FR2587720A2 - VACCINE AGAINST ACQUIRED IMMUNODEFICIENT SYNDROME AND IMMUNOGENIC INTERMEDIATES FOR THE PREPARATION OF THIS VACCINE AND IMMUNOLOGICAL ASSAYS FOR THE DETECTION OF THIS SYNDROME - Google Patents
VACCINE AGAINST ACQUIRED IMMUNODEFICIENT SYNDROME AND IMMUNOGENIC INTERMEDIATES FOR THE PREPARATION OF THIS VACCINE AND IMMUNOLOGICAL ASSAYS FOR THE DETECTION OF THIS SYNDROME Download PDFInfo
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Abstract
VACCIN CONTRE LE SYNDROME IMMUNODEFICITAIRE ACQUIS ET INTERMEDIAIRES POUR LA PREPARATION DE CE VACCIN. L'INVENTION CONCERNE DES VIRUS RECOMBINANTS QUI DIRIGENT L'EXPRESSION DE PEPTIDES OU PROTEINES APPARENTES A DES EPITOPES DU VIRUS DE L'ADENOPATHIE (LAV) ET VIRUS DE LA LEUCEMIE A LYMPHOCYTES T-HUMAINS (HTLV III), QUI EST L'AGENT RESPONSABLE DU SYNDROME IMMUNODEFICITAIRE ACQUIS (SIDA). ON PEUT FORMULER CES VIRUS SOUS FORME DE VACCINS A VIRUS VIVANTS OU INACTIVES OU DANS DES VACCINS MULTIVALENTS POUR LA PROTECTION CONTRE UNE INFECTION DUE A LAVHTLV III. ON DECRIT EGALEMENT DES PEPTIDES ET PROTEINES APPARENTES A DES EPITOPES DE CE VIRUS, ET LEUR PREPARATION. APPLICATION : VACCINS ET DOSAGES DE DEPISTAGE DU SYNDROME.ACQUIRED AND INTERMEDIATE IMMUNODEFICITARY SYNDROME VACCINE FOR THE PREPARATION OF THIS VACCINE. THE INVENTION CONCERNS RECOMBINANT VIRUSES WHICH DIRECT THE EXPRESSION OF PEPTIDES OR PROTEINS RELATED TO EPITOPES OF THE ADENOPATHY VIRUS (LAV) AND T-HUMAN LYMPHOCYTE LEUKEMIA (HTLV III) VIRUS, RESPONSIBLE FOR THE AGENT ACQUIRED IMMUNODEFICITARY SYNDROME (AIDS). THESE VIRUSES MAY BE FORMULATED AS LIVE OR INACTIVE VIRUS VACCINES OR MULTIVALENT VACCINES FOR PROTECTION AGAINST LAVHTLV III INFECTION. PEPTIDES AND PROTEINS RELATED TO EPITOPES OF THIS VIRUS, AND THEIR PREPARATION, ARE ALSO DESCRIBED. APPLICATION: VACCINES AND SYNDROME TESTING ASSAYS.
Description
La présente invention concerne des perfectionnementsThe present invention relates to improvements
et compléments apportés à la préparation, décrite dans le bre- and supplements made to the preparation, described in the
vet principal, de vaccins contre le syndrome immunodéficitaire acquis 'SIDA), ainsi que des vaccins obtenus et, également, des divers intermédiaires servant à cette obtention. Ainsi, la présente invention concerne des virus qui expriment des peptides et protéines apparentés A des épitopes du virus associé à l'adénopathie L Lymphadenopathy Associated Virus (LAV)] /virus de la leucémie des cellules T humaines vaccine, acquired vaccines and, also, the various intermediates used to obtain them. Thus, the present invention relates to viruses which express peptides and proteins related to L-associated lymphadenopathy associated virus (LAV) virus epitopes / human T-cell leukemia virus.
[Human T-Cell Leukemia Virus (HTLV-III)), l'agent étiologi- [Human T-Cell Leukemia Virus (HTLV-III)), the etiologi-
que du syndrome d'adénopathie C Lymphadenopathy Syndrome (LAS) 2 et du syndrome immunodéficitaire acquis (SIDA); L Acqui'red Immune Deficiency Syndrome (AIDS)J. Les virus only Lymphadenopathy Syndrome (LAS) 2 and Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS); Acquired Immune Deficiency Syndrome (AIDS) J. Viruses
de la présente invention qui expriment des peptides appa- of the present invention which express peptides
rentés à LAV/HTLV-III induisant une réponse d'immuno-protec- to LAV / HTLV-III inducing an immuno-protective response
tion peuvent servir d'immunogènes dans des formulations de vaccins A base de virus pour le syndrome d'adénopathie (LAS) may be used as immunogens in virus-based vaccine formulations for adenopathy syndrome (LAS)
ou le SIDA ou dans des formulations de vaccins multivalents. or AIDS or in multivalent vaccine formulations.
En fait, les virus infectieux de la présente invention, qui peuvent se multiplier dans un hôte sans provoquer de maladie, peuvent servir dans des formulations de vaccins à base de In fact, the infectious viruses of the present invention, which can multiply in a host without causing disease, can be used in vaccine-based vaccine formulations.
virus vivants qui procurent une stimulation immunogène pro- live viruses that provide immunogenic stimulation
longée et peuvent donner naissance à une forte immunité. and can give rise to strong immunity.
La présente invention vise également des peptides The present invention also relates to peptides
et protéines apparentés à des épitopes de LAV/HTLV III, pou- and proteins related to epitopes of LAV / HTLV III,
vant servir d'immunogènes dans des formulations de vaccins - sous-unité(s) pour LAS ou le SIDA, ou dans des formulations de vaccins multivalents, ou comme antigènes dans des dosages immunologiques pour le diagnostic de LAS ou du SIDA. Ces pestides et protéines peuvent être produits en utilisant des as immunogens in vaccine formulations - subunits for LAS or AIDS, or in multivalent vaccine formulations, or as antigens in immunoassays for the diagnosis of LAS or AIDS. These pestides and proteins can be produced using
techniques mettant en oeuvre de l'ADN recombinant dans n'im- techniques using recombinant DNA in any
porte quel système vecteur-hôte, ou bien ils peuvent être synthétisés par des méthodes chimiques. Donc, l'invention vise aussi la construction de nouvelles séquences de ADN et de vecteurs comprenant de l'ADN de plasmide, et de l'ADN viral comme des virus infectant les êtres humains, des virus infectant les animaux, des virus infectant les insectes ou des bactériophages pouvant servir pour diriger l'expression de peptides et protéines apparentés à LVA/HTLV dans des cellules d'un hôte approprié à Dartir desquelles on peut purifier les peptides et protéines. Des méthodes chimiques pour la synthèse de peptides et protéines apparentés à LAV/HTLV III sont également décrites. Dans une forme spécifique de mise en oeuvre de la which vector-host system, or they can be synthesized by chemical methods. Thus, the invention is also directed to the construction of novel DNA and vector sequences comprising plasmid DNA, and viral DNA such as viruses infecting humans, viruses infecting animals, viruses infecting insects. or bacteriophages that can be used to direct the expression of LVA / HTLV-related peptides and proteins in cells of a suitable host from which peptides and proteins can be purified. Chemical methods for the synthesis of peptides and proteins related to LAV / HTLV III are also described. In a specific form of implementation of the
présente invention, on a utilisé desvirus de vaccine recom- the present invention, vaccinia viruses have been
binants pour produire des protéines apparentées a l'enveloppe ou à la partie centrale (noyau) de LAV/HTLV III. Pour cela, on a inséré des séquences d'ADN d'enveloppe ou de gaq codant pour les glycoprotéines de l'enveloppe binders to produce proteins related to the envelope or core (core) of LAV / HTLV III. For this purpose, envelope or gaq DNA sequences coding for the glycoproteins of the envelope have been inserted.
ou les protéines de structure de noyau de LAV/HTLV III, res- or the core structure proteins of LAV / HTLV III,
pectivement, dans des vecteurs de vaccine capables de diriger in vaccinia vectors capable of directing
l'expression des gènes de LAV/HTLV III dans un hôte approprié. the expression of the LAV / HTLV III genes in a suitable host.
On a trouvé que les protéines apparentêes à l'enveloppe de LAV/HTLV III, oroduites par lesvirus de vaccine recombinants, sont antigéniques et immunogênes et capables de susciter chez des primates sub-humains une immunité a médiation humorale et cellulaire. Les protéines apparentées à gag de LAV/HTLV III, The LAV / HTLV III envelope-related proteins, oroduced by recombinant vaccinia viruses, have been found to be antigenic and immunogenic and capable of eliciting humoral and cell-mediated immunity in subhuman primates. Gag-related proteins of LAV / HTLV III,
produites par le virus.de vaccine recombinant, sont des pro- produced by the recombinant vaccinia virus, are
téines immunoréactives qui contiennent les épitopes majeurs immunoreactive proteins that contain major epitopes
des authentiques protéines de noyau. authentic core proteins.
Les virus de vaccine recombinants, qui expriment Recombinant vaccinia viruses, which express
les protéines apparentées à l'enveloppe de LAV/HTLV III, peu- proteins related to the envelope of LAV / HTLV III, may
vent servir isolément ou de concert avec les recombinants de vaccine qui expriment d'autres protéines apparentées à LAV/HTLV III (comme les protéines de structure de noyau) dans des formulations de vaccins à base de virus. En variante, les protéines apparentées à LAV/HTL7 III, produites par les virus recombinants, peuvent être purifiées ou chimiquement synthétisées, et utilisées à titre d'immunogènes dans des formulations de vaccins à sous-unitéfs). Puisque la ou les glycoprotéines apparentées à LAV/HTLV III risquent d'être reconnues comme "étrangères" dans l'hôte animal, une réponse immunitaire à médiation humorale et/ou cellulaire va être déclenchée contre cette protéine ou cette combinaison de protéines. Dans une formulation de vaccin préparée de manière appropriée, cela doit protéger l'hôte contre des infections can be used alone or in concert with vaccinia recombinants that express other LAV / HTLV III related proteins (such as core structure proteins) in virus-based vaccine formulations. Alternatively, LAV / HTL7 III related proteins, produced by recombinant viruses, can be purified or chemically synthesized, and used as immunogens in subunit vaccine formulations). Since the LAV / HTLV III-related glycoprotein (s) may be recognized as "foreign" in the animal host, a humoral and / or cell-mediated immune response will be elicited against that protein or combination of proteins. In an appropriately prepared vaccine formulation, this must protect the host against infections
subséquentes Dar LAV/HTLV III.subsequent Dar LAV / HTLV III.
Dans une autre forme spécifique de réalisation de la pré- In another specific embodiment of the present invention,
sente invention, on a utilisé des bacculovirus recombinants (Autographa Californica, virus de polyédrose nucléaire ou ANCPV) pour produire des protéines apparentées à l'enveloppe et au noyau de LAV/HTLV III. Pour cela, on a inséré des séquences de ADN d'enveloppe ou de gag, qui codent pour des protéines de structure d'enveloppe ou de noyau, respectivement, dans des vecteurs du type bacculovirus qui sont capables de diriger l'expression des gènes de LAV/HTLV III dans un hôte approprié. On a trouvé que les protéines de LAV/HTLV III, In this invention, recombinant bacculoviruses (Autographa Californica, nuclear polyhedrosis virus, or ANCPV) have been used to produce LAV / HTLV III-related envelope and core proteins. For this purpose, envelope or gag DNA sequences, which encode envelope or core structural proteins, respectively, have been inserted into bacculovirus-type vectors which are capable of directing the expression of the LAV / HTLV III in a suitable host. It has been found that the proteins of LAV / HTLV III,
produites par les bacculovirus recombinants, sont antigéni- produced by recombinant bacculoviruses, are antigenically
ques, d'après la mesure faite par radioimmunoprécipitation according to the measurement made by radioimmunoprecipitation
et ELISA.and ELISA.
La présente invention prévoit également la produc- The present invention also provides for the production of
tion d'antigènes de LAV/HTLV III, qui ont une importance générale en médecine humaine. Cela comprend l'utilisation des peptides et protéines de la présente invention comme réactifs dans des dosages immunologiques comme les essais antigens of LAV / HTLV III, which are of general importance in human medicine. This includes the use of the peptides and proteins of the present invention as reagents in immunoassays such as assays
de dosage immunoenzymatique et ELISA (Enzyme linked immuno- Immunoassay and ELISA (Enzyme linked immuno-
sorbent assay) et les dosages radioimmuologiques qui sont utiles comme des outils diagnostiques pour la détection d'anticorps spécifiques de LAV/HTLV.dans les échantillons de sang, les fluides corporels, les tissus, etc. En outre, sorbent assay) and radioimmune assays that are useful as diagnostic tools for the detection of LAV / HTLV specific antibodies in blood samples, body fluids, tissues, etc. In addition,
ce réactif sera un outil intéressant pour élucider le méca- this reagent will be an interesting tool to elucidate the
nisme de la pathogénèse de LAV/HTLV III. pathogenesis of LAV / HTLV III.
Le SIDA (Syndrome ImmunoDéficitaire Acquis) est une maladie caractérisée par une déficience immunitaire grave due principalement à des troubles de la réponse immunitaire à médiation cellulaire du patient (M. Gottlieb et col., 1981, AIDS (Acquired Immunodeficiency Syndrome) is a disease characterized by severe immune deficiency mainly due to disorders of the patient's cell-mediated immune response (M. Gottlieb et al., 1981,
N. Engl. J. Med. 305:1425; J Masur et col., 1981, N. Engl. N. Engl. J. Med. 305 1425; J Masur et al., 1981, N. Engl.
J. Med. 305:431). Deux présentations cliniques de la maladie sont reconnues: (a) une phase de prodrome, appelée syndrome J. Med. 305: 431). Two clinical presentations of the disease are recognized: (a) a prodrome phase, called
d'adénopathie Lymphadenopathy Syndrome (LAS) 7, caracté- Adenopathy Lymphadenopathy Syndrome (LAS) 7,
risée par une adénopathie chronique, de la leucopénie et une diminution quantitative des cellules auxiliaires du sang périphérique (cellules OKT4) , conduisant à une inversion du chronic lymph nodes, leukopenia and a quantitative decrease in peripheral blood helper cells (OKT4 cells), leading to a reversal of
rapport normal entre les lymphocytes auxiliaires et les lym- normal ratio of helper lymphocytes to lymphocytes
phocytes T suppresseurs (OKT4:OKT8),qui se déplace de 2 vers 0,1 ou moins a mesure que la maladie progresse; et (b) un état immunodéficitaire caractérisé par une diminution des cellules OKT4 et l'inversion du rapport normal OKT4:OKT8, la lymphopénie absolue, et des infections répétitives dues principalement à Pneumocystis carnii; cette dernière phase T suppressor cells (OKT4: OKT8), which moves from 2 to 0.1 or less as the disease progresses; and (b) an immunodeficiency state characterized by a decrease in OKT4 cells and reversal of normal OKT4: OKT8 ratio, absolute lymphopenia, and repetitive infections mainly due to Pneumocystis carnii; this last phase
est finalement associée à la mort dans la majorité des cas. is ultimately associated with death in the majority of cases.
Certains sous-groupes de patients présentent une incidence accrue de lymphome et de sarcome de Kaposi. Il n'existe actuellement pas de traitement ni de thérapie pour cette maladie. Some subgroups of patients have an increased incidence of lymphoma and Kaposi's sarcoma. There is currently no treatment or therapy for this disease.
Les données épidémiologiques ainsi que les rensei- Epidemiological data and information
gnements concernant les types de patients qui on-t contracté la maladie suggèrent qu'un agent infectieux transmis par contact intime pourrait être la cause de la maladie. Par la suite, trois groupes de chercheurs ont présenté de fortes preuves indiquant que l'agent provoquant le SIDA est un The types of patients who have contracted the disease suggest that an infectious agent transmitted through intimate contact may be the cause of the disease. Subsequently, three groups of researchers presented strong evidence that the agent causing AIDS is a
rétrovirus présentant un tropisme le dirigeant vers les lym- retrovirus with a tropism directing it towards the
phocytes T auxiliaires. Ces groupes sont: (a) R.C. Gallo et ses collaborateurs au National Institute of Health ont pu isoler un rétrovirus cytopathe helper T cells. These groups are: (a) R.C. Gallo and colleagues at the National Institute of Health have been able to isolate a cytopathic retrovirus
(HTLV III) sur des patients présentant le SIDA et du pré- (HTLV III) on patients with AIDS and pre-existing
SIDA (R.C. Gallo et col., 1984, Science 224:500; M. Popovic et col., 1984 (Science 224:497). Ils ont aussi décelé des anticorps contre HTLV III dans le sérum de patients atteints AIDS (R.C. Gallo et al., 1984, Science 224: 500, M. Popovic et al., 1984 (Science 224: 497).) They also detected antibodies against HTLV III in the serum of patients with AIDS.
de SIDA.of AIDS.
(b) L. Montagnier et ses.collaborateurs ont isolé à l'Institut Pasteur un rétrovirus lymphotrope (LAV/HTLV III) - - - sur un---patient-qui présentait une adénopathie cervicale et présentait aussi un risque de SIDA (Barre-Sinoussi, F. et col., 1983, Science 220:868). Ce groupe a pu aussi montrer l'existence d'anticorps contre LAV/HTLV III dans du sérum provenant de patients atteints de SIDA (V.S. Kalyansraman et col., 1984, Science 225:321). En outre, ils ont pu isoler LAV/HTLV III à partir des lymphocytes d'un patient qui avait développé du SIDA apres avoir reçu du sang d'un donneur atteint de SIDA (b) L. Montagnier and his collaborators isolated at the Institut Pasteur a lymphotropic retrovirus (LAV / HTLV III) - - - on a patient - who had cervical lymphadenopathy and also presented a risk of AIDS (Barre -Sinoussi, F. et al., 1983, Science 220: 868). This group could also show the existence of antibodies against LAV / HTLV III in serum from AIDS patients (V. S. Kalyansraman et al., 1984, Science 225: 321). In addition, they were able to isolate LAV / HTLV III from the lymphocytes of a patient who developed AIDS after receiving blood from a donor with AIDS.
(P.M. Feorino et col., 1984, Science 225:69). (M. M. Feorino et al., 1984, Science 225: 69).
(c) J. Levy et ses collaborateurs ont isolé des rétrovirus infectieux (appelés rétrovirus associés au SIDA (AIDS-associated retrovirus, ou ARV) à partir des cellules mononucléaires périphériques de patients présentant le SIDA (c) J. Levy and colleagues isolated infectious retroviruses (so-called AIDS-associated retroviruses (ARVs) from peripheral mononuclear cells of patients with AIDS
(J.A. Levy et col., 1984, Science 225:840). (J.A. Levy et al., 1984, Science 225: 840).
Ces trois virus ont tous été isolés indépendamment, mais ils appartiennent probablement tous au même sous-groupe des rétrovirus (J.A. Levy et col., 1984, Science 225:840) These three viruses have all been isolated independently, but probably all belong to the same subgroup of retroviruses (J. A. Levy et al., 1984, Science 225: 840).
et ils seront collectivement appelés ici LAV/HTLV III. and they will collectively be called LAV / HTLV III here.
La structure générale des rétrovirus est celle d'un The general structure of retroviruses is that of a
noyau de ribonucléoprotéines entouré par une enveloppe conte- nucleus of ribonucleoproteins surrounded by an envelope containing
nant des lipides que le virus acquiert au cours du bourgeon- lipid that the virus acquires in the course of the bud
nement cellulaire. Les glycoprotéines à codage viral sont cell. Virally encoded glycoproteins are
enfouies au sein de l'enveloppe et font saillie vers l'exté- buried in the envelope and protrude outwards.
rieur. Elles déterminent les virus connus de l'hôte et réa- laughing. They determine the viruses known to the host and
gissent avec des récepteurs spécifiques situés à la surface lie with specific receptors on the surface
de cellules sensibles. On pense que des anticorps neutra- sensitive cells. Neutral antibodies are thought to be
lisants se fixent sur les glycoprotéines de l'enveloppe et en bloquent l'interaction avec des récepteurs situés à la lisients are fixed on the glycoproteins of the envelope and block the interaction with receptors located at the
surface des cellules (pages 534-535 dans "The Molecular Bio- cell surface (pages 534-535 in "The Molecular Bio-
logy of Tumor Viruses" (biologie moléculaire des virus de tumeur), publié par John Tooze, 1973, Cold Spring Harbor Laboratory; pages 226-277 et 236237 dans "RNA Tumor Viruses" (virus de tumeur a ARN (acide ribonucléique), publié par R. Weiss, N. Teich, H. Varmus et J. Coffin, 1982, Cold Spring Harbor Laboratory). Dans le cas spécifique de LAV/HTLV III, il existe des preuves selon lesquelles l'antigène T4, présent dans un sous-groupe de lymphocytes T, est le récepteur ou un composant du récepteur du virus (A. G. Dalgleish et col., 1984, Nature 312:763; D. Kltazmann et col., 1984, Nature Logy of Tumor Viruses, published by John Tooze, 1973, Cold Spring Harbor Laboratory, pages 226-277 and 236237 in "RNA Tumor Viruses", published R. Weiss, N. Teich, H. Varmus and J. Coffin, 1982, Cold Spring Harbor Laboratory) In the specific case of LAV / HTLV III, there is evidence that T4 antigen T-cell cluster, is the receptor or component of the virus receptor (Dalgleish AG et al., 1984, Nature 312: 763, D. Kltazmann et al., 1984, Nature
312:767).312: 767).
Le génome de ARN de LAV/HTLV III est schématisé sur la figure 1. Trois gènes sont généralement reconnus: le gène gag code pour les protéines structurelles internes (protéines de noyau) du virus et définit les antigènes spécifiques du Zj 7720 The RNA genome of LAV / HTLV III is schematized in Figure 1. Three genes are generally recognized: the gag gene codes for the internal structural proteins (core proteins) of the virus and defines the specific antigens of Zj 7720
groupe de virus. Le gêne pol code pour la transcriptase in- group of viruses. The pol code annoyance for transcriptase
verse associée au virion. Le gêne env code pour les glycopro- verse associated with the virion. The discomfort env codes for glycoproteins
téines virales. D'autres régions, marquées sor et 3'-orf, désignent des zones du génome contenant des cadres à lecture libre; la fonction de ces régions n'est pas actuellement connue. On utilise actuellement un certain nombre de méthodes viral teins. Other regions, labeled sor and 3'-orf, designate areas of the genome containing free-reading frames; the function of these regions is not currently known. A number of methods are currently used
pour la prévention et le traitement des infections virales. for the prevention and treatment of viral infections.
Elles comprennent des vaccins qui déclenchent une réponse They include vaccines that trigger a response
immunitaire active, le traitement par des agents de chimio- active immune system, treatment with chemotherapy agents
thérapie et le traitement par l'interféron. therapy and treatment with interferon.
Les voies traditionnelles de préparation des vaccins Traditional ways of preparing vaccines
comprennent l'utilisation de virus inactivés ou atténués. include the use of inactivated or attenuated viruses.
L'atténuation désigne la production de souches de virus qui ont essentiellement perdu leur aptitude & provoquer des maladies. Une voie pour y parvenir consiste à soumettre le virus à des conditions inhabituelles de croissance et/ou à un passage fréquent en culture cellulaire. On choisit ensuite des mutants de virus qui ont perdu de la virulence Mitigation refers to the production of virus strains that have essentially lost their ability to cause disease. One way to achieve this is to subject the virus to unusual growth conditions and / or frequent passage into cell culture. Virus mutants that have lost virulence are then selected
mais sont encore capables de déclencher une réponse immuni- but are still able to trigger an immune response
taire. Les virus atténués constituent généralement de bons immunogénes, car ils se répliquent dans la cellule de l'h6te et déclenchent une immunité de longue durée. Cependant, on rencontre plusieurs problèmes lors de l'utilisation de vaccins silent. Attenuated viruses are generally good immunogens because they replicate in the host cell and trigger long-lasting immunity. However, there are several problems when using vaccines
vivants, dont le plus gênant est une atténuation insuffisante. alive, the most troublesome of which is insufficient attenuation.
Au lieu des méthodes ci-dessus, on peut utiliser ce que l'on appelle les vaccins de sous-unités, ou sous-unités de vaccins. Cela implique une immunisation obtenue seulement à l'aide des protéines contenant le matériel immunologique Instead of the above methods, so-called subunit vaccines or vaccine subunits can be used. This involves immunization obtained only with the help of proteins containing the immunological material
concerné. Pour de nombreux virus à enveloppe, la glycopro- concerned. For many enveloped viruses, glycoprotein
téine à codage viral contient les épitopes capables de déclen- viral-encoded protein contains epitopes capable of
cher la production d'anticorps neutralisants. Un avantage des expensive production of neutralizing antibodies. An advantage of
vaccins de sous-unités est que le matériel viral non-inté- subunit vaccines is that the non-intact viral material
ressant est exclu.ressant is excluded.
Les vaccins sont souvent administrés en association avec divers adjuvants. Les adjuvants aident à atteindre un niveau plus durable et plus élevé d'immunité,en utilisant de plus faibles quantités d'antigènes en de plus faibles Vaccines are often given in combination with various adjuvants. Adjuvants help to achieve a higher and higher level of immunity, using lower levels of antigen and lower
doses que si l'immunogène était administré seul. doses only if the immunogen was administered alone.
L'utilisation de la technologie de l'ADN recombi- The use of recombinant DNA technology
nant pour la production de vaccins de sous-unités implique for the production of subunit vaccines implies
le clonage moléculaire et l'expression dans un vecteur appro- molecular cloning and expression in an appropriate vector
prié de l'information génétique virale codant pour les pro- asked for the viral genetic information coding for
téines pouvant déclencher une réponse neutralisante dans l'animal hôte. Tous les autres renseignements génétiques du virus sont exclus et seules les protéines nécessaires pour établir une réponse neutralisante sont présentées à l'animal hôte. L'hôte n'est jamais exposé à la totalité du virus et which can trigger a neutralizing response in the host animal. All other genetic information of the virus is excluded and only the proteins necessary to establish a neutralizing response are presented to the host animal. The host is never exposed to the entire virus and
il ne risque pas de devenir infecté. he is not likely to become infected.
Récemment, une approche a été décrite, qui est Recently, an approach has been described, which is
potentiellement utile pour la production de vaccins de sous- potentially useful for the production of sub-
unités (M. Mackett, G.L. Smith et B. Moss, 1982, Proc. Nat'l. units (Mackett, G. L. Smith and B. Moss, 1982, Proc Nat'l.
Acad. Sci. 79, 7415-7419; M. Mackett, G.L. Smith et B. Moss, 1984, J. Virol. 49, 857-864; D. Ranicali et E. Paoletti, 1982, Proc. Nat'l. Acad. Sci. 79, 4927-4931). Cette approche implique l'utilisation du virus de la vaccine comme vecteur Acad. Sci. 79, 7415-7419; M. Mackett, G. L. Smith and B. Moss, 1984, J. Virol. 49, 857-864; D. Ranicali and E. Paoletti, 1982, Proc. Nat'l. Acad. Sci. 79, 4927-4931). This approach involves the use of vaccinia virus as a vector
pour exprimer des gènes étrangers insérés dans son génome. to express foreign genes inserted into its genome.
Quand il est introduit dans des hôtes animaux, le virus de When introduced into animal hosts, the virus of
vaccine recombinant exprime le gène étranger inséré et déclen- recombinant vaccinia expresses the inserted foreign gene and triggers
che ainsi une réponse immunitaire de l'hôte à de tels gènes. thus, an immune response of the host to such genes.
Puisque le virus virant de vaccine recombinant peut servir de vaccin, une telle approche combine l'avantage des vaccins Since recombinant vaccinia viral virus can be used as a vaccine, such an approach combines the advantage of vaccines
de sous-unité(s) et des vaccins vivants. sub-unit (s) and live vaccines.
Le virus de la vaccine contient un génome de ADN The vaccinia virus contains a DNA genome
(acide désoxyribonucléique) linéaire à double brin compor- (deoxyribonucleic acid) linear double-strand
tant environ 167 kilopaires de bases et il se réplique au sein cytoplasme de cellules infectées. Ces virus contiennent un système complet d'enzymes de transcription (ce qui comprend about 167 kilobases of bases and it replicates within the cytoplasm of infected cells. These viruses contain a complete system of transcription enzymes (this includes
les enzymes de coiffage, de méthylation et de polyadényla- styling, methylation and polyadenylation enzymes
tion) au sein du noyau du virus, qui sont nécessaires pour within the core of the virus, which are necessary for
l'infectivité du virus. Les séquences de régulation de trans- the infectivity of the virus. The regulatory sequences of trans-
cription du virus de la vaccine (promoteurs) permettent description of the vaccinia virus (promoters)
l'amorçage de la transcription par l'ARN polymérase de vac- the initiation of transcription by the vaccine RNA polymerase
cine, mais non pas par i'ARN polymérase des cellules de l'h6te. L'expression de l'ADN étranger dans des virus de vaccine recombinants exige la ligation des promoteurs de vaccine sur des séquences de ADN codant pour des protéines du gène étranger. Des vecteurs de plasmide, appelés également vecteurs d'insertion, ont été construits pour insérer des gènes chimères dans des virus de vaccine. Un type de vecteur but not by the RNA polymerase of the host cells. The expression of foreign DNA in recombinant vaccinia viruses requires the ligation of vaccinia promoters on DNA sequences encoding foreign gene proteins. Plasmid vectors, also called insertion vectors, have been constructed to insert chimeric genes into vaccinia viruses. A type of vector
d'insertion est composé: (a) d'un promoteur de virus de vac- of insertion is composed of: (a) a vacant virus promoter;
cine comprenant le site d'initiation de transcription; including the transcription initiation site;
(b) de plusieurs sites de clonage par endonucléase de res- (b) several endonuclease cloning sites with
triction unique, situés en aval du site de début de trans- unique triction, located downstream of the start site of trans-
cription pour l'insertion de fragments de ADN étrangers; (c) de ADN non essentiel de virus de vaccine (comme le gène cription for the insertion of foreign DNA fragments; (c) non-essential DNA from vaccinia virus (such as the gene
TK) entourant les sites du promoteur et de clonage qui diri- TK) surrounding the promoter and cloning sites that
gent l'insertion du gène chimérique dans la région homologue non essentielle du génome de virus; et (d) d'un marqueur d'origine bactérienne de réplication et de résistance à des the insertion of the chimeric gene into the non-essential homologous region of the virus genome; and (d) a marker of bacterial origin for replication and resistance to
antibiotiques pour la réplication et la sélection dans E.coli. antibiotics for replication and selection in E. coli.
Des exemples de tels vecteurs sont décrits par Mackett Examples of such vectors are described by Mackett
(M. Mackett, J.L. Smith et B. Moss, 1984, J. Virol. 49, 857- (M. Mackett, J. L. Smith and B. Moss, 1984, J. Virol., 49, 857-
864). Des virus de vaccine recombinants sont produits 864). Recombinant vaccinia viruses are produced
par transfection de plasmides d'insertion de bactéries recom- by transfection of plasmids for insertion of bacteria recom-
binantes, contenant le gène étranger, à des cellules précé- binaries, containing the foreign gene, to previous cells
demment infectées par le virus de la vaccine. Une recombinai- have been infected with the vaccinia virus. A recombinant
son homologue se produit au sein des cellules infectées et its counterpart occurs within infected cells and
produit l'insertion du gène étranger dans le génome viral. produces the insertion of the foreign gene into the viral genome.
Les cellules infectées peuvent être dépistées à l'aide de techniques immunologiques, d'hybridation sur plaque de ADN, ou de choix génétique de virus recombinants que l'on peut isoler par la suite. Ces recombinants de vaccine conservent Infected cells can be screened using immunological techniques, DNA plaque hybridization, or genetic selection of recombinant viruses that can be isolated later. These vaccinia recombinants retain
leurs fonctions essentielles et leur infectivité et ils peu- their essential functions and infectivity, and they can
vent être construits de manière à comporter environ 35 kilo- can be constructed to have approximately 35 kilo-
bases de ADN étranger.foreign DNA bases.
L'expression de gènes étrangers peut être décelée par des dosages enzymatiques ou immunlogiques (par exemple par immunoprécipitation, dosage radioimmunologique ou immuno- coagulation). Les glycoprotéines naturelles de membrane The expression of foreign genes can be detected by enzymatic or immunological assays (for example by immunoprecipitation, radioimmunoassay or immunoagagulation). Natural membrane glycoproteins
produites par des cellules infectées par de la vaccine recom- produced by cells infected with vaccinia recom-
binante sont glycosylées et peuvent être transportées vers la surface des cellules. On peut obtenir des taux élevés d'expression en utilisant des promoteurs forts ou en obtenant binante are glycosylated and can be transported to the cell surface. High levels of expression can be achieved by using strong promoters or by obtaining
par clonage des copies multiples d'un seul gène. by cloning multiple copies of a single gene.
Récemment, on a décrit une approche qui est poten- Recently, an approach has been described which is potentially
tiellement utile pour la production de protéines recombinantes (Pennock et al., 1984, mol. cel. biol. 4:399, Smith et al. 1983, J. Virol. 46:584). Cette approche implique l'utilisation d'un vecteur de type baculovirus pour exprimer des gènes étrangers insérés dans son génome. Après introduction dans une cellule d'un hôte approprié, le baculovirus recombinant It is particularly useful for the production of recombinant proteins (Pennock et al., 1984, Mol., Cell Biol., 4: 399, Smith et al., 1983, J. Virol., 46: 584). This approach involves the use of a baculovirus vector to express foreign genes inserted into its genome. After introduction into a cell of a suitable host, the recombinant baculovirus
exprime le gène étranger.expresses the foreign gene.
Le prototype de la famille des baculovirus est Auto- The prototype of the baculovirus family is Auto-
grapha californica, virus de polyédrose nucléaire (AcNPV). grapha californica, nuclear polyhedrosis virus (AcNPV).
Le génome de AcNPV consiste en une espèce de ADN circulaire à double brin de 128 paires de kilobases,dont on a dressé The AcNPV genome consists of a double-stranded circular DNA species of 128 kilobase pairs,
la carte par rapport à plusieurs sites de restriction (G.E. the map with respect to several restriction sites (G.E.
Smith et M.D. Summers, 1978, Virology 89:517). Le virus se Smith and M. D. Summers, 1978, Virology 89: 517). The virus is
réplique dans le noyau de cellules d'insectes infectées. replicate in the nucleus of infected insect cells.
Deux formes de virus sont produites par suite de l'infection, Two forms of virus are produced as a result of infection,
par AcNPV de type sauvage, de cellules sensibles, des parti- wild-type AcNPV, sensitive cells,
cules de virus à occlusion et sans occlusion. Des particules de virus à occlusion sont entourées par une protéine appelée polyèdre dont le codage est dû au gène de polyédrine (voir Virol. 131:561-565, 1983). Dans des cellules infectées, les occlusion and no occlusion. Occlusion virus particles are surrounded by a protein called polyhedron encoded by the polyhedrin gene (see Virol, 131: 561-565, 1983). In infected cells,
particules virales à occlusion peuvent être facilement visua- occlusion viral particles can be easily visualized
lisées à l'aide d'un microscope optique. using an optical microscope.
L'expression de l'ADN étranger dans des baculovirus recombinants exige la ligation des promoteurs de baculovirus sur des protéines codant pour des séquences d'ADN du gène Expression of foreign DNA in recombinant baculoviruses requires ligation of baculovirus promoters on proteins encoding DNA sequences of the gene
étranger. Des vecteurs du type plasmide, appelés aussi vec- foreign. Vectors of the plasmid type, also called vectors
teurs d'insertion, ont été construits afin d'insérer des gènes chimères dans AcNPV. Un type de vecteur d'insertion est composé de: (a) un promoteur de AcNPV comprenant le site d'initiation de transcription; (b) plusieurs sites de clona- ge d'endonucléase à restriction unique, situés en aval du site de début de transcription pour l'insertion de fragments d'ADN étrangers; (c) de l'ADN de AcNPV non essentiel (comme le gène de polyédrine) flanquant le promoteur et ies sites de clonage qui dirigent l'insertion du gène chimère dans la région homologue non essentielle du génome de virus; et (d) une origine bactérienne de réplication et un marqueur de résistance aux antibiotiques pour la réplication et la sélection dans E. coli. Des exemples de tels vecteurs sont insertion probes, were constructed to insert chimeric genes into AcNPV. One type of insertion vector is composed of: (a) an AcNPV promoter comprising the transcription initiation site; (b) a plurality of single-restriction endonuclease cloning sites located downstream of the transcription start site for insertion of foreign DNA fragments; (c) non-essential AcNPV DNA (such as the polyhedrin gene) flanking the promoter and the cloning sites that direct the insertion of the chimeric gene into the non-essential homologous region of the virus genome; and (d) a bacterial origin of replication and an antibiotic resistance marker for replication and selection in E. coli. Examples of such vectors are
décrits par Miyamota et al. (1985, Mol. Cell. Biol. 5:2860). described by Miyamota et al. (1985, Mol Cell Biol 5: 2860).
On reproduit des baculovirus recombinants par co- Recombinant baculoviruses are reproduced by
transfection de cellules avec insertion bactérienne recom- transfection of cells with bacterial insertion recom-
binante de plasmides contenant le gène, avec l'ADN de baculo- of plasmids containing the gene, with the baculo-
virus. Une recombinaison homologue se produit au sein des cellules infectées et provoque l'insertion du gène étranger dans le génome viral. Une fois un gêne étranger inséré dans le gène de polyédrine, les particules de virus à occlusion ne peuvent plus être produites et les plaques recombinantes résultantes peuvent être examinées visuellement pour y déceler virus. Homologous recombination occurs within infected cells and causes insertion of the foreign gene into the viral genome. Once a foreign gene has been inserted into the polyhedrin gene, the occlusion virus particles can no longer be produced and the resulting recombinant plaques can be examined visually for evidence.
l'absence des corps à occlusion. Les cellules infectées peu- the absence of occlusion bodies. Infected cells can
vent également être dépistées à l'aide de techniques immuno- can also be detected using immunoassay techniques
logiques, d'une hybridation de plaques de ADN, ou d'une sélection génétique donnant des virus recombinants que l'on logic, hybridization of DNA plaques, or genetic selection giving recombinant viruses that are
peut isoler par la suite. Ces baculovirus recombinants con- can isolate afterwards. These recombinant baculoviruses
servent leurs fonctions et infectivité essentielles. serve their essential functions and infectivity.
L'expression des gènes étrangers peut être décelée par des dosages enzymatiques ou immunologiques (par exemple Expression of foreign genes can be detected by enzymatic or immunological assays (e.g.
par immunoprécipitation, dosage radio-immunologique ou immu- by immunoprecipitation, radioimmunoassay or immune
nocoagulation). On peut obtenir des niveaux élevés d'expres- nocoagulation). High levels of expression can be achieved
sion en utilisant des promoteurs forts ou en clonant des using strong promoters or by cloning
copies multiples d'un gène unique.multiple copies of a single gene.
On va décrire des virus qui dirigent l'exDression de peptides ou protéines apparentés à des épitopes de LAV/ HTLV III. Les virus recombinants de la présente invention, Viruses that direct the expression of peptides or proteins related to LAV / HTLV III epitopes will be described. The recombinant viruses of the present invention,
qui expriment des épitopes apparentés à LAV/HTLV III susci- expressing epitopes related to LAV / HTLV III
tant une réponse d'immunoprotection, peuvent être formulés sous forme de vaccins contenant des virus pour protéger les êtres humains contre l'infection due à LAV/HTLV III. Dans une forme particulière de mise en oeuvre de la présente invention, on peut préparer des formulations de vaccins à both an immunoprotective response, can be formulated as vaccines containing viruses to protect humans against infection due to LAV / HTLV III. In a particular embodiment of the present invention, vaccine formulations can be prepared for
virus vivants, en utilisant des virus infectieux qui expri- viruses, using infectious viruses that express
ment de tels épitopes apparentés à LAV/HTLV III dans un hôte infecté, mais ne provoquent pas une telle maladie chez cet hôte. L'invention vise également des peptides ou protéines apparents aux épitopes de LAV/HTLV III. On peut formuler les such LAV / HTLV III-related epitopes in an infected host, but do not cause such disease in this host. The invention also relates to peptides or proteins apparent to epitopes of LAV / HTLV III. We can formulate
peptides ou protéines qui suscitent une réponse d'immuno- peptides or proteins that elicit an immune response
protection, en des vaccins de sous-unités ou en des vaccins protection, in subunit vaccines or in vaccines
multivalents pour protéger les êtres humains contre une infec- multivalents to protect humans against infection
tion par LAV/HTLV III. En variante,, on peut utiliser les peptides ou protéines de l'invention pour des essais et dosages diagnostiques de dépistage du SIDA ou de LAS. On peut produire les peptides ou protéines de la présente invention dans n'importe quel système de vecteur d'expression dans des cellules d'hôtes et les isoler à partir de ce système; cela comprend, par exemple, des cultures de cellules animales ou d'insectes infectées par du virus recombinant approprié; des microorganismes comme des bactéries transfectées par des plasmides recombinants, des cosmides ou des phages; et de by LAV / HTLV III. Alternatively, the peptides or proteins of the invention may be used for diagnostic assays and assays for AIDS or LAS. The peptides or proteins of the present invention can be produced in any expression vector system in host cells and isolated therefrom; this includes, for example, cultures of animal cells or insects infected with the appropriate recombinant virus; microorganisms such as bacteria transfected with recombinant plasmids, cosmids or phages; and of
la levure transformée à l'aide de plasmides recombinants. yeast transformed with recombinant plasmids.
La présente invention propose également des méthodes, des modes opératoires et des constructions de ADN servant à The present invention also provides methods, procedures and DNA constructs for
l'expression de l'information génétique codant pour les épi- the expression of the genetic information coding for epi-
topes de LAV/HTLV III. En variante, on peut.effectuer la syn- top of LAV / HTLV III. Alternatively, it is possible to perform the syn-
thèse chimique des peptides et protéines de la présente invention. Dans des formes spécifiques de mise en oeuvre de la présente invention, on insère dans des plasmides les chemical thesis of the peptides and proteins of the present invention. In specific embodiments of the present invention, plasmids are inserted into the plasmids.
séquences de gènes codant pour les glycoprotéines d'enve- gene sequences encoding the enzymatic glycoproteins
loppe ou les protéines de structure de noyau de LAV/HTLV III (c'est-àdire les séquences de gène de env ou gag de LAV/ HTLV III, respectivement) , de manière qu'un promoteur de virus de vaccine antérieur soit placé en 5' par rapport à la séquence méthionine d'amorçage (ATG) des séquences de gène loppe or LAV / HTLV III core structure proteins (i.e. env or gag gene sequences of LAV / HTLV III, respectively), so that an earlier vaccinia virus promoter is placed in the region. 5 'to the starting methionine sequence (ATG) of the gene sequences
LAV/HTLV III, ce qui donne la construction de gènes chimè- LAV / HTLV III, which gives rise to the construction of chimeric genes
res flanqués ou entourés par des séquences de thymidine res flanked or surrounded by thymidine
kinase (TK) de ADN de vaccine. Ces plasmides ont été trans- kinase (TK) of vaccinia DNA. These plasmids were trans-
fectés dans des cellules qui ont été au préalable infectées par du virus de vaccine de type sauvage, en laissant ainsi le gène env ou gag chimère de LAV/HTLV III, flanqué par les séquences de TK, se recombiner dans le gène TK du virus de vaccine. On laisse les cellules se lyser et l'on cultive les virus résultants sur des plaques de cellules de TK-. On choisit les virus recombinants d'après leur aptitude à se fixer sur des cultures de ces cellules en plaques en présence in cells that have been previously infected with wild-type vaccinia virus, thus leaving the env gene or LAV / HTLV III chimeric gag, flanked by the TK sequences, to recombine in the TK gene of the vaccinated. The cells are allowed to lyse and the resulting viruses are cultured on TK- cell plates. The recombinant viruses are selected based on their ability to bind to cultures of these plaque cells in the presence of
de la 5-bromo-désoxyuridine ainsi que par hybridation ADN- 5-bromo-deoxyuridine as well as by DNA-DNA hybridization.
ADN sur une sonde radiomarquée appropriée comprenant des DNA on a suitable radiolabeled probe comprising
séquences d'enveloppe de LAV/HTLV III ou de gag LAV/HTLV III. envelope sequences of LAV / HTLV III or gag LAV / HTLV III.
On a purifié des plaques positives pour l'hybridation, on Positive plaques for the hybridization were purified,
en a provoqué l'expansion et l'on a soumis les virus recom- resulted in the expansion and the viruses were recom-
binants résultants à des essais de détermination de leur aptitude à produire des glycoprotéines d'enveloppe de LAV/ HTLV III ou des protéines de structure de.noyau de LAV/HTLV III. Les protéines apparentées à l'enveloppe de LAV/HTLV III, resulting binders to assays for their ability to produce LAV / HTLV III envelope glycoproteins or LAV / HTLV III core structure proteins. Proteins related to the envelope of LAV / HTLV III,
exprimées par les virus de vaccine recombinants se sont avé- expressed by recombinant vaccinia viruses have been shown to
rées être antigéniques et immunogènes, et capables de susci- are antigenic and immunogenic and capable of
ter chez des primates sub-humains une immunité à médiation aussi bien humorale que cellulaire. Les protéines apparentées à gag de LAV/HTLV III, exprimées par les virus de vaccine recombinants, ont été des protéines immuno-réactives qui contenaient les épitopes majeurs des protéines de noyaux authentiques. Dans d'autres formes spécifiques de réalisation de la présente invention, on a inséré des séquences env ou gag de LAV/HTLV III dans un plasmide de façon qu'un promoteur de polyêdrine de baculovirus soit placé en position 5' par rapport à la séquence méthionine d'amorçage (ATG) du gène de LAV/HTLV III suivie par des séquences d'ADN de polyédrine & l'extrémité 3'. On a ensuite co- transfecté ces plasmides ter in subhuman primates immunity mediated both humoral and cellular. The gag-related proteins of LAV / HTLV III, expressed by recombinant vaccinia viruses, were immunoreactive proteins that contained the major epitopes of the authentic core proteins. In other specific embodiments of the present invention, env or gag sequences of LAV / HTLV III have been inserted into a plasmid such that a baculovirus polyedrine promoter is placed at the 5 'position relative to the sequence. initiation methionine (ATG) of the LAV / HTLV III gene followed by polyhedrin DNA sequences at the 3 'end. These plasmids were then co-transfected.
dans des cellules avec de l'ADN de baculovirus de type sauva- in cells with baculovirus DNA of the wild type.
ge, en laissant le gène chimère de LAV/HTLV III flanqué par des séquences additionnelles de AcNPV se recombiner dans ge, leaving the chimeric LAV / HTLV III gene flanked by additional sequences of AcNPV recombine in
le gène de polyédrine du baculovirus. On a laissé les cellu- the baculovirus polyhedrin gene. The cells were left
les subir une lyse et l'on a cultivé les virus résultants sur des plaques. Par examen visuel pour déceler le manque de corps à occlusion ou par hybridation de ADN-ADN sur des sondes radiomarquées env/HTLV III ou gag de LAV/HTLV III, lysed them and the resulting viruses grown on plates. By visual examination to detect the absence of occlusion bodies or by DNA-DNA hybridization on radiolabeled env / HTLV III or gag probes of LAV / HTLV III,
on a effectué la sélection de virus recombinants. On a puri- the selection of recombinant viruses was carried out. We have puri-
fié des plaques recombinantes et l'on en a provoqué la propa- releasing the recombinant plaques and provoked
gation, et l'on a soumis les virus recombLnants résultants à des dépistages de détermination de leur aptitude à produire and the resulting recombinant viruses were screened for their ability to produce
des protéines apparentées à LAV/HTLV III par immunoprécipita- proteins related to LAV / HTLV III by immunoprecipitation
tion suivie d'une analyse sur des gels de SDS (dodécylsulfate de sodium)polyacrylamide. On a soumis des lysats de cellules infectées à des essais de détermination de leur aptitude à followed by analysis on SDS (sodium dodecyl sulphate) polyacrylamide gels. Lysates of infected cells were subjected to assays for their ability to
déceler des anticorps de LAV/HTLV III dans du sérum par ELISA. detect antibodies to LAV / HTLV III in serum by ELISA.
On va maintenant brièvement décrire les figures annexées. The accompanying figures will now be briefly described.
La figure 1 représente la structure de génome provi- ral intégré de LAV/HTLV III. Les zones hachurées indiquent des régions de Figure 1 shows the integrated provisional genome structure of LAV / HTLV III. The hatched areas indicate regions of
cadres 'à lecture ouverte. Les régions codant frames' open reading. The coding regions
pour l'antigène spécifique du groupe, la transcriptase inver- for the group-specific antigen, the reverse transcriptase
se et les protéines d'enveloppe sont désignées respectivement par gag (groupe-spécifique antigène), pol et env. Les cadres à lecture ouverte qui se chevauchent sont représentés par se and the envelope proteins are designated respectively by gag (group-specific antigen), pol and env. The overlapping open reading frames are represented by
des zones à hachurage croisé. Les nombres désignent les nom- crosshatch areas. Numbers are the names
bres de paires de base en aval du site de coiffage (site de "cap"), o démarre la transcription virale. Les sites de restriction sont marqués comme suit: Bg, BglII; Ec, EcoRI; pairs of base pairs downstream of the styling site ("cap" site), where viral transcription starts. The restriction sites are labeled as follows: Bg, BglII; Ec, EcoRI;
Hn, HindIII; kp, kpnI; Ss, SstI.Hn, HindIII; kp, kpnI; Ss, SstI.
Les figures 2A et 2B représentent la séquence des nucléotides de la région spécifique de LAV/HTLV III (EcoRi à SstI) présentes dans le plasmide pRS-3 ADN; la totalité du gène d'enveloppe de LAV/HTLV III (nucléotide 5766 à 8349) est contenue dans l'insertion LAV/HTLV III. Les sites de restriction utilisés dans la construction de pv-envl, pv-env2 et pv-env5 sont indiqués. La totalité de la séquence des amino acides du gène de l'enveloppe, telle que déduite des données des séquences de nucléotides, est FIGS. 2A and 2B show the nucleotide sequence of the LAV / HTLV III specific region (EcoRI to SstI) present in the plasmid pRS-3 DNA; the entire LAV / HTLV III envelope gene (nucleotide 5766 to 8349) is contained in the LAV / HTLV III insert. The restriction sites used in the construction of pv-env1, pv-env2 and pv-env5 are indicated. The entire amino acid sequence of the envelope gene, as deduced from the nucleotide sequence data, is
également indiquée.also indicated.
La figure 3 est une représentation schématique de la construction de plasmides contenant une portion de la séquence codant pour des protéines d'enveloppe LAV/HTLV III, séquence insérée en aval d'un promoteur de virus de vaccine. La séquence codant pour l'enveloppe de LAV/HTLV III est représentée par la barre libre et le promoteur de vaccine par la barre ombrée ou hachurée. La séquence des nucléotides à la jonction de la région de promoteur de vaccine et de la séquence codant pour l'enveloppe LAV/HTL\I III est indiquée à la partie inférieure de la figure. Les séquences soulignées indiquent les codons Figure 3 is a schematic representation of plasmid construction containing a portion of the sequence encoding LAV / HTLV III envelope proteins, sequence inserted downstream of a vaccinia virus promoter. The coding sequence for the LAV / HTLV III envelope is represented by the free bar and the vaccinia promoter by the shaded or hatched bar. The nucleotide sequence at the junction of the vaccinia promoter region and the coding sequence for the LAV / HTL III envelope is shown at the bottom of the figure. Underlined sequences indicate codons
présumés d'amorçage et le cadre de lecture pour le gène chimé- suspected priming and reading frame for the chimeric gene
rique. On notera que les troisième et quatrième amino-acides de la séquence translatée (Pro-Val) du pv-env2 recombinant correspondent aux aminoacides numéro 43 et 44 de la séquence America. It will be noted that the third and fourth amino acids of the translated sequence (Pro-Val) of the recombinant pv-env2 correspond to amino acids number 43 and 44 of the sequence
de codage d'enveloppe de LAV/HTLV III. Envelope coding of LAV / HTLV III.
La figure 4 est une représentation schématique de la construction de plasmides contenant la totalité de la séquence de codage des protéines d'enveloppe de LAV/HTLV III Figure 4 is a schematic representation of plasmid construction containing the entire LAV / HTLV III envelope protein coding sequence.
insérée en aval d'un promoteur de virus de vaccine. Le promo- inserted downstream of a vaccinia virus promoter. The promotion
teur de virus de vaccine est représenté par la barre hachurée ou ombrée. Le plasmide pv-env5 contenant la totalité de la région de codage d'enveloppe de LAV/HTLV III a été construit en deux étapes. Les portions 5' et 3' de la région de codage ont été tout d'abord clonées séparément dans pGS20 pour former pv-envl qui contient l'extrémité amino de codage du gène de Vaccinia virus is represented by the hatched or shaded bar. Plasmid pv-env5 containing the entire LAV / HTLV III envelope coding region was constructed in two steps. The 5 'and 3' portions of the coding region were first cloned separately into pGS20 to form pv-envl which contains the amino terminus of the gene coding.
l'enveloppe de LAV/HTLV III et pv-env2 qui contient l'extré- the envelope of LAV / HTLV III and pv-env2 which contains the
mité carboxyle de codage du gène de l'enveloppe de LAV/HTLV III. Ces deux portions sont regroupées au site StuI comme the carboxyl coding of the LAV / HTLV III envelope gene. These two portions are grouped together at the StuI site as
représenté.represent.
La figure 5 est une représentation schématique de la construction de plasmides contenant la séquence de codage des protéines d'enveloppe de LAV/HTLV III, sans la séquence transmembrane (ancrage), insérée en aval d'un promoteur de virus de vaccine. Le plasmide pv-env7 a été construit en deux étapes. La partie 5' de pv-env 5 a été insérée dans p26 pour former un plasmide intermédiaire, pv-env5/26, qui a fourni une séquence de terminaison par translation dans le cadre (TAA) donnant un géne env tronqué. On a ensuite inséré la séquence env tronquée, terminée par TAA, dans pG20 afin de construire pv-env7 dans lequel le gène env tronqué est flanqué Figure 5 is a schematic representation of the plasmid construct containing the LAV / HTLV III envelope protein coding sequence, without the transmembrane (anchor) sequence, inserted downstream of a vaccinia virus promoter. Plasmid pv-env7 was constructed in two steps. The 5 'portion of pv-env was inserted into p26 to form an intermediate plasmid, pv-env5 / 26, which provided a translational terminator sequence (TAA) giving a truncated env gene. The truncated env sequence, terminated by TAA, was then inserted into pG20 to construct pv-env7 in which the truncated env gene is flanked.
par des séquences de gène de TK de vaccine. by vaccinia TK gene sequences.
La figure 6 représente la construction et le choix Figure 6 shows the construction and the choice
du virus de vaccine recombinant. Les barres pleines repré- recombinant vaccinia virus. The solid bars represent
sentent le gène de thymidine kinase (TK) du virus de la vaccine. Ce gène TK est aussi présent dans le plasmide pv-env5 ADN, mais dans le plasmide le gène TK est interrompu par le gène chimère consistant en le promoteur à 7,5K de la feel the thymidine kinase (TK) gene of vaccinia virus. This TK gene is also present in the plasmid pv-env5 DNA, but in the plasmid the TK gene is interrupted by the chimeric gene consisting of the 7.5K promoter of the TK gene.
vaccine (barre hachurée) et par la région de codage d'enve- vaccine (hatched bar) and by the coding region of
loppe de LAV/HTLV III (barre ouverte). Après infection des cellules par la vaccine, le plasmide recombinant contenant le gène TK interrompu par le gène d'enveloppe de LAV/HTLV III est introduit dans les cellules infectées. Les recombinaisons qui se produisent dans les séquences TK entourant le gène chimique introduisent la séquence de gène d'enveloppe de LAV/ HTLV III dans le génome de virus de la vaccine. Le virus recombinant résultant, contenant le gène d'enveloppe de LAV/ LAV / HTLV III loppe (open bar). After infection of the cells with vaccinia, the recombinant plasmid containing the TK gene interrupted by the LAV / HTLV III envelope gene is introduced into the infected cells. The recombinations that occur in the TK sequences surrounding the chemical gene introduce the LAV / HTLV III envelope gene sequence into the vaccinia virus genome. The resulting recombinant virus, containing the LAV envelope gene /
HTLV III,est TK.HTLV III, is TK.
Les figures 7A et 7B représentent une caractérisation des struc- FIGS. 7A and 7B show a characterization of the structures
* tures de génome des virus de vaccine recombinants contenant le gène env d'un LAV/HTLV III. La figure 7A représente unegenomes of recombinant vaccinia viruses containing the env gene of a LAV / HTLV III. Figure 7A shows a
analyse, A l'aide d'une enzyme de restriction, des recombi- analysis, using a restriction enzyme, recombinants
nants de vaccine v-env5 et v-env5NY ainsi que leurs souches v-env5 and v-env5NY vaccines as well as their
de vaccine parentale respectives (WR et v-NY, respectivement). respective parental vaccines (WR and v-NY, respectively).
Des fragments de ADN engendrés par des produits de digestion DNA fragments generated by digestion products
par l'enzyme de restriction HindIII ont été résolus par élec- by the restriction enzyme HindIII have been resolved by
trophorèse sur un gel d'agarose et colorés par du bromure trophoresis on an agarose gel and stained with bromide
d'éthidium afin de visualiser les bandes. La figure 7B repré- of ethidium to visualize the bands. Figure 7B shows
sente le caillot du Sud (Southern) obtenu après transfert feels the Southern clot (Southern) obtained after transfer
des fragments résolus par restriction sur de la nitrocellu- fragments resolved by restriction on nitrocellulose
lose et hybridation sur une sonde à translation par étrangle- lose and hybridization on a probe with translation by strangling
ment, spécifique des séquences d'enveloppe LAV/HTLV III. specifically, specific LAV / HTLV III envelope sequences.
La figure 8A représente une analyse par immunocoa- FIG. 8A represents an immunocautery analysis.
gulation de Western ("ouest") des protéines produites par les recombinants de env-LAV/HTLV III de vaccine. Les protéines provenant Western ("West") regulation of proteins produced by vaccinia env-LAV / HTLV III recombinants. Proteins from
des sources suivantes ont été résolues sur un gel de polyacryl- following sources were resolved on a polyacrylate gel
amide à gradient de 7 à 15 % de SDS et électrotransférées sur du papier nitrocellulosique: protéines de virion de' LAV/HTLV III (LAV/HTLV III); cellules infectées par du virus de vaccine de type sauvage ("WTvv"); ("Wild-type vaccinia gradient amide of 7 to 15% SDS and electrotransfered on nitrocellulose paper: LAV / HTLV III virion proteins (LAV / HTLV III); cells infected with wild-type vaccinia virus ("WTvv"); ("Wild-type vaccinia
virus"); cellules non infectées ("mock"); cellules infec- viruses "), uninfected cells (" mock "), infected cells
tées par des virus recombinants v-env2 (v-env2) ou v-env5 (v-env5). Des protéines immunoréatives A l'égard du sérum d'un patient atteint de SIDA ont été décelées par l'action by recombinant viruses v-env2 (v-env2) or v-env5 (v-env5). Immunotherative proteins against the serum of a patient with AIDS were detected by the action
d'une peroxydase conjugée à des anticorps de IgG anti-humaines. peroxidase conjugated to anti-human IgG antibodies.
Les gènes LAV/env produits sont indiqués par gp150, gpllO et gp41. Les étalons de poids moléculaire sont exprimés en The LAV / env genes produced are indicated by gp150, gp101 and gp41. The molecular weight standards are expressed in
kilodaltons (kd).kilodaltons (kd).
La figure 8B représente une analyse d'un immunocoa- FIG. 8B represents an analysis of an immunocautery
gulat de Western de protéines produites par des recombinants de vaccine LAV-env dans deux types de cellules. Les protéines provenant de cellules BSC-40 ou de cellules HeLa ont été résolues par électrophorèse sur gel de SDS-polyacrylamide Western gulat of proteins produced by LAV-env vaccinia recombinants in two types of cells. Proteins from BSC-40 or HeLa cells were resolved by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis
(SDS-PAGE) et électrotransférées sur du papier nitrocellulo- (SDS-PAGE) and electro-transferred onto nitrocellulose paper
sique,puis mises en réaction avec du sérum groupé provenant de personnes à sérum positif pour LAV/HTLV-III; les pistes 1 et 5 représentent les cellules infectées par "mock"; les pistes 2 et 6 représentent des cellules infectées par le virus de la vaccine de type sauvage; les pistes 3 et 7 représentent des cellules infectées par v-env5; et les pistes 4 et 8 représentent des cellules infectées par v-env2. On a décelé des protéines immunoréactives en utilisant de la protéine A marquée par 125I. Les produits de type gène de then reacted with pooled serum from LAV / HTLV-III serum positive persons; lanes 1 and 5 represent cells infected with "mock"; lanes 2 and 6 represent cells infected with wild-type vaccinia virus; lanes 3 and 7 represent cells infected with v-env5; and lanes 4 and 8 represent cells infected with v-env2. Immunoreactive proteins were detected using 125I-labeled Protein A. Products of the gene type
LAV-env sont indiqués par gp150, gpll0 et gp41. LAV-env are indicated by gp150, gpl10 and gp41.
La figure 9A représente les résultats d'une analyse par radioimmunoprécipitation des protéines synthétisées dans des cellules infectées par le virus de la vaccine de type sauvage ("WTvv") ou par du virus de vaccine recombinant (v-env2 et v-env5). Les protéines ont été marquées par de la 35S-méthionine de 10 à 12 heures après l'infection. On a fait réagir les protéines marquées présentes dans les lysats de cellules avec du sérum humain témoin (N) ou avec du sérum Figure 9A shows the results of radioimmunoprecipitation analysis of proteins synthesized in cells infected with wild-type vaccinia virus ("WTvv") or with recombinant vaccinia virus (v-env2 and v-env5). The proteins were labeled with 35 S-methionine 10 to 12 hours after infection. The labeled proteins present in the cell lysates were reacted with control human serum (N) or with serum
de patient atteint de SIDA (I) et l'on a provoqué la précipi- patient with AIDS (I) and provoked the precipi-
tation des immun complexes par la protéine A de Staphylococcus aureus. Les protéines immunoprécipitées ont été résolues par électrophorèse sur un gel de polyacrylamide à 15 % de SDS et détectées par fluorographie. Les poids moléculaires sont complex immunization with Staphylococcus aureus protein A. The immunoprecipitated proteins were resolved by electrophoresis on a 15% SDS polyacrylamide gel and detected by fluorography. Molecular weights are
indiqués en kilodaltons (kd).indicated in kilodaltons (kd).
La figure 9B représente les résultats d'une analyse Figure 9B shows the results of an analysis
par radioimmunoprécipitation de protéines marquées par 3H- by radioimmunoprecipitation of 3H-labeled proteins
glucosamine Droduites par effet d'expression des recombinants de vaccineLAV/HTLV III de l'invention. Les cellules Hela ont été soit glucosamine produced by the expression effect of the vacciniaLAV / HTLV III recombinants of the invention. Hela cells were either
"infectées" par des cellules non infectieuses ("mock"; non- "infected" by non-infectious cells ("mock";
infection) (pistes 1 et 5),soit infectées par des virus de vaccine de type sauvage (pistes 2 et 6), v-env5 (pistes 3 infection) (lanes 1 and 5), either infected with wild-type vaccinia viruses (lanes 2 and 6), v-env5 (lanes 3
et 7) ou v-env2 (pistes 4 et 8) et marquées par de la 3H- and 7) or v-env2 (tracks 4 and 8) and marked with 3H-
glucosamine. Les lysats de cellules ont été immunoprécipités avec du sérum humain normal (pistes 1-4) ou avec du sérum groupé provenant de personnes à sérum positif à l'égard de LAV/HTLV III (pistes 5-8) et de la protéine A. Les protéines immunoprécipitées ont été résolues par électrophorèse sur glucosamine. The cell lysates were immunoprecipitated with normal human serum (lanes 1-4) or with pooled serum from LAV / HTLV III positive serum (lanes 5-8) and protein A. Immunoprecipitated proteins were resolved by electrophoresis on
gel de SDS-polyacrylamide.SDS-polyacrylamide gel.
La figure 9C représente les résultats d'une analyse de radioimmunoprécipitation "par impulsions de chasse" des FIG. 9C shows the results of a "pulse-hunting" radioimmunoprecipitation analysis of
protéines d'enveloppe LAV/HTLV III produites par les recom- LAV / HTLV III envelope proteins produced by the recom-
binants de vaccine LAV/HTLV III. On a infecté des cellules HeLa avec du virus de vaccine de type sauvage, v-env5 ou v-env2 comme indiqué, marqué par 35S-méthionine, et on a lavé avec un milieu de chasse. Aux intervalles suivants de vaccinia binoculars LAV / HTLV III. HeLa cells were infected with wild-type vaccinia virus, v-env5 or v-env2 as indicated, labeled with 35 S-methionine, and washed with flushing medium. At the following intervals of
temps, on a lavé les cellules, on les a lysées et immuno- The cells were washed, lysed and immunized
précipitées avec du sérum groupé provenant de personnes à sérum positif à l'égard de LAV/HTLV III et l'on a résolu par SDS-PAGE (électrophorèse sur gel de polyacrylamide): 0 heure (pistes 1, 7, 13); une demi-heure (pistes 2, 8, 14); 1 heure (pistes 3, 9, 15); 2 heures (pistes 4, 10, 16); 6 heures (pistes 5, 11, 17) et 12 heures (pistes 6, 12, 18). La piste M représente des marqueurs comprenant des étalons de poids moléculaire marqués par 14C. La figure 9D représente les résultats d'une analyse de radioimmunoprécipitation des protéines apparentées à l'enveloppe de LAV/HTLV III que l'on trouve dans les cellules et dans des milieux provenant de cellules infectées par les precipitated with pooled serum from LAV / HTLV III serum-positive individuals and resolved by SDS-PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis): 0 hours (lanes 1, 7, 13); half an hour (tracks 2, 8, 14); 1 hour (lanes 3, 9, 15); 2 hours (tracks 4, 10, 16); 6 hours (tracks 5, 11, 17) and 12 hours (tracks 6, 12, 18). Lane M represents markers comprising 14C-labeled molecular weight standards. Figure 9D shows the results of a radioimmunoprecipitation assay for LAV / HTLV III envelope-related proteins found in cells and in media from cells infected with the cells.
virus de vaccine-LAV/HTLV III recombinants de l'invention. recombinant vaccinia-LAV / HTLV III virus of the invention.
Des cellules HeLa ont été soit "infectées" par des virus non infectés (c'est-à-dire non infectées; piste 1 "mock"), soit infectés par le virus de vaccine de type sauvage (piste 2) HeLa cells were either "infected" with uninfected (i.e. uninfected, lane 1 "mock") viruses or infected with wild-type vaccinia virus (lane 2)
v-env5 (piste 3) ou v-env2 (piste 4) et marquées par 35S- v-env5 (lane 3) or v-env2 (lane 4) and marked by 35S-
méthionine. Les cellules ont été séparées du milieu et lysées. methionine. The cells were separated from the medium and lysed.
Les lysats de cellules (culot) et le milieu supérieur surnageant ont été chacun immunoprécipités à l'aide de sérum groupe provenant de personnes à sérum positif à l'égard de LAV/HTLV III. Les protéines immunoprécipitées ont été résolues par The cell lysates (pellet) and the supernatant upper medium were each immunoprecipitated with serum group from LAV / HTLV III positive serum individuals. Immunoprecipitated proteins were resolved by
électrophorése sur gel de polyacrylamide (SDS-PAGE). Polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE).
La figure 9E représente le résultat d'une analyse par radioimmunoprécipitation des protéines apparentées à l'enveloppe de LAV/HTLV III dans des cellules et dans des Figure 9E shows the result of radioimmunoprecipitation analysis of LAV / HTLV III envelope-related proteins in cells and in
milieux provenant de cellules infectées par des virus recom- from cells infected with viruses recom-
binants de vaccine-LAV/HTLVL III de l'invention. v-env5 recombinant contient la totalité de la séquence de codage de l'enveloppe de LAV/HTLV III, alors que v-env7 contient la séquence de codage d'envelopee de LAV/HTLV III sauf la région de transmembrane (ancrage). Les cellules Hela ont été soit "infectées" par des virus non infectés (c'est-à-dire non infectés; piste 1 "mock"), soit infectées par le virus de vaccine de type sauvage (piste 2), v-env5 (piste 3) ou v-env7 (piste 4), et marquées par 35S-méthionine. Les cellules ont été séparées du milieu et lysées. Les lysats de cellules vaccinia-LAV / HTLVL III binders of the invention. Recombinant v-env5 contains the entire coding sequence of the LAV / HTLV III envelope, whereas v-env7 contains the LAV / HTLV III envelope coding sequence except the transmembrane region (anchoring). Hela cells were either "infected" with uninfected (i.e., uninfected, lane 1 "mock") viruses or infected with wild-type vaccinia virus (lane 2), v-env5 (lane 3) or v-env7 (lane 4), and labeled with 35 S-methionine. The cells were separated from the medium and lysed. Cell lysates
(culot) et le milieu (surnageant) ont été chacun immunopréci- (pellet) and the medium (supernatant) were each immunoprecipitated
pités à l'aide de sérum groupé provenant de personnes a sérum with serum pooled from serum
positif à l'égard de LAV/HTLV III. Les protéines immunopré- positive for LAV / HTLV III. Immunoprecipitation proteins
cipitées ont été résolues par électrophorèse sur gel de poly- cipitates were resolved by electrophoresis on poly-
acrylamide (SDS-PAGE).acrylamide (SDS-PAGE).
La figure 10 représente une analyse par immunocoa- Figure 10 shows an immunocautery analysis.
gulation de type Western d'échantillons de sérum provenant de souris immunisées par des virus recombinants da vaccine-LAV/ HTLV III. Las souris avaient été immunisées avec du virus da vaccine recombinant v-env5 ou v-env2. Au bout de 8 semainas, on a fait réagir las échantillons de sérum avac des protéines de virion LAV/HTLV III qui avaient été résolues par électrophorèse sur SDS-PAGE (gel de polyacrylamida) at électrotransférées Western-type gating of serum samples from mice immunized with vaccinia-LAV / HTLV III recombinant viruses. The mice had been immunized with recombinant vaccinia virus v-env5 or v-env2. After 8 weeks, serum samples were reacted with LAV / HTLV III virion proteins that had been resolved by electrophoresis on SDS-PAGE (polyacrylamid gel) and electrotransferred.
sur du papier nitrocellulosique. On a utilisé una immunoglo- on nitrocellulose paper. An immunoglobulin was used
buline anti-souris de chèvre conjuguée & de la phosphatasa alcalina pour déceler les protéines LAV/HTLV III qui ont été reconnues par les sérums de souris. Les pistes a & e représentent les échantillons de sérum de 5 souris individuelles auxquelles on a inoculé v-anv5, et las pistes f à k représentent des échantillons de sérum provenant de 5 souris individuelles auxquelles on a inoculé v-env2. Les sérums groupés provenant de personnes à résultat positif pour LAV/HTLV III (SIDA) et de souris non immunisées C57B16J- (NMS) ont servi de témoins conjugated goat anti-mouse bulin & phosphatasa alkalina to detect LAV / HTLV III proteins that have been recognized by mouse sera. Tracks were serum samples from 5 individual mice inoculated v-anv5, and tracks f through k represent serum samples from 5 individual mice inoculated v-env2. Pooled sera from LAV / HTLV III positive (AIDS) and non-immune C57B16J- (NMS) mice served as controls.
positif et négatif, respectivament. Les positions des glyco- positive and negative, respectivament. The positions of the glyco-
protéines d'enveloppe LAV/HTLV III gpl50, gpll0 et gp43 sont indiquées. LAV / HTLV III envelope proteins gpl50, gpl10 and gp43 are indicated.
La figure 1i est un histogramms'rêprésentant la sêro- Figure 1i is a histogram representing the steroids
conversion de singes màcaques vaccinés par du virus de vaccine recombinant, v-env5. On a inoculé a 4 singes macaques, par scarification de la peau, 2 x 10 unités de formation de plaque et à 4 singes 2 x 107 unités de formation de plaque conversion of male monkeys vaccinated with recombinant vaccinia virus, v-env5. Four macaque monkeys were inoculated, by scarification of the skin, 2 x 10 plaque forming units and 4 monkeys 2 x 107 plaque forming units.
de v-env-5. On a inoculé à 1 animal 2 x 107 unités de forma- of v-env-5. One animal was inoculated with 2 x 107 units of
tion de plaque de recombinant témoin vaccine-herpès simplex gD (v-HSVgD1). Dix semaines après la première inoculation, on a administré a tous les animaux, sauf la numéro 81, une seconde inoculation de 2 x 108 unités de formation de plaque du même virus. On a collecté des échantillons de sérum avant inoculation (barres ouvertes); 4 semaines après la première inoculation (barres hachurées; et 4 semaines après la seconde Recombinant vaccinia-herpes simplex gD (v-HSVgD1) recombinant plaque plate. Ten weeks after the first inoculation, all animals except No. 81 were given a second inoculation of 2 × 10 8 plaque forming units of the same virus. Serum samples were collected prior to inoculation (open bars); 4 weeks after the first inoculation (hatched bars, and 4 weeks after the second
inoculation (barres pleines). On a vérifié et titré la séro- inoculation (solid bars). We have checked and titrated the sero-
conversion par ELISA, en utilisant des virions purifiés de ELISA conversion, using purified virions of
LAV/HTLV III comme antigène cible.LAV / HTLV III as target antigen.
La figure 12 représente une analyse par immunocoagu- Figure 12 shows an immunocautery analysis.
lation de Western, d'échantillons de sérum provenant de singes macaques immunisés par des virus recombinants de vaccine- LAV/HTLV III, v-env5, comme décrit pour la figure 11. On a Western blot, serum samples from macaque monkeys immunized with recombinant vaccinia-LAV / HTLV III viruses, v-env5, as described for FIG.
collecté des échantillons de virus avant la première inocula- collected virus samples before the first inoculation
tion (piste pré) et au bout de 4 semaines après la seconde inoculation. On a dilué des parties aliquotes du sérum 50 fois et on l'a fait réagir avec de la protéine de virion de LAV/HTLV V qui a été résolue par chromatographie sur gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) et immobilisée sur des filtres en pre-run and 4 weeks after the second inoculation. Serum aliquots were diluted 50-fold and reacted with LAV / HTLV V virion protein which was resolved by polyacrylamide gel chromatography (SDS-PAGE) and immobilized on filters.
nitrocellulose, par électrotransfert en utilisant un proto- nitrocellulose, by electrotransfer using a proto-
cole qui permet la détection optimale des deux glycoprotéines d'enveloppe, gpllO (figure 12A) et gp41 (figure 12B). Les protéines de LAV/HTLV III reconnues par les sérums de macaques ont été décelées par de l'immunoglobuline anti-humaine de chèvre conjuguée à de la phosphatase alcaline. On a utilisé This method allows the optimal detection of the two envelope glycoproteins, gpl10 (FIG. 12A) and gp41 (FIG. 12B). The LAV / HTLV III proteins recognized by macaque sera were detected by goat anti-human immunoglobulin conjugated to alkaline phosphatase. We used
comme témoin positif des sérums regroupés provenant de per- as a positive control group sera collected from
sonnes Aru positifpourla recherche de LAV/HTLV III (SIDA). On a utilisé comme témoin des virions authentiques Aru positive for the research of LAV / HTLV III (AIDS). Authentic virions were used as a witness
de LAV/HTLV III (SIDA).of LAV / HTLV III (AIDS).
La figure 13 représente une analyse par immunocoa- FIG. 13 represents an immunocautery analysis.
gulation de Western de ces échantillons de sérum provenant de chimpanzés immunisés par des virusrecombinants de vaccine NY-LAV/HTLV III, v-env5NY. A deux chimpanzés, on a inoculé par voie intradermique 5 x 108 unités de formation de plaque de v-env5NY, cependant qu'on a inoculé à un animal la même dose de v-HSVgD1NY, un recombinant de vaccine-virus d'herpès simplex gD construit à partir de la même souche de vaccine Western determination of these serum samples from chimpanzees immunized with NY-LAV / HTLV III vaccinia recombinant viruses, v-env5NY. To two chimpanzees, 5 x 108 v-env5NY plaque formation units were inoculated intradermally, while the same dose of v-HSVgD1NY, a vaccinia-herpes simplex virus recombinant, was inoculated into an animal. gD constructed from the same strain of vaccinia
parentale-NY. Tous les animaux ont reçu une seconde inocula- Parental-NY. All animals received a second inoculation
tion 8 semaines après la première inoculation. On a collecté des échantillons de sérum avant immunisation (piste 1), 8 semaines après l'immunisation primaire (piste 2) et 2 semaines après la seconde immunisation (piste 3). On a dilué fois des parties aliquotes de sérum et on les a fait réagir avec des protéines de virion de LAV/HTLV III qui ont été 8 weeks after the first inoculation. Serum samples were collected prior to immunization (lane 1), 8 weeks after primary immunization (lane 2) and 2 weeks after the second immunization (lane 3). Aliquots of serum were diluted several times and reacted with LAV / HTLV III virion proteins which were
résolues par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (SDS- resolved by polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-
PAGE) et immobilisées sur des filtres nitrocellulosiques par électrotransfert, en utilisant un protocole qui permet la meilleure détection possible de gp 41. Les protéines de LAV/ HTLV III reconnues par les sérums de chimpanzés ont été déce- PAGE) and immobilized on nitrocellulose filters by electrotransfer, using a protocol that allows the best possible detection of gp 41. The LAV / HTLV III proteins recognized by the sera of chimpanzees were disappointed.
lées par de l'immunoglobuline anti-humaine de chèvre conju- by conjugated goat anti-human immunoglobulin
guée à de la phosphatase alcaline. On a utilisé comme témoin positif des sérums groupés provenant de personnes dont le for alkaline phosphatase. Positive sera were pooled sera from individuals
sérum était positif a la recherche de LAV/HTLV III (SIDA). serum was positive for LAV / HTLV III (AIDS).
Les figures 14A à 14D représentent la séquence des nucléotides Figures 14A to 14D show the nucleotide sequence
de la région spécifique de LAV/HTLV III (SstI à KpnI) pré- specific region of LAV / HTLV III (SstI to KpnI) pre-
sentes dans l'ADN de plasmide pKS-5; la totalité du gène gag LAV/HTLV III (nucléotides 340 à 1835) est contenue dans la partie insérée de LAV/HTLV III. Les sites de restriction utilisés pour la construction de pAc-gagl sont indiqués. La totalité des séquences des amino-acides du gène gag, telle que déduite des renseignements concernant la séquence des in pKS-5 plasmid DNA; the entire gag LAV / HTLV III gene (nucleotides 340 to 1835) is contained in the inserted portion of LAV / HTLV III. The restriction sites used for the construction of pAc-gagl are indicated. All the amino acid sequences of the gag gene, as inferred from the sequence information
nucléotides, est également indiquée. nucleotides, is also indicated.
La figure 15 est une représentation schématique de la construction du plasmide pAc-gagl contenant la séquence de codage des protéines gag LAV/HTLV III insérée en aval d'un promoteur AcNPV. Le vecteur de clonage pAc610 contient des séquences de nucléotides correspondant au promoteur de gène de polyédrine et il comprend les séquences de tête en 5' et les séquences de polyédrine en 3' interrompues par des sites Figure 15 is a schematic representation of the construction of the pAc-gagl plasmid containing the LAV / HTLV III gag protein coding sequence inserted downstream of an AcNPV promoter. The cloning vector pAc610 contains nucleotide sequences corresponding to the polyhedrin gene promoter and comprises 5 'leader sequences and 3' polyhedrin sequences interrupted by sites.
de clonage situés en aval du site de début de transcription. of cloning located downstream of the transcription start site.
Les sites de clonage à la position -8 sont EcoRI, SstI, SmaI (XmaI), BamHI, XbaI et PstI. SalI, AccI et HincII ne sont The cloning sites at position -8 are EcoRI, SstI, SmaI (XmaI), BamHI, XbaI and PstI. SalI, AccI and HincII are not
pas uniques. I1 n'y a présence de sites pour KnpI ou BglII. not unique. There are no sites for KnpI or BglII.
La figure 16 représente schématiquement la construc- Figure 16 schematically shows the construction of
tion et la sélection du recombinant AcNPV (Ac-gagl). La barre hachurée indique les séquences de promoteur de polyédrine et de tête en 5'. Les barres pleines représentent le gène de polyédrine de baculovirus. Les parties de ce gène sont présentes dans le plasmide pAc-gagl ADN, interrompues par la région de codage de LAV/HTLV III gag (barre ouverte). Des selection and selection of the AcNPV (Ac-gag1) recombinant. The hatched bar indicates the 5 'polyhedrin and leader promoter sequences. The solid bars represent the baculovirus polyhedrin gene. Portions of this gene are present in the plasmid pAc-gagl DNA, interrupted by the coding region of LAV / HTLV III gag (open bar). of the
cellules sont co-transfectées avec de l'ADN de plasmide recom- cells are co-transfected with plasmid DNA recom-
binant contenant des portions du gène de polyédrine interrom- with portions of the interrupted polyhedrin gene
pues par le gène LAV/HTLV III gag (pAc-gagl) avec de l'ADN stained by LAV / HTLV III gag gene (pAc-gagl) with DNA
de AcNPV de type sauvage. Des recombinaisons qui se produi- wild-type AcNPV. Recombinations that occur
sent dans les séquences de polyédrine flanquant le gêne chimère introduisent la séquence de gène LAV/HTLV III gag in the polyhedrin sequences flanking the chimeric gene introduce the LAV / HTLV III gag gene sequence.
dans le génome de AcNPV.in the genome of AcNPV.
La figure 17 représente une analyse de coagulation de Northern (Nord) de l'ARN extrait de cellules de Spodoptera frugiperda infectées par AcPNV de type sauvage et Ac-gagl, FIG. 17 represents a coagulation analysis of Northern (Northern) RNA extracted from Spodoptera frugiperda cells infected with wild-type AcPNV and Ac-gagl,
en utilisant des ondes spécifiques pour LAV/HTLV III gag. using specific waves for LAV / HTLV III gag.
La figure 18 représente le résultat d'une analyse par radioimmunoprécipitation des protéines exprimées dans Figure 18 shows the result of a radioimmunoprecipitation analysis of the proteins expressed in
des cellules infectées par du baculovirus Ac-gagl recombinant. cells infected with recombinant baculovirus Ac-gagl.
Les protéines ont été marquées par la (35S) méthionine,pendant 2 heures, à 24 heures (pistes 1, 2), 48 heures (pistes 3, 4) Proteins were labeled with (35S) methionine for 2 hours at 24 hours (lanes 1, 2), 48 hours (lanes 3, 4)
et 72 heures (pistes 5, 6) après l'infection. On a fait réa- and 72 hours (lanes 5, 6) after infection. We made
gir les protéines marquées présentes dans les lysats de cellules avec du sérum humain témoin (pistes 1, 3, 5) ou avec le sérum d'un patient atteint de SIDA (pistes 2, 4, 6), et les immun-complexes ont été précipités par la protéine A de Staphylococcus aureus. Les protéines immunoprécipitées ont été résolues par électrophorèse sur un gel de polyacrylamide the labeled proteins present in the cell lysates with control human serum (lanes 1, 3, 5) or with the serum of a patient with AIDS (lanes 2, 4, 6), and the immun-complexes were precipitated by protein A of Staphylococcus aureus. The immunoprecipitated proteins were resolved by electrophoresis on a polyacrylamide gel
à 10 % de SDS et détectées par fluorographie. Les poids molé- at 10% SDS and detected by fluorography. The molecular weights
culaires sont indiqués en kilodaltons. Cells are given in kilodaltons.
La figure 19 représente les résultats d'une analyse de radioimmunoprécipitation "par impulsions de chasse" des protéines apparentées à LAV/HTLV III gag que l'on trouve dans Figure 19 shows the results of a "hunting pulse" radioimmunoprecipitation analysis of the LAV / HTLV III gag-related proteins found in
des cellules infectées par l'AcNPV recombinant de l'invention. cells infected with the recombinant AcNPV of the invention.
On a infecté des cellules de Spodoptera frugiperda (Sf9) avec Ac-gagl et on les marquées par impulsions durant 5 minutes à 24 heures après l'infection. On a ensuite lavé les cellules avec un milieu complet et on les fait incuber avec du milieu complet durant 0 heure (pistes 1, 2), 2 heures (pistes 3, 4), 4 heures (pistes 5, 6) et 8 heures (pistes 7, 8). Aux moments indiqués, on a lavé les cellules, on les a lysées Spodoptera frugiperda (Sf9) cells were infected with Ac-gag1 and pulsed for 5 minutes to 24 hours post-infection. The cells were then washed with complete medium and incubated with complete medium for 0 h (lanes 1, 2), 2 h (lanes 3, 4), 4 h (lanes 5, 6) and 8 h ( tracks 7, 8). At the indicated times, cells were washed, lysed
et immunoprécipitées avec du sérum groupé provenant de per- and immunoprecipitated with pooled serum from
sonnes séropositives pour LAV/HTLV III (pistes 2, 4, 6, 8) ou du sérum humain normal (pistes 1, 3, 5, 7). Les protéines seropositive for LAV / HTLV III (lanes 2, 4, 6, 8) or normal human serum (lanes 1, 3, 5, 7). The proteins
ont été résolues par électrophorèse sur gel de SDS-polyacry- resolved by SDS-polyacryl gel electrophoresis.
lamide.lamide.
La figure 20 représente schématiquement la construc- Figure 20 schematically shows the construction
tion de cinq plasmides, pv-gagl, pv-gag2, pv-gag3, pv-gag4 et pv-gag5 contenant le promoteur de virus de vaccine 7,5K fixé par ligature sur diverses longueurs du génome de LAV/ HTLV III contenant des séquences de codage de gag. Le vecteur de clonage pGS62 que l'on utilise dans ces constructions est identique à pGS20 (voir figure 3), sauf qu'il comporte un of five plasmids, pv-gag1, pv-gag2, pv-gag3, pv-gag4 and pv-gag5 containing the 7.5K vaccinia promoter fixed by ligation to various lengths of the LAV / HTLV III genome containing sequences gag coding. The cloning vector pGS62 used in these constructions is identical to pGS20 (see FIG.
site unique EcoRI situé en aval du site unique SmaI de pGS20. single EcoRI site downstream of the unique SmaI site of pGS20.
La figure 21 représente les résultats d'une analyse d'immunocoagulation de type. Western (Ouest) des protéines exprimées dans des cellules infectées par des virus LAV/HTLV III de vaccine recombinants (v-gaglNY, v- gag2NY, v-gag3NY, v-gag4NY et v-gag5NY), le virus de vaccine de départ (v- NY) et des cellules "infectées" par des cellules non infectieuses ("MOCK") . Des échantillons de virions LAV/HTLV III purifiés ("LAV/HTLV III") ont été inclus comme témoins positifs. Des cellules BSC-40 confluentes ont été infectées à un indice de multiplicité d'infection de 10. On a laissé l'infection Figure 21 shows the results of a type immunocoagulation assay. Western (West) proteins expressed in cells infected with recombinant vaccinia LAV / HTLV III viruses (v-gaglNY, v-gag2NY, v-gag3NY, v-gag4NY and v-gag5NY), the starting vaccinia virus ( NY) and "infected" cells by non-infectious cells ("MOCK"). Samples of purified LAV / HTLV III virions ("LAV / HTLV III") were included as positive controls. Confluent BSC-40 cells were infected at a multiplicity index of infection of 10. The infection was left
se poursuivre durant 12 heures, au bout desquelles on a récol- continue for 12 hours, at the end of which we collected
té les cellules et on les a lysées. Les protéines cellulaires cells and lysed them. Cell Proteins
totales ont été résolues par électrophorèse sur gel de SDS- total were resolved by SDS-gel electrophoresis.
PAGE et immobilisées par électrotransfert sur de la nitro- PAGE and immobilized by electrotransfer on nitro-
cellulose. On a fait réagir les filtres avec (1) du sérum de patient atteint de SIDA (figure 21B) qui a été décelé à l'aide d'une immunoglobuline anti-humaine de chèvre conjuguée à de la phosphatase alcaline; (2) anticorps monoclonaux de souris qui définissent des protéines gag p25 et p18 (figures 21A et 21C), que l'on a ensuite décelées en utilisant de l'immunoglobuline anti-souris de chèvre conjuguées & de la cellulose. The filters were reacted with (1) AIDS patient serum (Figure 21B) which was detected using goat anti-human immunoglobulin conjugated to alkaline phosphatase; (2) mouse monoclonal antibodies which define p25 and p18 gag proteins (FIGS. 21A and 21C), which were then detected using conjugated goat anti-mouse immunoglobulin;
phosphatase alcaline.alkaline phosphatase.
La figure 22 représente schématiquement l-a construc- Figure 22 schematically represents the construction of
tion du plasmide pAc-env5 contenant la totalité de la séquence de codage d'enveloppe de LAV/HTLV III insérée en aval d'un promoteur de polyédrine AcNPV. Le vecteur de clonage pAc610 Plasmid pAc-env5 containing the entire LAV / HTLV III envelope coding sequence inserted downstream of an AcNPV polyhedrin promoter. The cloning vector pAc610
est décrit sur la figure 15 ci-dessus. is depicted in Figure 15 above.
La figure 23 représente les résultats d'une analyse par radioimmunoprécipitation des protéines exprimées dans Figure 23 shows the results of a radioimmunoprecipitation analysis of the proteins expressed in
des cellules infectées par du baculovirus recombinant Ac- cells infected with recombinant baculovirus Ac-
env5. Des cellules "infectées" par des virus non infectieux ("MOCK") et la souche de baculovirus de départ (AcNPV) sont incluses à titre de témoins. Les protéines exprimées par des cellules Sf9 infectées ont été marquées, 28 heures après l'infection, durant 2 heures par 35S-méthionine. On a fait réagir les protéines marquées présentes dans les lysats de cellules avec du sérum de patient atteint de SIDA ou avec des anticorps monoclonaux de souris qui définissent gpll0 ou gp41, et les immun- complexes ont été précipités à l'aide de la protéine A de Staphylococcus aureus. On a résolu, par électrophorèse sur gel de SDS-PAGE, et l'on a décèle par env5. "Infected" cells with non-infectious viruses ("MOCK") and the starting baculovirus strain (AcNPV) are included as controls. Proteins expressed by infected Sf9 cells were labeled, 28 hours after infection, for 2 hours with 35 S-methionine. The labeled proteins present in the cell lysates were reacted with AIDS patient serum or with mouse monoclonal antibodies which define gpl10 or gp41, and the immun-complexes were precipitated using protein A of Staphylococcus aureus. It was resolved by SDS-PAGE gel electrophoresis and detected by
fluorographie les protéines immunoprécipitées. fluorography immunoprecipitated proteins.
On va maintenant présenter une description plus We will now present a description more
détaillée de l'invention.detailed description of the invention.
La présente invention vise l'obtention de virus qui The present invention aims at obtaining viruses which
produisent les peptides; et protéines apparentés à des épi- produce the peptides; and proteins related to epi-
topes de LAV/HTLV III. L'invention vise également des peptides et protéines apparentés a des épitopes de LAV/HTLV III, que l'on peut produire en utilisant des méthodes faisant appel à de l'ADN recombinant ou par synthèse chimique. Les virus ou peptides et protéines de la présente invention qui peuvent top of LAV / HTLV III. The invention also provides peptides and proteins related to LAV / HTLV III epitopes that can be produced using recombinant DNA or chemical synthesis methods. The viruses or peptides and proteins of the present invention which can
susciter une réponse de protection immunitaire peuvent ser- elicit an immune protection response can serve
vir d'immunogènes dans diverses formulations de vaccins, ce qui comprend des formulations de vaccins multilvalents, pour protéger contre une infection par LAV/HTLV III, qui est l'agent responsable de LAS (syndrome d'adénopathie) et du of immunogens in various vaccine formulations, including multi-valent vaccine formulations, to protect against infection with LAV / HTLV III, which is the causative agent of LAS (Adenopathy Syndrome) and
SIDA. En variante, on peut utiliser comme antigènes les pep- AIDS. Alternatively, the antigens
tides ou protéines de l'invention, dans des essais ou dosages immunologiques diagnostiques pour la détection, chez un patient, d'anticorps spécifiques de LAV/HTLV III. Les peptides tides or proteins of the invention, in diagnostic immunoassays or assays for detecting, in a patient, antibodies specific for LAV / HTLV III. Peptides
ou protéines que l'on utilise dans les essais ou dosages immu- or proteins that are used in immunoassays or assays.
nologiques de l'invention doivent etre antigéniques (c'est- of the invention must be antigenic (that is,
a-dire capables de réagir avec des anticorps d'un patient concernant LAV/HTLV III), mais ils n'ont pas besoin d'être immunogènes (c'est-à-dire capables de susciter une réponse ie, capable of reacting with a patient's antibodies to LAV / HTLV III), but they do not need to be immunogenic (i.e., capable of eliciting a response
immunitaire). En outre, il n'est pas nécessaire que les anti- immune). Moreover, it is not necessary for
gènes utilisés dans l'essai ou dosage immunologique de dia- genes used in the immunological assay or assay of dia-
gnostic suscitent in vivo une réponse de protection immuni- taire. Selon une forme de mise en oeuvre de la présente invention, on utilise des techniques faisant appel à de l'ADN recombinant pour insérer des séquences de nucléotides codant des épitopes de LAV/HTLV III dans des vecteurs d'expression qui vont diriger l'expression de séquences de LAV/HTLV III dans des cellules d'hôtes appropriés. Ces systèmes vecteurs d'expression-cellules d'hôtes peuvent servir à produire in vitro des peptides et protéines apparentés à LAV/HTLV III et, dans ce cas, les gènes produits peuvent être purifiés à partir des cellules an culture. Les peptides ou protéines pouvant susciter une réponse de protection immunitaire et In vivo, immunosuppressive responses provide immunological protection. In accordance with one embodiment of the present invention, recombinant DNA techniques are used to insert nucleotide sequences encoding LAV / HTLV III epitopes into expression vectors that will drive expression. LAV / HTLV III sequences in appropriate host cells. These host cell expression vector systems can be used to produce LAV / HTLV III related peptides and proteins in vitro and, in this case, the produced genes can be purified from cultured cells. Peptides or proteins that can elicit an immune protection response and
servir d'immunogène dans des formulations de vaccins à sous- immunogen in subcutaneous vaccine formulations
unités. En variante, on peut utiliser des peptides et proté- units. Alternatively, peptides and proteins can be used.
ines, immunogènes ou tout simplement antigéniques, de l'inven- ines, immunogens or simply antigenic, of the invention
tion à titre d'antigènes dans des essais et dosages immunolo- as antigens in immunoassay tests and assays.
giques conçus pour déceler des anticorps de patients spécifi- designed to detect antibodies from specific patients.
ques de LAV/HTLV III. Dans une autre approche pour la produc- of LAV / HTLV III. In another approach to the production
tion des peptides et protéines de l'invention, les séquences des aminoacides de ces peptides et protéines peuvent être peptides and proteins of the invention, the amino acid sequences of these peptides and proteins can be
déduites des séquences des nucléotides de LAV/HTLV III conte- deduced from the nucleotide sequences of LAV / HTLV III contained
nues dans les recombinants qui expriment des peptides et pro- in recombinants that express peptides and
téines antigéniques et/ou immunogènes apparentés à LAV/HTLV III. Ces peptides et protéines peuvent ensuite faire l'objet de synthèses chimiques et servir dans des formulations de vaccins à sous unités synthétiques (s'ils sont immunogènes) antigenic and / or immunogenic tegins related to LAV / HTLV III. These peptides and proteins can then be chemically synthesized and used in synthetic subunit vaccine formulations (if they are immunogenic)
ou à titre d'antigènes dans des essais ou dosages immunolo- or as antigens in immunoassay tests or assays
giques pour diagnostics (s'ils sont antigéniques et/ou immu- diagnoses (if they are antigenic and / or
nogènes). Quand le vecteur d'expression est un virus qui dirige l'expression d'un immunogène relié à un épitope de LAV/HTLV III capable desusciter une réponse de protection immunitaire, le virus lui-même peut être formulé à titre de vaccin. Des virus recombinants infectieux, qui ne déclenchent pas une maladie dans l'hôte, peuvent servir dans des préparations nogènes). When the expression vector is a virus that directs the expression of an immunogen linked to an epitope of LAV / HTLV III capable of evoking an immune protection response, the virus itself can be formulated as a vaccine. Infectious recombinant viruses, which do not trigger disease in the host, can be used in
de vaccins à virus pour conférer une immunité importante. of virus vaccines to confer significant immunity.
En variante, on peut préparer des vaccins contenant des virus inactivés, quand on utilise des virus "tués". En outre, on peut préparer des vaccins multivalents contenant des épitopes de LAV/HTLV III ainsi que ceux d'autres agents provoquant Alternatively, vaccines containing inactivated viruses can be prepared when "killed" viruses are used. In addition, multivalent vaccines containing LAV / HTLV III epitopes as well as other
des maladies.diseases.
A seule fin de présenter une description claire, For the sole purpose of presenting a clear description,
le procédé de l'invention peut être divisé en les étapes sui- the process of the invention can be divided into the following steps:
vantes: (a) isolement d'un gène, ou fragment de gène, codant des protéines de virus LAV/HTLV III; (b) insertion du gène, ou du fragment de gène, dans des-vecteurs d'expression; (c) identification et croissance du vecteur d'expression recombinant dans un système hôte qui est capable d'assurer la réplication et l'expression du gène; (d) identification et purification du produit obtenu à l'aide du gène; (e) détermination du pouvoir immunitaire du produit, et (a) isolation of a gene, or gene fragment, encoding LAV / HTLV III virus proteins; (b) inserting the gene, or gene fragment, into expression vectors; (c) identifying and growing the recombinant expression vector in a host system that is capable of replication and gene expression; (d) identifying and purifying the product obtained with the gene; (e) determination of the immunity of the product, and
(f) formulation d'un vaccin.(f) formulation of a vaccine.
Dans des formes spécifiques de mise en oeuvre de l'invention, on décrit la construction de virus de vaccine recombinants et de baculovirus contenant le gène d'enveloppe In specific embodiments of the invention, the construction of recombinant vaccinia virus and baculovirus containing the envelope gene is described.
de LAV/HTLV III qui dirige l'expression de protéines immuno- of LAV / HTLV III, which directs the expression of
logiquement liées aux protéines d'enveloppe de LAV/HTLV III dans des cellules en culture tissulaire infectées par les virus recombinants. Dans d'autres formes de réalisation de la présente invention, on décrit la construction de virus de vaccine recombinants et de baculovirus contenant le gène gag de LAV/HTLV III qui dirige l'expression de protéines immunologiquement apparentées aux protéines de structure de noyaux de LAV/HTLV III dans des cellules de culture de ces tissus infectées par les virus recombinants. Cependant, les compositions et procédés que l'on décrit ici ne se limitent pas à la construction de virus recombinants exprimant des protéines apparentées à l'enveloppe ou à gag de LAV/HTLV III, et ils peuvent servir à construire des recombinants dans logically bound to LAV / HTLV III envelope proteins in tissue culture cells infected with recombinant viruses. In other embodiments of the present invention, there is described the construction of recombinant vaccinia viruses and baculoviruses containing the LAV / HTLV III gag gene which directs the expression of proteins immunologically related to LAV nuclei structural proteins. / HTLV III in culture cells of these tissues infected with recombinant viruses. However, the compositions and methods described herein are not limited to constructing recombinant viruses expressing LAV / HTLV III coat or gag-related proteins, and can be used to construct recombinants in
n'importe quel système de vecteurs d'expression pour la produc- any expression vector system for the production of
tion de polypeptides apparentés à des antigènes de n'importe polypeptides related to antigens of any
quel agent éthiliogique du SIDA.which ethicological agent of AIDS.
Pour la clarté de l'exposé, la totalité du procédé sera étudiée en termes de gènes d'enveloppe et gag de LAV/ HTLV III. La même technique, cependant, peut être appliquée de façon analogue pour construire des vecteurs d'expression recombinants et pour produire des polypeptides apparentés à n'importe laquelle des protéines de LAV/HTLV III ainsi que 101 ceux de virus apparentés. De telles protéines comprennent, sans que ce soit limitatif, les produits des gènes de LAV/ For the sake of clarity, the entire process will be studied in terms of envelope and gag genes of LAV / HTLV III. The same technique, however, can be applied analogously to construct recombinant expression vectors and to produce polypeptides related to any of the LAV / HTLV III proteins as well as those of related viruses. Such proteins include, but are not limited to, LAV gene products.
HTLV III, comme gag, pol et env et au moins quatre gènes sup- HTLV III, as gag, pol and env and at least four genes sup-
plémentaires appelés à ce jour: sor, tat, 3'-orf et un gène diversement appelé art ou trs (voir Fisher et al, 1986, are now called sor, tat, 3'-orf and a gene which is variously called art or trs (see Fisher et al, 1986,
Science 233:655-659).Science 233: 655-659).
ISOLEMENT DE GENES, OU DE FRAGMENTS DE GENE, CODANT DES ISOLATION OF GENES, OR GENE FRAGMENTS, ENCODING
PROTEINES VIRALES LAV/HTLV IIIVIRAL PROTEINS LAV / HTLV III
L'isolement des gènes de LAV/HTLV III implique tout The isolation of the LAV / HTLV III genes involves all
d'abord l'isolement de fragments de ADN contenant les séquen- first the isolation of DNA fragments containing the sequences
ces de gènes d'enveloppe. Comme précédemment expliqué, LAV/ HTLV III possède un génome de ARN et, donc, on peut obtenir these envelope genes. As previously explained, LAV / HTLV III has an RNA genome and, therefore, it is possible to obtain
l'ADN correspondant qui code le gène LAV/HTLV III (a) en clo- the corresponding DNA which encodes the LAV / HTLV III (a) gene
nant par ADNc l'ARN isolé de virions purifiés de LAV/HTLV III, ou (b) en clonant par ADNc de l'ARN contenant du polylAI que l'on obtient à partir de cellules infectées par LAV/HTLV III, ou (c) en clonant de l'ADN de génome purifié à partir cDNA RNA isolated from purified virions of LAV / HTLV III, or (b) by cDNA cloning of polylAI-containing RNA obtained from cells infected with LAV / HTLV III, or (c) ) by cloning purified genome DNA from
de cellules infectées par LAV/HTLV III. Ci-après, on appelle- of cells infected with LAV / HTLV III. Hereinafter, we call
ra l'ADN codant les gènes de LAV/HTLV III de'l'ADN de LAV/ the DNA coding the LAV / HTLV III genes of LAV DNA /
HTLV III.HTLV III.
Afin d'engendrer des fragments de ADN de LAV/HTLV In order to generate DNA fragments of LAV / HTLV
III, on peut cliver l'ADN de LAV/HTLV III en des sites spéci- III, the LAV / HTLV III DNA can be cleaved at specific sites.
fiques, en utilisant diverses enzymes de restriction. En using various restriction enzymes. In
variante, on peut utiliser de l'ADN ase en présence de man- Alternatively, DNA can be used in the presence of
ganèse pour fragmenter l'ADN, ou bien l'on peut cisailler ganesis to fragment DNA, or we can shear
physiquement l'ADN, par exemple par traitement aux ultrasons. physically DNA, for example by sonication.
On peut ensuite séparer les fragments linéairea de ADN, selon The linear fragments of DNA can then be separated according to
leurs dimensions, par des techniques classiques, ce qui com- their dimensions, by conventional techniques, which
prend, sans que ce soit limitatif, une électrophorése sur gélose et gel de polyacrylamlide et une chromatographie sur colonne. takes, but is not limited to, electrophoresis on agar and polyacrylamide gel and column chromatography.
On peut utiliser n'importe quelle enzyme de restric- Any restriction enzyme may be used
tion ou n'importe quelle combinaison d'enzymes de restriction pour engendrer un ou des fragments de ADN de LAV/HTLV III contenant les séquences gag ou d'enveloppe, à la condition que les enzymes ne détruisent pas l'antigénicité du produit protéinique de gène. Par exemple, le site antigénique d'une or combination of restriction enzymes to generate one or more LAV / HTLV III DNA fragments containing the gag or envelope sequences, provided that the enzymes do not destroy the antigenicity of the protein product of the invention. gene. For example, the antigenic site of a
protéine peut consister en environ 7 à environ 14 aminoacides. Protein can be from about 7 to about 14 amino acids.
Ainsi, une protéine de la dimension du peptide précurseur Thus, a protein of the size of the precursor peptide
d'enveloppe (environ 97 000 daltons) peut comporter de nom- envelope (approximately 97 000 daltons) may contain
breux sites antigéniques séparés, peut-être des milliers en considérant les séquences en recouvrement, des considérations de structures secondaires et tertiaires et des possibilités de traitement comme l'acétylation, la glycosylation ou la phosphorylation. Donc, de nombreuses séquences partielles de gènes polypeptidiques d'enveloppes risquent de coder pour several separate antigenic sites, perhaps thousands considering overlapping sequences, secondary and tertiary structural considerations, and treatment possibilities such as acetylation, glycosylation, or phosphorylation. Therefore, many partial sequences of envelope polypeptide genes are likely to encode
un site antigénique. Par conséquent, on peut utiliser de nom- an antigenic site. Therefore, we can use
breuses combinaisons d'enzymes de restriction pour engendrer many combinations of restriction enzymes to generate
des fragments de ADN qui, quand ils sont insérés dans un vec- fragments of DNA which, when inserted into a vec-
teur approprié, sont capables de diriger la production de séquences d'aminoacides spécifiques d'enveloppe comprenant are capable of directing the production of specific envelope amino acid sequences comprising
différents déterminants antigéniques. different antigenic determinants.
Une fois les fragments d'ADN engendrés,on peut réa- Once the DNA fragments have been generated, we can
liser d'un certain nombre de façons une identification du fragment spécifique d'ADN contenant le gène d'enveloppe LAV/ HTLV III. En premier lieu, il est possible de séquencer les fragments d'ADN correspondant à la totalité du génome de LAV/ HTLV III,puis d'identifier les fragments contenant la séquence de gènes protéiniques d'enveloppe ou de gène gag en se fondant sur une comparaison de la séquence des aminoacides prédite et de la séquence des aminoacides de la protéine d'enveloppe to identify in a number of ways an identification of the specific DNA fragment containing the LAV / HTLV III envelope gene. Firstly, it is possible to sequence the DNA fragments corresponding to the entire genome of LAV / HTLV III, then to identify the fragments containing the protein sequence of envelope or gag gene genes on the basis of a comparison of the predicted amino acid sequence and the amino acid sequence of the envelope protein
ou des protéines de noyau gag. En second lieu, une fois déter- or gag core proteins. Secondly, once
minée la totalité de la séquence de génome, on peut ordonner mined the entire genome sequence, one can order
de 5' à 3' les grands cadres à lecture ouverte. Comme l'orga- from 5 'to 3' large open reading frames. As the organization
nisation de génome de tous les rétrovirus examinés jusqu'à présent est 5'gag-pol-env-3', le grand cadre a lecture ouverte le plus voisin de l'extrémité 3' risque très probablement de coder pour le gène d'enveloppe, alors que le grand cadre à lecture ouverte le plus voisin de l'extrémité 5' risque très probablement de coder pour le gène gag. En troisième lieu, on peut effectuer une identification probable d'un gène spécifique par reconnaissance de l'homologie avec d'autres gènes de rétrovirus connus, par des analyses d'hybridation d'acides nucléiques ou des comparaisons de séquences si les Genomeization of all retroviruses examined so far is 5'gag-pol-env-3 ', the large open-reading frame closest to the 3' end is very likely to encode the envelope gene. , while the large open reading frame closest to the 5 'end is very likely to encode the gag gene. Thirdly, it is possible to make a probable identification of a specific gene by recognizing the homology with other known retrovirus genes, by nucleic acid hybridization analyzes or by sequence comparisons if the
séquences sont connues.sequences are known.
En variante, le fragment contenant le gène protéi- Alternatively, the fragment containing the protein gene
nique d'enveloppe peut être identifié par sélection de ARNm. envelope can be identified by mRNA selection.
Dans ce mode opératoire, on utilise les fragments de ADN LAV/ In this procedure, the LAV DNA fragments are used.
HTLV III pour isoler, par hybridation, les ARNm complémen- HTLV III to isolate, by hybridization, complementary mRNAs
taires. Une analyse par immunoprécipitation des produits de translation in vitro des ARNm isolés identifie l'ARNm et donc, tary. Immunoprecipitation analysis of the in vitro translation products of the isolated mRNAs identifies the mRNA and therefore,
les fragments d'ADN LAV/HTLV III complémentaire qui contien- complementary LAV / HTLV III DNA fragments which contain
nent les séquences des protéines d'enveloppe. Enfin, on peut choisir des ARNm spécifiques de protéines d'enveloppe par the envelope protein sequences. Finally, specific mRNAs of envelope proteins can be selected by
adsorption de polysomes isolés à partir de cellules infec- adsorption of polysomes isolated from infected cells
tées par LAV/HTLV III sur des anticorps immobilisés dirigés by LAV / HTLV III on immobilized antibodies directed
contre les protéines d'enveloppe ou de gag. On peut synthéti- against envelope or gag proteins. We can synthetize
ser une ADN d'enveloppe radiomarquée, ADNc (ADN complémen- radiolabeled envelope DNA, cDNA (complementary DNA
taire) en utilisant comme gabarit l'ARNm choisi (provenant using the chosen mRNA (from
des polysomes adsorbés). L'ARNm radiomarqué ou l'ADNc radio- adsorbed polysomes). Radiolabeled mRNA or radio-labeled cDNA
marqué peuvent alors servir de sonde pour identifier les fragments de ADN de LAV/HTLV III contenant des séquences de can then be used as a probe to identify LAV / HTLV III DNA fragments containing
gènes d'enveloppe ou de gag. Au lieu d'isoler le gène d'enve- envelope or gag genes. Instead of isolating the enve-
loppe ou de gag, on peut, sans que cette liste soit limi- of work or gag, we can, without this list being limited
tative, effectuer la synthèse chimique de la séquence de gène elle-même (à la condition que la séquence soit connue) ou transformer ADNc en ARNm qui code le gène d'enveloppe ou gag Une fois identifié et isolé, le fragment d'ADN de LAV/HTLV III contenant les séquences intéressantes peut être tative, perform the chemical synthesis of the gene sequence itself (provided the sequence is known) or transform cDNA into mRNA that encodes the coat or gag gene. Once identified and isolated, the DNA fragment LAV / HTLV III containing the interesting sequences can be
tout d'abord inséré dans un vecteur de clonage, tel un sec- first inserted into a cloning vector, such as a sec-
teur de clonage de plasmide, qui sert à transformer des cel- plasmid cloning, which serves to transform
lules hôtes appropriées afin de provoquer la réplication de l'ADN de manière à engendrer de nombreuses copies des séquences intéressantes de LAV/HTLV III. On peut y parvenir en provoquant la ligation du fragment de ADN de LAV/HTLV III dans un vecteur de clonage comportant des terminaisons cohé- sives complémentaires. Cependant, si les sites de restriction complémentaires servant à fragmenter l'ADN de LAV/HTLV III Suitable host cells to cause replication of the DNA to generate many copies of the relevant LAV / HTLV III sequences. This can be achieved by ligating the LAV / HTLV III DNA fragment into a cloning vector with complementary coherent termini. However, if complementary restriction sites serve to fragment LAV / HTLV III DNA
ne sont pas présents dans le vecteur de clonage, les extré- are not present in the cloning vector, the extremes
mités des molécules de ADN risquent d'être modifiées. De telles modifications comprennant la production d'extrémités émoussées par digestion des terminaisons de ADN à simple brin ou par garnissage des terminaisons à simple brin de manière que les extrémités puissent subir une ligation d'extrémité émoussée. En variante, on peut produire n'importe quel site voulu en fixant par ligation des séquences de nucléotides (agents de liaison) sur les terminaisons d'ADN; ces agents de liaison ligaturés peuvent comprendre des oligonucléotides spécifiques, synthétisés par voie chimique, et codant des séquences de reconnaissance de sites de restriction. Selon mutated DNA molecules may be modified. Such modifications include the production of blunt ends by digestion of the single-stranded DNA termini or by packing the single-ended termini so that the ends can be blunt end ligation. Alternatively, any desired site can be produced by ligating nucleotide sequences (binding agents) on the DNA termini; these ligated binding agents may comprise specific oligonucleotides, synthesized chemically, and coding restriction site recognition sequences. according to
d'autres procédés, on peut modifier, par terminaison homo- other processes can be modified by homogeneous termination
polymère, le vecteur clivé et le fragment de ADN de LAV/HTLV III. polymer, the cleaved vector and the LAV / HTLV III DNA fragment.
La transformation de cellules hôtes par des molé- Transformation of host cells by molecules
cules de ADN recombinants qui incorporent le gène isolé, par ADNc ou une séquence de ADN obtenue par synthèse, permet d'engendrer de multiples copies du gène. Ainsi, le gène peut Recombinant DNA molecules that incorporate the isolated gene, by cDNA or a synthetically obtained DNA sequence, make it possible to generate multiple copies of the gene. So, the gene can
être obtenu en grandes quantités par la croissance de trans- to be obtained in large quantities through the growth of trans-
* formants, l'isolement des molécules de ADN recombinant à partir des transformants et, quand cela est nécessaire, la récupération du gène inséré,à partir de l'ADN recombinant isolé. Si le but ultime consiste à insérer le gène dans des vecteurs d'expression de virus, comme le virus de la vaccine ou l'adénovirus, la molécule de ADN recombinant qui incorpore le gène LAV/HTLV III peut être modifiée de manière que le gène soit entouré par des séquences de virus permettant la recombinaison génétique dans des cellules infectées par le virus, de sorte que le gène puisse être inséré dans le* Formants, the isolation of recombinant DNA molecules from the transformants and, when necessary, the recovery of the inserted gene, from the isolated recombinant DNA. If the ultimate goal is to insert the gene into virus expression vectors, such as vaccinia virus or adenovirus, the recombinant DNA molecule that incorporates the LAV / HTLV III gene can be modified so that the gene surrounded by virus sequences allowing for genetic recombination into virus-infected cells, so that the gene can be inserted into the
génome viral.viral genome.
La totalité du génome de LAV/HTLV III a été clonée et séquencée par WainHobson et col. (S. Wain-Hobson et col., 1985, Cell 40:9). Un clone, appelé lambda J19, a contenu un fragment de ADN de 9,2 kilopaires de bases d'une séquence de génome de LAV insérée dans le site Hind III de lambda The entire genome of LAV / HTLV III was cloned and sequenced by WainHobson et al. (S. Wain-Hobson et al., 1985, Cell 40: 9). A clone, termed J19 lambda, contained a 9.2 kilobaseous base DNA fragment of an LAV genome sequence inserted into the lambda Hind III site.
L 47.1.L 47.1.
Un sous-clone particulièrement utile de lambda J19, contenant le gène d'enveloppe LAV/HTLV III, est pRS-3 qui A particularly useful subclone of lambda J19, containing the LAV / HTLV III envelope gene, is pRS-3 which
consiste en un fragment, à 3840 paires de bases EcoRI vers SstI. consists of a fragment at 3840 base pairs EcoRI to SstI.
de la séquence de nucléotides de LAV/HTLV III insérée, dans le site EcoRi et SstI de pUC18. L'ADN spécifique de LAV/HTLV III contenu dans pRS-3 se situe entre le site EcoRI placé au nucléotide 5289 et le site SstI placé au nucléotide 9129 sur le génome de LAV/HTLV III (S. Wain-Hobson et col., 1985, Cell 40:9); voir la figure 2 qui montre la séquence de nucléotides de LAV/HTLV III contenue dans pRS-3. Cependant, en raison de la dégénérescence des séquences codant pour les nucléotides, on peut utiliser dans la pratique de la présente invention, pour le clonage du gène d'enveloppe de LAV/HTLV III, d'autres séquences de ADN qui codent pratiquement la même séquence des aminoacides que celle présentée sur- la figure 2. Cela comprend, sans qẻ 6ela soi.t limitatif, des séquences de nucléotides comprenant la totalité ou des parties de la séquence des nucléotides d'enveloppe représentées sur of the LAV / HTLV III nucleotide sequence inserted into the EcoRi and SstI site of pUC18. The specific LAV / HTLV III DNA contained in pRS-3 is located between the EcoRI site placed at nucleotide 5289 and the SstI site placed at nucleotide 9129 on the LAV / HTLV III genome (S. Wain-Hobson et al., 1985, Cell 40: 9); see Figure 2 which shows the nucleotide sequence of LAV / HTLV III contained in pRS-3. However, due to the degeneracy of the nucleotide coding sequences, in the practice of the present invention, for the cloning of the LAV / HTLV III envelope gene, other DNA sequences which encode substantially the same amino acid sequence as shown in FIG. 2. This includes, but is not limited to, nucleotide sequences comprising all or portions of the envelope nucleotide sequence shown on FIG.
la figure 2, qui sont modifiées par remplacement de diffé- Figure 2, which are amended by replacing
rents codons qui codent le même reste aminoacide ou un reste aminoacide fonctionnellement équivalent au sein de la séquence (par exemple un aminoacide de même polarité), en produisant codons which encode the same amino acid residue or a functionally equivalent amino acid residue within the sequence (for example, an amino acid of the same polarity), producing
un changement silencieux.a silent change.
Des sous-clones particulièrement utiles de lambda Particularly useful subclones of lambda
J19 contenant le gène gag de LAV/HTLV III sont pKS-5 et pSS5. J19 containing the gag gene of LAV / HTLV III are pKS-5 and pSS5.
Le plasmide pKS5 consiste en un fragment de LAV/HTLV III com- The plasmid pKS5 consists of a fragment of LAV / HTLV III com-
portant 3148 paires de base de SstI vers KpnI dans pUC18. carrying 3148 base pairs of SstI to KpnI in pUC18.
L'ADN spécifique de LAV/HTLV III contenu dans pKS-5 va du site SstI situé sur le nucléotide 224 au site KpnI situé au nucleotide 3372 sur le génome LAV/HTLV III. Le plasmide pSS-5 consiste en un fragment de 5,1 kbp de SstI vers SalI de LAV/ The specific LAV / HTLV III DNA contained in pKS-5 goes from the SstI site located on nucleotide 224 to the KpnI site located at nucleotide 3372 on the LAV / HTLV III genome. Plasmid pSS-5 consists of a 5.1 kbp fragment of SstI to SalI of LAV /
HTLV III dans pUC 18. L'ADN spécifique de LAV/HTLV III conte- HTLV III in pUC 18. The specific DNA of LAV / HTLV III contains
nu dans pSS-5 provient du site SstI situé au nucléotide 224 jusqu'au site SalI situé au nucléotide 5331 sur le génome de LAV/HTLV III. (Wain-Hobson, S. et col., 1985, Cell 40:9), voir figure 14, qui décrit la séquence des nucléotides de nude in pSS-5 comes from the SstI site at nucleotide 224 to the SalI site at nucleotide 5331 on the LAV / HTLV III genome. (Wain-Hobson, S. et al., 1985, Cell 40: 9), see Figure 14, which describes the nucleotide sequence of
LAV/HTLV III contenue dans pKS-5 et PSS-5. Cependant, en rai- LAV / HTLV III contained in pKS-5 and PSS-5. However, due
son de la dégénerescence des séquences de codage des nucléo- the degeneracy of the coding sequences of
tides, on peut utiliser la pratique de la présente invention, tides, the practice of the present invention can be used,
pour le clonage du gène gag de LAV/HTLV III, d'autres séquen- for the cloning of the LAV / HTLV III gag gene, other sequences
ces de ADN qui codent sensiblement la même séquence des amino- those of DNA which encode substantially the same sequence of amino-
acides que celle représentée sur la figure 14. Cela comprend, sans que cela soit limitatif, des séquences de nucléotides comprenant la totalité ou des parties de ia séquence des same as that shown in Figure 14. This includes, but is not limited to, nucleotide sequences comprising all or portions of the sequence of
nucléotides gag représentée sur la figure 14, qui sont modi- gag nucleotides shown in Figure 14, which are modified
fiés par substitution de codons différents qui codent le même reste aminoacide, ou un reste aminoacide fonctionnellement équivalent, dans la séquence (par exemple un amioacide de by substitution of different codons which encode the same amino acid residue, or a functionally equivalent amino acid residue, in the sequence (for example a
même polarité), en produisant ainsi un changement silencieux. same polarity), thus producing a silent change.
INSERTION DES SEQUENCES DE CODAGE DE PROTEINES DE LAV/HTLV INSERTING ENCODING SEQUENCES OF LAV / HTLV PROTEINS
III DANS DES VECTEURS D'EXPRESSIONIII IN EXPRESSION VECTORS
On insère la séquence des nucléotides codant pour la protéine d'enveloppe de LAV/HTLV III, ou une partie de The nucleotide sequence coding for the LAV / HTLV III envelope protein, or part of it, is inserted.
cette séquence, dans un vecteur d'expression approprié, c'est- this sequence, in an appropriate expression vector, is it
&-dire un vecteur qui contient les éléments nécessaires pour la transcription et la translation de la séquence de codage a vector that contains the elements necessary for transcription and translation of the coding sequence
de protéines insérées. On peut utiliser divers systèmes hôtes- of inserted proteins. Various host systems can be used
vecteurs pour exprimer la séquence de codage des protéines. vectors to express the coding sequence of proteins.
Cela comprend, sans que ce soit limitatif, des systèmes de cellules de mammifères infectées par des virus (par exemple le virus de la vaccine, de l'adénovirus, etc.); des systèmes de cellules d'insectes infectées par des virus (par exemple du baculovirus); des micro-organismes comme de la levure contenant des vecteurs ou bactéries de levure transformés par de l'ADN de bactériophage, de l'ADN de plasmide ou de l'ADN de cosmide. Les éléments d'expression de ces vecteurs varient en force et spécificité. Selon le système hôte-vecteur This includes, but is not limited to, mammalian cell systems infected with viruses (e.g., vaccinia virus, adenovirus, etc.); insect cell systems infected with viruses (eg baculovirus); microorganisms such as yeast containing vectors or yeast bacteria transformed with bacteriophage DNA, plasmid DNA or cosmid DNA. The expression elements of these vectors vary in strength and specificity. According to the host-vector system
que l'on utilise, on peut utiliser n'importe lequel d'un cer- that we use, we can use any of
tain nombre d'éléments convenables de transcription et de translation. Par exemple, quand on effectue un clonage dans des systèmes de cellules de mammifères, on peut utiliser des a number of suitable transcription and translation elements. For example, when cloning into mammalian cell systems, one can use
promoteurs isolés à partir du génome des cellules de mammi- promoters isolated from the genome of mammalian cells.
fères (par exemple un promoteur de type métallothioniène de souris) ou isolés à partir de virus dont la croissance s'effectue dans ces cellules (par exemple le promoteur 7,5K de virus de vaccine). On peut aussi utiliser des promoteurs fers (for example a mouse metallothioniene promoter) or isolated from viruses which grow in these cells (for example the vaccinia virus 7.5K promoter). Promoters can also be used
produits par de l'ADN recombinant ou par des techniques syn- produced by recombinant DNA or by synthetic techniques.
thétiques, pour assurer la transcription des séquences insé- theories, to ensure the transcription of
rées. Il faut aussi des signaux spécifiques d'amorçage pour une translation efficace des séquences insérées de codage de protéines. Ces signaux comprennent le codon d'amorçage ATG et les séquences adjacentes. Quand on insère dans les Rees. Specific bootstrapping signals are also required for efficient translation of the inserted protein coding sequences. These signals include the ATG initiation codon and the adjacent sequences. When we insert in the
vecteurs d'expression appropriés la totalité du gène d'enve- appropriate expression vectors the entire enve-
loppe ou gag de de LAV/HTLV III, y compris son propre codon d'amorçage et les séquences adjacentes, des signaux témoins loppe or gag of LAV / HTLV III, including its own priming codon and the flanking sequences, control signals
supplémentaires pour la translation peuvent ne pas être néces- additional requirements for translation may not be necessary.
saires. Cependant, quand on insère une partie seulement de la séquence de codage d'enveloppe, ou gag, il faut fournir sary. However, when inserting only a part of the envelope coding sequence, or gag, it is necessary to provide
des signaux exogènes de commande de translation, ce qui com- exogenous translational control signals, which
prend le codon d'amorçage ou initiation de traduction ATG. takes the initiation codon or ATG translation initiation.
Le codon d'amorçage ou initiation doit en outre être en phase avec le cadre de lecture des séquences de codage de The initiation or initiation codon must also be in phase with the reading frame of the coding sequences of
protéines d'enveloppe pour garantir la translation de la tota- envelope proteins to guarantee the translation of the entire
lité de la séquence insérée. Ces signaux exogènes de commande de translation et ces codons d'iniation ou amorçage de of the inserted sequence. These exogenous translational control signals and these codons of iniation or priming of
traduction peuvent avoir diverses origines, aussi bien natu- translation may have various origins, both natural and
relles que synthétiques.only synthetic.
On peut utiliser n'importe laquelle des méthodes antérieurement décrites pour l'insertion de fragments de ADN dans un vecteur pour construire des vecteurs d'expression Any of the previously described methods for inserting DNA fragments into a vector can be used to construct expression vectors.
contenant un gène chimère consistant en des signaux appro- containing a chimeric gene consisting of appropriate signals
priés de commande de transcription/translation et les requested transcription / translation command and
2587720'2587720 '
séquences de codage de protéines. Ces procédés peuvent com- protein coding sequences. These processes can
prendre des techniques utilisant de l'ADN recombinant "in vitro" et des techniques synthétiques et une recombinaison take techniques using recombinant DNA "in vitro" and synthetic techniques and recombination
"in vivo" (recombinaison génétique). "in vivo" (genetic recombination).
Dans les formes particulières de réalisation décri- tes en détail dans les exemples de la présente invention, le virus de la vaccine et le baculovirus ont été choisis comme vecteurs d'expression. Cependant, l'invention ne se In the particular embodiments described in detail in the examples of the present invention, vaccinia virus and baculovirus have been chosen as expression vectors. However, the invention does not
limite pas à l'utilisation du virus de la vaccine ou du bacu- not limit the use of vaccinia virus or
lovirus. Comme précédemment expliqué, les vecteurs d'expres- lovirus. As previously explained, the vectors of expres-
sion utilisables comprennent, sans qu'on doive se limiter can not be limited to
aux vecteurs suivants ou à leurs dérivés: des virus infec- the following vectors or their derivatives: infected viruses
tant les êtres humains ou les animaux comme le virus de la vaccine ou les adénovirus; les virus infectant les insectes comme des baculovirus; des vecteurs de type levure; des cturs de type bactériophage, et des vecteurs de type ADN both human beings and animals such as vaccinia virus or adenoviruses; viruses infecting insects such as baculoviruses; yeast vectors; bacteriophage-like cells, and DNA-like vectors
de plasmide et de cosmide,pour n'en citer que quelques-uns. plasmid and cosmid, to name a few.
Quand on utilise un adénovirus comme vecteur d'expression, le gène de LAV/HTLV III est fixé par ligation sur un complexe de commande de transcription/translation d'adénovirus, par exemple la dernière séquence de promoteur et les séquences tripartites de tête. Ce gène chimère est When an adenovirus is used as an expression vector, the LAV / HTLV III gene is ligated to an adenovirus transcription / translation control complex, for example the last promoter sequence and the tripartite leader sequences. This chimeric gene is
ensuite inséré dans le génome de l'adénovirus par recombinai- then inserted into the genome of adenovirus by recombinant
son "in vitro" ou "in vivo". L'insertion dans une région non essentielle du génome de virus (par exemple la région El ou E3) va donner un virus recombinant qui est viable et capable d'exprimer, dans les hôtes infectés, la protéine apparentée its "in vitro" or "in vivo". Insertion into a non-essential region of the virus genome (e.g. E1 or E3 region) will result in a recombinant virus that is viable and capable of expressing, in infected hosts, the related protein.
à LAV/HTLV III. Actuellement, il existe deux souches d'adéno- to LAV / HTLV III. Currently, there are two strains of adeno-
virus (types 4 et 7) approuvées et utilisées comme vaccins pour le personnel militaire. Elles constituent les premiers candidats à utiliser comme vecteurs pour exprimer des gènes viruses (types 4 and 7) approved and used as vaccines for military personnel. They are the first candidates to use as vectors to express genes
de LAV/HTLV III.of LAV / HTLV III.
En outre, on peut choisir une souche de cellules In addition, one can choose a strain of cells
hôtes qui module l'expression des séquences insérées,ou modi- which modulates the expression of inserted sequences, or modifies
fie et traite le gène chimique produit de la façon spécifique voulue. On peut augmenter l'expression de certains promoteurs en présence de certains inducteurs (par exemple les ions zinc and process the produced chemical gene in the desired specific manner. The expression of certain promoters can be increased in the presence of certain inducers (for example zinc ions
2587720',2587720 '
et cadmium pour des promoteurs de métallothionéine). Donc, on peut régler l'expression de la protéine de LAV/HTLV III obtenue par génie génétique. Cela est important si le produit and cadmium for metallothionein promoters). Thus, the expression of the genetically engineered LAV / HTLV III protein can be regulated. This is important if the product
protéinique du gène étranger cloné est mortel pour les cellu- protein from the cloned foreign gene is lethal to cells
les hôtes. En outre, des modifications (par exemple une gly- cosylation) et un traitement (par exemple un clivage) des produits protéiniques sont importants pour le fonctionnement the hosts. In addition, modifications (e.g. glycosylation) and treatment (e.g. cleavage) of the protein products are important for the operation.
de la protéine. Des cellules hôtes différentes ont des méca- of the protein. Different host cells have mechanisms
nismes caractéristiques et spécifiques de traitement post- specific and specific post-treatment
translation et de modification des protéines. On peut choisir des lignées de cellules appropriées ou des systèmes d'hôtes appropriés pour garantir'la modification et le traitement translation and modification of proteins. Appropriate cell lines or host systems may be selected to ensure modification and treatment
corrects de la protéine étrangère exprimée. correct of the foreign protein expressed.
Dans deux formes particulières de réalisation décri- In two particular forms of decri-
tes en détail dans les exemples de la présente invention, on a fait la ligation des séquences codant l'enveloppe de LAV/HTLV III chimères, aussi bien dans leur forme complète que dans leurs portions, ou des séquences de codage gag de LAV/HTLV III sur le promoteur à 7,5K du virus de vaccine pour former des gènes chimères dans divers plasmides. On a entouré les In detail in the examples of the present invention, the chimeric LAV / HTLV III envelope coding sequences were ligated, both in their full form and in their portions, or LAV / HTLV gag coding sequences. III on the 7.5K promoter of vaccinia virus to form chimeric genes in various plasmids. We surrounded
gènes chimères de ces plasmides par des séquences supplémen- chimeric genes of these plasmids by additional sequences
taires du virus de la vaccine homologues du gène TK de virus de la vaccine. La construction du gène chimère a impliqué vaccinia virus homologs homologous to the vaccinia virus TK gene. The construction of the chimeric gene involved
l'utilisation de nucléotides, aussi bien naturels que syn- the use of nucleotides, both natural and syn-
thétiques, codant des signaux de commande pour la transcrip- theories, coding control signals for the transcription of
tion et la translation des séquences d'enveloppe de LAV/HTLV translation and translation of LAV / HTLV envelope sequences
III ou les séquences gag de LAV/HTLV III. On a ensuite intro- III or gag sequences of LAV / HTLV III. We then introduced
duit ces gènes chimères dans les vecteurs d'expression de virus de vaccine par recombinaison ' in vivo" entre la région TK homologue présente sur le vecteur de plasmide et le génome de virus de vaccine. On a utilisé ces virus recombinants, contenant le gène chimère, comme vecteurs d'expression pour produire des protéines apparentées à l'enveloppe de LAV/HTLV III ou produire des protéines apparentées à gag de LAV/HTLV These chimeric genes were generated in the vaccinia virus expression vectors by recombination in vivo between the homologous TK region present on the plasmid vector and the vaccinia virus genome, using these recombinant viruses containing the chimeric gene. as expression vectors for producing LAV / HTLV III-related proteins or producing gag-related proteins of LAV / HTLV
III.III.
Dans d'autres modes particuliers de réalisation détaillés dans les exemples de la présente invention, on a effectué la ligation des séquences de codage d'enveloppe de LAV/HTLV III ou des séquences de codage de gag de LAV/HTLV III sur le promoteur de polyédrine du virus de polyédrose nucléaire Autographa Californica (AcNPV) pour'former des gènes chimères dans divers plasmides. Les gènes chimères dans ces plasmides ont été entourés par des séquences additionnelles de AcNPV. La construction des gènes chimères a impliqué l'utilisation de signaux de commande de codage des nucléotides naturels pour la transcription et la translation des séquences de gag ou enveloppe de LAV/HTLV III. On a ensuite introduit les gènes chimères dans les vecteurs d'expression de AcNPV, par recombinaison in vivo entre les ADN homologues présents sur le vecteur plasmide et le génome de AcNPV. On a utilisé ces virus recombinants, contenant les gènes chimères, comme vecteurs d'expression pour produire des protéines apparentées à l'enveloppe de LAV/HTLV III ou des protéines apparentées In other particular embodiments detailed in the examples of the present invention, the LAV / HTLV III envelope coding sequences or LAV / HTLV III gag coding sequences were ligated to the LAV / HTLV III gag coding sequence. polyhedrin of Autographa Californica nuclear polyhedrosis virus (AcNPV) for forming chimeric genes in various plasmids. The chimeric genes in these plasmids were surrounded by additional sequences of AcNPV. The construction of the chimeric genes involved the use of natural nucleotide coding control signals for transcription and translation of LAV / HTLV III gag or envelope sequences. The chimeric genes were then introduced into the AcNPV expression vectors by in vivo recombination between the homologous DNAs present on the plasmid vector and the AcNPV genome. These recombinant viruses, containing the chimeric genes, were used as expression vectors to produce LAV / HTLV III-related proteins or related proteins.
à gag de LAV/HTLV III.to gag of LAV / HTLV III.
IDENTIFICATION DE VECTEURS D'EXPRESSION RECOMBINANTS IDENTIFICATION OF RECOMBINANT EXPRESSION VECTORS
CAPABLES DE REPLICATION ET D'EXPRESSION DU GENE INSERE CAPABLE OF REPLICATION AND EXPRESSION OF INSERTED GENE
On peut identifier par trois approches générales les vecteurs d'expression contenant des séquences insérées de gènes étrangers: (a) hybridation ADN-ADN; (b) présence ou absence de fonctions de gène "marqueur", et (c) expression Three general approaches can be used to identify expression vectors containing inserted sequences of foreign genes: (a) DNA-DNA hybridization; (b) presence or absence of "marker" gene functions, and (c) expression
de séquences insérées.inserted sequences.
Une fois une molécule particulière de ADN recombinant identifiée et isolée, on peut utiliser plusieurs procédés pour en provoquer la propagation, selon qu'un tel recombinant Once a particular molecule of recombinant DNA has been identified and isolated, several methods can be used to propagate it, depending on whether such a recombinant
constitue ou non une unité à autoréplication (un réplicon). is a self-replicating unit (a replicon)
Une unité à autoréplication, par exemple des plasmides, des A self-replicating unit, for example plasmids,
virus, des cellules, etc., peut se multiplier dans l'environ- viruses, cells, etc., can multiply in the environ-
nement cellulaire approprié et dans des conditions appro- cell and under appropriate conditions.
priées de croissance. Des recombinants manquant d'une unité required for growth. Recombinants missing a unit
d'autoréplication devront être intégrés à une molécule com- self-replication will have to be integrated into a com-
portant une telle unité pour que la propagation puisse avoir lieu. Par exemple, certains vecteurs d'expression de plasmide doivent, lors de leur introduction dans une cellule hôte, carrying such a unit for propagation to take place. For example, certain plasmid expression vectors must, when introduced into a host cell,
être intégrés au chromosome cellulaire Dour qarantir la Dro- to be integrated into the cell chromosome Dour quarring the Dro-
pagation et une expression stable du gène recombinant. Une fois établis un système d'hôtes convenables et des conditions convenables de croissance, on peut provoquer la propagation des vecteurs d'expression recombinants et les préparer en quantité. Dans des formes particulières de mise en oeuvre de l'invention décrites en détail dans les exemples, on a inséré des gènes chimères contenant la séquence codant l'enveloppe ou gag de LAV/HTLV III dans le gène TK du génome de virus pagation and stable expression of the recombinant gene. Once a suitable host system and suitable growth conditions have been established, the propagation of the recombinant expression vectors can be propagated and prepared in quantity. In particular embodiments of the invention described in detail in the examples, chimeric genes containing the sequence encoding the coat or gag of LAV / HTLV III were inserted into the TK gene of the virus genome.
de la vaccine, en transformant ainsi le virus en TK-, c'est- vaccinia, thus transforming the virus into TK-, that is,
à-dire en détruisant l'aptitude du virus à fabriquer de la thymidine kinase. On a choisi de tels recombinants d'après that is, destroying the ability of the virus to make thymidine kinase. Such recombinants have been chosen according to
leur aptitude à croître dans des milieux contenant de la 5- their ability to grow in media containing 5-
bromo-désoxy-uridine, qui est un nucléoside analogue à celui mortel pour les cellules TK mais non pas pour les cellules TK-. On a en outre identifié des recombinants par hybridation ADN-ADN, en utilisant des sondes spécifiques de l'enveloppe de LAV/HTLV III ou des sondes spécifiques de gag de LAV/HTLV bromo-deoxy-uridine, which is a nucleoside analogous to the lethal one for TK cells but not for TK- cells. Recombinants have also been identified by DNA-DNA hybridization, using LAV / HTLV III envelope specific probes or LAV / HTLV gag specific probes.
III On -a- isolé- l -virus recombinant TK _par purification _. The recombinant TK virus is isolated by purification.
sur plaque et l'on a préparé des stocks de réserve-à partir plate and stockpiles were prepared from
de cellules de cultures tissulaires infectées. infected tissue culture cells.
Dans d'autres fodrmes particulières de mise en oeuvre de l'invention, décrites en détail dans les exemples, on a inséré des gènes chimères contenant la séquence de codage enveloppe ou gag de LAV/HTLV III dans le gène de polyhédrine du génome de AcNPV, en transformant ainsi le virus en un phénotype de non-occlusion. On a choisi visuellement de tels recombinants d'après leur absence de particules de virus occlus. On a encore identifié les recombinants par analyse de coagulation de type Northern (Nord) en utilisant des sondes In other particular embodiments of the invention, described in detail in the examples, chimeric genes containing the envelope or gag coding sequence of LAV / HTLV III in the polyhedrin gene of the AcNPV genome have been inserted. , thereby transforming the virus into a non-occlusion phenotype. Such recombinants were visually selected based on their absence of occluded virus particles. Recombinants were further identified by Northern (Northern) coagulation analysis using probes
spécifiques d'enveloppe de LAV/HTLV III ou des sondes spéci- specific LAV / HTLV III envelope or specific probes
fiques de type gag de LAV/HTLV III. On a isolé les virus recombinants par purification de plaques et l'on a préparé gag of LAV / HTLV III. Recombinant viruses were isolated by plaque purification and prepared
des stocks de réserve à partir de cellules de cultures tissu- reserve stocks from tissue culture cells
laires infectées.infected.
IDENTIFICATION ET PURIFICATION DU PRODUIT DU GENE EXPRIME IDENTIFICATION AND PURIFICATION OF THE PRODUCT OF THE EXPRESS GENE
Une fois identifié un recombinant qui exprime le Once identified a recombinant that expresses the
gène LAV/HTLV III, il convient d'analyser le produit du gène. LAV / HTLV III gene, the gene product should be analyzed.
On peut y parvenir par des analyses et dosages se fondant This can be achieved through analyzes and assays based on
sur les propriétés physiques, immunologiques ou fonctionnel- physical, immunological or functional properties-
les du produit. Une analyse immunologique est particulièrement importante lorsque le but final consiste à utiliser les produits de gènes ou virus recombinants qui expriment de tels the product. Immunoassay is particularly important when the ultimate goal is to use gene products or recombinant viruses that express such
produits dans des formulations de vaccins et/ou à titre d'an- products in vaccine formulations and / or as
tigènes dans des dosages immunologiques pour diagnostics. tigenes in immunological assays for diagnostics.
Divers antisérums sont disponibles pour analyser l'immunoréactivité du produit, ce qui comprend, sans que ce soit limitatif, du sérum provenant de patients atteints de LAS (syndrome d'adénopathie) ou de SIDA et des anti-sérums polyvalents dirigés contre le virus LAV/HTLV, la protéine d'enveloppe virale ou des protéines de noyau codées par le gène gag. Les molécules immunogènes comprennent des analogues Various antisera are available to analyze the immunoreactivity of the product, which includes, but is not limited to, serum from patients with LAS (adenopathy syndrome) or AIDS and polyvalent antisera directed against LAV virus. / HTLV, viral coat protein or core proteins encoded by the gag gene. Immunogenic molecules include analogs
produits dans des systèmes bactériens, ou des peptides syn- produced in bacterial systems, or syngeneic peptides
-hétiques contenant des déterminants antigéniques de l'enve- containing antigenic determinants of the envenom-
loppe de LAV/HTLV III ou des antigènes de noyau LAV/HTLV III. L'identification des peptides et protéines décrits dans la présente LAV / HTLV III or LAV / HTLV III core antigens. The identification of the peptides and proteins described herein
invention se fonde sur deux exigences. En premier lieu, la protéine apparentée à l'enveloppe de LAV/HTLV III doit être produite seulement dans des cellules infectées par du virus recombinant. En second lieu, la protéine apparentée LAV/HTLV III doit être capable d'une réaction immunologique avec le sérum de patients atteints de SIDA ou avec divers anticorps dirigés contre les protéines d'enveloppe ou de The invention is based on two requirements. First, the LAV / HTLV III-related protein is to be produced only in cells infected with recombinant virus. Secondly, the related LAV / HTLV III protein must be capable of immunological reaction with the serum of AIDS patients or with various antibodies directed against envelope or
noyau de LAV/HTLV III ou leurs analogues et dérivés. LAV / HTLV III core or their analogues and derivatives.
-La protéine doit être immunoréactive, qu'elle résulte de l'expression de la totalité de la séquence entière de gènes, d'une partie de séquence de gènes ou de deux ou plusieurs séquences de gènes qui sont liées par ligation pour diriger la production de protéines de fusion. Cette réactivité peut -The protein must be immunoreactive, whether it results from the expression of the entire entire sequence of genes, a part of the gene sequence or two or more gene sequences that are linked by ligation to direct production fusion proteins. This reactivity can
être mise en évidence par des techniques immunologiques clas- to be demonstrated by standard immunological techniques
siques, comme une radio-immunoprécipitation, une compétition as a radioimmunoprecipitation, a competition
radio-immunologique ou des immunocaillots. radioimmunoassay or immunocoagles.
Une fois identifiée la protéine apparentée à LAV/ HTLV III, on peut isoler et purifier cette protéine par des méthodes classiques comprenant la chromatographie (par exemple la chromatographie par échange d'ions, par affinité et dans une colonne de classement par dimensions), par centrifugation, par différence de solubilité, ou par n'importe quelle autre technique classique pour la purification de protéines. Once the LAV / HTLV III-related protein has been identified, this protein can be isolated and purified by conventional methods including chromatography (eg ion exchange, affinity and column chromatography), by centrifugation, by solubility difference, or by any other conventional technique for the purification of proteins.
En variante, une fois identifiée une protéine immu- Alternatively, once an immune protein has been identified,
no-réactive apparentée à LAV/HTLV III et produite par un recombinant, on peut déduire la séquence des-aminoacides de la protéine immunoréactive d'après la séquence des nucléotides du gène chimère contenu dans le recombinant. Par suite, la protéine peut être synthétisée par des méthodes chimiques classiques connues en pratique (voir, par exemple, As a non-reactive related to LAV / HTLV III and produced by a recombinant, one can deduce the sequence of-amino acids of the immunoreactive protein according to the nucleotide sequence of the chimeric gene contained in the recombinant. As a result, the protein can be synthesized by conventional chemical methods known in the art (see, for example,
M. Hunkapiller et col., 1984, Nature 310:105-111). M. Hunkapiller et al., 1984, Nature 310: 105-111).
Dans des formes particulières de réalisation de la présente invention, de tels peptides, qu'ils soient produits par des techniques utilisant de l'ADN recombinant ou par des méthodes de synthèse chimique, Comprennent, sans que cette liste soit limitative, la totalité ou une partie des séquences des aminoacides essentiellement comme représenté sur la figure 2 ou sur la figure 14, ce qui comprend des séquences altérées dans lesquelles des restes d'aminoacides fonctionnellement équivalents remplacent des restes au sein de la séquence, ce qui crée une variation silencieuse. Par exemple, un ou plusieurs restes d'aminoacides de la séquence peuvent être remplacés par un autre aminoacide de polarité semblable, qui joue le rôle d'un équivalent fonctionnel, en donnant une altération silencieuse. On peut choisir, parmi In particular embodiments of the present invention, such peptides, whether produced by recombinant DNA techniques or by chemical synthesis methods, include, but are not limited to, all or one of the following: part of the amino acid sequences substantially as shown in Figure 2 or Figure 14, which includes altered sequences in which functionally equivalent amino acid residues replace residues within the sequence, creating silent variation. For example, one or more amino acid residues in the sequence may be replaced by another amino acid of similar polarity, which acts as a functional equivalent, giving a silent alteration. We can choose, among
d'autres membres de la classe à laquelle l'aminoacide appar- other members of the class to which the amino acid belongs
tient, des éléments pour remplacer un aminoacide au sein de holds, elements to replace an amino acid within
la séquence. Par exemple, les aminoacides non polaires (hydro- the sequence. For example, non-polar amino acids (hydro-
phobes) comprennent l'alanine, la leucine, l'isoleucine, la valine, la proline, la phénylalanine, le tryptophanne et la méthionine. Les aminoacides neutres polaires comprennent la glycine, la sérine, la thréonine, la cystéine, la tyrosine, l'asparagine et la glutamine. Les aminoacides (basiques) à phobes) include alanine, leucine, isoleucine, valine, proline, phenylalanine, tryptophan and methionine. Neutral polar amino acids include glycine, serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagine and glutamine. Amino acids (basic) to
charge positive comprennent l'arginine, la lysine et l'histi- positive charge include arginine, lysine and histi-
dine. Les aminoacides (acides) à charge négative comprennent 4 n dine. Amino acids (acids) with negative charge include 4 n
l'acide aspartique et l'acide glutamique. aspartic acid and glutamic acid.
DETERMINATION DU POUVOIR IMMUNITAIRE DU DETERMINATION OF THE IMMUNE POWER OF THE
PRODUIT RECOMBINANTRECOMBINANT PRODUCT
On peut déterminer le pouvoir immunitaire du produit apparenté à LAV/HTLV III en surveillant la réponse immuno- logique d'animaux d'essai après immunisation par injection de la protéine purifiée ou du peptide ou protéine de synthèse purifiée. Quand la protéine apparentée à LAV/HTLV III est The immune power of the LAV / HTLV III related product can be determined by monitoring the immunological response of test animals after immunization by injection of the purified protein or purified synthetic peptide or protein. When the protein related to LAV / HTLV III is
exprimée par un virus recombinant infectieux, on peut utili- expressed by an infectious recombinant virus, it is possible to use
ser le virus recombinant lui-même pour immuniser les animaux d'essai. Les animaux d'essai peuvent comprendre des souris, des lapins, des chimpanzés, et l'on peut éventuellement aussi faire appel à des êtres humains. Des méthodes d'introduction de l'immunogène peuvent comprendre la voie intradermique, intramusculaire, intrapéritonéale, intraveineuse, souscutanée, ser the recombinant virus itself to immunize the test animals. The test animals may include mice, rabbits, chimpanzees, and possibly humans may also be used. Methods of introducing the immunogen may include intradermal, intramuscular, intraperitoneal, intravenous, subcutaneous,
intranasale ou n'importe quelle autre voie classique d'immu- intranasal or any other classical route of immunization
nisation. La réponse imnl=togique-des sujets-d-essai peut être analysée par trois approches: (a) la réactivité de nization. The empirical response of the test subjects can be analyzed by three approaches: (a) the reactivity of
l'immun sérum résultant à l'égard d'antigènes viraux authen- the resulting serum immunity with respect to authentic viral antigens.
tiques de LAV/HTLV III, selon des dosages ou essais effectués LAV / HTLV III ticks, according to assays or tests carried out
par des techniques connues, par exemple le dosage par immuno- by known techniques, for example the immunoassay
sorption avec enzyme liée (ELISA), les immunocoagulats, des enzyme-linked sorption (ELISA), immunocoagulants,
radio-immunoprécipitations, etc. (b) l'aptitude de l'immun- radioimmunoprecipitations, etc. (b) the ability of the
sérum à neutraliser "in vitro" l'infectivité de LAV/HTLV III (M. RobertGuroff, 1985, Nature 316:72-74) (pour détection de l'anticorps antienveloppe), et (c) une protection contre serum to be neutralized "in vitro" the infectivity of LAV / HTLV III (M. RobertGuroff, 1985, Nature 316: 72-74) (for detection of anti-enveloped antibody), and (c) protection against
! infec-tion--A LAVr,/HTLV III et/ou une atténuation des symp- ! infection - at LAVr, / HTLV III and / or attenuation of symptoms
tômes infectieux chez des animaux immunisés (D.P. Francis, infectious diseases in immunized animals (D.P. Francis,
1984, Lancet 2:1276-1277 î D.C. Gujdusek, 1985, Lancet 1:55-56). 1984, Lancet 2: 1276-1277; D.C. Gujdusek, 1985, Lancet 1: 55-56).
FORMULATION D'UN VACCINFORMULATION OF A VACCINE
Le but de cette forme de réalisation de l'invention The purpose of this embodiment of the invention
est de formuler un vaccin dans lequel l'immunogène est appa- is to formulate a vaccine in which the immunogen is
renté à un épitope de LAV/HTLV III ou qui contient un virus recombinant qui exprime un tel immunogène qui protège contre les infections à virus de LAV/HTLV III pour la prévention de l'adénopathie (LAS) ou du SIDA. En outre, on peut préparer des formulations de vaccins multivalents qui contiennent plus d'un déterminant immunogène apparenté à LAV/HTLV III. De tels vaccins comprennent, mais n'y sont pas limités, ceux contenant to an epitope of LAV / HTLV III or which contains a recombinant virus that expresses such an immunogen that protects against LAV / HTLV III virus infections for the prevention of lymphadenopathy (LAS) or AIDS. In addition, multivalent vaccine formulations that contain more than one LAV / HTLV III related immunogenic determinant can be prepared. Such vaccines include, but are not limited to, those containing
des épitopes apparentés à l'enveloppe de LAV/HTLV III for- epitopes related to the envelope of LAV / HTLV III
mulés isolément ou en combinaison avec d'autres épitopes de LAV/HTLV III, comme les épitopes apparentés à gag. De tels vaccins multivalents, contenant à la fois des épitopes codés isolated or in combination with other LAV / HTLV III epitopes, such as gag-related epitopes. Such multivalent vaccines, containing both coded epitopes
enveloppe et codés gag, peuvent être importants pour la pré- envelope and coded gag, may be important for the pre-
vention du développement du SIDA. Des personnes ne présentant pas de symptômes semblent fabriquer des anticorps anti-gag plus souvent que des patients malades, alors que les deux groupes de patients fabriquent des anticorps dirigés contre des déterminants d'enveloppe (Science 1986, 233:419). Des études ont également montré que des patients atteints de SIDA fabriquent, aux stades précoces sans symptômes, des anticorps contre les protéines d'enveloppe et de noyau (gag). Lorsque la maladie progresse et que des symptômes apparaissent, les anticorps anti-gag sont réduits, cependant que les anticorps anti-enveloppe demeurent (Science, 1986, 233282). Ainsi, 1...l'inclusion d'éRitopes apparentés aa formulation de vaccins, dont la production est décrite a titre d'un aspect spécifique de réalisation de la présente invention, peut être importante pour l'immunoprophylaxie ou l'immunothérapie dans prevention of AIDS development. Non-symptomatic individuals seem to make anti-gag antibodies more often than sick patients, while both groups of patients make antibodies directed against envelope determinants (Science 1986, 233: 419). Studies have also shown that patients with AIDS produce, at early stages without symptoms, antibodies against envelope and core proteins (gag). As the disease progresses and symptoms appear, anti-gag antibodies are reduced, while anti-envelope antibodies remain (Science, 1986, 233282). Thus, inclusion of HIV-related epitopes, the production of which is described as a specific aspect of the invention, may be important for immunoprophylaxis or immunotherapy in
le cas d'une maladie apparentée.à LAV/HTLV III. the case of an illness related to LAV / HTLV III.
On peut formuler des vaccins multivalents de manière qu'ils contiennent les produits de gène de LAV/HTLV III et/ ou des virus recombinants exprimant les produits de gènes chimères. On peut aussi les utiliser en combinaison avec Multivalent vaccines can be formulated to contain the LAV / HTLV III gene products and / or recombinant viruses expressing the chimeric gene products. They can also be used in combination with
d'autres immunogènes pour la prévention du syndrome d'adéno- other immunogens for the prevention of adeno-
pathie (LAS) ou du SIDA et d'.autres maladies. Des exemples disease (LAS) or AIDS and other diseases. Examples
de diverses formulations sont présentés ci-après. various formulations are presented hereinafter.
FORMULATIONS DE VACCINS A VIRUSVIRUS VACCINE FORMULATIONS
On peut formuler un vaccin à virus recombinant vivant ou un vaccin à virus recombinant inactive. Le choix dépend de la nature du virus recombinant que l'on utilise pour exprimer les épitopes apparentées à LAV/HTLV III. Quand le virus recombinant est infectieux pour l'hôte à immuniser A live recombinant virus vaccine or an inactive recombinant virus vaccine can be formulated. The choice depends on the nature of the recombinant virus that is used to express LAV / HTLV III related epitopes. When the recombinant virus is infectious for the host to be immunized
mais ne suscite pas de:maladie, un vaccin vivant est préfé- but does not cause disease, a live vaccine is preferred
rable parce qu'une multiplication chez l'hôte conduit A une stimulation prolongée d'un genre et d'une amplitude semblables because a multiplication in the host leads to prolonged stimulation of a similar genus and amplitude
à ce qui se produit dans des infections subcliniques natu- what happens in natural subclinical infections
relles et, donc, cela confère une forte immunité de longue durée. Lors de son introduction dans un animal hôte, le virus and, therefore, this confers a strong long-term immunity. When introduced into a host animal, the virus
recombinant infectieux peut exprimer les protéines apparen- infectious recombinant can express the relevant proteins
tées à LAV/HTLV III à partir de son gène chimère et stimuler ainsi une réponse immunologique contre des antigènes de LAV/ HTLV III. Quand une telle réponse immunologique constitue une protection à l'encontre d'une attaque ultérieure par LAV/ HTLV III, le virus recombinant vivant peut servir lui-même to LAV / HTLV III from its chimeric gene and thereby stimulate an immunological response against LAV / HTLV III antigens. When such an immunological response provides protection against further attack by LAV / HTLV III, the live recombinant virus can serve itself
de vaccin préventif contre une infection par le virus du SIDA. preventive vaccine against infection with the AIDS virus.
La production d'un tel virus recombinant à utiliser dans ces formulations peut impliquer des systèmes aussi bien "in vitro" (par exemple des cellules de culture tissulaires) qu'"in vivo" (par exemple un animai hôte naturel comme une vache). On peut adapter des méthodes classiques pour la préparation et la formulation de vaccins contre la variole à la formulation d'un vaccin à virus recombinant (par exempIe, voir tVaccinria Viruses and Factors for Vaccine Antigens, publié sous la The production of such a recombinant virus for use in these formulations may involve systems both "in vitro" (e.g., tissue culture cells) and "in vivo" (e.g. a natural host animal such as a cow). Conventional methods for the preparation and formulation of smallpox vaccines can be adapted to the formulation of a recombinant virus vaccine (eg, see Vaccine Viruses and Factors for Vaccine Antigens, published under
direction de G.V. Quinnan chez Elsevier, 1985, pages 109-116). direction of G.V. Quinnan at Elsevier, 1985, pp. 109-116).
On peut préparer des vaccins multivalents à virus vivants, à partir d'un seul ou d'un petit nombre de virus Multivalent live virus vaccines can be prepared from a single or a small number of viruses
recombinants infectieux qui expriment plusieurs épitopes appa- infectious recombinants that express several epitopes
rentes à LAV/HTLV III/HTLV. Le vaccin peut inclure aussi des virus qui expriment des épitopes d'organismes provoquant d'autres maladies, en plus des épitopes de LAV/HTLV III. Par exemple, on peut traiter par génie génétique un virus de vaccine (qui peut recevoir environ 35 kp de base de ADN étranger) de manière qu'il contienne des séquences de codage LAV / HTLV III / HTLV annuities. The vaccine may also include viruses that express epitopes of organisms causing other diseases, in addition to LAV / HTLV III epitopes. For example, a vaccinia virus (which can receive about 35 kp of foreign DNA base) can be genetically engineered to contain coding sequences.
d'épitoges de LAV/HTLV III apparentés à l'enveloppe et à gag. of LAV / HTLV III epitopes related to the envelope and gag.
Le virus peut aussi coder d'autres épitopes en plus de ceux concernant LAV/HTLV III. Un tel virus recombinant lui-même peut servir d'immunogène dans un vaccin multivalent. En variante, on peut formuler, dans un vaccin multivalent, un mélange de virus de vaccine ou d'autres virus, capables chacun de diriger l'expression d'un gène différent codant The virus may also encode other epitopes in addition to those for LAV / HTLV III. Such a recombinant virus itself may serve as an immunogen in a multivalent vaccine. Alternatively, a mixture of vaccinia virus or other viruses, each capable of directing the expression of a different coding gene, can be formulated in a multivalent vaccine.
pour différents épitopes de LAV/HTLV III et/ou d'autres orga- for different epitopes of LAV / HTLV III and / or other
nismes capables de provoquer une maladie. can cause disease.
Que le virus recombinant soit ou-non infectieux pour l'hôte à immuniser, on peut preparer une formulation de vaccin inactive. Les vaccins inactivés sont "morts" en ce 'sens qua leur infectivité a été détruite, habituellement par traitement du formaldéhyde. En principe, l'infectivité du virus est Whether or not the recombinant virus is infectious for the host to be immunized, an inactive vaccine formulation can be prepared. Inactivated vaccines are "dead" in that their infectivity has been destroyed, usually by formaldehyde treatment. In principle, the infectivity of the virus is
détruite sans affecter les protéines de la capside ou d'en- destroyed without affecting the capsid or
veloppe qui portent le caractère immunogène du virus. Afin de préparer des vaccins inactivés, il faut faire croître en culture de grandes quantités de virus recombinant pour fournir which carry the immunogenic character of the virus. In order to prepare inactivated vaccines, large amounts of recombinant virus must be grown in culture to provide
la quantité nécessaire d'antigènes apparentés. On peut utili- the necessary amount of related antigens. We can use
ser un mélange de virus inactivés qui expriment différents be a mixture of inactivated viruses that express different
épitopes pour formuler des vaccins "multivalents". Dans cer- epitopes to formulate "multivalent" vaccines. In
tains cas, cela peut être préférable à des formulations de vaccins vivants, en raison de difficultés potentielles dues In some cases, this may be preferable to live vaccine formulations, because of potential difficulties with
à une interférence mutuelle de virus vivants administrés - - to mutual interference of live virus administered - -
ensemble. Dans l'un ou l'autre cas, il convient de formuler le virus recombinant inactive, ou le mélange de tels virus, together. In either case, it is advisable to formulate the inactive recombinant virus, or the mixture of such viruses,
avec un adjuvant convenable afin d'amplifier la réponse immu- with a suitable adjuvant to amplify the immune response
nologique à leurs antigènes. Des adjuvants convenables com- to their antigens. Suitable adjuvants
prennent, sans que cette liste soit limitative, des gels take, without this list being exhaustive, gels
minéraux, par exemple de l'hydroxyde d'aluminium; des subs- minerals, for example aluminum hydroxide; subsi-
tances tensioactives comme de la lysolécithine, des polyois "Pluronic"; des polyanions; des peptides; des émulsions dans de l'huile et des adjuvants potentiellement utiles pour les êtres humains, comme le BCG (bacille de Calmette Guerin) surfactants such as lysolecithin, polyols "Pluronic"; polyanions; peptides; emulsions in oil and adjuvants potentially useful for humans, such as BCG (Bacille Calmette Guerin)
et corynebacterium parvum.and corynebacterium parvum.
On peut utiliser de nombreuses méthodes pour intro- Many methods can be used to introduce
duire les formulations de vaccins décrites ci-dessus; elles to obtain the vaccine formulations described above; they
comprennent, sans que ce soit limitatif, les voies intrader- include, but are not limited to, intradermal
mique, intramusculaire, intrapéritonéale, intraveineuse, sous- intramuscular, intraperitoneal, intravenous, subcutaneous,
cutanée et intranasale. Quand on utilise une formulation de vaccins à virus recombinants vivants, ce vaccin peut être introduit par la voie naturelle d'infection du virus de type sauvage apparenté que l'on a utilisé pour obtenir le virus cutaneous and intranasal. When using a live recombinant virus vaccine formulation, this vaccine can be introduced by the natural route of infection of the related wild-type virus that has been used to obtain the virus.
recombinant dans la formulation du vaccin. recombinant in the formulation of the vaccine.
FORMULATION DE VACCINS A SOUS-UNITES FORMULATION OF SUBUNIT VACCINES
Au lieu de vaccins à base de virus, on peut utiliser Instead of virus-based vaccines, one can use
la protéine apparentée à LAV/HTLV III elle-même comme immu- the protein related to LAV / HTLV III itself as immune
nogène dans des formulations de vaccins à sous-unités qui peuvent être multivalents. Comme précédemment expliqué, des nogenous in subunit vaccine formulations that can be multivalent. As previously explained,
vaccins à sous-unités comprennent seulement le matériel immu- subunit vaccines include only the immune
nogène en cause, nécessaire pour immuniser un hôte. Donc, la ou les protéines apparentées LAV/HTLV III peut ou peuvent être purifiées à partir de recombinants qui expriment les épitopes de LAV/HTLV III. De tels recombinants comprennent n'importe lesquelles des cellules cultivées infectées par le virus, des transformants bactériens, des transformants involved, necessary to immunize a host. Thus, the related LAV / HTLV III protein (s) can or can be purified from recombinants that express LAV / HTLV III epitopes. Such recombinants include any of the virus-infected cultured cells, bacterial transformants, transformants and the like.
de levure ou des insectes infectés par des virus qui expri- yeast or insects infected with viruses that express
ment les épitopes de LAV/HTLV III (on peut se reporter à ce qui a été dit ci-dessus à propos de l'insertion des séquences de codage de protéines, de l'identification des vecteurs recombinants d'expression, et à propos de l'identification et de la purification du produit de gène exprimé). Dans une autre forme de mise en oeuvre de la présente invention, les peptides ou protéines apparentés à LAV/HTLV III peuvent être obtenus par synthèse chimique. Pour cela, on peut déduire la séquence des aminoacides d'un tel peptide ou d'une telle protéine à partir de la séquence des nucleotides du gène chimère qui en dirige l'expression (voir, par exemple, ce qui a été indiqué ci-dessus à propos de l'identification et LAV / HTLV III epitopes (see above for insertion of protein coding sequences, identification of recombinant expression vectors, and identification and purification of the expressed gene product). In another embodiment of the present invention, peptides or proteins related to LAV / HTLV III may be obtained by chemical synthesis. For this purpose, it is possible to deduce the amino acid sequence of such a peptide or protein from the nucleotide sequence of the chimeric gene which directs its expression (see, for example, what has been indicated below. about it about identification and
de la purification du produit de gène exprimé). purification of the expressed gene product).
Que les immunogênes soient purifiés à partir de recombinants ou obtenus par synthèse chimique, le produit Whether the immunogens are purified from recombinants or obtained by chemical synthesis, the product
final peut être ajusté à une concentration appropriée et for- final report may be adjusted to an appropriate and
mulé avec n'importe quel adjuvant convenable pour vaccin, mated with any adjuvant suitable for vaccine,
puis emballé en vue de son utilisation. Des adjuvants conve- then packaged for use. Adjuvants
nables comprennent, sans que cette liste soit limitative, des gels minéraux, par exemple l'hydroxyde d'aluminium, les substances tensioactives comme la lysolécithine, des polyols "Pluronic"; des polyanions; des peptides; des émulsions dans de l'huile et des adjuvants potentiellement utiles pour les êtres humains, comme le BCG (Bacille de Calmette Guerin) et corynebactérium parvum. L'immunogène peut également être incorporé à des liposomes, ou conjugué & des polysaccharides et/ou à d'autres polymères pour servir dans une formulation Examples include, but are not limited to, inorganic gels, for example, aluminum hydroxide, surfactants such as lysolecithin, "Pluronic" polyols; polyanions; peptides; emulsions in oil and adjuvants potentially useful for humans, such as BCG (Bacillus Calmette Guerin) and corynebacterium parvum. The immunogen may also be incorporated into liposomes, or conjugated to polysaccharides and / or other polymers for use in formulation
de vaccin.of vaccine.
Quand le peptide ou la protéine apparenté à LAV/HTLV When the peptide or protein related to LAV / HTLV
III est un haptène, c'est-a-dire une molécule qui est anti- III is a hapten, that is to say a molecule that is anti-
génique du fait qu'elle peut réagir sélectivement avec des anticorps reconnus, mais qui n'est pas antigénique du fait qu'elle ne peut déclencher une réponse immunitaire, l'haptène peut être lié par covalence à un support ou une molécule immunogène; par exemple, une grosse protéine comme de la Because the gene may react selectively with recognized antibodies, but is not antigenic because it can not elicit an immune response, the hapten may be covalently bound to an immunogenic carrier or molecule; for example, a big protein like
sérum albumine protéinique va conférer un caractère immuno- Protein serum albumin will confer an immunological
gène à l'haptène qui lui est couplé. On peut formuler l'en- hapten gene coupled to it. We can formulate
semble haptène-support pour l'utiliser à titre de vaccin. seems hapten-carrier for use as a vaccine.
IMMUNITE PASSIVE ET ANTICORPS ANTI-IDIOTYPIQUES PASSIVE IMMUNITY AND ANTI-IDIOTYPIC ANTIBODIES
Au lieu d'une immunisation active à l'aide de vaccins à virus ou à sousunités, il est possible de confArer une protection à court terme à un hôte en lui administrant de l'anticorps préformé dirigé contre un ou des épitopes de LAV/ HTLV III. Donc, on peut utiliser les formulations de vaccins décrites ci-dessus pour produire des anticorps destinés à servir à une immunothérapie passive. On préfère en médecine Instead of active immunization with virus or subunit vaccines, it is possible to confer short-term protection on a host by administering preformed antibody to one or more LAV / HTLV epitopes. III. Thus, the vaccine formulations described above can be used to produce antibodies for use in passive immunotherapy. We prefer in medicine
humaine de l'immunoglobuline humaine, car de l'immunoglobu- human immunoglobulin, because of the immunoglobulin
* line hétérologue risque de provoquer une réponse immunitaire* heterologous line may cause immune response
à ses composants immunogènes étrangers. Une telle immunisa- to its foreign immunogenic components. Such immunization
tion passive pourrait servir en cas d'urgence pour une protec- passive intervention could be used in case of emergency for
tion immédiate de personnes non immunisées et exposées a des risques spéciaux, par exemple les personnes exposées à un contact avec des patients'atteints de SIDA, par exemple, dans des hôpitaux et autres installations de soins. En variante, on peut utiliser ces anticorps pour produire de l'anticorps antiidiotypique, que l'on peut utiliser à son tour à titre d'antigène pour stimuler une réponse immunologique contre Immediate exposure of non-immune persons exposed to special risks, for example those exposed to contact with AIDS patients, for example, in hospitals and other health facilities. Alternatively, these antibodies can be used to produce antiidiotypic antibody, which in turn can be used as an antigen to stimulate an immunological response against
des épitopes de LAV/HTLV III.epitopes of LAV / HTLV III.
DOSAGES IMMUNOLOGIQUESIMMUNOLOGICAL ASSAYS
On peut utiliser les peptides et protéines de la The peptides and proteins of the
présente invention, apparentés à LAV/HTLV III, comme anti- the present invention, related to LAV / HTLV III, as anti-
Z587720Z587720
gènes dans des dosages et essais immunologiques pour la détec- genes in assays and immunoassays for the detection of
tion d'anticorps contre LAV/HTLV III dans divers tissus et fluides corporels de patients ainsi que pour le sang des banques de sang et des hôpitaux. Pour cela, on peut utiliser les antigènes de la présente invention dans n'importe quel système de dosage immunologique connu en pratique, ce qui antibodies against LAV / HTLV III in a variety of patients' body tissues and fluids, as well as blood from blood banks and hospitals. For this purpose, the antigens of the present invention can be used in any immunoassay system known in the art.
comprend, sans que ce soit limitatif, les dosages radioimmu- includes, but is not limited to, radioimmunoassays,
nologiques, les dosages dits "ELISA", les dosages en "sandwich", les réactions de précipitation, les réactions the so-called "ELISA" assays, "sandwich" assays, precipitation reactions, reactions
de précipitation par diffusion sur gel, les dosages d'immuno- precipitation by gel diffusion, the immunoassay
diffusion, les dosages par agglutination, les dosages par fixation de compléments, les dosages immunoradiométriques, diffusion, agglutination assays, complement fixation assays, immunoradiometric assays,
les dosages par immunofluorescence, les dosages immunologi- immunofluorescence assays, immunoassays,
ques de protéines A et les dosages par immunoélectrophorèse, protein A and immunoelectrophoresis assays,
pour n'en nommer que quelques-uns.to name a few.
Les essais et dosages immunologiques de la présente invention peuvent servir à effectuer des examens de dépistaqe sur le sang de banques de sang et chez des patients pour The immunoassays and assays of the present invention can be used to perform blood tests of blood banks and patients for
déceler une exposition éventuelle à LAV/HTLV III et pour sur- to detect possible exposure to LAV / HTLV III and to
veiller des patients qui sont traités en raison de LAS ou ensure patients who are treated because of LAS or
du SIDA. On peut utiliser, dans le dosage ou essai immuno- AIDS. In the assay or immunoassay,
logique selon l'invention, n'importe quel peptide ou n'importe logic according to the invention, any peptide or any
quelle protéine apparentée à un antigène de LAV/HTLV III. which protein is related to a LAV / HTLV III antigen.
De tels antigènes comprennent, sans que ce soit limitatif, les peptides et protéines apparentés aux produits des gènes de env, gag, pol et des quatre gènes supplémentaires désignés à ce jour: sor, tat, 3'-orf et art (ou trs). Dans une forme particulière de réalisation de la présente invention, on peut utiliser un ensemble d'antigènes dans un essai de dosage immunologique pour soumettre des patients à un dépistage de détermination d'un profil d'anticorps dirigé contre lesdits épitopes différents de LAV/HTLV III. Dans une autre forme de réalisation de l'invention, on peut suivre des patients, qui ont été vaccinés à l'aide d'une formulation de vaccins Such antigens include, but are not limited to, peptides and proteins related to env gene products, gag, pol and the four additional genes so far designated: sor, tat, 3'-orf and art (or very). . In a particular embodiment of the present invention, a set of antigens can be used in an immunoassay assay to screen patients for antibody profile profiling against said different LAV / HTLV epitopes. III. In another embodiment of the invention, patients who have been vaccinated with a vaccine formulation can be monitored.
de la présente invention, pour déceler une exposition subsé- of the present invention for detecting
quente à LAV/HTLV III. Dans de tels cas, l'antigène utilisé dans le dosage immunologique est de préférence un peptide ou une protéine de l'invention qui n'était pas un immunogène de la formulation de vaccin utilisée pour vacciner le patient, car de telles personnes vaccinées seront séropositives pour l'épitope particulier utilisé dans la formulation de vaccin et, par suite, donneront un résultat positif à des essais, qu'il y ait eu ou non exposition au virus. Par exemple, si quente to LAV / HTLV III. In such cases, the antigen used in the immunoassay is preferably a peptide or protein of the invention that was not an immunogen of the vaccine formulation used to vaccinate the patient, as such vaccinated persons will be seropositive. for the particular epitope used in the vaccine formulation and, therefore, will give a positive test result, whether or not there has been exposure to the virus. For example, if
un patient a été vacciné avec un épitope de la présente inven- a patient has been vaccinated with an epitope of the present invention.
tion apparenté à l'enveloppe de LAV/HTLV III, ce patient peut etre soumis, pour des essais de détection de l'infection par LAV/HTLV III, à des essais de dépistage utilisant n'importe quelle autre protéine non apparentée à l'enveloppe de LAV/ HTLV III, afin de déterminer la présence chez le patient d'anticorps spécifiques pour LAV/HTLV III. Ainsi, un patient vacciné avec un épitope apparenté à l'enveloppe peut Etre soumis à des essais de dépistage d'anticorps spécifiques des antigènes de noyaux de LAV/HTLV III, ou d'autres antigènes de LAV/HTLV III, ce qui comprend, sans que ce soit limitatif, LAV / HTLV III-related envelope, this patient may be screened for LAV / HTLV III infection tests using any other protein unrelated to LAV / HTLV III. envelope of LAV / HTLV III, to determine the presence in the patient of specific antibodies for LAV / HTLV III. Thus, a patient vaccinated with an envelope-related epitope may be screened for antibodies specific for LAV / HTLV III nuclei antigens, or other LAV / HTLV III antigens, including, without being limiting
les produits des gènes sor et 3'-orf et analogues. the products of the sor and 3'-orf genes and the like.
Dans une autre forme de réalisation, on peut utili- In another embodiment, it is possible to use
ser les peptides et protéines de l'invention, apparentés à LAV/HTLV III, dans des dosages immunologiques compétitifs, pour déceler et quantifier la présence de protéines codées par LAV/HTLV III-HTLV III, dans le sang, le sérum, etc., d'un patient. Serum peptides and proteins of the invention, related to LAV / HTLV III, in competitive immunological assays, to detect and quantify the presence of proteins encoded by LAV / HTLV III-HTLV III, in blood, serum, etc. , of a patient.
EXEMPLE: RECOMBINANTS D'ENVELOPPE DE VACCINE EXAMPLE: RECOMBINANTS OF VACCINE ENVELOPE
Dans les exemples suivants, on a construit divers vecteurs de plasmides contenant des gènes chimères comprenant des séquences de codage de l'enveloppe de LAV logées en aval par rapport aux séquences de commande de transcription du In the following examples, various plasmid vectors containing chimeric genes including downstream LAV envelope coding sequences with respect to the transcription control sequences of the present invention were constructed.
virus de la vaccine.vaccinia virus.
On a inséré dans le génome du virus de la vaccine, par recombinaison in vivo, ces gènes chimères, contenant le promoteur de vaccine et la séquence de codage de l'enveloppe de LAV/HTLV III. De tels virus recombinants ont été identifiés These chimeric genes containing the vaccinia promoter and the LAV / HTLV III envelope coding sequence were inserted into the genome of the vaccinia virus by in vivo recombination. Such recombinant viruses have been identified
et purifiés, et des stocks de réserve du virus ont été prépa- purified and stockpiles of the virus have been prepared
rés à partir de cellules de culture tissulaire infectées. res from infected tissue culture cells.
Il a été montré que des protéines immunoréactives, apparentées à l'enveloppe de LAV/HTLV III, sont produites par ces virus Immunoreactive proteins, related to the LAV / HTLV III envelope, have been shown to be produced by these viruses.
recombinants de la vaccine in vitro. On a soumis ces recom- recombinants of vaccinia in vitro. These recommendations were
binants à des essais dans des animaux d'expérience pour en déterminer l'aptitude à déclencher des réponses immunologiques de neutralisation ou de protection et pour étudier leur uti- test animals in order to determine their ability to trigger immunological neutralization or protection responses and to study their use.
lisation à titre de vaccins contre le SIDA. Une description as AIDS vaccines. A description
détaillée de chaque étape de cette forme de réalisation de detail of each step of this embodiment of
l'invention est présentée ci-après. the invention is presented below.
Voici quelques détails sur les modes opératoires Here are some details about the procedures
généraux.General.
CELLULES ET VIRUSCELLS AND VIRUSES
On a obtenu de R. Condit (Professeur associé, Dépar- From R. Condit (Associate Professor, Department of
tement de Biochimie, Université de L'Etat de New-York, Buffalo, New-York, Etats-Unis d'Amérique) des cellules de rein de singe vert d'Afrique (souche BSC-40, lignée continue de cellules de singe vert d'Afrique provenant de cellules BSC-1, n ATCC CCL26), et on en a provoqué la propagation dans du milieu de Eagle modifié selon Dulbecco (MEMD, Gibco, Grand Island, New-York) additionné de 10 % de sérum de foetus de bovin et de 100 unités de pénicilline et 100 unités de streptomycine Biochemistry, New York State University, Buffalo, New York, USA) African green monkey kidney cells (strain BSC-40, continuous line of green monkey cells from Africa from BSC-1 cells, n ATCC CCL26), and propagated in Dulbecco's modified Eagle's medium (MEMD, Gibco, Grand Island, New York) supplemented with 10% fetal serum. of cattle and 100 units of penicillin and 100 units of streptomycin
par millilitre. On a obtenu de M. Botchan (Professaur, Dépar- per milliliter. It was obtained from Mr. Botchan (Professaur, Depar-
tement de biologie moléculaire, Université de Californie, Berkley, Californie, Etats-Unis d'Amérique) des cellules humaines 143 TK (J.S. Rhim et col., 1975, Intl J. Cancer 15:23-29) et on en a provoqué la propagation dans le milieu ci-dessus, avec l'addition de 5-bromo-désoxyuridine (BUdR) Molecular Biology, University of California, Berkley, Calif., USA) of human TK cells (JS Rhim et al., 1975, Int. J. Cancer 15: 23-29) and was challenged therein. propagation in the above medium, with the addition of 5-bromo-deoxyuridine (BUdR)
à 25 pg/ml.at 25 μg / ml.
On a obtenu de l'American Type Culture Collec- We obtained American Type Culture Collec-
tion (ATCC n CCL 171) une cellule diploïde humaine (MRC-5) dont on a assuré la propagation dans le même milieu que celui (ATCC n CCL 171) a human diploid cell (MRC-5) which has been propagated in the same medium as that
utilisé pour BSC-40.used for BSC-40.
On a obtenu de R. Condit des virus de la vaccine (souche WR, n ATCC VR119) que l'on a cultivés dans des cellules BSC-40 dans MEMD + 5 % de sérum de veau sans gamma globuline + 100 unités/ml de pénicilline et 100 unités/ml de streptomycine. On a choisi des recombinants TK parmi des cellules 143 TK dans le même milieu contenant 25 "g/ml de BUdR et on les a purifiées sur plaque sur la même lignée de cellules dans MEMD contenant 1 % de gélose Noble (DIFCO, Détroit, Michigan, Etats-Unis d'Amérique), 5 % de sérum de veau sans gamma globuline, 100 unités/ml de pénicilline et 100 unités/ml de streptomycine ainsi que 25,g/ml de BUDR. On a effectué des dilutions des stocks de virus dans une solution saline tamponnée par des phosphates et contenant par litre 8 g de NaCl, 0,2 g de KC1, 1,5 g de NaH2PO4, 0,2g de K2HPO4, avec addition de 1 mM de MgC12 et de 0,01 % de Raccid viruses (strain WR, n ATCC VR119) were obtained from R. Condit and cultured in BSC-40 cells in MEMD + 5% gamma-free globulin serum + 100 units / ml. penicillin and 100 units / ml of streptomycin. TK recombinants were selected from TK cells in the same medium containing 25 μg / ml BUdR and plaque purified on the same cell line in MEMD containing 1% Noble agar (DIFCO, Detroit, Michigan). , United States of America), 5% gamma globulin-free calf serum, 100 units / ml penicillin and 100 units / ml streptomycin and 25, g / ml BUDR. virus in phosphate buffered saline containing 8 g of NaCl, 0.2 g of KCl, 1.5 g of NaH2PO4, 0.2 g of K2HPO4 per liter, with addition of 1 mM MgCl2 and 0.01 per liter % of
sérum albumine de bovin.serum albumin of cattle.
La souche de virus de la vaccine, provenant du "New-York City Board of Health" (Service de santé de The strain of vaccinia virus from the New York City Board of Health
la ville de New-York) a été purifiée à partir d'une prépara- the city of New York) has been purified from a
tion commerciale de vaccins antivarioliques (" Dryvax")(R)', (lot 321-501 g) vendus par Viet Laboratories (Marietta, PA, Etats-Unis d'Amérique). Le vaccin antivariolique a été dilué par de la solution saline tamponnée par des phosphates avec divers adjuvants (voir ci-après) et, a été soumis trois fois successivement à une purification de plaque en utilisant des cellules de BSC-40. On a préparé un stock de réserve, appelé ci-après vNY, sur des cellules BSC-40, à partir d'un tel isolat purifié sur plaque, et il a servi à construire commercial application of smallpox vaccines ("Dryvax") (R), (batch 321-501 g) sold by Viet Laboratories (Marietta, PA, United States of America). The smallpox vaccine was diluted with phosphate buffered saline with various adjuvants (see below) and subjected to plaque purification three times successively using BSC-40 cells. A stockpile, hereinafter referred to as vNY, was prepared on BSC-40 cells from such a plaque-purified isolate and was used to construct
des virus recombinants. On a assuré, dans des cellules MRT- recombinant viruses. It was ensured in MRT-cells
5000, la propagation de stocks de virus recombinants provenant 5000, the spread of recombinant virus stocks from
de v-NY.from v-NY.
On se reportera au brevet principal pour la descrip- Refer to the main patent for the descrip-
tion plus détaillée de la préparation, restriction et modifica- more detailed information on the preparation, restriction and modification of
tion de l'ADN, de la construction de vecteurs de plasmides contenant le virus de vaccine, promoteur, lié par ligation aux séquences de codage du gène de l'enveloppe de LAV/HTLV III et de la construction de vecteurs de plamnides contenant du virus de vaccine promoteur relié par ligation à la séquence DNA, vaccinia virus-containing plasmid vector constructs, promoter, ligated to LAV / HTLV III envelope gene coding sequences and plasmid vector constructs containing virus. vaccinia promoter linked by ligation to the sequence
codant en 3' ou en 5' du gène de l'enveloppe de LAV/HTLV III. 3 'or 5' coding of the LAV / HTLV III envelope gene.
CONSTRUCTION DES VECTEURS DE PLASMIDES CONTENANT DU VIRUS CONSTRUCTION OF PLASMID VECTORS CONTAINING VIRUSES
DE VACCINE PROMOTEUR RELIE PAR LIGATION A LA TOTALITE DES PROMOTER VACCINE CONNECTED BY LIGATION TO ALL
SEQUENCES DE CODAGE DU GENE D'ENVELOPPE DE LAV/HTLV III ENCODING SEQUENCES OF LAV / HTLV III ENVELOPE GENE
On a soumis 2 microgrammes d'ADN de plasmide pv-envl à digestion, jusqu'à achèvement, par l'enzyme de restriction StuI, PvuI et XhoI. On a résolu les fragments résultants sur un gel de gélose à 1 % à faible température de fusion. Le Two micrograms of plasmid pv-envl DNA were digested until completion with StuI restriction enzyme PvuI and XhoI. The resulting fragments were resolved on a 1% low melting temperature agar gel. The
clivage de Pv-envl à l'aide de StuI et PvuI donne deux frag- cleavage of Pv-envl using StuI and PvuI gives two fragments
ments de 4 pKb, l'un contenant la partie 5' de LAV/HTLV III et l'autre contenant pGS20; XhoI clive le fragment à 4 kpb contenant pGS 20 en des fragments plus petits qui, ainsi, permettent l'identification du fragment à 4 kpb StuI/PvuI contenant l'élément de commande de transcription du virus 4 pKb, one containing the 5 'portion of LAV / HTLV III and the other containing pGS20; XhoI cleaves the 4kbp fragment containing pGS 20 into smaller fragments which, thus, allow identification of the StuI / PvuI 4kbp fragment containing the virus transcriptional control element
de la vaccine et la partie 5' des séquences de codage d'enve- vaccinia and the 5 'part of the enzymic coding sequences.
loppe de LAV/HTLV III. On a isolé ce fragment, on l'a purifié et relié par ligation a un fragment à 6,5 kpb engendré par des produits de digestion par des enzymes de restriction StuI et PvuI de pv-env2. On a utilisé le mélange de ligation pour transformer la souche MC1000 de E. coli. On a choisi des transformants pouvant résister à l'ampicilline. On a soumis de l'ADN de plasmide provenant de transformants individuels à des essais de détermination de la régénération des sites de restriction StuI et PvuI et de la présence des fragments apparentés à 4 paires de kilobases (4 pKb) et 6,5 pKb. Le plasmide voulu, pv-env5, décrit sur la figure 4, contient la totalité du gène d'enveloppe de LAV correspondant aux nucléotides n 5766 à 8349 (comme représenté sur la figure 2), relié par ligation en aval des éléments de commande de loppe of LAV / HTLV III. This fragment was isolated, purified and ligated to a 6.5 kbp fragment generated by restriction enzyme digests StuI and PvuI of pv-env2. The ligation mixture was used to transform E. coli strain MC1000. Transformants that can withstand ampicillin have been chosen. Plasmid DNA from individual transformants was subjected to assays for the determination of StuI and PvuI restriction site regeneration and the presence of 4 kilobase (4 pKb) and 6.5 pKb related fragments. The desired plasmid, pv-env5, depicted in FIG. 4, contains the entire LAV envelope gene corresponding to nucleotides # 5766 to # 8349 (as shown in FIG. 2), connected by ligation downstream of the control elements of
transcription du virus de la vaccine. transcription of the vaccinia virus.
CONSTRUCTION DE VECTEURS DE PLASMIDES CONTENANT DU PROMOTEUR CONSTRUCTION OF PLASMID VECTORS CONTAINING PROMOTER
DE VIRUS DE VACCINE RELIE PAR LIGATION AU GENE D'ENVELOPPE OF VACCINE VIRUS RELATED BY LIGATION TO ENVELOPE GENE
DE LAV/HTLV III SANS LA SEQUENCE TRANSMEMBRANE (ANCRAGE) OF LAV / HTLV III WITHOUT THE TRANSMEMBRANE SEQUENCE (ANCHORAGE)
On a provoqué la digestion de 10 pg d'ADN de plas- Digestion of 10 μg of plasmid DNA was
mide Pv-env5 jusqu'à achèvement, par HIND-3, et l'on a résolu le fragment résultant sur un gel de gélose à 1 %, à bas point de fusion. On a purifié le fragment comportant 3 kilopaires Pv-env5 to completion, by HIND-3, and the resulting fragment resolved on a low melting 1% agar gel. The fragment with 3 kilograms was purified
de base contenant le promoteur de vaccine 7,5 K et le promo- the 7.5 K vaccinia promoter and the promoter
teur 5' des séquences de codage d'enveloppe de LAV/HTLV III, 5 'LAV / HTLV III envelope coding sequences,
puis on les a traités par l'enzyme de Klenow pour complé- then they were treated with Klenow's enzyme to supplement
ter les extrémités cohésives. On a ensuite relié par liga- tion ce fragment à un vecteur de clonage à sites multiples, P26, soumis au ter the cohesive ends. This fragment was then ligated to a multi-site cloning vector, P26, subjected to
préalable à digestion avec EcoRI, puis on a traité avec l'enzyme de Klenow et avec de la phosphatase prior to digestion with EcoRI, then treated with Klenow enzyme and with phosphatase
alcaline d'intestins de veau. Une ligation du site de HIND- alkaline of calf intestines. A ligation of the site of HIND-
3 introduit, dans Pv-env5 et du site de EcoRI empli dans le plasmide P26 a créé un codon d'arrêt en phase avec la séquence de codage pour l'enveloppe. Cette construction intermédiaire 3 introduced into Pv-env5 and the EcoRI site filled in plasmid P26 created a stop codon in phase with the coding sequence for the envelope. This intermediate construction
a été appelée Pv-env5/26.was called Pv-env5 / 26.
On a utilisé l'ADN du plasmide pv-env5/26 pour trans- The plasmid pv-env5 / 26 DNA was used to trans-
former E. coli MC1000, l'amplifier et le purifier. On a ensuite soumis à digestion par BamHI et HpAI, et l'on a résolu sur un gel le gélose à 1 % les fragments résultant. On a isolé le fragment de 2,1 kilopaires de base contenant la séquence de codage d'enveloppe de LAV/HTLV, et on l'a ensuite soumise à fixation par ligation sur du plasmide pGS 20 soumis form E. coli MC1000, amplify it and purify it. It was then digested with BamHI and HpAI, and the resulting fragments were resolved on a 1% agar gel. The 2.1 kilobase base fragment containing the LAV / HTLV envelope coding sequence was isolated, and then ligated onto pGS 20 plasmid submitted.
au préalable à digestion avec BamHI et SmAI. Le plasmide Pv- before digestion with BamHI and SmAI. The plasmid Pv-
env 7 résultant contient le promoteur de virus de vaccine à 7,5 K fixé par ligation sur une séquence spécifique de LAV/ HTLV III à partir des 96 paires de bases en amont du codon d'amorçage d'enveloppe par rapport au site HIND 3 au numéro de nucléotide 6798 (figure 5). Ce plasmide ne comporte donc pas la séquence présumée d'ancrage du gène d'enveloppe de Resultant env 7 contains the 7.5 K vaccinia promoter ligated to a LAV / HTLV III specific sequence from the 96 base pairs upstream of the envelope priming codon from the HIND 3 site. at nucleotide number 6798 (Figure 5). This plasmid therefore does not include the presumed sequence of anchoring the coat envelope gene.
LAV/HTLV III.LAV / HTLV III.
CONSTRUCTION ET CARACTERISATION DU VIRUS DE VACCINE CONSTRUCTION AND CHARACTERIZATION OF VACCINE VIRUS
RECOMBINANT CONTENANT LE GENE CHIMERE D'ENVELOPPE LAV/ RECOMBINANT CONTAINING THE CHIMERIC GENE OF ENVELOPE LAV /
HTLV IIIHTLV III
On a utilisé deux souches de départ de virus de vaccine pour la construction des virus recombinants: WR, la souche témoin de recherche, et v-NY, un dérivé de la souche provenant du "New-York City Board of Health" (Service de Two vaccinia virus strains were used for the construction of the recombinant viruses: WR, the research control strain, and v-NY, a derivative of the strain from the New York City Board of Health.
la Santé Publique de la Ville de New-York). Public Health of the City of New York).
L'insertion des séquences de gènes chimères corres- The insertion of the chimeric gene sequences corresponds to
pondant à l'enveloppe de LAV/HTLV III dans le génome du virus de la vaccine est obtenue par recombinaison "in vivo", rendue possible par le fait que les gènes chimériques sont entourés dans les plasmides pv-env2, pv-env5 et pv-env7 par des LAV / HTLV III enveloping in the genome of vaccinia virus is obtained by "in vivo" recombination, made possible by the fact that the chimeric genes are surrounded in the plasmids pv-env2, pv-env5 and pv -env7 by
séquences du virus de la vaccine codant pour le gène de thy- sequences of the vaccinia virus encoding the thyroid gene
midine kinase (TK). L'introduction de ces plasmides dans des cellules infectées par le virus de la vaccine a permis une recombinaison entre la séquence TK du plasmide et la séquence homologue du génome de virus de la vaccine. L'insertion du midine kinase (TK). Introduction of these plasmids into vaccinia virus infected cells allowed recombination between the TK sequence of the plasmid and the homologous sequence of the vaccinia virus genome. The insertion of the
gène chimère se produit par suite d'une double recombi- chimeric gene occurs as a result of a double recombination
naison dans les séquences d'entourage latéral. -De tels recom- binants comporteront le gène chimère inséré dans le gène naison in the lateral entourage sequences. Such recombinants will include the chimeric gene inserted into the gene
TK de la vaccine et, donc, leur phénotype correspondra & TK. TK of vaccinia and, therefore, their phenotype will match & TK.
On peut choisir ces recombinants TK pour les faire croître dans un milieu auquel on a ajouté BUdR, qui est mortel pour These TK recombinants can be chosen to grow in a medium to which BUdR has been added, which is lethal to
les cellules TK+ mais non pas pour les cellules TK-. Le prin- TK + cells but not for TK- cells. The principle
cipe général de ce mode opératoire a été décrit (M. Mackett, The general principle of this procedure has been described (Mr Mackett,
G.L. Smith et B. Moss, 1984, J. Virol. 49, 857-864). G. L. Smith and B. Moss, 1984, J. Virol. 49, 857-864).
CONSTRUCTION DU VIRUS DE VACCINE RECOMBINANT CONTENANT LE CONSTRUCTION OF THE RECOMBINANT VACCINE VIRUS CONTAINING THE
GENE CHIMERE CORRESPONDANT A L'ENVELOPPE DE LAV/HTLV III CHIMERE GENE CORRESPONDING TO LAV / HTLV III ENVELOPE
On a infecté une boîte de 100 mm de diamètre com- A box 100 mm in diameter was infected
portant 80 % de cellules confluentes de rein de singe vert d'Afrique (souche BSC-40) avec du virus de la vaccine (souche WR) A une multiplicité d'infections de 0,05. Apres 2 à 4 carrying 80% confluent African green monkey kidney cells (strain BSC-40) with vaccinia virus (strain WR) at a multiplicity of infections of 0.05. After 2 to 4
heures d'incubation à 37 C, on a recouvert les cellules in- hours of incubation at 37 C, the cells were covered
fectées par des copréciDités, à l'aide de phosphate de cal- by coprecificities, using calcium phosphate
cium, de l'ADN de plasmide pv-env2 ou pv-env5. On a préparé cium, pv-env2 or pv-env5 plasmid DNA. We prepared
les précipités en ajoutant goutte à goutte 0,5 ml d'une solu- precipitates by adding dropwise 0.5 ml of a solution.
tion de 2XADN-CaC12 à 0,5 ml de solution 2XHeBS (la solution de 2XADNCaC12 contient 20 pg de ADN de plasmide dans 0,5 ml de CaC12 0,25M; 2XHeBS contient, par ml, 16 mg de NaCl, 0,74 mg de KC1, 0,25 mg de Na2HPO4 2H20, 2 mg de dextrose, et 10 mg de HEPES, à un pH de 7,08). On a laissé se former à la température ambiante durant 30 minutes les coprécipités obtenus à l'aide de ADN-phosphate de calcium. Quatre heures après les avoir recouvertes de précipité, on a lavé les cellules une fois avec 1XHeBs, on a fait incuber à 37 C durant 3 minutes en présence de 2 ml de glycérol à 15 % dans 1XHeBs, 2XADN-CaC12 to 0.5 ml of 2XHeBS solution (2XADNCaC12 solution contains 20 μg of plasmid DNA in 0.5 ml of 0.25M CaC12; 2XHeBS contains, per ml, 16 mg of NaCl, 0.74 mg KCl, 0.25 mg Na2HPO4 2H20, 2 mg dextrose, and 10 mg HEPES, pH 7.08). The coprecipitates obtained with calcium phosphate DNA were allowed to form at room temperature for 30 minutes. Four hours after having covered with precipitate, the cells were washed once with 1XHeBs, incubated at 37 ° C. for 3 minutes in the presence of 2 ml of 15% glycerol in 1XHeBs,
puis on a lavé une fois encore avec 10 ml de milieu de crois- then washed again with 10 ml of growth medium.
sance (MEMD + 10 % de sérum de foetus de veau + 100 unités/ml de pénicilline et 100 unités/ml de streptomycine). Deux jours plus tard, on a récolté les cellules infectées et on les a (MEMD + 10% fetal calf serum + 100 units / ml penicillin and 100 units / ml streptomycin). Two days later, the infected cells were harvested and
collectées par centrifugation (40C, 10 minutes & 2010 x g). collected by centrifugation (40C, 10 minutes & 2010 x g).
25877zi0 On a préparé des stocks de virus en mettant ces cellules à 25877zi0 Virus stocks were prepared by putting these cells to
nouveau en suspension dans i ml d'une solution saline tampon- again in suspension in 1 ml of a saline buffer solution
née par des phosphates et additionnée de sérum albumine de bovin, puis l'on a effectué deux cycles de congélation et décongélation et trois traitements durant 15 secondes par bovine serum albumin, followed by two cycles of freezing and thawing and three
des ultrasons.ultrasound.
On a choisi des recombinants en plaçant 0,1 ml de dilution à 10 3 des stocks de virus provenant des opérations ci-dessus sur des plaques circulaires dans des boîtes de 60 mm de cellules humaines confluentes 143 TK, surmontées de 5 ml/boite de gélose Nobel à 1 % (Difco, Détroit, Michigan) avec 5 % de sérum de veau, 25 pg/ml de BUdR dans MEMD. Deux jours plus tard, on a coloré les cellules en plaçant 2 ml/ boîte de milieu de gélose contenant les mêmes ingrédients que ci-dessus, plus 0,01 % de rouge neutre. On a prélevé les plaques individuelles un jour après coloration, on les a mises à nouveau en suspension dans 0,5 ml d'une solution saline physiologique tamponnée par des phosphates et additionnée de sérum albumine de bovin (PBSAM), et l'on a utilisé des parties aliquotes (0,25 mi) des suspensions de virus pour infecter des cellules confluentes 143 TK placées dans des creux de 16. mm de diamètre sous un milieu sélectif (MEMD + Recombinants were selected by placing 0.1 ml of the 10-fold dilution of the virus stocks from the above operations on circular plates in 60 mm boxes of TK confluent human cells, topped with 5 ml / dish of 1% Nobel Agar (Difco, Detroit, Michigan) with 5% calf serum, 25 μg / ml BUdR in MEMD. Two days later, the cells were stained by placing 2 ml / dish of agar medium containing the same ingredients as above, plus 0.01% neutral red. The individual plates were removed one day after staining, resuspended in 0.5 ml of physiological phosphate buffered saline and supplemented with bovine serum albumin (PBSAM), and used aliquots (0.25 mi) of the virus suspensions to infect TK confluent cells placed in 16 mm diameter depressions in a selective medium (MEMD +
% de sérum de foetus de veau + 100 unités/ml de streptomy- % fetal calf serum + 100 units / ml streptomycin
cine + 100 unités/ml de pénicilline + 25 pg/ml de BUdR). On a collecté par centrifugation les cellules infectées et on les a remises en suspension dans 100 pl de solution saline physiologique tamponnée par des phosphates (PBS) contenant 0,5 mg/ml de trypsine et 0,2 mg/ml de EDTA (acide éthylène cine + 100 units / ml penicillin + 25 μg / ml BUdR). Infected cells were collected by centrifugation and resuspended in 100 μl phosphate buffered saline (PBS) containing 0.5 mg / ml trypsin and 0.2 mg / ml EDTA (ethylene acid).
diamine tétra acétique). On a lysé les cellules par incuba- tetraacetic diamine). The cells were lysed by incubation
tion à 37 C durant 30 minutes, ce qui a été suivi de 3 cycles at 37 C for 30 minutes, followed by 3 cycles
de 20 secondes chacun de traitement aux ultrasons. On a col- each 20 seconds of sonication treatment. We have
lecté sur des filtres de nitrocellulose les lysats de cellu- on nitrocellulose filters, cell lysates
les, en utilisant un manifold ou collecteur de filtration the, using a manifold or filtration manifold
à plusieurs creux (Schleicher et Schuell, Arlington, MA). several troughs (Schleicher and Schuell, Arlington, MA).
On a déterminé par hybridation ADN-ADN, comme décrit (M. Mackett, G.L. Smith et B. Moss, 1982, Proc. Nat'l. Acad. DNA-DNA hybridization was determined as described (M. Mackett, G. L. Smith and B. Moss, 1982, Proc Natl Acad.
Sci. 79, 7415-7419), la présence des séquences de ADN spéci- Sci. 79, 7415-7419), the presence of the specific DNA sequences
fiques de l'enveloppe de LAV/HTLV III dans ces échantillons. of the LAV / HTLV III envelope in these samples.
On a utilisé comme sonde d'hybridation de l'ADN de plasmide Hybridization probe used plasmid DNA
pRS-3 marqué par 32p, préparé par translation appropriée. pRS-3 labeled with 32p, prepared by appropriate translation.
On a encore purifié deux fois sur plaque des recombinants qui avaient donné une hybridation positive pour cette sonde, sur des cellules 143 TK dans des conditions sélectives (milieu contenant BUdR) et une fois sur des cellules BSC-40 dans des conditions non sélectives. Après confirmation finale par hybridation ADN-ADN, on a préparé des stocks de virus à partir des plaques trois fois purifiées sur des cellules Recombinants which gave positive hybridization for this probe, on TK cells under selective conditions (medium containing BUdR) and once on BSC-40 cells under non-selective conditions were further purified twice on plate. After final confirmation by DNA-DNA hybridization, virus stocks were prepared from the three-fold purified plaques on cells
de BSC-40 et on les a utilisés pour la caractérisation subsé- BSC-40 and used for subsequent characterization.
quente. Une représentation schématique de la construction des virus recombinants est montrée sur la figure 6, sur laquelle la séquence de gène correspondant à l'enveloppe de LAV/HTLV III (env) située en aval du promoteur de vaccine 7,5 K (p- -) est entourée au sein du génome de la vaccine par des séquences de ADN TK. Les stocks de virus provenant de la recombinaison entre le génome de virus de la vaccine quente. A schematic representation of the construction of recombinant viruses is shown in Figure 6, in which the gene sequence corresponding to the LAV / HTLV III envelope (env) located downstream of the 7.5 K vaccinia promoter (p- ) is surrounded within the vaccinia genome by TK DNA sequences. Virus stocks from recombination between the vaccinia virus genome
et le plasmide pv-env,5 ont été appelés v-env5, et ils con- and the plasmid pv-env, were called v-env5, and they were
tiennent la totalité du gène de l'enveloppe de LAV/HTLV III. hold the entire LAV / HTLV III envelope gene.
Dans la forme particulière de mise en oeuvre décrite dans In the particular form of implementation described in
les exemples ici, v-env5 contient la totalité du gène d'enve- examples here, v-env5 contains the entire enve-
loppe aussi bien que 96 paires de bases des séquences non translatées proches de 5' et 223. paires de bases des séquences non translatées proches de 3'. Les stocks de virus provenant as well as 96 base pairs of non-translated sequences close to 5 'and 223 base pairs of non-translated sequences close to 3'. Virus stocks from
de pv-env2 ont été appelés v-env2 et ils contiennent la plu- of pv-env2 have been called v-env2 and they contain the most
part du gène de l'enveloppe de LAV/HTLV III (c'est-à-dire le fragment KpnI), mais ils ne comportent pas la partie de la séquence codant pour les 42 premiers aminoacides de la protéine de l'enveloppe de LAV/HTLV III. Puisque la séquence de signal supposée de la protéine d'enveloppe de LAV/HTLV III est située au sein des 49 premiers aminoacides de la protéine, v-env2 devrait produire une protéine ne comportant pas la séquence de signal; donc, on devrait s'attendre à ce que la protéine apparentée à LAV/HTLV III produite par ce virus part of the LAV / HTLV III envelope gene (i.e., the KpnI fragment), but they do not include the portion of the sequence encoding the first 42 amino acids of the LAV envelope protein. / HTLV III. Since the supposed signal sequence of the LAV / HTLV III envelope protein is located within the first 49 amino acids of the protein, v-env2 should produce a protein lacking the signal sequence; therefore, the LAV / HTLV III related protein produced by this virus should be expected
recombinant ne soit pas transportée vers la membrane. Au con- recombinant is not transported to the membrane. At the
traire, v-env5, qui contient la totalité de la séquence d'enveloppe de LAV/HTLV III doit produire une protéine qui milk, v-env5, which contains the entire envelope sequence of LAV / HTLV III must produce a protein that
est transportée vers la membrane. Des stocks des virus prove- is transported to the membrane. Stocks of viruses from
nant de pv-env7 sont appelés v-ehv7 et ils contiennent la terminaison azotée complète du gène correspondant à l'enve- loppe de LAV/HTLV III, mais ne comportent pas la séquence pv-env7 are referred to as v-ehv7 and contain the complete nitrogen termination of the gene corresponding to the LAV / HTLV III envelope, but do not include the sequence
en aval du site HIND III. Puisque la séquence présumée trans- downstream of the HIND III site. Since the presumed sequence trans-
membrane (ancrage) est manquante dans cette construction, on pourrait s'attendre à ce que la protéine apparentée à LAV/ HTLV III, produite par ce recombinant, soit secrétée dans le milieu de croissance. Cette propriété est avantageuse pour la purification de cette protéine en vue de son utilisation comme réactif diagnostique ou pour sa formulation comme vaccin membrane (anchorage) is missing in this construct, one would expect that the LAV / HTLV III related protein, produced by this recombinant, would be secreted into the growth medium. This property is advantageous for the purification of this protein for use as a diagnostic reagent or for its formulation as a vaccine
à sous-unités.with subunits.
FORMATION DE FRAGMENTS DE RESTRICTION DE RECOMBINANTS FORMATION OF RESTRICTION FRAGMENTS OF RECOMBINANTS
VACCINE-ENVELOPPE DE LAV/HTLV IIIVACCINE ENVELOPE OF LAV / HTLV III
On a isolé, comme précédemment décrit (Esposito et al, 1981, J. Virol. Methods 2.2. 1975-180) l'ADN de souche de virus de vaccines de départ WR et v-NY, ainsi que leurs dérivés v-env5 et v-env5NY, respectivement. On les a soumis As described previously (Esposito et al., 1981, J. Virol, Methods 2.2, 1975-180) the strains of the starting vaccinia virus WR and v-NY as well as their v-env5 and v-env5NY, respectively. We submitted them
à digestion par l'enzyme de restriction HIND III et les frag- digestion with the restriction enzyme HIND III and the fragments
ments résultants ont été résolus sur un gel à 0,7 % de gélose. The resulting cultures were resolved on a 0.7% agar gel.
l'ADN provenant de la souche de départ WR a présenté le modèle the DNA from the starting strain WR presented the model
typique de fragment de restriction (figure 2A) comme précé- typical restriction fragment (FIG. 2A) as previously
dement décrit (De Filippesy1982, J. Virol. 43:136-149). Le modèle de fragment de restriction pour v-NY a été semblable, mais distinct de celui obtenu avec WR. Les différences les plus évidentes se sont situées dans la longueur des fragments b et c obtenus avec HIND III (fragments HIND III b et c), qui sont des fragments terminaux du génome du virus de la vaccine. Les recombinants v-env5 et v-env5NY ne comportent pas de fragments HIND III J de leurs souches de départ ou parentales. On a observé à la place deux nouveaux fragments, described (De Filippesy 1982, J. Virol 43: 136-149). The restriction fragment pattern for v-NY was similar, but distinct from that obtained with WR. The most obvious differences lie in the length of fragments b and c obtained with HIND III (HIND IIIb and c fragments), which are terminal fragments of the vaccinia virus genome. The recombinants v-env5 and v-env5NY do not contain HIND III J fragments of their starting or parental strains. Instead, two new fragments were observed,
ayant pour taille 5,4 Kbp (kilopaires de bases)et 3,2 Kbp. having a size of 5.4 Kbp (kilopiles of bases) and 3.2 Kbp.
Cette observation concorde avec le résultat de la double recombinaison qui a inséré la séquence codant l'enveloppe de LAV/HTLV III dans le gène TK de vaccine, qui est situé sur le fragment HIND III J. Deux fragments ont été engendrés par l'insertion, en raison de la présence d'un site HIND III dans la séquence LAV/HTLV III. Ce résultat confirme aussi l'orientation du fragment inséré LAV/HTLV III par rapport au gène TK de virus de la vaccine. ANALYSE PAR COAGULATION TYPE "SOUTHERN" (Sud) DE This observation is consistent with the result of the double recombination that inserted the sequence encoding the LAV / HTLV III envelope into the vaccinia TK gene, which is located on the HIND III fragment J. Two fragments were generated by insertion. because of the presence of a HIND III site in the LAV / HTLV III sequence. This result also confirms the orientation of the inserted LAV / HTLV III fragment with respect to the vaccinia virus TK gene. ANALYSIS BY COAGULATION TYPE "SOUTHERN" (South) DE
RECOMBINANTS VACCINE-ENVELOPPE LAV/HTLV III RECOMBINANTS VACCINE-ENVELOPE LAV / HTLV III
L'identité de deux nouveaux fragments HIND III dans les produits de digestion de restriction de génomes viraux recombinants a été confirmée par analyse de coagulation de type Southern. Des fragments de ADN, résolus sur un gel de The identity of two new HIND III fragments in the restriction digests of recombinant viral genomes was confirmed by Southern coagulation analysis. DNA fragments, resolved on a gel of
gélose comme celui présenté sur la figure 7A, ont été trans- as shown in Figure 7A, have been trans-
férés sur des filtres en nitrocellulose, et ont été hybridés sur une sonde obtenue par translation spécifique des séquences d'enveloppe de LAV/HTLV III. Comme représenté sur la figure 7B, l'hybridation a été décelée seulement dans les fragments de 5,4 et de 3,2 Kbp. Ce résultat confirme la structure du génome du virus recombinant telle que représentée sur la on nitrocellulose filters, and hybridized on a probe obtained by specific translation of LAV / HTLV III envelope sequences. As shown in Figure 7B, hybridization was detected only in the 5.4 and 3.2 Kbp fragments. This result confirms the structure of the genome of the recombinant virus as represented on the
figure 6.figure 6.
EXPRESSION DES PROTEINES APPARENTEES A L'ENVELOPPE DE LAV/ EXPRESSION OF PROTEINS RELATED TO THE ENVELOPE OF LAV /
HTLV III DANS DES CELLULES DE CULTURE TISSULAIRE INFECTEES HTLV III IN INFECTED TISSUE CULTURE CELLS
PAR DES VIRUS DE LA VACCINE RECOMBINANTS BY RECOMBINANT VACCINE VIRUSES
On a montré que les virus de vaccine recombinants, portant les gènes chimères d'enveloppe de LAV/HTLV III,sont capables d'exprimer les protéines apparentées à l'enveloppe de LAV/HTLV III lors d'une infection de cellules dans une culture tissulaire. On a également trouvé que ces protéines sont immunoréactives avec du-sérum provenant de patients Recombinant vaccinia viruses, harboring LAV / HTLV III envelope chimeric genes, have been shown to be capable of expressing LAV / HTLV III envelope-related proteins upon cell infection in a culture. tissue. These proteins have also been found to be immunoreactive with patient-derived serum.
atteints de SIDA.with AIDS.
On se reportera au brevet principal pour la descrip- Refer to the main patent for the descrip-
tion détaillée de l'identification, à l'aide de techniques detailed description of the identification, using techniques
d'immunocoagulation ou d'immunoprécipitationde protéines ap- immunocoagulation or immunoprecipitation of
parentées à l'enveloppe de LAV/HTLV III exprimées dans des related to the envelope of LAV / HTLV III expressed in
cellules infectées par du virus de vaccine recombinant. cells infected with recombinant vaccinia virus.
On note que les résultats obtenus sont représentés sur les figures 8A et 8B du présent expose, correspondant aux figures 6A et 6B du brevet principal (immunocoaqulation) et It is noted that the results obtained are shown in FIGS. 8A and 8B of the present disclosure, corresponding to FIGS. 6A and 6B of the main patent (immunocoaqulation) and
figure 9A (immunoprécipitation).Figure 9A (immunoprecipitation).
JJ
MARQUAGE PAR 3H-GLUCOSAMINE DE PROTEINES APPARENTEES A 3H-GLUCOSAMINE MARKING OF PROTEINS RELATED TO
L'ENVELOPPE DE LAV/HTLV III PRODUITES PAR DES VIRUS LAV / HTLV III ENVELOPE PRODUCED BY VIRUSES
RECOMBINANTS DE VACCINE CORRESPONDANT A LAV/HTLV III VACCINE RECOMBINANTS CORRESPONDING TO LAV / HTLV III
Le dosage par radioimmunoprécipitation décrit dans le brevet principal a donné des résultats représentés sur la figure 9B(correspondant à la figure 7B du brevet principal), The radioimmunoprecipitation assay described in the main patent gave results shown in Fig. 9B (corresponding to Fig. 7B of the main patent),
cependant que les résultats de l'analyse par immunoprécipita- however, the results of the immunoprecipita-
tion, avec pulsions de chasse, de protéines apparentées à with hunting drives, proteins related to
l'enveloppe de LAV/HTLV III produites par des virus recombi- the envelope of LAV / HTLV III produced by recombinant viruses
nants de vaccine liées à LAV/HTLV III, décrite en détail dans le brevet principal, apparaissent à la figure 9C (correspondant Vaccines related to LAV / HTLV III, described in detail in the main patent, appear in Figure 9C (corresponding
à la figure 7C du brevet principal). in Figure 7C of the main patent).
PRESENCE D'UNE PROTEINE APPARENTEE A L'ENVELOPPE DE LAV/ PRESENCE OF A PROTEIN RELATIVE TO THE ENVELOPE OF LAV /
HTLV III DANS LE MILIEU DE CROISSANCE DE CELLULES INFECTEES HTLV III IN THE GROWTH ENVIRONMENT OF INFECTED CELLS
PAR DES VIRUS DE VACCINE RECOMBINANTS-LAV/HTLV III BY RECOMBINANT VACCINE VIRUSES-LAV / HTLV III
Le dosage par radioimmunoprécipitation décrit ci- The radioimmunoprecipitation assay described above
après a montré que les protéines immunoréactives produites par le virus de vaccine recombinant de l'invention peuvent afterwards showed that the immunoreactive proteins produced by the recombinant vaccinia virus of the invention can
être exprimées et traitées de façon semblable à la glycopro- expressed and treated in a manner similar to glycoprotein
téine d'enveloppe de LAV/HTLV III authentique. authentic LAV / HTLV III envelope teat.
On a soumis des monocouches confluentes de cellules de HeLa à "infection" par du virus non infectieux (voir figure 9D, piste 1) ou séparément à infection par du virus de vaccine de type sauvage (piste 2), par v-env5 recombinant Confluent monolayers of HeLa cells were "infected" with non-infectious virus (see Figure 9D, lane 1) or separately infected with wild-type vaccinia virus (lane 2), with recombinant v-env5
(piste 3) ou v-env2 recombinant (piste 4), le tout à une mul- (lane 3) or recombinant v-env2 (lane 4), all at one
tiplicité ou taux d'infection de 20 unités de formation de tiplicity or infection rate of 20 training units
plaque par cellule. On a marqué les cellules avec 35S-méthio- plate per cell. The cells were labeled with 35 S-methio
nine (plus de 800 Ci/mmole, Amersham) à 100 >Ci/ml 10 à 12 heures après l'infection. A la fin de la période de marquage, on a retiré le milieu et on l'a clarifié par centrifugation nine (more than 800 Ci / mmol, Amersham) at 100> Ci / ml 10-12 hours after infection. At the end of the labeling period, the medium was removed and clarified by centrifugation.
durant 2 minutes à 12 000 g avant de l'utiliser pour une immu- for 2 minutes at 12,000 g before using it for an immunization
noprécipitation avec du sérum groupé provenant de personnes à résultat positif pour LAV/HTLV III. Les protéines provenant de cellules infectées ayant subi une immunoprécipitation par le même sérum sont présentées dans la partie marquée "culot" et les protéines provenant du milieu de croissance ou culture noprecipitation with pooled serum from persons with a positive result for LAV / HTLV III. Proteins from infected cells immunoprecipitated with the same serum are presented in the pelletized portion and proteins from the growth medium or culture.
sont présentées dans la partie marquée "Supe" (milieu supé- are shown in the section marked "Supe" (upper middle
rieur surnageant).laughing supernatant).
Comme on pouvait s'y attendre pour gpllO de LAV/ HTLV III, la protéine à 120 kd obtenue à l'aide du recombinant a également été décelée dans le milieu infecté (figure 9D, As expected for gpl10 of LAV / HTLV III, the 120 kd protein obtained using the recombinant was also detected in the infected medium (FIG. 9D, FIG.
piste 3). Ces résultats ont montré que v-env5 de virus recom- track 3). These results showed that v-env5 virus recom-
binant était capable d'exprimer le gène correspondant à l'en- binant was able to express the gene corresponding to the
veloppe de LAV et de produire des protéines immunoréactives qui ont été traitées de façon semblable à des glycoprotéines d'enveloppe de LAV/HTLV III authentique., Comme on pouvait s'y attendre pour des protéines ne comportant pas de peptides de signal, on n'a pas décelé de polypeptides liés à l'enveloppe de LAV/HTLV III dans le milieu de croissance de cellules infectées par v-env2 (figure veloppe of LAV and produce immunoreactive proteins that have been treated similarly to authentic LAV / HTLV III envelope glycoproteins. As would be expected for proteins lacking signal peptides LAV / HTLV III envelope-related polypeptides were not detected in the growth medium of v-env2 infected cells (FIG.
9D, piste 4).9D, lane 4).
Par ailleurs, les cellules infectées par v-env7 ont exprimé une protéine tronquée de 130 Kd. Cette protéine ne comporte pas les 217 aminoacides à carbone terminal contenant les séquences d'ancrage de la protéine d'enveloppe de LAV/ HTLV III. Cette protéine tronquée (gp130) a été sécrétée dans le milieu de croissance bien plus efficacement que gpllO ou son précurseur gpl50 (figure 9E). En même temps, gpl30 n'est pas efficacement transformé en gpllO0, bien que le site de In addition, cells infected with v-env7 expressed a truncated protein of 130 Kd. This protein does not include the 217 amino acid end-carbons containing the LAV / HTLV III coat protein anchor sequences. This truncated protein (gp130) was secreted into the growth medium much more efficiently than gpl10 or its gp150 precursor (Figure 9E). At the same time, gp130 is not efficiently transformed into gp110, although the site of
clivage soit encore présent sur la molécule tronquée. cleavage is still present on the truncated molecule.
POUVOIR IMMUNITAIRE DU VIRUS RECOMBINANT IMMUNE POWER OF THE RECOMBINANT VIRUS
CORRESPONDANT A L'ENVELOPPE DE LAVCORRESPONDING TO THE ENVELOPE OF LAV
Il a été montré que les virus recombinants, portant le gène chimère correspondant à l'enveloppe de LAV/HTLV III, sont capables de déclencher une réponse par anticorps contre LAV/HTLV III dans deux souches de souris et une espèce de Recombinant viruses, carrying the chimeric gene corresponding to the LAV / HTLV III envelope, have been shown to be capable of eliciting an antibody response against LAV / HTLV III in two mouse strains and a mouse species.
primate sub-humain.subhuman primate.
IMMUNOGENICITE DES RECOMBINANTS DE VACCINE PORTANT LE GENE IMMUNOGENICITY OF VACCINE RECOMBINANTS CARRYING THE GENE
D'ENVELOPPE DE LAV/HTLV III CHEZ LES SOURIS LAV / HTLV III ENVELOPE IN MOUSE
On a examiné le caractère immunogène de protéines Immunogenicity of proteins was examined
exprimées par v-env5 et v-env2 de virus de la vaccine recom- expressed by v-env5 and v-env2 of vaccinia virus recom-
binants. Les expériences sont décrites en détail dans le brevet principal, qui indique également les résultats des binants. The experiments are described in detail in the main patent, which also indicates the results of the
essais ELISA sur des échantillons de sérum de 6 semaines. ELISA tests on 6 week serum samples.
CARACTERE IMMUNOGENE DE V-ENV5 RECOMBINANT IMMUNOGENIC CHARACTER OF RECOMBINANT V-ENV5
DE VIRUS DE VACCINE-LAV/HTLV III CHEZ DES PRIMATES SUB-HUMAINS OF VACCINE-LAV / HTLV III VIRUS IN SUB-HUMAN PRIMATES
On a étudié le caractère immunogène de vaccine-V- Immunogenicity of vaccinia-V was studied
env5 recombinant de LAV/HTLV III dans deux espèces de primates subhumains: Macaca Fasciculariès et des chimpanzés. Les résultats décrits ciaprès montrent que v-env5 est capable de susciter dans les deux espèces une immunité humorale et recombinant env5 of LAV / HTLV III in two species of subhuman primates: Macaca Fasciculariès and chimpanzees. The results described below show that v-env5 is able to elicit in both species a humoral immunity and
à médiation cellulaire.cell-mediated.
Réponse humorale chez les singes macaques immunisés par v-env5 On a utilisé neuf macaques à longue queue (Macaca Fascicularis), allant de la jeunesse a l'âge adulte, pour étudier le caractère immunogène de v-env5 recombinant de virus de vaccine. On a soumis tous les animaux à des essais de dépistage préliminaire pour constater l'absence d'anticorps contre des virus de vaccine et contre LAV/HTLV III et l'absence de virus T-lymphotropes de singe ou de virus de SIDA de singe ou d'anticorps contre ces virus. A quatre des singes,on a inoculé 2 x 108 unités de formation de plaque de v-env5 et à quatre singes on a inoculé 2 x 10 unités de formation de plaque du même virus. A un animal, on a inoculé 2 x 107 unités de formatin de plaque d'un virus de vaccine Humoral response in macaques monkeys immunized with v-env5 Nine long-tailed macaques (Macaca Fascicularis), ranging from youth to adulthood, were used to study the immunogenic character of recombinant vaccinia v-env5. All animals were subjected to preliminary screening tests for the absence of antibodies against vaccinia virus and LAV / HTLV III and the absence of monkey T-lymphotropic virus or monkey or AIDS virus. antibodies against these viruses. To four of the monkeys, 2 x 10 8 v-env plate formation units were inoculated and to 4 monkeys 2 x 10 plaque forming units of the same virus were inoculated. To one animal, 2 x 107 units of plaque formatin a vaccinia virus were inoculated
recombinant témoin (v-HSgD1 de virus recombinant de vaccine- recombinant control (v-HSgD1 of recombinant vaccinia virus
herpès simplex gD1). Tous les animaux ont été inoculés par scarification de la peau. On a collecté des échantillons de sérum et de sang héparinisé, avant inoculation, et au bout de 4, 6 et 8 semaines après inoculation. Dix semaines après la première inoculation, on a administré à tous les herpes simplex gD1). All animals were inoculated by scarification of the skin. Serum and heparinized blood samples were collected prior to inoculation and after 4, 6 and 8 weeks after inoculation. Ten weeks after the first inoculation, all
animaux une seconde inoculation de 2 x 108 unites de forma- animals a second inoculation of 2 x 108 units of
tion de plaque du même virus. Tous.-les animaux ont présenté plate of the same virus. All.-the animals presented
une autocicatrisation des lésions de peau, typique des infec- self-healing of skin lesions, typical of infections
tions par le virus de la vaccine, et des indications physio- by the vaccinia virus, and physiological indications
logiques normales pendant tout le cours de l'expérimentation. normal logic throughout the course of the experiment.
La réponse humorale a été analysée par ELISA et par des essais The humoral response was analyzed by ELISA and by assays
de dosage de coagulation de type Western. Western-type coagulation assay.
Pour une analyse "ELISA", on a dilué les échantil- For an "ELISA" analysis, the samples were diluted
lons de sérum de 50 fois dans PBS contenant 3 % de poudre Serum 50 times in PBS containing 3% powder
de lait non gras et 0,2 % de NP-40 (polyoxyêthylène(9)p-tert- non-fat milk and 0.2% NP-40 (polyoxyethylene (9) p-tert-
* octylphênol), et on les a fait réagir avec des protéines de virion de LAV/HTLV III qui avaient été immobilisées sur des creux de plaques pour microtitrage. Le mode opératoire pour ELISA a été identique & celui décrit ci-dessus, sauf que le second anticorps utilisé a été de l'anticorps anti-humainoctylphenol), and reacted with LAV / HTLV III virion proteins which had been immobilized on microtiter plate wells. The procedure for ELISA was identical to that described above, except that the second antibody used was anti-human antibody.
de chèvre conjugué à de la péroxydase de raifort. of goat conjugated with horseradish peroxidase.
Les résultats obtenus, présentés sur la figure 11, The results obtained, presented in FIG.
montrent que, si deux animaux seulement ont présenté une séro- show that if only two animals have presented a serotype
conversion après inoculation primaire, tous les animaux ont conversion after primary inoculation, all animals have
présenté de la séroconversion après la seconde immunisation. presented with seroconversion after the second immunization.
Pour déterminer quels anticorps ont été produits chez les animaux immunisés, on a analysé, par coagulation de type Western, des échantillons de sérum collectés au bout de-4 semaines après la seconde immunisation. On a utilisé To determine which antibodies were produced in the immunized animals, serum samples collected at 4 weeks after the second immunization were analyzed by Western coagulation. We used
deux protocoles pour la détection optimale des deux glyco- two protocols for optimal detection of both glyco-
protéines d'enveloppe, gp41 et gpllO. Pour une détection optimale de gp41, on a dilué le sérum 50 fois dans PPS + 3 % envelope proteins, gp41 and gpl10. For optimal detection of gp41, serum was diluted 50 fold in PPS + 3%
de lait non pasteurisé et 0,2 % de NP-40, et l'on a fait réa- unpasteurized milk and 0.2% NP-40, and
gir durant 1 heure à la température ambiante avec de la protéine de virion de LAV/HTLV III purifiée et immobilisée sur un filtre nitrocellulosique. On a lavé les filtres avec PBS (solution saline physiologique additionnée d'un tampon de phosphate) + 0,2 % de NP-40, et l'on a fait réagir avec Leave for 1 hour at room temperature with purified LAV / HTLV III virion protein immobilized on a nitrocellulose filter. The filters were washed with PBS (physiological saline solution supplemented with phosphate buffer) + 0.2% NP-40, and reacted with
de l'anticorps d'immunoglobuline anti-humaine de chèvre con- goat anti-human immunoglobulin antibody
juguée à de la phosphatase alcaline (Zymed, CA) à une dilution de 1:2000 dans du tampon PBS + 0,2 % de NP-40. Pour la détection de la glycoprotéine gpllO, on a dilué le sérum fois dans PBS + 3 %de lait non pasteurisé et l'on a fait réagir durant 1 heure à la température ambiante avec de la protéine de virion de LV/HTVL III purifiée et immobilisée sur un filtre en nitrocellulose. On a lavé les filtres dans PBS + 0,05 % de "Tween-20" puis on a fait réagir avec de treated with alkaline phosphatase (Zymed, CA) at a dilution of 1: 2000 in PBS buffer + 0.2% NP-40. For the detection of the gp110 glycoprotein, the serum was diluted once in PBS + 3% unpasteurized milk and reacted for 1 hour at room temperature with purified LV / HTVL III virion protein and immobilized on a nitrocellulose filter. Filters were washed in PBS + 0.05% Tween-20 and reacted with
l'anticorps d'immunoglobuline anti-humaine de chèvre conju- goat anti-human immunoglobulin conjugate
guée à de la phosphatase alcaline (Zymed, CA) b une dilu- alkaline phosphatase (Zymed, CA) b diluted
tion de 1 à 2000 dans du tampon PBS. Dans chaque mode opéra- from 1 to 2000 in PBS buffer. In each operating mode
toire, le lavage final après la seconde réaction avec l'anti- the final wash after the second reaction with the anti-
corps a été réalisé dans du TRIS 0,1 M (pH 9,5) avec NaCl 0,1M et 5 mM de MgCl2. On a décelé l'anticorps lié à des antigènes sur le filtre en faisant réagir le filtre avec une solution contenant du Tris 0,1M (pH 9,5) , du NaCl 0,1M, 5mM de MgCl2, 0,33 g/ml de phosphate de bromo-chloroindolyle et 0,17 mg/ml de bleu de nitrotétrazolium. Après avoir fait body was made in 0.1M TRIS (pH 9.5) with 0.1M NaCl and 5mM MgCl 2. The antigen-bound antibody was detected on the filter by reacting the filter with a solution containing 0.1M Tris (pH 9.5), 0.1M NaCl, 5mM MgCl 2, 0.33g / ml of bromo-chloroindolyl phosphate and 0.17 mg / ml of nitrotetrazolium blue. After having done
réagir les filtres avec les chromogènes, on a rincé les fil- react the filters with the chromogens, we rinsed the filters
tres dans de l'eau, on les a séchés à l'air et photographiés. very in water, air dried and photographed.
Comme représenté sur la figure 12B, tous les animaux qui ont reçu deux inoculations ont montré une forte réaction As shown in Figure 12B, all animals that received two inoculations showed a strong reaction
d'anticorps à l'égard de gp41. En outre, quatre de ces ani- of antibodies to gp41. In addition, four of these
maux ont également produit des anticorps qui ont fortement evils have also produced antibodies that have strongly
réagi avec gpllO. Dans leur ensemble, les résultats repré- reacted with gpl10. As a whole, the results represent
sentés sur la figure 12A montrent que v-env5 recombinant est capable de susciter, chez les singes macaques, la production 12A show that recombinant v-env5 is able to elicit, in macaque monkeys, the production
d'anticorps spécifiques de l'enveloppe de LAV/HTLV III. antibodies specific for the LAV / HTLV III envelope.
REPONSE IMMUNOLOGIQUE, A MEDIATION CELLULAIRE, CHEZ DES IMMUNOLOGICAL RESPONSE, WITH CELLULAR MEDIATION, IN
MACAQUES IMMUNISES PAR V-ENV5IMMUNIZED MACAQUES BY V-ENV5
On a isolé des lymphocytes de sang périphérique à partir de sang héparinisé de macaques, obtenu quatre semaines après une seconde immunisation intradermique par v-env5, ou Peripheral blood lymphocytes were isolated from heparinized blood of macaques, obtained four weeks after a second intradermal immunization with v-env5, or
un virus recombinant de vaccine témoin exprimant la glycopro- a recombinant vaccinia virus control expressing the glycoprotein
téine D de virus de herpès simplex (v-HSVgDl), par centrifu- herpes simplex virus (D-HSVgD1) dye, by centrifugation
gation sur appareil "Ficoll Hypaque". On a également isolé des lymphocytes de sang périphérique provenant du macaque 81, qui a été vacciné une fois seulement avec v-env5, et provenant de macaques non immunisés. Les lymphocytes de sang périphérique ont été mis en suspension dans du milieu "RMPI 1640" (Gibco, Grand Island, New-York, Etats-Unis d'Amérique) additionné de 10 % de sérum humain normal inactivé par la on "Ficoll Hypaque" device. Peripheral blood lymphocytes from macaque 81, which was vaccinated once only with v-env5, and from unimmunized macaques were also isolated. Peripheral blood lymphocytes were suspended in "RMPI 1640" medium (Gibco, Grand Island, New York, United States of America) supplemented with 10% of normal human serum inactivated by
chaleur et l'on a placé 1 x 105 lymphocytes de sang périphé- heat and place 1 x 105 peripheral blood lymphocytes
rique, dans un volume final de 0,1 ml du milieu, dans des creux de plaque comportant 96 creux à fond rond. Dans chaque in a final volume of 0.1 ml of the medium in plate cavities with 96 round-bottomed cavities. In each
creux, on a introduit 0,1 ml de milieu contenant v-env5 inac- 0.1 ml of medium containing v-env5 was
tivé par la lumière (ultraviolette) (1 x 106 unités de forma- by light (ultraviolet) (1 x 106 units of
tion de plaque/ml avant inactivation par l'ultraviolet) ou plate / ml before ultraviolet inactivation) or
LAV/HTLV III non rompu (1 mg/ml, environ 1 x 105 doses in- Unbroken LAV / HTLV III (1 mg / ml, approximately 1 x 105
fectieuses moyennes obtenues par culture sur tissu), que l'on a purifié par deux cycles de centrifugation avec gradient de saccharose pour séparer les liquides surnageants de cellules CEM infectées par LAV/HTLV III, qui est une lignée de cellules de leucémie T négative de type HLADR. Six jours après la stimulation, on a marqué chaque creux de lymphocytes de sang périphérique avec 1 yCi de 3H-TDR (3H-thydimine, New England Nuclear, Boston, MA, Etats-Unis d'Amérique) durant 6 heures, on a récolté les cellules, et l'on a déterminé les coups par minute (cpm) correspondant à 3H-TDR incorporé, comme étant la valeur moyenne obtenue pour quatre creux. On a calculé l'indice de stimulation an divisant le nombre de coups par minute correspondant à 3H-TDR incorporé à des average tissue culture obtained), which was purified by two cycles of sucrose gradient centrifugation to separate the supernatant fluids from LAV / HTLV III infected CEM cells, which is a negative T cell leukemia cell line. HLADR type. Six days after the stimulation, each trough of peripheral blood lymphocytes was labeled with 1 μCi of 3H-TDR (3H-thydimine, New England Nuclear, Boston, MA, USA) for 6 hours, harvested. cells, and counts per minute (cpm) corresponding to incorporated 3H-TDR were determined as the average value obtained for four troughs. The stimulation index was calculated by dividing the number of strokes per minute corresponding to 3H-TDR incorporated into
cellules stimulées, par le nombre de coups par minute corres- stimulated cells, by the number of strokes per minute corresponding to
pondant à l'incorporation à des cellules non stimulées. spawning when incorporated into unstimulated cells.
TABLEAU ITABLE I
Réponse, par prolifération induite par LAV/HTLV III, de lymphocytes de sang périphérique prélevé sur des macaques, après immunisation par un virus recombinant de vaccine exprimant les glycoprotéines d'enveloppe de Response, by LAV / HTLV III-induced proliferation, of peripheral blood lymphocytes taken from macaques, after immunization with recombinant vaccinia virus expressing the envelope glycoproteins
LAV/HTLV IIILAV / HTLV III
Inr unisation v-env5 v-env5 v-env5 v-env5 v-env5 v-env5 v-env5 v-env5 venv5 V-HSVgD1 néant néant Néant, cpm* Virus utilisé pour Inr unisation v-env5 v-env5 v-env5 v-env5 v-env5 v-env5 v-env5 v-env5 venv5 V-HSVgD1 none none, cpm * Virus used for
LAV/HTLV IIILAV / HTLV III
cprn* IS**cprn * IS **
7465 4,77465 4.7
9075 4,09075 4.0
4732 3,04732 3.0
8645 14,98645 14.9
5987 2,55987 2.5
13922 12,913922 12.9
3985 4,13985 4.1
8580 3,38580 3.3
553 1,0-553 1.0-
1822 1,0-1822 1.0-
1072 1,0-1072 1.0-
la stimulation des lymphocytes v-env 5 cpmf IS** 38,1 12,8 13,6 14,1 14,8 23,0 42,0 18,1 91,9 1,0- 2,0 coups par minute correspondant à 3H-TdR Incorporé indice de stimulation ro Ln o -j. N1' Macaque no * cpm: stimulation of lymphocytes v-env 5 cpmf IS ** 38.1 12.8 13.6 14.1 14.8 23.0 42.0 18.1 91.9 1.0- 2.0 strokes per minute corresponding at 3H-TdR Incorporated stimulation index ro Ln o -j. N1 'Macaque no * cpm:
** IS:** IS:
0% %A Comme on le voit sur le tableau I, tous les macaques immunisés, y compris le numéro 81, qui ont reçu une seule inoculation de v-env5, ont produit des lymphocytes qui ont proliféré en réponse spécifique & la stimulation par LAV/ HTLV III in vitro. Au contraire, les lymphocytes provenant de l'animal 73, qui a reçu de la vaccine-v-HSVgDl recombinant de l'herpès simplex, n'a répondu qu'à la stimulation par le As shown in Table I, all immunized macaques, including # 81, which received a single inoculation of v-env5, produced lymphocytes that proliferated in specific response to LAV stimulation. / HTLV III in vitro. In contrast, lymphocytes from animal 73, which received recombinant herpes simplex recombinant vaccinia-v-HSVgD1, responded only to stimulation with
virus de la vaccine, mais non pas à celle par LAV/HTLV III. vaccinia virus, but not to LAV / HTLV III.
Des animaux témoins non immunisés n'ont pas produit de lympho- Non-immunized control animals did not produce lymphocytes
cytes répondant à l'un ou l'autre antigène. En outre, la réponse pour des lymphocytes provenant de macaques immunisés par v-env-5 a été semblable en amplitude à celle obtenue pour la macaque 73, qui a été vacciné avec vHSVgD1. Ces résultats indiquent que l'expression du gène env de LAV/HTLV III par le virus recombinant n'a pas supprimé chez les singes macaques les réponses immunologiques, à médiation par des cellules cysts responding to either antigen. In addition, the response for lymphocytes from v-env-5 immunized macaques was similar in magnitude to that obtained for macaque 73, which was vaccinated with vHSVgD1. These results indicate that the expression of the LAV / HTLV III env gene by the recombinant virus did not suppress the cell-mediated immunological responses in macaque monkeys.
T, in vitro ou in vivo.T, in vitro or in vivo.
Pour déterminer le sous-groupe de lymphocytes prove- To determine the subgroup of lymphocytes
nant de macaques immunisés qui a été stimulé par LAV/HTLV III, on a soumis les lymphocytes de sang périphérique stimulés à un examen par immunofluorescence en deux couleurs pour expression des récepteurs IL-2 qui sont présents sur des cellules T activées et sur des cellules -B. Les antigènes CD4 et CD8 sont présents sui les cellules T et l'antigène CD20 (Bp35) est présent sur les cellules B. Les résultats présentés au tableauIII montrent que presque tous les lymphocytes de sang périphérique stimulés par un virus, qui expriment des récepteurs IL-2, expriment aussi des antigènes CD4 ou CD8, alors que 1,5 à 2 % seulement coexpriment l'antigène CD20 (Bp35). Ce résultat indique que les lymphocytes stimulés sont des cellules T. of immunized macaques which was stimulated by LAV / HTLV III, stimulated peripheral blood lymphocytes were subjected to two-color immunofluorescence examination for expression of IL-2 receptors which are present on activated T cells and on cells. -B. The CD4 and CD8 antigens are present on T cells and the CD20 antigen (Bp35) is present on B cells. The results presented in Table III show that almost all virus-stimulated peripheral blood lymphocytes express IL receptors. -2, also express CD4 or CD8 antigens, whereas only 1.5 to 2% coexpress the CD20 antigen (Bp35). This result indicates that the stimulated lymphocytes are T cells.
TABLEAU IITABLE II
Expression de récepteurs IL-2 et d'antigènes CD4, CD8 ou CD20 (Bp35) sur des lymphocytes de sang périphérique obtenus sur des macaques vaccinés, après stimulation par Expression of IL-2 receptors and CD4, CD8 or CD20 (Bp35) antigens on peripheral blood lymphocytes obtained from vaccinated macaques, after stimulation with
LAV/HTLV III ou par un virus de vaccine recombinant exprimant les glycoprotéines d'enve- LAV / HTLV III or a recombinant vaccinia virus expressing enteric glycoproteins.
loppe de LAV/HTLV III Lymphocytes * stimulés par v-env5 % total de cellules LAV / HTLV III lymphocyte * stimulated with v-env5% total cells
IL-2R+IL-2R +
27,7 v-env5 % de cellules IL-2R+ coexprimant CD4 48,6 ,6 62,4 CD9 CD20 (Bp35) 52,2 ,0 2,0 NT 27.7 v-env 5% of IL-2R + cells coexpressing CD4 48.6, 62.4 CD9 CD20 (Bp35) 52.2, 0 2.0 NT
LAV/HITLV IIILAV / HITLV III
14,714.7
LAV/HTLV IIILAV / HTLV III
,0 12,0 pas de virus 58,0 0,3 0,3- 59,0 38,0 0,3- 1,9 1,5 0,3- * lymphocytes: lymphocytes de sang périphérique * N T: pas d'essai On 0o 'J Macaque n G\ ln On a obtenu comme suit les résultats du tableau , 0 12.0 no virus 58.0 0.3 0.3- 59.0 38.0 0.3- 1.9 1.5 0.3- * lymphocytes: peripheral blood lymphocytes * NT: no 'On 0o' test J Macaque n G \ ln The results of the table were obtained as follows.
II. On a coloré les lymphocytes de sang périphérique simul- II. Simulated peripheral blood lymphocytes were stained
tanément avec de l'anticorps monoclonal 2A3 conjugué à de la phycoérythrine (Becton-Dickinson, Inc., Mountain View, CA, Etats-Unis d'Amérique), anticorps par rapport au récep- at the same time with phycoerythrin-conjugated monoclonal antibody 2A3 (Becton-Dickinson, Inc., Mountain View, CA, United States of America), antibody to the receptor.
teur d'interleucine-2 (IL-2R), et avec des anticorps mono- interleukin-2 (IL-2R), and with monoclonal antibodies
clonaux IF5 conjugués à de la fluorescéine (Genetic Systems Corp., Seattle, WA, Etats-Unis d'Amérique) pour CD20, G10-1 (Genetic Systems Corp., Seattle, WA) pour CD8 ou T4 (Ortho a Fluorescein-conjugated IF5 clones (Genetic Systems Corp., Seattle, WA, USA) for CD20, G10-1 (Genetic Systems Corp., Seattle, WA) for CD8 or T4 (Ortho a
Diagnostics, Raritan, N.J.) pour CD4. On a utilisé les anti- Diagnostics, Raritan, N.J.) for CD4. We used the
corps à des concentrations de saturation, déterminées au préalable par des titrages sur des lymphocytes analysés par microfluorométrie en écoulement avec un classificateur FACS body at saturation concentrations, determined in advance by assays on lymphocytes analyzed by flow microfluorometry with a FACS classifier
IV modifié (Becton-Dickinson, Mountain View, CA). On a effec- IV modified (Becton-Dickinson, Mountain View, CA). We have
tué une analyse quantitative en deux couleurs comme indiqué précédemment (Ledbetter, J.A. et al., 1984, Perspectives in Immunogenetics and Histocompatibility, 6, 119-129). On a réglé les portes de dispersion en avant et à angle droit de manière à inclure des lymphoblastes et un nombre important de petits lymphocytes. Les valeurs indiquées sont celles concernant le pourcentage total de cellules IL-2R+ et pour le pourcentage de cellules IL-2R+ coexprimant CD4, CD8, ou killed a quantitative two-color assay as previously indicated (Ledbetter, J.A. et al., 1984, Perspectives in Immunogenetics and Histocompatibility, 6, 119-129). The dispersion gates were adjusted forward and at right angles to include lymphoblasts and a large number of small lymphocytes. The values indicated are those concerning the total percentage of IL-2R + cells and for the percentage of IL-2R + cells coexpressing CD4, CD8, or
CD20 (Bp35).CD20 (Bp35).
Il est bien établi que des cellules T, après simu- It is well established that T cells, after
lation par antigène, produisent des lymphokines comprenant by antigen, produce lymphokines comprising
IL-2, pouvant promouvoir une différenciation et/ou une proli- IL-2, which can promote differentiation and / or
fération des cellules T et B et pouvant activer des cellules ou globules lytiques naturels capables de lyser des cellules fission of T and B cells and can activate natural lytic cells or globules able to lyse cells
infectées par divers virus, ce qui comprend le virus du SIDA. infected with various viruses, including the AIDS virus.
On s'est donc demandé si les globules ou cellules T provenant de macaques vaccinés produisent IL-2 après stimulation par It was therefore questioned whether the globules or T cells from vaccinated macaques produce IL-2 after stimulation with
LAV/HTLV III.LAV / HTLV III.
Pour répondre à cette question, on a conduit deux expériences. Pour l'expérience 1, on a isolé les lymphocytes de sang périphérique à partir de sang héparinisé de macaques quatre semaine après une seconde injection intradermique d'immunisation par v-env5 ou v-HSVgDl construit avec la souche WR du virus de la vaccine. Pour l'expérience 2, on a isolé des lymphocytes de sang périphérique sur des macaques 4 To answer this question, we conducted two experiments. For experiment 1, peripheral blood lymphocytes were isolated from heparinized blood of macaques four weeks after a second intradermal injection of v-env5 or v-HSVgD1 immunization constructed with the WR strain of vaccinia virus. For experiment 2, peripheral blood lymphocytes were isolated from macaques 4
semaines après une première injection intradermique d'immu- weeks after a first intradermal injection of
nisation par 2 x 105 unités de formation de plaques de v-env5, v-HSVgDl ou d'un virus recombinant v-env5 construit avec la souche de virus de vaccin du "New York City Board of Health" (service de santé de la Ville de New-York) (v-env5NY). On a mis les lymphocytes de sang périphérique en suspension dans du milieu RPMI 1640 additionné de 10 % de sérum humain normal inactivé par la chaleur et l'on a placé 2 x 105 lymphocytes de sang périphérique dans des creux de plaque comportant 96 creux & fond rond. On a ensuite 2 x 105 v-env5, v-HSVgD1 or v-env5 recombinant virus constructs constructed with the vaccine strain of the New York City Board of Health. New York City) (v-env5NY). Peripheral blood lymphocytes were suspended in RPMI 1640 medium supplemented with 10% normal heat-inactivated human serum and 2 x 10 5 peripheral blood lymphocytes were placed in 96-well hollow fund wells. round. We then
ajouté dans les creux v-env5 inactivé par la lumière ultra- added in hollow v-env5 inactivated by ultraviolet light
violette (1 x 106 unités de formation de plaque/ml avant inactivation par la lumière ultraviolette) ou LAV/HTLV III purifié (1 ug/ml). Deux jours après la stimulation, on a récolté les liquides surnageants sur des creux utilisés par paires et l'on a soumis & des essais de détermination de la capacité & entretenir une prolifération de cellules CTLL-2 dépendant de IL-2 (cellules fournies par le Dr S. Gillis, Immunex Corp. Seattle, WA, Etats-Unis d'Amérique), qui ont été lavées durant 24 heures, avant l'essai, pour les débarrasser IL-2. Au cours des six dernières heures d'incubation avec le liquide surnageant, on a marqué les cellules avec 3HTdR, et l'on a déterminé la quantité de 3H-TdR incorporée aux cellules. On a calculé les unités d'activité de IL-2 présent dans le liquide surnageant, comme décrit, & partir de courbes de référence obtenues par des essais de l'effet de IL-2 humain recombinant (fourni par le Dr Gillis) sur la prolifération de cellules CTLL-2. Les violet (1 x 106 units of plaque formation / ml before inactivation by ultraviolet light) or purified LAV / HTLV III (1 μg / ml). Two days after the stimulation, the supernatant liquids were collected on hollows used in pairs, and assays were performed to determine the ability to maintain IL-2-dependent CTLL-2 cell proliferation (cells supplied by Dr. S. Gillis, Immunex Corp. Seattle, WA, USA), which was washed for 24 hours, prior to testing, to rid them of IL-2. During the last six hours of incubation with the supernatant, the cells were labeled with 3HTdR, and the amount of 3H-TdR incorporated into the cells was determined. The units of IL-2 activity present in the supernatant liquid, as described, were calculated from reference curves obtained by testing the effect of recombinant human IL-2 (provided by Dr. Gillis) on the proliferation of CTLL-2 cells. The
résultats obtenus sont présentés au tableau III. The results obtained are presented in Table III.
TABLEAU IIITABLE III
Production de IL-2 par les lymphocytes de sang périphérique provenant de macaques vaccinés, après stimulation par LAV/HTLV III ou par des virus de vaccine recombinants exprimant de la glycoprotéine d'enveloppe de virus de SIDA Expérience 1 IL-2 (unités/ml) Macaque no Immnunisation Liquides surnageants de lymphocytes* stimulés par pas de virus LAV/HTLV III v-env5 v-env5 v-env5 v-env5 v-HSVgDl néant o o o O o 28,0 16,0 9,0 o 96,0 124,0 52,0 108,0 o Expérience 2: v-env5 v-env5NY v-env5NY v-env5NY v-HSVgDl néant néant 14,4 16,8 7,1 2,4 o o o ,8 33,3 26,7 27,6 27,6 o o 27:, IL-2 production by peripheral blood lymphocytes from vaccinated macaques after stimulation with LAV / HTLV III or recombinant vaccinia viruses expressing AIDS virus envelope glycoprotein Experiment 1 IL-2 (units / ml ) Macaque no Immunization Vaccine-stimulated lymphocyte * supernatant fluids VLV / HTLV III v-env5 v-env5 v-env5 v-env5 v-HSVgD1 nil ooo O o 28.0 16.0 9.0 o 96.0 124.0 52.0 108.0 o Experiment 2: v-env5 v-env5NY v-env5NY v-env5NY v-HSVgDl nil nil 14.4 16.8 7.1 2.4 ooo, 8 33.3 26, 7 27.6 27.6 oo 27 :,
26-..,26 - ..,
oe CD ru o -4 rO> c>oe CD ru o -4 rO> c>
Les résultats de l'expérience 1 du tableau III mon- The results of experiment 1 of Table III
trent que les cellules surnageantes provenant de lymphocytes de sang périphérique stimulés par v-env5 ou par LAV/HTLV III obtenus sur des macaques immunisés deux fois par v-env5, contiennent IL-2, comme le montre leur aptitude à induire une prolifération de cellules CTLL-2, qui est une lignée de cellules dépendant de IL-2. De même, comme montré dans l'expérience 2 du tableau IV, on a décelé IL-2 dans ce qui surnage des lymphocytes de sang périphérique stimulés par LAV/HTLV III ou par v-env5 provenant du macaque 03, qui a été immunisé une fois avec v-env5, et provenant de l'ensemble des trois macaques qui ont été immunisés une fois par la souche de "vaccins" du même recombinant (v-env5NY, that supernatant cells from v-env5 or LAV / HTLV III stimulated peripheral blood lymphocytes obtained on v-env5-immunized macaques contain IL-2, as shown by their ability to induce cell proliferation. CTLL-2, which is an IL-2 dependent cell line. Similarly, as shown in Experiment 2 of Table IV, IL-2 was detected in supernatant of LAV / HTLV III or v-env5 stimulated peripheral blood lymphocytes from Macaque 03, which was immunized with once with v-env5, and from all three macaques that were once immunized with the "vaccine" strain of the same recombinant (v-env5NY,
voir ci-dessus l'exposé sur la construction et la caractéri- see above the presentation on the construction and characteris-
sation du virus de vaccine recombinant contenant le gène of the recombinant vaccinia virus containing the gene
d'enveloppe chimère de LAV/HTLV III). Au contraire, les lym- chimeric envelope of LAV / HTLV III). On the contrary, the
phocytes de sang périphérique provenant des macaques 73 et 59, qui ont subi des inoculations d'immunisation par des virus recombinants de vaccine-HSV gD-1, ont produit IL-2 après peripheral blood phocytes from macaques 73 and 59, which were immunized with recombinant vaccinia-HSV gD-1 viruses, produced IL-2 after
stimulation par v-env5iseulement, et non pas après stimula- v-env5 stimulation only, and not after stimulation.
tion par LAV/HTLV III. Les macaques 26 et 27, non immunisés, n'ont pas produit de IL-2 décelable après stimulation par LAV/HTLV III ou par le virus de vaccine recombinant. Puisque des cellules ou lymphocytes T, présentant de l'activité d'auxiliaires/inducteurs produisent IL-2 après stimulation antigénique, ces résultats montrent la présence des cellules ou globules T auxiliaires, qui reconnaissent LAV/HTLV III, chez des macaques immunisés par les virus recombinants. En by LAV / HTLV III. The unimmunized macaques 26 and 27 did not produce detectable IL-2 after stimulation with LAV / HTLV III or recombinant vaccinia virus. Since T cells or cells exhibiting helper / inducer activity produce IL-2 after antigenic stimulation, these results show the presence of T helper cells or globules, which recognize LAV / HTLV III, in macaques immunized with recombinant viruses. In
plus de leur rôle probable dans la différenciation des cellu- more of their probable role in the differentiation of
les ou lymphocytes B pour produire des anticorps contre des or B cells to produce antibodies against
antigènes d'enveloppe LAV/HTLV III, les cellules ou lympho- LAV / HTLV III envelope antigens, cells or lymphocytes
cytes T producteurs de IL-2 peuvent être impliqués dans la différenciation et/ou l'expansion de cellules effectrices, T-cells producing IL-2 may be involved in the differentiation and / or expansion of effector cells,
comme des lymphocytes T cytotoxiques ou des cellules lyti- like cytotoxic T lymphocytes or lytic cells
ques naturelles qui peuvent tuer des cellules infectées par natural diseases that can kill cells infected with
des virus.viruses.
REPONSES HUMORALES CHEZ LES CHIMPANZES IMMUNISES PAR HUMORAL RESPONSES IN IMMUNIZED CHIMPANZES
V-ENV5NYV-ENV5NY
A deux chimpanzés d'age juvénile, on a inoculé par voie intradermique 5 x 108 unités de formation de plaque de v-env5NY, la souche de "vaccin" de venv5. A un animal, on To two juvenile chimpanzees, 5x10 8 plaque formation units of v-env5NY were intradermally inoculated, the "vaccine" strain of venv5. To an animal, we
a inoculé par voie intradermique le même titre d'un recom- inoculated intradermally with the same title of a recom-
binant de vaccine-herpès simplex gD, v-HSVgDlNY construit à partir de la même souche parentale de vaccine (v-NY) que vaccinia-herpes simplex gD bovine, v-HSVgDlNY constructed from the same parental vaccinia strain (v-NY) as
v-env5NY. On a administré à tous les animaux une seconde ino- v-env5NY. All animals were given a second dose of
culation de la même dose 8 semaines après la première immuni- the same dose 8 weeks after the first immunization
sation. On a collecté deux fois par semaine les échantillons de sérum après immunisation et on les a soumis à des dosages, par ELISA et par coagulation de type Western, pour chercher des anticorps spécifiques de LAV/HTLV III. Tous les animaux ont présenté une autocicatrisation des lésions de la peau, typique d'une infection par virus de la vaccine et ils ont eu des résultats physiologiques normaux pendant tout le cours tion. Serum samples were collected twice weekly after immunization and assayed by ELISA and Western coagulation for antibodies specific for LAV / HTLV III. All animals exhibited self-healing of skin lesions, typical of vaccinia virus infection, and had normal physiological outcomes throughout the course.
de l'expérience.experience.
Les méthodes pour un examen de type ELISA sur des sérums de chimpanzés ont été identiques à celui utilisé pour des sérums de macaques. Les résultats présentés au tableau V indiquent que les deux animaux d'expérience (124 et 149) ont subi une séro-conversion au bout de 8 semaines après première immunisation et que les taux d'anticorps ont continué The methods for an ELISA type examination on chimpanzee sera were identical to those used for macaque sera. The results presented in Table V indicate that both experimental animals (124 and 149) underwent seroconversion after 8 weeks after first immunization and that antibody levels continued
à augmenter après la seconde injection d'immunisation. L'ani- to increase after the second immunization injection. The ani-
mal témoin (134) est resté séronégatif. poor control (134) remained seronegative.
TABLEAUIVTable IV
dosage ELISA d'échantillons de sérum provenant de chimpanzés immunisés par des virus de vaccine recombinants Lecture ELISA pour des anticorps de sérum spécifiques de LAV/HTLV III Temps du prélèvement Chimpanzé n 134 vHSVgDINY Chimpanzé n 124 v-env5NY Chimpanzé n 149 v-env5NY Avant saignée 8 semaines apres la première injection d'immunisation 2 semaines après la seconde injection d'immunisation ELISA assay of serum samples from chimpanzees immunized with recombinant vaccinia viruses ELISA reading for serum antibodies specific for LAV / HTLV III Collection time Chimpanzee n 134 vHSVgDINY Chimpanzee n 124 v-env5NY Chimpanzee n 149 v-env5NY Before bleeding 8 weeks after the first immunization injection 2 weeks after the second immunization injection
0,084 + 0,0150.084 + 0.015
0,085 + 0,0100.085 + 0.010
0,075 + 0,0120.075 + 0.012
0,100 + 0,0050.100 + 0.005
0,185 + 0,0200.185 + 0.020
0,237 + 0,0170.237 + 0.017
0,123 + 0,0250.123 + 0.025
0,403 + 0,0270.403 + 0.027
0,523 + 0,0730.523 + 0.073
ro N o -Jro N o -J
Pour montrer que les anticorps spécifiques de LAV/ - To show that antibodies specific to LAV / -
HTLV III décelés chez les animaux immunisés étaient dirigés contre les glycoprotéines d'enveloppe, on a analysé les HTLV III detected in immunized animals were directed against envelope glycoproteins, the
mêmes sérums par coagulation de type Western. Le mode opéra- same sera by Western coagulation. The operating mode
toire utilisé a été optimisé pour la détection de l'anti- corps gp41, et il a été identique à celui utilisé pour l'analyse des sérums de macaques. Les résultats présentés sur la figure 13 montrent que les anticorps spécifiques de LAV/HTLV III, fabriqués dans les deux animaux vaccinés, The field used was optimized for the detection of gp41 antibody, and it was identical to that used for the analysis of macaque sera. The results presented in FIG. 13 show that the antibodies specific for LAV / HTLV III, produced in the two vaccinated animals,
agissent bien entendu à l'encontre des glycoprotéines d'en- of course act against the glycoproteins of
veloppe, et que le taux au niveau de ces anticorps a augmenté veloppe, and that the level of these antibodies has increased
après la seconde injection d'immunisation. after the second immunization injection.
REPONSES IMMUNOLOGIQUES, A MEDIATION PAR LES CELLULES, IMMUNOLOGICAL RESPONSES, MEDIATED BY CELLS,
CHEZ DES CHIMPANZES IMMUNISES PAR V-ENV5NY IN CHIMPANZES IMMUNIZED BY V-ENV5NY
On a utilisé des lymphocytes de sang périphérique, isolées à partir des mêmes animaux que ceux décrits ci-dessus, Peripheral blood lymphocytes, isolated from the same animals as those described above, were used.
pour montrer les réponses immunologiques, à médiation cel- to show immunological responses, mediated by
lulaire, chez ces animaux. On a isolé les lymphocytes de in these animals. Lymphocytes were isolated from
sang périphérique à partir de sang héparinisé, par centri- peripheral blood from heparinized blood, by centrifugation
fugation de type Ficolli-hypaque 4 semaines après l'inocula- ficolli-hypaque fugation 4 weeks after inoculation
tion intradermique initiale des virus de vaccine recombinant. initial intradermal concentration of recombinant vaccinia viruses.
On a ensemencé ces lymphocytes à raison de 1 x 105 cellules par creux dans des plaques de microtitrage comportant 96 creux, dans un milieu RPMI 1640 additionné de 10 % de sérum humain normal inactivé par la chaleur et de pénicilline/ These lymphocytes were seeded at 1 x 105 cells per well in 96-well microtiter plates in RPMI 1640 medium supplemented with 10% normal heat-inactivated human serum and penicillin /
streptomycine. On a ensuite ajouté dans les creux les glyco- streptomycin. The glyco-
protéines de LAV/HTLV III (5,ug/ml) ou des glycoprotéines LAV / HTLV III proteins (5, ug / ml) or glycoproteins
d'enveloppe de LAV/HTLV III (1 ug/ml), isolées par chromato- envelope of LAV / HTLV III (1 μg / ml), isolated by chromato-
graphie de lectine sur LAV/HTLV III purifié. Six jours plus tard, on a déterminé, par comptage de scintillation en lectin on purified LAV / HTLV III. Six days later, scintillation counting was determined by
milieu liquide, H3-thymidine incorporée aux cellules. liquid medium, H3-thymidine incorporated into the cells.
Comme montré sur le tableau V, les lymphocytes provenant des deux animaux (n S 124 et 149) immunisés par v-env5NY, ont proliféré en réponse à une stimulation par le virion LAV/HTLV III ou par des protéines d'enveloppe purifiées (env). Au contraire, l'animal 134, qui a reçu de la vaccine, herpès simplex recombinant v-HSgD1NY, n'a pas As shown in Table V, lymphocytes from both animals (n S 124 and 149) immunized with v-env5NY, proliferated in response to stimulation by the LAV / HTLV III virion or purified envelope proteins (approx. ). In contrast, animal 134, which has received vaccinia, recombinant herpes simplex v-HSgD1NY, has not
produit de lymphocytes reconnaissant LAV/HTLV III. product of lymphocytes recognizing LAV / HTLV III.
TABLEAU VTABLE V
Réponse immunologique, à médiation cellulaire, chez des chimpanzés vaccinés par des recombinants de vaccine 3H-thymidine incorporée dans des lymphocytes* stimulés par Chimpanzé n Irmunisation pas d'antigène LAV/HTLV III env 124 v-env5NY 2842 37 132 26 370 149 v-env5NY 375 20 292 27 115 134 v-HSVgD1NY 367 1 987 367 64 néant 452 567 222 72 néant 737 2 417 905 * lymphocytes de sang périphérique Les lymphocytes de sang périphérique provenant de Immunological cell-mediated response in chimpanzees vaccinated with 3H-thymidine vaccinia recombinants incorporated into Chimpanzee-stimulated lymphocytes n No immunization LAV / HTLV III antigen 124 v-env5NY 2842 37 132 26 370 149 v env5NY 375 20 292 27 115 134 v-HSVgD1NY 367 1 987 367 64 NA 452 567 222 72 NA 737 2,417,905 * peripheral blood lymphocytes Peripheral blood lymphocytes from
tous les chimpanzés ont présenté des titres élevés d'incor- all chimpanzees had high titres of
poration de 3H-thymidine (38 870 à 109 790 cpm) après stimu- poration of 3H-thymidine (38,870 to 109,790 cpm) after stimulation
lation par de la phytohémagglutinine (PHA, 2,ug/ml) et des taux élevés d'incorporation de 3H-thymidine (42 172 à 12 067 cpm) après stimulation par des lymphocytes de sang phytohemagglutinin (PHA, 2, ug / ml) and high levels of 3H-thymidine incorporation (42,172 at 12,067 cpm) after stimulation with blood lymphocytes
périphérique humain xénogène, groupé, ayant subi une irra- xenogeneic human peripheral, grouped, having undergone irrational
diation par des rayons X. Les lymphocytes de sang périphé- X-ray diagnoses. Peripheral blood lymphocytes
rique provenant de chimpanzés immunisés par v-env5 et aussi le chimpanzé immunisé par v-HSVgDlNY, ont montré de fortes réponses de prolifération à des virus de la vaccine, alors from chimpanzees immunized with v-env5 and also the chimpanzee immunized with v-HSVgDlNY, showed strong proliferative responses to vaccinia viruses, then
que des lymphocytes de sang périphérique provenant de chim- peripheral blood lymphocytes from chemotherapy
panzés non immunisés n'ont pas proliféré en réponse à une non-immune panzés did not proliferate in response to a
stimulation par du virus de la vaccine. stimulation with vaccinia virus.
Dans l'ensemble, les résultats présentés au tableau I du brevet principal, sur les:.tableaux I à V et sbr les figures 11 à 13 indiquent que (a) le virus de vaccine recombinant v-env5 et sa contrepartie dans la souche de vaccin> v-env5NY, ont été capables de susciter des réponses immunologiques à médiation humorale et cellulaire spécifiques de LAV/HTLV III dans deux espèces de primates sub-humains, les macaques et les chimpanzés, et (b) que les virus recombinants n'ont pas supprimé les réponses immunologiques & médiation par les cellules ou Overall, the results shown in Table I of the main patent, on Tables I to V and Figures 11 to 13, indicate that (a) recombinant vaccinia virus v-env5 and its counterpart in the vaccine> v-env5NY, were able to elicit LAV / HTLV III specific humoral and cell-mediated immunologic responses in two subhuman primate species, macaques and chimpanzees, and (b) that recombinant viruses do not have not suppressed immunological responses & mediated by cells or
lymphocytes T, in vitro ou in vivo.T cells, in vitro or in vivo.
DIMINUTION DE LA NEUROTOXICITE DE RECOMBINANTS CONSTRUITS DECREASING THE NEUROTOXICITY OF RECOMBINANTS BUILT
AVEC LA SOUCHE V-NY DU VIRUS DE LA VACCINE WITH THE V-NY STRAIN OF VACCINE VIRUS
On a injecté dans le cerveau de groupes de cinq souris (souche ICR) des parties aliquotes de virus, contenant x 107 unités de formation de plaques dans 25 & 50 "l. On a coté le rapporté le rapport de mortalité 10 jours après Groups of five mice (ICR strain) were injected into the brain containing aliquots of virus, containing x105 plaque forming units in 25-50 μl. The reported mortality ratio was reported 10 days later.
inoculation.inoculation.
TABLEAU VITABLE VI
Mortalité de souris ayant subi une cérébrale par des recombinants Mortality of cerebral mice by recombinants
inoculation intra-inoculation
de la vaccine Inoculation v-NY v-env5NY v-env2NY; v-epv7NY vaccin antivariolique (Wyeth) v-env5 v-env2 v-env7 Animaux morts/ animaux traités par injection 0/5 0/5 0/5 0/5 3/5 /5 /5 /5 solution saline 0/5 Les résultats présentés au tableau VI indiquent vaccinia Inoculation v-NY v-env5NY v-env2NY; v-epv7NY smallpox vaccine (Wyeth) v-env5 v-env2 v-env7 Animals dead / animals treated by injection 0/5 0/5 0/5 0/5 3/5 / 5/5/5 saline solution 0/5 The results presented in Table VI indicate
que le virus de la vaccine provenant d'une culture tissu- that vaccinia virus from a tissue culture
laire, purifié sur plaque (souche v-NY) et ses dérivés v-env5NY, v-env2NY et v-env7NY, ont une neurotoxicité réduite en comparaison de la souche WR et de ses dérivés. Puisque la souche du "New York City Board of Health"(service de plaque-purified plaque (v-NY strain) and its derivatives v-env5NY, v-env2NY and v-env7NY, have reduced neurotoxicity in comparison with strain WR and its derivatives. Since the strain of the New York City Board of Health
santé de la ville de New-York) a servi de vaccin anti-vario- health of New York City) served as an anti-vario-
lique, des recombinants basés sur cette souche devraient mieux convenir pour le développement d'un vaccin pour usage humain. However, recombinants based on this strain should be better suited for the development of a vaccine for human use.
EXEMPLE 2-: RECOMBINANTS GAG DE BACULOVIRUS EXAMPLE 2- RECOMBINANTS GAG OF BACULOVIRUS
Dans l'exemple suivant, on a construit divers vec- In the following example, we have built various
teurs de plasmides contenant des gènes chimères comprenant des séquences de codage de gag LAV/HTLV III situées en aval par rapport aux séquences de commande de transcription de AcNPV. Plasmid vectors containing chimeric genes comprising LAV / HTLV III gag coding sequences located downstream from AcNPV transcriptional control sequences.
On a inséré ces gènes chimères, contenant le promo- These chimeric genes, containing the promoter, were inserted
teur de polyédrine AcNPV et la séquence de codage gag de LAV/HTLV III, dans le génome de AcNPV, par recombinaison in vivo. De tels virus recombinants ont été identifiés et purifiés, et on a préparé des stocks de virus à partir de cellules de cultures tissulaires infectées. On a montré que des protéines immunoréactives, apparentées à gag de LAV/HTLV III, sont produites in vitro par le recombinant AcNPV. On AcNPV polyhedrin and the gag coding sequence of LAV / HTLV III, in the AcNPV genome, by in vivo recombination. Such recombinant viruses were identified and purified, and virus stocks were prepared from infected tissue culture cells. GAV-related immunoreactive proteins of LAV / HTLV III have been shown to be produced in vitro by the AcNPV recombinant. We
a montré que les cellules infectées par des virus recombi- has shown that cells infected with recombinant viruses
nants présentent une immunofluorescence positive. Enfin, des lysats de cellules infectées par AcNPV recombinant ont été positifs dans le dosage ELISA quand des essais ont été effectués avec du sérum provenant de patients atteints de have a positive immunofluorescence. Finally, recombinant AcNPV-infected cell lysates were positive in the ELISA assay when assays were performed with serum from patients with
SIDA. Une description détaillée de chaque étape de cette AIDS. A detailed description of each step of this
forme de réalisation de l'invention est présentée ci-après. embodiment of the invention is presented hereinafter.
MODES OPERATOIRES GENERAUXGENERAL OPERATING MODES
Cellules et virus On a obtenu des cellules de Spodoptera frugiperda, clone Sf9, à l'American Type Culture Collection (ATCC n CRL 1711) et l'on en a effectué la propagation dans du milieu Antheraea de Grace (Gibco, KC Biologicals) contenant 3,3 g/l d'un hydrolysat de levure (de Difco) et 3, 3 g/l d'un hydrolysat de lactalbumine (Difco), 10 % de sérum de foetus de bovin et 0,06 g/l de pénicilline ainsi que 0,1 g/1 de streptomycine (milieu TNM-FH). On a cultivé les cellules à 28 C. On a obtenu le virus de polyhédrose nucléaire Autographa californica du Dr Lois Miller (Department of Genetics and Entomology, University de Géorgie, Athènes, GA 30602, Etats-Unis d'Amérique) et l'on a purifié ce virus par plaque sur des cellules Sf9 contenant i % de gélose et Cells and Virus Spodoptera frugiperda cells, clone Sf9, were obtained from the American Type Culture Collection (ATCC n CRL 1711) and propagated in Grace's Antheraea (Gibco, KC Biologicals) containing 3.3 g / l of a yeast hydrolyzate (from Difco) and 3.3 g / l of a lactalbumin hydrolyzate (Difco), 10% of fetal bovine serum and 0.06 g / l of penicillin as well as 0.1 g / l of streptomycin (TNM-FH medium). The cells were cultured at 28 ° C. The Autographa californica nuclear polyhedrosis virus was obtained from Dr. Lois Miller (Department of Genetics and Entomology, University of Georgia, Athens, GA 30602, United States of America). purified this virus by plate on Sf9 cells containing 1% agar and
0,8 x TNM-FH. Les dilutions de stocks de virus ont été réa- 0.8 x TNM-FH. The dilutions of virus stocks have been
lisées dans TNM-FH.in TNM-FH.
PREPARATION, RESTRICTION ET MODIFICATIONS DE ADN DNA PREPARATION, RESTRICTION AND MODIFICATIONS
Les enzymes de restriction ont été achetées au Bethesda Research Laboratories Inc., et les conditions pour les digestions de restriction ont été celles suggérées par le fournisseur. On a utilisé le fragment de Kenow de l'ADN polymérisage de E. coli à 200 unités/ml dans du Tris-HCl mM (pH 7,4), 6 mM de MgC12, 10 mM 2-mercaptoéthanol à Restriction enzymes were purchased from Bethesda Research Laboratories Inc., and the conditions for restriction digests were those suggested by the supplier. The Kenow fragment of the E. coli DNA polymerization was used at 200 units / ml in mM Tris-HCl (pH 7.4), 6 mM MgCl 2, 10 mM 2-mercaptoethanol.
37 C durant 30 minutes.37 C for 30 minutes.
On a préparé de l'ADN viral pour transfection à partir de stocks de virus non occlus (VNO) de virus de type sauvage, an utilisant le mode opératoire suivant de Miller, Viral DNA for transfection was prepared from wild-type non-occluded virus (VNO) stocks using the following Miller procedure.
L.K; Miller D.W. et Safer, P.: on a obtenu un culot de cen- L.K; Miller D.W. and Safer, P .: we obtained a pellet of
trifugation des particules de VNO pour les séparer du liquide surnageant à travers un coussin de 25 % de saccharose, mM de NaCl et 10 mM de EDTA, par centrifugation à 90 000g durant 1 heure à 5 C. On a enlevé le liquide surnageant et l'on a remis en suspension le culot de virus dans 0,5 ml 2O-dê-tampon de lyste (10 iM de Tris, pH 7,6, 10 mM de EDTA, 0,25 % de SDS). Apres remise an suspension du culot des virus, on a ajouté de la protéinase K jusqu'à une concentration finale de 500 ug/ml et l'on a fait incuber durant la nuit trifugation of the VNO particles to separate them from the supernatant liquid through a pad of 25% sucrose, mM NaCl and 10 mM EDTA, by centrifugation at 90,000g for 1 hour at 5 ° C. The supernatant liquid and the The virus pellet was resuspended in 0.5 ml of dye-lysate buffer (10 μM Tris, pH 7.6, 10 mM EDTA, 0.25% SDS). After resuspending the virus pellet, Proteinase K was added to a final concentration of 500 μg / ml and incubated overnight.
(environ 16 heures) à 37 C avec agitation occasionnelle. (about 16 hours) at 37 C with occasional agitation.
On a extrait l'ADN avec un égal volume de phénol: chloro- The DNA was extracted with an equal volume of phenol: chlorinated
forme: alcool isoamylique (25:24:1). On a ensuite précipité __ 'ADN à 20 C par l'addition d'1/10 de volume d'acétate de sodium 3M à pH 5 et de 2 volumes d'éthanol froid. Apres obention d'un culot de centrifugation, on a lavé l'ADN avec de l'éthanol à 70 %, on l'a séché et ramis en suspension form: isoamyl alcohol (25: 24: 1). The DNA was then precipitated at 20 ° C by the addition of 1: 10 volume of 3M sodium acetate at pH 5 and 2 volumes of cold ethanol. After obtaining a centrifugation pellet, the DNA was washed with 70% ethanol, dried and ramis suspended.
dans TE (10 mM de Tris, 1 mM de EDTA, pH 7,5) avant de l'uti- in TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.5) before use.
liser pour une transfection ou par analyse par enzyme de restriction. On a préparé de l'ADN de plasmide an utilisant le mode opératoire de Summers, M.D. et Smith, G.E. comme suit: On a inoculé une seule colonie de cellules bactériennes, provenant d'une plaque fraîchement préparée, à 1 ml de read for transfection or restriction enzyme analysis. Plasmid DNA was prepared using the procedure of Summers, M.D. and Smith, G.E. as follows: A single colony of bacterial cells, from a freshly prepared plate, was inoculated into 1 ml of
bouillon Luria (BL) additionné d'un antibiotique approprié. Luria broth (BL) supplemented with a suitable antibiotic.
Après incubation à 37 C durant 12 à 18 heures,on a transféré After incubation at 37 ° C. for 12 to 18 hours,
le ml de culture dans 200 ml de bouillon Luria plus des anti- ml of culture in 200 ml of Luria broth plus anti-
biotiques dans un ballon de 500 à 1000 ml, et l'on a fait incuber dans un incubateur à secousses (37 C) durant la nuit (12 à 18 heures). On a transféré les cultures, de 200 ml chacune, dans des bouteilles pour centrifugeuses, et l'on biotics in a 500 to 1000 ml flask, and incubated in a shaking incubator (37 C) overnight (12 to 18 hours). The cultures, of 200 ml each, were transferred to centrifuge bottles, and
a centrifugé à 2500 t/min durant 10 minutes. Après enlève- centrifuged at 2500 rpm for 10 minutes. After removing
ment du liquide surnageant, on a remis en suspension chaque supernatant fluid, each suspension was resuspended
culot de cellules dans 30 ml de tampon STET (8 % de saccha- cell pellet in 30 ml of STET buffer (8% saccharine
rose, 0,5 % de Triton X-100, 50 mM de EDTA (pH 8,0), 10 mM de Tris-Cl, pH 8,0) à la température ambiante et l'on a transféré dans un ballon de 125 ml. Puis l'on a ajouté dans chaque ballon 3 ml de 10 mg/ml de lysozyme (préparé frais dans du tampon STET), et l'on a fait tourbillonner chaque ballon pour mélanger, puis l'on a fait incuber durant 5 minutes environ à la température ambiante. On a ensuite fait doucement tourbillonner chaque ballon (environ 1 fois toutes les 5 secondes) directement au-dessus d'une flamme jusqu'à ce que les cellules commencent à coaguler et à virer au blanc. Au moment o des bulles se sont formées, on a transféré les ballons dans un bain d'eau bouillante durant secondes, après quoi on a refroidi les ballons dans un bain d'eau glacée durant 2 minutes ou davantage. On a versé rose, 0.5% Triton X-100, 50 mM EDTA (pH 8.0), 10 mM Tris-Cl, pH 8.0) at room temperature and was transferred to a 125 ml flask. ml. Then 3 ml of 10 mg / ml of lysozyme (freshly prepared in STET buffer) was added to each flask, and each flask was swirled to mix, followed by incubation for about 5 minutes. at room temperature. Each flask (approximately 1 every 5 seconds) was then gently swirled directly over a flame until the cells began to clot and turn white. As bubbles formed, the flasks were transferred to a boiling water bath for seconds, after which the flasks were cooled in an ice-water bath for 2 minutes or more. We paid
lentement les mélanges visqueux dans des tubes de centri- slowly viscous mixtures in centrifuge tubes.
fugeuses à fond rond, de 50 ml, et l'on a centrifugé durant minutes à 16000 t/min en utilisant un rotor SW 28 (Beckman, CA) dans une centrifugeuse pour préparation. On a soigneusement versé le liquide surnageant de chaque tube dans un tube de centrifugeuse an polypropylène, à jeter après usage, et auquel on a ajouté un volume d'isopropanol ou deux volumes d'éthanol, et l'on a précipité l'ADN à -80 C durant 20 minutes (ou -20 C durant 2 heures ou davantage), 50 ml round bottom runners, and centrifuged for minutes at 16,000 rpm using a SW 28 rotor (Beckman, CA) in a centrifuge for preparation. The supernatant fluid from each tube was carefully poured into a disposable polypropylene centrifuge tube, to which a volume of isopropanol or two volumes of ethanol was added, and the DNA was precipitated. -80 C for 20 minutes (or -20 C for 2 hours or more),
et l'on a centrifugé à 2500 g durant 15 minutes ou davantage. and centrifuged at 2500 g for 15 minutes or more.
Après enlèvement de l'alcool, on a ajouté 2,5 ml de tampon pour extraction (par litre: 12,1 g de Tris, 33,6 g de Na2EDTA, 2H20, 14,9 g de KC1, pH 7,5) au culot, que l'on a ensuite After removal of the alcohol, 2.5 ml of extraction buffer (per liter: 12.1 g of Tris, 33.6 g of Na 2 EDTA, 2H 2 O, 14.9 g of KCl, pH 7.5) was added. on the base, which we then
fait tourbillonner pour détacher le lysat du fond du tube. swirls to loosen the lysate from the bottom of the tube.
On a ajouté 100 el de 10 mg/ml de RNase A (dissous dans 0,1X TE et prétraité par 10 minutes d'ébullition) et l'on a fait incuber durant 30 minutes & 37 C. On a ajouté dans chaque tube environ 200,ug de protéinase K et l'on a ensuite fait incuber à 40-50 C durant 30 minutes environ, au bout desquelles on a ajouté 250,ul de Sarkosyl à 10 % et l'on a poursuivi l'incubation durant 3 heures au moins. Afin de préparer des gradients de CsCl, on a ajouté dans chaque tube 80 ul de 10 mg/ml de bromure d'éthidium par ml de solution de ADN. Puis l'on a ajouté dans chaque tube 1,04 g de CsCl 100 μl of 10 mg / ml of RNase A (dissolved in 0.1X TE and pretreated by 10 minutes of boiling) were added and incubated for 30 minutes at 37 ° C. 200 ug Proteinase K and then incubated at 40-50 ° C. for about 30 minutes, after which 250 ul of 10% Sarkosyl was added and incubation continued for 3 hours. at least. In order to prepare CsCl gradients, 80 μl of 10 mg / ml ethidium bromide per ml of DNA solution was added to each tube. 1.04 g of CsCl was then added to each tube.
par ml de solution de ADN et l'on a fait doucement tourbil- ml of DNA solution and gently
lonner pour dissoudre. Après transfert dans des tubes "Quick Seal"(R), on a centrifugé les gradients jusqu'& équilibre à 55 O00 t/min durant 16 heures dans un rotor à angle fixe 70.1 Ti, ce qui a donné deux bandes visiblement bien séparées de ADN dans lesquelles la bande supérieure comprend l'ADN linéaire et entaillé alors que la bande inférieure comprend de l'ADN circulaire fermé par covalence. La bande inférieure (ADN circulaire fermé par covalence) a été collectée et to dissolve. After transfer to "Quick Seal" tubes (R), the gradients were centrifuged to equilibrium at 55,000 rpm for 16 hours in a 70.1 Ti fixed angle rotor, resulting in two bands visibly well separated from each other. DNAs in which the upper band comprises linear DNA and notched while the lower band comprises covalently closed circular DNA. The lower band (covalently closed circular DNA) was collected and
versée dans un tube de centrifugeuse de 15 ml, en polypropy- poured into a 15 ml centrifuge tube made of polypropylene
lène, dans lequel on a ajouté de l'eau pour porter dans chaque tube le volume à environ 6 ml. On a extrait de l'ADN le bromure d'éthidium, en utilisant un volume égal d'alcool lene, in which water was added to bring the volume to about 6 ml in each tube. Ethidium bromide was extracted from the DNA using an equal volume of alcohol
isoamylique, et l'on a enlevé et jeté la phase rose (supé- isoamyl, and the pink phase was removed and discarded.
rieure). On a répété l'extraction jusqu'à ce que la phase supérieure soit incolore, et que la phase inférieure (ADN) soit limpide et incolore. Il doit rester dans chaque tube environ 5 ml de solution de ADN (sinon, on ajoute de l'eau jusqu'à un volume final de 5 ml) auquel on a ajouté 2 volumes d'éthanol absolu. On a précipité l'ADN à -20 C durant la nuit ou à -80 C durant 10 minutes, et l!on a formé un culot higher). Extraction was repeated until the upper phase was colorless, and the lower phase (DNA) was clear and colorless. About 5 ml of DNA solution should remain in each tube (otherwise water is added to a final volume of 5 ml) to which 2 volumes of absolute ethanol have been added. The DNA was precipitated at -20 ° C overnight or at -80 ° C for 10 minutes, and a pellet was formed.
par centrifugation à 2500 g durant 20 minutes. Après enlè- by centrifugation at 2500 g for 20 minutes. After
vement de la totalité de l'alcool, on a ajouté à chaque culot all the alcohol was added to each pellet
500 ul de 0,1X TE, et l'on a mis le culot à nouveau en sus- 500 μl of 0.1X TE, and the pellet was again resuspended.
pension à 65 C durant 10 minutes au moins. On peut conserver pension at 65 C for 10 minutes at least. We can keep
l'ADN à 4 C.DNA at 4 C.
On a aussi préparé de l'ADN de plasmide comme décrit dans Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (page 8696). L'ADN-ligase a été achetée chez New England Biolabs, et on l'a utilisée à 10 000 unités/ml dans 50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 10 mM MgC12, 20 mM de DTT, 1 mM de ATP. L'analyse de ADN sur des gels de gélose a été comme décrit dans Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning, Plasmid DNA was also prepared as described in Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (page 8696). DNA ligase was purchased from New England Biolabs, and used at 10,000 units / ml in 50 mM Tris-HCl (pH 7.8), 10 mM MgCl 2, 20 mM DTT, 1 mM ATP. DNA analysis on agar gels was as described in Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning,
Cold Spring Harbor Laboratory.Cold Spring Harbor Laboratory.
CONSTRUCTION DE VECTEURS PLASMIDES CONTENANT DU PROMOTEUR CONSTRUCTION OF PLASMID VECTORS CONTAINING PROMOTER
AcNPV RELIE PAR LIGATION A DES SEQUENCES DE CODAGE DE GENE GAG DE LAV/HTLV III (pAc-gagl) On décrit ci-après la construction et les vecteurs plasmides contenant des séquences codantes du gène de LAV/ LIGATION-RELATED ACNPV TO LAV / HTLV III GAG GENE ENCODING SEQUENCES (pAc-gag1) The construction and plasmid vectors containing coding sequences of the LAV gene are described below.
HTLV III gag, ce qui est précédé par des séquences de com- HTLV III gag, which is preceded by sequences of com-
mande de transcription de AcNPV et suivies de l'ADN poly- transcript of AcNPV and followed by poly-
* hédrine. Ces vecteurs plasmides recombinants ont servi ensuite à insérer les séquences de codage de LAV/HTLV III gag dans* hedrin. These recombinant plasmid vectors were then used to insert the coding sequences of LAV / HTLV III gag into
le génome du baculovirus par recombinaison in vivo. the baculovirus genome by in vivo recombination.
On a purifié la séquence de codage de LAV/HTLV III gag (figure 14) à partir de pKS-5, un sous-clone de lambda J19 (Wain-Hobson, S, et al., 1985, Cell 40:9) et on l'a The coding sequence of LAV / HTLV III gag (FIG. 14) was purified from pKS-5, a J19 lambda subclone (Wain-Hobson, S, et al., 1985, Cell 40: 9) and we have it
inséré dans le plasmide Ac610 en aval par rapport au promo- inserted into the plasmid Ac610 downstream relative to the promoter
teur de polyédrine de baculovirus contenu dans pAc610, afin de construire pAc-gagl (figure 15). Dans cette construction, la séquence de nucléotides spécifiques de LAV/HTLV III est précédée par le promoteur de polyédrine formant un gène baculovirus polyhedrin contained in pAc610 to construct pAc-gag1 (Figure 15). In this construct, the LAV / HTLV III specific nucleotide sequence is preceded by the gene forming polyhedrin promoter.
chimère suivi de la séquence du gène de pdlyédrine. chimera followed by the sequence of the pdlyedrine gene.
Comme précédemment expliqué, pKS-5 consiste en un fragment de 3148 paires de bases SStI à KpnI de la partie insérée de ADN de LAV/HTLV III contenue dans lambda J19 cloné dans le site de SstI et de KpnI de pUc18. On l'a obtenu en clonant le fragment de restriction de SstI de J19 dans le site SStI de pUC18 pour créer pBT-1, que l'on a ensuite soumis à digestion avec KpnI et soumis à nouvelle ligation. On a utilisé cet ADN pour transformer E. coli, et l'on a isolé le plasmide pKS-5. L'ADN spécifique de LAV/ As previously explained, pKS-5 consists of a 3148 base pair fragment SStI to KpnI of the inserted portion of LAV / HTLV III DNA contained in lambda J19 cloned into the SstI and KpnI site of pUc18. It was obtained by cloning the J19 SstI restriction fragment into the pUC18 SStI site to create pBT-1, which was then digested with KpnI and re-ligated. This DNA was used to transform E. coli, and plasmid pKS-5 was isolated. The specific DNA of LAV /
HTLV III contenu dans pKS-5 va du site SstI logé au nucléo- HTLV III contained in pKS-5 goes from the SstI site housed in the nucleus
g0 tide 224 jusqu'au site KpnI logé au nucléotide 3372 sur le génome LAV/HTLV III (Wain-Hobson, S et al., 1985, Cell 40:9; # 224 to the KpnI site at nucleotide 3372 on the LAV / HTLV III genome (Wain-Hobson, S et al., 1985, Cell 40: 9;
voir aussi la figure 14).see also Figure 14).
On a soumis 10 >g de pKS-5 & digestion jusqu'à achèvement par HincII et SStI, et l'on a résolu les fragments résultant sur un gel de gélose à 1 % a faible température de fusion. On a excisé du gel le fragment comportant 1818 paires de base (environ 0,20 ug). Ce fragment contenait des séquences spécifiques de LAV/HTLV III allant du nucléotide n 224 au n 2042, comme présenté sur la figure 14. Il contient 10 μg of pKS-5 was digested to completion with HincII and SStI, and the resulting fragments resolved on a low melting 1% agar gel. The fragment containing 1818 base pairs (about 0.20 μg) was excised from gel. This fragment contained specific sequences of LAV / HTLV III ranging from nucleotide # 224 to # 2042, as shown in FIG. 14. It contains
la région de codage pour la totalité du gène gag. the coding region for the entire gag gene.
On a soumis cinq microgrammes de pAc610 à digestion jusqu'à achèvement avec SmaI et SstI, et l'on a effectué le fractionnement sur un gel de gélose à 1 % & bas point de fusion; on a excisé du gel la bande de ADN (environ Five micrograms of pAc610 were digested until completion with SmaI and SstI, and fractionation was performed on a 1% low melting agar gel; the DNA band was excised from the gel (approximately
0,4 pg) (figure 15).0.4 μg) (Figure 15).
On a fait fondre les deux tranches de gel à 65 C durant 10 minutes et l'on a effectué la ligation de 3 1ul de fragment spécifique de LAV/HTLV III comportant 1818 Both gel slices were melted at 65 ° C. for 10 minutes and 3 μl of LAV / HTLV III specific fragment containing 1818 was ligated.
paires de base (digestion avec HincII et SstI) sur un-micro- pairs (digestion with HincII and SstI) on a micro-
litre de pAc 610 (digestion avec SmaI et SstI) dans un volume total de 40 jul. L'incubation a eu lieu à 23 C (température ambiante) durant 16 heures. On a ensuite chauffé le mélange de ligation durant 10 minutes à 65 C et on l'a utilisé pour transformer la souche HB101 de E. coli. On a testé de l'ADN plasmide provenant de transformants capables de résister 1 pAc 610 (digestion with SmaI and SstI) in a total volume of 40 μl. Incubation took place at 23 ° C (room temperature) for 16 hours. The ligation mixture was then heated for 10 minutes at 65 ° C and used to transform E. coli strain HB101. Plasmid DNA from transformants capable of resisting
à l'ampicilline, pour déceler la présence de la partie insé- ampicillin, to detect the presence of the insulin
rée correspondant à LAV/HTLV III. La structure de ce plas- corresponding to LAV / HTLV III. The structure of this plasm
mide, pAc-gagl, est montrée sur la figure 15. mide, pAc-gag1, is shown in FIG.
CONSTRUCTION DU BACULOVIRUS RECOMBINANT CONTENANT LE GENE CONSTRUCTION OF RECOMBINANT BACULOVIRUS CONTAINING GENE
CHIMERE LAV/HTLV IOI GAG (Ac-gagl) On a purifié par plaques AcNPV et l'on en a effec-LAV / HTLV IOI GAG CHIMER (Ac-gag1) AcNPV plates were purified and
tué la propagation sur des cellules Sf9. On a isolé de l'ADN de AcNPV de type sauvage et l'on a purifié pAc-gagl comme killed the spread on Sf9 cells. Wild-type AcNPV DNA was isolated and pAc-gagl was purified as
précédemment décrit (voir ci-dessus). previously described (see above).
On a réalisé l'insertion des séquences chimères The insertion of the chimeric sequences was carried out
de LAV/HTLV III gag dans le génome de AcNPV, par recombi- of LAV / HTLV III gag in the genome of AcNPV, by recombinant
25877'2025877'20
naison in vivo rendue possible par le fait que les séquences gag de pAcgagl sont entourées par des séquences AcNPV codantes. Une co-transfection de 1'ADN plasmide pAc-gagl In vivo generation made possible by the fact that the gag sequences of pAcgag1 are surrounded by coding AcNPV sequences. Co-transfection of plasmid pAc-gagl DNA
avec de l'ADN de AcNPV de type sauvage a permis à une recom- with wild-type AcNPV DNA allowed for a recom-
naison de se produire entre les séquences de polyédrine sur le plasmide et les séquences homologues du génome de AcNPV. L'insertion du gène chimère se produit par suite de double recombinaisons dans les séquences entourantes ou de flanc. De tels recombinants vont avoir le gène chimère inséré occur between the polyhedrin sequences on the plasmid and homologous sequences of the AcNPV genome. The insertion of the chimeric gene occurs as a result of double recombinations in the surrounding or flanking sequences. Such recombinants will have the chimeric gene inserted
dans le gène de polyédrine de AcNPV et, donc, seront inca- in the polyhedrin gene of AcNPV and, therefore, will be
pables de produire des corps à occlusion. On peut choisir les plaques de recombinants en effectuant un examen visuel to produce occlusion bodies. Recombinant plates can be selected by visual examination
pour déceler l'absence de virus à occlusion. to detect the absence of occlusion virus.
On a mélangé 1,g d'ADN de AcNPV, 5 ug de pAc-gagl, et 15 >ug d'ADN de thymus de veau, et l'on a précipité par de l'éthanol. On a lavé le précipité avec de l'éthanol à %, on a laissé sécher à l'air sous une hotte pour culture 1 g of AcNPV DNA, 5 μg of pAc-gag1, and 15 μg of calf thymus DNA were mixed, and precipitated with ethanol. The precipitate was washed with% ethanol, allowed to air dry under a hood for culture.
de tissus, et l'on a remis en suspension dans 437.1 de H20. of tissues, and resuspended in 437.1 H2O.
On a ajouté CaCl2 jusqu'à 0,25 M (63 ul de CaCl2 2M pour 437 ul de ADN dans H2Oi. Tout en faisant barboter de l'air CaCl2 was added up to 0.25 M (63 μl of 2M CaCl 2 for 437 μl of DNA in H 2 O) while bubbling air through it.
dans 500 ul de 2XHEBS, on a ajouté goutte à goutte la solu- in 500 μl of 2XHEBS the solution was added dropwise.
tion d'ADN (1 goutte/4 secondes). 2XHEBS contient, par ml, 16 mg de NaCl, 2 mg de D-glucose, 0,75 mg de KC1, 0,5 mg de Na2HPO4.12H2O, 9,5 mg pH 7,1. On a fait incuber le mélange à la température ambiante durant 30 minutes et on l'a ajouté à une boîte pour culture sur tissu, de 60 mm, DNA (1 drop / 4 seconds). 2XHEBS contains, per ml, 16 mg of NaCl, 2 mg of D-glucose, 0.75 mg of KC1, 0.5 mg of Na2HPO4.12H2O, 9.5 mg pH 7.1. The mixture was incubated at room temperature for 30 minutes and added to a 60 mm tissue culture dish.
contenant 3 x 106 cellules Sf9 dans 2 ml de milieu d'insec- containing 3 x 106 Sf9 cells in 2 ml of insect
tes de Grace contenant 10 % de sérum de foetus de veau et of Grace containing 10% fetal calf serum and
des antibiotiques (pas d'hydrolysat de levure ni d'hydroly- antibiotics (no yeast hydrolyzate or hydrolyzate
sat de lactalbumine). On a ajouté goutte à goutte la solu- sat lactalbumin). The solution was added dropwise
tion de ADN aux cellules, et l'on a fait incuber la boîte durant 4 heures à 28 C. On a rincé la boîte avec 4 ml de milieu de Grace + FBS + des antibiotiques, et l'on a fait incuber durant 90 minutes avec du milieu de Grace + FBS + The cells were incubated with 4 ml of Grace + FBS + antibiotics and incubated for 90 minutes. with Grace's middle + FBS +
des antibiotiques + 20 % de diméthylsulfoxyde. antibiotics + 20% dimethylsulfoxide.
On a rincé la plaque 3 fois avec du milieu complet et on l'a soumise à incubation à 28 C avec 4 ml de milieu complet. Au bout de 5 jours, on a collecté ce qui surnage et l'on a clarifié & 1000 g durant 5 minutes. On a titré le stock du virus sur des cellules Sf9 et l'on a identifié par examen visuel les plaques sans occlusion. On a prélevé les plaques sans occlusion et l'on a effectué deux fois encore un traitement sur plaque. On a provoqué l'expansion de ces plaques sur des cellules Sf9 et l'on a préparé des stocks du virus que l'on a utilisés pour une caractérisation The plate was rinsed 3 times with complete medium and incubated at 28 ° C. with 4 ml of complete medium. After 5 days, the supernatant was collected and clarified at 1000 g for 5 minutes. The virus stock was titrated on Sf9 cells and plaques without occlusion were visually identified. Plates were removed without occlusion and two more plate treatments were performed. These plates were expanded on Sf9 cells and virus stocks were prepared and used for characterization.
subséquente. Une représentation schématique de la construc- subsequent. A schematic representation of the construction
tion du recombinant est présentée sur la figure 16. The recombinant is shown in Figure 16.
EXPRESSION DE LA PROTEINE APPARENTEE A LAV/HTLV III GAG EXPRESSION OF LAV / HTLV III GAG RELATED PROTEIN
DANS DES CELLULES DE CULTURES TISSULAIRES INFECTEES PAR IN CELLS OF TISSUE CULTURES INFECTED BY
DES BACULOVIRUS RECOMBINANTSRECOMBINANT BACULOVIRUS
On a montré que l'AcNPV recombinant, portant le gène chimère LAV/HTLV III gag est capable d'exprimer, après infection des cellules dans une culture sur tissu, de l'ARN et des protéines apparentées à LAV/HTLV III gag. On a aussi trouvé que ces protéines sont immunoréactives avec du sérum Recombinant AcNPV carrying the LAV / HTLV III gag chimeric gene has been shown to be capable of expressing, after infection of the cells in tissue culture, RNA and related proteins to LAV / HTLV III gag. It has also been found that these proteins are immunoreactive with serum
provenant de patients atteints de SIDA. from AIDS patients.
L'identification de l'ARN spécifique de LAV/HTLV III gag dans des cellules infectées par Ac-gagl On a infecté dix boites de 100 ml de cellules Sf9 (environ 107 cellules/boite) par AcPNV de type sauvage ou The identification of LAV / HTLV III gag specific RNA in Ac-gag1 infected cells Ten boxes of 100 ml of Sf9 cells (approximately 107 cells / dish) were infected with wild-type AcPNV or
son recombinant, Ac-gagl, à un taux de multiplicité d'infec- its recombinant, Ac-gagl, at a multiplicity rate of infection.
tion de 4. 24 heures après l'infection, on a récolté les cellules et on les a lavées deux fois dans NaCl 0,15 M, Tris-HCl 0,01 M, pH 7,2. On a isolé de l'ARN polyadénylé, 4. 24 hours after infection, the cells were harvested and washed twice in 0.15 M NaCl, 0.01 M Tris-HCl, pH 7.2. Polyadenylated RNA was isolated,
comme décrit (Purchio, A.F. et Fareed, G.C, 1979, J. Virol. as described (Purchio, A.F. and Fareed, G.C, 1979, J. Virol.
29:763-769). On a fractionné l'ARN sur un gel à 1 % de géloseformaldéhyde (H. Lehrach et al., 1977, Biochemistry 16:4743-4251), on a transféré sur un filtre en "Nylon" 29: 763-769). The RNA was fractionated on a 1% gel of agarformaldehyde (H. Lehrach et al., 1977, Biochemistry 16: 4743-4251), transferred to a "nylon" filter.
("Hybond") et l'on a irradié par de la lumière ultraviolette. ("Hybond") and irradiated with ultraviolet light.
On a provoqué l'hybridation du filtre sur de l'ADN de pKS-5 marqué par 3 P dans NaCl 0,9 M, phosphate de sodium 50 mM (pH 7,0), EDTA 5 mM, SDS 0,1 %, 4 XDenhardts, RNAt 0,4 mg/ml, ADN de thymus de veau_0,25 mqiml, formamide à 50 % durant 16 heures à 42 C. On a lavé les filtres quatre fois dans SDS, 0,1 %, 0,25XSSC durant 30 minutes à 65 C et l'on a exposé à un film "Cronex 4" pour rayons X, en utilisant des écrans d'intensification "Lightening Plus". La figure 17 montre qu'une bande majeure de 2,2 kilopaires de base est décelée dans des cellules infectées par AcNPV recombinant, Filter hybridization was induced on 3 P-labeled pKS-5 DNA in 0.9 M NaCl, 50 mM sodium phosphate (pH 7.0), 5 mM EDTA, 0.1% SDS, 4 XDenhardts, RNAt 0.4 mg / ml, calf thymus DNA -0.25 mqiml, 50% formamide for 16 hours at 42 C. Filters were washed four times in SDS, 0.1%, 0.25XSSC during 30 minutes at 65 C and exposed to a film "Cronex 4" for X-rays, using intensifying screens "Lightening Plus". Figure 17 shows that a 2.2-kb major band is detected in cells infected with recombinant AcNPV,
mais non dans des cellules infectées par un type sauvage. but not in cells infected with a wild type.
IDENTIFICATION DE PROTEINES APPARENTEES A LAV/HTLV III GAG IDENTIFICATION OF PROTEINS RELATED TO LAV / HTLV III GAG
EXPRIMEES DANS DES CELLULES INFECTEES PAR DU BACULOVIRUS EXPRESSED IN CELLS INFECTED WITH BACULOVIRUS
RECOMBINANT, EN UTILISANT DES TECHNIQUES D'IMMUNOPRECI- RECOMBINANT, USING IMMUNOPRECI-
PITATIONPITATION
L'essai de dosage par immunoprécipitation, décrit The immunoprecipitation assay, described in
ci-après, montre que les cellules infectées par le baculo- below, shows that cells infected with baculo-
virus recombinant de la présente invention-synthétisent des protéines qui sont spécifiquement immunoréactives avec du recombinant virus of the present invention-synthesize proteins that are specifically immunoreactive with
sérum provenant de patients atteints de SIDA. serum from AIDS patients.
On a ensemencé des cellules Sf9 sur des boites de ml (5 x 106 cellules/botte) et l'on a infecté par AcNPV de type sauvage dans Ac-gagl. A 24,.48 et 72 heures après l'infection, on a remplacé les milieux par des milieux sans méthionine, et l'on a fait incuber les cellules durant 30 Sf9 cells were seeded on ml dishes (5x10 6 cells / bunch) and infected with wild-type AcNPV in Ac-gag1. At 24, 48 and 72 hours after infection, the media were replaced with methionine-free media, and the cells were incubated for 30 minutes.
minutes à 28 C. Au bout de ce temps, on a remplacé les mi- minutes at 28 C. At the end of this time, we replaced the
lieux par des milieux sans méthionine contenant 100 iCi/ml places with methionine-free media containing 100 iCi / ml
de 5sI méthionine et l'on a laissé le marquage se pour- of methionine and the labeling was allowed to proceed.
suivre durant 2 heures à 28 C.follow for 2 hours at 28 C.
A la fin de la période de marquage, on a lavé les cellules deux fois avec Tris-HCl 0,01 M (pH 7,2), NaCl 0,15M At the end of the labeling period, the cells were washed twice with 0.01M Tris-HCl (pH 7.2), 0.15M NaCl.
et l'on a collecté par centrifugation. On a remis en sus- and collected by centrifugation. We have reinstated
pension les culots de cellules, provenant de chaque botte pension cell pellets, from each boot
de 60 mm, dans 1 ml de tampon de lyse: 1 % de NP-40 (poly- 60 mm, in 1 ml of lysis buffer: 1% NP-40 (poly-
oxyéthylène(9) p-tert-octylphénol), 0,5 % de désoxycholate de sodium, 0, 1M de NaCl, 0,01M de Tris-HCl (pH 7,4), 1 mM de EDTA, et l'on a clarifié le lysat par centrifugation oxyethylene (9) p-tert-octylphenol), 0.5% sodium deoxycholate, 0.1M NaCl, 0.01M Tris-HCl (pH 7.4), 1 mM EDTA, and clarified the lysate by centrifugation
durant 30 minutes à 100 000 g.for 30 minutes at 100,000 g.
On a effectué une immunoprécipitation en ajoutant 4,l de sérum humain, inactivé par chauffage, provenant d'une population témoin ou de patients atteints de SIDA, Immunoprecipitation was performed by adding 4.1 of heat-inactivated human serum from a control or AIDS patient population.
à 500 ml de lysat de cellules. Après une demi-heure d'incu- to 500 ml of cell lysate. After half an hour of incu-
bation à 4 C, on a ajouté 80 ul de cellules de Staphylococcus aureus activées (cellules "Pansorbin", Calbiochem-Behring Corp., La Jolla, CA, Etats-Unis d'Amérique) et on a laissé at 4 ° C, 80 μl of activated Staphylococcus aureus cells ("Pansorbin" cells, Calbiochem-Behring Corp., La Jolla, CA, USA) were added and
l'incubation se poursuivre durant 1 demi-heure supplémen- incubation to continue for an additional half-hour
taire à 4 C. On a collecté les comples d'immunoprécipitation, par 5 minutes de centrifugation à 5000 t/min. dans un rotor Sorvall A384 à 4 C, et on a lavé une fois dans 1M NaCl + 0,1 % de NP-40 + 0,01 M de Tris-HCl, pH 7,4, et trois fois dans du tampon RIPA (10 mM de Tris-HCl, pH 7,2, 0, 15 M de NaCl, 1 % de désoxycholate de sodium, 1 % de lauryl sulfate The immunoprecipitation supplements were collected by centrifugation for 5 minutes at 5000 rpm. in a Sorvall A384 rotor at 4 ° C., and washed once in 1M NaCl + 0.1% NP-40 + 0.01 M Tris-HCl, pH 7.4, and three times in RIPA buffer ( 10 mM Tris-HCl, pH 7.2, 0.15 M NaCl, 1% sodium deoxycholate, 1% lauryl sulfate
de sodium, 1 % de "Triton X-100"). On a remis les immuno- of sodium, 1% of "Triton X-100"). The immune
précipités, ainsi lavés, en suspension dans 80,ul de tampon pour échantillons de Laemmli, on a fait bouillir durant 1 minute et centrifugé durant 5 minutes à 5000 t/min. dans un rotor Sorvall A384. On a analysé, par électrophorèse sur des gels de polyacrylamide à 10 % de SDS, les protéines immunoprécipitées présentes dans le liquide surnageant. Apres l'électrophorèse, on a coloré les gels avec du colorant bleu The precipitates thus washed, suspended in 80 μl of Laemmli sample buffer, were boiled for 1 minute and centrifuged for 5 minutes at 5000 rpm. in a Sorvall A384 rotor. The immunoprecipitated proteins present in the supernatant were analyzed by electrophoresis on 10% SDS polyacrylamide gels. After electrophoresis, the gels were stained with blue dye
Coomassie, on a traité par du salicylate de sodium (30 minu- Coomassie was treated with sodium salicylate (30 minutes
tes à la température ambiante dans du salicylate de sodium at room temperature in sodium salicylate
1M) et l'on a séché pour fluorographie. 1M) and dried for fluorography.
Il a été suggéré que les protéines gag matures (34 000 daltons, p24; 16000 daltons, p16; 14 000 daltons, It has been suggested that mature gag proteins (34,000 daltons, p24, 16,000 daltons, p16, 14,000 daltons,
p14) sont obtenues à partir d'une plus grosse protéine pré- p14) are obtained from a larger protein pre-
curseur de 55 000 daltons. La figure 14 montre que des protéines ayant des poids moléculaires de 67 000 daltons, 000 daltons, 40 000 daltons, 34 000 daltons, 32 000 daltons et 24 000 daltons ont été spécifiquement immunoprécipitées slider of 55,000 daltons. Figure 14 shows that proteins with molecular weights of 67,000 daltons, 10,000 daltons, 40,000 daltons, 34,000 daltons, 32,000 daltons and 24,000 daltons have been specifically immunoprecipitated
par du sérum provenant de patients atteints de SIDA. with serum from AIDS patients.
Afin de déterminer s'il existe une relation quel- In order to determine whether there is a relationship
conque précurseur/produit parmi des protéines immunoréac- precursor shell / product among immunoreactive proteins
tives quelconques décrites dans la figure 18, on a effectué des expériences par impulsions de chasse. 24 heures après l'infection, on a marqué durant 5 minutes les cellules avec [5SI méthionine; on a ensuite lavé les cellules avec du milieu complet et on les a faites incuber avec du milieu complet 2, 4 et 8 heures. On a alors récolté les cellules et on les a soumises & immunoprécipitation. On a soumis les protéines immunoprécipitées à fractionnement dans des gels In any case described in Figure 18, hunting pulse experiments were performed. 24 hours after infection, cells were labeled for 5 minutes with [5Si methionine; the cells were then washed with complete medium and incubated with complete medium at 2, 4 and 8 hours. The cells were then harvested and immunoprecipitated. The fractionally immunoprecipitated proteins were subjected to gels
de polyacrylamide à 10 % de SDS, comme décrit ci-dessus. polyacrylamide 10% SDS, as described above.
La figure 19 montre un fluorogramme de cette expérience. Figure 19 shows a fluorogram of this experiment.
Les données suggèrent que p67, p55, p40, p34 et p32 incor- porent le marqueur au bout de 5 minutes. Après une chasse de 8 heures, le marqueur diminue dans p67 et p55 et augmente The data suggest that p67, p55, p40, p34 and p32 incorporate the marker after 5 minutes. After an 8 hour hunt, the marker decreases in p67 and p55 and increases
dans p34. La quantité de radiomarqueur dans p40 reste rela- in p34. The amount of radiolabel in p40 remains relative to
tivement constante.constantly constant.
IDENTIFICATION PAR ELISA DE PROTEINES APPARENTEES A LAV/ ELISA IDENTIFICATION OF LAV-RELATED PROTEINS /
HTLV III GAGHTLV III GAG
On a infecté par Ac-gagl dix boites de 100 ml, con- Ac-gagl was infected with ten 100-ml
tenant chacune 10 cellules Sf9. 24 heures après l'infection, on a récolté les cellules, on les a lavées deux fois dans du Tris-HC1 0,01M (pH 7,2), NaCl 0,15M et on les a congelées et décongelées trois fois. On a provoqué la rupture des cellules à l'aide de 2 ml de solution saline tamponnée par des phosphates et contenant 0,5 % de NP-40 sur de la glace durant 5 minutes. On a centrifugé les lysat à 1000 x g each holding 10 Sf9 cells. 24 hours after infection, the cells were harvested, washed twice in 0.01M Tris-HCl (pH 7.2), 0.15M NaCl and frozen and thawed three times. The cells were disrupted with 2 ml of phosphate buffered saline containing 0.5% NP-40 on ice for 5 minutes. The lysates were centrifuged at 1000 x g
durant 10 minutes et l":'on a enlevé le liquide surnageant. for 10 minutes and the supernatant liquid was removed.
On a ajouté 4 ml de tampon de carbonate (50 mM de carbonate de sodium, pH 9,6) et l'on a fait tourner lae mélange dans une centrifugeuse Eppendorf durant 20 minutes. On a enlevé 4 ml of carbonate buffer (50 mM sodium carbonate, pH 9.6) was added and the mixture was rotated in an Eppendorf centrifuge for 20 minutes. We removed
le liquide surnageant et on l'a dilué dans du tampon de car- the supernatant liquid and diluted in
bonate comme présenté au tableau III. On a utilisé ces lysats pour revêtir durant la nuit à 4 C des plaques de microtitrage comportant 96 creux (50 ul/creux). On a ajouté 300,ul d'un réactif de blocage (5 % de poudre de lait non grasse, 0,01% de thimerosol, 0,1 % d'antimousse A dans 10 X solution saline tamponnée par des phosphates), et l'on a fait incuber durant as shown in Table III. These lysates were used to coat microtiter plates with 96 wells (50 μl / well) overnight at 4 ° C. 300 μl of a blocking reagent (5% non-fat milk powder, 0.01% thimerosol, 0.1% antifoam A in phosphate buffered saline) was added, and the reaction mixture was added to the reaction medium. 'were incubated during
minutes à la température ambiante. On a enlevé par aspi- minutes at room temperature. We removed by vacuum
ration le réactif de blocage, et l'on a ajouté dans chaque creux 50,ul d'une dilution a 1:100 de sérum humain dans du réactif de blocage. Avant l'addition aux creux, on a fait incuber les sérums dilués (sérums provenant de patients atteints de SIDA ou sérum humain normal) à 37 C durant 45 minutes. On a laissé chaque creux réagir & 37 C durant 1 The blocking reagent was added and 50 μl of a 1: 100 dilution of human serum in blocking reagent was added to each well. Prior to addition to the troughs, the diluted sera (sera from patients with AIDS or normal human serum) were incubated at 37 ° C for 45 minutes. Each hollow was allowed to react & 37 C during 1
heure. On a ensuite lavé les creux trois fois avec du chlo- hour. The hollows were then washed three times with chlorine
rure de sodium + "Tween 20" (monolaurate de polyoxyéthylène sorbitanne). On a ajouté dans chaque creux 100 >xl de conjugué de péroxydase de raifort anti-humain de chèvre (une dilu- tion à 1:100 dans du sérum normal de chèvre contenant 0,01% sodium chloride + "Tween 20" (polyoxyethylene sorbitan monolaurate). 100 μl of goat anti-human horseradish peroxidase conjugate (1: 100 dilution in goat normal serum containing 0.01%) was added to each well.
de thimérosol) et on a laissé réagir durant 1 heure à 37 C. of thimerosol) and allowed to react for 1 hour at 37 ° C.
On a lavé les plaques et l'on a ajouté 100 >l/creux de subs- The plates were washed and 100 μl / well
trat tamponné plus du réactif chromogène: le substrat tam- buffered tread plus chromogenic reagent: the
ponné est du péroxyde d'hydrogène, de l'acide citrique et poned is hydrogen peroxide, citric acid and
du tampon au phosphate; le réactif chromogène est la tétra- phosphate buffer; the chromogenic reagent is the tetra-
méthylbenzidine dans du diméthylsulfoxyde. On a fait incuber methylbenzidine in dimethylsulfoxide. We have incubated
les plaques durant 30 minutes à la température ambiante. plates for 30 minutes at room temperature.
On a arr6té la réaction en ajoutant 100,ul/creux d'acide sulfurique 3N. On a mesuré à 400 nm, avec une absorptance de référence à 630 nm, l'absorptance optique du mélange The reaction was stopped by adding 100 μl / well of 3N sulfuric acid. The optical absorptance of the mixture was measured at 400 nm with a reference absorbance at 630 nm.
réactionnel. Les résultats sont présentés au tableau VIII. reaction. The results are presented in Table VIII.
TR1, Y-1, CF22C et CF9 correspondent a du sérum provenant de patients atteints de SIDA; 2, 16, 21 et 48 sont du sérum TR1, Y-1, CF22C and CF9 correspond to serum from AIDS patients; 2, 16, 21 and 48 are serum
humain normal.normal human.
TABLEAU VIITABLE VII
VALEURS D'ABSORPTANCE LORS D'UN DOSAGE ABSORPTION VALUES DURING AN ASSAY
Antisérum Dilution du lysat de -1 SIDA TR1 Y-1 2,619 2,504 2,502 2,305 2, 486 2,319 2,303 2,209 CF22C CF9 Antiserum Dilution of lysate -1 AIDS TR1 Y-1 2,619 2,504 2,502 2,305 2, 486 2,319 2,303 2,209 CF22C CF9
SERUM NORMAL:NORMAL SERUM:
0,221 0,229 0,176 0,165 0,193 0,205 0,200 0,249 - 2,471 2,479 2,354 2,306 2,317 2,241 2,110 2,012 È,204 0,187 0,175 0,135 0,190 0,176 0,185 0,169 0.221 0.229 0.176 0.165 0.193 0.205 0.200 0.249 -2.471 2.479 2.346 2.306 2.317 2.241 2.111 2.012 È, 204 0.187 0.175 0.135 0.190 0.176 0.185 0.169
1 400-11,400-1
2,235 2,216 2,046 2,006 1,924 1,838 1,339 1,305 2,235 2,216 2,046 2,006 1,924 1,838 1,339 1,305
0,-3120 -312
0,176 0,217 0,139 0,216 0,170 0,2170.176 0.217 0.139 0.216 0.170 0.217
0,163,0.163,
2,076 2,119 1,564 1,595 1,393 1,331 0,855 0,850 0,199 0,227 0,131 0,210 0, 189 2,076 2,119 1,564 1,595 1,393 1,331 0.855 0.850 0.199 0.227 0.131 0.210 0, 189
0, 1990, 199
0,177 0,1750.177 0.175
"EL I SA""EL I SA"
Ac-gag 1Ac-gag 1
1000 11000 1
1,499 1,500 1,014 1,0781,499 1,500 1,014 1,078
0,8 110.8 11
0,848 0,512 0,4550.848 0.512 0.455
800- 1800- 1
1,786 1,877 1,298 1,282 1,009 1,068 0,636 0,659 0,228 0,208 0,144 0,175 0, 237 0,197 0,190 0,173 CD -4 0,222 0,210 0,129 0,145 0,165 0,224 0,134 0, 143 r%3 oo Po on uA.I 0c 1-' Dans l'ensemble, les résultats représentés sur les figures 17 à 19 et sur le tableau VII indiquent que les baculovirus recombinants que l'on décrit ici ont été capables (a) d'exprimer le gène inséré LAV/HTLV III gag; (b) de modifier ou traiter de tels produits de géne; et (c) de 1,786 1,877 1,298 1,282 1,009 1,068 0,636 0,659 0,228 0,208 0.144 0.175 0, 237 0.197 0.190 0.173 CD -4 0.222 0.210 0.129 0.145 0.165 0.224 0.134 0, 143 r% 3 oo Po on uA.I 0c 1- 'Overall, The results shown in Figures 17-19 and Table VII indicate that the recombinant baculoviruses described herein were capable of (a) expressing the inserted LAV / HTLV III gag gene; (b) modify or treat such gene products; and (c)
produire des protéines antigéniques spécifiquement immuno- produce specifically immunogenic antigenic
réactives avec du sérum de patients atteints de SIDA. reactive with serum from AIDS patients.
EXEMPLE: RECOMBINANTS GAG-VACCINEEXAMPLE: RECOMBINANT GAG-VACCINE
Dans l'exemple qui suit, on a construit des vec- In the following example, we constructed
teurs de plasmides qui contenaient des gènes chimères com- plasmids which contained complex chimeric genes
prenant des séquences de codage de LAV/HTLV III gag situées en aval par rapport aux régions de commande de transcription du virus de la vaccine. On a inséré le gène chimère contenant le virus de vaccine 7,5 K promoteur et la séquence LAV/HTLV taking LAV / HTLV III gag coding sequences located downstream from the vaccinia virus transcription control regions. The chimeric gene containing vaccinia 7.5 K promoter virus and the LAV / HTLV sequence was inserted.
III gag dans le génome du virus de la vaccine, par recombi- III gag in the genome of vaccinia virus, by recombinant
naison in vivo. On a identifié et purifié de tels virus recombinants, et l'on a préparé des stocks de virus à partir de cellules obtenues par culture sur tissu infecté. On a montré que des protéines immunoréactives apparentées à LAV/ HTLV III gag, sont produites in vitro par les virus de in vivo. Such recombinant viruses were identified and purified, and virus stocks were prepared from cells obtained by culturing on infected tissue. It has been shown that immunoreactive proteins related to LAV / HTLV III gag are produced in vitro by
vaccine recombinants. Une description détaillée de chaque recombinant vaccinia. A detailed description of each
étape dans cette forme de réalisation de l'invention est présentée ciaprès. Les modes opératoires généraux utilisés pour cette forme de réalisation ont été décrits ci-dessus step in this embodiment of the invention is presented below. The general procedures used for this embodiment have been described above
à propos des recombinants d'enveloppe de vaccine. about vaccinia envelope recombinants.
Construction de plasmides vecteurs contenant un promoteur de virus de vaccine, relié par ligation aux séquences de codage du gène LAV/HTLV III gag Construction of vector plasmids containing a vaccinia virus promoter, ligated to the coding sequences of the LAV / HTLV III gag gene
On a construit cinq.plasmides vecteurs qui conte- Five vector plasmids have been constructed which contain
naient le promoteur 7,5K de virus de vaccine relié par liga- The 7.5K promoter of vaccinia virus linked by ligand was
tion à diverses longueurs du génome de LAV/HTLV III conte- different lengths of the LAV / HTLV III genome
nant des séquences de codage de gag. La source des séquences gag coding sequences. The source of the sequences
de codage de LAV/HTLV III gag a été deux sous-clones appa- coding of LAV / HTLV III gag were two subclones
rentés de lambda J19 (Wain-Hobson et al, Cell 40: 1985), pKS- et pSS-5. Le plasmide pKS-5 contient un fragment de 3148 paires de base allant de SStI à KpnI (nucléotide n 224 à n 3372) de l'ADN de LAV/HTLV III inséré aux sites lambda J19 (Wain-Hobson et al., Cell 40: 1985), pKS- and pSS-5. Plasmid pKS-5 contains a 3148 base pair fragment ranging from SStI to KpnI (nucleotide # 224 to # 3372) of the LAV / HTLV III DNA inserted at the sites.
correspondants de pUC18. Le plasmide pSS-5 contient un frag- corresponding to pUC18. Plasmid pSS-5 contains a fragment
ment de 5107 paires de base de SstI à SalI (nucléotide n 224 5107 base pairs of SstI to SalI (nucleotide # 224
à 5221) de l'ADN de LAV/HTLV III inséré aux sites correspon- to 5221) of the LAV / HTLV III DNA inserted at the corresponding sites.
dants de pUC18. On a inséré diverses longueurs de séquences de codage de gag, provenant de pKS-5 ou de pSS-5, dans le plasmide pGS62, qui est identique à PGS20 (Mackett et al., 1984, J. Virol. 49:857-864), sauf qu'il comporte un unique site EcoRI situé en aval de l'unique site SmaI (voir figure ). Les séquences spécifiques de LAV/HTLV III, insérées dans pGS62, commencent toutes avec un site ThaI (FnuDII) situé à 76 paires de base en amont du codon d'amorçage du gène gag. Les plasmides pv-gagl, pv- gag2, pv-gag3, pv-gag4 et pv-gag5 contiennent des séquences spécifiques de LAV/HTLV III allant de ce site ThaI jusqu'aux sites EcoRI (à 4194), KpnI (à 3372), EcoRv (à 2523), BclI (à 1975) ou BglII (à pUC18. Various lengths of gag coding sequences, from pKS-5 or pSS-5, were inserted into plasmid pGS62, which is identical to PGS20 (Mackett et al., 1984, J. Virol 49: 857-864 ), except that it has a unique EcoRI site downstream of the unique SmaI site (see figure). The LAV / HTLV III specific sequences, inserted in pGS62, all begin with a ThaI site (FnuDII) located 76 base pairs upstream of the gag gene initiation codon. Plasmids pv-gag1, pv-gag2, pv-gag3, pv-gag4 and pv-gag5 contain specific LAV / HTLV III sequences from this ThaI site to the EcoRI (at 4194) and KpnI (at 3372) sites. , EcoRv (at 2523), BclI (at 1975) or BglII (at
1642), respectivement. La description de la construction 1642), respectively. The description of the construction
de chaque plasmide, effectuée ci-après, est facilitée quand of each plasmid, performed below, is facilitated when
on se réfère à la figure 20.reference is made to FIG.
Construction de pv-gagl: on a fait digérer jusqu'a achèvement 5 ug de l'ADN de plasmide pSS-5 par des enzymes de restriction ThaI EcoRI. Les fragments résultants ont été Construction of pv-gagl: 5 μg of plasmid pSS-5 DNA was digested to completion with ThaI EcoRI restriction enzymes. The resulting fragments were
résolus sur un gel à 1 % de gélose LMP. On a isolé un frag- resolved on a 1% LMP agar gel. A fragment has been isolated
ment de 3,9 kbp, contenant les séquences de codage de LAV/ HTLV III gag et on l'a fixé par ligation sur de l'ADN de 3.9 kbp, containing the coding sequences of LAV / HTLV III gag and ligated to DNA of
pGS62 précédemment soumis à digestion avec SmaI et EcoRI. pGS62 previously subjected to digestion with SmaI and EcoRI.
On a utilisé le mélange de ligation pour transformer E. coli HB101 et l'on a choisi des clones capables de résister à The ligation mixture was used to transform E. coli HB101 and clones capable of withstanding
l'ampicilline. On a soumis des plasmides provenant de colo- ampicillin. Plasmids from colony
nies individuelles à des essais pour déterminer la présence individual tests to determine the presence
du fragment inséré de 3,9 kilopaires de base (kbp), par ana- inserted fragment of 3.9 kilopytes of base (kbp), per
lyse de restriction et par la régénération du site EcoRI restriction lysis and regeneration of the EcoRI site
à la jonction de ligation. La construction résultante con- at the ligation junction. The resulting construction con-
tient la totalité de la séquence de codage des gènes gag holds the entire coding sequence of the gag genes
et de protéase (prt), et une majeure partie du cadre de lec- and protease (prt), and a major part of the
ture ouverte pol, jusqu'au site EcoRI au nucléotide 4194. open pol, up to the EcoRI site at nucleotide 4194.
Construction de pv-gag2: on a fait digérer 5,ug du plasmide pKS-5, jusqu'à achèvement, avec des enzymes de restriction ThaI et SmaI. Le site SmaI de pKS-5 est situé près du site KpnI, qui est la jonction entre la séquence insérée en provenance de LAV/HTLV III et les sites de clonage Construction of pv-gag2: 5 μg of plasmid pKS-5 was digested to completion with restriction enzymes ThaI and SmaI. The SmaI site of pKS-5 is located near the KpnI site, which is the junction between the inserted sequence from LAV / HTLV III and the cloning sites
multiples du plasmide pUC18. On a résolu les fragments résul- multiples of plasmid pUC18. The resulting fragments were solved
tants sur un gel à 1 % de gélose LMP, et l'on a isolé un fragment de 3,2 kbp contenant des séquences correspondant à LAV/HTLV III gag, et l'on a effectué la ligation sur de l'ADN de pGS 62, soumis au préalable à digestion par SmaI et traité par CIAP. On a utilisé le mélange de ligation pour transformer E. coli HB101 et l'on a choisi des clones capables on a 1% LMP agar gel, and a 3.2 kbp fragment containing sequences corresponding to LAV / HTLV III gag was isolated, and ligation was performed on pGS DNA. 62, previously subjected to SmaI digestion and treated with CIAP. The ligation mixture was used to transform E. coli HB101 and clones capable of
de résister à l'ampicilline. On a soumis des plasmides, pro- to resist ampicillin. Plasmids,
venant de colonies individuelles, à des essais de présence du fragment comportant 3,1 kilopaires de bases, et l'on a déterminé par analyse par restriction l'orientation de l'insertion. La construction résultante pvgag2, contient la totalité du gène gag, le gène prt et une partie du cadre from single colonies to tests for the presence of the 3.1 kilobase base fragment, and the orientation of the insertion was determined by restriction analysis. The resulting construct pvgag2, contains the entire gag gene, the gene prt and part of the frame
de lecture ouvert pol jusqu'au site KpnI au nucléotide 3372. open reading pol to the KpnI site at nucleotide 3372.
La construction de pv-gag3 a été semblable à celle de pv-gag2, sauf que l'on a utilisé un fragment de 2,3 kbp, engendré par des digestions par ThaI et EcoRV de pKS-5, pour l'insertion au site SmaI de pGS62. La construction finale, pv-gag3, contient la totalité des gènes gag et prt et une petite partie de pol fusionnée sur la- partie 3' du gène TK The construction of pv-gag3 was similar to that of pv-gag2 except that a 2.3 kbp fragment, generated by ThaI and EcoRV digests of pKS-5, was used for insertion at the site. SmaI of pGS62. The final construct, pv-gag3, contains all the gag and ready genes and a small portion of pol fused on the 3 'portion of the TK gene.
de virus de vaccine.of vaccinia virus.
Construction de pv-gag4: on a soumis à digestion, jusqu'à achèvement, par SStI et BclI 5 ug de ADN de plasmide pSS-5. On a purifié le fragment résultant, contenant la séquence correspondant à LAV/HTLV III gag. On a relié par ligation ce fragment à un plasmide vecteur pIC19R (Marsh et al., 1984, gène 32:481-485) préalablement découpé avec Construction of pv-gag4: 5 μg of pSS-5 plasmid DNA was digested to completion with SStI and BclI. The resulting fragment, containing the sequence corresponding to LAV / HTLV III gag, was purified. This fragment was ligated to a plasmid vector pIC19R (Marsh et al., 1984, gene 32: 481-485) previously cut with
SstI et BamHI pour construire un plasmide intermédiaire. SstI and BamHI to construct an intermediate plasmid.
L'insertion de la séquence gag au site BamHI de pIC19R abou- The insertion of the gag sequence at the BamHI site of pIC19R results in
tit la juxtaposition du site BclI dans la séquence LAV/HTLV III sur le site EcoRI dans ce vecteur de clonage à sites multiples. La digestion de cette construction intermédiaire par les enzymes de restriction ThaI et EcoRI a engendré un the juxtaposition of the BclI site in the LAV / HTLV III sequence at the EcoRI site in this multiple site cloning vector. Digestion of this intermediate construct with the restriction enzymes ThaI and EcoRI generated a
fragment de 1,72 kilopaires debases (kbp) que l'on a pu faci- a fragment of 1.72 kbp that could be easily
lement insérer dans le plasmide pGS62 aux sites SmaI et EcoRI. insert into the plasmid pGS62 at the SmaI and EcoRI sites.
La construction finale, pv-gag4, contient la totalité du gène LAV/HTLV III gag et une partie du gène prt fusionnée The final construct, pv-gag4, contains the entire LAV / HTLV III gag gene and part of the fused prt gene.
sur la partie 3' du gène TK de virus de vaccine. on the 3 'part of the TK gene of vaccinia virus.
La construction du plasmide pv-gag5 a utilisé la même stratégie en deux étapes que pour pv-gag4. On a fait digérer 5 ug de pSS-5 avec des enzymes de restriction SstI et BglII. On a isolé un fragment de 1,42 kbp, contenant la séquence correspondant à LAV/HTLV III gag, et l'on a purifié ce fragment sur un gel à 1% de gélose LMP et on l'a inséré dans le plasmide pIC19R aux sites SstI et BglII. Une ligation de la séquence gag au site BglII sur son site correspondant dans pIC19R permet (a) la formation d'un codon d'arrêt en The construction of plasmid pv-gag5 used the same two-step strategy as for pv-gag4. 5 μg of pSS-5 were digested with SstI and BglII restriction enzymes. A 1.42 kbp fragment, containing the sequence corresponding to LAV / HTLV III gag, was isolated and this fragment was purified on a 1% LMP agar and inserted into the plasmid pIC19R. SstI and BglII sites. Ligation of the gag sequence to the BglII site on its corresponding site in pIC19R allows (a) formation of a stop codon in
phase avec le cadre de lecture ouverte gag, et (b) ia juxta- phase with the open reading frame gag, and (b) the juxtaposition
position du site BglII sur le site adjacent EcoRI sur le plasmide à sites multiples de clonage. Cette construction intermédiaire a été ensuite soumise à digestion avec ThaI et EcoRI. On a purifié un fragment, de 1,39 kilopaires de bases contenant les séquences correspondant à LAV/HTLV III gag, et l'on a fixé pat ligation ce fragment,aux sites SmaI et EcoRI, sur le plasmide pGS62. Le plasmide résultant, pv-gagS, contient la plupart, mais non pas la totalité, de la séquence de codage de gag (jusqu'au site BglII) fixd par ligation sur une séquence d'arrêt de translation dans le position of the BglII site at the adjacent EcoRI site on the multi-site cloning plasmid. This intermediate construct was then digested with ThaI and EcoRI. A 1.39 kp fragment containing the sequences corresponding to LAV / HTLV III gag was purified and this fragment was ligated to the SmaI and EcoRI sites on the pGS62 plasmid. The resulting plasmid, pv-gagS, contains most, but not all, of the gag coding sequence (up to the BglII site) fixed by ligation on a translational stop sequence in the
cadre.frame.
Construction des virus de vaccine recombinants contenant des gènes chimères LAV/HTLV III gag L'insertion de gènes chimères LAV/HTLV III gag provenant de plasmides vecteurs pv-gagl, pv-gag2, pv-gag3, pv-gag4 et pvgag5, dans le génome du virus de vaccine, a été réalisée par le même protocole que celui utilisé pour la construction de v-env5 et v-env2 (voir ci-dessus). Dans les exemples qui suivent, tous les virus recombinants ont été construits a l'aide de la souche, purifiée par plaques, provenant du "New York City Board of Health" (service de Construction of recombinant vaccinia viruses containing LAV / HTLV III gag chimeric genes Insertion of LAV / HTLV III gag chimeric genes from pv-gag1, pv-gag2, pv-gag3, pv-gag4 and pvgag5 vector plasmids genome of vaccinia virus, was performed by the same protocol as that used for the construction of v-env5 and v-env2 (see above). In the following examples, all recombinant viruses were constructed using the plaque-purified strain from the New York City Board of Health.
la santé de la ville de New York) (v-NY, voir ci-dessus). the health of New York City) (v-NY, see above).
On a choisi des recombinants TK et on les a purifiés sur plaque trois fois avant d'effectuer l'expansion en des stocks de virus que l'on a utilisés pour des caractérisations subséquentes. Les virus recombinants provenant de pv-gagl, pv-gag2, pv-gag3, pv-gag4 et pv-gag5 ont été appelés v-gaglNY, v-gag2NY, v-gag3NY, v-gag4NY et v-gag5NY, respectivement. Expression de protéines apparentées à LAV/HTLV III GAG dans des cellules de culture sur tissu infectées par des virus de vaccine recombinants les virus de vaccine recombinants, porteurs du gène chimère LAV/HTLV III gag, décrits ci-dessus, sont capables d'exprimer des protéines apparentées à LAV/HTLV III gag, quand on les introduit par infection dans des cellules de TK recombinants were selected and plaque purified three times before expanding into virus stocks which were used for subsequent characterizations. Recombinant viruses from pv-gag1, pv-gag2, pv-gag3, pv-gag4 and pv-gag5 were designated v-gaglNY, v-gag2NY, v-gag3NY, v-gag4NY and v-gag5NY, respectively. Expression of LAV / HTLV III GAG-related Proteins in Tissue Culture Cells Infected with Recombinant Vaccinia Viruses Recombinant vaccinia viruses carrying the LAV / HTLV III gag chimeric gene, described above, are capable of expressing related proteins to LAV / HTLV III gag, when introduced by infection into
culture de tissu. Certains de ces recombinants ont été capa- tissue culture. Some of these recombinants have been
bles de faire passer la protéine correspondant à gag précur- to pass the protein corresponding to precarious gag
seur, p55, à l'état des protéines matures p25 et pl8. On a constaté que ces protéines sont immunoréactives avec du sérum de patients atteints de SIDA et/ou avec des anticorps p55, in the state of the mature proteins p25 and p18. These proteins have been found to be immunoreactive with serum of AIDS patients and / or with antibodies
monoclonaux contre des protéines gag p25 ou p18. monoclonal against gag p25 or p18 proteins.
On a infecté, à un taux d'infection de 10, des cel- At an infection rate of 10,
lules BSC-40 confluents, dans une boîte de 60 mm, par du virus de vaccine de type parental (v-NY) ou par ses dérivés recombinants, v-gaglNY, vgag2NY, v-gag3NY, v-gag4NY ou v-gag5NY. On a laissé l'infection se poursuivre durant 12 heures, au bout desquelles on a récolté les cellules, on les a lavées une fois avec de la solution saline tamponnée BSC-40 confluent flasks, in a 60 mm dish, with parental-type vaccinia virus (v-NY) or its recombinant derivatives, v-gaglNY, vgag2NY, v-gag3NY, v-gag4NY or v-gag5NY. The infection was allowed to continue for 12 hours, after which the cells were harvested, washed once with buffered saline.
par des phosphates et on les a collectées par centrifugation. by phosphates and collected by centrifugation.
On a remis les culots de centrifugation de cellules infec- The centrifugation pellets of infected cells were
tées en suspension dans 0,3 ml d'un tampon pour échantillons suspended in 0.3 ml of a sample buffer
de Laemmli et l'on a effectué la lyse par 4 minutes d'ébulli- of Laemmli and the lysis was performed by 4 minutes of boiling
tion. On a résolu la totalité de la protéine cellulaire dans ,ul de lysat de cellules par électrophorèse sur un gel à 15 % de polyacrylamide-SDS. On a inclus, à titre de-témoins, un échantillon de virion purifié LAV/HTLV III et une partie aliquote d'un lysat de cellules infectées par des éléments tion. The entire cell protein was resolved in μl of cell lysate by electrophoresis on a 15% SDS-polyacrylamide gel. As a control, a sample of purified virion LAV / HTLV III and an aliquot of a lysate of cells infected with elements were included.
non infectieux ("mock").non-infectious ("mock").
On a transféré par électrophorèse le contenu du gel sur une feuille d'un filtre en nitrocellulose. On a tout d'abord fait réagir le filtre avec du sérum de patients The contents of the gel were electrophoretically transferred to a sheet of a nitrocellulose filter. The filter was first reacted with patient serum
atteints de SIDA, ou avec une combinaison d'anticorps mono- with AIDS, or with a combination of mono-
clonaux contre les protéines gag p25 et pl8. Après des lavages poussés, on a ensuite fait réagir le filtre avec des anticorps d'immunoglobuline anti-humaine de chèvre con- jugués sur de la phosphatase alcaline (à conjugaison AP) dans les cas o l'on a utilisé du sérum de patient, ou avec clones against p25 and p18 gag proteins. After extensive washings, the filter was then reacted with alkaline phosphatase conjugated goat anti-human immunoglobulin (AP conjugate) antibodies in cases where patient serum was used. or with
des anticorps d'immunoglobuline anti-souris de chèvre à con- goat anti-mouse immunoglobulin antibodies to
jugaison AP, dans les cas o l'on a utilisé des anticorps monoclonaux de souris. Les conditions pour les premières et secondes réactions avec les anticorps ainsi que pour les AP judgment, in cases where mouse monoclonal antibodies have been used. The conditions for the first and second reactions with the antibodies as well as for the
lavages ont été comme décrit ci-dessus à propos de l'identi- washes as described above with regard to the identification of
fication des protéines apparentées dans l'enveloppe de LAV/ related proteins in the LAV envelope /
HTLV III. Le lavage final après la seconde réaction des anti- HTLV III. The final wash after the second reaction of
corps a été effectué dans du Tris 0,1M (pH 9,5) avec 0,1M NaCl et 5 mM de MgC12. On a décelé de l'anticorps lié à des antigènes sur le filtre en faisant réagir le filtre avec une solution contenant 0,1M de Tris (pH 9,5) , 0,1M de NaCl, mM de MgC12, 0,33 mg/ml de phosphate de bromo-chloro-indo- body was carried out in 0.1M Tris (pH 9.5) with 0.1M NaCl and 5mM MgCl2. Antibody-bound antibody was detected on the filter by reacting the filter with a solution containing 0.1M Tris (pH 9.5), 0.1M NaCl, mM MgCl2, 0.33mg / ml. ml of bromo-chloroindo phosphate
lyle, et 0,17 mg/ml deibleu de nitrotétrazolium. Après réac- and 0.17 mg / ml of nitrotetrazolium buffer. After reaction
tion des filtres avec les chromogènes, on a lavé les filtres filtering with the chromogens, the filters were washed
à l'eau, on les a séchés à l'air et photographiés. with water, they were air dried and photographed.
Les résultats de cette analyse sont présentés sur The results of this analysis are presented on
la figure 21. Les recombinants v-gagiNY et v-gag2NY contien- Figure 21. The recombinants v-gagiNY and v-gag2NY contain
nent la totalité des gènes gag et prt. Ces recombinants expriment une famille de protéines apparentées à LAV/HTLV III qui ont co-migré avec les protéines majeures gag de LAV/ all the gag and ready genes. These recombinants express a family of LAV / HTLV III related proteins that co-migrated with the major gag proteins of LAV /
HTLV III, p55, p40, p25 et pl8. Ces protéines ont été immuno- HTLV III, p55, p40, p25 and p18. These proteins have been immuno-
réactives aussi bien avec du sérum de patients atteints de SIDA (figure 21B) qu'avec des anticorps monoclonaux de souris contre p25 et p18 (figure 21A). Le recombinant v-gag3NY contient les gènes gag et prt, mais son cadre de lecture ouverte pol est relié par ligation en phase avec la partie terminale carboxy du gène TK de vaccine. V-gag3NY a été capable aussi d'exprimer le produit primaire de gène gag, p55. Cependant, le traitement de p55 semble avoir été moins efficace que dans le cas de vgaglNY et v-gag2NY, puisqu'il y a eu beaucoup moins de p25 et de pl8, par rapport A p55, reactive with both AIDS patient serum (Figure 21B) and mouse monoclonal antibodies against p25 and p18 (Figure 21A). The recombinant v-gag3NY contains the gag and prt genes, but its open reading frame pol is ligated in phase with the carboxy terminus of the vaccinia TK gene. V-gag3NY was also able to express the primary gag gene product, p55. However, the treatment of p55 seems to have been less effective than in the case of vgaglNY and v-gag2NY, since there was much less p25 and p18, compared to p55,
dans des lysats de cellules infectés par v-gag3NY. Le recom- in lysates of cells infected with v-gag3NY. The recom-
binant v-gag4NY contient la totalité du gène gag, mais seule- hog v-gag4NY contains the entire gag gene, but only
ment une partie du gène prt. Il a synthétisé une protéine apparentée à LAV/HTLV III semblable en dimensions à p55. Le recombinant v-gag5NY contient une partie seulement du gène gag et a exprimé une protéine tronquée de 43 kD (figure 21C). Bien que v-gag4NY et v-gag5NY ne semblent pas avoir part of the gene ready. He synthesized a similar LAV / HTLV III related protein in p55 dimensions. The recombinant v-gag5NY contains only a portion of the gag gene and expressed a truncated 43 kD protein (Figure 21C). Although v-gag4NY and v-gag5NY do not seem to have
traité efficacement leurs protéines apparentées à gag pri- effectively treated their gag-like proteins.
maire, leurs produits ont été immunoréactifs à l'égard d'anticorps monoclonaux contre p25 et p18. En somme, malgré Mayor, their products were immunoreactive with monoclonal antibodies against p25 and p18. In sum, despite
les différences de capacité de traitement, les cinq recom- differences in treatment capacity, the five recom-
binants ont tous été capables d'exprimer des protéines immu- binants have all been able to express immune
noréactives qui contenaient les épitopes majeurs des proté- which contained the major epitopes of
ines de noyau de LAV/HTLV III. -core ines of LAV / HTLV III. -
EXEMPLE: RECOMBINANTS D'ENVELOPPE DE BACULOVIRUS EXAMPLE: RECOMBINANTS OF BACULOVIRUS ENVELOPE
Dans l'exemple suivant, on a construit un plasmide vecteur contenant un gène chimère comprenant les séquences de codage d'enveloppe de LAV/HTLV III logées en aval par In the following example, a vector plasmid containing a chimeric gene comprising the LAV / HTLV III envelope coding sequences housed downstream by
* rapport aux séquences de commande de transcription de AcNPV. Le gène chimère a contenu le promoteur de polyédrine AcNPV et la séquence* report to transcription control sequences of AcNPV. The chimeric gene contained the AcNPV polyhedrin promoter and the sequence
de codage de LAV/HTLV III env a été insérée, par recombinaison in vivo, dans le génome de AcNPV. Le virus recombinant a été identifié et purifié, et l'on a préparé LAV / HTLV III env coding was inserted, by in vivo recombination, into the AcNPV genome. The recombinant virus has been identified and purified, and
des stocks de virus à partir de cellules surnageantes infec- virus stocks from infected supernatant cells
tées. Il a été montré que de la protéine immunoréactive apparentée à LAV/HTLV III env est produite in vitro Tees. It has been shown that LAV / HTLV III env-related immunoreactive protein is produced in vitro
par le baculovirus recombinant. Une description détaillée by the recombinant baculovirus. A detailed description
de chaque étape de cette forme de réalisation de l'invention of each step of this embodiment of the invention
est présentée ci-après. Les modes opératoires généraux utili- is presented below. The general operating procedures used
sés pour cette forme de réalisation sont tels que décrits for this embodiment are as described
ci-dessus pour les recombinants de baculovirus. above for baculovirus recombinants.
Construction de plasmides vecteurs contenant le promoteur AcNPV relié par ligation aux séquences codantes du gène LAV/HTLV III env On a purifié la séquence codante (ou de codage) du gène LAV/HTLV III env à partir de pvenv5 (voir ci-dessus, Construction of vector plasmids containing the AcNPV promoter linked by ligation to the coding sequences of the LAV / HTLV III env gene The coding (or coding) sequence of the LAV / HTLV III env gene was purified from pvenv5 (see above,
dans la partie concernant la construction et la caractérisa- in the part concerning the construction and characterization
tion du virus de vaccine recombinant contenant le gène chimère d'enveloppe de LAV/HTLV III), que l'on a utilisé pour la construction du virus de vaccine recombinant v-env5, dont on a montré qu'il exprime des protéines apparentées & env. La région de codage env dans pv-env, ainsi que les séquences non translatées de 96 paires de bases voisines de 5' et de 223 paires de bases voisines de 3', a été entourée recombinant vaccinia virus containing the LAV / HTLV III envelope chimeric gene), which was used for the construction of recombinant vaccinia virus v-env5, which has been shown to express related proteins & approx. The env coding region in pv-env, as well as the untranslated sequences of 96 base pairs close to 5 'and 223 base pairs close to 3', were surrounded.
aux deux extrémités par des sites BamHI. Une digestion par- at both ends by BamHI sites. A digestion par-
tielle de ce plasmide, qui a également contenu un site interne BamHI) à l'aide de l'enzyme de restriction BamHI a engendré un fragment de 2,9 kbp ne contenant que des of this plasmid, which also contained an internal BamHI site) using the BamHI restriction enzyme generated a 2.9 kbp fragment containing only
séquences spécifiques de LAV/HTLV III. On a résolu ce frag- specific sequences of LAV / HTLV III. We have resolved this frag-
ment (environ 0,5 ug) et on l'a purifié à- partir d'un gel à 1 % de gélose LMP, et on en a effectué la ligation sur 0,5,ug du plasmide vecteur pAc610, qui avait été au préalable linéarisé à l'aide de BamHI et traité par CIAP. On a utilisé le mélange de ligation pour transformer la souche MC1000 (about 0.5 μg) and purified from a 1% LMP agar, and ligated to 0.5 μg of the pAc610 vector plasmid, which had been pre-linearized with BamHI and treated with CIAP. The ligation mixture was used to transform the MC1000 strain
de E coli et l'on a choisi les colonies résistantes à 1'am- of E coli and the colonies resistant to
picilline. On a soumisil'ADN de plasmide de transformants individuels à des essais de détermination de la présence picilline. Plasmid DNA from individual transformants was tested for presence assays.
des séquences correspondant à LAV/HTLV III env (c'est-à- sequences corresponding to LAV / HTLV III env (i.e.
dire la formation, par digestion par BamHI, des fragments de 2,3 Kbp et de 0,54 Kbp) et pour déterminer l'orientation de la partie insérée. Le plasmide comportant la séquence correspondant à LAV/HTLV III env. insérée dans-l'orientation correcte, a été purifié et appelé pAc-env5; Sa structure say the formation, by BamHI digestion, of the fragments of 2.3 Kbp and 0.54 Kbp) and to determine the orientation of the inserted part. The plasmid comprising the sequence corresponding to LAV / HTLV III env. inserted in the correct orientation, was purified and named pAc-env5; Its structure
est représentée sur la figure 22.is shown in Figure 22.
Construction du baculovirus recombinant contenant le gène chimère LAV/HTLV III env On réalise l'insertion du gène chimère':LAV/HTLV III env dans le génome de AcNPV par recombinaison in:.vivo, comme expliqué ci- dessus (construction du baculovirus-recombinant contenant le gène chimère LAV/HTLV III gag). L'introduction Construction of the recombinant baculovirus containing the LAV / HTLV III env chimeric gene The insertion of the LAV / HTLV III env chimeric gene into the AcNPV genome is carried out by recombination in vivo as explained above (construction of the baculovirus- recombinant containing the chimeric gene LAV / HTLV III gag). The introduction
par transfection de 1 mg d'ADN de AcNPV, 5 mg d'ADN de pAc- by transfection of 1 mg of AcNPV DNA, 5 mg of pAc-DNA
env5 et 15 mg d'ADN de thymus de veau dans les cellules Sf9 a été réalisée comme décrit dans les mêmes paragraphes précités. Apres 5 jours d'incubation à 28 C avec 4 mi de milieu complet, on a collecté les parties surnageantes et on les a clarifiées par centrifugation & 1000 g durant minutes. On a titré le stock de virus sur les cellules Sf9, et l'on a d'abord identifié, par l'essai d'hybridation de plaque de M.D. Summers et G.E. Smith, comme suit, le virus recombinant: On a ensemencé des cellules Sf9 sur des plaques de culture de 60 x 15 mm à une densité de 2,5 x 106 cellules par plaque dans un milieu TNM-FH sans sérum. Apres fixation des cellules, on a enlevé le milieu et l'on a ajouté à chaque plaque 1 ml d'un inoculum-de virus dilué. Au bout d'l heure d'incubation a 27 C, on a enlevé la totalité de l'inoculum de chaque-piaque etai'on a lentement ajouté au bord de chaque plaque 4 ml d'une couche supérieure de gélose LMP. Une fois la couche supérieure solidifiée, on a fait incuber les plaques dans un environnement humide durant 4 A 6 jours, env5 and 15 mg of calf thymus DNA in Sf9 cells was performed as described in the same paragraphs above. After 5 days of incubation at 28 ° C. with 4 ml of complete medium, the supernatants were collected and clarified by centrifugation at 1000 g for minutes. The virus stock was titrated on Sf9 cells, and the recombinant virus was first identified by the MD Summers and GE Smith plate hybridization assay: Cells were seeded Sf9 on 60 x 15 mm culture plates at a density of 2.5 x 10 6 cells per plate in serum-free TNM-FH medium. After fixing the cells, the medium was removed and 1 ml of a diluted virus inoculum was added to each plate. At the end of the hour of incubation at 27 ° C., all of the inoculum was removed from each plate and 4 ml of an upper LMP agar layer was slowly added to the edge of each plate. Once the upper layer had solidified, the plates were incubated in a humid environment for 4 to 6 days,
ou jusqu'à bonne formation des colonies ou plaques de cellu- or until colonies or plaques of
les. On a ensuite laissé sécher les plaques de gélose durant the. The agar plates were then allowed to dry
la nuit ou plus longtemps, en les abandonnant dans un envi- at night or longer, abandoning them in an environment
ronnement non humidifié. Quand elles ont été suffisamment sèches, on a enlevé les couches supérieures de gélose et l'on a placé un filtre en nitrocellulose sèche par-dessus unhumidified environment. When dry enough, the top agar layers were removed and a dry nitrocellulose filter was placed on top of it.
les cellules demeurant dans la plaque de culture. On a satu- the cells remaining in the culture plate. We have saturated
ré avec une solution A (0,05 M de Tris-HCl, pH 7,4 et 0,15M de NaCl) un cercle de 47 mm de papier 3 MM Whatman et l'on a placé ce papier pardessus la filtre en nitrocellulose with a solution A (0.05 M Tris-HCl, pH 7.4 and 0.15 M NaCl) a 47 mm circle of Whatman 3MM paper and this paper was placed over the nitrocellulose filter
dans la plaque de culture. Après absorption, on a soigneuse- in the culture plate. After absorption, care was taken
ment enlevé le filtre en nitrocellulose et on l'a placé removed the nitrocellulose filter and placed it
(le côté des cellules par-dessus) sur un papier filtre What- (the side of the cells on top) on a What-What-What-Is
man saturé d'une solution a (0,5N de NaOH, 1,5M de NaCl). saturated with a solution a (0.5N NaOH, 1.5M NaCl).
Apres 2 & 3 minutes, on a séché à l'air le filtre en nitro- After 2 and 3 minutes, the nitro-filter was air-dried.
cellulose sur des serviettes en papier et on l'a transféré sur un papier filtre Whatman saturé d'une solution C (1,OM de Tris-HCl, pH 7,4; 1,5 M de NaCl). Au bout de 2 à 3 minutes, on a séché à l'air sur des serviettes en papier le filtre en nitrocellulose, et on l'a lavé par immersion ménagée dans une boite de Pétri emplie d'une solution D (0,3M en NaCl, 0, 03 M de citrate de sodium). On a ensuite enlevé le filtre et on l'a séché sur des serviettes en papier, et on l'a chauffé & 80 C durant 2 heures sous vide. On a fixé par hybridation le filtre sur pRS-3 marqué par 32p, comme sonde. On a prélevé des virus recombinants et on les a titrés & nouveau sur des cellules Sf9. On a identifié, cellulose on paper towels and transferred to Whatman filter paper saturated with a C solution (1. OM Tris-HCl, pH 7.4, 1.5 M NaCl). After 2 to 3 minutes, the nitrocellulose filter was air-dried on paper towels and immersed in a Petri dish filled with a D solution (0.3M). NaCl, 0.03 M sodium citrate). The filter was then removed and dried on paper towels, and heated at 80 ° C for 2 hours under vacuum. The 32 P-labeled pRS-3 filter was fixed by hybridization as a probe. Recombinant viruses were taken and titrated again on Sf9 cells. We identified,
par examen visuel, des plaques de cellules sans occlusion. by visual examination, cell plates without occlusion.
On les a purifiées trois fois encore et on les a utilisées They were purified three more times and used
pour préparer des stocks de virus pour des études subsé- to prepare virus stocks for further studies
quentes. Expression de protéines apparentées à LAV/HTLV III env dans des cellules de culture tissulaire infectées Dar du baculovirus recombinant Ac-env5 Il a été montré que AcNPV recombinant, portant le gène chimère LAV/HTLV III env, est capable d'exprimer les protéines apparentées à LAV/HTLV III env, par infection de cellules dans une culture sur tissu. On a trouvé que ces protéines sont immunoréactives avec du sérum provenant de quent. Expression of LAV / HTLV III env-related proteins in infected tissue culture cells Dar of recombinant baculovirus Ac-env5 It has been shown that recombinant AcNPV, carrying the chimeric LAV / HTLV III env gene, is capable of expressing related proteins to LAV / HTLV III env, by infection of cells in a tissue culture. These proteins have been found to be immunoreactive with serum from
patients atteints de SIDA ainsi qu'avec des anticorps mono- AIDS patients as well as monoclonal antibodies
clonaux qui définissent des glycoprotéines gpllO et gp41 clones that define glycoproteins gpl10 and gp41
apparentées à l'enveloppe de LAV/HTLV III. related to the envelope of LAV / HTLV III.
On a infecté des cellules Sf9 (1 x 107) ensemencées sur une boîte de 100 mm, avec AcNPV de type sauvage, ou son recombinant Ac-env5, à un indice d'infection de 5. 28 heures après l'infection, on a remplacé le milieu par du milieu sans méthionine ne comportant pas de sérums supplémentaires, et l'on a fait incuber durant 30 minutes. Après cette période, on a remplacé le milieu par 2 ml d'un milieu sans méthionine contenant 100 uCi/ml de E35SI méthionine, et on a laissé le marquage se poursuivre durant 2 heures à 28 C. A la fin de la période de marquage, on a lavé les cellules deux fois avec une solution saline tamponnée par du phosphate et on les a remises en suspension dans 1 ml de tampon de lyse, comme décrit ci-dessus à propos de l'identification de Sf9 cells (1 x 107) seeded on a 100 mm dish were infected with wild-type AcNPV, or its Ac-env5 recombinant, at an infection index of 5. 28 hours after infection, replaced the medium with methionine-free medium not containing additional sera, and incubated for 30 minutes. After this period, the medium was replaced with 2 ml of a methionine-free medium containing 100 μCi / ml of E35SI methionine, and the labeling was allowed to continue for 2 hours at 28 ° C. At the end of the labeling period. cells were washed twice with phosphate buffered saline and resuspended in 1 ml of lysis buffer, as described above for the identification of
protéines apparentées à l'enveloppe de LAV/HTLV III, expri- proteins related to the envelope of LAV / HTLV III, ex-
mées dans des cellules infectées par du virus de vaccine in cells infected with vaccinia virus
recombinant, an utilisant des techniques d'nimmunoprécipitation). recombinant, using immunoprecipitation techniques).
On a effectué l'immunoprécipitation comme décrit dans les paragraphes précités, en utilisant du sérum de patients atteints de SIDA aussi bien que des anticorps monoclonaux de souris contre gpllO ou gp41. Les résultats de cette analyse, tels que présentés sur la figure 23, indiquent que le virus recombinant Ac-env5 a synthétisé surtout une protéine de 150 kD, apparentée & l'enveloppe de LAV/HTLV III. Puisqu'elle comigre avec gp150 synthétisée par le recombinant de vaccine v-env5 et qu'elle a été immunoréactive avec du sérum de patient atteint de SIDA ainsi qu'avec des anticorps monoclonaux contre gpllO et gp41, cette protéine représente le précurseur glycosylé Immunoprecipitation was performed as described in the above paragraphs using serum from AIDS patients as well as mouse monoclonal antibodies against gpl10 or gp41. The results of this assay, as shown in Figure 23, indicate that the recombinant Ac-env5 virus synthesized primarily a 150 kD protein, related to the LAV / HTLV III envelope. Since it comigrates with gp150 synthesized by vaccinia recombinant v-env5 and has been immunoreactive with AIDS patient serum as well as with monoclonal antibodies against gpl10 and gp41, this protein represents the glycosylated precursor.
de la protéine d'enveloppe gp150. Le traitement de trans- of the envelope protein gp150. Transformation treatment
formation de cette molécule n'a pas été efficace, puisque l'on n'a pas décelé de gpllO ni gp41 au cours de la période des 2 heures de marquage. Cependant, puisque les épitopes majeurs de gpllO et gp41 sont présents sur le précurseur, cette protéine est potentiellement intéressante aussi bien The formation of this molecule was not effective since gpl10 and gp41 were not detected during the 2 hour labeling period. However, since the major epitopes of gpl10 and gp41 are present on the precursor, this protein is potentially interesting as well.
comme réactif pour diagnostic que comme immunogène. as a diagnostic reagent than as an immunogen.
DEPOT DE MICRO-ORGANISMESDEPOSIT OF MICROORGANISMS
Les souches suivants de E. coli, portant les plas- The following strains of E. coli carrying the
mides énumérés, ont été déposées au service appelé "Agricul- mides listed, were deposited in the service called "Agricul-
tural Research Culture Collection (NRRL), Peoria, Illinois (Etats-Unis d'Amérique) et ont reçu les numéros suivants d'inscription: E. coli Souche Plasmide Numéro d'inscription K12 MC1000 pv-envl NRRL B-18003 K12 MC1000 pv-env2 NRRL B-18004 K12 MC1000 pv-env5 NRRL B-18005 K12 MC1000 pv- env7 NRRL B-18110 K12 HB101 pv-gagl NRRL B-18111 K12 HB101 pAc-gagl NRRL B-18105 K12 NF1829 pAc-env5 NRRL B-18109 Les virus recombinants suivants ont été déposés Tural Research Culture Collection (NRRL), Peoria, IL (United States of America) and have received the following listing numbers: E. coli Strain Plasmid Registration Number K12 MC1000 pv-envl NRRL B-18003 K12 MC1000 pv NRRL B-18004 K12 MC1000 pv-env5 NRRL B-18005 K12 MC1000 pv-env7 NRRL B-18110 K12 HB101 pv-gagl NRRL B-18111 K12 HB101 pAc-gagl NRRL B-18105 K12 NF1829 pAc-env5 NRRL B- 18109 The following recombinant viruses were deposited
t'-American --T-ype- Culture Collection, Rockville, MD, Etats- American -T-Ype- Culture Collection, Rockville, MD, USA
Unis d'Amérique, et ont reçu les numéros suivants de dépôt Virus recombinant Numéro de dépôt v-env2 ATCC VR 2114 v-env5 ATCC VR 2213 venv7 ATCC VR 2148 v-env5NY ATCC VR 2149 v-gaglNY ATCC VR 2150 Ac-gagl ATCC VR 2147 Ac-env5 ATCC VR 2151 United States of America, and have received the following numbers of repository Recombinant virus Deposit number v-env2 ATCC VR 2114 v-env5 ATCC VR 2213 venv7 ATCC VR 2148 v-env5NY ATCC VR 2149 v-gaglNY ATCC VR 2150 Ac-gagl ATCC VR 2147 Ac-env5 ATCC VR 2151
On ne doit pas considérer que le cadre de la pré- It should not be considered that the framework of the pre-
sente invention sa limite seulement aux micro-organismes et virus déposés, puisque ce qui est déposé constitue une simple illustration d'un aspect de l'invention et que tous les micro-organismes ou virus fonctionnellement équivalents entrent dans le cadre de la présente invention. I1 va de soi que, sans sortir du cadre de l'invention, de nombreuses modifications peuvent être apportées aux virus recombinants, à leurs génomes chimères et protéines ou peptides et aux This invention is limited only to deposited microorganisms and viruses, since what is deposited is a mere illustration of one aspect of the invention and all functionally equivalent microorganisms or viruses are within the scope of the present invention. It goes without saying that, without departing from the scope of the invention, numerous modifications can be made to recombinant viruses, to their chimeric genomes and to proteins or peptides and to
formulations de vaccins, décrits et représentés. vaccine formulations, described and shown.
Il va également de soi que toutes les dimensions données pour les paires de bases des nucleotides constituent des renseignements approximatifs fournis à titre surtout descriptif. It is also self-evident that all the dimensions given for nucleotide base pairs are approximate information provided primarily for descriptive purposes.
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