FR2528854A1 - Antithrombotic oligosaccharide fragments of muco-polysaccharide prodn. - by reacting uronic acid and glucosamine units - Google Patents

Abstract

16.2.82, 28.5.82, 22.6.82(2), 2.7.82 6.8.82, 20.9.82(2)-FR-001575, 002526, 009392 010891/2, 011679, 013804, 015803/4) Prodn. of oligosaccharides (I) contg. or corresponding to fragments of acidic mucopolysaccharides comprises reacting two cpds., consisting of (or terminated by) units A of glucosamine (esp. in the D form) and of units U of glucuronic acid (esp) or iduronic acid (esp. L). One of units A and U is an alcohol with the hydroxy gp. at 3,4 or 6 position (for A) or at 2,3 or 4 position (for U), while the other has an activated anomeric carbon, i.e. an atom carrying a gp. reactive with hydroxy to form a glycosyl ether bond. All atoms (except the activated one) carry protected hydroxy, amino, or carboxy gps.(or their precursors) and it is esp. pref. that several different protecting gps. are used. This allows various substits. to be introduced subsequently at various positions. Formation of the disaccharide (2-N-sulphate or (2-N-acetyl)-6-O-sulphate-D-glucosamine) (methyl D-glucuronic acid). Intermediate oligosaccharides formed in the process and similar cpds. in which 1-3 hydroxy gps. are deprotected during the reaction are new. (I) are esp. useful as antithrombotic agents and also as biological reactants. The process is very generally applicable, and gives very pure prods. with the required stereospecificity.

Description

'Nouveaux dérivés de tétrasaccharides et leur préparati
L'invention a pour objet de nouveaux dérivC:; de tétrasaccharides et leur préparation.'' New tetrasaccharide derivatives and their preparation
The subject of the invention is new derivatives: of tetrasaccharides and their preparation.

Elle concerne plus particulièrement des tétrasaccharides formés d'un enchainement de motifs à structure acide glucuronique,D-glucosamine, acide
L-iduronique et D-glucosamine,de formule

dans laquelle - R4,R5,R6 et R10 représentent un atome d'hydrogène, un groupe sulfate, ou un groupe protecteur, l'un au moin de ces radicaux représentant alors dans ce dernier cas un atome d'hydrogene ou un groupe sulfate, R1. R2, R3, R7, R8 et Rg représentent un atome d'hydrogène ou un groupement protecteur, - les substituants R, identiques ou différents représen- tent un groupe alcoyle, en particulier renfermant 1 à 3 atomes de carbone, de préférence un groupe méthyle, ou un cation métallique, notamment le sodium, ou encore un cation organique,tel qu'un dérivé de base organique azotée, - Z représente un précurseur d'un groupement fonctionnel azoté ou ce groupement azoté lui-mëme, en particulier un groupe azide, un groupement amine, éventuellement substitué, ou un groupe -NHS03 . It relates more particularly to tetrasaccharides formed from a chain of units with a glucuronic acid, D-glucosamine, acid structure.
L-iduronic and D-glucosamine, of formula

in which - R4, R5, R6 and R10 represent a hydrogen atom, a sulfate group, or a protective group, one at least of these radicals then representing in the latter case a hydrogen atom or a sulfate group, R1. R2, R3, R7, R8 and Rg represent a hydrogen atom or a protective group, - the substituents R, which are identical or different, represent an alkyl group, in particular containing 1 to 3 carbon atoms, preferably a methyl group , or a metal cation, in particular sodium, or also an organic cation, such as a nitrogenous organic base derivative, - Z represents a precursor of a nitrogen functional group or this nitrogen group itself, in particular an azide group , an amine group, optionally substituted, or a group -NHS03.

Une famille préférée de tétrasaccharides de l'invention renferme avantageusement deux motifs D-glucosamine comportant un groupe N-sulfate en position 2. A preferred family of tetrasaccharides of the invention advantageously contains two D-glucosamine units comprising an N-sulfate group in position 2.

Des tétrasaccharides de ce type sont,en outre,avan tageusement substitués en position 6 par un groupe -O sulfate. Tetrasaccharides of this type are, moreover, advantageously substituted in position 6 by an -O sulfate group.

Dans d'autre tétrasaccharides préférés,R4 représente un groupe sulfate, cette disposition pouvant avantageuse ment s'ajouter à celles qui précedent. In other preferred tetrasaccharides, R4 represents a sulphate group, this arrangement being able advantageously to be added to those which precede.

Dans une autre famille préférée, les tétrasaccharides ci-dessus renferment en outre un motif acide L-iduronique comportant un groupe O-sulfate en position 2. In another preferred family, the above tetrasaccharides also contain an L-iduronic acid unit comprising an O-sulfate group in position 2.

Les positions restantes de ces tétrasaccharides sont libres ou protégées par des groupements de bloquage selon l'application envisagée pour ces produits. The remaining positions of these tetrasaccharides are free or protected by blocking groups depending on the application envisaged for these products.

D'une manière avantageuse, ces tétrasaccharides correspondent à dessequences de fractiom ou fragments de channes d'héparine douées d'une activité anticoagulante spécifique élevée (mesurée selon la méthode de Yin-Wessler décrite dans J.Lab.Clin.Med. Advantageously, these tetrasaccharides correspond to sequences of fractures or fragments of heparin chains endowed with a high specific anticoagulant activity (measured according to the Yin-Wessler method described in J. Lab. Clin. Med.

1976,81.-298-300 ) ~ tandis que leur activité anticoagulante globale (exprimée par le titre USP, mesuré selon la méthode décrite dans "Pharmacopea of the Uni tex States of Arrerica"pp 229-230)est plus faible que celle de l'héparine.1976,81.-298-300) ~ while their overall anticoagulant activity (expressed by the title USP, measured according to the method described in "Pharmacopea of the Uni tex States of Arrerica" pp 229-230) is weaker than that of heparin.

pa Ces Ces tétrasaccharides sont donc avantageusement utilisables comme substances de référence pour soles études de structure. These Ces tetrasaccharides are therefore advantageously usable as reference substances for soles structural studies.

Ils constituent également des produits intermédiaires de grand intéret en synthèse osidique, plus spécialement pour la synthèse d'oligosaccharides constitutifs de chaines d'héparine ou d'héparan~sulfat6.  They also constitute intermediates of great interest in osidic synthesis, more especially for the synthesis of oligosaccharides constituting chains of heparin or heparan ~ sulfat6.

Conformément à l'invention, le ou les groupes -O-sulfate des motifs constitutifs des tétrasaccharides sont obtenus à partir de groupements-O-acétyle(-O-COCit3). According to the invention, the group (s) -O-sulfate of the constituent units of the tetrasaccharides are obtained from groups-O-acetyl (-O-COCit3).

Dans une première étape, on procède à l'élimination partielle de groupes -O-acétyle. par exemple à l'aide de carbonate de potassium dans du méthanol, ou à une élimination complète de tous les groupements -Oacétyle du tétrasaccharide à l'aide, par exemple, de soude. Les groupes -OH ainsi libérés sont alors soumis à un traitement de sulfatation. A cet effet, on utilise, par exemple, un complexe de tétramethyl; amine /S03. In a first step, the partial elimination of -O-acetyl groups is carried out. for example using potassium carbonate in methanol, or a complete elimination of all the -Oacetyl groups of the tetrasaccharide using, for example, sodium hydroxide. The -OH groups thus released are then subjected to a sulfation treatment. For this purpose, a tetramethyl complex is used, for example; amine / S03.

Les groupes -N-sulfate sont avantageusement obtenus par sulfatation de groupes amine. The -N-sulfate groups are advantageously obtained by sulfation of amine groups.

Comme produit de départ, on met avantageusement
en oeuvre un tétrasaccharide, tel qu'obenu selon le pro cédé décrit dans la demando dc brevet ~~ - - -
FR 82 02526 du 16 février 1982 au nom de la Demanderesse.As a starting material, advantageously
using a tetrasaccharide, as obtained according to the process described in the patent application ~~ - - -
FR 82 02 526 of February 16, 1982 in the name of the Applicant.

Dans ce tétrasaccharide, les groupes de bloquage sont convenablement choisis selon le type de substitution souhaité dans le produit final.In this tetrasaccharide, the blocking groups are suitably chosen according to the type of substitution desired in the final product.

Ainsi, on a plus spécialement recours à un tétrasaccharide comportant des groupes -OCOCH3 sur les positions à sulfater et des groupes de bloquage inertes vis-à-vis de la réaction de désacétylation et de sulfatation et compatibles entre eux pour les autres positions. Thus, use is more especially made of a tetrasaccharide comprising —OCOCH3 groups on the positions to be sulfated and blocking groups which are inert with respect to the deacetylation and sulfation reaction and which are compatible with each other for the other positions.

Les produits intermédiaires mis en oeuvre dans lé procédé évoqué ci-dessus sont nouveaux et, en tant que tels, entrent également dans le cadre de l'invention. The intermediate products used in the process mentioned above are new and, as such, also come within the scope of the invention.

D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaitront dans les exemples qui suivent relatifs à la synthèse de tétrasaccharides de
l'invention. Le schéma de synthèse est représenté sur 3a
figure.Les composés y sont désignés par les memes numéros que dans les exemples.Les symboles utilisés dans la description ct la figure ont les significationr suivantes
Ac : acétyle, Me : méthyle, Bn : benzyle, S : S03 ido : motif iduronique, gluco : motif glucosamine, : triméthylamine, A : benzyloxycarbonyle. Other characteristics and advantages of the invention will appear in the examples which follow relating to the synthesis of tetrasaccharides of
the invention. The summary diagram is represented on 3a
The compounds are designated therein by the same numbers as in the examples. The symbols used in the description and in the figure have the following meanings:
Ac: acetyl, Me: methyl, Bn: benzyl, S: S03 ido: iduronic unit, gluco: glucosamine unit,: trimethylamine, A: benzyloxycarbonyl.

EXEMPLE 1 - Synthèse du tétrasaccharide 2
Une solution de tétrasaccharide 1 (28mg) dans le méthanol anhydre (3ml) est refroidie à -150C sous atmosphère d'argon sec. Du carbonate de potassium anhydre (12 mg) est ajouté et le mélange est agité
6 heures dans ces conditions. Les solides sont alors
essorés, le filtrat est évaporé et le résidu est repris avec du chloroforme (15 ml). La phase organique est
lavée avec une solution aqueuse saturée de chlorure de
sodium, avec de l'eau,séchée (sulfate de sodium), fil-
trée et évaporée.EXAMPLE 1 - Synthesis of tetrasaccharide 2
A solution of tetrasaccharide 1 (28mg) in anhydrous methanol (3ml) is cooled to -150C under an atmosphere of dry argon. Anhydrous potassium carbonate (12 mg) is added and the mixture is stirred
6 hours under these conditions. The solids are then
drained, the filtrate is evaporated and the residue is taken up with chloroform (15 ml). The organic phase is
washed with saturated aqueous chloride solution
sodium, with water, dried (sodium sulfate), wire-
sorted and evaporated.

Le résidu est chromatographié sur une colonne
de gel de silice (2 g). L'élution par le mélange
acétate d'éthyle/hexane (3:2,v/v) donne le tétrasaccharide 2 sous forme d'un verre incolore (22mg, 85x). The residue is chromatographed on a column
silica gel (2 g). Elution by mixing
ethyl acetate / hexane (3: 2, v / v) gives tetrasaccharide 2 as a colorless glass (22mg, 85x).

Spectre RMN (270 MHz,CDCl3) & 7,30 (m,35H, 7 Ph)
5,37 (d,lH, H1, J1" " : 3.5 Hz);
5,29 (d. de d., 1H, H3, J2", 3": 10 Hz, J3 ",4 ": 8,5H;z); 5,09 (d, 1H, H1, J1,2 : 3,5 Hz);
3,57 (s,3H, COOMe ido)
3.43 (s, 3H, COOMe gluco) , 2,06 (s, 3H,OAc).NMR spectrum (270 MHz, CDCl3) & 7.30 (m, 35H, 7 Ph)
5.37 (d, 1H, H1, J1 "": 3.5 Hz);
5.29 (d. Of d., 1H, H3, J2 ", 3": 10 Hz, J3 ", 4": 8.5H; z); 5.09 (d, 1H, H1, J1.2: 3.5 Hz);
3.57 (s, 3H, COOMe ido)
3.43 (s, 3H, COOMe gluco), 2.06 (s, 3H, OAc).

Ce composé 2 qui est un dérivé mono-O-acétylé (en posi- tion 3 sur le 2ème motif) du tétrasaccharide 6, est un intermédiaire potentiel pour la synthèse d'un analogue de ce tétrasaccharide qui ne serait pas sulfaté sur la position 3 du deuxième motif.This compound 2, which is a mono-O-acetylated derivative (in position 3 on the 2nd motif) of tetrasaccharide 6, is a potential intermediate for the synthesis of an analog of this tetrasaccharide which would not be sulfated at position 3 of the second motif.

EXEMPLE 2 - Synthèse du tétrasaccharide 3
Une solution du tétrasaccharide 1 (40 mg) dans un mélange de 1,2-diméthoxyéthane (3 ml) et de méthanol
(lml) est refroidie à -15 C, Une solution aqueuse
M de soude (1 ml) est ajoutée goutte à goutte en 10 mn.EXAMPLE 2 Synthesis of Tetrasaccharide 3
A solution of tetrasaccharide 1 (40 mg) in a mixture of 1,2-dimethoxyethane (3 ml) and methanol
(lml) is cooled to -15 C, an aqueous solution
M of sodium hydroxide (1 ml) is added dropwise over 10 min.

et le mélange réactionnel est agité 5 heures à 0 C. De
l'acide chlorhydrique M est alors ajouté goutte à goutte jusqu'à pH = O et le mélange est versé dans de
l'eau glacée (50 ml). Après extraction avec du chloro
forme (5 fois 5 ml), les phases organiques sont lavées
avec del'eau, sechées (sulfate de sodium) filtrées et
évaporées. and the reaction mixture is stirred for 5 hours at 0 C.
hydrochloric acid M is then added dropwise until pH = 0 and the mixture is poured into
ice water (50 ml). After extraction with chloro
form (5 times 5 ml), the organic phases are washed
with water, dried (sodium sulfate) filtered and
evaporated.

Le résidu est dissous dans du méthanol (1 mi)
et traité par une solution éthérée de diazométhane jusqu'd
persistance de la coloration jaune. Après 30 mn, le
mélange réactionnel est évaporé à sec. Le résidu
est chromatographié sur une colonne de gel de silice
(3 g). L'élution par le mélange acétate d'éthyle/
hexane (2:1, v/v) donne le tétrasaccharide 3 (27 mg,
75%) : P.F 126-127 C (éthanol);[α]D + 55
(cl,chloroforme).The residue is dissolved in methanol (1 mi)
and treated with an ethereal solution of diazomethane up to
persistence of yellow coloring. After 30 minutes, the
reaction mixture is evaporated to dryness. The residue
is chromatographed on a column of silica gel
(3 g). Elution with ethyl acetate /
hexane (2: 1, v / v) gives tetrasaccharide 3 (27 mg,
75%): PF 126-127 C (ethanol); [α] D + 55
(cl, chloroform).

Spectre RMN (90 MHz, CDCl ) : absence totale de
3
signaux OAc(versS =2).
NMR spectrum (90 MHz, CDCl): total absence of
3
OAc signals (versS = 2).

Analyse élémentaire : conforme avec la structure
recherchée.Elementary analysis: consistent with structure
wanted.

EXEMPLE 3 : Synthèse du tétrasaccharide 4. EXAMPLE 3 Synthesis of the tetrasaccharide 4.

A une solution du dérivé 3 (24 mg) dans le DMF (1 ml). To a solution of derivative 3 (24 mg) in DMF (1 ml).

on ajoute le complexe TMA/SO (24 mg). Après une nuit
3
à 50 C, la réaction de sulfatation est complète.
the TMA / SO complex (24 mg) is added. After one night
3
at 50 C, the sulfation reaction is complete.

Du méthanol (0,5 ml) est ajouté au mélange réactionnel puis celui-ci est déposé sur une colonne de Séphadex Lls- 20 équilibrée en chloroforme méthanol (1:1, v/v). Les fractions-contenant 4 sont regroupées. Après ovaporation à sec, le résidu est chromatographié sur gel de sili ce 1O g) dans le mélange acétate d'éthyle/pyridine/acide acétique/eau (160:77:19:42 : v/v/v/v). Les fractions pures sont regroupées. Après concentration à sec, le résidu est passé au travers d'une colonne Dowex 50W x 4. Methanol (0.5 ml) is added to the reaction mixture, which is then deposited on a Sephadex Lls-20 column equilibrated with chloroform methanol (1: 1, v / v). The fractions-containing 4 are grouped together. After dry evaporation, the residue is chromatographed on sili gel (10 g) in an ethyl acetate / pyridine / acetic acid / water mixture (160: 77: 19: 42: v / v / v / v). The pure fractions are grouped. After concentration to dryness, the residue is passed through a Dowex 50W x 4 column.

Na+ éluée avec de l'eau. Le produit obtenu (30 mg) est homogène en chromatographie sur couche mince dans le solvant ci-dessus. Son spectre RMN confirme la structure. Na + eluted with water. The product obtained (30 mg) is homogeneous by thin layer chromatography in the above solvent. Its NMR spectrum confirms the structure.

[α]D 20 = + 39 du (1,méthanol).  [α] D 20 = + 39 of (1, methanol).

EXEMPLE 4 - Synthèse du tétrasaccharide 5 -
Une solution du dérivé 4 (10 mg) dans un mélange de méthanol (1,8 ml) et d'eau (0,2 ml) est agitée sous une pression d'hydrogène de 0,2 bar en présence de Pd/C à 5% (10 mg). Après 95 heures, le cata
liseur est éliminé par filtration. L'analyse en ultra
violet confirme l'absence de noyaux aromatiques. Après
évaporation, le dérivé 5 est utilisé tel quel pour la
preparation du dérivé 6.EXAMPLE 4 - Synthesis of the tetrasaccharide 5 -
A solution of derivative 4 (10 mg) in a mixture of methanol (1.8 ml) and water (0.2 ml) is stirred under a hydrogen pressure of 0.2 bar in the presence of Pd / C at 5% (10 mg). After 95 hours, the catamaran
reader is removed by filtration. Ultra analysis
purple confirms the absence of aromatic nuclei. After
evaporation, derivative 5 is used as it is for the
preparation of the derivative 6.

EXEMPLE 5 - Synthèse du tétrasaccharide 6
Le dérivé 5 obtenu à l'étape précédente,
est dissous dans l'eau (2 ml). Le pH de cette solution
est ajusté à 9,5 ; il est maintenu à cette valeur pendant
toute la durée de la sulfatation. Le complexe TMA/S03
(14 mg) est ajouté. Une deuxième addition est faite après
24 heures (14 mg) Après 48 heures, le pH est amené à 12,
puis à 7, deux heures plus tard. Le mélange réactionne]
est alors chromatographié sur une colonne de Sephadez
G-25 (50 ml). Les fractions contenant le dérivé 6
{détection par réaction colorée des acides uroniques)
sont regroupées, passées au travers d'une colonne de
résine Dowex 50 W x 4 Na puis lyophilisées.EXAMPLE 5 Synthesis of Tetrasaccharide 6
Derivative 5 obtained in the previous step,
is dissolved in water (2 ml). The pH of this solution
is adjusted to 9.5; it is kept at this value for
throughout the duration of sulfation. The TMA / S03 complex
(14 mg) is added. A second addition is made after
24 hours (14 mg) After 48 hours, the pH is brought to 12,
then at 7, two hours later. The mixture reacts]
is then chromatographed on a Sephadez column
G-25 (50 ml). The fractions containing derivative 6
(detection by colored reaction of uronic acids)
are grouped, passed through a column of
Dowex resin 50 W x 4 Na then lyophilized.

On obtient ainsi le tétrasaccharide 6 (2 mg).This gives tetrasaccharide 6 (2 mg).

L'analyse colorimétrique des constituants du dérivé 6 donne 1,84 moles de glucosamine pour 2,06 moles d'acides uroniques. The colorimetric analysis of the constituents of derivative 6 gives 1.84 moles of glucosamine per 2.06 moles of uronic acids.

La structure du dérivé 6 (séquence, anomérie, position desgroupes sulfates) est confirmé par le spectre R::.l (270 MHz, TMS) :# pour les protons anomeres respectivement des ler, 2ème, 3ème et 4ème motifs 4,72 ; 5,30 : 5,55 , et 5,67.  The structure of derivative 6 (sequence, anomerism, position of the sulphate groups) is confirmed by the spectrum R ::. L (270 MHz, TMS): # for the anomeric protons of ler, 2nd, 3rd and 4th motifs respectively 4.72; 5.30: 5.55, and 5.67.

Claims (1)

REVENDICATION CLAIM Tétrasaccharides formés d'un enchainement de motif a' structure acide glucuronique D-glucosamine, acide L-iduronique et D-glucosamine, caractérisés en ce qu'ils répondent à la formule.: Tetrasaccharides formed from a pattern chain with a structure of glucuronic acid D-glucosamine, L-iduronic acid and D-glucosamine, characterized in that they correspond to the formula .:

dans laquelle - R4,R5,R6 et R 10 représentent un atome d'hydrogène, un groupe sulfate, ou un groupe protecteur, l'un au oin de ces radicaux représentant alors dans ce dernier cas un atome d'hydrogène ou un groupe sulfate, - Rl, R2, R 3' R, R8 et Rg représentent un atome d'hy drogène ou un groupement proteteur, - les substituants R, identiques ou différents rpresen- tent un groupe alcoyle, en particulier renfermant 1 à 3 atomes de carbone, de préférence un groupe méthyle ou un cation métallique, notamment le sodium, ou encore un cation organique tel qu'un dérivé de base organique azotée. in which - R4, R5, R6 and R 10 represent a hydrogen atom, a sulphate group, or a protective group, one of these radicals then representing in the latter case a hydrogen atom or a sulphate group , - Rl, R2, R 3 'R, R8 and Rg represent a hydrogen atom or a protecting group, - the substituents R, identical or different, represent an alkyl group, in particular containing 1 to 3 carbon atoms , preferably a methyl group or a metal cation, in particular sodium, or also an organic cation such as a derivative of nitrogenous organic base. - Z représente un précurseur d'un groupement fonctionnel azoté ou ce groupement azoté lui-méme, en particulier un groupe azide, un groupement amine,éventuellement substitué, ou un groupe -NHS03 . - Z represents a precursor of a functional nitrogen group or this nitrogen group itself, in particular an azide group, an amine group, optionally substituted, or a group -NHS03.