FR2609047A1 - Procede de preparation de l-valine - Google Patents

Abstract

L'INVENTION CONCERNE UN PROCEDE DE PREPARATION DE LA L-VALINE QUI EST UN AMINO-ACIDE ESSENTIEL. CE PROCEDE CONSISTE A CULTIVER DES MICRO-ORGANISMES DU GENRE BREVIBACTERIUM STABLES A L'HYDROXAMATE DE L-ARGININE OU STABLES AUSSI BIEN A L'HYDROXAMATE DE L-ARGININE QU'A L'ACIDE A-AMINOBUTYRIQUE EN PRESENCE DE L-LEUCINE, DANS UN MILIEU NUTRITIF CONTENANT DES SOURCES DE CARBONE ET D'AZOTE, DES SELS INORGANIQUES ET DES STIMULATEURS DE LA CROISSANCE, A ISOLER ULTERIEUREMENT LA L-VALINE FORMEE DANS LE MILIEU DE CULTURE ET A LA PURIFIER.

Description

L'invention concerne l'industrie microbiologi-

que, d'une manière plus concrète des procédés de prépara-

tion d'amino-acides, et plus précisément un procédé de

préparation de la L-valine.

La présente invention trouvera une application en médecine et dans les industries chimique, alimentaire

et de culture de tabac.

On connaît un procédé de préparation de la L-

valine par culture de micro-organismes de l'espèce Serra-

tia marcescens stables à l'acide < -aminobutyrique. Ces micro-organismes sont capables d'accumuler la L-valine

lors de la culture dans des milieux contenant des sour-

ces assimilables de carbone et d'azote, des sels inorga-

niques et des stimulateurs de la croissance ("Journal of

Bacteriology", N5, 1971, Kisumi M. et al. "Valine accu-

mulation by o< -aminobutyrique acid-resistant Mutants of

Serratia marcescens", p. 493-499).

Le rendement maximal en L-valine dans ce proc -

dé est de 9 à 10 g/l.

On connait un procédé de préparation de la L-

valine fondé sur l'utilisation de micro-organismes des espèces Corynebacterium et Brevibacterium stables à la thiazol-2-alanine et qui ont en même temps besoin de la

L-leucine, la L-isoleucine ou la L-thréonine (JP, B, 52-

116). Le rendement maximal en L-valine obtenu par ce pro-

cédé est de 25 g/l.

On connaît également un orocédé de préparation de la L-valine utilisant, en qualité de producteurs de

L-valine, des micro-organismes des espèces Corynebacte-

rium et Brevibacterium qui résistent à la S-amino-éthyl-

cystéine (JP, B, 58-2678). Ce procédé assure une accumu-

lation jusqu'à 30,5 g/l de L-valine dans le milieu de culture. On connaît encore un procédé de préparation de

la L-valine par fermentation, utilisant des micro-orga-

nismes du genre Brevibacterium qui ont besoin de la L-

isoleucine pour leur croissance et résistant en même

temps, soit au D-ribose, soit aux ribonucléosides puri-

ques, soit aux ribonucléosides oyrimidiques (JP, B, 58-

32594).

On atteint un rendement maximal en L-valine de 35 g/1 dans le cas o les micro-organismes cités résistent

à la thiazol-2-alanine.

Le but de l'invention est de créer un procédé

de préparation de la L-valine en utilisant des micro-or-

ganismes nouveaux, procédé permettant d'élever le rende-

ment en produit visé.

La solution de ce problème consiste en ce que, dans le procédé de préparation de la L-valine par culture

de micro-organismes du genre Brevibacterium dans un mi-

lieu nutritif contenant des sources de carbone et d'azote,

des sels inorganiques et des composés organiques stimu-

lant le croissance des micro-organismes, isolement subsé-

quent dans le milieu de culture et purification du produit

visé, conformément à l'invention on utilise des micro-or-

ganismes du genre Brevibacterium stables à l'hydroxamate

de L-arginine ou stables aussi bien à l'hydroxamate de L-

arginine qu'à l'acide C'-aminobutyrique en présence de L-

leucine. Grâce à l'invention, le rendement en L-valine

atteint 55 g/l.

Conformément à la présente invention, il est rationnel d'utiliser les micro-organismes suivants de

l'espèce Brevibacterium flavum déposés au Vsesojuzny nau-

chno-issledovatelsky institut genetiki i selektsii promy-

shlennych micro-organizmov: souche Brevibacterium flavum AA52, enregistré sous le N 3-3713 le 21 avril 1986; souche Brevibacterium flavum AA53, enregistré sous le N B-3714 le 21 avril 1986; souche Brevibacterium flavum AA54, enregistré sous

le N B-3715 le 21 avril 1986.

Il est avantageux d'utiliser la souche Brevi-

bacterium flavum AA52 stable à l'hydroxamate de L-argi-

nine. De plus, on peut, conformément à l'invention,

utiliser la souche Brevibacterium flavum AA53 ou la sou-

che Brevibacterium flavum AA54 stables aussi bien à

l'hydroxamate de L-arginine qu'à l'acide o< -aminobuty-

rique Én ptsaoe de L-eaie.

D'autres buts et avantages de l'invention se-

ront mieux compris à la lecture de la description qui va

suivre du procédé de préparation de la L-valine et des

exemples de mise en oeuvre de ce procédé.

Le procédé de préparation de la L-valine par

fermentation suivant l'invention est fondé sur l'utilisa-

tion de micro-organismes producteurs de L-valine cultivés

dans un milieu nutritif.

On propose d'utiliser des micro-organismes du

genre Brevibacterium stables à l'hydroxamate de L-argini-

ne. Un exemple concret de tels micro-organismes est la souche-productrice de L-valine Brevibacterium flavum AA

52, déposé au Vsesojuzny nauchno-issledovatelsky insti-

tut genetiki i selektsii promyschlennych micro-organiz-

mov et enregistrée sous le N B-3713 le 21 avril 1986.

Conformément à l'invention, on propose égale-

ment d'utiliser des micro-organismes du genre Brevibac-

terium stables aussi à 1'hydroxamate de L-arginine et à l'acide d%aminobutyrique en présence de L-leucine. Les souches productrices de Lvaline, Brevibacterium flavum

AA53 bu Brevibacterium flavum AA54, déposées dans Vseso-

juzny nauchno-issledovatelsky institut genetiki i selekt-

sii promychlennych micro-organizmov et enregistrées res-

pectivement sous le N B-3714 et B-2715 le 21 avril 1986

peuvent servir d'exemples de tels micro-organismes.

Les souches de Brevibacterium flavum AA52, AA

53 et AA54 ont besoin de L-isoleucine pour la croissance.

Les mutations de la résistance à hautes concen-

trations en acide c0 -aminobutyrique en présence de L-

leucine, à l'hydroxamate de L-arginine et de l'auxotro-

phicité selon la L-isoleucine peuvent être obtenues à l'aide de la mutagénisation des bactéries par n'importe quel procédé connu (par exemple par traitement avec la N-méthyl-N'-nitro-N-nitroso-guanidine ou par irradiation ultraviolette). Les souches nouvelles indiquées sont obtenues

par méthodes génétiques sélectionnées à partir de la sou-

che de Brevibacterium flavum ATCC 14067 déposée au Vseso-

juzny nauchno-issledovatelsky institut genetiki i selekt-

sii promychlennych microorganizmov et enregistrée sout

le N B-42 le 16 janvier 1969.

Cependant, on peut utiliser toutes les autres

souches de micro-organismes se rapportant au genre Brevi-

bacterim en qualité de souches parentales pour la sélec-

tion des micro-organismes cités dans la présente inven-

tion.

On donnera ci-après le schéma de la sélection

des souches-productrices de L-valine.

ATCC 14067

(souche parentale produisant jusqu'à 2 g/l de L-valine)

mutagénèse avec la N-méthyl-N'-nitro-N-nitro-

soguanidine et sélection des mutants ayant be-

soin de la L-isoleucine pour la croissance

ATCC 14067 ile-

lauxotrophe d'isoleucine produisant jusqu'à 4,5 g/l de L-valine)

mutagénèse avec la N-méthyl-N'-nitro-N-nitro-

soguanidine et sélection des mutants stables à l'hydroxamate de Larginine (10 mg/ml) AA52

(auxotrophe d'isoleucine stable à l'hydroxamate de L-ar-

ginine, produisant jusqu'à 17 g/l de L-valine)

mutagénèse avec la N-méthyl-N'-nitro-N-nitroso-

guanidine et sélection des mutants stables à

l'acide cl -aminobutyrique (55 mg/ml) en pré-

/sence de L-leucine AA53 et AA54

(auxotrophes d'isoleucine stables à l'hydroxamate de L-ar-

ginine et stables à de hautes concentrations en

acide C( -aminobutyrique en présence de L-leu-

cine, produisant de 52 à 55 g/l de L-valine).

Les souches AA52, AA53 et AA54 selon leurs carac-

téristiques (sauf la stabilité à l'hydroxamate de L-argini-

ne, à l'acide Q -aminobutyrique en présence de L-leucine, l'auxotrophicité selon la L-isoleucine et la capacité de

produire la L-valine) ne diffèrent pas de la souche paren-

tale Brevibacterium flavum ATCC 14067.

Les souches productrices de L-valine, Brevibac-

terium flavum AA52, AA53, AA54, utilisées présentent les

caractères de culture et morphologiques suivantes.

Caractères morpholoqiques:

les cellules sont ovales d'une longueur de 1,7-

2,5pm, asporogènes, immobiles, gram-positives.

Caractères de culture:

au deuxième jour de la croissance à la tempéra-

ture de 28 C, elles forment sur la surface de l'agar de viande-peptone des colonies d'un diamètre de 3 à 4 mm, rondes, à l'extrémité lisse; le centre est soulevé en

forme de cône, la surface est lisse, brillante et de cou-

leur crème-jaunâtre.

Avec un ensemencement par strie sur l'agar de viande-peptone, la croissance est modérée au 2 éme jour; l'extrémité est lisse; la surface est brillante, compacte

et de couleur crème-jaunâtre.

La croissance dans la masse d'agar de viande-

peptone est modérée, essentiellement sur la surface du milieu. Le milieu minéral a la composition suivante (mg/ml): glucose = 20; Na2S04 = 2; K2HPO4 = 3; KH2PO4 = 1; NH4C1 = 3; NH4NO3 =1; MgS04.7 H20 = 0,1; MnS04.5 H20 = 1.10-4; biotine = 5.10-5; chlorure de thiamine = 1.10-4; L isoleucine = 0,2; FeSO4.7 H20=

1.10-4; pH = 7,4. La biotine, la thiamine et la L-iso-

leucine sont indispensables pour la croissance. Au 2ème

jour de la croissance à la température de 28 C, elle for-

me des colonies de 1 mm de diamètre, de couleur crème-

claire. La croissance à la strie au 2ème jour est modé-

rée, compacte et de couleur crème-claire.

Sur un milieu de pomme de terre, elle croit et

forme un pigment à nuance jaune.

Elle ne liquéfie pas la gélatine.

Comportement vis-à-vis des sources de carbone: bonne croissance sur le glucose, le saccharose, le maltose, le fructose, le mannose; une plus faible croissance sur le galactose, le rhamnose, le sorbose, le

sorbitol, les sels ammonique et sodique de l'acide acéti-

que, l'éthanol; n'utilise pas le lactose.

Comportement vis-à-vis des sources d'azote:

elle assimile (NH)2S04, NH4C1 et l'urée.

La préparation de la souche Brevibacterium fla-

vum AA52 est réalisée de la manière suivante.

On cultive la souche Brevibacterium flavum ATCC 14067 dans un bouillon de viande-peptone à la température de 30 C avec aération jusqu'à l'obtention du titre de 109

cellules/ml. On lave les cellules du bouillon de viande-

peptone par centrifugation et on remet en suspension dans

une solution tampon de citrate à pH = 5,5. A la suspen-

sion obtenue, on ajoute de la N-méthyl-N'-nitro-N-nitro-

soguanidine jusqu'à la concentration finale de 300 mg/ml, on fait incuber avec aération pendant 20-minutes à la température de 300C. On libère les cellules du mutagène à l'aide d'un bouillon de viande-peptone refroidi, on transfère dans une éprouvette avec 10 ml de bouillon de viande-peptone, on fait incuber avec aération pendant 18 heures à la température de 30 C et puis on ensemence sur un milieu NQ 1 de composition suivante (mg/ml): glucose = ; Na2S04 = 2; K2HPO4 = 3; KH2PO4 = 1; NH4C1 = 3; NH4N03 = 1; MgSO4.7H20 = 0,1; MnSO4.5H20 = 10-4; biotine = 5x10-5; chlorure de thiamine = lx10-4; L-iÈoleucine = 0,2; agar-agar = 20; FeSO4.7H20 =

lxlO-4; pH=7,4. Parmi les colonies développées sur ce mi-

lieu N 1 après 48 heures d'incubation à la température de 30 C,.on choisit un mutant incapable de croltre sur le

milieu N 1 qui ne renferme pas de L-isoleucine. L'auxo-

trophe d'isoleucine obtenu est mutagénésé de nouveau avec la N-méthyl-N'nitro-N-nitrosoguanidine et ensemencé sur

le milieu N 1 contenant également de l'hydroxamate de L-

arginine à la concentration de 10 mg/ml. Les colonies dé-

veloppées sur ce milieu après 72 heures d'incubation sont purifiées, leur capacité de produire de la valine étant

vérifiée. Un des mutants choisis de cette façon, produi-

sant de la L-valine, est désigné Brevibacterium flavum AA 52.

On réalise la préparation des souches Brevibac-

tteri'm flavum AA53, AA54 de la manière suivante.

On soumet la souche AA52 à une mutagénèse avec la N-méthyl-N'-nitro-Nnitrosoguanidine et on l'ensemnce

sur un milieu N 2 de composition suivante (mg/ml): glu-

cose= 10, Na2SO4 = 2; K2HPO4 = 3; KH2PO4 =1; NH4Cl = 3; NH4NO3 = 1; MgSO4. 7H20 = 0,1; MnSO4.5H20 = 1 x 10-4; FeSO4. 7H20 = 1 x 10-4; biotine = 5 x 10-5; chlorure de thiamine = 1 x 10-4; L-isoleucine = 0,2;

L-leucine = 0,2; acide c -aminobutyrique = 55 et agar-

agar = 20. On purifie les colonies développées et on exa-

mine leur capacité de produire de la valine. Deux mutants

produisant des quantités élevées de L-valine sont dési-

gnées Brevibactérium flavum AA53 et Brevibacterium flavum AA54. La semence des souches productrices pour une fermentation ultérieure peut être préparée par n'importe quel procédé connu, tel que la culture sur la surface de milieux nutritifs solides agarisés ou dans des milieux

liquides contenant des sources de carbone et d'azote as-

similables, des sels inorganiques et des substances orga-

niques assurant la croissance des micro-organismes.

Les substances organiques renferment des vita-

mines (biotine, thiamine) ainsi que d'autres composés, y compris des amino-acides, dans le cas oI ces derniers sont indispensables pour la croissance d'une souche productrice déterminée. A titre de milieu nutritif de fermentation pour la culture de micro-organismes du genre Brevibacterium, on peut utiliser des milieux nutritifs quelconques contenant des sources assimilables de carbone et d'azote, des sels inorganiques et des substances organiques stimulant la croissance des micro-organismes et l'accumulation de la L-valine. A titre de sources assimilables de carbone, on

peut utiliser des hydrates de carbone tels que le saccha-

rose, le glucose, le fructose, le maltose, le mannose,

l'amidon, un hydrolysat d'amidon et la mélasse; des po-

lyalcools tels que la glycérine et la sorbite; des aci-

des organiques tels que les acides formique, acétique,

lactique, fumarique, maléique et propionique; des al-

cools, tels que le méthanol et l'éthanol. Les sources de

carbone indiquées peuvent être utilisées aussi bien sépa-

rément qu'en combinaison avec une autre en divers rapports pondéraux. La quantité totale de substance constituant la

source de carbone peut être introduite au.début de la fer-

mentation ou par portions lors du processus de fermenta-

tion. A titre de source d'azote assimilable, on peut utiliser aussi bien des sels organiques que des sels

inorganiques d'ammonium, par exemple le sulfate d'ammo-

nium, le chlorure d'ammonium, le carbonate d'ammonium,

l'acétate d'ammonium, le nitrate d'ammonium, le phospha-

te d'ammonium, le lactate d'ammonium; l'urée; divers

composés azotés naturels, par exemple la peptone, un hy-

drolysat de levures, un extrait de viande et des hydro-

lysats de protéines végétales.

A titre de sels inorganiques, on peut utiliser

le phosphate de potassium et de sodium, le sulfate de ma-

gnésium, le chlorure de sodium, des sels de fer et de

manganèse, le carbonate de calcium.

A titre de substances organiques nécessaires pour la croissance des microorganismes indiqués, on peut

utiliser la thiamine (par exemple sous forme de dilohy-

drate ou de bromhydrate), la biotine ou ses substituts

(par exemple la déthiobiotine, la biocine, l'acide 7, 8-

OS diamino-pélargonique) ainsi que des amino-acides s'ils sont nécessaires pour la croissance des micro-organismes, par exemple la L- isoleucine. Dans le cas o les substances organiques sont présentés en quantité suffisante dans les autres composants du milieu nitritif, on n'a plus besoin

d'introduire ces substances organiques à l'état pur.

L'exemple d'une composition concrète du milieu de fermentation est le suivant: saccharose ou glucose 100-200 g/l, sulfate d'ammonium 40-80 g/l, sulfate de magnésium 0,5-10 g/l, phosphate monopotassique 0,5-10 g/l, Lisoleucine 0,1-0,4 g/l, ainsi que le sulfate de fer, le sulfate de manganèse, la biotine et la thiamine. On observe une accumulation de

L-valine 6 à 8 heures après le début de la fermentation.

Cependant, le niveau maximal de la L-valine dans le mi-

lieu de culture est atteint après une consommation entière de la source et de l'énergie (26 heures et davantage après le début de la fermentation selon la concentration en

source de carbone et l'énergie consommée).

On détermine la teneur en L-valine du milieu de culture et dans d'autres solutions par chromatographie sur papier et la coloration avec la ninhydrine ou à l'aide

d'un analyseur d'amino-acide.

La L-valine accumulée peut isolée du milieu de

culture par n'importe quel procédé connu, tel que l'élimi-

nation des micro-organismes et d'autres particules non dissoutes par contrifugation ou filtration, adsorption de

la L-valine sur des résines échangeuses d'ions avec élu-

tion, concentration et cristallisation ultérieures de la L-valine.

EXEMPLE 1

On prépare une semence de la souche Brevibacte-

rium flavum AA54 de la manière suivante. Dans des éprou-

vettes contenant 10 ml de bouillon de viande-peptone sté-

rile, à pH=7,5, on introduit aseptiquement une culture de AA54 cultivée sur la surface de l'agar de viante-peptone

et on fait incuber les éprouvettes en les secouant pen-

dant 16 heures.

Dans chaque ballon de fermentation de 500 ml de capacité, on verse aseptiquement 15 ml d'un milieu de fermentation stérilisé de composition suivante (g/l):

saccharose = 150, (NH4)2SO4 = 55, KH2PO4 = 0,1, MgSO4.

7H20 = 1, CaCO = 50, FeSO4.7H20 = 0,01, MnSO 4. 5H20 = 0,01,

biotine = 0,0005, chlorure de thiamine = 0,0005, L-isoleu-

cine = 0,25; pH = 7,5.

On introduit 1 ml de semence de la souche Brevi-

bacterium flavum AA54 dans des ballons et on fait incuber

en les secouant (220 t/min) pendant 96 heures à la tempé-

rature de 30 C. La teneur en L-valine du milieu de culture obtenu après l'achèvement de la fermentation est de 55,3 g/l.

250 ml du milieu de culture de la souche Brevi-

* bacterium flavum AA54 obtenu contenant 13,8 g de L-valine

sont centrifugés (5000 t/min pendant 20 minutes) pour éli-

miner les bactéries et autres particules insolubles. On

fait passer le liquide surnageant obtenu à travers une co-

lonne chargée de résine échangeuse d'ions sous forme H+, de bas en haut, au débit de 0,6 volume de solution par 1 volume de résine par heure. On lave la colonne à l'eau et on élue la L-valine adsorbée par une solution aqueuse à 3,5 % d'ammoniac. On concentre sous vide l'éluat obtenu

jusqu'à l'apparition de cristaux et on réalise une cris-

tallisation ultérieure de la L-valine à la température de

+5 C.pendant 3 heures. On sépare les cristaux de la solu-

tion par filtration à travers un filtre en papier et on sèche sous vide. Le rendement en L-valine est de 8,7 g, t sant tenir compte de sa teneur de la solution mère, ce

qui donne un rendement total de 63 % de la teneur en mi-

lieu de culture.

Le taux de pureté du produit selon les données

de la chromatographie sur papier, est de 96,6 %.

EXEMPLE 2

On conduit le processus dans des conditions analogues à celles de l'Exemple 1 mais, en qualité de souche productrice de L-valine, on utilise la souche

Brevibacterium flavum AA53 et on utilise une concentra-

tion de saccharose dans le milieu de fermentation de g/l. La teneur en Lvaline du milieu de culture

après 72 heures d'incubation est de 41,7 g/l.

On effectue ensuite la purification d'une ma-

nière analogue à celle décrite dans l'Exemple 1.

EXEMPLE 3

On réalise le processus dans des conditions analogues à celles de l'Exemple 2 mais, en qualité de souche productrice de L-valine, on utilise la souche

Brevibacterium flavum AA54.

La teneur en L-valine du milieu de culture

après 72 heures d'incubation est de 43,5 g/l. On effec-

tue ensuite la purification d'une manière analogue à

celle décrite dans l'Exemple 1.

EXEMPLE 4

On conduit le processus dans des conditions analogues à celles de l'Exemple 1 mais, en qualité de souche productrice de L-valine, on utilise la souche

Brevibacterium flavum AA53.

Le rendement en L-valine du milieu de culture est de 52,7 g/1. On effectue ensuite la purification

d'une manière analogue à celle décrite dans l'Exemple 1.

EXEMPLE 5

On effectue la préparation de la L-valine dans

des conditions analogues à celles indiquées dans l'Exem-

ple 1 mais, en qualité de souche productrice de L-valine,

on utilise la souche Brevibacterium flavum AA52.

La teneur en L-valine du milieu de culture est

de 17,2 g/1.

On réalise ensuite la purification d'une façon

tout à fait analogue à celle décrite dans l'Exemple 1.

Claims (3)

REVENDICATIONS

1. Procédé de préparation de L-valine par culture de micro-organismes du genre Brevibacterium dans un milieu

contenant des sources de carbone et d'azote, des sels inor-

ganiques et des substances organiques stimulant la crois-

sance des micro-organismes, isolement ultérieur dans le mi-

lieu de culture et purification du produit désiré formé, caractérisé en ce qu'on utilise des micro-organismes du genre Brevibacterium stables à l'hydroxamate de L-arginine ou stables aussi bien à l'hydroxamate de Larginine qu'à

l'acide -amino butyrique en présence de L-leucine.

2. Procédé suivant la revendication 1, caracté-

risé en ce qu'on utilise les micro-organismes du genre

Brevibacterium flavum déposés au Vsesojuzny nauchno-issle-

dovatelsky institut genetiki i seleltsii promyshlennych microorganizmov; souche Brevibacterium flavum'AA52, enregistrée sous le N B-3713 le 21 avril 1986, stable à l'hydroxamate de L-arginine; souche Brevibacterium flavum AA53, enregistrée sous le N B-3714 le 21 avril 1986; et souche Brevibacterium flavum AA54, enregistrée sous

le NQ B-3715 le 21 avril 1986, stables aussi bien à l'hy-

droxamate de L-arginine qu'à l'acide i -aminobutyrique

en présence de L-leucine.

3. Cultures biologiques pures de micro-organis-

mes possédant des caractéristiques et identifiables avec n'importe laquelle des souches productrices de L-valine ci-après: Brevibacterium flavum AA52, Brevibacterium flavum AA53,

Brevibacterium flavum AA54.