FR2541306A1 - Process for inoculating plants, especially leguminous plants with stem nodules and colloidal solutions which are useful especially for implementing this process - Google Patents

Abstract

The present invention relates to a process for inoculating plants with phytoactive microorganisms, characterised in that an aqueous colloidal solution containing the said phytoactive microorganisms is prepared by dissolving in an aqueous solution a powder consisting of bacteria encapsulated in a polymeric gel which is at least partially soluble in water, and in that the sites for inoculation of the plants are sprayed with the aqueous colloidal solution obtained.

Description

La présente invention concerne un procédé d'inoculation de légumineuses, notamment de légumineuses à nodules caulinaires, par exemple des légumineuses du genre Sesbania. The present invention relates to a method for inoculating legumes, in particular leguminous plants with cauline nodules, for example legumes of the genus Sesbania.

La présente invention sera décri te plus particulièrement en relation avec Sesbania rostrata bien qu'elle ne soit nullement limitée à l'inoculation de cette légumineuse. The present invention will be more particularly described in connection with Sesbania rostrata although it is in no way limited to the inoculation of this legume.

Sesbania rostrata est une légumineuse à nodulation caulinaire (c'est-à-dire sur la tige) ayant une capacité considérable de fixation de l'azote moléculaire (azote de l'air) pour le transformer en azote fixé assimilable par les plantes. Cette capacité dépasse 200 kg de N2 fixé par hectare en 52 jours. Sesbania rostrata is a leguminous tree with nodulation on the stem that has a considerable capacity for fixing molecular nitrogen (air nitrogen) to transform it into fixed nitrogen assimilated by plants. This capacity exceeds 200 kg N2 fixed per hectare in 52 days.

Une autre caractéristique intéressante de
S. rostrata est-le fait que la nodulation et la fixation de N2 ne sont pas inhibées par un apport d'engrais azoté, même lorsque ces engrais sont apportés à des doses élevées (100-150 kg h2 1), Cette propriété mérite d'être soulignée puisque S. rostrata est actuellement le seul système fixateur qui ne soit cas inhibé par azote minéral du sol. Another interesting feature of
S. rostrata is the fact that nodulation and fixation of N2 are not inhibited by a nitrogen fertilizer, even when these fertilizers are made at high doses (100-150 kg h2 1), This property deserves to 'to be underlined since S. rostrata is currently the only fixative system that is not case inhibited by mineral nitrogen from the soil.

On a maintenant pu démontrer que ces capacités exceptionnelles de fixation de azote moléculaire sont
conférées à S. rostrata par les nodules caulinaires qui proviennent d'interactions complexes lors de la symbiose entre des bactéries du genre Rhizobium et la légumineuse.It has now been demonstrated that these exceptional molecular nitrogen
attributed to S. rostrata by stem nodules that arise from complex interactions during the symbiosis between Rhizobium bacteria and the legume.

Bien que l'on ait étudié depuis longtemps la symbiose existant entre les Rhizobiums et le système racinaire des légumineuses qui est trds importante puisqu'aucune légumineuse ne peut fixer l'azote sans la présence de rhizobium (nodule racinaire), jusqu'à présent les nodules caulinaires avaient été ignorés et le rôle des rhizobiums au niveau de ces nodules n'avait pas été explicité. Although the symbiosis between Rhizobia and the legume root system has been studied for a long time, since no legume can fix nitrogen without the presence of rhizobium (root nodule), so far stem nodules had been ignored and the role of rhizobia in these nodules had not been clarified.

Les études conduites par les inventeurs ont permis de mettre en évidence qu'une inoculation artificielle de S. rostrata par une culture de Rhizobium conduisait à une augmentation de la nodulation caulinaire et augmentait la teneur en azote combiné de la plante améliorant parallèlement ses caractéristiques "d'engrais vert'.'
Des expériences conduites en plein champ ont montré que S. rostrata peut doubler le rendement du riz sans aucun apport d'engrais azoté. - On - peut donc considérer que chaque plant de S. rostrata constjtue une usine miniaturisée d'engrais azotés à haut rendement.The studies conducted by the inventors made it possible to demonstrate that an artificial inoculation of S. rostrata by a Rhizobium culture led to an increase in the nodulation of the cauline and increased the combined nitrogen content of the plant, improving at the same time its characteristics. 'green manure'.
Field experiments have shown that S. rostrata can double the yield of rice without any nitrogen fertilizer input. It can therefore be considered that each plant of S. rostrata constitutes a miniaturized plant of high-yielding nitrogen fertilizers.

Bien que les légumineuses à nodulation çaulinaire, telles que S. rostrata, puissent noduler spontanément lorsqu'elles se trouvent placées dans des sols qui comportent les souches de Rhizobium qui lueur sont spécifiquos, on observe que cette nodulation est souvent insuffisante, irrégulière et localisée à la partie inférieure des tiges; pour obtenir une nodulation optimale nécessaire à l'expression du potentiel fixateur d'azote des légumineuses à nodules caulinaires il est indispensable d'effectuer une inoculation artificielle. Although legumes with nodulosis, such as S. rostrata, can nodulate spontaneously when they are placed in soils with rhizobial strains that are gleaming, it is observed that this nodulation is often insufficient, irregular and localized. the lower part of the stems; in order to obtain optimal nodulation necessary for the expression of the nitrogen-fixing potential of leguminous plants with cauline nodules, artificial inoculation is essential.

Toutefois, l'un des problèmes essentiels -dans- le cas de l'inoculation artificielle est la disponibilité des souches de Rhizobium sur les lieux de traitement. However, one of the key issues-in the case of artificial inoculation is the availability of Rhizobium strains at the treatment site.

Ce type de traitement doit pouvoir être mis en oeuvre loin des lieux de production des Rhizobiums, il est donc exclu d'utiliser le jus des fermenteurs. L'inoculation doit, en outre, pouvoir être mise en oeuvre dans des conditions parfois assez difficiles, il est donc exclu d'utiliser des appareillages dwinoculation ou de conservation très complexes.This type of treatment must be able to be implemented far from the production sites of Rhizobia, it is therefore excluded to use the juice of fermenters. Inoculation must, moreover, be able to be carried out under sometimes rather difficult conditions, it is thus excluded to use very complex apparatus of inhibition or conservation.

Enfin, s'il existe actuellement des compositions solides contenant des Rhizobiums et qui peuvent être utilisées pour l'inoculation des racines, ce type d'inoculum solide est tout à fait inadapté pour l'inoculation des tiges. D'ailleurs, il convient de remarquer que l'inoculum solide, même pour l'inoculation des racines, n'assure qu'un contact très aléatoire entre les Rhizobiums et les racines. Finally, if there are currently solid compositions containing Rhizobia that can be used for root inoculation, this type of solid inoculum is quite unsuitable for inoculation of the stems. Moreover, it should be noted that the solid inoculum, even for root inoculation, ensures only a very random contact between Rhizobia and roots.

Il fallait donc mettre au point un procédé permettant une inoculation simple et efficace à l'aide de Rhizobium, notamment l'inoculation de S. rostrata, ledit procédé permettant de conserver les souches un temps assez long dans des conditions non contrôlées. It was therefore necessary to develop a method allowing a simple and effective inoculation using Rhizobium, in particular the inoculation of S. rostrata, said method making it possible to preserve the strains for a long time under uncontrolled conditions.

C'est l'objet de la présente invention qui concerne un procédé d'inoculation de plantes par des microorganismes phytoactifs, caractérisé en ce que
- on prépare une solution aqueuse colloïdale contenant lesdits microorganismes phytoactifs, par dissolution dans une solution aqueuse d'une poudre constituée de bactéries incluses dans un gel polymère au moins partiellement soluble dans liteau; et
- on pulvérise les sites d'inoculation des plantes avec la solution aqueuse colloïdale obtenue.It is the object of the present invention which relates to a method of inoculating plants with phytoactive microorganisms, characterized in that
an aqueous colloidal solution containing said phytoactive microorganisms is prepared by dissolving in an aqueous solution a powder consisting of bacteria included in a polymer gel that is at least partially soluble in water; and
the plant inoculation sites are sprayed with the colloidal aqueous solution obtained.

Par "microorganismes phytoactifs1,, on entend désigner les microorganismes vivant en symbiose ou en association avec une plante et qui présentent une action favorable sur cette plante
Pour la détermination de ces microorganismes, on pourra par exemple se reporter au brevet français n" 77 10254 qui mentionne les microorganismes telluriques à action rhizosphérique favorable.By "phytoactive microorganisms" is meant microorganisms living in symbiosis or in association with a plant and which have a favorable action on this plant.
For the determination of these microorganisms, it is possible, for example, to refer to French Patent No. 77 10254 which mentions telluric microorganisms with favorable rhizospheric action.

Dans ce qui va suivre, on s'intéressera plus particulièrement aux Rhizobiums de tige ou de racine. In what follows, we will focus more particularly Rhizobium stem or root.

Des gels polymères comportant des bactéries incluses et notamment des bactéries du genre Rhizobium ont déjà été décrits, notamment dans le brevet francais nO 77 10254 et dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique nO 4 155 737. Dans ces documents, on décrit des gels de polymères qui sont essentiellement constitués pàr un gel de polyacrylamide ou un gel de silice, ces produits synthétiques particuliers sont peu solubles dans l'eau mais, bien entendu, il est possible d'améliorer la solubilité des gels synthétiques-par des procédés connus. Polymeric gels comprising embedded bacteria and in particular bacteria of the genus Rhizobium have already been described, in particular in French Patent No. 77 10254 and in United States Patent No. 4,155,737. Polymer gels which are essentially made up of a polyacrylamide gel or a silica gel, these particular synthetic products are poorly soluble in water but, of course, it is possible to improve the solubility of synthetic gels by known methods. .

Des gels de polymères comportant des microorganismes inclus sont salement décrits dans la demande de brevet européen n 0 017 565 au nom de la société RHONE-POULENC qui suggère d'utiliser comme matrice un polymbre du groupe des polysaccharides, notamment un alginate, ainsi que dans le brevet français nO 79 28956. Polymer gels comprising microorganisms included are badly described in European Patent Application No. 0 017 565 in the name of the company Rhone-Poulenc which suggests using as a matrix a polymbre of the group of polysaccharides, in particular an alginate, as well as in French Patent No. 79 28956.

Dans le cadre de la présente invention, bien que l'on puisse utiliser un gel de polymère quelconque au moins partiellement soluble dans l'eau, on pré-fèrera utiliser un gel de polysaccharide, et de préférence un alginate., car il s'agit là de polymères souvent solubles dans l'eau et, en outre, qui sont biodégradables donc non polluants. In the context of the present invention, although any polymer gel which is at least partially soluble in water may be used, it will be preferred to use a polysaccharide gel, and preferably an alginate, because In this case, polymers are often soluble in water and, in addition, are biodegradable and therefore non-polluting.

Les différents documents précédents décrivent également les procédés permettant de préparer ces gels de polymères puis de les broyer afin d'obtenir une poudre. The various previous documents also describe the processes for preparing these polymer gels and then grinding them to obtain a powder.

Dans le cas de S. rostrata ou autre légumineuse à nodule caulinaire, les souches de Rhizobium inoculées sont de préférence des Rhizobiums de tige et de préférence correspondent à la légumineuse que l'on va inoculer. Ainsi, pour l'inoculation de S. rostrata, on utilisera de préférence des Rhizobiums de tige de
S. rostrata, par exemple la souche ORS 571 déposée à 1 ' INSTITUT PASTEUR.In the case of S. rostrata or other leguminous leguminous legume, the inoculated Rhizobium strains are preferably stem Rhizobia and preferably correspond to the legume that will be inoculated. Thus, for the inoculation of S. rostrata, Rhizobiums of
S. rostrata, for example strain ORS 571 deposited at INSTITUT PASTEUR.

Ces souches peuvent être isolées à partir des nodules caulinaires en utilisant les techniques connues décrites pour les nodules racinaires. These strains can be isolated from stem nodules using the known techniques described for root nodules.

De façon surprenante, on a constaté que,lors de la mise en solution colloïdale de gels polymères contenant des Rhizobiums inclus dans une solution aqueuse, on obtenait un inoculum tout à fait satisfaisant, en particulier si l'on prenait la précaution d'utiliser une solution aqueuse saline contenant par exemple un tampon salin tel qu'un tampon phosphate, un pH compris entre 6,4 et 7,2 et à une concentration en phosphate comprise entre 0,02 M et 0,1 M, de préférence aux environs de 0,06 M. Surprisingly, it was found that, during the placing in colloidal solution of polymer gels containing Rhizobiums included in an aqueous solution, a completely satisfactory inoculum was obtained, in particular if one took the precaution of using a aqueous saline solution containing, for example, a saline buffer such as a phosphate buffer, a pH of between 6.4 and 7.2 and a phosphate concentration of between 0.02 M and 0.1 M, preferably around 0.06 M.

En outre, il a été démontré que l'époque à laquelle avait lieu la pulvérisation était déterminante -pour accroître la fixation d'azote et la production de la biomasse. In addition, it has been shown that the timing of spraying was critical - to increase nitrogen fixation and biomass production.

On a d'ailleurs démontré, de même, qu'il était préférable de procéder à une inoculation unique entre 28 et 42 jours après le semis, de préférence lors de la cinquième semaine après le semis, plutôt que de procéder à des inoculations multiples. It has also been shown that it is preferable to carry out a single inoculation between 28 and 42 days after sowing, preferably at the fifth week after sowing, rather than to carry out multiple inoculations.

Bien entendu, il est possible d'ajouter à la solution colloldale d'autres adjuvants destinés à amélio- rer l'inoculation, en particulier des agents tensioactifs, mais il conviendra de contrôler dans chacun des cas que ces adjuvants ne nuisent pas à la viabilité des Rhizobiums inclus. Of course, it is possible to add to the colloidal solution other adjuvants intended to improve the inoculation, in particular surfactants, but it will be necessary to control in each case that these adjuvants do not impair viability. Rhizobia included.

On a ainsi pu mettre en évidence le fait que l'adjonction à la solution colloldale d'un pesticide, en particulier d'un pesticide de type organophosphoré, ne nuisait pas à la mise en oeuvre du procédé selon l'invention. It has thus been possible to demonstrate that the addition to the colloidal solution of a pesticide, in particular of an organophosphorus pesticide, does not interfere with the implementation of the process according to the invention.

Enfin, l'invention concerne une solution colloïdale obtenue par dissolution en solution aqueuse d'une poudre contenant des microorganismes phytoactifs, en particulier des Rhizobiums, ladite poudre étant constituée par des microorganismes inclus dans un gel polymères au moins partiellement soluble dans l'eau, ladite solution étant plus particulièrement destinée à la mise en oeuvre du procédé selon la présente invention.  Finally, the invention relates to a colloidal solution obtained by dissolution in aqueous solution of a powder containing phytoactive microorganisms, in particular Rhizobiums, said powder consisting of microorganisms included in a polymer gel at least partially soluble in water, said solution being more particularly intended for the implementation of the method according to the present invention.

Les exemples ci-après sont destinés à mettre en évidence d'autres avantages et caractéristiques de la présente invention sans pour autant la limiter. The following examples are intended to highlight other advantages and features of the present invention without limiting it.

Exemple 1 - Préparation d'une solution colloidale de
de poudre de Rhizobiums inclus
On inclut une souche de Rhizobium ORS 571,maintenue en collection au laboratoire de biologie des sols de l'ORSTOM à Dakar, dans un gel d'alginate selon le procédé décrit dans le brevet français nO 79 28956.EXAMPLE 1 Preparation of a Colloidal Solution of
Rhizobia powder included
A strain of Rhizobium ORS 571, maintained in a collection at the soil biology laboratory of ORSTOM in Dakar, is included in an alginate gel according to the process described in French Patent No. 79 28956.

La poudre obtenue après séchage est mise en solution colloïdale dans un tampon phosphate dont la concentration et le pH optimum sont déterminés comme indiqué précédemment. The powder obtained after drying is placed in colloidal solution in a phosphate buffer whose optimum concentration and pH are determined as indicated above.

On estime l'efficacité de la mise en solution colloïdale de l'inoculum de la façon suivante.The effectiveness of the colloidal solution of the inoculum is estimated as follows.

On agite 50 mg de poudre sèche de Rhizobium inclus avec 50 ml de différents tampons dans un Erlenmeyer de 100 ml. 50 mg of dry Rhizobium powder included with 50 ml of different buffers are shaken in a 100 ml Erlenmeyer flask.

Après 20 minutes d'agitation (120 coups/minute), on transvase chaque solution colloïdale dans un tube à essai, 25 x 300 mm, et on laisse décanter 10 minutes. On prélève délicatement 5 ml du surnageant sur lequel on mesure la densité optique à 570 nm. On considère que la densité optique est fonction de la quantité de particules d'alginate et de bactéries mises en solution colloïdale après le traitement. On admet en conséquence que le traitement le plus favorable correspond à la densité optique maximale.After 20 minutes of stirring (120 strokes / minute), each colloidal solution is transferred into a test tube, 25 × 300 mm, and allowed to settle for 10 minutes. 5 ml of the supernatant on which the optical density is measured at 570 nm are gently removed. The optical density is considered to be a function of the amount of alginate particles and bacteria placed in colloidal solution after the treatment. It is therefore assumed that the most favorable treatment corresponds to the maximum optical density.

a) Concentration optimale~du tampon~phosphate
On prépare une solution mère de tampon phosphate 0,1 M à pH 7 en mélangeant 200 ml d'une solution de phosphate dipotassique 0,1 M et 120 ml d'une solution de phosphate monopotassique 0,1 M. A partir de cette solution mère, on prépare une gamme de concentration 0 ; 0,02 ; 0,04 ; 0,06 ; 0,08 ; 0,10 M. Les résultats observés sont rassemblés au-tableau 1. Ce tableau 1 montre que la mise en solution colloïdale est la meilleure dans le cas de la concentration 0,06 M.a) Optimum concentration of phosphate buffer
A stock solution of 0.1 M phosphate buffer at pH 7 is prepared by mixing 200 ml of a 0.1 M dipotassic phosphate solution and 120 ml of a 0.1M monopotassic phosphate solution. mother, a concentration range 0 is prepared; 0.02; 0.04; 0.06; 0.08; 0.10 M. The results observed are summarized in Table 1. This Table 1 shows that the colloidal dissolution is best in the case of the concentration 0.06 M.

b) pH optimum du tampon phosphate
On prépare une gamme de tampons 0,06 M correspondant aux pH suivants : 6,4 ; 6,6 ; 6,8 , 7,0 ; 7,2.b) optimum pH of the phosphate buffer
A range of 0.06 M buffers corresponding to the following pH values are prepared: 6.4; 6.6; 6.8, 7.0; 7.2.

Les résultats observés sont rassemblés au tableau 2.The observed results are summarized in Table 2.

Ce tableau 2 montre que le pH optimum est 6,8. This table 2 shows that the optimum pH is 6.8.

TABLEAU 1
INFLUENCE DE LA CONCENTRATION EN PHOSPHATE SCR LA MISE EN
SOLUTION COLLOIDALE D'INOCULUM POUDRE (ALGINATE)
CONCENTRATION PO4 3
0 0,02 M 0,04 M 0,06 M 0,08 M 0,10 M
Dansité optique 0,18 0,35 0,48 0,95 0,83 0,54 TABLEAU 2
INFLUENCE DU pH (TAMPON PHOSPHATE 0,6 M) SUR LA MISE EN
SOLUTION COLLOIDALE DE L'INOCULUM EN POUDRE (ALGINATE)
6,2 6,6 6,8 7,0 7,2
Densité optique 0,28 0,57 1,25 0,92 0,82
c) Contrôle de la survie des Rhizobiums ORS 571
dans la suspens~on de la poudre de
Rhizobium inclus dans I lginate
On part d'une culture de Rhizobium ORS 571 âgée de 48 heures renfermant 109 bactéries vivantes/ml (comptage effectué en boîte de Pétri sur milieu YL additionné de 100 ppm d'ampicilline et 200 ppm d'actidione).TABLE 1
INFLUENCE OF SCR PHOSPHATE CONCENTRATION
COLLOIDAL SOLUTION OF INOCULUM POWDER (ALGINATE)
CONCENTRATION PO4 3
0 0.02 M 0.04 M 0.06 M 0.08 M 0.10 M
Optical Dice 0.18 0.35 0.48 0.95 0.83 0.54 TABLE 2
PH INFLUENCE (0.6 M PHOSPHATE BUFFER) ON IMPLEMENTATION
COLLOIDAL SOLUTION OF INOCULUM POWDER (ALGINATE)
6.2 6.6 6.8 7.8 7.2
Optical density 0.28 0.57 1.25 0.92 0.82
c) Control of the survival of Rhizobia ORS 571
in the suspense ~ one of the powder of
Rhizobium included in I lginate
It starts from a 48-hour Rhizobium ORS 571 culture containing 109 live bacteria / ml (counting carried out in a Petri dish on YL medium supplemented with 100 ppm of ampicillin and 200 ppm of actidione).

L'inclusion dans un gel d'alginate est ensuite effectuée conformément au procédé faisant l'objet du brevet français nO 79 28956. Ce gel. est séché sous courant d'air à 300C puis mis en poudre (poudre de
Rhizobium inclus).The inclusion in an alginate gel is then carried out in accordance with the process that is the subject of French patent No. 79 28956. This gel. is dried under a stream of air at 300C and then put into powder (powder of
Rhizobium included).

Après 3 semaines de stockage dans un dessiccateur sur actigel on-met en solution colloldale la poudre dans le tampon au phosphate suivant le procédé décrit précédemment et on procède au comptage des bactéries vivantes par le test d'infection des plantules en tube à essai (Brockwell, 1963). After 3 weeks of storage in an actigel drier, the powder in phosphate buffer is put into colloidal solution according to the process described above, and live bacteria are counted by the test tube seedling infection test (Brockwell). , 1963).

Les plantules stériles sont des plantules de Sesbania rostrata âgées de 2 à 3 jours.Sterile seedlings are 2 to 3 day old seedlings of Sesbania rostrata.

Si l'on ramène le nombre de bactéries vivantes déterminé suivant la méthode Brockwell au volume de la culture initiale utilisé pourl'inclusion, on trouve 4 x 108 bactéries vivantes/ml (chiffre très voisin de 109 bactéries/ml renfermées dans la cultuxe initiale de Rhizobium). Ceci confirme la stabilité du produit utilisé. If we reduce the number of living bacteria determined by the Brockwell method to the volume of the initial culture used for inclusion, we find 4 x 10 8 live bacteria / ml (a figure very close to 109 bacteria / ml contained in the initial culture of Rhizobium). This confirms the stability of the product used.

Exemple 2
Détermination des dates optimales d'inoculation de Sesbania rostrata
Les plantes sont cultivées dans des cylindres, 30 x 60 cm, fermés à la partie inférieure, enfoncés dans le sol en place jusqu'S 10 cm du bord supérieur et remplis de sol soigneusement, homogénéisé. Ce dispositif simule de façon satisfaisante l'expérimentation au champ classique (Legg et Sloger, 1975). On sème 10 graines par cylindre.Example 2
Determination of optimal dates of inoculation of Sesbania rostrata
The plants are grown in cylinders, 30 x 60 cm, closed at the bottom, sunk into the soil in place up to 10 cm from the top edge and filled with soil thoroughly, homogenized. This device satisfactorily simulates classical field experimentation (Legg and Sloger, 1975). We sow 10 seeds per cylinder.

Pour obtenir une germination rapide et régulière des graines de Sesbania rostrata, celles-ci sont mises pendant 20 minutes dans un récipient où l'on verse de l'acide sulfurique concentré. Les graines sont ensuite rincées très rapidement et abondamment (pour éviter l'échauffement dû à la réaction de l'eau sur l'acide sulfurique) (Dreyfus et Dommergues, 1980). To obtain a rapid and regular germination of Sesbania rostrata seeds, they are put for 20 minutes in a container where concentrated sulfuric acid is poured. The seeds are then rinsed very quickly and abundantly (to avoid heating due to the reaction of water on sulfuric acid) (Dreyfus and Dommergues, 1980).

Lorsque les plantes atteignent 15-20 cm de hauteur, on procède à un démariage de façon à laisser un plant par cylindre. Après cette opération, on arrose plus abondamment de façon à maintenir une lame d'eau de 5 cm environ à la surface du sol dans chaque cylindre. When the plants reach 15-20 cm in height, one carries out a stinging so as to leave one plant per cylinder. After this operation, we water more abundantly so as to maintain a blade of water of about 5 cm at the surface of the soil in each cylinder.

La souche de Rhizobium spécifique et effective (fixatrice d'azote) utilisée est la souche ORS 571 (Dreyfus et Dommergues, 1981 b) maintenue en collection au laboratoire de biologie des sols de l'ORSTOM à Dakar. The specific and effective Rhizobium strain (nitrogen scavenger) used is strain ORS 571 (Dreyfus and Dommergues, 1981b) maintained in a collection at ORSTOM soil biology laboratory in Dakar.

Cette souche qui est une souche à croissance rapide a été cultivée sur le milieu suivant
Milieu YL pour culture de Rhizobium ORS 571 lactate de sodium 5,- g (NH4)2SO4 1,- g K2HPO4 1,67 g
KH2P04 0,87 g
NaCl 0-,05 g
MgS04,7H20 0,10 g
CaCl2 40 mg
FeCl3 4 mg
Extrait de levure 1 g Oligoéléments 1 eau distillée 1000 ml pH ajusté à 6,8 stérilisation à 1200C pendant 20 minutes.This strain which is a fast-growing strain was grown on the following medium
YL medium for Rhizobium culture ORS 571 sodium lactate 5, - g (NH4) 2SO4 1, - g K2HPO4 1.67 g
KH2P04 0.87 g
0-, 05 g NaCl
MgSO4.7H20 0.10 g
CaCl2 40 mg
FeCl3 4mg
Yeast extract 1 g Trace elements 1 distilled water 1000 ml pH adjusted to 6.8 sterilization at 1200C for 20 minutes.

Pour déterminer la ou les dates optimales d'inoculation de S. rostrata, on a comparé la fixation d'azote et la production de biomasse de plants de
S. rostrata soumis aux 5 traitements suivants - inoculation unique précoce (3ème semaine après le semis) - inoculation unique intermédiaire (5ème semaine après
le semis) - inoculation unique tardive (7ème semaine après le semis) - inoculation répétée (3ème, 5ème et 7ème semaine après
le semis) - pas d'inoculation.To determine the optimal date (s) of inoculation of S. rostrata, nitrogen fixation and biomass production of
S. rostrata subjected to the following 5 treatments - single early inoculation (3rd week after sowing) - single intermediate inoculation (5th week after
sowing) - single late inoculation (7th week after sowing) - repeated inoculation (3rd, 5th and 7th week after
sowing) - no inoculation.

On a effectué 5 rdpétitions. We performed 5 repetitions.

La nodulation est mesurée par le nombre et le poids des nodules. La fixation d'azote est estimée par la méthode de réduction de l'acétylène (Hardy et al., 1981) et exprimée en micromoles de C2H4 produit par heure et par plante. L'accroissement de la fixation d'azote résultant de l'inoculation est, en outre, déterminé par la différence entre les teneurs en azote total des plantes inoculées et des plantes témoin. La production de biomasse est mesurée par le poids sec des plantes. Nodulation is measured by the number and weight of nodules. Nitrogen fixation is estimated by the acetylene reduction method (Hardy et al., 1981) and expressed in micromoles of C2H4 produced per hour per plant. The increase in nitrogen fixation resulting from inoculation is further determined by the difference between the total nitrogen contents of the inoculated plants and the control plants. Biomass production is measured by the dry weight of plants.

Les résultats obtenus sont rassemblés dans le tableau 3.  The results obtained are collated in Table 3.

TABLEAU 3
INFLUENCE DE LA DATE D'INOCULATION DE SESBANIA ROSTRATA SUR LA NODULATION,
LA FIXATION D'AZOTE ET LE POIDS DES TIGES ET FEUILLES DEES PLANTES AGEES DE 65 JOURS

TABLE 3
INFLUENCE OF THE INOCULATION DATE OF SESBANIA ROSTRATA ON NODULATION,
THE FIXATION OF NITROGEN AND THE WEIGHT OF THE RODS AND LEAVES OF PLANTS AGE OF 65 DAYS

<SEP> NODULES <SEP> FIXATION <SEP> (1) <SEP> TIGES <SEP> ET <SEP> FEUILLES
<tb> <SEP> (par <SEP> plante) <SEP> D'AZOTE <SEP> (ARA) <SEP> (par <SEP> piants)
<tb> <SEP> INOCULATION <SEP> Norrbre <SEP> Poids <SEP> sec <SEP> Poids <SEP> sec <SEP> Azote <SEP> total
<tb> <SEP> (g) <SEP> (g) <SEP> (g)
<tb> Unique <SEP> à <SEP> la <SEP> 3ème <SEP> semaine <SEP> 305 <SEP> # <SEP> 69 <SEP> 1,35 <SEP> # <SEP> 0,27 <SEP> 67 <SEP> # <SEP> 9 <SEP> 42,1 <SEP> # <SEP> 4,8 <SEP> 0,86 <SEP> # <SEP> 0,09
<tb> Unique <SEP> à <SEP> la <SEP> 5ème <SEP> semaine <SEP> 653 <SEP> # <SEP> 81 <SEP> 1,60 <SEP> # <SEP> 0,35 <SEP> 123 <SEP> # <SEP> 24 <SEP> 52,0 <SEP> # <SEP> 6,9 <SEP> 1,15 <SEP> # <SEP> 0,13
<tb> Unique <SEP> à <SEP> la <SEP> 7ème <SEP> semaine <SEP> 604 <SEP> # <SEP> 93 <SEP> 0,94 <SEP> # <SEP> 0,24 <SEP> 77 <SEP> # <SEP> 18 <SEP> 36,3 <SEP> # <SEP> 6,8 <SEP> 0,77 <SEP> # <SEP> 0,11
<tb> Répétée <SEP> (3ème, <SEP> 5ème <SEP> et <SEP> 709 <SEP> # <SEP> 56 <SEP> 2,00 <SEP> # <SEP> 0,36 <SEP> 132 <SEP> # <SEP> 35 <SEP> 54,6 <SEP> # <SEP> 5,4 <SEP> 1,30 <SEP> # <SEP> 0,13
<tb> <SEP> 7ème <SEP> semaine)
<tb> Témoin <SEP> (pas <SEP> d'inoculation) <SEP> 235 <SEP> # <SEP> 41 <SEP> 0,88 <SEP> # <SEP> 0,16 <SEP> 32 <SEP> # <SEP> 6 <SEP> 33,6 <SEP> # <SEP> 5,9 <SEP> 0,75 <SEP> # <SEP> 0,09
<tb> (1) Micromoles de C2H4 produit par heure et par plante # erreur standard
L'examen des résultats figurant au tableau 3 amène aux conclusions suivantes
Bien que le témoin soit spontanément nodulé et fixe une certaine quantité d'azote, l'inoculation apparaît indispensable pour accroîtreila fixation d'azote et la production de biomasse.<SEP> NODULES <SEP> FIXING <SEP> (1) <SEP> RODS <SEP> AND <SEP> SHEETS
<tb><SEP> (by <SEP> plant) <SEP> NITROGEN <SEP> (ARA) <SEP> (by <SEP> piants)
<tb><SEP> INOCULATION <SEP> Standard <SEP> Weight <SEP> sec <SEP> Weight <SEP> sec <SEP> Nitrogen <SEP> total
<tb><SEP> (g) <SEP> (g) <SEP> (g)
<tb> Single <SEP> to <SEP> the <SEP> 3rd <SEP> week <SEP> 305 <SEP>#<SEP> 69 <SEP> 1.35 <SEP>#<SEP> 0.27 <SEP > 67 <SEP>#<SEP> 9 <SEP> 42.1 <SEP>#<SEP> 4.8 <SEP> 0.86 <SEP>#<SEP> 0.09
<tb> Single <SEP> to <SEP> the <SEP> 5th <SEP> week <SEP> 653 <SEP>#<SEP> 81 <SEP> 1.60 <SEP>#<SEP> 0.35 <SEP > 123 <SEP>#<SEP> 24 <SEP> 52.0 <SEP>#<SEP> 6.9 <SEP> 1.15 <SEP>#<SEP> 0.13
<tb> Single <SEP> to <SEP> the <SEP> 7th <SEP> week <SEP> 604 <SEP>#<SEP> 93 <SEP> 0.94 <SEP>#<SEP> 0.24 <SEP > 77 <SEP>#<SEP> 18 <SEP> 36.3 <SEP>#<SEP> 6.8 <SEP> 0.77 <SEP>#<SEP> 0.11
<tb> Repeated <SEP> (3rd, <SEP> 5th <SEP> and <SEP> 709 <SEP>#<SEP> 56 <SEP> 2.00 <SEP>#<SEP> 0.36 <SE> 132 <SEP>#<SEP> 35 <SEP> 54.6 <SEP>#<SEP> 5.4 <SEP> 1.30 <SEP>#<SEP> 0.13
<tb><SEP> 7th <SEP> week)
<tb> Control <SEP> (not <SEQ> inoculation) <SEP> 235 <SEP>#<SEP> 41 <SEP> 0.88 <SEP>#<SEP> 0.16 <SEP> 32 <SEP >#<SEP> 6 <SEP> 33.6 <SEP>#<SEP> 5.9 <SEP> 0.75 <SEP>#<SEP> 0.09
<tb> (1) Micromoles of C2H4 produced per hour per plant # standard error
The examination of the results in Table 3 leads to the following conclusions
Although the control is spontaneously nodulated and fixes a certain amount of nitrogen, inoculation appears essential to increase nitrogen fixation and biomass production.

Dans le cas de l'inoculation unique, la date optimale correspond à la 5ème semaine : l'accroissement de la fixation d'azote et de la production de biomasse est maximum pour ce traitement. In the case of single inoculation, the optimal date corresponds to the 5th week: the increase in nitrogen fixation and biomass production is maximum for this treatment.

Des inoculations répétées peuvent accroitre la fixation d'azote et la production de biomasse, mais cette augmentation n'est pas aussi importante qu'on aurait pu le supposer. Repeated inoculations can increase nitrogen fixation and biomass production, but this increase is not as large as one would have thought.

C'est pourquoi une inoculation unique vers la ème semaine donne les meilleurs résultats. This is why a single inoculation towards the eighth week gives the best results.

Exemple 3 - Comparaison de l'efficacité de l'inoculum constitué par la solution colloïdale de poudre de Rhizobium inclus et de l'inoculum constitué par la culture liquide de
Rhizobium
On inocule par pulvérisation les tiges de
S. rostrata avec deux types d'inoculum
1) l'inoculum obtenu par mise en solution colloldale de la poudre de Rhizobium inclus (poudre conservée 3 mois),
2) l'inoculum constitué par la culture liquide de Rhizobium (utilisée dès obtention en fermenteur) qui est l'inoculum de référence.EXAMPLE 3 Comparison of the Efficacy of the Inoculum Comprising the Colloidal Solution of Rhizobium Powder Included and the Inoculum Consisting of the Liquid Culture of
Rhizobium
Sprays are inoculated by spraying
S. rostrata with two types of inoculum
1) the inoculum obtained by placing in collold solution the Rhizobium powder included (powder stored for 3 months),
2) the inoculum constituted by the liquid culture of Rhizobium (used as soon as obtained in fermentor) which is the reference inoculum.

On effectue des dilutions de ces inoculums de façon à obtenir 107 et 106 bactéries vivantes par ml de liquide. La comparaison des résultats montre que pour une même dilution les deux types d'inoculum donnent des résultats comparables, aussi bien en ce qui concerne la nodulation (initiation de la symbiose) que la fixation d'azote (fonctionnement de la symbiose), bien que l'inoculum 1 ait été conservé 3 mois. Il apparaît, en outre, que les inoculums, même dilués (107 bactéries vivantes/ml) sont encore très efficaces. Dilutions of these inocula were made to obtain 107 and 106 living bacteria per ml of liquid. The comparison of the results shows that for the same dilution both types of inoculum give comparable results, both as regards nodulation (symbiosis initiation) and nitrogen fixation (symbiosis functioning), although inoculum 1 was kept for 3 months. It appears, moreover, that the inocula, even diluted (107 live bacteria / ml) are still very effective.

Exemple 4
Influence de l'incorporation d'un pesticide l'inoculum
La tolérance de ORS 571 à l'incorporation d'un pesticide a été testée dans le cas d d'un ester organophosphoré : Curacron.Example 4
Influence of incorporation of a pesticide intooculum
The tolerance of ORS 571 to the incorporation of a pesticide was tested in the case of an organophosphorus ester: Curacron.

- a) Influence de l'addition de Curacron au milieu
de culture sur la croissance des Rhizobiums
On étale 0,1 ml de culture d'ORS 571 en phase exponentielle sur des boites de Pétri renfermant le milieu
YL gélosé auquel on a ajouté des doses croissantes de
Curacron stérilisé par filtration sur millipore 0, 20, SO, 100, 200, 500 ppm. Le tableau 4 montre que
ORS 571 résiste parfaitement à une dose de Curacron élevée (200 ppm). Même à 506 ppm, la croissance est seulement ralentie.- a) Influence of the addition of Curacron to the medium
of culture on the growth of Rhizobia
0.1 ml of exponential phase ORS 571 culture is spread on Petri dishes containing the medium.
YL agar to which increased doses of
Curacron sterilized by Millipore filtration 0, 20, SO, 100, 200, 500 ppm. Table 4 shows that
ORS 571 is highly resistant to a high dose of Curacron (200 ppm). Even at 506 ppm, growth is only slowed down.

TABLEAU 4

TABLE 4

<tb> <SEP> Doses <SEP> de <SEP> Curacron <SEP> apportées <SEP> au <SEP> milieu <SEP> (ppm)
<tb> <SEP> 0 <SEP> 20 <SEP> 50 <SEP> 100 <SEP> 200 <SEP> 500
<tb> Croissance <SEP> de <SEP> +
<tb> Rhizobium <SEP> ORS <SEP> 571 <SEP> <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP>
<tb>
b) Influence de l'addition de Curacron à la culture liguide de Rhizobium
On effectue l'inoculation de plantes âgées de 2 mois cultivées en plein air avec des cultures de
Rhizobium ORS 571 renfermant 108, 107 et 106 bactéries/ml, avec et sans addition de Curacron (200 ppm). Les observations et mesures effectuées 21 jours après l'inoculation sont rapportées au tableau 5. Il résulte de cette expérience que l'adjonction de Curacron à l'inoculum ne nuit nullement à la nodulation ni à la fixation d'azote.<tb><SEP> Doses <SEP> of <SEP> Curacron <SEP> made <SEP> at <SEP> Medium <SEP> (ppm)
<tb><SEP> 0 <SEP> 20 <SEP> 50 <SEP> 100 <SEP> 200 <SEP> 500
<tb> Growth <SEP> of <SEP> +
<tb> Rhizobium <SEP> ORS <SEP> 571 <SEP><SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP>
<Tb>
b) Influence of the addition of Curacron to Rhizobium liguide culture
Inoculation of 2-month-old plants grown outdoors with
Rhizobium ORS 571 containing 108, 107 and 106 bacteria / ml, with and without addition of Curacron (200 ppm). The observations and measurements made 21 days after inoculation are reported in Table 5. It follows from this experiment that the addition of Curacron to the inoculum in no way impairs the nodulation or fixation of nitrogen.

c > Influence de l'addition de Curacron à la solution colloldale de poudre de Phizobium inclus
Cette expérience est effectuée dans les mêmes conditions et en même temps que la précédente mais en remplaçant l'inoculum constitué par la culture liquide de Rhizobium par l'inoculum constitué par la solution colloidale de poudre de Rhizobium inclus.Comme dans le cas précédent, on n'observe aucune modification de l'efficacité de l'inoculum à la suite de l'addition de Curacron. TABLEAU 5
INFLUENCE DE L'ADDITION DE CURACRON A LA CULTURE LIQUIDE ORS 571
SUR LA NODULATION ET LA FIXATION D'AZOTE DE SESEANIA ROSTRATA
TRAITEMENT NODULES PAR 10 CM DE TIGE FIXACTION D'AZOTE
Nombre de Rhizobium Apport de (umole C2H4/h/g) par ml d'inoculum Curacron Nombre Poids sec NODULE SEC
(ppm) (mg)
108 0 67 # 5 89 # 21 166 # 28
107 0 70 # 14 81 # 17 126 # 14
106 0 60 # 8 73 # 17 120 # 19
108 200 69 # 9 63 # 17 163 # 38
107 200 64 # 11 64 # 18 132 # 35
106 200 77 # 11 68 # 11 112 # 7
Ces différents essais démontrent que l'introduction en agriculture de Sesbania rostrata à titre d'engrais vert doit être appelée à se développer considdrablement, tout particulièrement dans les régions tropicales, notamment en riziculture.en extrême-orient. c> Influence of the addition of Curacron to the colloidal solution of Phizobium powder included
This experiment is carried out under the same conditions and at the same time as the previous one but by replacing the inoculum constituted by the Rhizobium liquid culture by the inoculum constituted by the colloidal solution of Rhizobium powder included. As in the previous case, observed no change in the efficacy of the inoculum following the addition of Curacron. TABLE 5
INFLUENCE OF THE ADDITION OF CURACRON TO LIQUID CULTURE ORS 571
ON THE NODULATION AND FIXATION OF NITROGEN OF SESEANIA ROSTRATA
TREATMENT NODULES PER 10 CM OF NITROGEN FIXACTION ROD
Number of Rhizobium Supply of (umol C2H4 / h / g) per ml of Curacron inoculum Dry weight NODULE SEC
(ppm) (mg)
108 0 67 # 5 89 # 21 166 # 28
107 0 70 # 14 81 # 17 126 # 14
106 0 60 # 8 73 # 17 to 120 # 19
108 200 69 # 9 63 # 17 163 # 38
107 200 64 # 11 64 # 18 to 132 # 35
106 200 77 # 11 68 # 11 112 # 7
These different trials show that the introduction of Sesbania rostrata as a green manure into agriculture is likely to develop considerably, especially in the tropics, particularly in the Far East.

C'est évidemment sous forme d'inoculum déjd conditionné en poudre qui peut être mis facilement en suspension pour l'emploi que la diffusion de ce rhizobium pourra être assurée dans les meilleurs conditions.  It is evidently in the form of an inoculum already packaged in powder which can be easily suspended for use that the diffusion of this rhizobium can be assured under the best conditions.

REFERENCES BROCKWELL J. (1963)
Accuracy of a plant-infection technique for counting populations of Rhizobium trifolii; Appl. Microbiol. 11 : 377-383.REFERENCES BROCKWELL J. (1963)
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DREYFUS B. et DOMMERGUES Y.R. (1980)
Non-inhibition de la fixation azote atmosphérique par l'azote combiné chez une légumineuse à nodules caulinaires,
Sesbania rostrata; C.R. Acad. Sciences Paris, D, 291, 767-770.DREYFUS B. and DOMMERGUES YR (1980)
Non-inhibition of atmospheric nitrogen fixation by combined nitrogen in a stem-nodule legume
Sesbania rostrata; CR Acad. Sciences Paris, D, 291, 767-770.

DREYFUS B. et DOMMERGUES Y.R. (1981 a)
Nitrogen-fixing nodules induced by Rhizobium on the stem of the tropical legume Sesbania rostrata; FEMS Microbiol.DREYFUS B. and DOMMERGUES YR (1981 a)
Nitrogen-fixing nodules induced by Rhizobium on the stem of the tropical legume Sesbania rostrata; FEMS Microbiol.

Letters, 10, 313-317.Letters, 10, 313-317.

DREYFUS B.L. et DOMMERGUES Y.R. (1981 b)
Stem nodules on the tropical legume, Sesbania rostrata;
In: Current Perspectives in Nitrogen Fixation (A.H. Gibson et W.E. Newton eds.);Australian Academy of Science,
Canberra. p. 471.DREYFUS BL and DOMMERGUES YR (1981b)
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In: Current Perspectives in Nitrogen Fixation (AH Gibson and WE Newton eds.), Australian Academy of Science,
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HARDY R.W.F. (1980)
Translating basic research on biological nitrogen fixation to improved crop production in less-developed countries, a user's view; In: Linking Research to Crop Production; (R.C. Staples et R.J. Kuhr eds.); Plenùm New York.HARDY RWF (1980)
Translating basic research on a biological nitrogen fixation to a crop production in less-developed countries, a user's view; In: Linking Research to Crop Production; (RC Staples and RJ Kuhr eds.); Plenum New York.

137-151.137-151.

LEGG J.O. et SLOGER C. (1975)
A tracer method determining symbiotic nitrogen fixation in field studies;In: Proceedings of the Second International
Conference on Stable Isotopes; (E.R. Klein et P.O. Klein eds) 661-666. LEGG JO and SLOGER C. (1975)
To be traced method of determining symbiotic nitrogen fixation in field studies; In: Proceedings of the Second International
Conference on Stable Isotopes; (ER Klein and PO Klein eds) 661-666.

Claims (16)

REVENDICATIONS 1) Procédé d'inoculation de plantes par des microorganismes phytoactifs, caractérisé en ce que 1) A process for inoculating plants with phytoactive microorganisms, characterized in that - on prépare une solution aqueuse colloidale contenant lesdits microorganismes phytoactifs, par dissolution dans une solution aqueuse d'une poudre constitude de bactéries incluses dans un gel polymère au moins partiellement soluble dans l'eau, et an aqueous colloidal solution containing said phytoactive microorganisms is prepared by dissolving in an aqueous solution a constancy powder of bacteria included in a polymer gel that is at least partially soluble in water, and - on pulvérise les sites d'inoculation des plantes avec la solution aqueuse colloïdale obtenue. the plant inoculation sites are sprayed with the colloidal aqueous solution obtained. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les microorganismes sont inclus dans un gel de polysaccharide. 2) Process according to claim 1, characterized in that the microorganisms are included in a polysaccharide gel. 3) Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le gel de polysaccharide est un alginate. 3) Process according to claim 2, characterized in that the polysaccharide gel is an alginate. 4) Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le pH de la solution aqueuse colloidale est compris entre 6,4 et 7,2. 4) Method according to one of claims 1 to 3, characterized in that the pH of the aqueous colloidal solution is between 6.4 and 7.2. 5) Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le pH de la solution aqueuse colloïdale est de 6,8. 5) Process according to claim 4, characterized in that the pH of the aqueous colloidal solution is 6.8. 6) Procédé selon l'une des revendications 4 et 5, caractérisé en ce que le pH est tamponné par un tampon phosphate. 6) Method according to one of claims 4 and 5, characterized in that the pH is buffered with a phosphate buffer. 7) Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la solution aqueuse colloïdale contient une concentration en phosphate comprise entre 0,02 et 0,1 M. 7) Method according to one of claims 1 to 6, characterized in that the colloidal aqueous solution contains a phosphate concentration of between 0.02 and 0.1 M. 8) Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la concentration en phosphate est voisine de 0,06 M.  8) Process according to claim 7, characterized in that the phosphate concentration is close to 0.06 M. 9) Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que le microorganisme phytoactif est un Rhizobium. 9) Method according to one of claims 1 to 8, characterized in that the phytoactive microorganism is a Rhizobium. 10) Procédé selon la revendication 9 caractérisé en ce que le Rhizobium utilisé est un Rhizobium de tiges. 10) Method according to claim 9 characterized in that the Rhizobium used is a Rhizobium rods. 11) Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que les Rhizobiums utilisés sont des 11) Process according to claim 10, characterized in that the Rhizobia used are Rhizobiums de Sesbania rostrata.Rhizobia of Sesbania rostrata. 12) Procédé selon l'une des revendications 10 et 11, caractérisé en ce qu'on effectue la pulvérisation entre 28 et 42 jours après le semis. 12) Method according to one of claims 10 and 11, characterized in that spraying is carried out between 28 and 42 days after sowing. 13) Procédé selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que la solution contient, en outre, un pesticide. 13) Method according to one of claims 1 to 12, characterized in that the solution contains, in addition, a pesticide. 14) Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que le pesticide est un ester organophosphoré. 14) Process according to claim 13, characterized in that the pesticide is an organophosphorus ester. 15) Solution colloïdale aqueuse obtenue par dissolution dans une solution aqueuse d'une poudre constituée de bactéries incluses dans un gel polymère au moins partiellement soluble dans l'eau. 15) Aqueous colloidal solution obtained by dissolution in an aqueous solution of a powder consisting of bacteria included in a polymer gel at least partially soluble in water. 16) Solution colloïdale selon la revendication 15, caractdrisée en ce que la poudre est constituée d'une souche de Rhizobium incluse dans un gel d'alginate.  16) A colloidal solution according to claim 15, characterized in that the powder consists of a Rhizobium strain included in an alginate gel.