, 150 mM NaCl, 0.001% Thimerosal) was treated with a fresh solution prepared (10 1) containing sodium cyanoborohydride (10'7 mole). After two hours of incubation at room temperature, the transformation of the acridinium marker & base present on the antibody into acridane is complete, as can be seen from the visible W-light spectra indicating the appearance of a band at 280 nm and the disappearance of the band 9 360 nm. These reduced forms retained all their immunological properties.

PROTOCOLES ANALYTIQUES
Exemple 16
1. Constituants
A) Anticorps marqué (conjugué) : anti
prolactine de lapin purifiée par affinité
conjuguée à du fluorosulfonate de N-méthyl
acridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthoxy-3
chlorosulfonyl)phényle. Tampon de mise en
réserve : tampon au phosphate 10 mM, NaCl
100 mM, pH 6,0, 0,001% de Thimerosal, 0,4% de
SAB.ANALYTICAL PROTOCOLS
Example 16
1. Constituents
A) Labeled antibody (conjugate): anti
affinity purified rabbit prolactin
conjugated to N-methyl fluorosulfonate
(2,6-dimethoxy-3-acridinium-9-carboxylate
chlorosulfonyl) phenyl. Setting buffer
reserve: phosphate buffer 10 mM, NaCl
100 mM, pH 6.0, 0.001% of Thimerosal, 0.4% of
SAB.

B) Anticorps de capture : anti-prolactine
de lapin (6 g/ml) sous forme de phase solide
sur des tubes de Nunc (disponible dans le
commerce auprès de Midland Scientific,
Roseville, Minnesota).B) Capture antibodies: anti-prolactin
rabbit (6 g / ml) as solid phase
on Nunc tubes (available in the
trade with Midland Scientific,
Roseville, Minnesota).

C) Tubes revêtus de phase solide : des
tubes de Nunc secs ont été préparés de la
manière suivante
1) 0,3 ml de l'anticorps de capture
par tube à 6 g/ml dans du tampon au STP
(sérum physiologique tamponné avec un
phosphate, pH 7,2-7,4, phosphate 10 mM,
NaCl 100 mM, NaN3 10 mM) a été introduit
à la pipette dans des tubes de Nunc.C) Tubes coated with solid phase:
dry Nunc tubes were prepared from the
next way
1) 0.3 ml of the capture antibody
per 6 g / ml tube in STP buffer
(physiological serum buffered with a
phosphate, pH 7.2-7.4, phosphate 10 mM,
100 mM NaCl, 10 mM NaN3) was introduced
pipette into Nunc tubes.

2) Les tubes ont été incubés pendant
18 à 14 heures.2) The tubes were incubated for
6 to 2 p.m.

3) Les tubes ont été lavés à deux
reprises avec le tampon au STP.3) The tubes were washed in pairs
repeated with buffer at STP.

4) Les tubes ont été bloqués avec
2,0% de SAB dans du tampon au STP.4) The tubes were blocked with
2.0% BSA in STP buffer.

L'incubation a été effectuée pendant un
temps inférieur ou égal à 4 heures à
température ambiante.The incubation was carried out for a
time less than or equal to 4 hours at
ambient temperature.

5) Les tubes ont été lavés à trois
reprises avec du tampon au STP.5) The tubes were washed three times
repeated with STP buffer.

6) Les tubes ont été déshydratés å
température ambiante.6) The tubes have been dehydrated
ambient temperature.

7) Les tubes ont été entreposés dans
des sacs en matière plastique pour
congélateur, à 4'C. 7) The tubes have been stored in
plastic bags for
freezer, at 4'C.

D) Etalons : préparés dans du sérum de cheval. 0,5, 30, 100 et 200 ng/ml/ml. D) Standards: prepared in horse serum. 0.5, 30, 100 and 200 ng / ml / ml.

2. Protocoles analvtioues
1) 25 1 d'échantillon ou d'étalon
ont été introduits à la pipette dans les
tubes revêtus d'anticorps.2. Analogue protocols
1) 25 1 of sample or standard
have been pipetted into the
antibody coated tubes.

2) 100 1 d'anticorps marqué ont été
ajoutés.2) 100 l of labeled antibody were
added.

3) Les tubes ont été agités doucement par tourbillonnement. 3) The tubes were gently swirled.

4) Les tubes ont été incubés pendant
1 heure à température ambiante sur un
appareil d'agitation rotative.4) The tubes were incubated for
1 hour at room temperature on a
rotary shaker.

5) Les tubes ont été lavés à trois
reprises avec de l'eau désionisée.5) The tubes were washed three times
repeated with deionized water.

6) La chimioluminescente a été
comptée pendant 2 secondes (pompe 1
HN03 0,1 N + 0,258 H202 ; pompe 2
NaOH 0,25 N + 0,125% CTAC) dans un
analyseur LumaTag (disponible dans le
commerce aupres de London Diagnostics,
Eden Prairie, Minnesota).6) The chemiluminescent has been
counted for 2 seconds (pump 1
HN03 0.1 N + 0.258 H2O2; pump 2
0.25 N NaOH + 0.125% CTAC) in a
LumaTag analyzer (available in the
trade with London Diagnostics,
Eden Prairie, Minnesota).

ExemDle 17
1. Constituants
A) Conjugués de progestérone avec le produit d'addition de 8-D-thioglucose sur le fluorosulfonate de N-méthyl-acridinium-9carboxylate de (2,6-diméthoxy-3-chlorosulfonyl)phényle : 20 pg/ml de conjugué de progestérone dans du tampon au phosphate (pH 6,0, phosphate 100 mM, NaCl 150 mM, 0,1% de sérum-albumine humaine, 0,001% de Thimerosal).EXAMPLE 17
1. Constituents
A) Conjugates of progesterone with the adduct of 8-D-thioglucose on the fluorosulfonate of N-methyl-acridinium-9carboxylate of (2,6-dimethoxy-3-chlorosulfonyl) phenyl: 20 μg / ml of progesterone conjugate in phosphate buffer (pH 6.0, 100 mM phosphate, 150 mM NaCl, 0.1% human serum albumin, 0.001% Thimerosal).

B) Anticorps principal : anti-progestérone de lapin (Cambridge Medical Diagnostics) dans du tampon au phosphate (pH 6,0, phosphate 200 mM, NaCl 150 mM, 0,1% de sérum-albumine humaine, 0,01% de CHAPS, 5 g de Danazol). B) Main antibody: rabbit anti-progesterone (Cambridge Medical Diagnostics) in phosphate buffer (pH 6.0, 200 mM phosphate, 150 mM NaCl, 0.1% human serum albumin, 0.01% CHAPS , 5 g of Danazol).

C) Tubes revêtus de phase solide : tubes de Nunc secs revêtus avec 2,5 g d'anti-fc de lapin, obtenu i partir de chèvre, et bloqués avec 0,5% de SAB. Les tubes ont été préparés de la manière suivante
1) Les tubes ont été incubés pendant
1 heure avec 2,5 g/ml d'anti-fc de
lapin, obtenu à partir de chèvre, (500 1)
à température ambiante.C) Tubes coated with solid phase: dry Nunc tubes coated with 2.5 g of rabbit anti-fc, obtained from goats, and blocked with 0.5% BSA. The tubes were prepared as follows
1) The tubes were incubated for
1 hour with 2.5 g / ml of anti-fc
rabbit, obtained from goat, (500 1)
at room temperature.

2) Les tubes ont été lavés à 3
reprises avec de l'eau distillée.2) The tubes were washed at 3
times with distilled water.

3) Les tubes ont été incubés
immédiatement pendant 3 heures avec 0,5%
de SAB (500 1) à température ambiante.3) The tubes were incubated
immediately for 3 hours with 0.5%
of SAB (500 1) at room temperature.

4) Les tubes ont été lavés à 3
reprises avec de l'eau distillée.4) The tubes were washed at 3
times with distilled water.

5) Les tubes ont été séchés pendant
une nuit à une humidité relative de 40%,
à température ambiante.5) The tubes were dried for
one night at a relative humidity of 40%,
at room temperature.

6) Les tubes ont été entreposés dans
des sacs en matière plastique pour
congélateur à 4 C. 6) The tubes have been stored in
plastic bags for
4 C. freezer

D) Matrice de sérum : sérum de boeuf
Antech.D) Serum matrix: beef serum
Antech.

E) Etalons : 0,013, 0,38, 1,31, 7,31, 16,6 et 37,0 ng/ml. E) Standards: 0.013, 0.38, 1.31, 7.31, 16.6 and 37.0 ng / ml.

2. Protocoles analytiques
1) 50 1 d'échantillon ou d'étalon ont été introduits à la pipette dans les tubes revêtus d'anticorps.2. Analytical protocols
1) 50 l of sample or standard were pipetted into the antibody-coated tubes.

2) 100 1 de tampon renfermant le conjugué ont été ajoutés. 2) 100 l of buffer containing the conjugate were added.

3) 100 1 de tampon renfermant l'anticorps principal ont été ajoutés. 3) 100 l of buffer containing the main antibody were added.

4) Les tubes ont été agités doucement par tourbillonnement. 4) The tubes were gently agitated by swirling.

5) Les tubes ont été incubés pendant 2 heures à 37c. 5) The tubes were incubated for 2 hours at 37c.

6) Les tubes ont été décantés et lavés avec 150 mM de NaCl dans 0,1% de Tween (1 ml), puis â 3 reprises avec de l'eau distillée. 6) The tubes were decanted and washed with 150 mM NaCl in 0.1% Tween (1 ml), then 3 times with distilled water.

7) On a inversé les tubes et on les a laissé s'égoutter. 7) The tubes were inverted and allowed to drip.

8) La chimioluminescence a été comptée pendant 2 secondes [pompe 1 : HNO3 0,1 N + 0,25% H2O2 ; pompe 2 : NaOH 0,25 N + 0,125%
CTAC] dans un analyseur LumaTag (disponible dans le commerce auprès de London Diagnostics,
Eden Prairie, Minnesota). 8) The chemiluminescence was counted for 2 seconds [pump 1: HNO3 0.1 N + 0.25% H2O2; pump 2: NaOH 0.25 N + 0.125%
CTAC] in a LumaTag analyzer (commercially available from London Diagnostics,
Eden Prairie, Minnesota).

Exemple 18
I. Constituants
A) Anticorps marqué : anti-TSH, obtenu à partir de chèvre, purifié par affinité, conjugué à du fluorosulfonate de N-méthylacridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthoxy-3chlorosulfonyl)phényle.Example 18
I. Constituents
A) Labeled antibody: anti-TSH, obtained from goat, affinity purified, conjugated to (2,6-dimethoxy-3chlorosulfonyl) phenyl N-methylacridinium-9-carboxylate fluorosulfonate.

B) Tampon de mise en réserve : 100 mM de phosphate, 0,145 M de NaCl, 0,001% de Thimerosal, 0,4% de SAB, 0,1 mg/ml de globulines de souris et 0,1 mg/ml de globulines de chèvre, à pH 6,0. B) Storage buffer: 100 mM phosphate, 0.145 M NaCl, 0.001% Thimerosal, 0.4% BSA, 0.1 mg / ml mouse globulins and 0.1 mg / ml mouse globulins goat, pH 6.0.

C) Anticorps de capture : anti-TSH monoclonal (2 g/ml) sous forme d'une phase solide sur des tubes de Nunc. Procédé de préparation des tubes de Nunc portant une phase solide
1) 0,4 ml de l'anticorps de capture
à 2 g/ml dans du tampon au STP (sérum
physiologique tamponné avec un phosphate,
pH 7,2-7,4, 10 mM de phosphate, 100 mM de
NaCl, 10 mM de NaN3) a été introduit dans
chaque tube.C) Capture antibodies: monoclonal anti-TSH (2 g / ml) in the form of a solid phase on Nunc tubes. Process for the preparation of Nunc tubes carrying a solid phase
1) 0.4 ml of the capture antibody
2 g / ml in STP buffer (serum
physiological buffered with phosphate,
pH 7.2-7.4, 10 mM phosphate, 100 mM
NaCl, 10 mM NaN3) was introduced into
each tube.

(2) Les tubes ont été incubés
pendant 18 à 24 heures.(2) The tubes were incubated
for 18 to 24 hours.

3) Les tubes ont été lavés à 3
reprises avec le tampon au STP.3) The tubes were washed at 3
repeated with buffer at STP.

4) Les tubes ont été bloqués avec
2,0% de SAB dans du tampon au STP et
incubés pendant un temps inférieur ou
égal à 4 heures à température ambiante.4) The tubes were blocked with
2.0% BSA in STP buffer and
incubated for a shorter time or
equal to 4 hours at room temperature.

6) Les tubes ont été séchés à
température ambiante. 6) The tubes were dried at
ambient temperature.

7) Les tubes ont été entreposés dans
des sacs en matière plastique pour
congélateur, à 4'C.7) The tubes have been stored in
plastic bags for
freezer, at 4'C.

D) Etalons : préparés dans du sérum de cheval, 0, 0,5 , 2,5, 10, 25 et 100 UI/ml. D) Standards: prepared in horse serum, 0, 0.5, 2.5, 10, 25 and 100 IU / ml.

2. Protocoles analvtiaues
1) 200 1 d'échantillon ont été introduits à la pipette dans les tubes revêtus.2. Analogue protocols
1) 200 l of sample were pipetted into the coated tubes.

2) 100 1 d'anticorps marqué ont été ajoutés. 2) 100 l of labeled antibody were added.

4) Les tubes ont été incubés pendant 2 heures à température ambiante sur un agitateur par secousses. 4) The tubes were incubated for 2 hours at room temperature on a shaker.

5) Les tubes ont été lavés en utilisant un appareil de lavage Biotomic (disponible dans le commerce auprès de Ocean Scientific, Inc.,
Garden Grove, Californie).5) Tubes were washed using a Biotomic washer (commercially available from Ocean Scientific, Inc.,
Garden Grove, California).

6) La chimioluminescence a été comptée pendant 2 secondes [pompe 1 : HNo3 0,1N + 0,25%
H202 ; pompe 2 : NAOH 0,25 N + 0,125% CTAC] dans un analyseur LumaTag (disponible dans le commerce auprès de London Diagnostics, Eden
Prairie, Minnesota).6) Chemiluminescence was counted for 2 seconds [pump 1: HNo3 0.1N + 0.25%
H2O2; pump 2: NAOH 0.25 N + 0.125% CTAC] in a LumaTag analyzer (commercially available from London Diagnostics, Eden
Prairie, Minnesota).

Exemple 19
1. Constituants
A) Anticorps marqué : anti-prolactine de lapin, purifiée par affinité, conjuguée à du fluorosulfonate de N-méthyl-acridinium-9carboxylate de (2,6-diméthyl-4-nitro)phényle.Example 19
1. Constituents
A) Labeled antibody: rabbit anti-prolactin, affinity purified, conjugated to (2,6-dimethyl-4-nitro) phenyl N-methyl-acridinium-9carboxylate fluorosulfonate.

Tampon de mise en réserve : tampon au phosphaté 10 mM, 100 mM de NaCi, pH 6,0, 0,001% de
Thimerosal, 0,4% de SAB.Storage buffer: 10 mM phosphate buffer, 100 mM NaCi, pH 6.0, 0.001% of
Thimerosal, 0.4% SAB.

B) Anticorps de capture : anti-prolactine de lapin (6 g/ml) sous forme de phase solide sur des tubes de Nunc. B) Capture antibodies: rabbit anti-prolactin (6 g / ml) in the form of a solid phase on Nunc tubes.

C) Tubes revêtus de phase solide : des tubes de Nunc sec ont été préparés de la manière suivante
1) 0,3 ml de l'anticorps de capture
par tube à 6 g/ml dans du tampon au STP
(sérum physiologique tamponné avec un
phosphate, pH 7,2-7,4, 10 mM de phospha
te, 100 mM de NaCl, 10 mM de NaN3) a été
introduit à la pipette dans des tubes de
Nunc.C) Tubes coated with solid phase: dry Nunc tubes were prepared as follows
1) 0.3 ml of the capture antibody
per 6 g / ml tube in STP buffer
(physiological serum buffered with a
phosphate, pH 7.2-7.4, 10 mM phospha
te, 100 mM NaCl, 10 mM NaN3) was
pipetted into tubes of
Nunc.

2) Les tubes ont été incubés pendant
18 à 24 heures.2) The tubes were incubated for
18 to 24 hours.

4) Les tubes ont -été bloqués avec
2,0t de SAB dans du tampon au STP.4) The tubes have been blocked with
2.0t of SAB in STP buffer.

6) Les tubes ont été séchés à
température ambiante.6) The tubes were dried at
ambient temperature.

7) Les tubes ont été entreposés dans
des sacs en matière plastique pour
congélateur, à 4"C. 7) The tubes have been stored in
plastic bags for
freezer, at 4 "C.

D) Etalons : préparés dans du sérum de cheval. 0, 5, 30, 100 et 100 ng/ml/ml
2. Protocoles analytiques
1) 25 1 d'échantillon ou d'étalon ont été introduits à la pipette dans les tubes revêtus d'anticorps.D) Standards: prepared in horse serum. 0, 5, 30, 100 and 100 ng / ml / ml
2. Analytical protocols
1) 25 l of sample or standard were pipetted into the antibody coated tubes.

3) Les tubes ont été agités doucement par
tourbillonnement.3) The tubes were gently shaken by
swirl.

4) Les tubes ont été incubés pendant 1
heure à température ambiante sur un appareil
d'agitation rotative.4) The tubes were incubated for 1
hour at room temperature on a device
rotary agitation.

5) Les tubes ont été lavés à 3 reprises
avec de l'eau désionisée.5) The tubes have been washed 3 times
with deionized water.

6) La chimioluminescence a été comptée
pendant 2 secondes [pompe 1 : HNO3 0,1 N
+ 0,25% H202 ; pompe 2 : NaOH 0,25N + 0,1258
CTAC] dans un analyseur LumaTag (disponible
dans le commerce auprès de London Diagnostics,
Eden Prairie, Minnesota).6) Chemiluminescence has been counted
for 2 seconds [pump 1: HNO3 0.1 N
+ 0.25% H2O2; pump 2: 0.25N NaOH + 0.1258
CTAC] in a LumaTag analyzer (available
in trade with London Diagnostics,
Eden Prairie, Minnesota).

ETUDES DE STABILITE
Conformément aux études suivantes de stabilité, les groupes et conjugués de la présente invention sont de préférence entreposés et utilisés dans des analyses à un pH d'environ 6,5 à environ 7,5. Les groupements et conjugués présentent une stabilité accrue à d'autres pH dans certaines conditions ; cependant, l'accroissement n'est pas dépendant des conditions dans l'intervalle de pH préféré.STABILITY STUDIES
In accordance with the following stability studies, the groups and conjugates of the present invention are preferably stored and used in assays at a pH of about 6.5 to about 7.5. The groups and conjugates exhibit increased stability at other pHs under certain conditions; however, the increase is not dependent on conditions in the preferred pH range.

Exemple 20
La stabilité comparative a été déterminée en comparant le nombre de jours (tl/2) nécessaire pour qu'un groupement perde 50% de sa chimioluminescence. La stabilité de certains groupements non liés à une protéine ou une autre matière a été contrôlée à température ambiante et à 4'C. Les groupements ont été entreposés dans un tampon (pH 6,0, 50 mM de Pi, 0,1% de SAB).Le fluorosulfonate de 3-(3 succinimidyloxycarbonyl) propyloxy-N-méthyl-acridinium-9- carboxylate de (2,6-diméthyl-4-nitro)phényle n'a présenté aucune perte'appréciable du nombre de coups après 98 jours à température ambiante et à 4"C. Le fluorosulfonate de 3 (3-succinimidyl-oxycarbonyl)propyloxy-N-méthyl-acridinium 9-carboxylate de (2,6-isopropyl-4-nitro)phényle n'a présenté aucune perte appréciable de nombre de coups après 312 jours à température ambiante et à 4'C.Pour le difluorosulfonate de N-méthyl-acridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthyl-4-triméthylammonio)phényle, t1/2 est égal à 105 jours à température ambiante et t1/2 n'a pas été atteint après 105 jours à 4'C. Pour le fluorosulfonate de
N-méthyl-acridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthoxy-3chlorosulfonyl)phényle, tl/2 est égal à 50 jours à température ambiante, tl/2 n'a pas été atteint à 4 C au bout de 130 jours.. Pour le fluorosulfonate de N-méthylacridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthoxy-3-chlorosulfonyl-4-propanoyl)phényle, tl/2 est égal à 24 jours à température ambiante et était supérieur à 95 jours à 4'C. Example 20
Comparative stability was determined by comparing the number of days (tl / 2) required for a group to lose 50% of its chemiluminescence. The stability of certain groups not linked to a protein or another material was checked at room temperature and at 4 ° C. The groups were stored in a buffer (pH 6.0, 50 mM Pi, 0.1% BSA). 3- (3 succinimidyloxycarbonyl) fluorosulfonate propyloxy-N-methyl-acridinium-9-carboxylate , 6-dimethyl-4-nitro) phenyl showed no appreciable loss of the number of strokes after 98 days at room temperature and at 4 "C. The fluorosulfonate of 3 (3-succinimidyl-oxycarbonyl) propyloxy-N-methyl (2,6-isopropyl-4-nitro) phenyl -acridinium 9-carboxylate showed no appreciable loss of number of counts after 312 days at room temperature and at 4 ° C. For N-methyl-acridinium difluorosulfonate (2,6-dimethyl-4-trimethylammonio) phenyl -9-carboxylate, t1 / 2 is equal to 105 days at room temperature and t1 / 2 has not been reached after 105 days at 4 ° C. For fluorosulfonate of
N-methyl-acridinium-9-carboxylate of (2,6-dimethoxy-3chlorosulfonyl) phenyl, tl / 2 is equal to 50 days at room temperature, tl / 2 was not reached at 4 C after 130 days .. For N-methylacridinium-9-carboxylate (2,6-dimethoxy-3-chlorosulfonyl-4-propanoyl) phenyl fluorosulfonate, tl / 2 is equal to 24 days at room temperature and was greater than 95 days to 4 'VS.

Pour le fluorosulfonate de N-méthyl-acridinium-9-carboxy- late de (2,6-diméthyl)phényle, tl/2 était égal à 50 jours à température ambiante. En comparaison, des groupements ne portant pas les substituants figurant sur les groupements de la présente invention possédaient un tl/2 moyen inférieur à 8 jours à température ambiante et approximativement égal à 32 jours à 4 C.For N-methyl-acridinium-9-carboxy (2,6-dimethyl) phenyl fluorosulfonate, tl / 2 was 50 days at room temperature. In comparison, groups not bearing the substituents appearing on the groups of the present invention had an average tl / 2 of less than 8 days at room temperature and approximately equal to 32 days at 4 C.

Exemple 21
La stabilité comparative des esters de Nméthyl-acridinium de phényle, de (2,6-diméthyl)phényle, de (2,6-diméthoxy-3-chlorosulfonyl)phényle, de (2, 6-diméthyl- 3-chlorosulfonyl)phényle, de (2,6-diméthyl-4-nitro)phényle, de (2,6-diméthyl-4-triméthylammonio)phényle, et de (2,6diméthyl-4-bromo)phényle a été observée dans un tampon au phosphate (100 mM de Pi, 150 mM de NaCl, 0,001% de
Thimerosal, 0,005% de sérum-albumine humaine) à pH 6,3 et à pH 8,0, par incubation a 35 C et 45 C. Les résultats de stabilité pour ces composés, a pH 6,3 à 35C et 45 C, sont présentés, respectivement, sur les figures 1 et 2.Les résultats de stabilité pour ces composés, à pH 8,0, a 35 C et 45 C, sont présentés, respectivement, sur les figures 3 et 4. Tous les composés portant un groupe phényle substitué (å l'exception du composé portant un groupe (2,6diméthyl)phényle, ont présenté une stabilité accrue, comparativement au composé nu. Le composé portant un groupe (2,6-diméthyl)phényle était moins stable que le composé portant un groupe phényle nu à pH 6,3 à 35 c, mais présentait une stabilité accrue à pH 8,0 à 35'C et aux deux pH & 45 C.Example 21
The comparative stability of the methyl methyl acridinium esters of (2,6-dimethyl) phenyl, (2,6-dimethoxy-3-chlorosulfonyl) phenyl, (2,6-dimethyl-3-chlorosulfonyl) phenyl, (2,6-dimethyl-4-nitro) phenyl, (2,6-dimethyl-4-trimethylammonio) phenyl, and (2,6dimethyl-4-bromo) phenyl was observed in phosphate buffer (100 mM Pi, 150 mM NaCl, 0.001%
Thimerosal, 0.005% human serum albumin) at pH 6.3 and pH 8.0, by incubation at 35 C and 45 C. The stability results for these compounds, at pH 6.3 at 35 C and 45 C, are shown, respectively, in FIGS. 1 and 2. The stability results for these compounds, at pH 8.0, at 35 ° C. and 45 ° C., are presented, respectively, in FIGS. 3 and 4. All the compounds bearing a substituted phenyl group (with the exception of the compound bearing a (2,6-dimethyl) phenyl group, exhibited increased stability compared to the naked compound. The compound bearing a (2,6-dimethyl) phenyl group was less stable than the compound bearing a naked phenyl group at pH 6.3 to 35 c, but exhibited increased stability at pH 8.0 at 35 ° C. and at both pH & 45 C.

Exemple 22
La stabilité de conjugués d'IgG de souris avec du fluorosulfonate de 3-(3-succinimidyloxycarbonyl)propyl- oxy-N-méthyl-acridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthyl-4- nitro)phényle et du fluorosulfonate de N-méthyl-acridinium9-carboxylate de (2,6-diméthoxy-3-chlorosulfonyl)phényle, à différentes températures et à différents pH, a été étudiée et comparée à la stabilité de conjugués d'IgG et de fluorosulfonate de N-méthyl-acridinium-9-carboxylate de 4 (2-succinimidylcarboxyéthyl)phényle.Le fluorosulfonate de
N-méthyl-acridinium-9-carboxylate de 4-(2-succinimidylcarboxyéthyl)phényle répond à la formule suivante

Example 22
The stability of mouse IgG conjugates with 3- (3-succinimidyloxycarbonyl) propyl-oxy-N-methyl-acridinium-9-carboxylate (2,6-dimethyl-4-nitro) phenyl fluorosulfonate and fluorosulfonate N-methyl-acridinium9-carboxylate of (2,6-dimethoxy-3-chlorosulfonyl) phenyl, at different temperatures and at different pH, was studied and compared to the stability of conjugates of IgG and N-methyl fluorosulfonate 4 (2-succinimidylcarboxyethyl) phenyl acridinium-9-carboxylate.
4- (2-succinimidylcarboxyethyl) phenyl N-methyl-acridinium-9-carboxylate corresponds to the following formula

Le fluorosulfonate de N-méthyl-acridinium-9-carboxylate de 4- (2-succinimidylcarboxyéthyl) phényle diffère des composés de la présente invention en ce qu'il ne possède pas de groupe électrophile ou de substituants en positions 2,6 sur le noyau phényle. Le fluorosulfonate de N-méthyl acridinium-9-carboxylate de 4-(2-succinimidylcarboxyéthyl)phényle a été publié dans la littérature et est couramment utilisé dans des applications utilisant la chimioluminescence.4- (2-succinimidylcarboxyethyl) phenyl N-methyl-acridinium-9-carboxylate fluorosulfonate differs from the compounds of the present invention in that it does not have an electrophilic group or substituents in positions 2,6 on the nucleus phenyl. 4- (2-succinimidylcarboxyethyl) phenyl N-methyl acridinium-9-carboxylate fluorosulfonate has been published in the literature and is commonly used in applications using chemiluminescence.

De la manière indiquée ci-dessous, la diminution du nombre de coups pour un conjugué donné résulte de l'hydrolyse de la liaison ester dans le marqueur chimioluminescent. En conséquence, lorsque la stabilité du marqueur diminue, la vitesse de diminution du nombre de coups dans le conjugué diminue. As indicated below, the decrease in the number of counts for a given conjugate results from the hydrolysis of the ester bond in the chemiluminescent label. Consequently, when the stability of the marker decreases, the rate of decrease in the number of strokes in the conjugate decreases.

Des conjugués d'IgG de souris et de fluorosulfonate de 3-(3-succinimidyloxycarbonyl)propyloxy-Nméthyl-acridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthyl-4nitro)phényle, de fluorosulfonate de N-méthyl-acridinium-9carboxylate de (2, 6-diméthoxy-3-chlorosulfonyl) phényle et de fluorosulfonate de N-méthyl-acridinium-9-carboxylate de 4-(2-succinimidylcarboxyéthyl)phényle ont été entreposés à 4 c. Les conjugués ont été entreposés dans trois solutions de tampon différentes à pH 6,3, 7,3 et 8,0. Conjugates of mouse IgG and fluorosulfonate of 3- (3-succinimidyloxycarbonyl) propyloxy-Nmethyl-acridinium-9-carboxylate of (2,6-dimethyl-4nitro) phenyl, of N-methyl-acridinium-9carboxylate fluorosulfonate (2,6-dimethoxy-3-chlorosulfonyl) phenyl and 4- (2-succinimidylcarboxyethyl) phenyl N-methyl-acridinium-9-carboxylate fluorosulfonate were stored at 4 tsp. The conjugates were stored in three different buffer solutions at pH 6.3, 7.3 and 8.0.

Le premier tampon contenait 100 mM de Pi, 150 mM de NaCl, 0,001 % de Thimerosal, 0,1 % de sérumalbumine humaine, 20 mg/l de IgG de mouton ("tampon standard au phosphate11). Les résultats de stabilité dans le tampon standard au phosphate à pH 6,3, 7,3 et 8,0 sont présentés, respectivement, sur les figures 5, 6 et 7. The first buffer contained 100 mM Pi, 150 mM NaCl, 0.001% Thimerosal, 0.1% human serum albumin, 20 mg / l sheep IgG ("standard phosphate buffer11). Results of stability in the buffer phosphate standard pH 6.3, 7.3 and 8.0 are shown, respectively, in Figures 5, 6 and 7.

Le deuxième tampon était du tampon standard au phosphate sans IgG de mouton. Les résultats de stabilité dans le deuxième tampon à pH 6,3, 7,3 et 8,0 sont pré sentés, respectivement, sur les figures 8, 9 et 10. The second buffer was standard phosphate buffer without sheep IgG. The stability results in the second buffer at pH 6.3, 7.3 and 8.0 are shown, respectively, in Figures 8, 9 and 10.

Le troisième tampon était du tampon standard au phosphate sans IgG de mouton et avec 0,1 % de sérumalbumine bovine à la place de la sérum-albumine humaine. The third buffer was standard phosphate buffer without sheep IgG and with 0.1% bovine serum albumin in place of human serum albumin.

Les résultats de stabilité dans le troisième tampon à pH 6,3, 7,3 et 8,0 sont présentés, respectivement, sur les figures 11, 12 et 13.The stability results in the third buffer at pH 6.3, 7.3 and 8.0 are shown, respectively, in Figures 11, 12 and 13.

Dans chaque tampon, à chaque pH, les conjugués d'IgG et de fluorosulfonate de 3-(3-succinimidyloxy carbonyl)propyloxy-N-methyl-acridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthyl-4-nitro)phényle et de fluorosulfonate de Nméthyl acridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthoxy-3 chlorosulfonyl)phényle présentaient une stabilité accrue, comparativement au conjugué d'IgG et de fluorosulfonate de .N-méthyl-acridin ium-9-carboxylate de 4-(2-succinimidylcarboxyéthyl)phényle. In each buffer, at each pH, the conjugates of IgG and fluorosulfonate of 3- (3-succinimidyloxy carbonyl) propyloxy-N-methyl-acridinium-9-carboxylate of (2,6-dimethyl-4-nitro) phenyl and N-methyl acridinium-9-carboxylate (3-2,6-dimethoxy-chlorosulfonyl) phenyl fluorosulfonate exhibited increased stability compared to the conjugate of IgG and 4- .N-methyl-acridin ium-9-carboxylate fluorosulfonate (2-succinimidylcarboxyethyl) phenyl.

Des conjugués d'IgG de souris avec du fluorosulfonate de 3-(3-succinimidyloxycarbonyl)propyloxy-N méthyl-acridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthyl-4 nitro)p: yle, du fluorosulfonate de N-méthyl-acridinium-9- carboxylate de (2,6-diméthoxy-3-chlorosulfonyl)phényle et du fluorosulfonate de N-méthyl-acridinium-9-carboxylate de 4-(2-succinimidylcarboxyéthyl)phényle ont été entreposés à température ambiante.(environ 23C) ("TA") et à 37 C. Les conjugués ont été entreposés dans du tampon standard au phosphate à pH 6,3, 7,3 et 8,0. Conjugates of mouse IgG with 3- (3-succinimidyloxycarbonyl) propyloxy-N methyl-acridinium-9-carboxylate (2,6-dimethyl-4 nitro) p: yl fluorosulfonate, N-methyl fluorosulfonate (2,6-dimethoxy-3-chlorosulfonyl) phenyl acridinium-9-carboxylate and 4- (2-succinimidylcarboxyethyl) phenyl N-methyl-acridinium-9-carboxylate fluorosulfonate were stored at room temperature (about 23C ) ("TA") and at 37 C. The conjugates were stored in standard phosphate buffer at pH 6.3, 7.3 and 8.0.

Les résultats de stabilité à température ambiante aux trois pH pour les conjugués d'IgG et de fluorosulfonate de N-méthyl-acridinium-9-carboxylate de 4 (2-succinimidylcarboxyéthyl)phényle, de fluorosulfonate de 3-(3-succinimidyloxycarbonyl)propyloxy-N-méthyl-acridinium9-carboxylate de (2,6-diméthyl-4-nitro)phényle et de fluorosulfonate de N-méthyl-acridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthoxy-3-chlorosulfonyl)phényle sont présentés, respectivement, sur les figures 14, 15 et 16. Les résultats de stabilité pour les conjugués d'IgG et de fluorosulfonate de N-méthyl-acridinium-9-carboxylate de 4- (2-succinimidyl- carboxyéthyl)phényle et de fluorosulfonate de N-méthylacridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthoxy-3-chlorosulfonyl)phényle à 37 C, aux trois pH, sont présentés, respectivement, sur les figures 17 et 18.Les figures 19 et 20 résument les résultats de stabilité pour un conjugué d'IgG et de fluorosulfonate de 3-(3-succinimidyloxycarbonyl)propyloxy-N-méthyl-acridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthyl-4-nitro)phényle à 37ec aux trois pH. Les figures 19 et 20 présentent des résultats pour des conjugués de fluorosulfonate de 3-(3-succinimidyloxycarbonyl)propyloxy-N-méthyl-acridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthyl-4-nitro)phényle produits en utilisant, respectivement, un excès molaire de 20x de fluorosulfonate de 3-(3-succinimidyloxycarbonyl)propyloxy-N-méthyl- acridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthyl-4-nitro)phényle et un excès molaire de 5x de fluorosulfonate de 3-(3 succinimidyloxycarbonyl)propyloxy-N-methyl-acridinium-9- carboxylate de (2,6-diméthyl-4-nitro)phényle dans le protocole de conjugaison. Results of stability at room temperature at three pHs for the conjugates of IgG and fluorosulfonate of N-methyl-acridinium-9-carboxylate of 4 (2-succinimidylcarboxyethyl) phenyl, of fluorosulfonate of 3- (3-succinimidyloxycarbonyl) propyloxy- (2,6-dimethyl-4-nitro) phenyl N-methyl-acridinium9-carboxylate and (2,6-dimethoxy-3-chlorosulfonyl) phenyl N-methyl-acridinium-9-carboxylate are presented, respectively , in FIGS. 14, 15 and 16. The stability results for the conjugates of IgG and N-methyl-acridinium-9-carboxylate fluorosulfonate of 4- (2-succinimidyl-carboxyethyl) phenyl and N- fluorosulfonate (2,6-dimethoxy-3-chlorosulfonyl) phenyl methylacridinium-9-carboxylate at 37 C, at three pHs, are shown in Figures 17 and 18, respectively. Figures 19 and 20 summarize the stability results for a conjugate of IgG and fluorosulfonate of 3- (3-succinimidyloxycarbonyl) propyloxy-N-methyl-acridinium-9-carboxylate of (2, 6-dimethyl-4-nitro) phenyl at 37ec at three pH. Figures 19 and 20 show results for 3- (3-succinimidyloxycarbonyl) propyloxy-N-methyl-acridinium-9-carboxylate (2,6-dimethyl-4-nitro) phenyl fluorosulfonate conjugates produced using, respectively , a 20x molar excess of 3- (3-succinimidyloxycarbonyl) propyloxy-N-methylacridinium-9-carboxylate fluorosulfonate of (2,6-dimethyl-4-nitro) phenyl and a 5x molar excess of fluorosulfonate 3 - (3 succinimidyloxycarbonyl) propyloxy-N-methyl-acridinium-9-carboxylate of (2,6-dimethyl-4-nitro) phenyl in the conjugation protocol.

A -chaque pH et à température ambiante et à 37 c, les conjugués d'IgG avec le fluorosulfonate de 3-(3succinimidyloxycarbonyl)propyloxy-N-méthyl-acridinium-9carboxylate de (2,6-diméthyl-4-nitro)phényle et le fluorosulfonate de N-méthyl-acridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthoxy-3-chlorosulfonyl)phényle présentaient une stabilité accrue, comparativement au conjugué d'IgG avec le fluorosulfonate de N-méthyl-acridinium-9-carboxylate de 4 (2-succinimidylcarboxyéthyl)phényle. At each pH and at room temperature and at 37 ° C., the conjugates of IgG with the fluorosulfonate of 3- (3succinimidyloxycarbonyl) propyloxy-N-methyl-acridinium-9carboxylate of (2,6-dimethyl-4-nitro) phenyl and (2,6-dimethoxy-3-chlorosulfonyl) phenyl N-methyl-acridinium-9-carboxylate fluorosulfonate exhibited increased stability compared to the IgG conjugate with N-methyl-acridinium-9-carboxylate fluorosulfonate 4 (2-succinimidylcarboxyethyl) phenyl.

Les conjugués d'IgG avec le fluorosulfonate de 3-(3-succinimidyloxyzarbonyl)propyloxy-N-méthyl-acridinium- 9-carboxylate de (2,6-diméthyl-4-nitro)phényle, le fluorosulfonate de N-méthyl-acridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthoxy-3-chlorosulfonyl)phényle et le fluorosulfonate de N-méthyl-acridinium-9-carboxylate de 4-(2 succinimidyicarboxyéthyl)phényie ont été entreposés a 37 C dans du tampon à l'avide (50 mM de Pi, 100 mM de NaCl, 0,1 % de sérum-albumine bovine, 10 mM d'azide de sodium) à pH 6,9, 7,0, 7,3 et 8,0. Les résultats de stabilité dans le tampon à l'azide, à pH 6,9, 7,0, 7,3 et 8,0, sont pré sentés-, respectivement, sur les figures 21, 22, 23 et 24. Conjugates of IgG with 3- (3-succinimidyloxyzarbonyl) propyloxy-N-methyl-acridinium-9-carboxylate (2,6-dimethyl-4-nitro) phenyl fluorosulfonate, N-methyl-acridinium fluorosulfonate (2,6-dimethoxy-3-chlorosulfonyl) phenyl 9-carboxylate and 4- (2 succinimidyicarboxyethyl) phenyl N-methyl-acridinium-9-carboxylate fluorosulfonate were stored at 37 C in avid buffer (50 mM Pi, 100 mM NaCl, 0.1% bovine serum albumin, 10 mM sodium azide) at pH 6.9, 7.0, 7.3 and 8.0. The results of stability in the azide buffer, at pH 6.9, 7.0, 7.3 and 8.0, are shown in Figures 21, 22, 23 and 24, respectively.

A des pH supérieurs à 7,3, les conjugués d'IgG avec le fluorosulfonate de 3- (3-succinimidyloxycarbonyl)- propyloxy-N-méthyl-acridinium-9-carboxylate de (2,6diméthyl-4-nitro)phényle et lé fluorosulfonate de N-méthylacridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthoxy-3-chloro- sulfonyl)phényle présentaient une stabilité accrue, comparativement au conjugué d'IgG avec le fluorosulfonate de N-méthyl-acridinium-9-carboxylate de 4-(2-succinimidylcarboxyéthyl) phényle. A pH 6,9 et 7,0, seul le conjugué d'IgG avec le fluorosulfonate de 3-(3-succinimidyloxy carbonyl)propyloxy-N-methyl-acridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthyl-4-nitro)phényle présentait une stabilité accrue.Le conjugué d'IgG avec le fluorosulfonate de Nméthyl-acridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthoxy-3- chlorosulfonyl)phényle n'était pas notablement plus stable que le conjugué d'IgG avec le fluorosulfonate de N-méthylacridinium-9-carboxylate de 4-(2-succinimidylcarboxyéthyl)phényle à pH 6,9 et 7,0. At pH above 7.3, the conjugates of IgG with 3- (3-succinimidyloxycarbonyl) - propyloxy-N-methyl-acridinium-9-carboxylate (2,6-dimethyl-4-nitro) phenyl fluorosulfonate and l (2,6-dimethoxy-3-chlorosulfonyl) phenyl N-methylacridinium-9-carboxylate fluorosulfonate exhibited increased stability compared to the conjugate of IgG fluorosulfonate of N-methyl-acridinium-9-carboxylate 4 - (2-succinimidylcarboxyethyl) phenyl. At pH 6.9 and 7.0, only the conjugate of IgG with 3- (3-succinimidyloxy carbonyl) propyloxy-N-methyl-acridinium-9-carboxylate fluorosulfonate (2,6-dimethyl-4-nitro ) phenyl showed increased stability. The IgG conjugate with (2,6-dimethoxy-3-chlorosulfonyl) phenyl N-methyl-acridinium-9-fluorosulfonate phenyl was not significantly more stable than the IgG conjugate with 4- (2-succinimidylcarboxyethyl) phenyl N-methylacridinium-9-carboxylate fluorosulfonate at pH 6.9 and 7.0.

Les conjugués d'IgG avec le fluorosulfonate de 3-(3-succinimidyloxycarbonyl)propyloxy-N-méthyl-acridinium9-carboxylate de (2,6-diméthyl-4-nitro)phényle, le fluorosulfonate de N-méthyl-acridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthoxy-3-chlorosulfonyl)phényle et le fluorosulfonate de N-méthyl-acridinlum-9-carboxylate de 4-(2 succinimidylcarboxyéthyl)phényle ont été entreposés à 37'C dans du tampon à l'azide à pH 6,3. Les résultats de stabilité pour les conjugués d'IgG avec le fluorosulfonate de 3-(3-succinimidyloxycarbonyl)propyloxy-N-methyl- acridinium-9-carboxylate de (2, 6-diméthyl-4-nitro) phényle, le fluorosulfonate de N-méthyl-acridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthoxy-3-chlorosulfonyl)phényle et le fluorosulfonate de N-méthyl-acridinium-9-carboxylate de 4-(2succinimidylcarboxyéthyl)phényle dans le tampon à l'azide à pH 6,3 à 37'C sont présentés sur la figure 25. Conjugates of IgG with 3- (3-succinimidyloxycarbonyl) propyloxy-N-methyl-acridinium9-carboxylate (2,6-dimethyl-4-nitro) phenyl fluorosulfonate, N-methyl-acridinium-9- fluorosulfonate (2,6-dimethoxy-3-chlorosulfonyl) phenyl carboxylate and 4- (2 succinimidylcarboxyethyl) phenyl N-methyl-acridinlum-9-carboxylate fluorosulfonate were stored at 37 ° C in azide buffer. pH 6.3. Stability results for IgG conjugates with 3- (3-succinimidyloxycarbonyl) propyloxy-N-methyl-acridinium-9-carboxylate fluorosulfonate, N fluorosulfonate (2,6-dimethyl-4-nitro) phenyl -2,6-dimethoxy-3-chlorosulfonyl) phenyl-acridinium-9-carboxylate and 4- (2succinimidylcarboxyethyl) phenyl N-methyl-acridinium-9-carboxylate fluorosulfonate in the azide buffer at pH 6.3 to 37'C are shown in Figure 25.

Les conjugués d'IgG avec le fluorosulfonate de 3- (3-succinimidyloxycarbonyl) propyioxy-N-méthyl-acridinium- 9-carboxylate de (2,6-dimêthyl-4-nitro)phényle et le fluorosulfonate de N-méthyl-acridinium-9-carboxylate de 4 (2-succinimidylcarboxyéthyl)phényle ont été entreposés à température ambiante et à 4'C dans du tampon à l'azide à pH 5,9. Les résultats de stabilité pour les conjugués d'IgG avec le fluorosulfonate de 3-(3-succinimidyloxycarbonyl)- propyloxy-N-méthyl-acridinium-9-carboxylate de (2,6diméthyl-4-nitro)phényle et le fluorosulfonate de N-méthylacridinium-9-carboxylate de 4-(2-succinimidylcarboxyéthyl)phényle dans le tampon à l'avide à pH 5,9 sont présentés sur la figure 26. Conjugates of IgG with 3- (3-succinimidyloxycarbonyl) propyioxy-N-methyl-acridinium-9-carboxylate (2,6-dimethyl-4-nitro) phenyl fluorosulfonate and N-methyl-acridinium fluorosulfonate 4 (2-succinimidylcarboxyethyl) phenyl 9-carboxylate were stored at room temperature and at 4 ° C in azide buffer at pH 5.9. Stability results for IgG conjugates with 3- (3-succinimidyloxycarbonyl) - propyloxy-N-methyl-acridinium-9-carboxylate (2,6-dimethyl-4-nitro) phenyl fluorosulfonate and N- fluorosulfonate 4- (2-succinimidylcarboxyethyl) phenyl methylacridinium-9-carboxylate in the avid buffer at pH 5.9 are shown in Figure 26.

A des pH inférieurs à 6,3 à 37 C, les conjugués d'IgG avec le fluorosulfonate de 3-(3-succinimidyloxycarbonyl)propyloxy-N-méthyl-acridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthyl-4-nitro)phényle et le fluorosulfonate de N méthyl-acridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthoxy-3chlorosulfonyl)phényle présentaient une stabilité réduite, comparativement au conjugué d'IgG avec le fluorosulfonate de N-méthyl-acridinium-9-carboxylate de 4-(2-succinimidylcarboxyéthyl)phényle.A pH 5,9, à température ambiante et à 4-C, le conjugué d'IgG avec le fluorosulfonate de 3-(3 succinimidyloxycarbonyl)propyloxy-N-méthyl-acridinium-9- carboxylate de (2,6-diméthyl-4-nitro)phényle présentait une stabilité réduite, comparativement au conjugué d'IgG avec le fluorosulfonate de N-méthyl-acridinium-9-carboxylate de 4- (2-succinimidylcarboxyéthyle. At pH below 6.3 to 37 C, the conjugates of IgG with 3- (3-succinimidyloxycarbonyl) propyloxy-N-methyl-acridinium-9-carboxylate fluorosulfonate (2,6-dimethyl-4-nitro ) phenyl and N-methyl-acridinium-9-carboxylate fluorosulfonate (2,6-dimethoxy-3chlorosulfonyl) phenyl showed reduced stability compared to the conjugate of IgG with N-methyl-acridinium-9-carboxylate fluorosulfonate 4- (2-succinimidylcarboxyethyl) phenyl. At pH 5.9, at room temperature and at 4-C, the conjugate of IgG with the fluorosulfonate of 3- (3 succinimidyloxycarbonyl) propyloxy-N-methyl-acridinium-9-carboxylate (2,6-dimethyl-4-nitro) phenyl exhibited reduced stability compared to the conjugate of IgG with 4- (2-succinimidylcarboxyethyl) N-methyl-acridinium-9-carboxylate fluorosulfonate.

Exemple 23
La stabilité comparative des esters phénylique, (2,6-diméthyl)phénylique et (2, 6-diméthyl-4-nitro) - phénylique de N-méthyl-acridane a été examinée dans du tampon au phosphate (100 mM de Pi, 150 mM de NaCl, 0,001 % de Thimerosal, 0,005 % de sérum-albumine humaine) à pH 6,3 et à pH 8,0, par incubation à 35 C et 45 C. Les résultats de stabilité pour ces composés à pH 6,3, à 35 C et a 45 C, sont présentés, respectivement, sur les figures 27 et 28.Example 23
The comparative stability of the phenyl, (2,6-dimethyl) phenyl and (2,6-dimethyl-4-nitro) - phenyl esters of N-methyl-acridane was examined in phosphate buffer (100 mM Pi, 150 mM NaCl, 0.001% Thimerosal, 0.005% human serum albumin) at pH 6.3 and pH 8.0, by incubation at 35 C and 45 C. The stability results for these compounds at pH 6.3 , at 35 C and a 45 C, are shown, respectively, in FIGS. 27 and 28.

Les résultats de stabilité pour ces composés à pH 8,0, à 35 C et 45 C, sont présentés, respectivement, sur les figures 29 et 30. Les composés portant un groupe (2,6diméthyl)phényle et un groupe (2,6-diméthyl-4-nitro)phényle présentaient une stabilité accrue, comparativement au composé portant un groupe phényle nu.The stability results for these compounds at pH 8.0, at 35 ° C. and 45 ° C., are presented, respectively, in FIGS. 29 and 30. The compounds bearing a group (2,6dimethyl) phenyl and a group (2,6 -dimethyl-4-nitro) phenyl exhibited increased stability compared to the compound carrying a naked phenyl group.

GROUPEMENTS CHIMIOLUMINESCENTS ADDITIONNELS
Exemple 24
Un groupement chimioluminescent apprécié de la présente invention, portant un groupe RnX sur l'atome de carbone auquel est fixée la liaison ester, est le N-méthylacr. 9-éthoxy-9-carboxylate de (2,6-diméthoxy-3chlor vlyl)phényle, qui répond à la formule suivante

ADDITIONAL CHEMOLUMINESCENT GROUPS
Example 24
A preferred chemiluminescent group of the present invention, carrying an RnX group on the carbon atom to which the ester bond is attached, is N-methylacr. (2,6-dimethoxy-3chlor vlyl) phenyl 9-ethoxy-9-carboxylate, which corresponds to the following formula

Le N-méthyl-acridane-9-éthoxy-9-carboxylate de (2,6diméthoxy-3-chlorosulfonyl)phényle est synthétisé à partir du N-méthyl-acridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthoxy-3- chlor @@@@fonyl)phényle par deux procédés différents, décrits ci-dessous.N-methyl-acridane-9-ethoxy-9-carboxylate of (2,6-dimethoxy-3-chlorosulfonyl) phenyl is synthesized from N-methyl-acridinium-9-carboxylate of (2,6-dimethoxy-3-chlor fonyl) phenyl by two different methods, described below.

1. Chromatographie en phase liquide à haute performance (CLHP)
Une colonne de C18 (Rainin, Dynamax 6,0 nm, 250 mm x 10 mm) a été équilibrée avec un mélange d'éthanol et d'acétonitrile (jusqu'à 10 %) contenant environ 0,05 % d'une amine tertiaire (par exemple la triéthylamine). Du Nméthyl-acridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthoxy-3chlorosulfonyl)phényle a été dissous dans la phase mobile et injecté au sommet de la colonne. La fraction principale, s'éludant avec une absorbance maximale à 280 -m, a été recueillie à un débit de 2,0-2,5 ml/min. Le solvant a été immédiatement éliminé totalement sous vide.Puis le résidu a été traité avec une petite quantité de benzène pour éliminer les traces d'alcool et pour éliminer l'humidité du produit final, le N-méthyl-acridane-9-éthoxy-9-carboxylate de (2,6-diméthoxy-3-chlorosulfonyl)phényle. Ce procédé de
CLHP constitue le procédé préféré de synthèse, puisqu'il donne un produit beaucoup plus pur. Cependant, le procédé de CLHP peut ne pas être approprié pour certains nucléophiles. Lorsque le procédé de CUP ne convient pas, le procédé utilisant un anion nucléophile, décrit ci-dessous, peut être utilisé.1. High performance liquid chromatography (HPLC)
A column of C18 (Rainin, Dynamax 6.0 nm, 250 mm x 10 mm) was equilibrated with a mixture of ethanol and acetonitrile (up to 10%) containing approximately 0.05% of a tertiary amine (e.g. triethylamine). N-methyl-acridinium-9-carboxylate (2,6-dimethoxy-3chlorosulfonyl) phenyl was dissolved in the mobile phase and injected at the top of the column. The main fraction, eluding with a maximum absorbance at 280 μm, was collected at a flow rate of 2.0-2.5 ml / min. The solvent was immediately removed completely in vacuo and the residue was treated with a small amount of benzene to remove traces of alcohol and to remove moisture from the final product, N-methyl-acridane-9-ethoxy- (2,6-dimethoxy-3-chlorosulfonyl) phenyl 9-carboxylate. This process of
HPLC is the preferred method of synthesis, since it gives a much purer product. However, the HPLC method may not be suitable for some nucleophiles. When the UPC method is not suitable, the method using a nucleophilic anion, described below, can be used.

2. Traitement du comPOsé de départ avec un anion nucléophile
Le N-méthyl-acridinium-9-carboxylate de (2,6 diméthoxy-3-chlorosulfonyl)phényle (0,013 mmole, 7,5 mg) a été dissous dans de méthanol absolu (3 ml), sous atmosphère d'azote. Une solution de tertio-butylate de potassium dans l'éthanol absolu (2 mg/ml) a ajoutée goutte à goutte (en utilisant une seringue étant aux gaz) a la solution, sous agitation énergique, de N-méthylacridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthoxy-3-chlorosulfonyl)phényle jusqu'à disparition totale de la couleur jaune de la solution. Puis l'éthanol a été totalement éliminé sous vide.Le résidu a été traité avec de l'éther anhydre (2 ml) et approximativement 1 g de sulfate de sodium anhydre. La séparation de la solution éthérée et l'évaporation du solvant ont donné du N-méthyl-acridane-9éthoxy-9-carboxylate de (2,6-diméthoxy-3-sulfonyl)phényle sous forme d'une substance solide de couleur blanche (2,5 mg).2. Treatment of the starting compound with a nucleophilic anion
The (2,6 dimethoxy-3-chlorosulfonyl) phenyl N-methyl-acridinium-9-carboxylate (0.013 mmol, 7.5 mg) was dissolved in absolute methanol (3 ml) under a nitrogen atmosphere. A solution of potassium tert-butoxide in absolute ethanol (2 mg / ml) was added dropwise (using a gas syringe) to the solution, with vigorous stirring, of N-methylacridinium-9-carboxylate. (2,6-dimethoxy-3-chlorosulfonyl) phenyl until the yellow color of the solution has completely disappeared. The ethanol was then completely removed in vacuo. The residue was treated with anhydrous ether (2 ml) and approximately 1 g of anhydrous sodium sulfate. Separation of the ethereal solution and evaporation of the solvent gave (2,6-dimethoxy-3-sulfonyl) phenyl N-methyl-acridane-9ethoxy-9-carboxylate as a white solid ( 2.5 mg).

Du N-méthyl-acridane-9-méthoxy-9-carboxylat (2,6-diméthoxy-3-chlorosulfonyl)phényle a été produit en utilisant à la fois les procédés de synthèse par CLHP et au moyen d'un anion nucléophile, à partir du N-méthylacridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthoxy-3-chloro- sulfonyl)phényle. Le N-méthyl-acridane-9-méthoxy-9carboxylate de (2,6-diméthyl-3-chlorosulfonyl)phényle a été produit au moyen du procédé de synthèse utilisant un anion nucléophile, à partir du N-méthyl-acridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthyl-3-chlorosulfonyl)phényle. N-methyl-acridane-9-methoxy-9-carboxylate (2,6-dimethoxy-3-chlorosulfonyl) phenyl was produced using both the HPLC synthesis methods and using a nucleophilic anion, to starting from (2,6-dimethoxy-3-chlorosulfonyl) phenyl N-methylacridinium-9-carboxylate. N-methyl-acridane-9-methoxy-9carboxylate of (2,6-dimethyl-3-chlorosulfonyl) phenyl was produced by means of the synthesis process using a nucleophilic anion, from N-methyl-acridinium-9- (2,6-dimethyl-3-chlorosulfonyl) phenyl carboxylate.

3. Autres synthèses
Les deux procédés de synthèse décrits ci-dessus peuvent être utilisés pour produire n'importe lequel des composés de la présente invention portant un groupe RnX. Si un composé nucléophile autre que l'méthanol doit céder le groupe RnX, méthanol est remplacé par le composé nucléophile désiré dans les procédés de synthèse. Si un acridinium, un phénanthridinium, etc., différents sont désirés, le N-méthyl-acridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthoxy-3 chlorosulfonyl)phényle peut être remplacé par le composé auquel le groupe RnX doit ête ajouté dans les procédés de synthèse décrits ci-dessus. Dans la plupart des cas, un changement du composé nucléophile nécessite également un changement de solvant (par exemple, si le méthanol est le composé nucléophile désiré, l'méthanol ne peut être utilisé comme solvant en raison d'une compétition pour l'addition).3. Other summaries
The two synthetic methods described above can be used to produce any of the compounds of the present invention carrying an RnX group. If a nucleophilic compound other than methanol must yield the RnX group, methanol is replaced by the nucleophilic compound desired in the synthesis processes. If different acridinium, phenanthridinium, etc. are desired, the (2,6-dimethoxy-3 chlorosulfonyl) phenyl N-methyl-acridinium-9-carboxylate can be replaced with the compound to which the RnX group is to be added in the synthesis methods described above. In most cases, a change in the nucleophilic compound also requires a change in solvent (for example, if methanol is the desired nucleophilic compound, methanol cannot be used as a solvent due to competition for addition) .

Dans de tels cas, le nouveau composé nucléophile peut être utilisé comme solvant de remplacement, s'il est approprié, ou bien un solvant non protique, non nucléophile (par exemple le THF) peut être utilisé en remplacement.In such cases, the new nucleophilic compound can be used as an alternative solvent, if appropriate, or a non-protic, non-nucleophilic solvent (eg THF) can be used as a replacement.

D'autres procédés de synthèse, comprenant, à titre non limitatif, le traitement avec un solvant nucléophile, peuvent également être utilisés pour produire des groupements portant un groupe RnX. Other synthetic methods, including, without limitation, treatment with a nucleophilic solvent, can also be used to produce groups carrying an RnX group.

Exemple 25
Pour confirmer la possibilité de mise en oeuvre des procédés de synthèse décrits dans l'exemple 24, les produits ont été analysés par spectroscopie UV-lumière visible, par spectroscopie de masse par bombardement atomique rapide et par RMN des protons à 300 MHz.Example 25
To confirm the possibility of implementing the synthesis methods described in Example 24, the products were analyzed by UV-visible light spectroscopy, by mass spectroscopy by rapid atomic bombardment and by proton NMR at 300 MHz.

La figure 31 représente un spectre UV-lumière visible du N-méthyl-acridane-9-éthoxy-9-carboxylate de (2,6-diméthoxy-3-chlorosulfonyl)phényle (solvant:chloroforme). La figure 32 est un spectre de masse par bombardement atomique rapide du N-méthyl-acridane-9-éthoxy-9carboxylate de (2,6-diméthoxy-3-chlorosulfonyl)phényle (m/e = 472,1 ; M+ - OCH2CH3). L'intégrité du groupement chlorure de sulfonyle est confirmée par le pic d'abondance d'isotope à 472+2=474. FIG. 31 represents a visible UV-light spectrum of phenyl (2,6-dimethoxy-3-chlorosulfonyl) phenyl N-methyl-acridane-9-ethoxy-9-carboxylate (solvent: chloroform). FIG. 32 is a mass spectrum by rapid atomic bombardment of N-methyl-acridane-9-ethoxy-9carboxylate of (2,6-dimethoxy-3-chlorosulfonyl) phenyl (m / e = 472.1; M + - OCH2CH3) . The integrity of the sulfonyl chloride group is confirmed by the isotope abundance peak at 472 + 2 = 474.

La figure 33 représente un spectre RMN des protons à 300 MHZ du N-méthyl-acridane-9-méthoxy-9carboxylate de (2,6-diméthoxy-3-chlorosulfonyl)phényle (solvant:CDCi3). FIG. 33 represents an NMR spectrum of the protons at 300 MHz of the N-methyl-acridane-9-methoxy-9carboxylate of (2,6-dimethoxy-3-chlorosulfonyl) phenyl (solvent: CDCl3).

La figure 34 représente un spectre RMN des protons à 300 MHz du N-méthyl-acridane-9-méthoxy-9- carboxylate de (2,6-diméthyl-3-chlorosulfonyl)phényle (solvant:CDCl3). FIG. 34 represents an NMR spectrum of the protons at 300 MHz of the N-methyl-acridane-9-methoxy-9-carboxylate of (2,6-dimethyl-3-chlorosulfonyl) phenyl (solvent: CDCl3).

ExemPle 26
Du N-méthyl-acridane-9-éthoxy-9-carboxylate de (2,6-diméthoxy-3-chlorosulfonyl)phenyle a été utilisé comme marqueur dans une analyse de TSH, de la manière suivante
1. Constituants
A) Anticorps marqué : de i'anti-TSH de chèvre, purifié par affinité, a été conjugué à du N-méthylacridane-9-éthoxy-9-carboxylate de (2,6-diméthoxy-3chlorosulfonyl)phényle de la manière suivante : une solution de l'anticorps anti-TSH (approximativement 100 Sg) dans du tampon au bicarbonate (0,lM, pH 9,6) a été traitée avec un excès molaire de 25x de N-méthyl-acridane-9-éthoxy- 9-carboxylate de (2,6-diméthoxy-3-chlorosulfonyl)phényle sous forme de solution dans le DMF. Le mélange réactionnel a été purifié sur une colonne de Sephadex G25 (superfin) à écoulement rapide (Pharmacia) -en utilisant un dispositif de
CLHP.Le pic de protéine a été recueilli à un débit approximativement égal à 0,75 ml/min avec une phase mobile de tampon au phosphate (pH 6,0) contenant approximativement 20 % d'éthanol. Après changement du tampon, la préparation d'anticorps marqué a été diluée avec du tampon de mise en réserve pour parvenir approximativement à 100 000 unités/100 ul dans un analyseur LumaTag TM (disponible dans le commerce auprès de London Diagnostics,
Eden Prairie, Minnesota) après une dilution au 1/10.EXAMPLE 26
2,6-dimethoxy-3-chlorosulfonyl) phenyl N-methyl-acridane-9-ethoxy-9-carboxylate was used as a marker in a TSH analysis, as follows
1. Constituents
A) Labeled antibody: affinity purified anti-TSH of goat was conjugated to (2,6-dimethoxy-3chlorosulfonyl) phenyl N-methylacridane-9-ethoxy-9-carboxylate as follows: a solution of the anti-TSH antibody (approximately 100 Sg) in bicarbonate buffer (0.1 μM, pH 9.6) was treated with a 25 × molar excess of N-methyl-acridane-9-ethoxy-9 (2,6-dimethoxy-3-chlorosulfonyl) phenylcarboxylate in the form of a solution in DMF. The reaction mixture was purified on a fast flow Sephadex G25 column (superfine) (Pharmacia) -using a
HPLC. The protein peak was collected at a flow rate approximately equal to 0.75 ml / min with a mobile phase of phosphate buffer (pH 6.0) containing approximately 20% ethanol. After changing the buffer, the labeled antibody preparation was diluted with stock buffer to approximately 100,000 units / 100 µl in a LumaTagTM analyzer (commercially available from London Diagnostics,
Eden Prairie, Minnesota) after a 1/10 dilution.

B) Tampon de mise en réserve : 100 mM de phosphate, 0,145 M de NaCi, 0,001 iÓ de Thimerosal, 0,4 % de
SAB, 0,1 mg/ml de globulines de souris et 0,1 mg/ml de globulines de chèvre, pH 6,0.B) Storage buffer: 100 mM phosphate, 0.145 M NaCi, 0.001 iÓ Thimerosal, 0.4%
SAB, 0.1 mg / ml mouse globulins and 0.1 mg / ml goat globulins, pH 6.0.

C) Anticorps de capture : anti-TSH monoclonal (2 pg/ml) sous forme d'une phase solide sur des tubes de
Nunc. Procédé de préparation de tubes de Nunc portant une phase solide
1) 0,4 ml de l'anticorps de capture à
2 pg/ml dans du tampon au STP (sérum
physiologique tamponné avec un
phosphate, pH 7,2-7,4, 10 mM de
phosphate, 100 mM de NaCi, 10 mM de
NaN3) a été introduit dans chaque
tube.C) Capture antibodies: monoclonal anti-TSH (2 μg / ml) in the form of a solid phase on tubes of
Nunc. Process for the preparation of Nunc tubes carrying a solid phase
1) 0.4 ml of the capture antibody to
2 pg / ml in STP buffer (serum
physiological buffered with a
phosphate, pH 7.2-7.4, 10 mM
phosphate, 100 mM NaCi, 10 mM
NaN3) was introduced into each
tube.

2) Les tubes ont été incubés pendant 18
à 24 heures.2) The tubes were incubated for 18
at 24 hours.

3) Les tubes ont été lavés à trois
reprises avec le tampon au STP. 3) The tubes were washed three times
repeated with buffer at STP.

4) Les tubes ont été bloqués avec 2,0 %
de SAB dans du tampon au STB et
incubés pendant un temps inférieur à
4 heures à température ambiante.4) Tubes were blocked with 2.0%
of SAB in STB buffer and
incubated for less than
4 hours at room temperature.

6) Les tubes ont été séchés & tempéra
ture ambiante.6) The tubes have been dried & tempera
ambient ture.

7) Les tubes ont été entreposés dans
des sacs en matière plastique pour
congélateur à 4 C. 7) The tubes have been stored in
plastic bags for
4 C. freezer

D) Etalons : préparés dans du sérum de cheval. D) Standards: prepared in horse serum.

0, 0,05, 0,1, 0,5, 2,5, 10, 25 et 50 UI/ml.0, 0.05, 0.1, 0.5, 2.5, 10, 25 and 50 IU / ml.

E) Solution de lavage : tampon au sérum physiologique contenant de la SAB. E) Washing solution: physiological saline buffer containing BSA.

2. Protocole analytique
1) 200 l d'échantillon ont été introduits à la pipette dans les tubes revêtus.2. Analytical protocol
1) 200 l of sample were pipetted into the coated tubes.

5) 1 ml de solution de lavage a été introduit dans chaque tube. 5) 1 ml of washing solution was introduced into each tube.

6) Les tubes ont été lavés en utilisant un appareil de lavage Biotomic (disponible dans le commerce auprès de Ocean Scientific, Inc., Garden Grove, Californie). 6) Tubes were washed using a Biotomic washer (commercially available from Ocean Scientific, Inc., Garden Grove, California).

7) La chimioluminescence a été comptée pendant 2 secondes [pompe 1 : HNO3 0,1 N + 0,25 % de H202 pompe 2 : NaOH 0,25 N + 0,125 % de CTAC) dans un analyseur
LumaTag TM (disponible dans le commerce auprès de London
Diagnostics, Eden Prairie, Minnesota). 7) The chemiluminescence was counted for 2 seconds [pump 1: HNO3 0.1 N + 0.25% of H 2 O 2 pump 2: NaOH 0.25 N + 0.125% of CTAC) in an analyzer
LumaTag TM (commercially available from London
Diagnostics, Eden Prairie, Minnesota).

L'addition de HNO3 au mélange analytique contenant l'anticorps marqué provoque la séparation du groupe éthoxy en Cg de la molécule d'acridinium avant induction de la réaction de chimioluminescence par addition de NaOH. Une courbe de référence pour l'analyse est présentée sur la figure 35. The addition of HNO3 to the analytical mixture containing the labeled antibody causes the separation of the ethoxy group Cg of the acridinium molecule before induction of the chemiluminescence reaction by addition of NaOH. A reference curve for the analysis is shown in Figure 35.

Exemple 27
Les stabilités du N-méthyl-acridinium-9carboxylate de (2,6-diméthoxy-3-chlorosulfonyl)phényle ("DMC") et du N-méthyl-acridane-9-éthoxy-9-carboxylate de (2,6-diméthoxy-3-chlorosulfonyl)phényle ("DME") ont été comparées à pH 9,6 à 25'C. Les composés ont été dissous dans le DMF (approximativement 0,5 mg/ml). Puis 10 p1 de la solution ont été ajoutés à 1 ml de tampon au bicarbonate (0,lM de bicarbonate, 0,00025 % de Thimerosal, 0,1 % de sérum-albumine bovine). La solution a été diluée davantage pour parvenir à approximativement 300 000 coups dans 10 1. Example 27
Stabilities of (2,6-dimethoxy-3-chlorosulfonyl) phenyl ("DMC") N-methyl-acridinium-9carboxylate and (2,6-dimethoxy) N-methyl-acridane-9-ethoxy-9-carboxylate -3-chlorosulfonyl) phenyl ("DME") were compared at pH 9.6 at 25 ° C. The compounds were dissolved in DMF (approximately 0.5 mg / ml). Then 10 µl of the solution was added to 1 ml of bicarbonate buffer (0.1 µM bicarbonate, 0.00025% Thimerosal, 0.1% bovine serum albumin). The solution was further diluted to approximately 300,000 counts in 10 L.

Les résultats obtenus par l'étude de stabilité sont présentés sur la figure 36. Le DME s'est révélé être plus stable que le DMC au cours du temps.The results of the stability study are shown in Figure 36. DME was found to be more stable than DMC over time.

Les stabilités du conjugué TSH marqué au DMC et du conjugué TSH marqué au DME ont été comparées à pH 6,0 à 25, 30 et 35 C. Les résultats obtenus à partir de l'étude de stabilité sont présentés sur les figures 37 à 39. Le conjugué TSH marqué au DME s'est révélé être plus stable au cours du temps. The stabilities of the DMC-labeled TSH conjugate and the DME-labeled TSH conjugate were compared at pH 6.0 at 25, 30 and 35 C. The results obtained from the stability study are presented in FIGS. 37 to 39 The TSH conjugate labeled with DME has been shown to be more stable over time.

Exemple 28
Un groupement chimioluminescent apprécié de la présente invention, portant un groupe RnX sur l'atome de carbone auquel est fixée la liaison ester et portant un substituant péri, est le N.-méthyl-1,3-diméthyl-acridane-9- méthoxy-9-carboxylate de phényle, qui répond à la formule suivante

Example 28
A preferred chemiluminescent group of the present invention, carrying an RnX group on the carbon atom to which the ester bond is attached and carrying a peri substituent, is N.-methyl-1,3-dimethyl-acridane-9-methoxy- Phenyl 9-carboxylate, which corresponds to the following formula

Le N-méthyl-1,3-diméthyl-acridane-9-méthoxy-9-carboxylate de phényle a été synthétisé à partir du N-méthyl-1,3diméthyl-acridinium-9-carboxylate de phényle suivant le procédé de CLHP décrit ci-dessus. Pour produire du N méthyl-1,3-dimethyl-acridinium-9-carboxylate de phényle, de la 3,5-diméthylaniline et du bromobenzène ont été amenés à réagir dans des conditions de réaction d'Ullmann par extension, donnant la N-phényl-N-(3,5-diméthyl)phénylamine.Phenyl N-methyl-1,3-dimethyl-acridane-9-methoxy-9-carboxylate was synthesized from phenyl N-methyl-1,3dimethyl-acridinium-9-carboxylate according to the HPLC method described above. -above. To produce phenyl N-1,3-dimethyl-acridinium-9-carboxylate, 3,5-dimethylaniline and bromobenzene were reacted under Ullmann reaction conditions by extension, giving N- phenyl-N- (3,5-dimethyl) phenylamine.

La réaction de la N-phényl-N-(3,5-diméthyl)phénylamine avec le chlorure d'oxalyle a donné la N-phényldiméthylisatine intermédiaire. Par cyclisation dans des conditions basiques, l'acide 1,3-diméthyl-acridine-9-carboxylique a été formé. L'ester phénylique d'acridine a été formé par estérification avec le phénol, de la manière décrite précédemment. Le N-méthyl-1,3-diméthyl-acridinium-9carboxylate de phényle a été produit à partir de l'ester d'acridine de la manière décrite ci-dessus.The reaction of N-phenyl-N- (3,5-dimethyl) phenylamine with oxalyl chloride gave the intermediate N-phenyldimethylisatin. By cyclization under basic conditions, 1,3-dimethyl-acridine-9-carboxylic acid was formed. The acridine phenyl ester was formed by esterification with phenol, as described above. Phenyl N-methyl-1,3-dimethyl-acridinium-9carboxylate was produced from the acridine ester as described above.

Pour confirmer la possibilité de mise en oeuvre du procédé de synthèse décrit dans cet exemple, le N méthyl-1,3-diméthyl-acridane-9-methoxy-9-carboxylate de phényle a été analysé par RMN des protons à 300 MHz (solvant : CDC13). Le spectre est présenté sur la figure 40. To confirm the possibility of implementing the synthesis process described in this example, the phenyl N-1,3-methyl-acridane-9-methoxy-9-carboxylate was analyzed by proton NMR at 300 MHz (solvent : CDC13). The spectrum is shown in Figure 40.

Il va de soi que de la présente invention n'a été décrite qu'à titre explicatif, mais nullement limitatif, et que de nombreuses modifications peuvent y être apportées sans sortir de son cadre. It goes without saying that the present invention has been described for explanatory purposes, but in no way limiting, and that numerous modifications can be made thereto without departing from its scope.

Claims

REVENDICATIONS

1. Analyse par liaison spécifique destinée à déterminer la présence d'un analyte dans un échantillon, (i) ladite analyse utilisant un conjugué chimioluminescent comprenant un groupement chimioluminescent fixé a une matière à liaison spécifique et (ii) la présence de l'analyte dans ledit échantillon étant proportionnelle à la formation d'un ou plusieurs produits de réaction de liaison spécifique contenant ledit conjugué chimioluminescent, ladite analyse consistant 1. Specific binding analysis for determining the presence of an analyte in a sample, (i) said analysis using a chemiluminescent conjugate comprising a chemiluminescent group attached to a specific binding material and (ii) the presence of the analyte in said sample being proportional to the formation of one or more specific binding reaction products containing said chemiluminescent conjugate, said analysis consisting

à permettre dans des conditions convenables une formation notable dudit ou desdits produits de tion de liaison spécifique contenant ledit conjugué chimioluminescent ; et allowing, under suitable conditions, a notable formation of said one or more specific binding products containing said chemiluminescent conjugate; and

à mesurer la chimioluminescence (i) dudit ou desdits produits de réaction de liaison spécifique contenant ledit conjugué chimioluminescent ou (ii) du conjugué chimioluminescent non présent dans ledit ou lesdits produits de réaction de liaison spécifique measuring the chemiluminescence (i) of said one or more specific binding reaction products containing said chemiluminescent conjugate or (ii) of the chemiluminescent conjugate not present in said one or more specific binding reaction products

caractérisée en ce que le perfectionnement consiste à choisir comme groupement chimioluminescent un ester, thioester ou amide dans lequel la liaison ester, thioester ou amide est située entre characterized in that the improvement consists in choosing as chemiluminescent group an ester, thioester or amide in which the ester, thioester or amide bond is located between

un noyau ou système cyclique hétérocyclique contenant un atome de carbone auquel est fixée ladite liaison, l'hétéro-atome présent dans ledit noyau ou système cyclique hétérocyclique étant à un état d'oxyôation qui rend cet atome de carbone sensible à une attaque par un peroxyde ou de l'oxygène moléculaire pour former un intermédiaire qui se dégrade pour engendrer une chimioluminescence ; et a heterocyclic ring or ring system containing a carbon atom to which said bond is attached, the hetero atom present in said heterocyclic ring or ring system being in an oxidation state which makes this carbon atom susceptible to attack by a peroxide or molecular oxygen to form an intermediate which degrades to generate chemiluminescence; and

un noyau ou système cyclique aryle, ledit noyau ou système cyclique aryle contenant au moins un noyau hexagonal substitué, ledit noyau hexagonal substitué portant deux ou plus de deux substituants, au moins deux de ces substituants bloquant par encombrement stérique l'hydrolyse de ladite liaison an aryl ring or ring system, said aryl ring or ring system containing at least one substituted hexagonal ring, said substituted hexagonal ring carrying two or more than two substituents, at least two of these substituents blocking the hydrolysis of said bond by steric hindrance

l'atome de carbone auquel est fixée ladite liaison portant un substituant secondaire de formule RnX, dans laquelle X est choisi dans le groupe comprenant 0, N, the carbon atom to which is fixed said bond carrying a secondary substituent of formula RnX, in which X is chosen from the group comprising 0, N,

S et C, R est n'importe quel groupe et n est un nombre choisi de manière que X possède une valence convenable.S and C, R is any group and n is a number chosen so that X has a suitable valence.

2. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 1, caractérisée en ce que la matière à liaison spécifique peut se lier spécifiquement à l'analyste et le ou les produits de réaction de liaison spécifique sont constitués d'un complexe analyte-conjugué chimioluminescent, ladite analyse consistant en outre 2. Analysis by specific binding according to claim 1, characterized in that the specific binding material can bind specifically to the analyst and the specific binding reaction product (s) consist of an analyte-chemiluminescent conjugate complex, said further analysis

à permettre dans des conditions convenables une formation notable dudit complexe analyte-conjugué chimioluminescent ; et to allow, under suitable conditions, a significant formation of said analyte-chemiluminescent conjugate complex; and

à mesurer la chimioluminescence (i) dudit complexe analyte-conjugué chimioluminescent ou (ii) du conjugué chimioluminescent non présent dans ledit complexe analyte-conjugué chimioluminescent. measuring the chemiluminescence (i) of said chemiluminescent conjugate complex or (ii) of the chemiluminescent conjugate not present in said analyte-chemiluminescent conjugate complex.

3. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle utilise en outre un corps réactionnel qui peut se lier spécifiquement (i) à l'analyte pour former un complexe analyte-corps réactionnel, et (ii) à la matière à liaison spécifique pour former un complexe conjugué chimioluminescent-corps réactionnel, le ou les produits de réaction de liaison spécifique étant constitués dudit complexe conjugué chimioluminescent-corps réactionnel, ladite analyse consistant en outre 3. Analysis by specific binding according to claim 1, characterized in that it also uses a reaction substance which can specifically bind (i) to the analyte to form an analyte-reaction body complex, and (ii) to the specific binding material for forming a chemiluminescent conjugate-reaction complex, the specific binding reaction product (s) being made up of said chemiluminescent conjugate-reaction complex, said analysis further comprising

à permettre dans des conditions convenables une formation notable dudit complexe analyte-corps réactionnel et dudit complexe conjugué chimioluminescent-corps réactionnel ; et allowing, under suitable conditions, a significant formation of said analyte-reaction body complex and of said chemiluminescent-reaction body complex; and

& mesurer la chimioluminescence (i) dudit complexe conjugué chimioluminescent-corps réactionnel ou (ii) dudit conjugué chimioluminescent non présent dans ledit complexe conjugué chimioluminescent-corps réactionnel. & measuring the chemiluminescence (i) of said chemiluminescent conjugate-reaction body complex or (ii) of said chemiluminescent conjugate not present in said chemiluminescent conjugate-reaction body complex.

4. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 1, caractérisée en ce que la matière å liaison spécifique peut se lier spécifiquement à l'analyte, ladite analyse utilisant en outre un corps réactionnel pouvant se lier spécifiquement audit analyte pour former un complexe corps réactionnel-analyte-conjugué chimioluminescent, et le ou les produits de réaction de liaison spécifique sont constitués dudit complexe corps réactionnel-analyte-conjugué chimioluminescent, ladite analyse consistant en outre 4. Specific binding analysis according to claim 1, characterized in that the specific binding material can bind specifically to the analyte, said analysis further using a reactant which can specifically bind to said analyte to form a complex reactant- chemiluminescent analyte-conjugate, and the specific binding reaction product (s) are made up of said reactant-analyte-chemiluminescent conjugate complex, said analysis further comprising

à permettre dans des conditions convenables une formation notable dudit complexe corps réactionnel-analyteconjugué chimioluminescent ; et to allow, under suitable conditions, a significant formation of said chemiluminescent conjugate reaction-analytical complex; and

& mesurer la chimioluminescence (i) dudit complexe corps réactionnel-analyte-conjugué chimioluminescent ou (ii) du conjugué chimioluminescent non présent dans ledit complexe corps réactionnel-analyteconjugué chimioluminescent. & measuring the chemiluminescence (i) of said chemiluminescent conjugate-analyte-conjugate complex or (ii) of the chemiluminescent conjugate not present in said chemiluminescent conjugate-analytic complex.

5. Analyse par liaison spécifique destinée à déterminer la présence d'un analyte dans un échantillon, (i) ladite analyse utilisant un groupement chimioluminescent et (ii) la présence de l'analyte dans ledit échantillon étant proportionnelle à la formation d'un ou plusieurs produits de réaction de liaison spécifique ne contenant pas ledit groupement chimioluminescent, ledit groupement chimioluminescent entrant en chimioluminescence proportionnellement à la formation du ou des produits de réaction de liaison spécifique, ladite analyse consistant 5. Analysis by specific binding intended to determine the presence of an analyte in a sample, (i) said analysis using a chemiluminescent group and (ii) the presence of the analyte in said sample being proportional to the formation of one or more several specific binding reaction products not containing said chemiluminescent group, said chemiluminescent group entering into chemiluminescence in proportion to the formation of the specific binding reaction product (s), said analysis consisting

à permettre dans des conditions convenables une formation notable du ou des produits de réaction de liaison spécifique ; et to allow, under suitable conditions, a significant formation of the specific binding reaction product (s); and

å mesurer la chimioluminescence dudit groupement chimioluminescent provoquée par la formation du ou des produits de réaction de liaison spécifique ; å measuring the chemiluminescence of said chemiluminescent group caused by the formation of the specific binding reaction product (s);

un noyau ou système cyclique hétérocyclique contenant un atome de carbone auquel est fixée ladite liaison, l'hétéro-atome dans ledit noyau ou système cyclique hétérocyclique étant -å un état d'oxydation qui rend ledit atome de carbone sensible à une attaque par un peroxv -u de l'oxygène moléculaire pour former un intermudfiaire qui se dégrade pour engendrer une chimioluminescence ; et a heterocyclic ring or ring system containing a carbon atom to which said bond is attached, the hetero atom in said heterocyclic ring or ring system being an oxidation state which makes said carbon atom susceptible to attack by a peroxv -u molecular oxygen to form an intermudium which degrades to generate chemiluminescence; and

l'atome de carbone auquel est fixée ladite liaison portant un substituant secondaire de formule RnX, dans laquelle X est choisi dans le groupé comprenant O, N, the carbon atom to which is fixed said bond carrying a secondary substituent of formula RnX, in which X is chosen from the group comprising O, N,

S et C, R représente n'importe quel groupe et n est un nombre choisi de manière que X possède une valence convenable.S and C, R represents any group and n is a number chosen so that X has a suitable valence.

6. Analyse par liaison spécifique suivant la revendicrtion 5, caractérisée en ce qu'elle utilise en outre un corps réactionnel pouvant se lier à l'analyte pour former un complexe analyte-corps réactionnel, le groupement chimioluminescent entrant en chimioluminescence proportionnellement à la formation dudit complexe analyte-corps réactionnel. 6. Analysis by specific binding as claimed in claim 5, characterized in that it also uses a reaction body capable of binding to the analyte to form an analyte-reaction body complex, the chemiluminescent group entering into chemiluminescence in proportion to the formation of said analyte-reaction body complex.

7. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 1 ou 5, caractérisée en ce que le substituant secondaire est choisi dans le groupe comprenant -CN, -OR, -NR2, -NR3+, -SR, -SR2+ -S2R, -NRCO2R, -NHNR2, -NRNR2, -NHOR, -ONR2, -CR(CN)2, -CR(COR)2, -CR2NO2, -C#COR, 7. Analysis by specific binding according to claim 1 or 5, characterized in that the secondary substituent is chosen from the group comprising -CN, -OR, -NR2, -NR3 +, -SR, -SR2 + -S2R, -NRCO2R, - NHNR2, -NRNR2, -NHOR, -ONR2, -CR (CN) 2, -CR (COR) 2, -CR2NO2, -C # COR,

8. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 7, caractérisée en ce que chacun des substituants qui bloquent par encombrement stérique l'hydrolyse de la liaison est choisi entre les groupes -CH3, -OCH3 et isopropyle. 8. Analysis by specific bond according to claim 7, characterized in that each of the substituents which block by steric hindrance the hydrolysis of the bond is chosen from the groups -CH3, -OCH3 and isopropyl.

9. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 7, caractérisée en ce qu'au moins l'un des substituants qui bloquent par encombrement stérique l'hydrolyse de la liaison est un groupe électrophile. 9. Analysis by specific bond according to claim 7, characterized in that at least one of the substituents which block by steric hindrance the hydrolysis of the bond is an electrophilic group.

10. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 7, caractérisée en ce que le noyau hexagonal substitué porte au moins tn substituant supplémentaire, en plus des substituants qui bloquent par encombrement stérique l'hydrolyse de la liaison, au moins un substituant supplémentaire étant un groupe électrophile. 10. Analysis by specific binding according to claim 7, characterized in that the substituted hexagonal nucleus carries at least one additional substituent, in addition to the substituents which block by steric hindrance the hydrolysis of the bond, at least one additional substituent being a group electrophilic.

11. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 10, caractérisee en ce qu'au moins un substituant supplémentaire est choisi entre les groupes -NO2 -SO2C1, -Br, -N(CH3)3+ et -H. 11. Analysis by specific binding according to claim 10, characterized in that at least one additional substituent is chosen from the groups -NO2 -SO2C1, -Br, -N (CH3) 3+ and -H.

12. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 11, caractérisée en ce que le groupe électrophile est un groupe -H. 12. Analysis by specific binding according to claim 11, characterized in that the electrophilic group is a group -H.

13. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 7, caractérisée en ce que le noyau ou système cyclique aryle est choisi entre les groupes phényle, naphtalène et anthracène. 13. Analysis by specific binding according to claim 7, characterized in that the aryl ring or ring system is chosen from phenyl, naphthalene and anthracene groups.

14. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 13, caractérisée en ce que le noyau ou système cyclique aryle est un groupe phényle. 14. Analysis by specific binding according to claim 13, characterized in that the aryl ring or ring system is a phenyl group.

15. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 14, caractérisée en ' ce que la somme des valeurs sigmap pour tous les substituants présents sur le groupe phényle, qui sont des groupes électrophiles, est inférieure ou égale à environ 1,0. 15. Analysis by specific binding according to claim 14, characterized in that the sum of the sigmap values for all the substituents present on the phenyl group, which are electrophilic groups, is less than or equal to about 1.0.

16. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 7, caractérisée en ce que le noyau ou système cyclique hétérocyclique est une forme réduite d'un membre choisi dans le groupe comprenant l'acridinium, le benz[a]acridinium, le benz[b)acridinium, le benz[c)acridinium, un cation 1,2,4-triazole, un cation isoxazole, un cation isothiazole, un cation 1,2-azole, un cation imidazole, un cation benzimidazoler le quinolinium, l'isoquinolinium, le quinolizinium, un quinolinium à substitution cyclique, le pyridinium, le pyrimidinium, le pyridazinium, le pyrazinium, le phénanthridinium et le quinoxalinium. 16. Analysis by specific binding according to claim 7, characterized in that the heterocyclic ring or ring system is a reduced form of a member chosen from the group comprising acridinium, benz [a] acridinium, benz [b) acridinium, benz [c) acridinium, a 1,2,4-triazole cation, an isoxazole cation, an isothiazole cation, a 1,2-azole cation, an imidazole cation, a benzimidazoler cation quinolinium, isoquinolinium, quinolizinium, a cyclically substituted quinolinium, pyridinium, pyrimidinium, pyridazinium, pyrazinium, phenanthridinium and quinoxalinium.

17. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication ' 16, caractérisée en ce que le noyau ou système cyclique hétérocyclique est une forme réduite de l'acridinium, du quinolinium ou du phénanthridinium. 17. Analysis by specific binding according to claim '16, characterized in that the heterocyclic ring or ring system is a reduced form of acridinium, quinolinium or phenanthridinium.

18. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 17, caractérisée en ce que le substituant secondaire est choisi entre les groupes -OCH3 et -OCH2CH3. 18. Analysis by specific binding according to claim 17, characterized in that the secondary substituent is chosen from the groups -OCH3 and -OCH2CH3.

19. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 18, caractérisée en ce que le groupement chimioluminescent est le N-méthyl-acridane-9-éthoxy-9carboxylate de (2,6-diméthoxy-3-chlorosulfonyl)phényle. 19. Analysis by specific binding according to claim 18, characterized in that the chemiluminescent group is the N-methyl-acridane-9-ethoxy-9carboxylate of (2,6-dimethoxy-3-chlorosulfonyl) phenyl.

20. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 18, caractérisée en ce que le groupement chimioluminescent est le N-méthyl-acridane-9-méthoxy-9 carboxylate de (2,6-diméthoxy-3-chlorosulfonyl)phényle. 20. Analysis by specific binding according to claim 18, characterized in that the chemiluminescent group is the N-methyl-acridane-9-methoxy-9 carboxylate of (2,6-dimethoxy-3-chlorosulfonyl) phenyl.

21. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 18, caractérisée en ce que le groupement chimioluminescent est le N-méthyl-acridane-9-méthoxy-9carboxylate de (2,6-diméthyl-3-chlorosulfonyl)phényle. 21. Analysis by specific binding according to claim 18, characterized in that the chemiluminescent group is the N-methyl-acridane-9-methoxy-9carboxylate of (2,6-dimethyl-3-chlorosulfonyl) phenyl.

22. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 7, caractérisée en ce que le noyau ou système cyclique hétérocyclique porte au moins un substituant péri, en position péri par rapport a l'atome de carbone auquel est fixée la liaison. 22. Analysis by specific bond according to claim 7, characterized in that the heterocyclic ring or ring system carries at least one peri substituent, in the peri position relative to the carbon atom to which the bond is attached.

23. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 22, caractérisée en ce qu'au moins un substituant péri est un groupe alkyle ou aryle. 23. Analysis by specific binding according to claim 22, characterized in that at least one peri substituent is an alkyl or aryl group.

24. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 23, caractérisée en ce qu'au moins un groupe substituant péri est un groupe -CH3. 24. Analysis by specific binding according to claim 23, characterized in that at least one substituent group peri is a group -CH3.

25. Composition, caractérisée en ce qu'elle comprend le groupement chimioluminescent suivant les revendications 1 à 24. 25. Composition, characterized in that it comprises the chemiluminescent group according to claims 1 to 24.

26. Composition suivant la revendication 25, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre un partenaire de liaison spécifique. 26. Composition according to claim 25, characterized in that it further comprises a specific binding partner.

27. Article manufacturé sous forme d'un kit d'analyse par liaison spécifique, caractérisé en ce qu'il comprend un flacon contenant au moins la composition suivant la revendication 25 ou 26. 27. Article manufactured in the form of a specific binding analysis kit, characterized in that it comprises a bottle containing at least the composition according to claim 25 or 26.

28. Analyse par liaison spécifique destinée à déterminer la présence d'un analyte dans un échantillon, (i) ladite analyse utilisant un conjugué chimioluminescent comprenant un groupement chimioluminescent fixé à une matière à liaison spécifique et (ii) la présence de l'analyte dans ledit échantillon étant proportionnelle à la formation d'un ou plusieurs produits de réaction de liaison spécifique contenant ledit conjugué chimioluminescent, ladite analyse consistant 28. Specific binding analysis for determining the presence of an analyte in a sample, (i) said analysis using a chemiluminescent conjugate comprising a chemiluminescent group attached to a specific binding material and (ii) the presence of the analyte in said sample being proportional to the formation of one or more specific binding reaction products containing said chemiluminescent conjugate, said analysis consisting

à permettre dans des conditions convenables une formation notable du ou des produits de réaction de liaison spécifique contenant ledit conjugué chimioluminescent, et to allow, under suitable conditions, a significant formation of the specific binding reaction product (s) containing said chemiluminescent conjugate, and

à mesurer la chimioluminescence (i) du ou des produits de réaction de liaison spécifique contenant ledit conjugué chimioluminescent ou (ii) du conjugué chimioluminescent non présent dans le ou les produits de réaction de liaison spécifique measuring the chemiluminescence (i) of the specific binding reaction product (s) containing said chemiluminescent conjugate or (ii) of the chemiluminescent conjugate not present in the specific binding reaction product (s)

un noyau ou système cyclique hétérocyclique contenant un atome de carbone auquel est fixée ladite liaison, l'hétéro-atome présent dans ledit noyau ou système cyclique hétérocyclique étant à un état d'oxydation qui rend ledit atome de carbone sensible à une attaque par un peroxyde ou de l'oxygène moléculaire pour former un intermédiaire qui se dégrade pour engendrer une chimioluminescence ; et a heterocyclic ring or ring system containing a carbon atom to which said bond is attached, the hetero atom present in said heterocyclic ring or ring system being in an oxidation state which makes said carbon atom susceptible to attack by a peroxide or molecular oxygen to form an intermediate which degrades to generate chemiluminescence; and

un groupe partant a leaving group

l'atome de carbone auquel est fixée ladite liaison portant un substituant secondaire de formule RnX, dans laquelle X est choisi dans le groupe comprenant O, N, the carbon atom to which said bond carrying a secondary substituent of formula RnX is attached, in which X is chosen from the group comprising O, N,

S- et C, R représente n'importe quel groupe et n est un nombre choisi de manière que X possède une valence convenable.S- and C, R represents any group and n is a number chosen so that X has a suitable valence.

29. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 28, caractérisée en ce que la matière à liaison spécifique peut se lier spécifiquement å l'analyte et le ou les produits de réaction de liaison spécifique sont constitués d'un complexe analyte-conjugué chimioluminescent, ladite analyse consistant en outre 29. Specific binding analysis according to claim 28, characterized in that the specific binding material can specifically bind to the analyte and the specific binding reaction product (s) consist of an analyte-chemiluminescent conjugate complex, said further analysis

à permettre dans des conditions convenables une formation notable dudit complexe analyte-conjugué chimio luminescent ; et to allow, under suitable conditions, a significant formation of said analyte-conjugate chemiluminescent complex; and

& mesurer la chimioluminescence (i) dudit complexe analyte-conjugué chimioluminescent ou (ii) du conjugué chimioluminescent non présent dans ledit complexe analyte-conjugué chimioluminescent. & measuring the chemiluminescence (i) of said chemiluminescent conjugate complex or (ii) of the chemiluminescent conjugate not present in said analyte-chemiluminescent conjugate complex.

30. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 28, caractérisée en ce qu'elle utilise en outre un corps réactionnel qui peut se lier spécifiquement (i) à l'analyte pour former un complexe analyte-corps réactionnel et (ii) à la matiere à liaison spécifique pour former un complexe conjugué chimioluminescent-corps réactionnel, le ou les produits de réaction de liaison spécifique étant constitués dudit complexe conjugué chimioluminescent-corps réactionnel, ladite analyse consistant en outre 30. Analysis by specific binding according to claim 28, characterized in that it also uses a reaction substance which can specifically bind (i) to the analyte to form an analyte-reaction body complex and (ii) to the material specific binding to form a conjugated chemiluminescent-reaction complex, the specific binding reaction product (s) consisting of said conjugated chemiluminescent-reacting complex, said analysis further comprising

à mesurer la chimioluminescence (i) dudit complexe conjugué chimioluminescent-corps réactionnel ou (ii) du conjugué chimioluminescent non présent dans ledit complexe conjugué chimioluminescent-corps réactionnel. measuring the chemiluminescence (i) of said chemiluminescent conjugate-reaction body complex or (ii) of the chemiluminescent conjugate not present in said chemiluminescent conjugate-reaction body complex.

31. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 28, caractérisée en ce que la matière à liaison spécifique peut se lier spécifiquement à l'analyte, ladite analyse utilisant en outre un corps réactionnel pouvant se lier spécifiquement audit analyte pour former un complexe corps réactionnel-analyte-conjugué chimioluminescent, le ou les produits de réaction de liaison spécifique étant constitués dudit complexe corps réactionnel-analyte-conjugué chimioluminescent, ladite analyse consistant en outre 31. Specific binding analysis according to claim 28, characterized in that the specific binding material can bind specifically to the analyte, said analysis further using a reactant capable of specifically binding to said analyte to form a reactant complex- chemiluminescent analyte-conjugate, the specific binding reaction product (s) being made up of said reaction body-chemiluminescent conjugate-analyte complex, said analysis further comprising

à permettre dans des conditions convenables une formation notable dudit complexe corps réactionnel-analyte conjugué chimioluminescent t et to allow, under suitable conditions, a significant formation of said chemiluminescent conjugate reactant-analyte complex t and

& mesurer la chimioluminescence (i) dudit complexe corps réactionnel-analyte-conjugué chimioluminescent ou (ii) du conjugué chimioluminescent non présent dans ledit complexe corps réactionnel-analyteconjugué chimioluminescent. & measure the chemiluminescence (i) of said chemiluminescent conjugate-analyte-conjugate complex or (ii) of the chemiluminescent conjugate not present in said chemiluminescent conjugate-analytic complex.

32. Analyse par liaison spécifique destinée à déterminer la présence d'un analyte dans un échantillon, (i) ladite analyse utilisant un groupement chimioluminescent et (ii) la présence de 1'analyte dans ledit échantillon étant proportionnelle & la formation d'un ou plusieurs produits de réaction de liaison spécifique ne contenant pas ledit groupement chimioluminescent, ledit groupement chimioluminescent entrant en chimioluminescence proportionnellement à la formation du ou des produits de réaction de liaison spécifique, ladite analyse consistant 32. Specific binding analysis intended to determine the presence of an analyte in a sample, (i) said analysis using a chemiluminescent group and (ii) the presence of the analyte in said sample being proportional to the formation of one or more several specific binding reaction products not containing said chemiluminescent group, said chemiluminescent group entering into chemiluminescence in proportion to the formation of the specific binding reaction product (s), said analysis consisting

à permettre dans des conditions convenables une formation notable du ou des produits de liaison spécifique ; et to allow, under suitable conditions, significant formation of the specific binding product (s); and

à mesurer la chiminoluminescence dudit groupement chimioluminescent provoquée par la formation du ou des produits de réaction de liaison spécifique measuring the chiminoluminescence of said chemiluminescent group caused by the formation of the specific binding reaction product (s)

un noyau ou système cyclique hétérocyclique contenant un atome de carbone auquel est fixée ladite liaison, l'hétéro-atome présent dans ledit noyau ou système cyclique hétérocyclique étant à un état d'oxydation qui rend ledit atome de carbone sensible & une attaque par un peroxyde ou de l'oxygène moléculaire pour former un intermédiaire qui se dégrade pour engendrer une chimioluminescence ; et a heterocyclic ring or ring system containing a carbon atom to which said bond is attached, the hetero atom present in said heterocyclic ring or ring system being in an oxidation state which makes said carbon atom sensitive to attack by a peroxide or molecular oxygen to form an intermediate which degrades to generate chemiluminescence; and

un groupe partant a leaving group

33. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 32, caractérisée en ce qu'elle utilise en outre un corps réactionnel pouvant se lier à l'analyte pour former un complexe analyte-corps réactionnel, le groupement chimioluminescent entrant en chimioluminescence proportionnellement å la formation dudit complexe analyte-corps réactionnel. 33. Analysis by specific binding according to claim 32, characterized in that it also uses a reaction body capable of binding to the analyte to form an analyte-reaction body complex, the chemiluminescent group entering into chemiluminescence proportional to the formation of said analyte-reaction body complex.

34. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 28 ou 32, caractérisée en ce que le substituant secondaire est choisi entre les groupes -CN, -OR, 'NR2 , -NR3+, -SR, -SR2+, -S2R, -NRC02 R, -NHNR2, -NRNR2 -NHOR, -ONR2, -CR(CN)2, -CR(COR)2, -CR2N02, -C-COR, 34. Analysis by specific binding according to claim 28 or 32, characterized in that the secondary substituent is chosen from the groups -CN, -OR, 'NR2, -NR3 +, -SR, -SR2 +, -S2R, -NRC02 R, -NHNR2, -NRNR2 -NHOR, -ONR2, -CR (CN) 2, -CR (COR) 2, -CR2N02, -C-COR,

35. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 34, caractérisée en ce que le groupe partant est un noyau ou système cyclique aryle. 35. Analysis by specific binding according to claim 34, characterized in that the leaving group is an aryl ring or ring system.

36. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 35, caractérisée en ce que le noyau ou système cyclique aryle est choisi entre les groupes phényle, naphtalène et anthracène. 36. Analysis by specific binding according to claim 35, characterized in that the aryl ring or ring system is chosen from the phenyl, naphthalene and anthracene groups.

37. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 36, caractérisée en ce que le noyau ou système cyclique aryle est un groupe phényle. 37. Analysis by specific binding according to claim 36, characterized in that the aryl ring or ring system is a phenyl group.

38. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 37, caractérisée en ce que le noyau phényle est non substitué. 38. Analysis by specific binding according to claim 37, characterized in that the phenyl ring is unsubstituted.

39. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 34, caractérisée en ce que le groupement chimioluminescent est un amide et le groupe partant est un groupe de formule NR'(S02-R"-Y), dans laquelle R' et R" sont choisis entre des groupes alkyle, alkylène, aryle, alkyle facultativement substitué, alkyléne facultativement substitué, aryle facultativement substitué, alkyloxy, aryloxy, halogéno, amino facultativement protégé, aminohydroxy substitué, hydroxy protégé, oxo, thio, imino, mercapto facultativement substitué, un noyau hétérocyclique et un groupe hétéro-alkyle, et Y est choisi dans le groupe comprenant l'hydrogène, et des groupes carboxy, halogénure de c onyle, halogénure de sulfonyle, carbo-alkoxy, carboxamido, carbo-aryloxy, cyano, carboximido, isocyanato, isothiocyanato, sulfo, N-succinimidylcarboxy et Nmaléimido. 39. Analysis by specific binding according to claim 34, characterized in that the chemiluminescent group is an amide and the leaving group is a group of formula NR '(SO2-R "-Y), in which R' and R" are chosen between alkyl, alkylene, aryl, optionally substituted alkyl, optionally substituted alkylene, optionally substituted aryl, alkyloxy, aryloxy, halogen, optionally protected amino, substituted aminohydroxy, protected hydroxy, oxo, thio, imino, optionally substituted mercapto, heterocyclic ring and a heteroalkyl group, and Y is selected from the group comprising hydrogen, and carboxy, c onyl halide, sulfonyl halide, carbo-alkoxy, carboxamido, carbo-aryloxy, cyano, carboximido, isocyanato, isothiocyanato groups , sulfo, N-succinimidylcarboxy and Nmaleimido.

40. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 34, caractérisée en ce que le groupement chimioluminescent est un thioester et le groupe partant est un gl de formule V-R"', dans laquelle V représente un groupe aliphatique ou aromatique et R"' représente un groupe qui est utile pour la fixation dudit groupement à un partenaire de liaison spécifique. 40. Analysis by specific binding according to claim 34, characterized in that the chemiluminescent group is a thioester and the leaving group is a gl of formula VR "', in which V represents an aliphatic or aromatic group and R"' represents a group which is useful for attaching said group to a specific binding partner.

41. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 40, caractérisée en ce que le groupe partant est un groupe sulfonamido ou sulfocarbonyle. 41. Analysis by specific binding according to claim 40, characterized in that the leaving group is a sulfonamido or sulfocarbonyl group.

42. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 34, caractérisée en ce que le noyau ou système cyclique hétérocyclique est une forme réduite d'un membre choisi dans le groupe comprenant l'acridinium, le benz[a]acridinium, le benz[b]acridinium, le benz[c]acridinium, un cation 1,2,4-triazole, un cation isoxazole, un cation isothiazole, un cation 1,2-azole, un cation imidazole, un cation benzimidazole, le quinolinium, l'isoquinolinium, le quinolizinium, un quinolinium à substitution cyclique, le pyridinium, le pyrimidinium, le pyridazinium, le pyrazinium, le phénanthridinium et le quinoxalinium. 42. Analysis by specific binding according to claim 34, characterized in that the heterocyclic ring or ring system is a reduced form of a member chosen from the group comprising acridinium, benz [a] acridinium, benz [b] acridinium, benz [c] acridinium, a 1,2,4-triazole cation, an isoxazole cation, an isothiazole cation, a 1,2-azole cation, an imidazole cation, a benzimidazole cation, quinolinium, isoquinolinium, quinolizinium, a cyclically substituted quinolinium, pyridinium, pyrimidinium, pyridazinium, pyrazinium, phenanthridinium and quinoxalinium.

43. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 42, caractérisée en ce que le noyau ou système cyclique hétérocyclique est une forme réduite de l'acridinium, du quinolinium ou du phénanthridinium. 43. Analysis by specific binding according to claim 42, characterized in that the heterocyclic ring or ring system is a reduced form of acridinium, quinolinium or phenanthridinium.

44. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 43, caractérisée en ce que le substituant secondaire est choisi entre les groupes -OCH3 et -OCH2CH3. 44. Analysis by specific binding according to claim 43, characterized in that the secondary substituent is chosen from the groups -OCH3 and -OCH2CH3.

45. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 42, caractérisée en ce que le noyau ou système cyclique hétérocyclique porte au moins un substituant péri, en position péri par rapport à l'atome de carbone auquel est fixée la liaison. 45. Analysis by specific bond according to claim 42, characterized in that the heterocyclic ring or ring system carries at least one peri substituent, in the peri position relative to the carbon atom to which the bond is attached.

46. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 45, caractérisée en ce qu'au moins un substituant péri est un groupe alkyle ou aryle. 46. Analysis by specific binding according to claim 45, characterized in that at least one peri substituent is an alkyl or aryl group.

47. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 46, caractérisée en ce qu'au moins un substituant péri est un groupe -CH3. 47. Analysis by specific binding according to claim 46, characterized in that at least one peri substituent is a group -CH3.

48. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 47, caractérisée en ce que le groupe chimioluminescent est le N-méthyl-1,3-diméthyl-acridinium9-méthoxy-9-carboxylate de phényle. 48. Analysis by specific binding according to claim 47, characterized in that the chemiluminescent group is phenyl N-methyl-1,3-dimethyl-acridinium9-methoxy-9-carboxylate.

49. Composition, caractérisée en ce qu'elle comprend le groupement chimioluminescent suivant l'une quelconque des revendications 28 à 48 et un partenaire de liaison spécifique. 49. Composition, characterized in that it comprises the chemiluminescent group according to any one of claims 28 to 48 and a specific binding partner.

50. Article manufacturé sous forme d'un kit d'analyse par liaison spécifique, caractérisé en ce qu'il comprend la composition suivant la revendication 49. 50. Article manufactured in the form of a specific binding analysis kit, characterized in that it comprises the composition according to claim 49.

51. Analyse par liaison spécifique destinée & déterminer la présence d'un analyte dans un échantillon, (i) ladite analyse utilisant un conjugué chimioluminescent comprenant un groupement chimioluminescent fixé å une matière à liaison spécifique et (il) la présence de l'analyte dans ledit échantillon étant proportionnelle & la formation d'un ou plusieurs produits de réaction de liaison spécifique contenant ledit conjugué chimioluminescent, ladite analyse consistant 51. Specific binding analysis for determining the presence of an analyte in a sample, (i) said analysis using a chemiluminescent conjugate comprising a chemiluminescent group attached to a specific binding material and (ii) the presence of the analyte in said sample being proportional to the formation of one or more specific binding reaction products containing said chemiluminescent conjugate, said analysis consisting

à permettre dans des conditions convenables une format ion notable du ou des produits de réaction de liaison spécifique contenant ledit conjugué chimioluminescent ; et allowing, under suitable conditions, a significant ion format for the specific binding reaction product (s) containing said chemiluminescent conjugate; and

un noyau ou système cyclique aryle, ledit noyau ou système cyclique aryle contenant au moins un noyau hexagonal substitué, ledit noyau hexagonal substitué portant deux ou plus de deux substituants, au moins deux de ces substituants bloquant par encombrement stérique l'hydrolyse de ladite liaison. an aryl ring or ring system, said aryl ring or ring system containing at least one substituted hexagonal ring, said substituted hexagonal ring carrying two or more than two substituents, at least two of these substituents blocking the hydrolysis of said bond by steric hindrance.

52. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 51, caractérisée en ce que la matière à liaison spécifique peut se lier spécifiquement à l'analyte, le ou les produits de réaction de liaison spécifique étant constitués d'un complexe analyte-conjugué chimioluminescent, ladite analyse consistant en outre 52. Specific binding analysis according to claim 51, characterized in that the specific binding material can bind specifically to the analyte, the specific binding reaction product or products consisting of an analyte-chemiluminescent conjugate complex, said further analysis

53. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 51, caractérisée en ce qu'elle utilise en outre un corps réactionnel qui peut se lier spécifiquement (i) à l'analyste pour former un complexe analyte-corps réactionnel et (ii) à la matière à liaison spécifique pour former un complexe conjugué chimioluminescent-corps réactionnel, le ou les produits de réaction de liaison spécifique étant constitués dudit complexe conjugué chimioluminescent-corps réactionnel, ladite analyse consistant en outre 53. Analysis by specific binding according to claim 51, characterized in that it also uses a reaction body which can bind specifically (i) to the analyst to form an analyte-reaction body complex and (ii) to the material specific binding to form a conjugated chemiluminescent-reactive complex, the specific binding reaction product (s) being made up of said conjugated chemiluminescent-reactive complex, said analysis further comprising

à permettre dans des conditions convenables une formation notable dudit complexe analyte-corps réactionnel et dudit complexe conjugué chimioluminescent-corps réactionnel ;; et to allow, under suitable conditions, a significant formation of said analyte-reaction body complex and of said chemiluminescent-reaction body complex; and

54. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 51, caractérisée en ce que la matière à liaison spécifique peut se lier spécifiquement & l'analyte, ladite analyse utilisant en outre un corps réactionnel pouvant se lier spécifiquement audit analyte pour former un complexe corps réactionnel-analyte-conjugué chimioluminescent, le ou les produits de réaction de liaison spécifique étant constitués dudit complexe corps réactionnel-analyte-conjugué chimioluminescent, ladite analyse consistant en outre 54. Analysis by specific binding according to claim 51, characterized in that the specific binding material can bind specifically to the analyte, said analysis further using a reactant capable of specifically binding to said analyte to form a complex reactant- chemiluminescent analyte-conjugate, the specific binding reaction product (s) being made up of said reaction body-chemiluminescent conjugate-analyte complex, said analysis further comprising

à mesurer la chimioluminescence (i) dudit complexe corps réactionnel-analyte-conjugué chimioluminescent ou (ii) du conjugué chimioluminescent non prés > ns ledit complexe corps réactionnel-analyte- conj. - mioluminescent. measuring the chemiluminescence (i) of said chemiluminescent conjugate-analyte-conjugate complex or (ii) of the chemiluminescent conjugate not present> ns said reactant-analyte-conjugate complex. - mioluminescent.

55. Analyse par liaison spécifique destinée & déterminer la présence d'un analyte dans un échantillon, (i) ladite analyse utilisant un groupement chimioluminescent et (ii) la présence de l'analyte dans ledit échantillon étant proportionnelle à la formation d'un ou plusieurs produits de réaction de liaison spécifique ne conte pas ledit groupement chimioluminescent, ledit groupement chimioluminescent entrant en chimioluminescence proportionnellement à la formation du ou des produits de réaction de liaison spécifique, ladite analyse consistant 55. Analysis by specific binding intended to determine the presence of an analyte in a sample, (i) said analysis using a chemiluminescent group and (ii) the presence of the analyte in said sample being proportional to the formation of one or more several specific binding reaction products do not contain said chemiluminescent group, said chemiluminescent group entering into chemiluminescence in proportion to the formation of the specific binding reaction product (s), said analysis consisting

& mesurer la chimioluminescence dudit groupement ch ~luminescent provoquée par la formation du ou des produits de réaction de liaison spécifique & measure the chemiluminescence of said ch ~ luminescent group caused by the formation of the specific binding reaction product (s)

caractérisée en ce que le perfectionnement consiste à choisir comme groupement chimioluminescent un ester, thioester ou amide dans lequel la liaison ester, thioester ou amide est situee entre characterized in that the improvement consists in choosing as chemiluminescent group an ester, thioester or amide in which the ester, thioester or amide bond is located between

un noyau ou système cyclique aryle, ledit noyau ou système cyclique aryle contenant au mc?s un noyau hexagonal substitué, ledit noyau hexagc ubstitué portant deux ou plus de deux substituants, au moins deux de ces substituants bloquant par encombrement stérique l'hydrolyse de ladite liaison. an aryl ring or ring system, said aryl ring or ring system containing at least one substituted hexagonal ring, said substituted hexagc ring carrying two or more than two substituents, at least two of these substituents blocking by hydric hindrance the hydrolysis of said liaison.

56. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 55, caractérisée en ce qu'elle utilise en outre un corps reactionnel pouvant se lier à l'analyte pour former un complexe analyte-corps réactionnel, le groupement chimioluminescent entrant en chimioluminescence proportionnellement à la formation dudit complexe analyte-corps réactionnel. 56. Analysis by specific binding according to claim 55, characterized in that it also uses a reaction substance capable of binding to the analyte to form an analyte-reaction body complex, the chemiluminescent group entering into chemiluminescence proportional to the formation of said analyte-reaction body complex.

57. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 51 ou 55, caractérisée en ce que chacun des substituants qui bloquent par encombrement stérique l'hydrolyse de la liaison est choisi entre les groupes -CH3, -OCH3 et isopropyle. 57. Analysis by specific binding according to claim 51 or 55, characterized in that each of the substituents which block by steric hindrance the hydrolysis of the bond is chosen from the groups -CH3, -OCH3 and isopropyl.

58. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 51 ou 55, caractérisée en ce qu'au moins l'un des substituants qui bloquent par encombrement stérique l'hydrolyse de la liaison est un groupe électrophile. 58. Analysis by specific binding according to claim 51 or 55, characterized in that at least one of the substituents which block by steric hindrance the hydrolysis of the bond is an electrophilic group.

59. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 51 ou 55, carractérisée en ce que le noyau hexagonal substitué porte au moins un substituant supplémentaire, en plus des substituants qui bloquent par encombrement stérique l'hydrolyse de la liaison, au moins un substituant supplémentaire étant un groupe électrophile. 59. Analysis by specific binding according to claim 51 or 55, characterized in that the substituted hexagonal nucleus carries at least one additional substituent, in addition to the substituents which block by sterically hindering the hydrolysis of the bond, at least one additional substituent being an electrophilic group.

60. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 59, caractérisée en ce qu'au moins un substituant supplémentaire est choisi entre les groupes -NO2, -SO2C1, -Br, -N(CH3)3+ et -H. 60. Analysis by specific binding according to claim 59, characterized in that at least one additional substituent is chosen from the groups -NO2, -SO2C1, -Br, -N (CH3) 3+ and -H.

61. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 60, caractérisée en ce que le groupe électrophile est un groupe -H. 61. Analysis by specific binding according to claim 60, characterized in that the electrophilic group is a group -H.

62. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 51 ou 55, caractérisée en ce que le noyau ou système cyclique aryle est choisi entre les groupes phényle, naphtalène et anthracène. 62. Analysis by specific binding according to claim 51 or 55, characterized in that the aryl ring or ring system is chosen from the phenyl, naphthalene and anthracene groups.

63. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 62, caractérisée en ce que le noyau ou système cyclique aryle est un groupe phényle. 63. Analysis by specific binding according to claim 62, characterized in that the aryl ring or ring system is a phenyl group.

64. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 63, caractérisée en ce que la somme des valeurs sigmap pour tous les substituants présents sur le groupe phényle, qui sont des groupes électrophiles, est inférieure ou égale à environ 1,0. 64. Specific binding analysis according to claim 63, characterized in that the sum of the sigmap values for all the substituents present on the phenyl group, which are electrophilic groups, is less than or equal to about 1.0.

65. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 63, caractérisée en ce que le groupement chimioluminescent répond à la formule 65. Analysis by specific binding according to claim 63, characterized in that the chemiluminescent group corresponds to the formula

66. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 63, caractérisée en ce que le groupement chimioluminescent répond à la formule 66. Analysis by specific binding according to claim 63, characterized in that the chemiluminescent group corresponds to the formula

67. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 63, caractérisée en ce que le groupe chimioluminescent répond à la formule 67. Analysis by specific binding according to claim 63, characterized in that the chemiluminescent group corresponds to the formula

68. Analyse. par liaison spécifique suivant la revendication 63, caractérisée en ce que le groupement chimioluminescent répond i la formule 68. Analysis. by specific bond according to claim 63, characterized in that the chemiluminescent group corresponds to the formula

69. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 63, caractérisée en ce que le groupement chimioluminescent répond à la formule 69. Analysis by specific binding according to claim 63, characterized in that the chemiluminescent group corresponds to the formula

70.Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 63, caractérisée en ce que le groupement chimioluminescent répond à la formule 70. Analysis by specific binding according to claim 63, characterized in that the chemiluminescent group corresponds to the formula

71. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 63, caractérisée en ce que le groupement chimioluminescent répond à la formule 71. Analysis by specific binding according to claim 63, characterized in that the chemiluminescent group corresponds to the formula

72. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 63, caractérisée en ce que le groupement chimioluminescent répond å la formule 72. Analysis by specific binding according to claim 63, characterized in that the chemiluminescent group corresponds to the formula

73. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 63, caractérisée en ce que le groupement chimioluminescent répond à la formule : 73. Analysis by specific binding according to claim 63, characterized in that the chemiluminescent group corresponds to the formula:

74. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 63, caractérisée en ce que le groupement chimioluminescent répond à la formule 74. Analysis by specific binding according to claim 63, characterized in that the chemiluminescent group corresponds to the formula

75.Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 63, caractérisée en ce que le groupement chimioluminescent répond à la formule 75. Analysis by specific binding according to claim 63, characterized in that the chemiluminescent group corresponds to the formula

76. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 63, caractérisée en ce que le groupement chimioluminescent répond à la formule 76. Analysis by specific binding according to claim 63, characterized in that the chemiluminescent group corresponds to the formula

77.Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 51 ou 55, caractérisée en ce que le noyau ou système cyclique hétérocyclique est choisi dans le groupe comprenant l'acridinium, le benzEa]acridinium, le benztb]- acridinium, le benz[c]acridinium, un cation 1,2,4-triazole, un cation isoxazole, un cation isothiazole, un cation 1,2azole, un cation imidazole, un cation benzimidazole, le quinolinium, l'isoquinolinium, le quinolizinium, un quinolinium à substitution cyclique, le pyridinium, le pyri-: um, le pyridazinium, le pyrazinium, le phénanthriainium et le quinoxalinium. 77. Analysis by specific binding according to claim 51 or 55, characterized in that the heterocyclic ring or ring system is chosen from the group comprising acridinium, benzEa] acridinium, benztb] - acridinium, benz [c] acridinium , a 1,2,4-triazole cation, an isoxazole cation, an isothiazole cation, a 1,2azole cation, an imidazole cation, a benzimidazole cation, quinolinium, isoquinolinium, quinolizinium, a cyclically substituted quinolinium, the pyridinium, pyri-: um, pyridazinium, pyrazinium, phenanthriainium and quinoxalinium.

78. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 77, caractérisée en ce que le noyau ou système cyclique hétérocyclique est choisi dans le groupe comprenant l'acridinium, le quinolinium et le .phénanthridinium. 78. Analysis by specific binding according to claim 77, characterized in that the heterocyclic ring or ring system is chosen from the group comprising acridinium, quinolinium and .phenanthridinium.

79. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 78, caractérisée en ce que le noyau ou système cyclique hétérocyclique est 1 lacridinium. 79. Analysis by specific binding according to claim 78, characterized in that the heterocyclic ring or ring system is 1 lacridinium.

80. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 51 ou 55, caractérisée en ce que le noyau ou système cyclique hétérocyclique est une forme réduite d'un membre choisi dans le groupe comprenant l'acridinium, le benz[a]acridinium, le benz[b)acridinium, le benz[c]acridinium, un cation 1,2,4-triazole, un cation isoxazole, un cation isothiazole, un cation 1,2-azole, un cation imidazole, .un cation benzimidazole, le quinolinium, l'isoquinolinium, le quinolizinium, un quinolinium à substitution cyclique, le pyridinium, le pyrimidinium, le pyridazinium, le pyrazinium, le phénanthridinium et le quinoxalinium. 80. Analysis by specific binding according to claim 51 or 55, characterized in that the heterocyclic ring or ring system is a reduced form of a member chosen from the group comprising acridinium, benz [a] acridinium, benz [ b) acridinium, benz [c] acridinium, a 1,2,4-triazole cation, an isoxazole cation, an isothiazole cation, a 1,2-azole cation, an imidazole cation, .a benzimidazole cation, quinolinium, l isoquinolinium, quinolizinium, a cyclically substituted quinolinium, pyridinium, pyrimidinium, pyridazinium, pyrazinium, phenanthridinium and quinoxalinium.

81. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 80, caractérisée en ce que le noyau ou système cyclique hétérocyclique est une forme réduite de l'acridinium, du quinolinium ou dru phénanthridinium. 81. Analysis by specific binding according to claim 80, characterized in that the heterocyclic ring or ring system is a reduced form of acridinium, quinolinium or dru phenanthridinium.

82. Analyse par liaison spécifique suivant Ia revendication 80, caractérisée en ce que l'atome de carbone porte un substituant choisi dans le groupe comprenant -H, un groupe -CN, un halogène, les groupes -OR, -NR2, -NR3+, -SR, -SR2+ et -S2R, R représentant un groupe alkyle, un groupe aryle, un amino-acide ou un sucre. 82. Analysis by specific binding according to claim 80, characterized in that the carbon atom carries a substituent chosen from the group comprising -H, a group -CN, a halogen, the groups -OR, -NR2, -NR3 +, -SR, -SR2 + and -S2R, R representing an alkyl group, an aryl group, an amino acid or a sugar.

83. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 81, caractérisée en ce que le conjugué répond à la formule 83. Analysis by specific binding according to claim 81, characterized in that the conjugate corresponds to the formula

84. Composition, caractérisée en ce qu'elle comprend le groupement chimioluminescent suivant l'une quelconque des revendications 51 à 83. 84. Composition, characterized in that it comprises the chemiluminescent group according to any one of claims 51 to 83.

85. Composition suivant la revendication 84, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre un partenaire de liaison spécifique lié au groupement. 85. Composition according to claim 84, characterized in that it further comprises a specific binding partner linked to the group.

86. Article manufacturé sous forme d'un kit d'analyse par liaison spécifique, caractérisé en ce qu'il comprend un flacon contenant au moins la composition suivant la revendication 84 ou 85. 86. Article manufactured in the form of a specific binding analysis kit, characterized in that it comprises a bottle containing at least the composition according to claim 84 or 85.