FR2601781A1 - Reactif de dosage de mycotoxine et methode l'utilisant pour doser une mycotoxine - Google Patents

Abstract

L'INVENTION CONCERNE UN REACTIF DE DOSAGE DE MYCOTOXINE. LE REACTIF COMPREND UN ANTICORPS MONOCLONAL MARQUE PAR UNE ENZYME DIRIGE CONTRE LA MYCOTOXINE. L'ENZYME PEUT ETRE DU TYPE PEROXYDASE, PHOSPHATASE ALCALINE, B-GALACTOSIDASE, CATALASE, GLUCOSE-OXYDASE, ACIDE LACTIQUE-OXYDASE, ALCOOL-OXYDASE OU MONOAMINE-OXYDASE ET LA MYCOTOXINE EST PRODUITE PAR UN MICROORGANISME DU GENRE PENICILLIUM, ASPERGILLUS OU FUSARIUM. L'INVENTION VISE EGALEMENT UNE METHODE POUR DOSER UNE MYCOTOXINE OU CE REACTIF EST UTILISE DANS DES CONDITIONS DE REACTIONS COMPETITIVES. L'INVENTION S'APPLIQUE NOTAMMENT AU DOMAINE DU CONTROLE DES PRODUITS ALIMENTAIRES.

Description

La présente invention concerne un réactif de dosage pour une mycotoxine,

et une méthode de dosage. Plus particulièrement, elle concerne un réactif de dosage de mycotoxine

contenant un anticorps monoclonal marqué par une enzyme et 5 une méthode de dosage o est employé ce réactif de dosage.

Les mycotoxines produites par des eumycètes tels que des microorganismes des genres Penicillium, Aspergillus et Fusarium sont parfois carcinogènes ou tumorigènes dans les reins ou le foie, même s'ils ne présentent pas de toxi10 cité aiguë. Parmi les mycotoxines, l'aflatoxine B1 fait

preuve d'un pouvoir carcinogène particulièrement puissant.

De fait, l'effet exercé par l'aflatoxine B1 sur les humains et les animaux a été bien étudié, et il a été reconnu que

l'aflatoxine B1 cancérise le foie comme un organe-cible.

I1 est donc très important de mesurer la quantité de mycotoxines qui est présente dans les aliments destinés

aux êtres humains et aux animaux avant que ceux-ci ne les consomment et d'éviter ainsi l'ingestion des mycotoxines.

Les méthodes classiques pour le dosage des myco20 toxines comprennent, par exemple, la chromatographie en couche mince, la chromatographie en phase liquide à haute performance, la chromatographie en phase gazeuse, la spectroscopie de masse et les épreuves biologiques sur des animaux. Ces méthodes sont cependant limitées dans leur appli25 cation pratique car elles présentent des difficultés concernant la sensibilité de mesure ou le temps demandé pour la mesure et l'analyse. De nouveaux perfectionnements sont

donc souhaitables.

I1 a récemment été mis au point un dosage immuno30 enzymatique utilisant l'aflatoxine B1 marquée par une enzyme et

un anticorps polyclonal qui lui est spécifique [Appl. Envi.

Microbiology, 41, 1472 (1981)]. Cette méthode est extrêmement pratique en ce qui concerne la sensibilité du dosage et le temps requis pour le dosage et l'analyse, mais sa sensibi35 lité de dosage n'est pas encore suffisante. De plus,.étant

donné que de grandes quantités de réactifs contenantla myco-

toxine doivent être rejetés après emploi, il est encore souhaitable de l'améliorer en ce qui concerne la sécurité et l'économie.

Dans Proceedings of the Japanese Association of 5 Mycotoxicology, N 21, 30 juin 1985, Ikuko Ueno décrit un dosage immuno-enzymatique perfectionné de l'aflatoxine B1.

Cette méthode permet de doser l'aflatoxine B1 dans la plage

de 10 à 1000 pg/10 Vú (1 ng/ml à 100 ng/ml).

Un dosage de l'aflatoxine B1 par un immunosorbant 10 lié à une enzyme est également connu [Bhanu P. Ram et L. Patrick Hart dans J. Assoc. Off. Anal. Chem., volume 69, N 5 (1986)]. Selon cette méthode, la plage de dosage de

l'aflatoxine B1 est également de 1 ng/ml à 100 ng/ml.

Un dosage immuno-enzymatique pour la détection de 15 mycotoxine utilisant un anticorps monoclonal dirigé contre l'aflatoxine B1 est également connu et a été mis au point par A.A.G. Candlish, W.H. Stimson et J.E. Smith (Letters in

Applied Microbiology, 1985, 1, 57-61). La plage de dosage de l'aflatoxine B1 par cette méthode est d'environ 1 à 20 5 ng/ml.

Les méthodes de dosage immuno-enzymatique précitées sont très pratiques car elles se prêtent à une manipulation simple et permettent de doser beaucoup d'échantillons à la fois. I1 n'a encore été signalé aucune méthode de dosage immuno-enzymatique qui permette de doser l'aflatoxine B1 à

moins d'environ 1 ng/ml.

Un but de la présente invention est de fournir un réactif pour doser une mycotoxine telle que l'aflatoxine B1. 30 Un autre but de la présente invention est de fournir un réactif pour doser une mycotoxine, dont la sensibilité à la mycotoxine soit suffisante et qui réagisse rapidement avec celle-ci. Un autre but encore de la présente invention est 35 de fournir un réactif pour doser une mycotoxine, qui soit

suffisamment stable et économique.

Un autre but encore de la présente invention est de fournir un anticorps antimycotoxine monoclonal marqué par une enzyme, qui est destiné à être utilisé dans un réactif de dosage de mycotoxine ayant les propriétés précitées. 5 Un autre but encore de la présente invention est de fournir une méthode pour doser une mycotoxine rapidement et avec une grande sensibilité en utilisant le réactif de

dosage de mycotoxine précité de l'invention.

Ces buts et avantages ainsi que d'autres de la

présente invention se dégageront de la description suivante.

Conformément à la présente invention, les buts et

avantages de l'invention sont atteints en premier lieu par un réactif de dosage d'une mycotoxine, comprenant un anticorps monoclonal marqué par une enzyme dirigé contre la 15 mycotoxine.

Sur les dessins annexés: la figure 1 est une courbe d'étalonnage obtenue en fixant un complexe OTA-SAB (20 pg/ml) à une plaque de dosage immunologique à fond plat comportant 96 alvéoles, 20 en ajoutant un réactif de dosage de mycotoxine dilué à diverses concentrations et une solution titrée de OTA en diverses concentrations aux alvéoles individuelles de la plaque pour provoquer une réaction enzymatique, en arrêtant la réaction et en mesurant sur la plaque l'absorbance de la 25 solution réactionnelle à 500 nm au moyen d'un photomètre pour microplaque, et en traçant graphiquement les absorbances mesurées en fonction des concentrations de la mycotoxine: la figure 2 est une courbe d'étalonnage obtenue comme dans le cas de la figure 1, à la différence qu'un complexe HS-T-2-SAB (20 pg/ml) est utilisé à la place du complexe OTA-SAB et qu'une solution titrée de T-2 est utilisée à la place de la solution titrée de OTA; la figure 3 est une courbe d'étalonnage obtenue comme dans le cas de la figure l, à la différence qu'un complexe AFBi-SAB (0,5 pg/ml) est utilisé à la place du complexe OTA-SAB et qu'une solution titrée de AFB est utilisée à la place de la solution titrée de OTA (excepté que la réaction compétitive est conduite pendant 2 heures à la température ambiante et la réaction avec le substrat pendant 30 minutes à la température ambiante dans du méthanol à 50 %, et que l'absorbance est mesurée à 492 nm); la figure 4 est une courbe d'étalonnage obtenue comme dans le cas de la figure 3 (excepté que les réactions compétitives sont conduites pendant 30 minutes à 37 C et la 10 réaction avec le substrat pendant 15 minutes à 37 C dans du méthanol à 50 %) la figure 5 montre des courbes d'étalonnage correspondant respectivement à la dilution de 104 fois des figures 3 et 4, les absorbances étant exprimées en pourcen15 tages; la figure 6 est une courbe d'étalonnage obtenue dans l'Exemple Comparatif 1; la figure 7 est une courbe d'étalonnage obtenue dans l'Exemple Comparatif 2 7 la figure 8 montre des courbes correspondant respectivement aux dilutions de 105 fois et 106 fois de la figure 7, les absorbances étant exprimées en pourcentages; et la figure 9 montre les résultats d'une expérience 25 dans laquelle AFB1 est ajoutée à des graines d'arachide puis récupérée, la référence A désignant des graines d'arachide produites au Japon auxquelles AFB1 n'est pas ajoutée et la référence B désignant des graines d'arachide produites en

Chine auxquelles AFB1 n'est pas ajoutée.

La Demanderesse a tout d'abord tenté de perfectionner la méthode dedosage de mycotoxine en employant une méthode de dosage immunoenzymatique consistant à préparer un anticorps monoclonal hautement spécifique envers une mycotoxine, à faire réagir cet anticorps monoclonal non marqué (immunoglobuline de souris) avec la mycotoxine dans des conditions de réaction compétitive, puis à faire réagir le mélange réactionnel avec un anticorps anti-immunoglobulines de souris marqué à la peroxydase (voir l'Exemple Comparatif 1 donné ci-après). Il en est résulté que la quantité de mycotoxine pouvant être décelée était de l'ordre du ng, et son analyse nécessitait une longue période de temps (par exemple plus de 6 heures environ). Etant donné qu'on devait examiner beaucoup d'aliments pour humains et animaux et que nombre d'entre eux ne pouvaient être conservés pendant de longues périodes de temps, il s'est avéré nécessaire de perfectionner 10 davantage la méthode ci-dessus de telle façon que la mycotoxine présente dans les échantillons à analyser puisse être

dosée simplement et rapidement avec une bonne sensibilité.

Par des recherches approfondies, la Demanderesse a découvert qu'un réactif de dosage de mycotoxine peut être 15 préparé en combinant chimiquement avec une enzyme un anticorps doué d'une haute spécificité envers une mycotoxine (dénommé ci-après l'anticorps anti-mycotoxine), et que les buts de la présente invention peuvent être atteints grâce à

ce réactif.

Des exemples de la mycotoxine à doser selon la présente invention sont des toxines produites par des microorganismes des genres Penicillium, Aspergillus et Fusarium,

telles que l'ochratoxine A, la toxine T-2 et l'aflatoxine B1.

Des enzymes que l'on peut utiliser de préférence pour marquer l'anticorps monoclonal utilisé dans la présente invention comprennent, par exemple, des enzymes des types peroxydase, phosphatase alcaline, e-galactosidase, catalase, glucose-oxydase, acide lactique-oxydase, alcool-oxydase et monoamine-oxydase. Selon la présente invention, une mycotoxine peut être dosée rapidement avec une grande sensibilité dans des conditions de réaction compétitive en utilisant un réactif de dosage de mycotoxine contenant un anticorps monoclonal

marqué par une enzyme.

La méthode de dosage de mycotoxine selon la présente invention peut être mise en oeuvre par un mode opéra-

toire consistant à fixer uhe mycotoxine telle que l'aflatoxine B à un support tel qu'une plaque de titrage immunologique à 96 alvéoles, ajouter ensemble un échantillon à analyser et le réactif de dosage de mycotoxine de l'inven5 tion, ajouter une solution d'un substrat, par exemple un substrat correspondant à l'enzyme utilisée pour marquer l'anticorps, et mesurer l'absorbance de la solution réactionnelle colorée. A l'étape du mode opératoire ci-dessus o l'on ajoute le réactif de dosage de mycotoxine et l'échan10 tillon, il se produit une réaction compétitive entre la mycotoxine fixée et le réactif et entre la mycotoxine présente dans l'échantillon et le réactif, si bien que la quantité de la mycotoxine présente dans l'échantillon peut

être rapidement mesurée avec une grande sensibilité.

Pour la fixation de la mycotoxine, on peut également utiliser d'autres supports tels que des perles de polyéthylène, des perles de polystyrène et des perles de résine ABS. Les Exemples de Référence suivants illustrent la 20 préparation d'un antigène pour dosage de mycotoxine, et la

production et la purification d'un anticorps.

Exemple. de Référence 1 Préparation d'un antigène pour dosage de mycotoxine: On prépare par le mode opératoire suivant un com25 plexe d'une mycotoxine et de sérum-albumine bovine (SAB) à titre d'antigène devant être fixé à une plaque de titrage

immunologique à 96 alvéoles.

(1) On prépare par la méthode suivante un complexe d'ochratoxine A (OTA), produite par un microorganisme du

genre Aspergillus, et de SAB (désigné ci-après par OTA-SAB).

On dissout 5 mg de OTA dans 0,12 ml d'éthanol et 3 ml de phosphate tampon 1M (pH 7,0). On mélange ensuite la solution de OTA avec 50 mg de SAB dissoute dans une solution de chlorure de sodium 0,1M. A ce mélange, on ajoute du chlor35 hydrate de 1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl) carbodiimide (EDPC), et on agite le mélange à l'obscurité à 20 C pendant 24 heures. On dialyse le produit contre de l'eau distillée

et le lyophilise pour obtenir 30 mg de OTA-SAB.

(2) On prépare par la méthode suivante un complexe de toxine T-2 (T-2), produite par un microorganisme du genre Fusarium, et de SAB (désigné ciaprès par T-2-SAB). On fait réagir le groupe hydroxyle de T-2 avec de l'anhydride succinique pour synthétiser l'hémisuccinate de T-2 (HS-T-2). En utilisant HS-T-2, on prépare HS-T-2-SAB de la même manière que pour la préparation de OTA-SAB en (1). 10 (3) On prépare par la méthode suivante un complexe d'aflatoxine B1 (AFB1), produite par un microorganisme du

genre Aspergillus, et de SAB (désigné ci-après par AFB1-SAB).

On dissout 20 mg de AFB1 (un produit de Sigma Co.) dans une petite quantité de méthanol à 60 C environ, et on 15 ajoute 200 mg de chlorhydrate de carbométhoxyamine (un produit de Tokyo Chemical Co., Ltd.) . Tandis que l'on ajuste le pH de la solution à 7 avec NaOH 5N, on soumet la solution à une oximation à une température de 60 à 70 C pendant 2 à 3 heures selon la méthode de Chu [F.S. Chu, M.T.S. Hsia et P. Sun, 1977, Preparation and Characterization of Aflatoxin

B1-O-carbomethyloxime, J. Assoc. Off. Anal. Chem., 60, 791794].

On purifie la AFBl-oxime et on en dissout 10 mg par addition de 1 ml de diméthylformamide. On ajoute 18,0 mg 25 de EDPC à une solution de 25 mg de SAB dans 10 ml de phosphate tampon 0,1M (pH 7,2), et on ajoute goutte à goutte la solution de AFBl-oxime ci-dessus. On ajoute encore 5,2 mg de EDPC à la solution mixte et, tout en ajustant le pH de la solution à 5,5 avec de l'acide chlorhydrique 0,1M, on l'agite pendant 24 heures à la température ambiante en supprimant la lumière. On dialyse le produit contre de l'eau

distillée et le lyophilise pour obtenir 45 mg de AFBi-oxime-SAB.

La préparation ci-dessus repose sensiblement sur la méthode précitée de Chu, et la méthode de Ueno [F.S. Chu 35 et I. Ueno, 1977, Production of antibody against aflatoxin

B1, Appl. Environ. Microbiol., 33, 1125-1128].

Exemple de Référence 2 Production et purification d'anticorps: On produit et purifie des anticorps monoclonaux doués de hautes spécificités envers OTA, T-2 et AFB1 pré5 parés par les méthodes décrites dans les brevets japonais mis à l'Inspection Publique N 171500/1986 et 229899/1986

et dont la Demanderesse s'est rendue propriétaire.

On produit les anticorps monoclonaux en administrant par voie intrapéritonéale 107 cellules provenant d'une 10 lignée cellulaire établie mises en suspension dans du phosphate tampon à des souris BALB/c (mâles âgés de 9 semaines auxquels on a administré 0,5 ml de pristane par voie intrapéritonéale 2 semaines auparavant). On commence à observer un net accroissement du poids corporel des souris en 1 se15 maine environ, et on extrait les ascites 1 à 3 semaines plus tard. Les titres d'anticorps sont de 106 à 108 pour l'anticorps monoclonal anti-OTA, 10 à 106 pour l'anticorps monoclonal anti-T-2 et 10 à 10 pour l'anticorps monoclonal anti-AFB1.

On effectue la purification des anticorps monoclonaux provenant des ascites par le mode opératoire suivant.

On dialyse les ascites contre du tampon Tris-HCl (pH 7,4), et les applique à une colonne de DEAE-cellulose amenée à l'équilibre avec le même tampon. On relargue une fraction qui traverse spontanément la colonne avec du sulfate d'ammonium saturé à 50 %. On dissout le précipité résultant dans du tampon phosphate (pH 7,4) et le dialyse. On détermine que les anticorps monoclonaux résultants dirigés contre OTA, T-2

et AFB1 sont tous de haute pureté par électrophorèse sur 30 plaque de gel en utilisant du polyacrylamide SDS.

Les mycotoxines peuvent être dosées rapidement

avec une grande sensibilité par une méthode (méthode ELISA) utilisant des réactifs de dosage de mycotoxines préparés en marquant par des enzymes les anticorps monoclonaux purifiés 35 dirigés contre OTA, T-2 et AFB1.

La présente invention va être décrite ci-après plus

en détail.

(1) Préparation d'un réactif de dosage de mycotoxine Le marquage de l'anticorps peut être exécuté par diverses méthodes telles qu'une méthode à une seule étape o l'on utilise du glutaraldéhyde [Immunochemistry, 6, 43 (1969)], une méthode à deux étapes o l'on utilise du glutaraldéhyde [Immunochemistry, 8, 1175 (1971)], une méthode par oxydation à l'acide periodique [Methods in Enzymology, 37, 133 (1975)], et une méthode au maléimide [Journal of the

Biochemistry, 78, 235 (1975)]. Ces deux dernières méthodes 10 sont préférées.

Après conjugaison avec l'enzyme, l'anticorps peut être directement utilisé pour ie dosage de mycotoxine. Pour accroître encore la sensibilité, on utilise de préférence comme réactif de dosage de mycotoxine un anticorps marqué par l'enzyme obtenu en purifiant l'anticorps conjugué par filtration sur gel de Sephadex, Sephacryl, etc. La fraction contenant l'anticorps marqué par l'enzyme est utilisée comme réactif de dosage de mycotoxine après avoir été soumise à une dialyse contre du tampon phosphate (pH 7,4) ou du tampon 20 Tris-HCl (pH 7,4) et lyophilisée ou filtrée à travers un filtre stérile dont la taille des pores n'est pas supérieure

à 0,45 Pm.

(2) Dosage d'une mycotoxine Un complexe d'une mycotoxine et d'une protéine de 25 haut poids moléculaire différente de la SAB du complexe mycotoxine-SAB employé comme immunogène pour la production de l'anticorps anti-mycotoxine [par exemple l'hémocyanine de fissurelle (HCF) et l'ovalbumine (OVA)] est utilisé comme antigène (antigène pour la fixation à une plaque de dosage 30 immunologique à fond plat à 96 alvéoles) servant à doser une

mycotoxine produite par un microorganisme du genre Penicillium, Aspergillus ou Fusarium.

Pour doser la mycotoxine, on place le complexe de mycotoxine-protéine de haut poids moléculaire sur la plaque 35 de dosage immunologique à fond plat à 96 alvéoles o il se fixe. On lave les alvéoles traitées par l'antigène et les bloque pour empêcher que l'anticorps anti-mycotoxine ne se lie non spécifiquement aux alvéoles auxquelles n'est pas lié l'antigène. Ensuite, on lave les alvéoles bloquées, et on ajoute des volumes égaux d'un échantillon à analyser (ou d'une mycotoxine en une concentration connue pour la construction d'une courbe d'étalonnage) et du réactif de dosage de mycotoxine décrit en (1) ci-dessus. On laisse la plaque au repos pendant une période donnée de temps. On lave ensuite soigneusement les alvéoles et l'on ajoute une solu10 tion d'un substrat correspondant à l'enzyme utilisée pour marquer l'anticorps dans le réactif de dosage de mycotoxine (contenant une substance qui engendre une couleur lorsque se produit une réaction avec l'enzyme). Après avoir laissé évoluer la réaction avec l'enzyme pendant une période donnée 15 de temps, on mesure l'absorbance de la solution réactionnelle à la longueur d'onde à laquelle la couleur engendrée présente son absorbance maximale. On construit une courbe d'étalonnage sur la base des résultats obtenus en utilisant une concentration connue de la mycotoxine, et la concentra20 tion de la mycotoxine (par exemple OTA, T-2 ou AFB1) dans un échantillon à analyser peut être déterminée d'après la

courbe d'étalonnage.

Les exemples non limitatifs suivants illustrent plus particulièrement la présente invention. 25 EXEMPLE 1 Préparation de réactifs de dosage de mycotoxines: On marque chacun des trois anticorps monoclonaux purifiés dirigés contre OTA, T-2 et AFB1 décrits à l'Exemple de Référence 2 en opérant par la méthode de marquage enzyma30 tique connue décrite cidessous pour préparer des réactifs

de dosage de mycotoxines.

On dissout 7,32 mg de peroxydase de raifort dans 1 ml d'eau distillée et on ajoute 200 pi de periodate de sodium 0,1M. On laisse le mélange au repos à la température ambiante 35 pendant 30 minutes. On dialyse la solution d'enzyme contre

du tampon acétate lmM (pH 4,5) pendant une nuit à 4 C.

On ajoute ensuite 100 pl de tampon carbonate de sodium 0,2M (pH 9,5) pour ajuster le pH du dialysat à 9,5. D'autre part, on dialyse 8,78 mg de chaque anticorps monoclonal (dirigé contre OTA, T-2 ou AFB1) dissous dans du tampon phosphate 0,1M (pH 7,4) contre du tampon carbonate de sodium 0, 01M (pH 9,5) pendant une nuit à 4 C. On mélange la solution de peroxydase et la solution d'anticorps monoclonal résultantes et laisse le mélange au repos à la température ambiante pendant 2,5 heures environ. A la solution réactionnelle, on 10 ajoute 100 à 200 p2 de borohydrure de sodium à 0,4 % et on laisse le mélange au repos à 4 C pendant 2 heures. On dialyse complètement l'anticorps monoclonal marqué par la peroxydase ainsi obtenu contre du tampon phosphate (pH 7,4) à 4 C, et l'utilise comme réactif de dosage de mycotoxine soit tel 15 quel, soit après lyophilisation, pour effectuer un dosage

de mycotoxine.

EXEMPLE 2

Dosage de OTA produite par un microorganisme du genre Aspergillus: On introduit OTA-SAB à 20 pg/ml dans une plaque de dosage immunologique à fond plat à 96 alvéoles (fabriquée par Nunc) à raison de 100 pi par alvéole, et l'abandonne pendant une nuit à 4 C pour qu'il se fixe. On lave deux fois la plaque avec une solution de lavage (tampon phosphate ayant 25 un pH de 7,4 et contenant 0,1 % de Tween 20). Pour empêcher une adsorption non spécifique de l'anticorps sur la plaque, on laisse la plaque au repos à la température ambiante pendant 30 minutes dans la même solution de lavage que ci-dessus mais contenant 10 % de sérum de boeuf. On lave ensuite 30 deux fois la plaque avec la solution de lavage. Ensuite, on ajoute simultanément à chacune des alvéoles 50 piú du réactif de dosage de mycotoxine dilué avec la même solution de lavage

3 4 4 5

que ci-dessus (respectivement à 103, 3 x 104, 6 x 104, 105, et 10 fois) et 50 pi d'une solution titrée de OTA (0 pg 35 à 5 pg/50 pi) préparée en utilisant la même solution de lavage

que ci-dessus, et on laisse la plaque au repos à la tempéra-

ture ambiante pendant 30 minutes (dans le cas de la construction d'une courbe d'étalonnage). On lave quatre fois la plaque avec la solution de lavage, et on ajoute une solution de substrat (préparée en dissolvant 20 mg de o-phénylène5 diamine et 10 pi de H202 à 35 % dans 50 ml de tampon citrate ayant un pH de 5,0) à raison de 100 pi par alvéole. On met la plaque à l'abri de la lumière au moyen d'une feuille d'aluminium et la laisse au repos à la température ambiante pendant 30 minutes. Finalement, on ajoute de l'acide sulfurique 10 2N à raison de 50 pi par alvéole pour arrêter la réaction enzymatique. Après avoir arrêté la réaction enzymatique, on mesure l'absorbance à 500 nm de la solution réactionnelle en utilisant un photomètre pour microplaque. Les résultats sont représentés sur la figure 1 des dessins annexés. 15 Le réactif de dosage de mycotoxine dilué de 3 x 104 fois

permet de doser avec une sensibilité de quelques pg.

On examine un échantillon à analyser (50 pi d'une solution de SAB à 0,1 % contenant, d'après calcul, 50 pg de OTA) en utilisant 50 pi de réactif de dosage de mycotoxine 20 dilué de 3 x 104 fois. La quantité mesurée de OTA est de

52 pg, ce qui coincide presque avec la quantité calculée.

La durée du dosage est aussi courte qu'environ

1 heure.

EXEMPLE 3

Dosage de T-2 produite par un microorganisme du genre Fusarium: On introduit du HS-T-2-SAB à 20 pg/ml dans une plaque de dosage immunologique à fond plat à 96 alvéoles (fabriquée par Nunc) à raison de 100 vi par alvéole, et on -30 laisse la plaque au repos pendant une nuit à 4 C pour que l'antigène se fixe. On lave deux fois la plaque avec une solution de lavage (tampon phosphate, pH 7,4, contenant 0,1 % de Tween 20) et, pour empêcher l'adsorption non spécifique de l'anticorps sur la plaque, on laisse la plaque au 35 repos pendant 30 minutes-à la température ambiante dans la même solution de lavage que ci-dessus mais contenant 10 % de sérum de boeuf. On lave ensuite deux fois la plaque avec la même solution de lavage que ci-dessus, et on ajoute en même temps à chacune des alvéoles 50 pú du réactif de dosage de mycotoxine dilué avec la même solution de lavage que ci2 3 3 44 dessus (respectivement de 102, 103, 2 x 103, 104, 2 x 104 et 105 fois) et 50 pi d'une solution titrée de T-2 (O pg à pg/50 piú) préparée en utilisant la même solution de lavage que ci-dessus. On laisse ensuite la plaque au repos à la température ambiante pendant 30 minutes (dans le cas de la cons10 truction d'une courbe d'étalonnage). On lave la plaque encore quatre fois avec la même solution de lavage que ci-dessus, et on ajoute à raison de 100 pi par alvéole une solution de substrat (préparée en dissolvant 20 mg de o-phénylènediamine et 10 pú de H202 à 35 % dans 50 ml de tampon citrate 0,1M ayant un pH de 5,0). On met la plaque à l'abri de la lumière au moyen d'une feuille d'aluminium et la laisse au repos à la température ambiante pendant 30 minutes. Finalement, on ajoute de l'acide sulfurique 2N à raison de 50 pi paralvéole pour arrêter la réaction enzymatique. Après l'arrêt de la réaction enzymatique, on mesure l'absorbance à 500 nm de la solution réactionnelle en utilisant un photomètre pour microplaque. Les résultats sont représentés sur la figure 2. Le réactif de dosage de mycotoxine dilué de 2 x 104 permet le

dosage jusqu'à quelques pg avec une grande sensibilité.

On examine un échantillon à analyser (50 pi d'une solution à 0,1 % de SAB contenant, d'après calcul, 50 pg de T-2) selon la méthode décrite cidessus à l'Exemple 3 en utilisant 50 pi du réactif de dosage de mycotoxine dilué de

2 x 104 fois. La quantité mesurée de T-2 est de 47 pg, ce 30 qui coincide presque avec la valeur calculée.

La durée de mesure est aussi courte qu'environ

1 heure.

EXEMPLE 4

Dosage de AFB1 produite par un microorganisme du genre 35 Aspergillus: On introduit du AFB 1-SAB à 0,5 pg/ml dans une plaque de dosage immunologique à fond plat à 96 alvéoles (fabriquée par Nunc) à raison de 100 pú par alvéole, et on laisse la plaque au repos pendant une nuit à 4 C pour que l'antigène se fixe. On lave la plaque deux fois avec une solution de lavage (tampon phosphate, pH 7,4, contenant 0,05 % de Tween- 20) et, pour empêcher une adsorption non spécifique de l'anticorps sur la plaque, on laisse la plaque au repos à la température ambiante pendant 30 minutes dans la même solution de lavage que ci-dessus mais contenant 10 %

de sérum de boeuf.

On lave ensuite la plaque deux fois avec la même solution de lavage que ci-dessus, et on ajoute simulténament à chaque alvéole 50 Pi du réactif de dosage d'aflatoxine B 2 5 1o (dilué de 102 à 105fois) et 50 Pú d'une solution titrée de AFB1 (0 pg à 5 ng/50 ui) préparée en utilisant une solution d'ex15 traction pour l'analyse de toxines dans les engrais et aliments pour humains et animaux (par exemple une solution aqueuse de méthanol à 50 %). On laisse la plaque au repos pendant 30 minutes à 37 C ou pendant 2 heures à la température ambiante (dans le cas de la construction d'une courbe 20 d'étalonnage). On lave la plaque quatre fois avec la même solution de lavage que ci-dessus, et on ajoute à raison de pi. par alvéole une solution de substrat (préparée en dissolvant 20 mg de o-phénylènediamine et 10 pú de H202 à % dans 50 ml de tampon citrate 0,1M ayant un pH de 5,0). 25 On met la plaque à l'abri de la lumière et la laisse au repos pendant 15 minutes à 37 C, ou pendant 30 minutes à la température ambiante. Finalement, on ajoute de l'acide sulfurique 2N à raison de 50 pú par alvéole pour arrêter la réaction

enzymatique. On mesure l'absorbance de la solution réaction30 nelle à 492 nm en utilisant un photomètre pour microplaque.

Les résultats sont représentés sur les figures 3 et 4. AFB peut être dosée jusqu'à 6,9 pg/dosage ou moins avec une grande sensibilité et la durée du dosage est aussi courte

que 1 heure. La figure 5 montre des courbes d'étalonnage construites en représentant

graphiquement les absorbances (expri-

mées en pourcentage) obtenues par des réactions compétitives

(pendant 2 heures à la température ambiante, et pendant 30 minutes à 37 C) en utilisant le réactif de dosage de mycotoxine dilué de 104 fois.

EXEMPLE COMPARATIF 1

Dosage de OTA produite par un microorganisme du genre Aspergillus: On introduit du OTA-SAB à 20 pg/ml dans une plaque de microtitrage à fond plat à 96 alvéoles à raison de 100 10 par alvéole, et on laisse la plaque au repos pendant une nuit à 4 C pour que l'antigène se fixe. On lave la plaque deux fois avec une solution de lavage et, pour empêcher une adsorption non spécifique de l'anticorps sur la plaque, on laisse la plaque au repos pendant 30 minutes à la température 15 ambiante dans une solution de lavage contenant 10 % de sérum de boeuf. On lave ensuite la plaque deux fois avec une solution de lavage, et on ajoute simultanément à chacune des alvéoles 50 pi d'une solution d'anticorps monoclonal antimycotoxine doué d'une haute spécificité (respectivement di2 3 4 5 5 6 6 7 luée de 102 103 104 105, 5 x 105, 10, 5 x 10, 10 et 108 fois) et 50 Pi d'une solution titrée de OTA (0 pg à pg/50 pi) préparée en utilisant la même solution de lavage. On laisse la plaque au repos pendant 30 minutes à la température ambiante (dans le cas de la construction d'une courbe 25 d'étalonnage). On lave la plaque trois fois avec la solution de lavage, et on ajoute à raison de 100 pi par alvéole un anticorps antiimmunoglobuline de souris marqué à la peroxydase (dilué de 103 fois avec une solution de dilution contenant 10 % de sérum de boeuf). On laisse la plaque au repos pendant 2 heures à la température ambiante et la lave quatre fois avec la solution de lavage. On ajoute à raison de 100 pi par alvéole une solution de substrat (préparée en dissolvant mg de ophénylènediamine et 10 pl de H202 à 35 % dans ml de tampon citrage 0,1M). On met la plaque à l'abri de 35 la lumière au moyen d'une feuille d'aluminium et la laisse

au repos pendant 30 minutes à la température ambiante. Fina-

lement, on ajoute de l'acide sulfurique 2N à raison de 50 pú par alvéole pour arrêter la réaction enzymatique. Après l'arrêt de la réaction enzymatique, on mesure l'absorbance

de la solution réactionnelle à 500 nm en utilisant un photo5 mètre pour microplaque. Les résultats sont représentés sur la figure 6.

Lorsqu'on utilise comme ci-dessus l'anticorps monoclonal anti-mycotoxine non marqué dans le dosage immunologique, OTA ne peut être décelé qu'en une quantité de quel10 ques ng en utilisant l'anticorps monoclonal anti- OTA dilué de 106 fois et en mettant environ 6 heures pour effectuer

le dosage.

EXEMPLE COMPARATIF 2

Dosage de AFB1 produite par un microorganisme du genre 15 Aspergillus: On introduit du AFB1-SAB à 0,5 pg/ml dans une plaque de microtitrage à fond plat à 96 alvéoles à raison de 100 pi par alvéole, et on laisse la plaque au repos pendant une nuit à 4 C pour que l'antigène se fixe. On lave la 20 plaque deux fois avec une solution de lavage et, pour empêcher une adsorption non spécifique de l'anticorps sur la plaque, on laisse la plaque au repos pendant 30 minutes à la température ambiante dans une solution de lavage contenant % de sérum de boeuf. On lave ensuite la plaque deux fois 25 avec une solution de lavage, et on ajoute simultanément à chacune des alvéoles 50 Pú d'une solution d'anticorps monoclonal anti-AFB. doué d'une haute spécificité (respectivement

3 4 5 5

diluée de 10, 10-, 10, 5 x 105, 106 et 107 fois) et 50 pi d'une solution titrée de AFB1 (0 pg à 5 pg/50 pi) préparée 30 en utilisant une solution d'extraction pour l'analyse des toxines dans les engrais et aliments pour humains et animaux (par exemple une solution aqueuse de méthanol à 50 %). On laisse la plaque au repos pendant 2 heures à la température ambiante (dans le cas de la construction d'une courbe d'éta35 lonnage). On lave la plaque quatre fois avec la solution de

lavage, et on ajoute à raison de 100 pi par alvéole un anti-

corps anti-immunoglobuline de souris marqué à la peroxydase (dilué de 103 fois avec une solution de dilution contenant 10 % de sérum de boeuf). On laisse la plaque au repos pendant 2 heures à la température ambiante et la lave quatre fois avec la solution de lavage. On ajoute à raison de 100 pú par alvéole une solution de substrat (préparée en dissolvant mg de ophénylènediamine et 10 pi de H202 à 35 % dans ml de tampon citrate 0,lM ayant un pH de 5,0). On met la plaque à l'abri de la lumière et la laisse au repos pendant 10 30 minutes à la température ambiante. Finalement, on ajoute de l'acide sulfurique 2N à raison de 50 pi par alvéole pour arrêter la réaction enzymatique. Après l'arrêt de la réaction enzymatique, on mesure l'absorbance de la solution

réactionnelle à 492 nm en utilisant un photomètre pour micro15 plaque. Les résultats sont représentés sur la figure 7.

Lorsque les absorbances sont exprimées en pourcentage, comme à l'Exemple 4, les courbes d'étalonnage sont telles que représentées sur la figure 8.

Lorsqu'on utilise comme ci-dessus l'anticorps monoclonal anti-AFB1 non marqué dans le dosage immunologique, AFB1 ne peut être décelée qu'en une quantité de plusieurs centaines de pg/dosage en utilisant l'anticorps monoclonal dirigé contre AFB1 dilué de 105 fois et en mettant environ 6 heures pour effectuer le dosage. 25 EXEMPLE 5 Addition de AFB1 à des graines d'arachides et sa récupération à partir de ces graines: Par la méthode de l'Exemple 4, on ajoute AFB à

des graines d'arachides et l'en récupère.

On utilise comme échantillons des graines d'arachide

produites au Japon et des graines d'arachide produites en Chine.

On pulvérise les graines d'arachide au moyen d'un homogénéisateur après en avoir retiré les cosses. On recueille les particules qui traversent un tamis ayant une ouverture de 35 maille de 1 mm. On imprègne chacun de ces échantillons de

graines d'arachide en poudre avec 25 pi d'une solution métha-

nolique titrée de AFB1 (11,1 ug/ml). On ajoute 25 ml d'une solution aqueuse de méthanol à 50 % à l'échantillon imprégné et on mélange le tout pendant 3 minutes au moyen d'un mélangeur pour substances biologiques. On filtre ensuite le mélange à travers un papier-filtre Toyo N 1 ou un papierfiltre Whatman N 4 ou un papier-filtre équivalent. On examine conformément à l'Exemple 4 le filtrat et un échantillon ne contenant pas AFB1, et les résultats sont représentés sur

la figure 9.

A l'extrait dans le méthanol à 50 % obtenu, on ajoute AFB1 en une concentration de 11,1 milliardièmes (556 pg/dosage). Les quantités mesurées de AFB1 dans ces

échantillons sont de 573 pg/dosage et de 625 g/dosage, sur la-base de quoi on calcule que les taux de récupération sont 15 respectivement de 92 % et 96 %.

Comme établi ci-dessus, la présente invention se caractérise en ce que la mycotoxine est fixée à un support tel qu'une plaque de dosage immunologique et en ce que les réactions compétitives de l'anticorps monoclonal avec la 20 mycotoxine présente dans un échantillon et la mycotoxine fixée au support sont exécutées en ajoutant en même temps l'échantillon à analyser et le réactif de dosage de mycotoxine. Ainsi,.la méthode de la présente invention permet de doser la mycotoxine plus facilement avec une plus grande 25 sensibilité et en une plus courte période de temps que les méthodes classiques de dosage. La méthode de la présente invention est également meilleure aux plans de la sécurité

et de l'économie.

Claims (8)

REVENDICATIONS

1. Réactif de dosage de mycotoxine, caractérisé en ce qu'il comprend un anticorps monoclonal marqué par une

enzyme dirigé contre la mycotoxine.

2. Réactif selon la revendication 1, caractérisé

en ce que l'enzyme marquant l'anticorps monoclonal est choisie parmi les enzymes des types peroxydase, phosphatase alcaline, e-galactosidase, catalase, glucose-oxydase, acide lactique-oxydase, alcool-oxydase et monoamine-oxydase.

3. Réactif selon la revendication l, caractérisé en ce que la mycotoxine est produite par un microorganisme

du genre Penicillium, Aspergillus ou Fusarium.

4. Réactif selon la revendication 1, caractérisé

en ce que la mycotoxine est l'ochratoxine A, la toxine T-2 15 ou l'aflatoxine B1.

5. Méthode pour doser une mycotoxine, caractérisée en ce qu'elle consiste à doser la mycotoxine dans des conditions de réactions compétitives en utilisant un anticorps monoclonal marqué par une enzyme dirigé contre la mycotoxine. 20

6. Méthode selon la revendication 5, caractérisée

en ce que l'enzyme marquant l'anticorps monoclonal est choisie parmi les enzymes des types peroxydase, phoAphatase alcaline, B-galactosidase, catalase, glucose-oxydase, acide lactique-oxydase, alcool-oxydase et monoamine-oxydase.

7. Méthode selon la revendication 5, caractérisée en ce que la mycotoxine est produite par un microorganisme

du genre Penicillium, Aspergillus ou Fusarium.

8. Méthode selon la revendication 5, caractérisée

en ce que la mycotoxine est l'ochratoxine A, la toxine T-2 30 ou l'aflatoxine B1.