FR2623520A1 - Continuous enzymatic process for the preparation of L-carnitine - Google Patents

Abstract

Enzymatic process for the preparation of L-carnitine by reducing 3-dehydrocarnitine with NADH in the presence of carnitine dehydrogenase, and a NAD<+>-reducing system, characterised in that the reactor containing the enzymes is continuously supplied with 3-dehydrocarnitine and a NAD<+>-reducing agent, the NAD<+> being either also continuously introduced into the reactor or present in the reactor in a form grafted onto a water-soluble polymer, the reaction medium is subjected to an ultrafiltration in a circuit shunt connected to the reactor and the L-carnitine is recovered in the separated ultrafiltrate.

Description

La présente invention concerne un procédé continu de préparation de la L-carnitine par voie enzymatique. Ce composé et certains. de ses esters sont utilisés en thérapeutique humaine. De nombreux procédés de préparation de la L-carnitine, ou acide L-triméthylamino-4 hydroxy-3 butyrique, ont été décrits. The present invention relates to a continuous process for preparing L-carnitine enzymatically. This compound and some. of its esters are used in human therapy. Numerous processes for the preparation of L-carnitine, or L-trimethylamino-4 hydroxy-3 butyric acid, have been described.

dont certains mettent en oeuvre des réactions catalysées par des enzymes.some of which implement reactions catalyzed by enzymes.

Un procédé. particulièrement intéressant est celui ,décrit dans le brevet français FR-A-2 398 046 qui consiste en une réduction enzymatique asymétrique de la 3-déhydrocarnitine. ou acide triméthylamino-4 oxo-3 butyrique, selon le schéma réactionnel

A method. particularly interesting is that, described in French patent FR-A-2 398 046, which consists of an asymmetric enzymatic reduction of 3-dehydrocarnitine. or trimethylamino-3-oxo-butyric acid, depending on the reaction scheme

3-déhydrocarnitine L-carnitine
La réaction est catalysée par la carnitine déshydrogénase (CDH) et le cofacteur que constitue le nicotinamide adénine dinucléotide (NADH) est régénéré.3-dehydrocarnitine L-carnitine
The reaction is catalyzed by carnitine dehydrogenase (CDH) and the cofactor nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) is regenerated.

in situ, soit par une réaction enzamatique, par exemple, par oxydation du glucose en présence de glucose déshydrogénase (GDHZ, d'un formiate en présence de formiate déshydrogénase (FDH) ou de l'éthanol en présence d'alcool déshydrogénase (ADH), soit par réduction chimique, par exemple. par l'action d'un dithionite alcalin.in situ, either by an enzamatic reaction, for example, by oxidation of glucose in the presence of glucose dehydrogenase (GDHZ, of a formate in the presence of formate dehydrogenase (FDH) or of ethanol in the presence of alcohol dehydrogenase (ADH) or by chemical reduction, for example by the action of an alkaline dithionite.

Différents perfectionnements' à ce procédé ont été décrits et notamment, dans les demandes de brevet EP-A-2s0 422 et -EP-A-240 423 l'utilisation d un milieu réactionnel de force ionique d'au-moins 0,5 M dans le cas de l'utilisation du système formiate/FDH pour régénérer le cofacteur. Various improvements' to this process have been described and in particular, in patent applications EP-A-2s0 422 and -EP-A-240 423, the use of a reaction medium with an ionic strength of at least 0.5 M. in the case of using the formate / FDH system to regenerate the cofactor.

Lorsque ces procédés sont mis en oeuvre dans des réacteurs classiques, la bioconversion s'arrête environ 48 heures après la charge des réactifs dans l'appareil, quelles que soient les quantités de produits mises en jeu, ce qui entraîne, notamment, la consommation d'une quantité non négligeable d'enzymes et de cofacteur par kilo de L-carnitine produite. When these processes are implemented in conventional reactors, the bioconversion stops approximately 48 hours after loading the reagents into the device, regardless of the quantities of products involved, which leads, in particular, to the consumption of 'a significant amount of enzymes and cofactor per kilo of L-carnitine produced.

Le procédé de la présente invention supprime cet inconvient et diminue sensiblement le prix de revient de la fabrication de la L-carnitine, puisqu'il permet une production continue pendant plusieurs centaines d'heures avec un rendement de 90 à 100X. The process of the present invention eliminates this drawback and significantly reduces the cost of manufacturing L-carnitine, since it allows continuous production for several hundred hours with a yield of 90 to 100X.

En outre, la purification de la L-carnitine est simplifiée et se fait avec d'excellents rendements, ce qui est un autre avantage de 1 invention. Further, the purification of L-carnitine is simplified and takes place in excellent yields, which is another advantage of the invention.

Ce procédé. qui met en oeuvre la réduction de la 3-déhydrocarnitine par le NADH en présence de carnitine déshydrogénase avec régénération simultanée du NADH à partir du NAD formé, consiste à introduire en continu, dans un réacteur contenant les enzymes. la 3-déhydrocarnitine et l'agent réducteur du NAD+, le NAD+ étant soit également introduit en continu dans le réacteur soit présent dans le réacteur sous forme greffée à un polymère hydrosoluble, à soumettre le milieu réactionnel dans un circuit en dérivation sur le réacteur, à une ultrafiltration et à récupérer la
L-carnitine dans l'ultrafiltrat séparé.This process. which implements the reduction of 3-dehydrocarnitine by NADH in the presence of carnitine dehydrogenase with simultaneous regeneration of NADH from the NAD formed, consists in continuously introducing into a reactor containing the enzymes. 3-dehydrocarnitine and the reducing agent for NAD +, the NAD + being either also continuously introduced into the reactor or present in the reactor in the form grafted to a water-soluble polymer, to subject the reaction medium in a bypass circuit on the reactor, ultrafiltration and recover the
L-carnitine in the separated ultrafiltrate.

I1 est en général préférable d'introduire de temps en temps dans le milieu réactionnel, de petites quantités supplémentaires d'enzymes pour maintenir le rendement élevé de la bioconversion. It is generally preferable to introduce from time to time into the reaction medium, small additional amounts of enzymes to maintain the high yield of the bioconversion.

Suivant une caractéristique de l'invention, on opère dans un réacteur de bioconversion classique, qui est relié à une source d'alimentation en fluides et qui comporte, en dérivation, un circuit constitué d'une unité d'ultrafiltration et d'une pompe qui assure l'extraction du milieu réactionnel du réacteur, sa circulation dans l'unité d'ultrafiltration et le retour du retentat au réacteur. According to one characteristic of the invention, the operation is carried out in a conventional bioconversion reactor, which is connected to a fluid supply source and which comprises, in bypass, a circuit consisting of an ultrafiltration unit and a pump. which ensures the extraction of the reaction medium from the reactor, its circulation in the ultrafiltration unit and the return of the retentate to the reactor.

Le réacteur est de préférence thermostaté et muni d'un moyen d'agitation. Le conduit d'introduction de fluide dans le réacteur est reiié à un ou des ré servoirs contenant la déhydrocarnitine, l'agent réducteur du NAD et éventuellement le cofacteur sous la forme de NARD , plus stable. The reactor is preferably thermostatted and provided with stirring means. The conduit for introducing fluid into the reactor is linked to one or more reservoirs containing the dehydrocarnitine, the reducing agent for NAD and optionally the cofactor in the form of NARD, which is more stable.

La déhydrocarnitine n'étant stable qu'en milieu acide. et à basse température,elle est avantageusement stockée dans le réservoir à température inférieure à la température- ambiante, de préférence inférieure à 5-C, et sous forme d'un sel d'acide fort, tel que l'acide chlorihydrique, qui est neutralisé dans le réacteur. par exemple, par réaction avec NH4OH. Par ailleurs. lorsque l'agent réducteur est un formiate, celui-ci peut être introduit soit sous forme d'acide formique en même temps que la déhydrocarnitine soit sous forme d'un sel comme le formiate d'ammonium; dans ce cas il ne sera mélangé à la déhydrocarnitine que juste avant son arrivée dans le milieu réactionnel ou même dans ledit milieu. Dehydrocarnitine is only stable in an acidic environment. and at low temperature, it is advantageously stored in the tank at a temperature below room temperature, preferably below 5-C, and in the form of a strong acid salt, such as hydrochloric acid, which is neutralized in the reactor. for example, by reaction with NH4OH. Otherwise. when the reducing agent is a formate, the latter can be introduced either in the form of formic acid at the same time as the dehydrocarnitine or in the form of a salt such as ammonium formate; in this case, it will not be mixed with the dehydrocarnitine until just before its arrival in the reaction medium or even in said medium.

Le réacteur peut aussi être équipé d'une arrivée de fluide pour permettre d'introduire au cours de l'opération de bioconversion une solution d'acide ou de base, en fonction du système enzymatique utilisé, pour maintenir le milieu au pH optimum d'activité des enzymes; le réacteur est alors aussi équipé d'une sonde de mesure du pH qui plonge dans le milieu réactionnel. The reactor can also be equipped with a fluid inlet to allow the introduction during the bioconversion operation of an acid or base solution, depending on the enzymatic system used, to maintain the medium at the optimum pH of activity of enzymes; the reactor is then also equipped with a pH measurement probe which immerses in the reaction medium.

Enfin, comme on a constate que pour avoir un rendement optimum, sur une période supérieure à plusieurs jours, il était préférable d'ajouter de temps en temps des enzymes au milieu réactionnel, le réacteur peut aussi comporter un moyen d'introduction de ces enzymes. Finally, as it has been observed that in order to have an optimum yield, over a period of more than several days, it was preferable to add enzymes from time to time to the reaction medium, the reactor can also include a means for introducing these enzymes. .

Le circuit d'ultrafiltration comporte avantageusement avant l'unité d'ultrafiltration un filtre de microfiltration, ce qui permet d'éliminer les particules en suspension dans le milieu, qui proviennent essentiellement des extraits enzymatiques, et qui sin-on pourraient colmater la membrane d'ultra-filtration. Cette membrane est choisie de façon à retenir les molécules de masse moléculaire supérieure à 5000 et de préférence à 20000. The ultrafiltration circuit advantageously comprises before the ultrafiltration unit a microfiltration filter, which makes it possible to eliminate the particles in suspension in the medium, which essentially come from the enzymatic extracts, and which could potentially clog the membrane d 'ultrafiltration. This membrane is chosen so as to retain molecules with a molecular mass greater than 5,000 and preferably over 20,000.

L'unité de filtration comprend un moyen de soutirage de l'ultrafiltrat qui contient, notamment, la L-carnitine. The filtration unit comprises a means for withdrawing the ultrafiltrate which contains, in particular, L-carnitine.

La pompe du circuit d'ultrafiltration, placée en général avant le filtre, est choisie de telle sorte que le débit du liquide au niveau de la membrane soit suffisant pour ne pas entrainer son colmatage, tout en ne provoquant pas une dénaturation rapide des enzymes. phénomène qui augmente avec la vitesse de recirculation du milieu réactionnel. The pump of the ultrafiltration circuit, generally placed before the filter, is chosen so that the flow rate of the liquid at the level of the membrane is sufficient not to cause its clogging, while not causing rapid denaturation of the enzymes. phenomenon which increases with the rate of recirculation of the reaction medium.

Le réacteur peut être aussi muni d'un capteur de niveau du liquide, sur lequel est asservi la pompe du circuit d'introduction des réactifs qui permet de ne pas dépasser un volume donné de milieu de bioconversion dans le réacteur. The reactor can also be fitted with a liquid level sensor, on which the pump of the reagent introduction circuit is slaved, which makes it possible not to exceed a given volume of bioconversion medium in the reactor.

On préfère maintenir le volume sensiblement constant au cours de l'opération grace à un système de régularisation de niveau. It is preferred to keep the volume substantially constant during the operation thanks to a level regulation system.

Une installation pour la mise en oeuvre du procédé conforme à l'invention est représentée à titre d'exemple sur la figure unique qui représente schéma tiqùement l'installation utilisée dans le cas où le système réducteur du NAD + est composé de formiate déshydrogénase et de formiate. An installation for the implementation of the process according to the invention is shown by way of example in the single figure which shows the diagram tiqùement the installation used in the case where the reducing system of NAD + is composed of formate dehydrogenase and formate.

Cette installation est constituée d'un réacteur à double enveloppe 10 dans lequel arrive une tubulure d'introduction 110, alimentée par une pompe à deux voies 1t, chacune des voies étant reliées aux tubes 120 et 130 qui plongent respectivement dans les liquides des réservoirs 12 et 13; le réservoir 13 destiné à contenir la déhydrocarnitine est à double enveloppe. Les doubles enveloppes des réservoirs 10 et 13 sont reliées à des circuits- de fluides thermostatés. La pompe 11 est asservie à un capteur de niveau 14 qui plonge dans le réacteur 10. This installation consists of a jacketed reactor 10 in which arrives an introduction pipe 110, supplied by a two-way pump 1t, each of the channels being connected to the tubes 120 and 130 which respectively immerse in the liquids of the reservoirs 12. and 13; the reservoir 13 intended to contain the dehydrocarnitine has a double jacket. The double envelopes of the reservoirs 10 and 13 are connected to thermostatically controlled fluid circuits. The pump 11 is slaved to a level sensor 14 which immerses in the reactor 10.

Le circuit d'ultrafiltration qui est en dérivation au réacteur 10 comprend une tubulure d'entrée 210 plongeant dans le réacteur 10, une pompe 20 assurant la circulation du milieu réactionnel, un filtre 21, puis l'unité d'ultrafiltration 22 qui comporte une membrane 23 et est équipée d'un conduit de sortie de l'ultrafiltrat 220 qui débouche dans un moyen de récupération de l'ultrafiltrat 24, et d'une tubulure de sortie du liquide filtré 230 qui débouche dans le réacteur 10. Le réacteur 10 contient en outre une sonde de mesure du pH 15 connectée à un dispositif 16 qui déclenche l'arrivée dans le réacteur par une tubulure 170 d'une solution de base contenue dans le réservoir 17, pour maintenir le pH à une valeur constante prédéterminée. The ultrafiltration circuit which is bypassed to the reactor 10 comprises an inlet pipe 210 immersed in the reactor 10, a pump 20 ensuring the circulation of the reaction medium, a filter 21, then the ultrafiltration unit 22 which comprises a membrane 23 and is equipped with an outlet pipe for the ultrafiltrate 220 which opens into a means for recovering the ultrafiltrate 24, and an outlet pipe for the filtered liquid 230 which opens into the reactor 10. The reactor 10 furthermore contains a pH measurement probe 15 connected to a device 16 which triggers the arrival in the reactor via a pipe 170 of a base solution contained in the reservoir 17, in order to maintain the pH at a predetermined constant value.

Un mode de mise en oeuvre du procédé de l'invention est décrit en détail dans ce qui suit en utilisant l'installation représentée sur le dessin annexé. An embodiment of the method of the invention is described in detail in what follows using the installation shown in the accompanying drawing.

Le réacteur 10 est tout d'abord chargé avec une solution aqueuse contenant les enzymes. le cofacteur NAD libre ou greffé sur un polymère hydrosoluble de haut poids moléculaire qui ne peut pas traverser la membrane d'ultrafiltration; on introduit aussi de préférence des le départ de l'agent réducteur du NAD pour opérer en concentration saturante du substrat pour l'enzyme de régénération. On peut aussi introduire au départ dans le milieu de la L-carnitine à la concentration que l'on veut maintenir lors du fonctionnement en continu du réacteur, ce qui évite la mise en oeuvre d'un réacteur "batch", classique. Le pH est ajusté à la valeur convenable et la température du milieu est établie à une valeur convenant à la bioconversion. Reactor 10 is first charged with an aqueous solution containing the enzymes. the NAD cofactor free or grafted on a water-soluble high molecular weight polymer which cannot cross the ultrafiltration membrane; is also preferably introduced from the start of the reducing agent of NAD to operate in saturating concentration of the substrate for the regeneration enzyme. L-carnitine can also be introduced at the start into the medium at the concentration which it is desired to maintain during the continuous operation of the reactor, which avoids the use of a conventional "batch" reactor. The pH is adjusted to the appropriate value and the temperature of the medium is set at a value suitable for bioconversion.

Dans le cas du procédé mettant en oeuvre le système enzymatique CDH, NAD et FDH. on introduit dans le réacteur les enzymes CDH et FDH. du NAD et du formiate d'ammonium, on ajuste le pH à 7,5 par introduction d'une solution aqueuse de NH40H; et on porte le milieu à 30'C; il est inutile d'introduire un agent antibactérien dans le milieu si l'on introduit, au départ, .un sel dans le milieu réactionnel pour augmenter la force ionique du milieu jusqu'à une valeur supérieure à 0,5, ce qui permet la mise en oeuvre d'une quantité réduite d'enzymes comme décrit dans
EP-A-240 423.In the case of the method using the enzymatic system CDH, NAD and FDH. the enzymes CDH and FDH are introduced into the reactor. NAD and ammonium formate, the pH is adjusted to 7.5 by introducing an aqueous solution of NH4OH; and the medium is brought to 30 ° C; it is unnecessary to introduce an antibacterial agent into the medium if one introduces, at the start, a salt in the reaction medium to increase the ionic strength of the medium up to a value greater than 0.5, which allows the use of a reduced quantity of enzymes as described in
EP-A-240 423.

Le pH est maintenu au cours de la bioconversion par introduction, à l'aide de la tubulure 170, d'une solution aqueuse de NU4 OH provenant du réservoir 17. The pH is maintained during the bioconversion by introducing, using the tubing 170, an aqueous solution of NU4 OH coming from the reservoir 17.

D'autre part, le réservoir 13 est rempli d'une solution aqueuse de chlorhydrate de 3-déhydrocarnitine, dans laquelle est éventuellement introduit du NAD+, si celui du réacteur n'est pas greffé sur un polymère. On the other hand, the reservoir 13 is filled with an aqueous solution of 3-dehydrocarnitine hydrochloride, into which is optionally introduced NAD +, if that of the reactor is not grafted onto a polymer.

Le réservoir 12 est rempli d'une solution aqueuse d'une base pour neutraliser le sel de déhydrocarnitine et éventuellement de l'agent réducteur du NAD
Dans le cas du système réducteur FDH/for miate, on met de préféence une partie, ou la totalité, de l'acide formique nécessaire à la régénération du NAD+ dans le réservoir t3 et l'ammoniaque nécessaire à la neutralisation du sel de déhydrocarnitine et de l'acide formique dans le réservoir 12, qui peut contenir aussi du formiate d'ammonium si l'acide formique est en défaut dans le réservoir 13.The reservoir 12 is filled with an aqueous solution of a base to neutralize the salt of dehydrocarnitine and optionally of the reducing agent of NAD.
In the case of the FDH / formate reducing system, a part, or all, of the formic acid necessary for the regeneration of the NAD + is preferably placed in the reservoir t3 and the ammonia necessary for the neutralization of the dehydrocarnitine salt and formic acid in tank 12, which may also contain ammonium formate if formic acid is lacking in tank 13.

Le réservoir 17 est rempli d'une solution aqueuse de NH OH, par exemple de concentration aN. The reservoir 17 is filled with an aqueous solution of NH OH, for example of concentration aN.

La pompe il d'alimentation du réacteur 10 et celle de circulation du circuit d'ultrafiltration 20 sont mises en route, lorsque les différents réservoirs ont été chargés. Le débit des pompes est réglé comme il a été dit précédemment, de façon que la membrane d'ultrafiltration ne se colmate pas, que les enzymes ne soient pas dénaturées rapidement et que la réduction de la déhydrocarnitine soit pratiquement complate. Ce débit dépend des concentrations des réactifs en solution et de la nature de ces réactifs; en géné- ral, les liquides sont introduits, goutte à goutte, dans le réacteur 10 par les conduits 110 et 230. The feed pump 11 for the reactor 10 and the circulation pump for the ultrafiltration circuit 20 are started when the various tanks have been loaded. The flow rate of the pumps is regulated as has been said previously, so that the ultrafiltration membrane does not become clogged, that the enzymes are not rapidly denatured and that the reduction of dehydrocarnitine is practically complete. This flow rate depends on the concentrations of the reagents in solution and on the nature of these reagents; in general, the liquids are introduced dropwise into the reactor 10 through conduits 110 and 230.

Il est en général nécessaire d'augmenter progressivement la pression sur la membrane 23, qui a tendance à se colmater malgré la présence-du filtre 21. Lorsque la pression transmembranaire atteint des valeurs incompatibles avec les propriétés mécaniques de la membrane choisie, on peut connecter le circuit d'ultrafiltration sur une autre membrane; on peut faire de même pour changer de filtre, mais celui-ci peut aussi entre remplacé lors d'une courte interruption de la circulation du liquide dans le circuit d'ultra filtration. It is generally necessary to gradually increase the pressure on the membrane 23, which has a tendency to clog despite the presence of the filter 21. When the transmembrane pressure reaches values incompatible with the mechanical properties of the chosen membrane, it is possible to connect the ultrafiltration circuit on another membrane; the same can be done to change the filter, but it can also be replaced during a short interruption in the circulation of the liquid in the ultrafiltration circuit.

L'ultrafiltrat isolé dans le réservoir 24 est prélevé. traité pour en séparer la L-carnitine. The ultrafiltrate isolated in the reservoir 24 is taken. processed to separate L-carnitine.

Pour cela, on l'acidifie jusqu'à pH 3 par addition d'acide minéral concentré, de préférence d'acide sulfurique. La solution acide est alors passée sur une colonne contenant une résine cationique forte, sous forme NH4+, telle que celle commercialisée sous le nom de Amberlite R ER 151; la L-carnitine et les autres anions qui se sont fixés, sont élués de la colonne, de préférence après son rinçage à l'eau déminéralisée, par une solution aqueuse de NH40H 2N et l'éluat, de pu=11 environ, est passé, pour éliminer les anions présents, sur une colonne de résine anionique forte, en partie sous forme OH , telle que celle commercialisée sous le nom de Dowex 1X2 et l'éluat incolore est isolé. Cet éluat est concentré sous vide et le résidu obtenu isolé.For this, it is acidified to pH 3 by adding concentrated mineral acid, preferably sulfuric acid. The acidic solution is then passed through a column containing a strong cationic resin, in NH4 + form, such as that sold under the name Amberlite R ER 151; the L-carnitine and the other anions which are fixed, are eluted from the column, preferably after its rinsing with demineralized water, with an aqueous solution of 2N NH40H and the eluate, of pu = 11 approximately, is passed , to remove the anions present, on a column of strong anionic resin, partly in OH form, such as that marketed under the name of Dowex 1X2, and the colorless eluate is isolated. This eluate is concentrated under vacuum and the residue obtained isolated.

La L-carnitine qui constitue la majeure partie du résidu, peut etre purifiée comme suit : on dissous le résidu dans le minimum d'alcool isobutylique vers 65-C puis on refroidit la solution alcoolique jusqu'à température ambiante et on ajoute environ un volume d'acétone pour précipiter la L-carnitine pure, celle-ci est alors isolée par filtration et séchée. The L-carnitine, which constitutes the major part of the residue, can be purified as follows: the residue is dissolved in the minimum of isobutyl alcohol at around 65-C then the alcoholic solution is cooled to room temperature and approximately one volume is added. acetone to precipitate pure L-carnitine, which is then isolated by filtration and dried.

Le rendement de cette purification est d'au moins 85X : ce rendement est supérieur à celui obtenu lorsqu'il faut séparer la L-carnitine formée du système enzymatique utilisé pour la bioconversion en, discontinu. The yield of this purification is at least 85X: this yield is greater than that obtained when it is necessary to separate the L-carnitine formed from the enzymatic system used for the batch bioconversion.

Dans ce qui suit on décrit des exemples de mise en oeuvre de-l'invention. In what follows, examples of implementation of the invention are described.

EXEMPLE
On introduit dans un réacteur de 1 litre, 500 ml d'une solution aqueuse contenant 0,16 mole de
L-carnitine amphotère, 0.16'mole de NH4Cl, 0.32 mole de HCO2NH4. 0,4 mmole de NAD +, 625 unités de CDH,et 400 unités de FDH.EXAMPLE
500 ml of an aqueous solution containing 0.16 mol of
Amphoteric L-carnitine, 0.16 mole NH4Cl, 0.32 mole HCO2NH4. 0.4 mmol of NAD +, 625 units of CDH, and 400 units of FDH.

La CDH a été extraite -de Pseudomona-s Putida comme décrit dans FR-A-2 398 046 et la concentration de l'extrait mesurée en oxydant la carnitine. CDH was extracted from Pseudomona-s Putida as described in FR-A-2 398 046 and the concentration of the extract measured by oxidizing carnitine.

La FDH a été extraite de Pichia Pastoris. FDH was extracted from Pichia Pastoris.

On introduit aussi au départ et ensuite chaque jour 60 mg de chloramphénicol dans le réacteur. 60 mg of chloramphenicol are also introduced at the start and then each day into the reactor.

Le pH est ajusté à 7,5 par addition d'une solution aqueuse de NH40H 8N; le milieu est maintenu à 30'C pendant toute l'opération. The pH is adjusted to 7.5 by adding an aqueous solution of 8N NH4OH; the medium is maintained at 30 ° C. throughout the operation.

On remplit le réservoir 13, t hermostaté à avec une solution aqueuse de déhydrocarnitine
(0,6in), d'acide formique (0,64M) et de NAD+ (0,8 mM) et -le réservoir 12 avec une solution aqueuse de NU 4OH (0,64M). The tank 13 is filled, hermostatically sealed with an aqueous solution of dehydrocarnitine
(0.6in), formic acid (0.64M) and NAD + (0.8mM) and reservoir 12 with an aqueous solution of NU 4OH (0.64M).

Le débit de la pompe 11 est de 15 ml/heure pour chaque voie. The flow rate of the pump 11 is 15 ml / hour for each channel.

L'unité d'ultrafiltration 22- comporte une membrane 23 de type VMS commercialisée par AMI CON dont
2 le seuil de coupure est de 5000, qui a 43 cm de surface et 90 mm de diamètre. Le débit de la pompe 20 estde 12 ml/minute, ce qui donne une vitesse linéaire de balayage de 22 cm/seconde.The ultrafiltration unit 22- comprises a membrane 23 of the VMS type marketed by AMI CON, of which
2 the cut-off threshold is 5000, which has 43 cm in area and 90 mm in diameter. The flow rate of pump 20 is 12 ml / minute, resulting in a linear sweep speed of 22 cm / second.

La pression transmombranairo est maintenue entre 0,5X105 et 105 Pa, ce qui donne un débit d'ultrafiltrat voisin de 30 ml/heure, et par conséquent l'extraction d'un volume de réacteur toutes les 17 heures. The transmombranairo pressure is maintained between 0.5 × 105 and 105 Pa, which gives an ultrafiltrate flow rate close to 30 ml / hour, and consequently the extraction of a reactor volume every 17 hours.

Au bout de 80 heures, la concentration en
L-carnitine dans l'ultrafiltrat est de 0,30 M.After 80 hours, the concentration of
L-carnitine in the ultrafiltrate is 0.30 M.

EXEMPLE2
On a introduit dans un réacteur de 1 litre, 500 ml d'une solution aqueuse contenant 0,3 mole de
L-carnitine, 0,25 mole de formiate d'ammonium, 0,25 mmole de NARD , 1100 U de CDH et 560 U de FDH; le pH et la température ont été ajustés comme décrit dans l'exemple 1, et le réacteur a été alimenté par une solution aqueuse de 3-déhydrocarnitine 1,2 M, d'acide formique 1,2 M et de NAD+ 1,0 mM à partir du réservoir 13 à 4ic et par une solution aqueuse de formiate d'ammonium 1,0 M et NH40H 1,3 M à partir du réservoir 12.EXAMPLE 2
500 ml of an aqueous solution containing 0.3 mole of
L-carnitine, 0.25 mole of ammonium formate, 0.25 mmol of NARD, 1100 U of CDH and 560 U of FDH; the pH and temperature were adjusted as described in Example 1, and the reactor was fed with an aqueous solution of 1.2 M 3-dehydrocarnitine, 1.2 M formic acid and 1.0 mM NAD + from tank 13 to 4ic and with an aqueous solution of 1.0 M ammonium formate and 1.3 M NH4OH from tank 12.

Les débits et les conditions d'ultrafiltration étaient identiques à celles décrites à l'exemple 1. The flow rates and ultrafiltration conditions were identical to those described in Example 1.

On a ajouté 640 U de FDH en trois fois, au bout de 22 heures, 47 heures et 141 heures et 560 U de
CDH au bout de 47 heures.640 U of HDD were added in three steps, after 22 hours, 47 hours and 141 hours and 560 U of
CDH after 47 hours.

En 200 heures, on a isolé un volume d'ultrafitrat correspondant à 12 fois le volume du réacteur; la concentration de l'ultrafiltrat en L-carnitine était de 0,6 M, ce qui représente 95Z de rendement. In 200 hours, a volume of ultrafitrate corresponding to 12 times the volume of the reactor was isolated; the concentration of the L-carnitine ultrafiltrate was 0.6 M, which represents 95% yield.

EXEMPLE3
On a introduit dans un réacteur de 1 litre, 500 ml d'une solution aqueuse contenant de la L-carnitine (1,0 M), du formiate d'ammonium (0,5 M), du NAD+ (0,5 mM), de la CDH (2600 U) et de la FDH (1100 U}. EXAMPLE 3
500 ml of an aqueous solution containing L-carnitine (1.0 M), ammonium formate (0.5 M), NAD + (0.5 mM) were introduced into a 1 liter reactor. , CDH (2600 U) and FDH (1100 U}.

Le réservoir 13 contenait une solution de 3-dehydrocarnitine (2,0 M), d'acide formique (2,0 M) et de NAD+ (1,0 mM). Reservoir 13 contained a solution of 3-dehydrocarnitine (2.0 M), formic acid (2.0 M) and NAD + (1.0 mM).

Le réservoir 12 contenait une solution de formiate d'ammonium (0,1 M) et d'ammoniaque (3,5 M). Reservoir 12 contained a solution of ammonium formate (0.1 M) and ammonia (3.5 M).

Les conditions opératoires étaient identiques à celles de l'exemple 2. The operating conditions were identical to those of Example 2.

Au bout de 44 heures, l'activité de la CDH dans le milieu n'était plus que de 760 U et la concentration de la L-canitine de 0,7 M. After 44 hours, the CDH activity in the medium was only 760 U and the concentration of L-canitine 0.7 M.

La quantité totale de L-carnitineisolée dans l'ultrafiltrat n'était que de 0,88 M ce qui correspond à 67' de rendement. The total amount of L-carnitine isolated in the ultrafiltrate was only 0.88 M which corresponds to 67% yield.

EXEMPLE 4
On a introduit dans un réacteur de 1 litre, 500 ml d'une solution aqueuse contenant de la L-carni tine (0,1 M), du formiate d'ammonium (0,5 M), du NAD
(0,5 mM), de la CDH (1720 U) et de la FDH (850 U),
Les réservoirs 12 et 13 contenaient les mêmes solutions qu à l'exemple 3 et les conditions opératoires étaient identiques.EXAMPLE 4
500 ml of an aqueous solution containing L-carni tine (0.1 M), ammonium formate (0.5 M), NAD were introduced into a 1 liter reactor.
(0.5 mM), CDH (1720 U) and FDH (850 U),
Reservoirs 12 and 13 contained the same solutions as in Example 3 and the operating conditions were identical.

-On a, par contre, introduit régulièrement dans le réacteur des enzymes - après 18 heures : 300 U de CDH et 300 U de FDH - après 47 heures : 800 U de CDH et 300 U de FDH - après 187 heures: 600 ü de CDH et 300 U de FDH - après 212 heures: 600 U de CDH et 200 U de FDH
Dans ces conditions, le réacteur a fonctionné 352 heures avec des rendements instantanés, voisin de 90X.-On the other hand, enzymes were introduced regularly into the reactor - after 18 hours: 300 U of CDH and 300 U of FDH - after 47 hours: 800 U of CDH and 300 U of FDH - after 187 hours: 600 U of CDH and 300 U of FDH - after 212 hours: 600 U of CDH and 200 U of FDH
Under these conditions, the reactor operated 352 hours with instantaneous yields, close to 90X.

EXEMPLES
Dans un réacteur classique contenant 50 ml d'une solution dans un tampon phosphate (50 mM pH 7,5) de formiate d'ammonium (0,5 M). on introduit 40 U de CDM, 25 U de FDH, du NAD (0.4 mM) greffé sur un polyéthylène glycol de masse moléculaire moyenne 20000, Le réacteur est alimenté ä 0,75 ml/h avec une solution de déhydrocarnitine (1,6 M) conservé à i'C et le pH et la température sont contrôlés comme à l'exemple 1. Au bout de 24 heures, le volume est de 69 ml et la concentration en L-carnitine de 340 mM; le rendement est par conséquent de 817.. EXAMPLES
In a conventional reactor containing 50 ml of a solution in phosphate buffer (50 mM pH 7.5) of ammonium formate (0.5 M). 40 U of CDM, 25 U of FDH, NAD (0.4 mM) grafted on a polyethylene glycol with an average molecular mass of 20,000 are introduced. The reactor is fed at 0.75 ml / h with a solution of dehydrocarnitine (1.6 M). ) stored at 1 ° C. and the pH and temperature are controlled as in Example 1. After 24 hours, the volume is 69 ml and the L-carnitine concentration is 340 mM; the yield is therefore 817 ..

Cet exemple montre qu'un NAD+ greffé sur un polymère hydrosoluble peut etre utilisé à la place du NAD+ pour la réaction de réduction de la déhydrocarnitine et donc peut être utilisé dans la présente invention. This example shows that an NAD + grafted onto a water-soluble polymer can be used in place of NAD + for the dehydrocarnitine reduction reaction and therefore can be used in the present invention.

Claims (10)

REVENDICATIONS 1. Procédé enzymatique de préparation de la 1. Enzymatic process for the preparation of L-carnitine par réduction de la 3-déhydroCarnitine par le NADH en présence de carnitine déshydrogénase. et d'un système réducteur de NARD , caractérisé en ce que le réacteur contenant les enzymes est alimenté en continu en 3-déhydrocarnitine et en agent réducteur duL-carnitine by reduction of 3-dehydroCarnitine by NADH in the presence of carnitine dehydrogenase. and a NARD reducing system, characterized in that the reactor containing the enzymes is continuously supplied with 3-dehydrocarnitine and reducing agent of the NAD , le NAD étant soit également introduit en continu dans le réacteur soit présent dans le réacteur sous forme greffé à un polymère hydrosoluble. et le milieu réactionnel est soumis à une ultrafiltration dans un circuit monté en dérivation sur le reacteur et la L-carnitine est récupérée dans l'ultrafiltrat séparé.NAD, the NAD being either also continuously introduced into the reactor or present in the reactor in the form grafted to a water-soluble polymer. and the reaction medium is subjected to ultrafiltration in a circuit mounted as a bypass on the reactor and the L-carnitine is recovered in the separated ultrafiltrate. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on introduit des enzymes dans le réacteur en cours d'opération lorsque la productivité diminue. 2. Method according to claim 1, characterized in that enzymes are introduced into the reactor during operation when the productivity decreases. 3. Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que la 3-déhydrocarnitine est introduite sous forme d'un de ses sels stables avec un acide fort qui est neutralisé dans le réacteur. 3. Method according to claim 1 or claim 2, characterized in that 3-dehydrocarnitine is introduced in the form of one of its stable salts with a strong acid which is neutralized in the reactor. 4. Procédé selon l'une des revendications précédentes. caractérisé en ce que le système réducteur du NAD est un système enzymatique. 4. Method according to one of the preceding claims. characterized in that the reducing system of NAD is an enzymatic system. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la force ionique du milieu réactionnel est supérieure à 0,5. 5. Method according to any one of the preceding claims, characterized in that the ionic strength of the reaction medium is greater than 0.5. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 ou 5, caractérisé en ce que le système réducteur est composé d'un sel d'acide formique et de formiate déshydrogénase. 6. Method according to any one of claims 4 or 5, characterized in that the reducing system is composed of a salt of formic acid and of formate dehydrogenase. 7. Procédé selon la revendication 6. carac térisé en ce que le sel d'acide formique est le formiate d'ammonium. 7. The method of claim 6. charac terized in that the formic acid salt is ammonium formate. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 7, caractérisé en ce que le pH du milieu réactionnel est maintenu autour de 7,5 et sa température autour de 30C. 8. Method according to any one of claims 4 to 7, characterized in that the pH of the reaction medium is maintained around 7.5 and its temperature around 30C. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la L-carnitine est isolée de l'ultrafiltrat par fixation sur une résine cationique forte, suivi d'un passage de l'éluat de cette résine sur une résine anionique et évaporation du solvant du liquide élué. 9. Method according to any one of the preceding claims, characterized in that the L-carnitine is isolated from the ultrafiltrate by attachment to a strong cationic resin, followed by passing the eluate of this resin over an anionic resin. and evaporating the solvent from the eluted liquid. 10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que la L-carnitine est purifiée par précipitation dans un mélange d'alcool isobutylique et d'acétone. 10. The method of claim 9, characterized in that the L-carnitine is purified by precipitation from a mixture of isobutyl alcohol and acetone.