FR2518570A1 - ENZYME FOR THE DECOMPOSITION OF A CARBON HYDRATE OF HIGH MOLECULAR WEIGHT, CARBON HYDRATE OBTAINED THEREBY, METHOD FOR SELECTING A MICROORGANISM PRODUCING THE SAME ENZYME AND PROCESS FOR PRODUCING SUCH AN ENZYME - Google Patents

ENZYME FOR THE DECOMPOSITION OF A CARBON HYDRATE OF HIGH MOLECULAR WEIGHT, CARBON HYDRATE OBTAINED THEREBY, METHOD FOR SELECTING A MICROORGANISM PRODUCING THE SAME ENZYME AND PROCESS FOR PRODUCING SUCH AN ENZYME Download PDF

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Abstract

L'INVENTION A POUR OBJET UNE CARBOHYDRASE SOUS FORME UTILISABLE APPELEE SPS-ASE. LA SPS-ASE EST CAPABLE DE DECOMPOSER LE SPS EN PRODUITS DE DECOMPOSITION QUI SE FIXENT EUX-MEMES A UNE PROTEINE, EN MILIEU AQUEUX, A UN DEGRE MOINDRE QUE NE LE FERAIT LE SPS AVANT DECOMPOSITION. LE PROCEDE DE SELECTION DE MICRO-ORGANISMES PRODUISANT UNE SPS-ASE EST BASE SUR LE FAIT QUE LA SOURCE DE CARBONE PRINCIPALE DU MILIEU DE CULTURE EST LE SPS ET SUR UN TEST QUALITATIF SUR LE PLAN D'AGAR. APPLICATION DE LA SPS-ASE DANS LA FABRICATION ET L'INDUSTRIE TRAITANT DES FRUITS ET LEGUMES.THE SUBJECT OF THE INVENTION A CARBOHYDRASE IN USEABLE FORM CALLED SPS-ASE. SPS-ASE IS CAPABLE OF DECOMPOSING SPS INTO DECOMPOSITION PRODUCTS WHICH BIND INTO A PROTEIN IN AQUEOUS ENVIRONMENT TO A LESS DEGREE THAN SPS PRIOR TO DECOMPOSITION WILL. THE PROCESS FOR THE SELECTION OF MICRO-ORGANISMS PRODUCING AN SPS-ASE IS BASED ON THE FACT THAT THE MAIN SOURCE OF CARBON OF THE CULTURE MEDIUM IS SPS AND ON A QUALITATIVE TEST ON THE AGAR PLAN. APPLICATION OF SPS-ASE IN THE FRUIT AND VEGETABLE MANUFACTURING AND INDUSTRY.

Description

Enzyme destinée à la décomposition d'un hydrate de carbone à poidsEnzyme for the decomposition of a carbohydrate by weight

moléculaire élevé, hydrate de carbone ainsi Cbaud procédé de sélection d'un microorganisme produisant ladite  high molecular weight, carbohydrate and Cbaud method of selecting a microorganism producing said

nyme et procédé de production d'une telle enzyme.  nyme and method of producing such an enzyme.

La présente invention concerne une enzyme destinée à la décomposition d'un hydrate de carbone à poids moléculaire élevé, l'hydrate de carbone à poids moléculaire élevé isolé ainsi obtenu, un procédé de sélection d'un microorganisme produisant cette enzyme ainsi qu'un procédé  The present invention relates to an enzyme for the decomposition of a high molecular weight carbohydrate, the isolated high molecular weight carbohydrate thus obtained, a method of selecting a microorganism producing the enzyme, and a method

de production d'une telle enzyme.of producing such an enzyme.

Un procédé de préparation d'une protéine végétale purifiée (pvp) par élimination enzymatique-de la rémanence, sans dissolution et reprécipitation de la protéine, est décrit dans le brevet BE 882 769 La pureté de la pvp pouvant être obtenue par ce procédé connu n'est pas satisfaisante et demande donc à être améliorée Dans les exemples, on a mis en évidence une pureté de la pvp d'environ 85 % Même s'il est possible d'obtenir une pvp présentant une pureté d'environ 90 % suivant le procédé  A process for preparing a purified plant protein (pvp) by enzymatic removal of the remanence, without dissolution and reprecipitation of the protein, is described in patent BE 882 769. The purity of the pvp obtainable by this known method is is not satisfactory and therefore needs to be improved In the examples, it has been demonstrated that the pvp is about 85% pure. Even if it is possible to obtain a pvp with a purity of about 90% depending on the process

connu, ceci n'est possible qu'en utilisant certaines sub-  known, this is only possible by using certain sub-

stances de départ prétraitées, par exemple un concentré de protéines de soja Il serait souhaitable d'obtenir une pureté de pvp supérieure ou proche de 90 % avec une gamrne de substances de départ beaucoup plus large, particulière;-ent de  It is desirable to obtain a purity of pvp of greater than or equal to 90% with a much larger range of starting materials, particularly

la farine de soja décortiquée et dégraissée.  dehulled and defatted soybean meal.

La présente invention repose sur la découverte  The present invention is based on the discovery

surprenante qu'une certaine partie du produit de la décom-  surprising that a certain part of the product of the decom-

position de la rémanence,tel qu'il apparaît pendant le traitement enzymatique précité, à savoir un hydrate de carbone à poids moléculaire élevé soluble dans l'eau, se fixe lui-rême sur une partie de la protéine végétale ccmme il sera expliqué plus en détail ci-après Il en résulte, bien entendu, une pureté moins bonne de la protéine Il est également apparu que l'hydrate de carbone à poids moléculaire élevé est capable de se fixer à des protéines  The position of the remanence, as it appears during the aforesaid enzymatic treatment, namely a water-soluble high molecular weight carbohydrate, is itself fixed on a part of the vegetable protein as it will be further explained. This, of course, results in a lower purity of the protein. It has also been found that the high molecular weight carbohydrate is able to bind to proteins

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d'origine animale.of animal origin.

L'invention vise donc tout particulièrement à fournir une enzyme pour la décomposition des hydrates de carbone à poids moléculaire élevé précités et qui ouvrent la possibilité de produire une pvp de pureté améliorée,  The object of the invention is therefore particularly to provide an enzyme for the decomposition of the abovementioned high molecular weight carbohydrates which opens the possibility of producing a pvp of improved purity.

ainsi qu'un procédé pour la production d'une telle enzyme.  as well as a process for the production of such an enzyme.

Le principe de l'invention peut être décrit de la manière suivante en référence à la figure 1 qui n'indique que les substances existant en tant que solides non dissous alors que tous les surnageants sont omis Une charge de farine de soja a été divisée en deux parties  The principle of the invention can be described in the following manner with reference to Figure 1 which indicates only the substances existing as undissolved solids while all the supernatants are omitted. A load of soy flour has been divided into two parts

égales,partie I et partie Il (colonne a dans la figure 1).  Equals, Part I and Part II (column a in Figure 1).

La partie I a été décomposée par voie protéolytique à un  Part I was proteolytically decomposed to a

p H d'environ 8 au moyen d'ALCALASE (nom cm-mercial pour une-  p H of about 8 using ALCALASE (cm-mercial name for one-

enzyme protéolyticue produite au noven de B lichenformis et vendue Dar NOVO INDUSTRI A/S, 2880 Bagsvoe rd, Danemark) et a été ensuite lavée à p H d'environ 8 afin d'éliminer la quantité totale de protéine et la rémanence a été séparée  proteolytic enzyme produced in B lichenformis noven and sold to NOVO INDUSTRI A / S, 2880 Bagsvoe Rd, Denmark) and was then washed at about pH 8 to eliminate the total amount of protein and the remanence was separated

du surnageant et a été lavée (voir partie I, colonne a et b.  supernatant and was washed (see part I, column a and b.

figure 1) De cette manière, on a isolé une rémanence pure (désignée par rémanence I) (colonne b à la figure) La partie II de la farine de soja n'a pas été traitée; pour plus de concision, la rémanence de la partie II a été dénommée rémanence II (colonne b à la figure 1) Ensuite, la rémanence I et la partie II sont décomposées au moyen  Figure 1) In this way, a pure remanence (designated as remanence I) was isolated (column b in the figure) Part II of the soy flour was not treated; for brevity, the persistence of Part II has been called remanence II (column b in Figure 1). After that, remanence I and Part II are decomposed by means of

d'une pectinase commerciale, par exemple PECTINEX (nom c OM Ier-  commercial pectinase, for example PECTINEX (name c OM I-

cial Dour une enzyme pectolytique produite par Schweizerische Ferment A/G Bâle, Suisse) (voir colonnes b et c à la figure 1) On a découvert de manière inattendue que la partie non dissoute de la rémanence I est beaucoup plus faible que la partie non dissoute de la rémanence II, sur base des bilans d'azote et de la masse de matières sèches (voir figure 1 dans  For a pectolytic enzyme produced by Schweizerische Ferment A / G Basel, Switzerland) (see columns b and c in Figure 1) It has been unexpectedly found that the undissolved portion of the remanence I is much smaller than the non-dissolved part. dissolve remanence II, based on the nitrogen balance and the mass of dry matter (see Figure 1 in

laquelle les surfaces hachurées de la colonne c correspon-  which the hatched areas of column c correspond to

dent aux substances insolubles différentes des protéines dans l'étape indiquée ci-dessus) En outre, si le  different insoluble substances from the proteins in the step indicated above).

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surnageant de la rémanence I traitée à la pectinase est est ajouté à la suspension de protéine de soja à p H 4,5, un  pectinase-treated remanence supernatant is added to the soybean protein suspension at pH 4.5, a

polysaccharide du surnageant est lié à la protéine de soja.  polysaccharide of the supernatant is bound to the soy protein.

Ce polysaccharide du surnageant de la rémanence 1, qui est une partie du produit de décomposition de la, rémanence et qui est nettement soluble dans l'eau en l'absence de protéine de soja mais qui est lié à la protéine de soja au point isoélectrique de la protéine de soja ou autour de ce point,  This polysaccharide of the remanence supernatant 1, which is a part of the remanence decomposition product and which is clearly soluble in water in the absence of soy protein but which is bound to the isoelectric point soy protein of soy protein or around that point,

si la protéine de soja est présente, est désigné par SPS (nolvsaccha-  if the soy protein is present, is designated SPS (nolvsaccha-

ride soluble; voir figure 1 Le SPS présente une dis-  soluble wrinkle; see Figure 1 The SPS presents a

tribution de poids moléculaire comprise entre 5 x 10 et 4,9 x 104 La préparation de SPS isolé apparaît dans le diagramme synoptique représenté à la figure 2 qui recouvre également certains des procédés indiqués à la figure 1 Le problème consiste donc à trouver une enzyme qui est capable de décomposer la SPS de telle manière que les produits de décomposition de SPS ne lient pas la protéine de soja ou lient celle-ci dans une mesure beaucoup moindre que le SPS  Molecular weight of between 5 x 10 and 4.9 x 104 The preparation of isolated SPS appears in the block diagram shown in Figure 2 which also covers some of the processes shown in Figure 1 The problem is therefore to find an enzyme that is able to break down SPS in such a way that SPS decomposition products do not bind soy protein or bind it to a much lesser extent than SPS

ne lie la protéine de soja.does not bind the soy protein.

Bien que la description concerne principalement  Although the description mainly concerns

la décomposition d'une protéine de soja, l'invention n'est pas limitée à une telle protéine mais concerne toutes les espèces de protéines végétales, notamment par exemple les protéines citées dans le brevet BE 992 769, page 1.  the decomposition of a soy protein, the invention is not limited to such a protein but relates to all species of plant proteins, including for example the proteins mentioned in patent BE 992 769, page 1.

Suivant la présente invention, on a à piésent.  According to the present invention, one has to piezent.

trouvé qu'en examinant l'aptitude à décomposer du SPS de soja, il est possible de sélectionner des microorganismes  found that by examining the ability to break down soy SPS, it is possible to select microorganisms

qui sont aptes à produire un composé qui présente une acti-  which are capable of producing a compound which has an activity

vité enzymatique,en decoiposant effectivement le SPS de soja, composé désigné ci-dessous, pour plus de concision, SPS-ase.  enzymatic activity, by actually decoding the soy SPS, compound referred to below, for brevity, SPS-ase.

Par conséquent, sous un premier aspect, l'inven-  Therefore, in a first aspect, the invention

tion concerne une SPA-ase, une carbohydrase sous une forme utilisable et capable de décomposer le SPS de soja dans des  The invention relates to a SPA-ase, a carbohydrase in a usable form capable of decomposing SPS soybean in

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condit-ions appropriées pour donner des produits de décompo-  appropriate conditions for the production of decompo-

sition qui se fixent eux-mêmes sur une protéine en milieu aqueux, à un degré moindre que celui auquel le SPS de soja  which bind themselves to a protein in an aqueous medium, to a lesser degree than that to which soybean SPS

se.serait fixé lui-même, avant-décomposition, sur la même.  it would be fixed itself, before-decomposition, on the same.

protéine dans des conditions correspondantes.  protein under corresponding conditions.

En outre, on a trouvé que cette SPS-ase permettant de dégrader le SPS de soja est capable de dégrader des  In addition, it has been found that this SPS-ase for degrading soy SPS is capable of degrading

polysaccharides similaires au SPS et provenant de légumes.  polysaccharides similar to SPS and from vegetables.

et de fruits, de manière plus complète que ne le font les  and fruit, more fully than do the

pectinases commerciales et les cellulases commerciales.  commercial pectinases and commercial cellulases.

L'expression "forme utilisable" indiquée ci-dessus, vise à exclure de l'invention par exemple une préparation contenant une SPS-ase qui contient des substances toxiques ou qui présente une activité de SPS-ase si basse qu'elle nécessite l'utilisation de plus de 10 % d'une préparation contenant la SPS-ase, par rapport au poids du SPS dans le substrat dans une réaction effectuée pendant 24 heures, à  The expression "usable form" indicated above, is intended to exclude from the invention for example a preparation containing an SPS-ase which contains toxic substances or which has a SPS-ase activity so low as to require use of more than 10% of a preparation containing SPS-ase, based on the weight of the SPS in the substrate in a reaction carried out for 24 hours, at

500 C et au p H optimal de la SPS-ase en question, pour obte-  500 C and at the optimum pH of the SPS-ase, to obtain

nir la décomposition du SPS présentant une importance pratique.  the decomposition of SPS of practical importance.

La pureté de la protéine végétale finale est néces-  The purity of the final vegetable protein is necessary

sairement améliorée par une élimination totale ou partielle du SPS de la protéine végétale finale par rapport à la pureté de la protéine végétale finale obtenue suivant le procédé du brevet BE' 882 769 du fait que' cette protéine  It has been improved by a total or partial removal of the SPS from the final vegetable protein relative to the purity of the final vegetable protein obtained by the process of patent BE '882 769 because this protein

végétale connue était contaminée avec du SPS.  known plant was contaminated with SPS.

On ne sait pas à présent, si la SPS-ase particulière décrite ci-après développe son activité enzymatique à partir  It is not known at present whether the particular SPS-ase described below develops its enzymatic activity from

d'une seule enzyme ou à partir d'un complexe d'enzymes com-  of a single enzyme or from a com-

prenant au moins deux enzymes Certaines recherches semblent indiquer qu'au moins deux enzymes sont responsables de l'effet de décomposition de la SPS-ase,-une de ces enzymes étant capable de n'effectuer qu'une légère décomposition du SPS, après quoi une ou plusieurs-enzymes sont capables d'effectuer une décomposition plus importante du-SPS Une telle-hypothèse ou des hypothèses semblables  taking at least two enzymes Some research suggests that at least two enzymes are responsible for the decomposition effect of SPS-ase, -one of these enzymes being capable of performing only a slight decomposition of the SPS, after which one or more-enzymes are capable of performing a greater decomposition of -SPS Such-hypothesis or similar hypotheses

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ne doivent cependant pas limiter la portée de l'invention.  must not, however, limit the scope of the invention.

Suivant une forme d'exécution particulièrement préférée de l'invention, la SPS-ase est caractérisée en ce qu'elle est capable de décomposer du SPS de soja, en milieu aqueux, pour donner des produits de décomposition  According to a particularly preferred embodiment of the invention, SPS-ase is characterized in that it is capable of decomposing soy SPS in an aqueous medium to give decomposition products.

qui se fixent eux-mêmes sur une protéine végétale, en mi-  who themselves attach themselves to a vegetable protein, half

lieu aqueux, à un degré moindre que celui auquel le SPS de soja se serait fixé lui-même, avant décomposition, sur  water, to a lesser degree than that to which the SPS of soya would have fixed itself, before decomposition, on

la même protéine végétale, en milieu aqueux.  the same vegetable protein, in an aqueous medium.

Suivant une forme d'exécution préférée de la pré-  According to a preferred embodiment of the present invention,

sente invention, la SPS-ase est caractérisée en ce qu'elle permet de décomposer du SPS de soja en milieu aqueux à un p H ne s'écartant pas de plus de 1,5 unités de la valeur 4,5, pour donner des produits de décomposition qui se fixent eux-mêmes sur une protéine de soja, en milieu aqueux, à un dégré moindre que celui auquel le SPS de soja  SPS-ase is characterized in that it is capable of decomposing soybean SPS in an aqueous medium at a pH of not more than 1.5 units of 4.5, to give decomposition products which themselves bind to a soy protein in an aqueous medium to a lesser degree than that to which soybean SPS

se serait fixé lui-même, avant décomposition, sur la pro-  would have set itself, before decomposition, on the

téine de soja, en milieu aqueux.soybean, in an aqueous medium.

Suivant une forme particulièrement préférée de la présente invention la SPS-ase est caractérisée en ce que  According to a particularly preferred form of the present invention the SPS-ase is characterized in that

les produits de décomposition du SPS de soja, après dégra-  the decomposition products of SPS soybean, after degrading

dation complète, se fixent eux-mêmes sur la protéine végé-  dation, bind themselves to the vegetable protein.

tale à un degré représentant une valeur inférieure à 50 %,  to a degree representing a value of less than 50%,

en particulier inférieure à 20 %, que celui auquel le SPS-  in particular less than 20%, that to which SPS-

de soja se serait fixé lui-même, avant décomposition, sur  soybeans would have fixed itself, before decomposition, on

la protéine végétale, en milieu aqueux.  vegetable protein in an aqueous medium.

Suivant une forme particulièrement préférée de la présente invention la SPS-ase est caractérisée en ce  In a particularly preferred form of the present invention SPS-ase is characterized in that

qu'elle réagit positivement au test de la SPS-ase, lors-  that it reacts positively to the SPS-ase test, when

qu'il est exécuté suivant le procédé de détermination qualitative et quantitative de la SPS-ase décrite dans  that it is performed according to the process of qualitative and quantitative determination of SPS-ase described in

cette description.this description.

Suivant une forme d'exécution particulièrement pré-  In a particularly preferred embodiment

féré de la présente invention, la SPS-ase est produite au moyen d'un microorganisme appartenant au genre d'Aspergillus,  of the present invention, SPS-ase is produced by means of a microorganism belonging to the genus Aspergillus,

de préférence appartenant au groupe Aspergillus niger.  preferably belonging to the group Aspergillus niger.

Suivant une autre forme d'exécution particulière-  According to another particular embodiment

ment préféré de la présente invention, la SPS-ase est dérivée des enzymes pouvant être obtenue au moyen de  of the present invention, SPS-ase is derived from enzymes obtainable by means of

Asp aculeatus CBS 101 -43 La mêime SPS-ase peut être obte-  Asp aculeatus CBS 101 -43 The same SPS-ase can be obtained

nue par A Sp japonicus IFO 4408 On a trouvé que Asp.  by A Sp japonicus IFO 4408 Asp has been found.

aculeatus CBS 101 43 produit également des rémanases, des cellulases, des pectinases et des hémicellulases très effi-  aculeatus CBS 101 43 also produces very effective lipases, cellulases, pectinases and hemicellulases.

caces En outre, on a trouvé que toutes les souches appar-  In addition, it has been found that all strains

tenant aux souches Asp aculeatus ou As japonicus ne con-  Asp aculeatus or As japonicus strains do not

viennent pas pour produire une SPS-ase nécessaire dans le cadre de l'invention Ainsi, comme il apparaît dans un  not come to produce an SPS-ase necessary in the context of the invention Thus, as it appears in a

paragraphe ultérieur de la présente description (partie 5),  subsequent paragraph of this description (Part 5),

on a prouvé que Asp japonicus ATCC 20236 ne produit pas suffisamment de SPS-ase pour que celle-ci puisse être détectée par la détermination enzymatique de la SPS-ase  it has been shown that Asp japonicus ATCC 20236 does not produce enough SPS-ase to be detected by enzymatic determination of SPS-ase

décrite dans le présent mémoire descriptif.  described in this specification.

Suivant une autre forme d'exécution particulière-  According to another particular embodiment

ment préférée de l'invention, la SPS-ase est identique au  preferred embodiment of the invention, SPS-ase is identical to

point de vue de l'immunoélectrophorèse à la SPS-ase produi-  point of view of SPS-ase immunoelectrophoresis

te au moyen de Asp aculeatus CBS 101 43 et peut être iden-  using Asp aculeatus CBS 101 43 and can be

tifiée au moyen de la technique de recouvrement électropho-  using electrophoretic

rétique (cfr parties 6 et 7).retique (cf. parts 6 and 7).

Lorsque la SPS-ase est produite par voie microbio-  When SPS-ase is produced microbially

logique, elle est obtenue en mélange avec différentes  logical, it is obtained in mixture with different

substances accompagnantes, particulièrement d'autres enzymes.  accompanying substances, especially other enzymes.

Si on le désire, la SPS-ase en question peut être purifiée,  If desired, the SPS-ase may be purified,

par exemple au moyen des procédés de séparation chromatogra-  for example by means of chromatographic separation methods

phique, comme on le verra plus tard dans ce mémoire (partie 8). Dans Agr Biol Chem 40 ( 1), 87-92, 1976, on décrit qu'une souche de Asp japonicus, ATCC 20236 produit un  as we will see later in this memoir (part 8). In Agr Biol Chem 40 (1), 87-92, 1976, a strain of Asp japonicus, ATCC 20236,

complexe d'enzymes qui-est capable d'effectuer une décom-  enzyme complex that is able to perform a decomposition

position partielle d'un polysaccharide acide dans une sauce de soja, nommée APS, dont une fraction est désignée par APS-1 Ce polysaccharide acide n'est pas identique au SPS,  partial position of an acid polysaccharide in a soy sauce, called APS, a fraction of which is designated APS-1 This acid polysaccharide is not identical to the SPS,

ce qui sera montré plus loin et plus en détail dans ce mémoire des-  what will be shown later and in more detail in this thesis

criptif à la partie 3 Ainsi les chromatooramnes de chromatographie li-  ciphering in part 3 Thus the chromatography chromato-

quide de haute performance (HPLC)de filtration sur gel du SPS et de  high performance (HPLC) gel filtration system of SPS and

-À - "- 2518570-A - "- 2518570

l'APS sont nettement différents, et,en outre, les chromratooramnes de filtration sur gel de l'APS décomposée par la pectinase commerciale Pectolyaseet d'un SPS traité avec la pectinase commerciale Pectolyase sont nettement différents En outre, il n'apparait pas dans cet article que le polysaccharide  APS are distinctly different, and, furthermore, the chromratooramnes of APS gel filtration decomposed by commercial pectinase Pectolyase and of a SPS treated with commercial pectinase Pectolyase are markedly different. Furthermore, it does not appear in this article that the polysaccharide

acide est lié à la protéine de soja et que le polysacchari-  acid is bound to the soy protein and polysaccharide

de acide décomposé n'est pas lié à la protéine de soja ou y  of decomposed acid is not bound to the soy protein or

est lié à un degré nettement inférieur à celui d'un poly-  is significantly lower than that of a poly-

saccharide acide non décomposé On a également prouvé que  saccharide acid undecomposed It has also been proved that

cette souche ne forme pas de SPS-ase en une quantité suffi-  this strain does not form SPS-ase in a sufficient quantity

sante pour une détection au moyen d'une détermination enzy-  for detection by means of an enzymatic determination

matique de la SPS-ase décrite dans cette description Ceci créait  of the SPS-ase described in this description This created

un préjugé à l'égard de toute souche de Asp Japonicus en  prejudices against any strain of Asp Japonicus in

tant que producteur de SPS-ase;^cependant, suivant -  as a producer of SPS-ase; however, following -

l'invention, on a trouvé de manière inattendue quecertaines  the invention, it was unexpectedly found that some

souches de Asp japonicus-sont des producteurs de SPS-ase.  strains of Asp japonicus-are producers of SPS-ase.

Suivant un deuxième aspect, la présente invention concerne le SPS isolé, produit à partir d'une protéine  In a second aspect, the present invention relates to isolated SPS, produced from a protein

végétale brute servant de substance de départ.  raw vegetable as a starting substance.

Un mode d'exécution préféré du SPS isolé suivant la présente invention est caractérisé en ce que la protéine  A preferred embodiment of the isolated SPS according to the present invention is characterized in that the protein

végétale brute consiste en une farine de soja dégraissée.  Crude vegetable is defatted soy flour.

La préparation de ce SPS isolé est décrite dans ce-qui précède,  The preparation of this isolated SPS is described in the foregoing,

en référence à la figure 2.with reference to Figure 2.

Suivant un troisième aspect, la présente inven-  According to a third aspect, the present invention

tion concerne un procédé de sélection d'un microorga-  tion relates to a process for selecting a microorgan-

nisme produisant une SPS-ase permettant de produire la SPS-  producing an SPS-ase to produce the SPS-

ase suivant l'invention, dans lequel le microoraanisme à tester est cultivé S u r u N milieu de fermentation dont la source principale de carbone est le SPS, après quoi un échantillon du milieu de fermentation est analysé Dour la détermination de la SPS-ase et le microorganisme en question est choisi en tant que microorganisme produisant une SPS-ase si l'analyse de détermination de la SPS-ase est  according to the invention, in which the microoraanism to be tested is cultured S uru N fermentation medium whose main source of carbon is SPS, after which a sample of the fermentation medium is analyzed for the determination of SPS-ase and the The microorganism in question is chosen as the microorganism producing an SPS-ase if the SPS-ase determination analysis is

positive.positive.

CBS 101 43 produit également des enzymes solubilisant la  CBS 101 43 also produces enzymes solubilizing the

rémanence,des cellulases, des pectinases et des hémicellu-  persistence, cellulases, pectinases and hemicellulose

lases très efficaces en plus de la SPS-ase et que le com-  in addition to SPS-ase, and that

plexe d'enzymes produit au moyen de la souche Asp aculeatus CBS 101 43 convient extrêmement bien en tant qu'agent des-  Enzyme plex produced with Asp aculeatus strain CBS 101 43 is an excellent candidate for

tiné à la désintégration de parois cellulaires des substan-  for the disintegration of cell walls of substances

ces végétales Ainsi, le complexe d'enzymes produit par Asp aculeatus 101 43 peut être utilisé dans l'industrie  Thus, the enzyme complex produced by Asp aculeatus 101 43 can be used in industry

alimentaire avec d'excellents résultats, pour le traite-  with excellent results, for the treatment of

ment de purées de fruits et de légumes et-pour clarifier et réduire la viscosité lors de la production de jus et de  fruit and vegetable purees and-to clarify and reduce viscosity in the production of juices and

vins; on peut également l'utiliser comme agent de déshydra-  wines; it can also be used as a dehydrating agent

tation (à savoir un agent de décomposition de polysaccha-  tation (ie a polysaccharide decomposition agent

rides et par conséquent de libération de l'eau liée à l'intérieur de la structure polymère des polysaccharides)  wrinkles and consequently release of water bound to the inside of the polysaccharide polymer structure)

dans le traitement de végétaux.in the treatment of plants.

Un cinquième aspect de la présente invention concer-  A fifth aspect of the present invention relates to

ne l'utilisation d'une SPS-ase ou un procédé de décomposi-  use of an SPS-ase or a decomposition

tion de polysaccharides, de préférence des polysaccharides  polysaccharides, preferably polysaccharides

de parois cellulaires de plantes, au moyen d'une carbohy-  of plant cell walls by means of a carbohydrate

drase, procédé dans lequel on met une préparation de SPS-  drase, a process in which a preparation of SPS-

ase suivant la présente invention en contact avec un sub-  according to the present invention in contact with a sub-

strat pour ladite préparation de SPS-ase, en un milieu aqueux, exception faite des décompositions déjà décrites  strat for said preparation of SPS-ase, in an aqueous medium, with the exception of the decompositions already described

dans la demande de brevet danois n 5691/81.  in the Danish patent application No. 5691/81.

Ainsi, on a trouvé, suivant la présente invention, que les préparations de SPS-ase sont des préparations  Thus, it has been found, according to the present invention, that SPS-ase preparations are

d'enzymes efficaces pour la liquéfaction ou la décomposi-  effective enzymes for liquefaction or decomposition

tion partielle ou totale de différentes substances, de préférence des substances végétales, par exemple des fruits et des déchets de plantes, contenant des protéines, de la cellulose, de l'hémicellulose,(par exemple des glucannes, du xylane, des galactanes et de l'arabanne), des gommes, de la pectine, des lipides, de l'inuline, des polyphénols, de l'amidon et des alginates; elles peuvent également être utilisées pour des applications qui y sont apparentées,  partially or completely different substances, preferably vegetable substances, for example fruit and vegetable waste, containing proteins, cellulose, hemicellulose, (for example glucans, xylan, galactans and araban), gums, pectin, lipids, inulin, polyphenols, starch and alginates; they can also be used for related applications,

Suivant un quatrième aspect, la présente inven-  According to a fourth aspect, the present invention

tion concerne un procédé de production de SPS-ase, suivant lequel une souche choisie suivant le procédé ci-dessus de sélection d'un microorganisme produisant une SPS-ase est cultivée dans un milieu nutritif La culture peut être effectuée e N fermentation noyée (basse) ou en  This invention relates to a method of producing SPS-ase, wherein a strain selected according to the above method of selecting a microorganism producing SPS-ase is cultured in a nutrient medium. ) or

fermentation en surface (haute>.surface fermentation (high>.

Un mode d'exécution préféré du procédé suivant  A preferred embodiment of the following process

l'invention est caractérisé en ce que la souche s.  the invention is characterized in that the strain s.

aculeatus CBS 101 43 ou Asp japonicus IFO 4408 est cultivé  aculeatus CBS 101 43 or Asp japonicus IFO 4408 is grown

dans un milieu nutritif.in a nutrient medium.

Suivant un mode d'exécution préféré de l'inven-  According to a preferred embodiment of the invention,

tion, le procédé est caractérisé en ce que la culture.  the process is characterized in that the cultivation.

est effectuée e N culture noyée à un p H compris dans l'intervalle de 3 à 7, de préférence de 4 à 6, à une température comprise dans l'intervalle de 20 à 40 OC, de préférence de 25 à 35 OC et en ce que le milieu nutritif contient des sources de carbone et d'azote et des sels inorganiques.  embedded culture is carried out at a pH in the range of from 3 to 7, preferably from 4 to 6, at a temperature in the range of from 20 to 40 ° C, preferably from 25 to 35 ° C, and the nutrient medium contains carbon and nitrogen sources and inorganic salts.

Suivant un autre mode d'exécution particulière-  According to another particular embodiment

ment préféré de l'invention, le procédé est caractérisé en ce que le milieu nutritif contient de la farine desoja,  In a preferred embodiment of the invention, the method is characterized in that the nutrient medium contains desoja flour,

de préférence grillée.preferably grilled.

Suivant un autre mode d'exécution particulière-  According to another particular embodiment

ment préféré de la présente invention, le procédé est caractérisé en ce que la farine de soja est traitée par une enzyme protéolytique avant d'être utilisée comme composant du substrat, l'enzyme protéolytique étant, de préférence, produite par voie microbiologique au moyen du  In a preferred embodiment of the present invention, the process is characterized in that the soy flour is treated with a proteolytic enzyme before being used as a component of the substrate, the proteolytic enzyme preferably being produced microbiologically by means of

B licheniformis.B licheniformis.

Suivant un autre mode d'exécution préféré de l'invention, le procédé est caractérisé en ce qu'on ajoute une solution de pectine de manière aseptique au bouillon  According to another preferred embodiment of the invention, the process is characterized in that a pectin solution is added aseptically to the broth.

de fermentation pendant la culture.fermentation during the cultivation.

On a trouvé que la souche Asp aculeatus  Asp strain aculeatus was found

voir le tableau ci-dessous dans la description A titre  see the table below in the description

d'exemple pour de telles applications onpeut citer toutes  example for such applications we can cite all

les applications pour lesquelles les pectinases et cellu-  applications for which pectinases and

lases commerciales sont utilisées-de nos jours Différents  commercial lases are used-nowadays different

exemples seront donnés plus loin dans cette description.  examples will be given later in this description.

En ce qui concerne le procédé d'extraction (d'isolation) décrit dans l'exemple 2, par exemple, il faut noter que la préparation de SPS-ase est essentiellement exempte de protéinase, étant donné que le produit final désiré, à savoir la protéine, serait décomposé dans le cas contraire De même, si l'on désire extraire (isoler),  With regard to the extraction (isolation) method described in Example 2, for example, it should be noted that the SPS-ase preparation is essentially free of proteinase, since the desired end product, namely the protein, would be decomposed in the opposite case Similarly, if one wishes to extract (isolate),

d'une substance biologique brute, des substances biologi-  biological substance, biological substances

ques différentes de la protéine, la préparation de SPS-ase utilisée sera essentiellement exempte de toute-enzyme dégradant cette autre substance biologique Une telle préparation de SPS-ase modifiée peut être produite par  protein, the SPS-ase preparation used will be essentially free of any degrading enzyme of this other biological substance. Such a modified SPS-ase preparation may be produced by

inactivation sélective-de l'enzyme indésirée, par fraction-  selective inactivation of the undesired enzyme, by

nement ou par-un autre procédé connu en soi.  or by another method known per se.

Ainsi, un mode d'exécution préféré de la présente invention est caractérisé en ce que la composition est accompagnée par l'isolation ou l'extraction d'une substance  Thus, a preferred embodiment of the present invention is characterized in that the composition is accompanied by the isolation or extraction of a substance

biologique différente d'une protéine de soja et de protéines végé-  biological diversity of soy protein and vegetable protein

tales apparentées d'une substance biologique brui 2 e, la préparation de SPS-ase étant essentiellement exempte de  related substances of a noisy biological substance, the SPS-ase preparation being substantially free of

toute enzyme capable de décomposer ladite substance biolo-  any enzyme capable of decomposing the said biological substance

gique. Suivant la présente invention, on a donc trouvé que les préparations modifiées de SPS-ase (modifiées dans le sens qu'elles sont essentiellement exemptes d'enzymes capables de décomposer la substance biologique à extraire ou à isoler) sont des préparations d'enzymes efficaces pour  cal. In accordance with the present invention, it has therefore been found that modified SPS-ase preparations (modified in the sense that they are essentially free of enzymes capable of decomposing the biological substance to be extracted or isolated) are effective enzyme preparations. for

l'extraction (isolation) de-substances biologiques spéci-  extraction (isolation) of specific biological substances

fiques, par exemple l'amidon, les lipides, les arômes, les  such as starch, lipids, flavorings,

pigments et les essences de substances biologiques brutes.  pigments and essences of raw biological substances.

Plusieurs exemples seront donnés plus tard dans cette des-  Several examples will be given later in this

cription. Suivant un m Dde particulièrement préféré de la présente invention, l'utilisation suivant l'invention est caractérisée en ce que l'un ou plusieurs des produits de réaction (sans distinguer s'ils  scription. According to a particularly preferred embodiment of the present invention, the use according to the invention is characterized in that one or more of the reaction products (without distinguishing whether or not

sont des produits finals recherchés ou des déchets) sont traités ulté-  end products or waste) are subsequently

rieurement en même temps que le traitement par enzyme ou après celui-ci.  at the same time as the enzyme treatment or after it.

Ceci fournit une utilisation plus flexible et pouvant être mieuxadaptée.  This provides a more flexible use and can be better adapted.

Suivant un autre mode d'exécution particulièrement préféré de la présente invention, l'utilisation est caractérisée en ce que le traitement ultérieur consiste en une fermentation alcoolique dans le cas o le produit de réaction est un sucre fermentable Ainsi on  According to another particularly preferred embodiment of the present invention, the use is characterized in that the subsequent treatment consists of an alcoholic fermentation in the case where the reaction product is a fermentable sugar.

fournit un procédé simple et bon marché pour la production d'alcool.  provides a simple and cheap process for the production of alcohol.

Afin de mieux expliciter la nature de la présente invention,  In order to better explain the nature of the present invention,

on se référera à la description qui suit et qui est divisée en diffé-  reference is made to the following description, which is divided into

rentes parties numérotées de 1 à 10 décrivant chacune les détails spé-  parts numbered from 1 to 10 each describing the specific details

cifiques relatifs à la présente invention Les différentes parties sont comne suit:  The various parts are as follows:

1 Préparation du SPS.1 Preparation of the SPS.

2 Caractérisation du SPS, en particulier la distribution  2 Characterization of the SPS, in particular the distribution

du poids moléculaire de celui-ci.molecular weight thereof.

3 Essais prouvant la différence entre SPS et APS.  3 Tests proving the difference between SPS and APS.

4 Sélection de microorganismes produisant de la SPS-ase.  4 Selection of microorganisms producing SPS-ase.

Caractérisation de certains microorganismes formant de  Characterization of certain microorganisms forming

la SPS-ase.SPS-ase.

6 Description générale de la technique de recouvrement  6 General description of the recovery technique

associée à des imnunoélectrophorèses.  associated with immunoelectrophoresis.

7 Caractérisation imnnunoélectrophorétique de la SPS-ase  7 Immunoelectrophoretic characterization of SPS-ase

avec un anticorps polyspécifique et recouvrement.  with a polyspecific antibody and recovery.

8 Purification d'une préparation de SPS-ase.  Purification of a SPS-ase preparation.

9 Dépendance de l'activité à l'égard du p H et de la tem-  9 Dependence of activity on p H and weather

pérature et stabilité d'une SPS-ase.  the temperature and stability of an SPS-ase.

Détermination de l'activité enzymatique.  Determination of enzymatic activity

-.251857-0-.251857-0

PARTIE 1.PART 1.

PREPARATION DU SPS.PREPARATION OF SPS.

Comme déja mentionné précédemment, la substance de départ pour-la préparation du SPS peut être la rémanence de soja C'est pourquoi, on décrira d'abord la préparation  As already mentioned, the starting substance for the preparation of the SPS may be the persistence of soya. This is why the preparation will first be described.

d'une rémanence de soja.a lingering soybean.

La rémanence de soja est une fraction d'hydrate de carbone exempte de protéines (qui, en pratique, peut  Soy remanence is a protein-free carbohydrate fraction (which, in practice, can be

contenir de faibles quantités de lignine et matières miné-  contain small amounts of lignin and

rales), contenue dans la farine de soja dégraissée et décortiquée, ladite fraction d'hydrate de carbone étant insoluble dans un milieu aqueux à p H 4,5 et pouvant être préparée de la manière suivante, en référence a:u tableau  rales), contained in the defatted and dehusked soya flour, said carbohydrate fraction being insoluble in an aqueous medium at pH 4.5 and can be prepared in the following manner, with reference to:

synoptique n 1.synoptic n 1.

La farine de soja dégraissée (Sojamel 13 de Aarhus Oliefabrik A/S) est mise en suspension dans de l'eau désionisée à 50 C dans un proportion pondérale de farine de  The defatted soy flour (Sojamel 13 from Aarhus Oliefabrik A / S) is suspended in deionized water at 50 ° C. in a proportion by weight of flour of

soja à l'eau de 1:5, dans un réservoir contenant un équi-  soybean with water of 1: 5, in a tank containing a

pement de stabilisation de p H et de température On règle le p H à 8,0 au moyen de Na OH 4 N ( 1 I) On effectue une hydrolyse à p H stationnaire aiu moyen d'ALCALASE 0,6 L (une enzyme protéolytique à base de B licheniformis ayant une activité de 0,6 unités Anson par gramme, l'activité'étant déterminée suivant la méthode Anson, comme décrit dans NOVO ENZYME INFOR-t ATION IB No 058 e-GB) Le rapport enzyme/ substrat correspond à 4 % de la quantité de protéines dans la farine de soja (II) Après une hydrolyse pendant une heure, la boue est séparée par centrifugation (III) et on lave (IV), cette opération étant effectuée- deux fois (V, VI, VII) La boue ainsi traitée est-ensuite hydrolysée une fois de plus pendant une heure au moyen d'ALCALASE 0,6 L (VIII,  pH stabilization and temperature stabilization pH was adjusted to 8.0 by means of 4N NaOH (1 I). Hydrolysis was carried out at steady state using 0.6 L ALCALASE (a proteolytic enzyme). based on B licheniformis having an activity of 0.6 Anson units per gram, the activity being determined according to the Anson method, as described in NOVO ENZYME INFOR-T ATION IB No. 058 e-GB) The enzyme / substrate ratio corresponds at 4% of the amount of protein in the soy flour (II) After hydrolysis for one hour, the sludge is separated by centrifugation (III) and washed (IV), this operation being carried out twice (V, VI VII) The slurry thus treated is then hydrolysed once more for one hour by means of 0.6 L ALCALASE (VIII,

IX), de manière similaire à ce qui a été dit-ci-dessus.  IX), similarly to what has been said above.

Ensuite la boue séparée par centrifugation (X) est lavée deux fois (XI, XII, XIII, XIV}, la boue finalement lavée ( 6) étant séchée par pulvérisation (XV) La poudre ainsi produite, séchée par pulvérisation est la rémanence de soja  Then the sludge separated by centrifugation (X) is washed twice (XI, XII, XIII, XIV), the finally washed sludge (6) being spray-dried (XV). The powder thus produced, spray-dried, is the remanence of soya.

servant de matériau brut pour la production de SPS.  serving as raw material for the production of SPS.

Le SPS est la fraction soluble à l'eau de poly-  SPS is the water-soluble fraction of poly-

saccharide qui est obtenue par un traitement classique de  saccharide which is obtained by a conventional treatment of

la rémanence de soja susmentionnée avec de la pectinase.  the aforementioned soybean remanence with pectinase.

Le SPS est préparé de la manière suivante au moyen des 14 étapes réactionnelles indiquées ci-dessous, en référence au  The SPS is prepared in the following manner by means of the 14 reaction steps indicated below, with reference to

tableau synoptiquen 2.synoptic chart 2.

1 On détermine la teneur en matière sèche de la rémanence susmentionnée et on dilue la rémanence de soja dans de l'eau à raison de 2 % de matière sèche et ladite rémanence de soja est maintenue en suspension à 50 C  The dry matter content of the above-mentioned remanence is determined and the persistence of soybeans in water is diluted at a rate of 2% of dry matter and said remanence of soy is kept in suspension at 50 ° C.

dans un réservoir comportant un règlage de température.  in a tank with a temperature setting.

2 On règle-lavaleur du n HE 4,50 au moyen de Na O Hi 6 N. 3 On ajoute en une quantité de 200 g/kg de matière sèche du Pectinex Super concentréL(pectinase commerciale de la Schweizerische Ferment AG, Bâle, Suisse présentant une activité en pectinase de 750 000 MOU, déterminée suivant le feuillet "Détermination of the Pectinase units of Apple Juice (MOU)" du 12 6 1981, disponible à la Schweizerische Ferment AG, Bâle, Suisse) et on ajoute égaaement en quantité de 20 g/kg de matière sèche du Celluclast 200 L (cellulase commerciale décrite dans le feuillet NOVO enzymes, information sheet B-153 e-GB 1000 juillet 1981, disponible chez NOVO INDUSTRIE A/S,Novo Alle, 2880 Bacsvaerd, Danemark) 4 Le contenu du réservoir est maintenu à 50 C pendant 24  The value of HE 4,50 is adjusted using Na 2 O 6 N 3. Supercontained Pectinex (commercial pectinase from Schweizerische Ferment AG, Basel, Switzerland) is added in a quantity of 200 g / kg of dry matter. having a pectinase activity of 750 000 MOU, determined according to the "Determination of the Pectinase Units of Apple Juice (MOU)" leaflet of 12.6.1981, available from Schweizerische Ferment AG, Basel, Switzerland) and is also added in an amount of 20 g / kg dry matter of Celluclast 200 L (commercial cellulase described in the NOVO enzyme sheet, information sheet B-153 e-GB 1000 July 1981, available from NOVO INDUSTRIE A / S, Novo Alle, 2880 Bacsvaerd, Denmark) 4 The contents of the tank are kept at 50 C for 24

*heures en agitant.* hours waving.

3 Les enzymes sont inactivées en augmentant le p H à 9,0  3 The enzymes are inactivated by increasing the pH to 9.0

au moyen de N;a OH 4 N Le mélange réactionnel est main-  by means of N; a OH 4 N The reaction mixture is now

tenu tel quel pendant 30 minutes et le p H est ensuite réajusté à 4,5 au moyen de HC 1 6 N. 6 Le mélange réactionnel est centrifugé et on récupère le  held as it is for 30 minutes and the pH is then readjusted to 4.5 by means of HC 1 6 N. The reaction mixture is centrifuged and the mixture is recovered.

produit de centrifugation ainsi que la boue.  centrifugation product as well as sludge.

7 Le produit de centrifugation de l'étape 6 subit une filtration de contrôle sur un filtre presse (le filtre  The centrifugation product of step 6 undergoes a control filtration on a filter press (the filter

est lavé à l'eau avant la filtration de contrôle).  is washed with water before control filtration).

8 Le filtrat de contrôle est soumis à une ultrafiltratior  8 The control filtrate is subjected to ultrafiltration

à une diafiltration et ensuite encore à une ultrafiltra-  to a diafiltration and then again to an ultrafiltration

tion sur une membrane présentant une valeur de coupure de 30 000 (DDS GR 60-P de De Danske Sukkerfabrikker), en ayant recours aux paramètres suivants: 1 Ultrafiltration correspondant à une concentration de  on a membrane with a cut-off value of 30 000 (DDS GR 60-P from De Danske Sukkerfabrikker), using the following parameters: 1 Ultrafiltration corresponding to a concentration of

volume de 6.volume of 6.

2 Diafiltration jusqu'à ce que le pourcentage en matière sèche dans le perméat soit égal â(I O Brix), 3 Ultrafiltration jusqu'à-environ 15 % de matière sèche  2 Diafiltration until the percentage of dry matter in the permeate is equal to (I O Brix), 3 Ultrafiltration up to about 15% dry matter

dans le concentrat.in the concentrate.

La température est de 50 C, le p H est de 4,5 et la  The temperature is 50 C, the H p is 4.5 and the

pression moyenne de 3 bars.average pressure of 3 bars.

9 Le concentrat soumis à l'ultrafiltration est refroidi  9 The concentrate subjected to ultrafiltration is cooled

jusqu'à 5 C et on ajoute un volume égal d'éthanol à 96 %.  to 5 C and an equal volume of 96% ethanol is added.

10 On récupère le précipité au moyen d'une centrifugeuse.  The precipitate is recovered by means of a centrifuge.

11.Le précipité est lavé deux fois par de l'éthanol dans l'eau à 50 % v/v, correspondant au volume du produit de centrifugation de l'étape 10, c'est-à-dire qu'on effectue  11. The precipitate is washed twice with ethanol in water at 50% v / v, corresponding to the volume of the centrifugation product of step 10, i.e.

deux centrifugations. 12 Le précipité lavé est remis en solution dans l'eau en un volume quitwo centrifugations. The washed precipitate is redissolved in water in a volume which

correspond au volume de concentrat de l'étape  corresponds to the volume of concentrate of the step

9 soumis à ultrafiltration.9 subjected to ultrafiltration.

13.Le liquide de l'étape 12 est soumis à une filtration de  13.The liquid from step 12 is subjected to a filtration of

contrôle sur un filtre de verre.check on a glass filter.

14 Le filtrat clair contenant du SPS pur est lyophylisé.  The clear filtrate containing pure SPS is lyophilized.

251 '8570251 '8570

TABLEAU SY-, 'OPTIQUE Z 1TABLE SY-, OPTICAL Z 1

li O Na OH jusqu'à p H 8 Farine de soja serais 2 e d"i%,drolyse Alcalase O 6 L (E/S= 4 %) yse 1 heure avant déc 11-iargeme p'1-stat 8 T = 50 ' CI Na OH 4 LI 1)roduit de lère centrifugation III 4 "centrifug 1 boue 1 1 vers décharge H ler 1-avace produit -de 2 c centrifugation V cen tri fug 2 boue 2 ' vers décharge H 2 O 2 c lavage T'roduit de trifugation VU r 7 c cen E C_ entrifug 3 boue 3, fers décharge  The amount of soybean flour used was 2%, Alcalase O 6 L (I / O = 4%), 1 hour before dec 11, and p'1-stat 8 T = 50. ## EQU2 ## 1) Centrifugation product III 4 Centrifuge 1 sludge 1 to discharge H 1-avace product 2 c centrifugation V cen tri fug 2 sludge 2 'to discharge H 2 O 2 c wash T trifugation product VU r 7 c cen E C_ entrifug 3 mud 3, irons discharge

C II 1C II 1

Z;ouveau mélange d'hydrolys lJI Na Cii issu, à r, i i = 5 Ilydrolvse 1 avant décharqement pli 50,C) I:aoli, n-duit de 4 c centrîfu:aticn X C(, ntrifug 4 ALCALASE 0,6 L boue 4 vers décharge H 20 ier lavage 1)1 iduit de e centrifugation I I C -r-ntrifug 5  Z: a new mixture of hydrolys I NaIi resulting from, at ri ii = 5 Ilydrolvse 1 before unloading fold 50, C) I: aoli, n-duit of 4 c centrifu: aticn XC (, ntrifug 4 ALCALASE 0.6 L sludge 4 to discharge H 20 ier wash 1) 1 iduit of e centrifugation IIC -r-ntrifug 5

1 E_ -1-1 -1 E_ -1-1 -

247 1 H Décomposition par pectinase et 1, 2, 3, 4,5 cellulose li 1 = 1 5: 24 hetirp, y-  247 1 H Decomposition with pectinase and 1, 2, 3, 4,5 cellulose li 1 = 1 5: 24 hetirp, y

1 Centrifugation -1-1 Centrifugation -1-

I i:'1 traticn-de ccn'rÈlei y j Précipita-lion r _ y - I  I I: 'I' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' 'I

2518570 _2518570 _

r AB-L EiU SYNOPTYQUE No 2 1000 g Pectinex Super Conc L cr Celluclast 250 S kg rémanence séchée par pulvérisation Bnuf, 3 à kg' Ultrafiltration, diafiltration, ultrafiltration  r AB-L SYNOPTYTIC EIU No. 2 1000 g Pectinex Super Conc L Celluclast 250 S kg spray-dried persistence Bnuf, 3 to kg Ultrafiltration, diafiltration, ultrafiltration

(GR60 P) ( 19 à26OC) -(GR60 P) (19 to 26OC) -

T surnageant ic; 2 5 I('z à goe" (décharge) produit de centrifugation  Supernatant ic; 2 5 I ('z to goe' (discharge) centrifugation product

1 _,_ 101 _, _ 10

ité 2 x produit de Centrifugatior 2 x lavage  2 x Centrifugatior product 2 x washing

1 centrifugation-1 centrifugation

1 1 précipité 1 3 Redissolution y1 1 precipitate 1 3 Redissolution y

1 Bc JUP de r)rotéi Drc -1 Bc JUP of r) rotéi Drc -

-:111 de conti Er (décharge)-: 111 de conti Er (discharge)

1 -1 -

y 1 Lyophïlisat 310 g de SPS lyophilisé  Lyophilate 310 g lyophilized SPS

18 1 H 20 __18 1 H 20 __

24-1 de per-24-1 of

méat 1 O récir ymeat 1 O recive y

2 1 H 202 1 H 20

PARTIE 2PART 2

CARACTERISATION DUSPS, EN PARTICULIER DISTRIBUTION DU  CHARACTERIZATION DUSPS, ESPECIALLY DISTRIBUTION OF

POIDS MOLECULAIRE DE CELUI-CI.MOLECULAR WEIGHT THEREOF.

On a déterminé (fig 4), la distribution du poids moléculaire du SPS dont la productioh est effectuée comme indiqué dans ce mémoire, au moyen d'une chromatographie sur gel dans un équipement f IPLC (pompe Waters, modèle 6000, module de données 730 de Waters et réfractomètre R 401 de Waters) On a également déterminé (fig 5) la distribution du poids moléculaire des produits de décomposition du SPS par la SPS-ase suivant le mime brocédé En outre, on a montré par la m éme methode,l'effet de liaison entre la prot Aine de soja et le SPS (fig 6) et l'absence d'effet de liaison entre la protéine de soja et le SPS décomposé par l'agent suivant  The molecular weight distribution of the SPS, the production of which was carried out as indicated in this specification, was determined by means of gel chromatography in IPLC equipment (Waters pump, model 6000, data module 730). of Waters and R 401 refractometer from Waters) The distribution of the molecular weight of SPS decomposition products by SPS-ase according to the same method was also determined (FIG. 5). In addition, it was shown by the same method that binding effect between soy protein and SPS (Fig. 6) and lack of binding effect between soy protein and SPS broken down by the following agent

l'invention (fig 7).the invention (FIG. 7).

La courbe de calibrage (le logarithme du poids moléculaire en fonc-  The calibration curve (the logarithm of the molecular weight

tion de Rf o la valeur Rf pour le glucose est arbitrairement léfinie corme étant 1 et o la valeur Rf d'un dextrane smécifique est définie en tant que temps de rétention de ce dextrane divisé par le temps de rétention du glucose) a été établie au moyen de plusieurs dextranes étalons ayant des poids moléculaires connus (T 4, T 10,T 40, T 70, T 110, T 500) vendus par Pharmacia Fine Chemicals AB, Boite 175, S-75104, Uppsala, Suède On a trouvé la valeur R, pour le maximum de chaque pic de dextrane et le poids moléculaire correspondant a été calculé en tant qu n  where the Rf value for glucose is arbitrarily defined as 1 and where the Rf value of a specific dextran is defined as the retention time of this dextran divided by the glucose retention time) has been set to of several standard dextrans with known molecular weights (T 4, T 10, T 40, T 70, T 110, T 500) sold by Pharmacia Fine Chemicals AB, Box 175, S-75104, Uppsala, Sweden. R value, for the maximum of each dextran peak and the corresponding molecular weight was calculated as n

ou est la valeur moyenne pondérale du poids molécu-  where is the weight-average value of the molecular weight

laire et M est la valeur moyenne numérique du poids molé-  and M is the average numerical value of the molecular weight

n culaire On a utilisé du a Nal O 3 0,1 MI corie éluant pour ce processus chrcmatographique Les colonnes utilisées dans ce processus chromatocraphique sont la colonne PW 5000 de cm suivie par une colonne PW 3000 de 60 cm vendues par Toyo Soda Mtanufacturing Co, Japon On a établi la relation entre le poids moléculaire et la valeur R pour les  The columns used in this chromatographic process are the PW 5000 cm column followed by a 60 cm PW 3000 column sold by Toyo Soda Mtanufacturing Co, which is used for this chromographic process. Japan The relationship between molecular weight and R-value has been established for

dextranes indiqués ci-dessus de cette manière, cfr fig 3.  dextrans indicated above in this way, see fig 3.

A partir de la fig 4, on peut calculer que le SPS présente une distribution de poids moléculaire qui est Islis O caractérisée par une valeur ew d'environ 5,4 x 105 et par w 4 une valeur;i d'environ 4,2 x 10 Il apparaît également n dans cette figure que le chromatogramme présente deux pics distincts à un temps de rétention de 34,5 minutes ( 6 %) correspondant à un poids moléculaire d'environ 5 x 10 et  From Fig. 4, it can be calculated that the SPS has a molecular weight distribution which is Islis 0 characterized by a value ew of about 5.4 x 105 and by w 4 a value of about 4.2 It also appears n in this figure that the chromatogram has two distinct peaks at a retention time of 34.5 minutes (6%) corresponding to a molecular weight of about 5 x 10 and

a un temps de rétention de 47,12 minutes ( 67 %) correspon-  has a retention time of 47.12 minutes (67%) corresponding to

dant a un poids moléculaire d'environ 4,9 x 10 Il  It has a molecular weight of about 4.9 x 10

apparaît également de cette courbe qu'il existe un épaule-  also appears from this curve that there is a shoulder-

ment entre ces deux pics à un temps de rétentibn de 41,25 minutes ( 27 %) correspondant à un poids moléculaire de 2,8 x 105 Après la décomposition du SPS par la SPS-ase, le mélange d'hydrolyse a été filtré sur membrane et le filtrat a été soumis à la chromatographie On a trouvé qu'environ 55 % du SPS est décomposé en monosaccharide, disaccharide ' et trisaccharide et que le résidu de 45 % a été décomposé en un polymère présentant trois pics correspondant au poids moléculaires suivants: 5 x 104, 10 et 44 x 103, cfr fig 5.  between these two peaks at a retention time of 41.25 minutes (27%) corresponding to a molecular weight of 2.8 × 10. After the SPS decomposition by SPS-ase, the hydrolysis mixture was filtered on membrane and the filtrate was subjected to chromatography. It was found that about 55% of the SPS was decomposed into monosaccharide, disaccharide and trisaccharide and that the 45% residue was decomposed into a polymer having three peaks corresponding to the following molecular weights : 5 x 104, 10 and 44 x 103, see fig 5.

Dans le but de démontrer l'effet de la liaison entre la pro-  In order to demonstrate the effect of the link between the

téine de soja et le-SPS et la réduction substantielle de l'effet de liaison entre la protéine ce soja et le SPS décomposé au moyen de la SPSase, on a effectué les essais suivants 3 % de SPS dans un tampon acétate 0,10 M à pli 4,5 est ajouté à une boue d'un isolat de soja (Purina E 500) afin de générer une suspension présentant le rapport isolat/ SPS correspondant à 10:1 On fait incuber cette suspension pendant 18 heures dans un bain agité à 50 o C Apres incubation, la suspension est centrifugée et le surnageant cla r es L analysé par IIPLC con me décrit précédem ent En comparant la fig 6 à la fig 4, il apparaît que le SPS est  soy protein and SPS and substantially reducing the binding effect between soy protein and SPSase-decomposed SPS, the following assays were performed on 3% SPS in 0.10 M acetate buffer. 4.5 fold is added to a slurry of a soy isolate (Purina E 500) to generate a suspension having the isolate / SPS ratio corresponding to 10: 1. This suspension is incubated for 18 hours in a shake bath. 50 ° C. After incubation, the suspension is centrifuged and the supernatant cleaves L analyzed by IIPLC as described above. Comparing FIG. 6 to FIG. 4, it appears that the SPS is

complètement adsorbé sur l'isolat de soja.  completely adsorbed on the soy isolate.

Le-m mre processus que celui mentionné dans le paragraphe précédent est mis en oeuvre avec une solution à 3 % de SPS hydrolysé avec une SPS-ase produite par CBS 101 43 (fig 7) En comparant la fig 7 et la fig 5, on constate qu'aucun composé du SPS hydrolysé présentant un  The same process as mentioned in the previous paragraph is carried out with a 3% solution of SPS hydrolysed with an SPS-ase produced by CBS 101 43 (FIG. 7). Comparing FIG. 7 and FIG. notes that no hydrolyzed SPS compound with

poids moléculaire inférieurà-environ 104 n'est adsorbé sur l'iso-  molecular weight of less than about 104 is adsorbed on the iso-

lat de soja L'hydrolyse réduit la liaison quantitative jusqu'à environ 10 à 15 % par rapport à la liaison du SPS à la protéine de soja. Une analyse R 4 K du SPS, dont la production est  Soyl Hydrolysis reduces quantitative binding to about 10 to 15% over SPS binding to soy protein. An R 4 K analysis of the SPS, whose production is

effectuée commrse indiqué dans ce mémoire, révèle la composi-  made in this paper, reveals the composi-

tion approximative suivante du SPS: 1) acide c-galacturonique en une quantité d'environ 45 %, approximativement 40 % de la quantité totale d'acide c-galacturonique étant présentsen tant qu'ester méthylique. 2) rhamnopyrannose en une quantité d'environ 20 %, 3) galacto O yrannose en une quantité d'environ 15 %, et  Next approximate amount of SPS: 1) α-galacturonic acid in an amount of about 45%, approximately 40% of the total amount of α-galacturonic acid being present as methyl ester. 2) rhamnopyranose in an amount of about 20%, 3) galacto Oyrannose in an amount of about 15%, and

t 5 4) -1 xylopyrannose en une quantité d'environ 20 %.  t 4) -1 xylopyranose in an amount of about 20%.

Les constituants semblent être présents suivant une  Constituents appear to be present following a

structure comprenant une chaîne principale rhamnogalacturo-  structure comprising a rhamnogalacturo main chain

nicue et des chaînes latérales de xylose et de galactose.  nicue and side chains of xylose and galactose.

L'hydrolyse acide co>lète du SPS ( 8 heures dans H 2504 IN) et l'analyse par chromatographie en couche mince (TLC)ultérieure ont révélé qu'il y a également de faibles quantités de monosaccharides fucose et  Acidic acid hydrolysis of SPS (8 hours in H 2504 IN) and subsequent thin layer chromatography (TLC) analysis revealed that there are also small amounts of fucose monosaccharide and

arabinose dans le SPS hydrolysé.arabinose in the hydrolysed SPS.

Une analyse HPLC du SPS décomposé par le complexe d'enzymes SPS-ase formé par CBS 101 43 montre une importante réduction du poids moléculaire De manière semblable, le spectre R M du SPS décomposé con-me indiqué cidessus montre qu'une majeure partie des groupes ester a disparu et que, également, la teneur en xylose et galactose dans la substance A poids moléculaire plus élevé a diminué Le spectre P-l de la partie du produit de décomposition du SPS qui précipite par addition d'un volume d'éthanol à un volume de produit de décompositiondu SPS est semblable au spectre R- :; du SPS qui a subi les modifications susmentionnées en ce qui concerne les groupes ester et la teneur en xylose et galactose  HPLC analysis of the SPS decomposed by the SPS-ase enzyme complex formed by CBS 101 showed a significant reduction in molecular weight. Similarly, the decomposed MR spectrum of the decomposed SPS shows that most of the groups The ester has disappeared and the xylose and galactose content in the higher molecular weight substance has also decreased. The spectrum P1 of the part of the SPS decomposition product which precipitates by adding one volume of ethanol to one volume. decomposition product of the SPS is similar to the R- spectrum; of the SPS which has undergone the abovementioned modifications as regards the ester groups and the xylose and galactose content

PARTIE 3PART 3

ESSAIS PROUVANT LA DIFFERENCE ENTRE SPS ET APS  TESTS PROVIDING THE DIFFERENCE BETWEEN SPS AND APS

On a préparé le APS comme mentionné dans-Agr.  APS was prepared as mentioned in Agr.

Biol Chem, Vol 36, No 4, p 544 550 ( 1972).  Biol Chem, Vol 36, No. 4, 544,550 (1972).

On a ensuite hydrolysé ce polysaccharide et le SPS avec ci'fférentes cenzymes, puis on a soumis le mélange de décomoresition à une chromatographie sur gel par un équipement Hi PLC, comme mentionné dans la deuxième  This polysaccharide and SPS were then hydrolysed with various cenzymes, and then the decomorption mixture was subjected to gel chromatography by Hi PLC equipment, as mentioned in the second one.

partie, "Caractérisation du SPS, en particulier la dis.  part, "Characterization of the SPS, especially the dis.

tribution du poids moléculaire de celle-ci".  tribution of the molecular weight of it ".

Plus précisément, on a effectué les hvdrolyses par traitement d'une solution de 25 ml de 2 % de APS ou de 2 % de SPS dans un tampon acetate 0, 1 M ayant un p H-de 4,5 par 10 mg de KRF 68 ou 30 mg de Pectolyase Le IRF 68 est une préparation de SPS-ase dont la fabrication est décrite à l'exemple 1 Les résultats sont repris dans le tableau suivant:  Specifically, the hydrolyses were performed by treating a 25 ml solution of 2% APS or 2% SPS in 0.1 M acetate buffer having a pH of 4.5 per 10 mg of KRF. 68 or 30 mg of Pectolyase The IRF 68 is a SPS-ase preparation the manufacture of which is described in Example 1. The results are shown in the following table:

PARTIE 4PART 4

SELECTION DE MICROORGANISMES PRODUISANT DE LA SPS-ASE.  SELECTION OF MICROORGANISMS PRODUCING SPS-ASE.

Le microorganisme à tester est soumis à une incubation sur un substrat incliné d'agar présentant une  The microorganism to be tested is incubated on an inclined substrate of agar having a

cor mosition qui permet la croissance du microorganisme.  cor mosition that allows the growth of the microorganism.

Aprè's une croissance initiale sur le substrat incliné d'agar, le microorganisme est transféré dans un substrat  After initial growth on the slanted agar substrate, the microorganism is transferred to a substrate

principal liquide dans lequel la source de carbone princi-  main liquid in which the principal carbon source

pale est le SPS (préparé comme indiqué), dans lequel la Poivsaccharide| Enzym-e J Chrcmatogranme Polysaccharide _ __ IIPLC sur gel De Cfc Sép JO I I l I I l' 'as e APS ct ' fig 8 x APS KRF 63 fici9 x SPS r ectc fig 10 x l_.ase S PS,-Ut F 68 fig 5 source d'azote est du NO 3,NH 4 de l'urée, des acides  pale is the SPS (prepared as indicated), in which the Poivsaccharide | Enzyme J Chromatogranme Polysaccharide _ __ IIPLC on gel Cfc Sep O II II II APS and Fig 8 x APS KRF 63 fici9 x SPS r ectc fig 10 x l_ase S PS, -Ut F 68 fig 5 source of nitrogen is NO 3, NH 4 of urea, acids

aminés libres, des protéines ou d'autres composés conte-  free amines, proteins or other compounds containing

nant de l'azote et qui contient en outre, un mélange de sels nécessaires et de vitamines, de préférence sous forme d'un extrait de levure La composition du substrat prin- cipal dépend du genre du microorganisme, la considération principale consistant en ce que le substrat principal est capable de supporter la croissance et le métabolisme du microorganisme Lorsque la croissance a eu lieu pendant une durée adéquate, de l'ordre de 1 à 7 jours, en fonction de la vitesse de croissance du microorganisme en question, on analyse un échantillon du bouillon de culture pour la  Nitrogen and which additionally contains a mixture of necessary salts and vitamins, preferably in the form of a yeast extract. The composition of the main substrate depends on the kind of the microorganism, the main consideration being that the main substrate is able to support the growth and the metabolism of the microorganism. When the growth has taken place for a suitable duration, of the order of 1 to 7 days, depending on the growth rate of the microorganism in question, a sample of the culture broth for the

détermination de la SPS-ase suivant la détermination enzy-  determination of SPS-ase following the determination

matique de la SPS-ase décrite dans cette description ou  of the SPS-ase described in this description or

suivant toute autre détermination de SPS-ase adaptée à des utilisations spécifiques de la SPS-ase différentes de  according to any other SPS-ase determination adapted to specific uses of SPS-ase different from

l'utilisation en tant que composant d'un agent de décompo-  use as a component of a decomposition agent

sition de la rémanence de soja.seance persistence.

Afin d'avoir une technique plus sensible pour la détermination de l'activité enzymatique, on peut abaisser  In order to have a more sensitive technique for the determination of enzymatic activity, one can lower

la température à 40 C et on peut augmenter le temps d'incu-  the temperature at 40 C and can increase the incubation time

bation à 20 heures pendant la détermination de l'activité de SPS-ase, des antibiotiques pouvant être ajoutés au  at 20 hours during the determination of SPS-ase activity, antibiotics that can be added to

substrat dans le but d'éviter une infection.  substrate in order to avoid an infection.

Par cette technique, on peut trouver d'autres microorganis-  By this technique, one can find other microorganisms

mes produisant de la SPS-ase appartenant au genre Aspergillus ainsi  my producing SPS-ase belonging to the genus Aspergillus as well

qu'à d'autres genres.than to other genres.

PARTIE 5PART 5

CARA Cr ERISATION DE CERTAINS MICROORGANISMES FORMA@T DE LA SPS-ASE  CARA CREATION OF CERTAIN MICROORGANISMS FORMA @ T OF SPS-ASE

Par la technique de sélection pour des microorga-  By the selection technique for microorganisms

nismes produisant de la SPS-ase indiquée dans ce mémoire descriptif, on a trouvé que les microorganismes cités dans la partie supérieure du tableau suivant sont des producteurs de SPS-ase Le tableau contient également une souche appartenant à l'espèce Asp ja Donicus qui n'est pas un producteur de SPS-ase Une identification courte des souches indiquées' ci-dessus peut être trouvée dans les catalogues de culture suivants List of Cultures 1978, Centraalbureau voor  SPS-ase species indicated in this specification, the microorganisms listed in the upper part of the following table have been found to be SPS-ase producers. The table also contains a strain belonging to the species Asp ja Donicus which It is not a producer of SPS-ase. A short identification of the strains indicated above can be found in the following culture catalogs List of Cultures 1978, Centraalbureau voor

Schimmelcultures, Baarn, Pays-Bas.Schimmelcultures, Baarn, Netherlands.

List of Cultures, 1972, 5 è édition, de l'"Institute for Fermentation" Osaka, 17-85,Juso -honmachi 2-Chorite, Yodogawa-ku, Osaka 532, Japon The American Type Culture Collection Catalogue of Strains I, 14 è édition 1980, 12301 Parklawn Drive,  List of Cultures, 1972, 5 th edition, Osaka Institute for Fermentation, 17-85, Juso-honmachi 2-Chorite, Yodogawa-ku, Osaka 532, Japan The American Type Culture Collection Catalog of Strains I, 14 1980 edition, 12301 Parklawn Drive,

Rockville, Maryland 20852, Etats-Unis d'Anmérique.  Rockville, Maryland 20852, United States of America.

Toutes les souches du tableau indiqué ci-dessus  All the strains of the table indicated above

correspondent étroitement à la description taxonomique-de S'  closely match the taxonomic description-of S '

espèces Asp japonicus et Asp aculaétus décrites dans "The genus Aspergillus" de Raper et Fennell, 1965 (voir  species Asp japonicus and Asp aculaetus described in "The genus Aspergillus" by Raper and Fennell, 1965 (see

particulièrement les pages 327 à 330).  particularly pages 327 to 330).

PARTIE 6PART 6

DESCRIPTP'ION ' GE ERALE DE LA TECHNIQUE DE RECOUVREMENT  GE ERAL DESCRIPTION OF THE RECOVERY TECHNIQUE

ASSOCIEE A r ES I",MUN'OELECTROPHIORESES.  ASSOCIATED WITH I, MUN'OELECTROPHIORESES.

La demanderesse a dévelo Dpé un procédé donommé "tech-  The applicant has developed a process known as "technical

niaue de recouvrement de top-a Tar" nour identifier les caposants individuels d'un complexe d'enzymes par immunoelectrophorèse croisée au moyen d'un anticorps polyspécifique pourtous les cc osants d'enzyme du complexe d'enzymes Le -procédé est 7 roducteurj e -S ascEspèces Dénomrination Premier 2.e SF S-asóI Epce Js.: I de la Dénomination dépôt Oui |;on j ajo laédemnanderesse officielle année x x A 805 CBS 101 43; DSI 1 M 2344-1943 x x A 1443 IFO 4408; DSM 23461950 -x x A 1384 ATCC 20236-; DSM 23451969 basé sur le fait que les enzymes sont encore actives après la liaison spécifique entre l'enzyme et l'anticorps ou, exprimé de manière différente, le procédé est basé sur le fait que le site enzymatique actif n'est pas identique au site de la liaison enzyme- anticorps Les complexes enzyme-anticorps précipitent en tant qu' arcs distincts dans le gel pendant l'électrophorèse La plaque de gel est recouverte avec du SPS soluble dans' diu"top-agar' Après chauffage à 45 C pendant 20 heures dans une atmosphère ayant une humidité relative de 100 %, l'arc qui possède une activité de SPS-ase apparaît en tant que zone claire dans la couverture de SPS après précipitation par un mélange de parts &,ales en voiic d'éthanol et d'acétone, lorsqu'on  The method is designed to identify the individual caposants of an enzyme complex by cross-immunoelectrophoresis using a polyspecific antibody for all enzymes in the enzyme complex. -This designation first 2.e SF S-asoI Credit Js .: I of the Denomination Deposit Yes |; I am the official indemnifier year xx A 805 CBS 101 43; DSI 1 M 2344-1943 xx A 1443 IFO 4408; DSM 23461950 -xx A 1384 ATCC 20236-; DSM 23451969 based on the fact that the enzymes are still active after the specific binding between the enzyme and the antibody or, expressed differently, the method is based on the fact that the site Enzymatic active is not identical to the site of enzyme-antibody binding The enzyme-antibody complexes precipitate as distinct arcs in the gel during electrophoresis The gel plate is coated with SPS soluble in 'diu' top- agar 'After heating to 4 At 20 ° C. for 20 hours in an atmosphere having a relative humidity of 100%, the arc which has SPS-ase activity appears as a clear zone in the SPS cover after precipitation by a mixture of particles in water. ethanol and acetone, when

regarde du dessus contre up fond noir Les arcs qui ne présen-  look from above against black background The arches that do not present

tcmt pas d'activité SPS-ase restent invisibles.  tcmt no SPS-ase activity remain invisible.

PARTIE 7.PART 7.

CARACTERISATION I' -I Ur NOELECTROPHORETIQUE DE LA SPS-ASE AVEC UN ANTICORPS POLYSPECIFIQUE ET RECOUWRE 1 E Nt T. On a irmmunisé des lapins par le complexe d'enzymes contenant la SPS-ase Cbtenu par fermentation de Aspergillus aculeatus CBS 10 11 o 43, comme indiqué dans  NO-ELECTROPHORETIC CHARACTERIZATION OF SPS-ASE WITH A POLYSPECIFIC ANTIBODY AND RECOVERY OF E T. T. Rabbits were immunized with the enzyme complex containing SPS-ase Cbtenu by fermentation of Aspergillus aculeatus CBS 10 11 43 as indicated in

l'exen Dmple 1 (KRF 68) et on a récupéré l'anticorps polyspé-  Exen Sample 1 (KRF 68) and the polyspec antibody was recovered.

cifique d'une manière connue en soi Au moyen de cet  in a manner known per se By means of this

anticorps poiyspécifique on a effectué une immunoélectro-  polysaccharide antibody, an immunoelectrochemical

phorèse croisée du complexe d'enzymes obtenu par fermentation de l'Aspergjillus aculeatus CBS 101 43, comme indiqué à l'exemple I (KRF 68), i'immunoélectrophorèse croisée ayant été décrite par N l Axelser et autres, dans "A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis", Eune édition/ 1977 On se réfère à la fig 11 qui montre les arcs correspondant aux différentes protéines produites par le microorcanisme On a trouvé, au moyen de la"technique de recouvrnement de "top-agar" décrite précéde mment, que la surface  cross-phoresis of the enzyme complex obtained by fermentation of Aspergillus aculeatus CBS 101 43, as indicated in Example I (KRF 68), cross-immunoelectrophoresis having been described by N. Axelser et al., in "A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis, Eune édition / 1977 Referring to Fig. 11 which shows the arcs corresponding to the different proteins produced by the micro-mechanism, it has been found, by means of the "top-agar" coating technique described above, that the surface

hachurée correspond à la SPS-ase.hatched corresponds to the SPS-ase.

Si l'hypothèse susmentionnée supposant que la SPS-ase consiste en au moins deux enzymes est correcte, la surface hachurée est la surface dans laquelle se trouvent toutes les enzymes responsables de l'activité de SPSase Si, suivant d'autres modes d'exécution de la présente invention, on peut séparer des enzymes par irmunoélectrophorèse de telle manière qu'elles ne couvrent aucune surface mutuelle, on peut-encore identifier une  If the above assumption that SPS-ase consists of at least two enzymes is correct, the hatched area is the area in which all enzymes responsible for SPSase Si activity are located, according to other embodiments. of the present invention, enzymes can be separated by immunoelectrophoresis so that they do not cover any mutual surface, it is possible to further identify a

partie de l'activité de SPS-ase aul moyen d'immunoélectro-  part of SPS-ase's activity in the medium of immunoelectro-

phorèse avec un recouvrement avec à la fois le SPS et une  phoresis with overlap with both the SPS and a

pectinase commerciale.commercial pectinase.

PARTIE 8.PART 8.

PURIFICATION D'UNE PREPARATION DE SPS-ASE.  PURIFICATION OF A PREPARATION OF SPS-ASE.

On a effectué la purification de la préparation  Purification of the preparation

de SPS-ase KRF 92 (voir exemple 1) par échange d'ions.  SPS-ase KRF 92 (see Example 1) by ion exchange.

Le tampon est le Tris (tris-hvdroxvnéthvlamino-méthane ( 50 m 1) qui est réglé à p H 7 au moyen de HC 1 La colonne est une colonne K 5/30 vendue par Pharmacia, Suede La substance d'échange d'ions est du DEAE-trisacryl vendu par LKB, Bromma, Suède ( 300 ml) La vitesse de passage est de  The buffer is Tris (tris-hydroxymethyl) methane (50 m 1) which is adjusted to pH 7 using HC 1. The column is a K 5/30 column sold by Pharmacia, Sweden. The ion exchange material is DEAE-trisacryl sold by LKB, Bromma, Sweden (300 ml) The speed of passage is from

ml/heure.ml / hour.

On a dissous 15 g de la préparation de SPS-ase KRF 92 dans 450 ml de I 120 at 6 C et toutes les opérations  15 g of the SPS-ase KRF 92 preparation were dissolved in 450 ml of I 120 at 6 C and all the operations

indiquées ci-dessous ont été effectuées entre 6 et 10 C.  indicated below were made between 6 and 10 C.

On a réglé le p H à 7,0 au moyen de Tris 1 La colonne a été équilibree au moyen du tampon et on a ensuite introduit l'"chantillon de SPS-ase dans la colonne On a mesuré OD 280 (densité optique à 280 nm) et la conductivité de l'éluat; voir à la fig 12 La fraction 1 correspond à l'éluat qui n'est pas lié à la substance d'échange d'ions Ensuite la colonne a été lavée avec 2000 ml de tampon, ce cui donne la fraction 2 On a ensuite établi un gradient de Na Cl 0-500 iri ce crui donne les fractions 3 9 Les neuf fractions ont été concentrées à 200 ml et ont été dyalisées contre l'eau à une conductivité de 2 m Si par dialyse (Hollow Fiber DP 2 de Amicon, Massachussetts, U S A) Ensuite les neuf fractions ont été lyophilisées Uniquement les  The pH was adjusted to 7.0 by means of Tris 1. The column was equilibrated with the buffer and the SPS-ase sample was then introduced into the column OD 280 (optical density 280 ° C.). nm) and the conductivity of the eluate, see Fig. 12 Fraction 1 corresponds to the eluate which is not bound to the ion exchange substance. Then the column was washed with 2000 ml of buffer, This gives the fraction 2. A gradient of NaCl 0-500 was then obtained, giving the fractions. The nine fractions were concentrated to 200 ml and were dyalized against water at a conductivity of 2 m. by dialysis (Hollow Fiber DP 2 from Amicon, Massachussetts, USA) Then the nine fractions were freeze-dried.

fractions 1 et 2 présentaient une activité de SPS-ase.  Fractions 1 and 2 exhibited SPS-ase activity.

La fraction 1 a été purifiée ultérieurement par une filtration sur gel On a dissous 1,5 g de la fraction 1 dans 10 ml d'acétate de sodium 50 m M ayant un EDH de 4,5 (KCl 500 m M) La colonne est une colonne de 2,5 x 100 cm de LKB La substance servant à la filtration sur gel est le Sephacryl S200 de Pharmacia, Suède La vitesse de passage est de 30 ml/heure Les fractions contenant des substances ayant un poids moléculaire compris entre 70 000 et 100 000, calibrées avec des protéines globulaires, contenaient un complexe d'enzymes-désigné par facteur G qui ne peut décomposer le SPS lorsque l'on pratique l'essai suivant le test qualitatif d'agar; cependant, le SPS est décomposé suivant le test qualitatif d'agar lorsque l'on rélange le facteur G avec une pectinase Ona trouvé que le facteur G est capable de séparer le galactose, le fucose et certains acides galacturoniques du SPS; mais le produit de décomposition principal suivantl'analyse HPLC est encore un oroduit à poids moléculaire élevé ressemblant  Fraction 1 was purified subsequently by gel filtration. 1.5 g of fraction 1 was dissolved in 10 ml of 50 mM sodium acetate having an EDH of 4.5 (KCl 500 mM). 2.5 x 100 cm column of LKB The gel filtration material is Sephacryl S200 from Pharmacia, Sweden. The rate of flow is 30 ml / hour. The fractions containing substances having a molecular weight between 70,000 and 100,000, calibrated with globular proteins, contained a G-factor-designated enzyme complex that can not decompose the SPS when performing the assay following the qualitative agar test; however, the SPS is decomposed according to the qualitative agar test when the factor G is reassembled with a pectinase. It has been found that the G factor is capable of separating galactose, fucose and certain galacturonic acids from the SPS; but the main decomposition product following the HPLC analysis is still a high molecular weight product resembling

très fort au SPS.very strong at the SPS.

PARTIE 9.PART 9.

DLEPENDAI CE DE L'ACTIVTIE A L'EGARD DU pl I ET DE LA TEMPERA-  DPEPENDAI CE OF THE ACTIVITY WITH REGARD TO THE PIP I AND THE TEMPERA-

T'Rs E Tr S/LBILITE D'Ui L SPS-ASE La fig 13 montre l'uctivité en fonction du p H de la préparation de SPS-ase XRF 68 De pli 2,7 à 3,5 on a utilisé un système de tampon à l'acide formique et de p H  FIG. 13 shows the activity as a function of the pH of the SPS-ase XRF preparation. From 2.7 to 3.5, a system was used. of formic acid buffer and p H

3,7 à 5,5 on a utilisé un système de tampon à l'acétate.  3.7 to 5.5 an acetate buffer system was used.

La fig 14 montre l'activité en fonction de la  Fig. 14 shows the activity according to the

texoérature de la préparation de SPS-ase KRF 68.  texoerature of the preparation of SPS-ase KRF 68.

La fig 15 montre la stabilité thermique de la  Fig. 15 shows the thermal stability of the

préparation de SPS-ase KRF 68.preparation of SPS-ase KRF 68.

PARTIE 10PART 10

DETERMINATION DE L'ACTIVITE ENZYMATIQUE.  DETERMINATION OF THE ENZYMATIC ACTIVITY.

Le tableau repris ci-dessous donne un apçrçu des différentes déterminations de l'activité enzymatique relevant de la présente invention Définition de l'unité d'activité  The table below gives an indication of the different determinations of the enzymatic activity of the present invention. Definition of the unit of activity

et description de la détermination de  and description of the determination of

l'activité enzymatique Genre d'activité,ixiblique Décrit plus désignationment loin dans ce Erzye abrégée disponible mémoire Référence SPS-ase SPS-ase X Solubi 1 RU x lisantla VR J_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ r a r- aenc e,_'_' SRU ':120 x Protéase HUT x Ce lulase C x 2 PU x 3  enzymatic activity Type of activity, ixiblic Describes more designationment far away in this Erzye abbreviated available memory Reference SPS-ase SPS-ase X Solubi 1 RU x reading VR J_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ ra r- aenc e, '' SRU ': 120 x Protease HUT x This lulase C x 2 PU x 3

?GE x 4.GE x 4.

Pectirase UPTE x 5 pt.'X 6 U 7.-icellu VHCU x 7 lase Il Les références indiquées dans la dernière colonne du tableau susmentionné sont détaillées dans' le tableau suivant Réf l Identification de la N, Iréfêérence -Les -r Céférences peuven t être obtienues  Pectirase UPTE x 5 pt.'X 6 U 7.-icellu VHCU x 7 lase II The references given in the last column of the abovementioned table are detailed in the following table Ref l Identification of the N, Irefereference -The -r References may can not be obtained

de NOVO IN-from NOVO IN-

DUSTRI A/SDUSTRI A / S

N.OVO Allé,N.OVO Gone,

2880 Bags-2880 Bags-

voe rd, Danemarkvoe rd, Denmark

de Schwei-from Schwei-

zerische Fornment AG Bâle, Suissezerische Fornment AG Basel, Switzerland

Analytical Biochemis-Analytical Biochemis-

try, 84, 522 à 532 'C tnai ytical mnethod 149/6-o GB du 25-05-1981 x  try, 84, 522-532 'C tnai ytical mnethod 149/6-o GB of 25-05-1981 x

TDétermination of Pec-TDetermination of Pec

tinase Activity with 3 J Citr-us Pectin (PU)X 1 du 23-03-1976  tinase Activity with 3 J Citr-us Pectin (PU) X 1 from 23-03-1976

\Viskosiretrische Po-\ Viskosiretrische Po-

4 lygalacturonase-Be-4 lygalacturonase-Be-

stirrr (PG-E 7)du Xstirrr (PG-E 7) of the X

Bestiz 7-ung der Pectin-Bestiz 7-ung der Pectin-

transelimir ase (UPTE/ x lg) du 24-09-19715 Déterm-ination of the  transelimir ase (UPTE / x lg) of 24-09-19715 Detem-ination of the

6 Pectinester-ase acti-6 Pectinester-ase activates

6 vity(non daté)portant ' les initiales 'ij A/c-, lnalvt ical method i F 156/1-G 13 c  6 vity (undated) with 'initials' ij A / c-, lnalvt ical method i F 156/1-G 13 c

En ce qui concerne la détermination de l'activi-  As regards the determination of the activity

té-de cellulase, il est à noter que l'analyse a 'été effec-  cellase, it should be noted that the analysis was carried out

tuée co:rune indiqué dans AF 149/6-GB et que les principes  killed in accordance with AF 149/6-GB and that the principles

de déteritination sont expliqués dans Analytical Biochemis-  deterination are explained in Analytical Biochemis-

try. Io 5 dans unetry. Io 5 in a

bibi io-bibi io-

thèque p ARTIE l a DE-TIMINATION ENZYMATIQUE DE SPS-ASE La détermination enzymatique de SPS-ase est effectuée en deux étapes, c'est-à-dire un essai qualitatif sur plaque d'agar et une détermination quantitative de D l'activité SPS-ase, basée sur la mesure de la quantité totale de sucres libérée Si l'essai qualitatif sur plaque d'agar est négatif, l'activité SPS-ase est nulle quelle:  The SPS-ASE ENZYMATIC DE-TIMING DETERMINATION Enzymatic determination of SPS-ase is performed in two steps, ie a qualitative agar plate assay and quantitative determination of SPS activity. -ase, based on the measurement of the total amount of sugars released If the qualitative agar plate test is negative, the SPS-ase activity is zero:

que soit la valeur provenant de la détermination quanti-  whatever the value from the quantitative determination

tative de l'activité en SPS-ase Si l'essai qualitatif sur plaque d'agar est positif, l'activité en SPS-ase est égale à la valeur provenant de la détermination quantitative de  SPS-ase activity If the qualitative agar plate assay is positive, SPS-ase activity is equal to the value from the quantitative determination of the SPS-ase activity.

l'activité en SPS-ase.activity in SPS-ase.

I Essai qualitatif sur plaque d'agar.  I Qualitative test on agar plate.

On a préparé une plaque de SPS-agar de la manière suivante On a préparé un tampon (B) en amenant de l'acide acétique 0,3 M à p H 4,5 au moyen de Na OH 1 N. On dissout 1 g de SPS dans 20 ml de B On mélange 1 g d'agarose (HSB Litex) avec 80 ml de B et on chauffe  A SPS-agar plate was prepared as follows. A buffer (B) was prepared by feeding 0.3 M acetic acid at pH 4.5 using 1N NaOH. 1 g of SPS in 20 ml of B are mixed 1 g of agarose (HSB Litex) with 80 ml of B and heated

jusqu'au point d'ébullition en agitant Lorsque l'aga-  up to the boiling point when shaking

rose est dissoutela solution de SPS est lentement ajoutée La solution qui en résulte à 1 %de SPS-agarosè est disposée dans un bain d'eau à 60 C Les plaques sont ensuite coulées en versant 15 ml de la solution à 1 % de SPS-agarose sur une plaque en verre horizontale ayant les dimensions de 10 cm x 10 cm Ensuite on esta z me 9 "puits" dans la couche solidifiée de SPS-agarose à une distance de 2,5 cm Dans chaque  The solution that results in 1% SPS-agarose is placed in a water bath at 60 ° C. The plates are then poured by pouring 15 ml of the 1% solution of SPS-1. agarose on a horizontal glass plate having the dimensions of 10 cm x 10 cm Then we are z me 9 "well" in the solidified layer of SPS-agarose at a distance of 2.5 cm In each

puits on introduit 10 ul d'une solution à 1 % de la pro-  10 μl of a 1% solution of the

téine enzymatique tester en ce qui concerne l'activité en SPS-ase On fait incuber la plaque pendant 18 heures à C et à une humidité relative de 100 % Ensuite le SPS  Enzyme test with regard to SPS-ase activity The plate is incubated for 18 hours at C and at a relative humidity of 100%. Next the SPS

ren encore déccr csé est précipité par une solution à parts -  ren deccr csé is precipitated by a solution in parts -

égales en volumes d'éthanol et d'acétone L'essai de la SPS-ase sur laplaque d'agar est positif pour un échantillon placé dans un puits spécifique si une zone  equal volumes of ethanol and acetone The test of SPS-ase on the agar plate is positive for a sample placed in a specific well if an area

annulaire claire apparaît autour de ce puits.  clear ring appears around this well.

II DETERMINATION QUANTITATIVE DE L'ACTIVITE DE SPS-as A Le but de cet essai est de déterminer les activités enzymatiques qui sont capables de décomposer le SPS d'une telle façon que les produits de décompo- sition présentent une affinité à l'adsorption ou à la liaison de protéine de soja fortement réduite ou ne présentent pas d'affinité, à l'adsorption ou à la liaison de protéine de soja Des essais ont montré que la partie des produits de décomposition de SPS qui n'est cas précipitée par le mélange de parts égales en volume S  II QUANTITATIVE DETERMINATION OF THE ACTIVITY OF SPS-AS A The purpose of this test is to determine the enzymatic activities which are capable of decomposing the SPS in such a way that the decomposition products have an affinity for adsorption or soybean protein binding is strongly reduced or does not show affinity, adsorption or binding of soy protein Tests have shown that the part of SPS decomposition products that is not precipitated by the mixture of equal parts by volume S

d'eau et d'éthanol ne présente aucune affinité à l'ad-  water and ethanol has no affinity to ad-

sorption ou à la liaison à la protéine de soja.  sorption or binding to soy protein.

La détermination de la SPS-ase est basée sur une 515 hydrolyse du SPS dans des conditions standard suivie par une précipitation de la partie de SPS qui n'a pas été hydrolysée par l'éthanol Apres la précipitation, la teneur en hydrate de carbone qui n'est pas précipitée est déterminée par une analyse quantitative pour le sucre total (suivant AF 169/1, disponible chez NOVO  The SPS-ase determination is based on SPS hydrolysis under standard conditions followed by precipitation of the portion of SPS that was not hydrolysed by ethanol. After precipitation, the carbohydrate content which is not precipitated is determined by a quantitative analysis for total sugar (according to AF 169/1, available from NOVO

INDUSTRIE A/S, 2880 Bagsvoerd (Danemark).  INDUSTRY A / S, 2880 Bagsvoerd (Denmark).

Les conditions standard sont: Température: 50 C p H: 4,5 Temps de réaction: contrôle pendant 210 minutes uniquement avec le substrat, suivi par 2 minutes  The standard conditions are: Temperature: 50 Cp H: 4.5 Reaction time: Control for 210 minutes only with the substrate, followed by 2 minutes

l'enzyme étant additionnée.the enzyme being added.

Temps de réaction: valeur principale 212 minutes L'_cuiuement comprend  Reaction time: main value 212 minutes The amount includes

Bain d'eau agité thermostatisé à 50 C.  Thermostatic agitated water bath at 50 C.

Agitateur de type Whirlimixer Centrifugeuse  Whirlimixer Centrifuge Stirrer

Un bain d'eau glacé.A bath of iced water.

Les réactifs comprenncrit: Tampon: acide acétique 0,6 M dans l'eau  Reagents Comprised: Buffer: 0.6M acetic acid in water

déminéralisée (a) et Na OH 1,0 M (b).  demineralized (a) and 1.0 M NaOH (b).

Substrat:la valeux du p H de 50 ml de a est règlée à 4,5 au moyen de b, ensuite on ajoute 4,0 g de SPS et après dissolution de celui-ci, le p est réglé une nouvelle fois à 4,5 et le volume est porté à 100 ml au moyen d'eau désioniaée.  Substrate: the pH value of 50 ml of a is adjusted to 4.5 by means of b, then 4.0 g of SPS is added and after dissolution thereof, the p is adjusted again to 4, 5 and the volume is brought to 100 ml by means of deionized water.

Réactif u'arrêt:Ethanol absolu.Stop reagent: Absolute ethanol.

Unre unité d'activité SPS-ase (SAE ou SP Su) est définie ccnmó l'activité SPS-ase qui libère une quantité d'hydrate de carbone soluble dans de l'éthanol à 50 % équivalente à 1 mole de galactose par  One unit of SPS-ase activity (SAE or SP Su) is defined as the SPS-ase activity which releases a quantity of soluble carbohydrate in 50% ethanol equivalent to 1 mole of galactose per ml.

minute, dans les conditions standard susmentionnées.  minute, in the above standard conditions.

iême si la partie initiale de la courbe standard de l'enzyme est une ligne droite, il faut noter qu'elle  even if the initial part of the standard curve of the enzyme is a straight line, it should be noted that it

n'iniersècte pas le point ( 0,0).do not insert the point (0,0).

PARTIE 10 B DETERMINATION ENZY-TIQUE DE L ACTIVITE SOLUBILISANT  PART 10 B ENZY-TIC DETERMINATION OF SOLUBILIZING ACTIVITY

LA REAINCE EXRIMEE EN SRUM 120.EXPRESSED REHEAT IN SRUM 120.

Princioe.Princioe.

Dans le procédé pour la détermination de l'acti-  In the process for determining the activity

vité d'hydrolyse, la artie insoluble de la farine de soja dégraissée, déprotéinisée et décortiquée est hydrolysée dans des conditions standard La réaction de l'enzyme est arrêtée avec un réactif d'arrêt et la fraction insoluble est séparée par filtration La quantité de polysaccarides dissous est déterminée par spectrophotométrie après une hydrolyse acide suivant AF 169/1, disponible chez Novo Industri A/S, 2880  In the case of hydrolysis, the insoluble part of the defatted, deproteinised and shelled soybean meal is hydrolysed under standard conditions. The reaction of the enzyme is stopped with a stop reagent and the insoluble fraction is separated by filtration. The amount of polysaccharides dissolved is determined by spectrophotometry after acid hydrolysis according to AF 169/1, available from Novo Industri A / S, 2880

Bagsvoe rd (Danemark).Bagsvoe rd (Denmark).

Les carbohydrases présentant une activité endo ainsi que celles présentant une activité exo sont  Carbohydrases with endo activity as well as those with exo activity are

déterminées suivant le procédé.determined according to the process.

Le substrat faisant partie de cette détermina-  The substrate forming part of this determination

tion enzymatique est identique au substrat de la rémanence décrit pour la méthode SRU Le substrat est dissous sous forme d'une solution à 3 % dans le talmon au citrate indiqué ci-dessous: Tarpon au citrate-phosphate 0,1 i N de p H 4,5 K,2 Aq d'acide citrique monohydraté (Plerck Art 244) 8,12 g d'hydrogène-phosphate disodique bihydraté (Merck Art 6580) Amnené à 1 litre par de l'eau déminéralisée p H 4,5 + 0,05  The substrate is identical to the substrate of the remanence described for the SRU method. The substrate is dissolved in the form of a 3% solution in talmon citrate indicated below: citrate-phosphate Tarpon 0.1 i N of p H 4.5 K, 2 Aq of citric acid monohydrate (Plerck Art 244) 8.12 g of disodium hydrogen phosphate dihydrate (Merck Art 6580) Aminized to 1 liter with demineralised water p H 4.5 + 0 .05

Stable pendant 14 jours.Stable for 14 days.

Le réactif ld'arrêt présente la composition suivante: ml de Na Ol 0,5 N' ml d'éthanol à 96 % A garder dans un réfrigérateur jusqu'au moment de l'utilisation. Conditions standard: Temperature: 50 "C pli: 4,5 Temps de réaction, échantillon:120 minutes à blanc: 5 minutes Définition de l'unité: Une unité d'activité solubilisante la rémanence de soja (SRU:S) 120 (M pour manuel) correspond à la quantité d'enzyme qui, dans les conditions de réaction données, libère, par minute, des polysaccharides solubilisés  The stop reagent has the following composition: ml of Na 2 O 5 N 'ml of 96% ethanol to be kept in a refrigerator until use. Standard conditions: Temperature: 50 "C fold: 4.5 Reaction time, sample: 120 minutes blank: 5 minutes Unit definition: A unit of solubilizing activity soybean remanence (SRU: S) 120 (M for manual) corresponds to the amount of enzyme which, under the given reaction conditions, releases, per minute, solubilized polysaccharides

équivalant à une micro-mole de galactose.  equivalent to a micro-mole of galactose.

DETEP R::;ATION ENZYM:A 'TIQUE DE L'ACTIVITE PROTEOLYTIQUE  DETEP R :: ENZYM ATION: A TICK OF PROTEOLYTIC ACTIVITY

_SU E 'HUT_SU E 'HUT

Procédé pour la détermination de la protéinase dans un  Process for the determination of proteinase in a

milieu acide.acid medium.

Le procédé est basé sur la digestion d'hémoglo-  The process is based on hemoglobin digestion

bine dénaturée par l'enzyme à 40 C, à pli 3,2, pendant 30 minutes L'hémoglobine non digérée est précipitée au moyen d'acide trichloracé tique à 14 % (poids/volume). Tous les échantillons d'enzymes sont préparés en dissolvant celles-ci dans un tampond'acétate 0,1 M,  Enzyme denatured at 40 ° C, at 3.2 fold, for 30 minutes. Undigested hemoglobin is precipitated with 14% (w / v) trichloroacetic acid. All enzyme samples are prepared by dissolving them in a 0.1M acetate buffer,

p H 3,2.p H 3.2.

Le substrat d'hémoglobine est préparé en utili-  The hemoglobin substrate is prepared using

sant 5,0 g de poudre d'hémoglobine bovine lyophilisée, conservée avec du Thicrersalate à 1 % et 100 ml d'eau déminéralisée qui est agitée pendant 10 minutes, avant de règler le p H à 1,7 au moyen de IIC 1 0,33 N. Après une agitation ultérieure de 10 minutes, on règle le p H à 3,2 au moyen de Na OH 1 N Le volume de cette solution est porté à 200 ml au moyen d'un tampon acétate 0,2 M Ce substrat d'hémoglobine doit être  5.0 g lyophilized bovine hemoglobin powder, preserved with 1% Thicrersalate and 100 ml demineralized water which is stirred for 10 minutes, before adjusting the pH to 1.7 using IIC 1 0 , 33 N. After stirring for 10 minutes, the pH is adjusted to 3.2 by means of 1N NaOH. The volume of this solution is brought to 200 ml by means of a 0.2 M acetate buffer. hemoglobin substrate must be

* refroidi pour être gardé pendant 5 jours.* cooled to be kept for 5 days.

Le substrat d'hémoglobine est porté à termperature  The hemoglobin substrate is brought to termperature

ambiante Au temps zéro, 5 ml du substrat sont intro-  At zero time, 5 ml of the substrate is introduced.

Nuits dans une éprouvette contenant 1 ml d'enzyme Apres agitation d'une seconde, l'éprouvette est mise dans un bain d'eau à 40 C pendant 30 minutes Après exactement minutes, on ajoute 5 ml d'acide trichloroacétiqueà 14 % dans l'éprouvette qui est ensuite agitée et  Nights in a test tube containing 1 ml of enzyme After stirring for one second, the test specimen is placed in a water bath at 40 ° C. for 30 minutes. After exactly 5 minutes, 5 ml of 14% trichloroacetic acid are added test piece which is then shaken and

portée à température ambiante pendant 40 minutes.  brought to room temperature for 40 minutes.

Pour l'essai à blanc, le substrat d'hémoglobine est porté à température ambiante Au temps zéro, on ajoute 5 ml du substrat dans une éprouvette contenant 1 ml d'enzyme Après une agitation d'une seconde, l'éprouvette est mise dans un bain d'eau à 40 C pendant 5 minutes -Après exactement 5 minutes, on ajoute 5 ml d'acide trichloroacétique à 14 % dans l'éprouvette qui est ensuite a Jit( et lJ 3 rtce à température ambiante  For the blank test, the hemoglobin substrate is brought to ambient temperature. At time zero, 5 ml of the substrate is added to a test tube containing 1 ml of enzyme. After stirring for one second, the test specimen is put into A bath of water at 40 ° C. for 5 minutes. After exactly 5 minutes, 5 ml of 14% trichloroacetic acid are added to the test tube, which is then cooled to room temperature.

pendant 40 minutes.for 40 minutes.

Après 40 minutes, les essais à blanc et les échantillons sont agité 5 s, filtrés une ou deux fois à travers un filtre de type Berzelius N 0, et disposés dans un spectrophotomètre L'échantillon est lu par rapport à  After 40 minutes, the blanks and the samples are shaken for 5 seconds, filtered once or twice through a Berzelius N 0 type filter, and arranged in a spectrophotometer. The sample is read in relation to

l'essai à blanc à 275 nm en ajutant le spectrophoto-  the 275 nm blank test by adding the spectrophoton

mètre par rapport à de l'eau.meter compared to water.

Etant donné que l'absorbance de la tyrosine à 275 nm est un facteur connu, il n'est pas nécessaire d' établir une courbe standard de tyrosine à moins  Since the absorbance of tyrosine at 275 nm is a known factor, it is not necessary to establish a standard tyrosine curve unless

qu'il ne soit nécessaire de contrôler le spectrophoto-  that it is necessary to control the spectrophoto-

mètre de Beckman.Beckman's meter.

Calculs:' 1 HUT est la quantité d'enzyme qui forme, en une minute, un hydrolisat équivalent en ce qui concerne  Calculations: 1 HUT is the amount of enzyme that forms, in one minute, an equivalent hydrolisate with respect to

l'absorbance à 275 nm à une solution de 1,10 micro-  the absorbance at 275 nm to a solution of 1.10 micro-

gramme/ml de tyrosine dans du HC 1 0,006 N Cette valeur de l'absorbance est de 0,0084 La réaction s'effectue  gram / ml of tyrosine in 0.006 N HCl. This absorbance value is 0.0084.

à 40 C, à p H 3,2 et pendant 30 minutes.  at 40 ° C, at pH 3.2 and for 30 minutes.

HUT = Lchantillon à blanc x Volume en ml  HUT = Blank sample x Volume in ml

0,0084 termps de réaction en mn.0.0084 reaction times in min.

E-chantillon à blanc 1 1 HUT = -cantillon= ( E-B) x 43,65  E-sample blank 1 1 HUT = -cantillon = (E-B) x 43.65

0,0084 300.0084 30

HUT/g enzyme = DûB) x 43,65 g enzyme dans 1 ml Un essai pour déterminer la dépendance de la stabilité du p H de la protéase dansle KRF 68, effectué 0 au moyen d'une analyse HUT avec des valeurs de p H de 2,0 à 8, 0,a montré que la stabilité de la protéase à p H  HUT / g Enzyme = DeB) x 43.65 g Enzyme in 1 ml An assay to determine the dependence of p H stability of the protease in KRF 68, performed by HUT analysis with p H values. from 2.0 to 8.0, showed that the stability of the protease at p H

supérieur à 8,0 était très faible, cfr fig 16.  greater than 8.0 was very weak, see fig 16.

Dans le but d'illustrer la présente invention,on se reftrera aux exemples suivant 1 à 10, dans lesquels l'exemple 1 illustre la préparation de SPSase et dans lesquels les exemples 2 à 10 illustrent l'application  For the purpose of illustrating the present invention, reference will be made to the following Examples 1 to 10, in which Example 1 illustrates the preparation of SPSase and in which Examples 2 to 10 illustrate the application.

de la SPS-ase.of SPS-ase.

On a effectué à l'échelle du laboratoire, de nombreuses fer-  Many labs have been carried out at the laboratory scale.

mantations avec les souches Asn aculéatus et Asp japonicus indiquées ici Ainsi on a obtenu des préparations qui contenaient la SPS-ase suivant les essais de SPS-ase indiqués ci-dessus Cependant, étant donné qu'on a besoin de quantités assez importantes de SPS-ase afin d'exécuter les essais, on a effectué des fermentations semblables à l'échelle d'une installation pilote; cfr  Therefore, preparations were obtained which contained SPS-ase according to the above-mentioned SPS-ase assays. However, since relatively large amounts of SPS-ase are required. In order to carry out the tests, similar fermentations were carried out at the scale of a pilot plant; cf.

exemple 1 suivant.example 1 below.

1857018570

Exemple iExample i

Production d'une SPS-ase à l'échelle d'une  Production of a SPS-ase on a scale of

installation pilote.pilot installation.

On a préparé une SPS-ase par fermentation submergée d'Aspergillus aculeatus CBS 101 43. On a préparé un substrat d'agar présentant la  SPS-ase was prepared by submerged fermentation of Aspergillus aculeatus CBS 101 43. An agar substrate exhibiting

composition suivante dans un flacon de Fernbach.  following composition in a bottle of Fernbach.

Peptone Difco 6 g Aminoline Ortana 4 g Glucose 1 g Extrait de levure Difco 1 g Extrait de viande Difco 1,5 g KH 2 PO 4 Merck 20 g 2 2 g Extrait de malt Evers 20 g H 20 déminéralisée jusqu'à 1000 ml  Peptone Difco 6 g Aminoline Ortana 4 g Glucose 1 g Difco yeast extract 1 g Difco meat extract 1.5 g KH 2 PO 4 Merck 20 g 2 2 g Malt extract Evers 20 g H 20 demineralized up to 1000 ml

On a règlé le p H à une valeur entre 5,30 et 5,35.  The p H was set at a value between 5.30 and 5.35.

Ensuite on a ajouté 40 g d'agar Difco et on a maintenu le mélange dans un autoclave pendant 20 minutes à 120 C (le substrat est denatmé E-agar) La souche CBS 101 43 a été cultivée sur un plan incliné de E-agar ( 37 C) Les spores du plan incliné ont été mis en suspension dans du lait écrémé stérilisé et la suspension a été lyophilisée dans des fioles La teneur d'une fiole lyophilisée a été transvasée dans un flacon de Fernbach Le flacon a ensuite été soumis à une incubation  Then 40 g of Difco agar was added and the mixture was kept in an autoclave for 20 minutes at 120 ° C. (the substrate was denatured E-agar). The strain CBS 101 43 was grown on an inclined plane of E-agar. (37 C) The spores of the inclined plane were suspended in sterilized skimmed milk and the suspension was lyophilized in flasks The contents of a lyophilized flask was transferred to a bottle of Fernbach The flask was then subjected to an incubation

pendant 13 jours à 30 C.for 13 days at 30 C.

On a préparé un substrat ayant la composition  A substrate having the composition

suivante dans un réservoir de fermentation de 500 litres-  following in a 500 liter fermentation tank-

Ca CO 3 1,2 kg Glucose 7,2 kg Rofec (matière sèche d'une liqueur de mais) 3,6 kg Huile de soja 1,2 kg On a ajouté de l'eau de robinet jusqu'à unvolume total d'environ 240 litres On a règlé le p H à environ 5,5 avant d'ajouter du Ca CO 3 On a stérilisé le substrat dans le fermentateur a'inoculation pendant une heure à 1210 C. Le volume final avant inoculation était d'environ 300 litres. La suspension de spores dans le flacon de Fernbach a été transférée dans le fermentateur d' inocula- tion Les conditions de fermentation de l'inoculat étaient:  Ca CO 3 1.2 kg Glucose 7.2 kg Rofec (dry matter of a corn liqueur) 3.6 kg Soybean oil 1.2 kg Tap water was added up to a total volume of about 240 liters The pH was adjusted to about 5.5 before Ca CO 3 was added. The substrate was sterilized in the fermenter for 1 hour at 1210 C. The final volume before inoculation was about 300 liters. The spore suspension in the Fernbach flask was transferred to the inoculation fermenter. The fermentation conditions of the inoculum were:

Type de fermentateur: Réservoir de fermen-  Fermentor type: Fermenting tank

tation classique aéré et agité présentant un rapport  aerated and agitated classical

hauteur/diamètre d'environ 2,3.height / diameter of about 2.3.

Agitation: 300 tours/minute ( 2 hélices de turbine) Aération: 300 litres N d'air/minute Température:30 à 31 C Pression:0,5 atmospère relative  Stirring: 300 rpm (2 turbine propellers) Aeration: 300 liters N of air / minute Temperature: 30 to 31 C Pressure: 0.5 relative atmosphere

Temps; Environ 28 heures.Time; About 28 hours.

Environ 28 heures après l'inoculation, on a transféré 150 litres du fermentateur d'inoculation Vers le  Approximately 28 hours after inoculation, 150 liters of the inoculation fermentor was transferred to the

réservoir de fermentation principal.  main fermentation tank.

On a préparé un substrat ayant la composition suivante dans un réservoir de fermentation principal de 2500 litres: Farine de soja grillée: 90 kg KH 2 PO 4: 20 kg Pluronic (nom commercial): 150 ml On a ajouté de l'eau de robinet à un volume total d'environ 900 1 La farine de soja grillé a été mise en suspension dans l'eau On a règlé le p H à 8,0 au moyen de Na OH et on a augmenté la température à 50 C Ensuite on a ajouté environ 925 unités Anson d'ALCALASE 0,6 L à la suspension On a maintenu le mélange pendant 4 heures à 50 C et à p Hli 8,0 (addition de Na 2 CO 3) sans aération, sous une pression relative de zero atmosphère relative et une agitation à raison de 100 tours/minute Ensuite on a ajouté les composants restants de substrat et on a règlé le p H à environ 6 au moyen d'acide phosphorique On a stérilisé le substrat dans le réservoir de fermentation  A substrate having the following composition was prepared in a 2500 liter main fermentation tank: Grilled soy flour: 90 kg KH 2 PO 4: 20 kg Pluronic (trade name): 150 ml Tap water added at a total volume of about 900 1 The roasted soy flour was suspended in water The pH was adjusted to 8.0 with NaOH and the temperature was increased to 50 ° C. added approximately 925 Anson units of ALCALASE 0.6 L to the suspension. The mixture was maintained for 4 hours at 50 ° C. and at pH 8.0 (addition of Na 2 CO 3) without aeration under a relative zero pressure. Relative atmosphere and stirring at 100 rpm Then the remaining substrate components were added and the pH was adjusted to about 6 with phosphoric acid. The substrate was sterilized in the fermentation tank.

1857018570

principal pendant 1 1/2 heure à 123 C Le volume final  main for 1 1/2 hours at 123 C The final volume

avant inoculation était d'environ 1080 litres.  before inoculation was about 1080 liters.

Ensuite on a ajouté 150 litres-de culture d'inoculation Les conditions de fermentation sont:  Then 150 liters of inoculation culture were added. The fermentation conditions are:

Type de fermentateur:Réservoir de fermen-  Fermentor type: Fermenting tank

tation classique aéré et agité présentant un rapport  aerated and agitated classical

hauteur/diamètre d'environ 2,7.height / diameter about 2.7.

Agitation: 250 tours/minute ( 2 hélices de turbine)  Stirring: 250 rpm (2 turbine propellers)

Aération: 1200 1 N d'air/minute.Aeration: 1200 1 N of air / minute.

Température: 30 C Pression: 0,5 atmosphère relative  Temperature: 30 C Pressure: 0.5 relative atmosphere

Temps: environ 151 heures.Time: about 151 hours.

A partir de 24 heures de fermentation jusqu'à environ 116 heures de fermentation on a ajouté une solution  From 24 hours of fermentation until about 116 hours of fermentation a solution was added

de pectine de manière aseptique au réservoir de fermenta-  pectin aseptically to the fermentation tank

tion principal à raison d'une vitesse constante d'environ 8 litres par heure La solution de pectine ayant la composition suivante a été préparée dans un réservoir de  at a constant rate of about 8 liters per hour. The pectin solution having the following composition was prepared in a tank of

dosage de 500 litres.dosage of 500 liters.

Pectin genu: 22 kg Acide phosporique concentré: 6 kg Euronic (nanom ccoercial): 50 ml x Genu pectin (du genre citrus NF de "The Copenhagen  Pectin genu: 22 kg Concentrated phosphoric acid: 6 kg Euronic (nanomccoercial): 50 ml x Genu pectin (of the citrus genus NF from "The Copenhagen

pectin factory Ltd").pectin factory Ltd ").

On a ajouté de l'eau de robinet à un volume total d'environ 325 litres Le substrat a été stérilisé dans un réservoir de dosage pendant 1 heure à 121 C Le volume  Tap water was added to a total volume of about 325 liters. The substrate was sterilized in a dosing tank for 1 hour at 121 ° C.

final avant le début du dosage était d'environ 360 litres.  final before the start of dosing was approximately 360 liters.

Lorsque cette partie a été énuisée)on a nréDaré une autre partie similaire Le volume total de la solution de pectine pour  When this part was disguised) another similar part was born. The total volume of the pectin solution for

une fermentation était d'environ 725 litres.  a fermentation was about 725 liters.

Après environ 151 *heures de fermentation on a arrêté le processus de fermentation Le bouillon de culture d'environ 1850 litres a été refroidi à environ 5 C  After about 151 hours of fermentation the fermentation process was stopped. The culture broth of about 1850 liters was cooled to about 5 ° C.

et on a récupéré les enzymes selon l technique suivante.  and the enzymes were recovered according to the following technique.

Le bouillon de culture a été filtré sur un fiblre tambour sous vide (Dorr Oliver), qui était enrobé -'une terre de diatonées Hy-flo-super-cel (adjuvant de filtration) Le filtrat a été concentré par évaporation à environ 15 % du volume du bouillon de culture Le concentré a été filtré sur une feuille de filtre Seitz (type supra 100) comportant 0,25 % de Hiyflo-super-cel à titre d'adjuvant de filtration (dénommé filtration I dans le tableau suivant) Le filtrat a été précipité au moyen de 561 g de(NH 4) 2 SO 4/l à un p H de 5,5 et on a ajouté 4 % de terre de diataore Hy-flosuper-cel à titre d'adjuvant de filtration Le précipité et l'adjuvant de filtration sont séparés par filtration sur un filtre à cadre Le * 15 gâteau de filtre est dissous dans de l'eau et les fractions insolubles sont séparées par filtration sur un filtre à cadre Le filtrat est soumis à un essai de filtration sur une feuille filtrante Seitz (de type supra 100) avec  The culture broth was filtered through a vacuum drum fi lter (Dorr Oliver), which was coated with Hy-flo-super-cel diatonea (filter aid). The filtrate was concentrated by evaporation to about 15%. The volume of the culture broth The concentrate was filtered on a Seitz filter sheet (type supra 100) comprising 0.25% Hiyflo-super-cel as filter aid (referred to as filtration I in the following table). The filtrate was precipitated by means of 561 g of (NH 4) 2 SO 4 / l at a pH of 5.5 and 4% of Hy-flosuper-celate diataore earth was added as a filter aid. The filter cake is dissolved in water and the insoluble fractions are filtered off on a frame filter. The filtrate is subjected to a test. filtration on a Seitz filter sheet (type supra 100) with

0,25 % de Hy-flo-super-cel à titre d'adjuvant de filtra-  0.25% of Hy-flo-super-cel as a filter aid

tion (dénormé filtration II dans le tableau suivant) Le filtrat est soumis à une diafiltration dans un appareil d'ultrafiltration Aorès diafiltration, le liquide est concentré jusqu'à une teneur en matière sèche de 12,7 % (dénommée, dans le tableau suivant, teneur en matière sèche  The filtrate is diafiltrated in an ultrafiltration apparatus. After the diafiltration, the liquid is concentrated to a dry matter content of 12.7% (referred to in the following table). , dry matter content

du concentré).concentrate).

Un traitement de base facultatif pour éliminer partiellement l'activité de protéase peut être effectué à cette étape Dans le cas d'un traitement de base, celui-ci est effectué à un pli de 9,2 pendant une heure, le p Hli étant  An optional basic treatment for partially removing the protease activity can be carried out at this stage. In the case of a basic treatment, this is carried out at a fold of 9.2 for one hour, p Hli being

ensuite règlé à 5,0.then set to 5.0.

Ensuite le-liquide est soumis à une filtration de contrôle et filtrédans le but d-'une réduction de germes et  Then the liquid is subjected to a control filtration and filtered for the purpose of a reduction of germs and

le filtrat est lyophilisé dans un équipement de lyophili-  the filtrate is lyophilized in a freeze-dried equipment

sation de Stokes.Stokes.

On a effectué quatre fermentations de la manière  Four fermentations were done in the same way

'18570'18570

indiquée ci-dessous; la souche utilisée pour la fermen-  indicated below; the strain used for the fermentation

tation, l'utilisation facultative d'un traitement de base et d'autres paramètres variant, comme indiqué dans le  tation, the optional use of a basic treatment and other parameters varying as indicated in

tableau suivant.following table.

x Apres filtration de réduction des germes, le filtrat est concentré par évaporation en un rapport de 1:2,3 Une  After filtration of germ reduction, the filtrate is concentrated by evaporation in a ratio of 1: 2.3.

Paible partie du filtrat concentré a été séchée par pul-  Part of the concentrated filtrate was dried by pulp

vérisation et la partie restante a été lyophilisée.  verification and the remaining part was lyophilized.

Afin de réduire encore plus l'activité de protéase, certaines préparations indiquées ci-dessus sont traitées comme indiqué ci-dessous, en n'utilisant qu'une des trois possibilités A, B, ou C. A On dissout 100 g de préparation de SPS-ase dans un litre d'eau désionisëe en agitant à 10 C + 2 C On règle le p H à 9,1 au moyen de Na OH 4 N Ce traitement de base est effectué pendant une heure On règle ensuite le p H à 4,5 au moyen d'acide acétique glacial et on dialyse en  In order to further reduce the protease activity, some of the above preparations are treated as indicated below, using only one of the three possibilities A, B, or C. A 100 g of the preparation of SPS-ase in a liter of deionized water with stirring at 10 ° C + 2 ° C. The pH is adjusted to 9.1 by means of NaOH 4 N. This basic treatment is carried out for one hour. 4.5 with glacial acetic acid and dialyzed with

opposition à l'eau désionisée froide à une conductivi-  opposition to cold deionized water at a conductivity

té de 3 m Si Ensuite on effectue la congélation et la lyophilisation.  If then freezing and lyophilization are carried out.

B On dissout une préparation de 500 y de SPS-  B A 500 μl preparation of SPS-

ase dans 4 litres d'eau désionisée en agitant à 10 C + 2 C.  in 4 liters of deionized water with stirring at 10 ° C + 2 ° C.

On règle le p H à 9,1 au moyen de Na O Hi 4 N 1 Ce traitement de base est effectué pendant une heure On règle ensuite le p H à 5,0 au moyen d'acide acétique glacial La  The pH is adjusted to 9.1 with Na 2 O 4 N 1 This basic treatment is carried out for one hour. The pH is then adjusted to 5.0 by means of glacial acetic acid.

substance obtenue est lyophilisée.substance obtained is lyophilized.

Traitenrnt de Code Concentration ( 5) d 'leneur base de l'adjuvant de filtraen rat Prépl tion r-ur: úSche ration du icroorganisuti non uti filt/-prc-ci filtra duemar  Treatment of Code Concentration (5) of leneur base of the adjuvant of filtraen rat Pre - treatment: úSche ration of icroorganisuti non uti filt / -prc-ci filtra duemar

j concen T_.j concen T_.

lisé iisé tion I pitat ioni r es ticn tr CES 101 43| i RF 68 0,5 5 0,2 k 28 l_ _ " __ A-CC 20236 x j}E 74 2,0 4 0,4 7,5 i.O 4 4 C 8j x KRF 83 1,0 5 -0,25 12,4 _)_ CES 101 43 x KRF 92 0,25 4 0,25 12,7  P ark I ntroductio n I nglish 101 101 | i RF 68 0.5 5 0.2 k 28 A-CC 20236 xj} E 74 2.0 4 0.4 7.5 iO 4 4 C 8 i x KRF 83 1.0 5 -0.25 12.4 _) _ CES 101 43 x KRF 92 0.25 4 0.25 12.7

1857018570

C On dissout 50 g d'une préparation de SPS-ase dans 400 ml d'eau désionisée en agitant à 10 C + 2 C On règle le p H à 9,1 au moyen de Na OH 4 N Ce traitement de base est effectué pendant une heure Ensuite on réduit le  50 g of an SPS-ase preparation are dissolved in 400 ml of deionized water with stirring at 10 ° C. + 2 ° C. The pH is adjusted to 9.1 by means of 4N NaOH. This basic treatment is carried out for an hour Then we reduce the

p H à 5,7 au moyen d'acide acétique glacial La substance-  at 5.7 by means of glacial acetic acid.

obtenue est lyophilisée. Préparation de SPS-ase Traitement de Code de la en tant que substance base utilisé préparation de départ pour le trai teent de base B C KRF 68 x KRF 6 G Bl I KR? 63 x KRF 65 BIII KRF 92 x KRF 92 BI  obtained is lyophilized. Preparation of SPS-ase Code Processing as a base substance used starting preparation for base treatment B C KRF 68 x KRF 6 G Bl I KR? 63 x KRF 65 BIII KRF 92 x KRF 92 BI

Les préparations indiquées ci-dessus sont carac-  The preparations indicated above are typical

térisées par leur activité des enzymes selon la présente  by their enzyme activity according to this

invention dans le tableau suivant.invention in the following table.

Activité enzymatique par g KRF 68 IERF 68 Bl I KPF 68 BIII KRF 74*KRF 83 KRF 92 KRFW 92 E 1 SAS, esade plaqw + + + + essai quantita 350 301 349 Q 168 476 430 t i f_ _ _ _ _ _ _ _ _ __ _ _ _ _  Enzymatic activity by g KRF 68 IERF 68 Bl I KPF 68 BIII KRF 74 * KRF 83 KRF 92 KRFW 92 E 1 SAS, esade plaqw + + + + test quantita 350 301 349 Q 168 476 430 ti f_ _ _ _ _ _ _ _ _ __ _ _ _ _

SRTJ 737 507 481 142 683 626 757SRTJ 737 507 481 142 683 626 757

SRUM 120 2125 1560 1720 578 753 1640 1030  SRUM 120 2125 1560 1720 578 753 1640 1030

UT ph 3,2 67000 105 339 1630 12800 5960 397  UT ph 3.2 67000 105 339 1630 12800 5960 397

C 80008044 9396 1320 8040 5700 3092C 80008044 9396 1320 8040 5700 3092

PU 1 È 3000009000000 880000,0 8400 '00 7500000 8400000 7600000  PU 1 è 3000009000000 880000.0 8400 '00 7500000 8400000 7600000

______________ 119400 72000 77700 4100 64600 60000 68800  ______________ 119400 72000 77700 4100 64600 60000 68800

UPTÉ 78100 83700 76900 15130 327000 44000 62400  UPTÉ 78100 83700 76900 15130 327000 44000 62400

PEE 840 910 770 370 690 1000 7190PEE 840 910 770 370 690 1000 7190

Vlicu 16000003,100000 10000001 65000 2200000 1100000 742000 o. M'f vo u n C 1 , Exemple 2 (exemple d'application) Cet exemple décrit la fabrication de p v p à partir de farine de soja dégraissée et décortiquée,  Vlicu 16000003,100000 10000001 65000 2200000 1100000 742000 o. Example 1 (Example of Application) This example describes the manufacture of pvp from defatted and dehusked soybean meal.

"Sojamel 13 " (disponible dans le conerce auprès de Aarhus Olie-  "Sojamel 13" (available in the trade with Aarhus Olie-

fabrik A/S) La teneur en matière sèche de cette farine était de 94,0 % et la teneur en (N x 6,25) sur la base des matières sèches était de 58,7 % La farine de soja a été traitée avec les préparatio rsde SPS-ase KRF 68 Bl I (exemple 1) de la manière suivante:  fabrik A / S) The dry matter content of this flour was 94.0% and the dry matter content (N x 6.25) was 58.7%. Soy flour was treated with Preparations of SPS-Ase KRF 68 B1 I (Example 1) as follows:

On a mis 85,2 g de la farine de soja en suspen-  85.2 g of the soya flour was suspended

sion et on a maintenu en agitation à 50 C dans 664,8 g d'eau et on a règlé le p H à 4,5 au moyen de 7,5 ml de H Cl 6 N On y a ajouté 50 g d'une solution contenant 4,00 g de ladite préparation de SPS-ase et on a ensuite agité le mélange réactionnel pendant 240 minutes à 50 C Le méange a ensuite été centrifugé dans une centrifugeuse de laboratoire (modèle Beckman J-6 B) pendant 15 minutes à 3000 xg On a pesé le surnageant et on l'a analysé suivant la méthode de  The mixture was stirred at 50 ° C. in 664.8 g of water and the pH was adjusted to 4.5 by means of 7.5 ml of 6 N HCl. solution containing 4.00 g of said SPS-ase preparation and the reaction mixture was then stirred for 240 minutes at 50 ° C. The mixture was then centrifuged in a laboratory centrifuge (Beckman model J-6 B) for 15 minutes at room temperature. 3000 xg The supernatant was weighed and analyzed according to the method of

Kjeldahl afin de déterminer l'azote et les matières sèches.  Kjeldahl to determine nitrogen and dry matter.

La phase solide a ensuite été lavée avec un volume d'eau équivalent à la masse de surnageant obtenue lors de la première centrifugation Cette opération a été effectuée deux fois La phase solide a ensuite été lyophilisée,  The solid phase was then washed with a volume of water equivalent to the supernatant mass obtained during the first centrifugation. This operation was carried out twice. The solid phase was then lyophilized.

pesée et analysée suivant la méthode de Kjeldablpour dater-  weighed and analyzed according to Kjeldabl's method for

miner l'azote et les matières sèches chez Qvist's Labora-  nitrogen and dry matter at Qvist's Labora-

torium, Marselis Boulevard 169, 8000 Aarhus C, Danemark.  torium, Marselis Boulevard 169, 8000 Aarhus C, Denmark.

Ce laboratoire est agrée par l'Etat pour les analyses d'aliments pour bétail et des produits laitiers Les résultats obtenus apparaissent dans le tableau 2 1: 1 < Tableau 2 1 Résultats obtenus Pe t Renendement Composants Masse N x 6,25 Matière en pro en matière g % s Ache, % téine A% sèches, % Farine de soja 85,2 55,2 94,0 100 % 100 % Préparation de  This laboratory is approved by the State for analyzes of feed and dairy products The results obtained appear in Table 2 1: 1 <Table 2 1 Results obtained Pe t Return Components Mass N x 6.25 Material pro g% s Ache,% A% dry%,% Soy flour 85.2 55.2 94.0 100% 100% Preparation of

SPS ase 4,00 75,6 6,4 % -SPS ase 4.00 75.6 6.4% -

1 Produit de centrigugation 66,6 1,50 5,04 21,2 % 42,0 % p.v p 44,5 87,5 95,7 82,7 % 53 2 % On a donc obtenu une p v p présentant une pureté de protéine, c'est-à-dire N x 6,25 sur la base des matières sèches, de 91,4 % et avec un rendement total en protéine  1 Centrigugation product 66.6 1.50 5.04 21.2% 42.0% pv p 44.5 87.5 95.7 82.7% 53 2% Thus a pvp having a purity of protein was obtained , ie N x 6.25 on a dry matter basis, of 91.4% and with a total yield of protein

de 83 % -83% -

Exemple 3 (exemple d'application) Cet exemple a été effectué afin de comparer les rendements en protéine, la qualité nutritive et certaines propriétés fonctionnelles de produits à base de protéine de soja préparés suivant les trois techniques suivantes: A: La précipitation isoélectrique classique pour la préparation d'un isolat de protéine de soja B: Le lavage isoélectriqueclassique pour la  Example 3 (Application Example) This example was performed to compare protein yields, nutritional quality, and certain functional properties of soy protein products prepared according to the following three techniques: A: Conventional isoelectric precipitation for the preparation of a soy protein isolate B: The classic isoelectric wash for the

préparation de concentré de protéine de soja.  preparation of soy protein concentrate.

C: Le lavage isoélectrique suivant l'invention  C: The isoelectric washing according to the invention

comportant une enzyme solubilisant la réma-  containing an enzyme solubilizing the

nence, pour la préparation d'une p v p. Afin de créer une comparaison valable du procédé  nence, for the preparation of a p v p. In order to create a valid comparison of the process

de l'invention (C) avec les procédés classiques de prépara-  of the invention (C) with the conventional methods of preparing

tion de protéine de soja (A et B), on a utilisé la même substance brute dans les trois cas De même, les essais ont été effectués de telle manière que les temperatures correspondantes et les durées de traitement soient les mêmes dans les trois cas Uniquement les valeurs de p H étaient différentes étant donné les différences  In the same way, the tests were carried out in such a way that the corresponding temperatures and the treatment times were the same in all three cases. the values of p H were different given the differences

fondamentales entre les trois essais.  between the three tests.

A La précipitation isoélectrique classique pour la  A classical isoelectric precipitation for the

préparation d'un isolat de protéine de soja.  preparation of a soy protein isolate.

On a extrait 425,8 g de farine de soja (Sojamel 13 produit par Aarhus Oliefabrik A/S) dans 3574,2 g d'eau de robinet à 50 C On a règlé le p H à 8,0 avec 20,1 g de Na OH 4 N Après une agitation d'1 heure, on a centrifugé la suspension à 3000 x g pendant 15 minutes en utilisant quatre bechers d'l 1 litre dans une centrifugeuse de laboratoire (modèle Beckman J-6 B) Le produit de centrifugation I et le précipité I ont été pesés Le précipité I a été soumis à une nouvelle extraction avec de l'eau jusqu'à atteindre un poids total de 4000 g On a maintenu la température à 500 C, on a règlé le p H à 8 au moyen de Na OH 4 N et on a agité la suspension pendant 1 heure On a effectué la centrifugation et le pesage du produit de  425.8 g of soy flour (Sojamel 13 produced by Aarhus Oliefabrik A / S) were extracted in 3574.2 g of tap water at 50 ° C. The pH was adjusted to 8.0 with 20.1 g. After stirring for 1 hour, the suspension was centrifuged at 3000 xg for 15 minutes using four 1 liter beakers in a laboratory centrifuge (Beckman model J-6 B). Centrifugation product The precipitate I was re-extracted with water until a total weight of 4000 g was reached. The temperature was maintained at 500 ° C., the pH was adjusted to 8 ° C. with 4N NaOH and the suspension was stirred for 1 hour. Centrifugation and weighing of the product of

centrifugation II et du précipité II comme décrit ci-dessts.  centrifugation II and precipitate II as described above.

On a retiré des échantillons des produits de centrifugation I et II et du précipité II pour les analyses suivant Kjeldahl et pour la mesure des matières sèches Ensuite, les produits de centrifugation I et II ont été m Alangbs et maintenus à 50 C La protéine a ensuite été précipitée isolélectriquement à p H 4,5 au moyen de 45 g de HC 1 6 N. Apres une agitation d'l heure à 50 C, on a récupéré la  Samples of centrifugation products I and II and of precipitate II were removed for Kjeldahl analyzes and dry matter measurement. Next, centrifugation products I and II were kept in Alangbs and maintained at 50 ° C. was precipitated isolelectrically at pH 4.5 with 45 g of HC 1 6 N. After stirring for 1 hour at 50 C, the

protéine par centrifugation à 3000 x g pendant 15 minutes.  protein by centrifugation at 3000 x g for 15 minutes.

Le produit de centrifugation III a été pesé et analysé pour les déterminations Kjeldahl-N et les mesures de matière sèche La phase solide III a été pesée et lavée à l'eau en une quantité correspondant au poids du produit de centrifugation I Le lavage a été effectué en agitant pendant 1 heure à 50 C La protéine lavée a été récupérée par centrifugation à 3000 x g pendant 15 minutes Le produit de centrifugation IV et la phase solide IV ont été pesés Le produit de centrifugation IV a été analysé pour la détermination de Kjeldahl-N et pour la mesure des matières sèches La phase solide a été mise en suspension dans 1550 g d'eau à 50 C et on a règlé le p H à-6,5 au moyen de 17 g de Na OH 4 N Le mélange a été maintenu en agitation pendant 1 heure et on a de nouveau règlé le p H à 6,5, si nécessaire Finalement, le produit a été lyophilisé, pesé et analysé pour la détermination suivant Kjeldahl-N et pour la mesure des matières sèches Les calculs de bilan  Centrifugation product III was weighed and analyzed for Kjeldahl-N determinations and dry matter measurements. The solid phase III was weighed and washed with water in an amount corresponding to the weight of the centrifugation product. The washed protein was collected by centrifugation at 3000 xg for 15 minutes. The centrifugation product IV and the solid phase IV were weighed. The centrifugation product IV was analyzed for the determination of Kjeldahl. N and for measurement of solids The solid phase was suspended in 1550 g of water at 50 ° C. and the pH was adjusted to -6.5 by means of 17 g of 4N NaOH. The mixture was stirred for 1 hour and the pH was again adjusted to 6.5, if necessary. Finally, the product was lyophilized, weighed and analyzed for Kjeldahl-N determination and dry matter measurement. balance sheet

massique sont représentés au tableau 3 1.  are shown in Table 3 1.

Tableau 3 1:Calculs du bilan massique de la précipitation isolélectrique classique pour la préparation  Table 3 1: Mass Balance Calculations of the Classical Isolated Precipitation for Preparation

d'un isolat de protéine de soja -of a soy protein isolate -

Opérations etfractions Masse de Protine Matière ndement Rendement fraction % sèche % pn pro en matière 9 (Nx 6,25) téine % sèche % Extraction: Farine de soja 425,8 55,2 94,0 100,0 100,0 Eau 3574,2 O O O O Na OH 4 N 20,1 O 16,0 O 0,8 1.Centrifugation:E 4020,1 5,9 10,0 100,9 100, 4 Centrifugat I 3141,0 4,4 6,9 58,8 54,1 Précipité I 805,0 Réextraction:  Operations and fractions Mass of Protine Matter yield% fraction% dry% pn pro material 9 (Nx 6,25)% dry protein% Extraction: Soy flour 425,8 55,2 94,0 100,0 100,0 Water 3574, 2 OOOO NaOH 4 N 20.1 O 16.0 O 0.8 1.Centrifugation: E 4020.1 5.9 10.0 100.9 100, 4 Centrifugate I 3141.0 4.4 6.9 58, 8 54.1 Precipitation I 805.0 Re-extraction:

Précipité I 805,0 -Precipitate I 805.0 -

Eau 3195,0 O O O O 2.Centrifugation: Centrifugat II 3104,0 0,5 0,9 6,6 7, 0 Précipité II 820,0 9,1 17,2 31,7 35,2  Water 3195.0 O O O O 2.Centrifugation: Centrifugate II 3104.0 0.5 0.9 6.6 7, 0 Precipitate II 820.0 9.1 17.2 31.7 35.2

Agitation et acidifica-Agitation and acidification

tioe ton / Centrifugats I+II 6245,0tioe ton / Centrifugats I + II 6245.0

HC 1 6 N 45,0 O 21,3 O 2,4HC 1 6 N 45.0 O 21.3 O 2.4

3.Centrifugation:i 6290,0 Centrifugat III 5650,0 0,3 1,9 7,2 26,8 Précipité III 308,0 Lavage: Précipité III 308,0 Eau 3141,0 O O O O 4. Centrifugation: Z 3449,0 Centrifugat IV 3113,0 0,04 0,1 O i 5 1,2 Précipité IV 291,0 Neutralisation: Précipité IV 291,0 Eau 1550,0 O O O O Na OH 4 N 17,0 O 16,0 O 0,7 Séchage: poudre 128,0 93,8 96,3 51,1 30,8 B Lavage isoélectrique pour la préparation d'un concentré  3.Centrifugation: i 6290.0 Centrifugate III 5650.0 0.3 1.9 7.2 26.8 Precipitate III 308.0 Wash: Precipitate III 308.0 Water 3141.0 O00 4. Centrifugation: Z 3449.0 Centrifugate IV 3113.0 0.04 0.1 O i 5 1.2 Precipitate IV 291.0 Neutralization: Precipitate IV 291.0 Water 1550.0 OOOO Na OH 4 N 17.0 O 16.0 O 0.7 Drying Powder 128.0 93.8 96.3 51.1 30.8 B Isoelectric wash for the preparation of a concentrate

de protéine de soja.of soy protein.

On a lavé 425,6 g de farine de soja (Sojamel 13 produit par Aarhus Oliefabrik A/S) dans 3574 g d'eau à 50 C On a règlé le p H à 4,5 au moyen de 44,8 g de HC 1 6 No On a effectué le lavage pendant 4 heures en agitant La suspension a ensuite été centrifugée à 3000 x g pendant 15 minutes dans une centrifugeuse de laboratoire (modèle Beckman  425.6 g of soy flour (Sojamel 13 produced by Aarhus Oliefabrik A / S) was washed in 3574 g of water at 50 ° C. The pH was adjusted to 4.5 by means of 44.8 g of HC. The wash was washed for 4 hours with shaking. The suspension was then centrifuged at 3000 xg for 15 minutes in a laboratory centrifuge (Beckman model).

J-6 B) utilisant 4 béchers d'l 1 Le produit de centrifuga-  J-6 B) using 4 beakers of l 1 The centrifuge product

tion I a été pesé et analysé pour la détermination suivant Kjeldahl-N et la mesure des matières sèches La phase solide I a été pesée et lavée une nouvelle fois à l'eau jusqu'à un poids total de 4000 g Le p H a de nouveau  I was weighed and analyzed for Kjeldahl-N determination and dry matter measurement. The solid phase I was weighed and washed again with water to a total weight of 4000 g. new

été règlé à 4,5 au moyen de 1,7 g de HC 1 6 N et on a main-  was adjusted to 4.5 by means of 1.7 g of HC 1 6 N and it was

tenu la suspension sous agitation pendant 30 minutes à 50 Co On a effectué une centrifugation et une pesée du produit de  The suspension was stirred for 30 minutes at 50 ° C. The product was centrifuged and weighed.

centrifugation II et des solides II comme précédemment.  centrifugation II and solids II as before.

La phase solide II a été remise en suspension dans 1575 g de H 20 à 50 C et on a règlé le p H à 6,5 au moyen de 34,5 g de Na OH 4 N; On a maintenu le mélange sous agitation à 50 C pendant une heure et on a de nouveau règlé le p H à 6,5, si nécessaire Finalement le produit de protéine a été lyophilisé, pesé et analyse suivant Kjeldahl-N et pour la mesure des matières sèches Le bilan massique est  The solid phase II was resuspended in 1575 g of H 2 O at 50 ° C. and the pH was adjusted to 6.5 by means of 34.5 g of 4N NaOH; The mixture was stirred at 50 ° C. for one hour and the pH adjusted again to 6.5, if necessary. Finally, the protein product was lyophilized, weighed and analyzed according to Kjeldahl-N and for dry matter The mass balance is

représenté dans le tableau 3 2.represented in Table 3 2.

Tableau 3 2:Calculs du bilan massique du lavage isoîlectri-que  Table 3 2: Mass Balance Calculations of Isoelectric Wash

pour la préparation d'um concentré de protéine de soja.  for the preparation of a soy protein concentrate.

Opérations et Masse de Protéine Matière Rende Rendement  Operations and Mass of Protein Matter Rende Yield

fractions la frac <(Nx 6,25) sèche,% ment en en mat.  Fraction (N x 6.25) dried, mp.

tion, g Drotine% sèche % Lavage farine de soja 425,8 55,2 94,0 100,0 100, 0 eau 3574,0 O O O O H Cl 6 N 44,8 O 21,3 O 2,4 l.Centrifugation: 4044,6 Centrifugat I 3150,0 0,6 3,2 8,0 25,2 Solides I 846,0 Nouveau lavage: Solides I 846,0 _ eau 3154,0 O O O O  Drotin% Dry% Washing Soy flour 425.8 55.2 94.0 100.0 100.0 Water 3574.0 OOOOH Cl 6 N 44.8 O 21.3 O 2.4 l.Centrifugation: 4044 , 6 Centrifugate I 3150.0 0.6 3.2 8.0 25.2 Solids I 846.0 New wash: Solids I 846.0 _ Water 3154.0 O00

: HC 1 6 N 1,7 O 21,3 O 0,1: HC 1 6 N 1.7 O 21.3 O 0.1

2.Centrifugation: 1 4001,7 Centrifugat II 313 G O O 1 0,4 1 > 3 3,2 Solides II 863,0 Neutralisation: Solides II 863 O eau 1575,0 O O O O Na OH 4 N 34,5 O 16,0 O 14 Séchage:poudre 281,0 72,5 98,4 86,7 69,1 C Lavage isoélectrique comprenant une enzyme solubilisant la rémanence, pour la préparation d'une p v p, On a lavé 425,8 g de farine de soja (Sojamel 13 produit par Aarhus Oliefabrik A/S) dans 3524,2 g d'eau à 50 C On a règlé le p H à 4,5 en utilisant 43, 7 g de H Cl 6 N On a dissous 24 g de la préparationde SPS-ase, KRF 68 BIII (exemple 1) dans 26 g d'eau et on l'a ajoutéeau mélange de lavage On a ensuite effectué le lavage pendant  2.Centrifugation: 1 4001.7 Centrifugate II 313 GOO 1 0.4 1> 3 3.2 Solids II 863.0 Neutralization: Solids II 863 O water 1575.0000O NaOH 4 N 34.5 O 16.0 O Drying: Powder 281.0 72.5 98.4 86.7 69.1 C Isoelectric wash comprising an enzyme solubilizing the remanence, for the preparation of a pvp, 425.8 g of soy flour (Sojamel 13 produced by Aarhus Oliefabrik A / S) in 3524.2 g of water at 50 ° C. The pH was adjusted to 4.5 using 43.7 g of 6 N HCl. 24 g of the SPS preparation were dissolved. KRF 68 BIII (Example 1) in 26 g of water and added to the wash mixture.

4 heures sous agitation On a ensuite effectué la purifi-  4 hours stirring Then the purification was carried out

cation comme décrit dans l'essai B, les quantité de HC 1 6 N, de Na OH 4 N et d'eau pour la nouvelle suspension étant les seuls paramètres présentant des valeurs différentes Le  As described in Test B, the amounts of HC 1 6 N, NaOH 4 N and water for the new suspension are the only parameters with different values.

bilan massique est représenté dans le tableau 3 3.  Mass balance is shown in Table 3 3.

Tableau 3 3: Calcul du bilan massique du lavage isoélec-  Table 3 3: Calculation of the mass balance of the isoelectric wash

trique comportant un enzyme solubilisant la rémanence pour la préparation d'une p v p. 1) Analysé par Bioteknisk Institut, Holbersvej 10, DK-6000 Kolding, Danemark 2) Analysé par Qvist's Laboratorium, Marselis B Oulevard 169, DK-8000, Aarhus C, Danemark Propriétés nutritives Les compositions en acides aminés des trois produits de protéine ont été déterminées, voir tableau 3 4 La teneur totale en acides aminés essentiels, la teneur chimique et l'indice d'acides aminés essentiels (EAAI) sont  cation containing an enzyme solubilizing the remanence for the preparation of a p v p. 1) Analyzed by Bioteknisk Institute, Holbersvej 10, DK-6000 Kolding, Denmark 2) Analyzed by Qvist's Laboratorium, Marselis B Oulevard 169, DK-8000, Aarhus C, Denmark Nutritional Properties The amino acid compositions of the three protein products were The total content of essential amino acids, the chemical content and the essential amino acid index (EAAI) are

calculés en utilisant le document de référence-FAO de 1957.  calculated using the 1957 FAO Reference Document.

La teneur en inhibiteur de trypsine des trois produits a été déterminée au moyen de la méthode décrite dans A O C S Tentative Method Ba 12-75 (A O C S est une  The trypsin inhibitor content of the three products was determined using the method described in US Pat.

Rendement Rende-Yield Render-

Opérations et Masse de Protéine Matière en prote ment en fractions Eraction %(N x 6,25 sèche % ine, matière _ % sèche % Lavage farine de soja 425,8 55,2 94,0 100,0 100,0 eau 3540,2 O O O  Operations and Protein Mass Protective material in fractions Eraction% (N x 6.25% dry%, dry matter%% Washing soya flour 425.8 55.2 94.0 100.0 100.0 water 3540, 2 OOO

HC 1 6 N 43,7 O 213 O 2,3HC 1 6 N 43.7 O 213 O 2.3

SPS-ase:KRF 68 BIII 24,0 75,3 96,0 7,7 5 8 1.Centrifugation: E 4043,7 Centrifugat I 3420, O 1,7 5 t 2 24,7 44,4 Solides I 620,0 Nouveau lavage Solides I 620,0 _ eau 3380,0 O 0 00 H Cl 6 N 1,3 O 21,3 0 0,1 2. Centrifugation: Z 4001,3 Centrifugat II 3400,0 0,2 0,6 2,9 5,1 Solides II 577,0 Neutralisation: Solides II 577,0 eau 1700,0 O O 0 0 Na OH 4 N 25,3 O 16 A O O 1 '0 séchage: poudre 211,0 87 31) 96,71) 78,2 51,1  SPS-ase: KRF 68 BIII 24.0 75.3 96.0 7.7 5 8 1.Centrifugation: E 4043.7 Centrifugate I 3420, O 1.7 5 t 2 24.7 44.4 Solids I 620, 0 New wash Solids I 620.0 _ water 3380.0 O 0 00 H Cl 6 N 1.3 O 21.3 0 0.1 2. Centrifugation: Z 4001.3 Centrifugate II 3400.0 0.2 0.6 2.9 5.1 Solids II 577.0 Neutralization: Solids II 577.0 Water 1700.0 OO 0 0 Na OH 4 N 25.3 O 16 AOO 1 0 Drying: Powder 211.0 87 31) 96.71 ) 78.2 51.1

86,92) 97,02)86.92) 97.02)

abréviation pour American Oil Chemists' Society) Les ré-  abbreviation for American Oil Chemists' Society)

sultats sont représentés dans le tableau 3 5 qui comporte également les rendements et le rapport protéine/matière  The results are shown in Table 3, which also includes the yields and protein / material ratio.

sèche des trois produits.dry of the three products.

Tableau 3 4: Conposition d'acides aminés et évaluation nutritive des trois produits de protéine A, B, et C 1)aas = teneur en acides aminés (amino-acid score) basée  Table 3 4: Amino Acid Conposition and Nutrient Evaluation of the Three Protein Products A, B, and C 1) aas = amino acid content (amino acid score) based

sur 11 document de référence FAO de 1957.  of the 1957 FAO Reference Document.

A.Isolat de pro B Concentré de C Isolat de pro-  A.Isolate of pro B Concentrate of C Isolate of pro

téine de soja protéine de soj téine de soja  soy protein soy protein soy protein

Acide aminé g/16 g N (P P-Amino acid g / 16 g N (P P-

Acide_ _ ___g/16 g N _ aas 1 g/16 g N aas C/16 g N aas 1 Non-essentiel:  Acid g / 16 g N = 1 g / 16 g Nas C / 16 g Nas 1 Non-essential:

Acide asparti 12,4 11,3 11,9 -Aspartic acid 12.4 11.3 11.9 -

quethan

Sérine 4,'62 4,69 4,81 -Serine 4, '62 4.69 4.81 -

Acie olutamic e 21,3 18,2 17,7 -Acie olutamic e 21.3 18.2 17.7 -

Proline 6,07 5,19 4,76 -Proline 6.07 5.19 4.76 -

Glycine 4,13 4,26 4,33 -Glycine 4.13 4.26 4.33 -

Alanine 3,54 4,27 4,55 -Alanine 3.54 4.27 4.55 -

Histidine 2,83 2,78 2,50 -Histidine 2.83 2.78 2.50 -

Arginine 8,09 7,57 7,04 -Arginine 8.09 7.57 7.04 -

Essentiel: Isoleucine 4,87 > 100 4,97 > 100 5,19) 100  Essential: Isoleucine 4.87> 100 4.97> 100 5.19 100

Leucine 7,80 > 100 7,98 > 100 8,09 > 100 -  Leucine 7.80> 100 7.98> 100 8.09> 100 -

Lysine 6,24 > 100 6,09 > 100 5,57 > 100 Phénylalanine 5,47 > 100 10 5,35 > 10 ' 5,17 100 > 10 Tyrosine 3,38 > 0100 J3,88 > 10 J 4,44 001 J Cystine 1,29 64 IA 1,32 6662 1,44 72,0 Mthioni N e 1,0 49, 1 1 9, Méthionine 1,08 1,21 55,0) 1,31 5 Thréonine 3,10 > 100 3,60 > 100 3,97 > 100 Tryptophane 1,06 75,7 1,37 97,9 1,32 94,3  Lysine 6.24> 100 6.09> 100 5.57> 100 Phenylalanine 5.47> 100 10 5.35> 10 '5.17 100> 10 Tyrosine 3.38> 0100 J 3.88> 10 J 4.44 001 J Cystine 1.29 64 IA 1.32 6662 1.44 72.0 Mthioni N e 1.0 49, 1 1 9, Methionine 1.08 1.21 55.0) 1.31 5 Threonine 3.10> 100 3.60> 100 3.97> 100 Tryptophan 1.06 75.7 1.37 97.9 1.32 94.3

Valine 4,90 > 100 5,23 > 100 5,57 > 100 -  Valine 4.90> 100 5.23> 100 5.57> 100 -

T'eneur totale I en acides am i, 38,36 41,31 42,21 nés essentiels% Teneur chimique 56,4 % 60,2 % 65,5 %  Total loss I in amino acids, 38.36 41.31 42.21 essential births% Chemical content 56.4% 60.2% 65.5%

EAAI 86,7 % 90,2 % 91,3 %EAAI 86.7% 90.2% 91.3%

Tableau 3 5: Caractéristiques du processus et teneur en inhibiteur de trypsine des trois produits de protéine A, B et C Propriétés fonctionnelles L'indice de solubilité de l'azote (NSI: Nitrogen solubility index) a été déterminé respectivement, dans une dispersion de protéine à 1 % à p H 7,-0 dans Na Cl 0,2 M et dans l'eau distillée Après avoir agité pendant 45 minutes au moyen d'un agitateur magnétique, on a centrifugé la suspension à 4000 x g pendant 30 minutes et on a analysé le surnageant pour déterminer l'azote La solubilité de l'azote a été calculée comme le rapport: % N soluble/ % N total Les résultats de cette évaluation effectuée  Table 3 5: Process Characteristics and Trypsin Inhibitor Content of the Three Protein Products A, B and C Functional Properties The Nitrogen Solubility Index (NSI) was determined, respectively, in a dispersion of 1% protein at pH 7, -0 in 0.2M NaCl and in distilled water. After stirring for 45 minutes using a magnetic stirrer, the suspension was centrifuged at 4000 xg for 30 minutes and the supernatant was analyzed for nitrogen The solubility of nitrogen was calculated as the ratio:% N soluble /% N total The results of this evaluation carried out

sur les trois produits sont représentés dans le tableau 3 6.  of the three products are shown in Table 3 6.

La capacité d'émulsification a été déterminée trois fois sur chaque produit par un titrage de Swift légèrement modifié 4,0 g de (N x 6,25) du produit ont été mélangésdans 250 ml de Na Cl 0,5 M au moyen d'unagitateur Sorval Omnimixer à vitesse lente On a transféré 50 ml de la suspension dans un récipient mélangeur en verre et on y a ajouté 50 ml d'huile de soja Le mélange total a ensuite été pesé Le mélange huile-eau a ensuite été homogénéisé A Isolat de B Concentré C Isolat de protéine de protéin Eprotéine de de soja de soja soja (p v p C aractéris Protéine dans matière sèche 97,4 % 73,7 % 90,0 % tiques du _ processus Rendement en Protéine 51,1 % 86,7 % 78,2 % Inhibiteurs de trypsine34 000 21 000 9 000 TUI/g Protéine TUI/g 36 250 28 970 21 810 à 10 000 tours/minute, le récipient étant disposé dans un bain de glace On a ajouté une quantité supplémentaire d'huile de soja à une vitesse de 0,3 ml par seconde jusqu'à ce que l'émulsion s'effondre La quantité totale d'huile ajoutée avant le "point final" a été déterminée par  The emulsification capacity was determined three times on each product by a slightly modified Swift titration. 4.0 g of (N x 6.25) of the product were mixed in 250 ml of 0.5 M NaCl by means of Sorval Omnimixer slow speed stirrer 50 ml of the suspension was transferred to a glass mixing vessel and 50 ml of soybean oil was added thereto. The total mixture was then weighed. The oil-water mixture was then homogenized. of B Concentrate C Protein Protein Isolate Soy Protein Soybean Soybean (pvp C aracteris Protein in dry matter 97.4% 73.7% 90.0% process ticks Protein Yield 51.1% 86.7 % 78.2% Trypsin inhibitors 34,000 21,000 9,000 TUI / g Protein TUI / g 36,250 28,970 21,810 at 10,000 rpm, the container being placed in an ice bath An additional amount of soybean oil at a rate of 0.3 ml per second until the emulsion collapses The total amount of oil added before the "end point" was determined by

pes Ae.pes Ae.

La capacité d'émulsification est calculée comme le nombre de ml d'huile par gramme de protéine (N x 6,25) La densité de l'huile a été supposée égale à  The emulsification capacity is calculated as the number of ml of oil per gram of protein (N x 6.25) The density of the oil was assumed equal to

0,9 g/ml.0.9 g / ml.

Les résultats moyens de la détermination de la  The average results of the determination of

capacité d'émulsification des trois produits sont représen-  The emulsification capacity of the three products is

tés au tableau 3 6.Table 3 6.

L'expansion au fouettement a été détermtinée dans une solution de protéine à 3 %,à p H 6,5 On a fouetté 250 ml d'une dispersion aqueuse des Ecbantilions de  The whipping expansion was determined in a 3% protein solution at pH 6.5. An aqueous dispersion of the Ecbantilions from

protéine à la vitesse III pendant 4 minutes dans un agita-  protein at speed III for 4 minutes in a shaking

teur Hobart (modèle N-50) comportant un fouet en forme de fil L'expansionau fouettement a été calculée selon la formule Expansion au fouettement = V 250 x 100 %  Hobart (model N-50) with a wire-shaped whip The whipping expansion was calculated using the formula Whip expansion = V 250 x 100%

dans laquelle V représente le volume de fouettement final.  where V is the final flush volume.

en ml.in ml.

La valeur V est mesurée en remplissant le ré-  The value V is measured by filling in the

cipient mélangeur avec de l'eau On a doublé les essais de chacun des trois échantillons Les résultats moyens  mixing vessel with water The tests of each of the three samples were doubled Average results

sont représentés au tableau 3 6.are shown in Table 3 6.

La stabilité de la mousse est déterminée en tant que rapport entre la quantité de mousse abandonnée après égouttage pendant 30 minutes et la quantité de mousse à l'origine Un gramme de mousse produitepar le procédé précédent a été introduit dans un cylindre en plastique (diamètre 7 cm, hauteur 9 cm) comportant un filet à mailles de 1 mm x lmmo Le cylindre a été disposé au-dessus d'un entonnoir monté sur un cylindre en verre et le poids (B) du liquide égoutté dans le cylindre en-verre est mesuré La stabilité de la mousse FS (foam stability) est déterminée par l'équation A -B FS A A x 100 % Les résultats de la mesure sont représentés au  The stability of the foam is determined as a ratio between the amount of foam left after dewatering for 30 minutes and the amount of foam at the origin. One gram of foam produced by the foregoing process was introduced into a plastic cylinder (diameter 7). cm, height 9 cm) having a mesh of 1 mm x lmmo The cylinder was placed above a funnel mounted on a glass cylinder and the weight (B) of the liquid drained in the glass cylinder is measured The stability of foam FS (foam stability) is determined by the equation A-B FS AA x 100% The results of the measurement are shown in FIG.

tableau 3 6.table 3 6.

La résistance du gel est définie dans cette  The gel strength is defined in this

description en tant que la viscosité de Brookfield mesurée  description as the measured Brookfield viscosity

au moyen de mandrins T sur un statif de Brookfield Helipath Les gels sont produits par traitement thermique de suspensions de protéine à 12 % dans du Na Cl 0,5 M Le traitement thermique a été effectué dans des bidons fermés ayant un diamètre de 7,3 cm et une hauteur de 5,0 cm, plongés dans un bain d'eau, maintenu P Pn et 1000 C, pendant  using T-chucks on a Brookfield Helipath stand The gels are produced by heat treatment of 12% protein suspensions in 0.5 M NaCl. The heat treatment was carried out in closed cans having a diameter of 7.3. cm and a height of 5.0 cm, immersed in a water bath, maintained P Pn and 1000 C, while

N mn chacun Les bidons ont été refroidis et thermostati-  N mn each The cans were cooled and thermostatically

sés à 20 C avant de les ouvrir et avant d'effectuer ies mesures Les résultats de ces mesures sont représentés  at 20 C before opening and making measurements. The results of these measurements are

dans le tableau 3 6.in Table 3 6.

Tableau 3 6: Propriété fonctionnelles des trois substances de protéine A, B, et C Propriétés A Isolat de B Concentré de C Isolat-de fonctionnelles protéine de protéine de protéine soja so O ja de soja(pvp) % NSI dans Na Cl 0,2 M 39,5 20,3 25,6 % NSI dans l'eau 53,9 25,1 28,6  Table 3 6: Functional Properties of the Three Protein Substances A, B, and C Properties A B Isolate Concentrate C Isolate-Functional Protein Soy Protein Protein Soybean Protein (pvp)% NSI in Na Cl 0, 2 M 39.5 20.3 25.6% NSI in water 53.9 25.1 28.6

Capacité d' érmulsifi-Ability to emulsify

cation: mi huile/g 218 182 354 (N x 6,25) Expansion au fouette 120 120 340  cation: mi oil / g 218 182 354 (N x 6.25) Whisk expansion 120 120 340

120 ' 340120 '340

mnnt % Stabilité de la 50 50 20 musse % 50 50 20 mousse % Résistance du gel 3 4 2 C (Na Cl 0,5 M) 1,7 x 10 1,2 x 104 3,3 x 104 1000 C (Na Cl 0,5 M) 2,0 x 10 4,0 x 10 1,3 x 10 ïi Nôi _ __ Exemple 4 (exemple d'application) On a produit une p v p suivant le processus décrit à l'exemple 3 C sauf que l'activité de cellulase était partiellement dérivée de Trichoderma reseei La préparation de cette cellulase commerciale CELLUCLAST, produite par Novo Industri A/S, a été traitée au moyen d'une base à faible temperature, de lamanière suivante Le p H d'une solution à 10 % de CELLUCLAST dans l'eau a été règlé à 9,2 au moyen de Na OH, et la solution résultante a été refroidie à 5 C Après séjour d'une heure à ce p H et à -cette température, on a règlé le p H à 4,7 au moyen d'acide acétique à 20 % Cette solution a été maintenue à 5 C  Stability of the 50 50 20 musse% 50 50 20 foam% Resistance of the gel 3 4 2 C (NaCl 0.5 M) 1.7 x 10 1.2 x 104 3.3 x 104 1000 C (NaCl 0.5M) 2.0 × 10 4.0 × 10 1.3 × 10 6 N 1 Example 4 (Example of Application) A pvp was produced according to the procedure described in Example 3 C except that Cellulase activity was partially derived from Trichoderma reseei. The preparation of this CELLUCLAST commercial cellulase, produced by Novo Industri A / S, was treated using a low temperature base, following the following method. 10% of CELLUCLAST in water was adjusted to 9.2 with NaOH, and the resulting solution was cooled to 5 ° C. After standing for one hour at this pH and at this temperature, p H at 4.7 using 20% acetic acid This solution was maintained at 5 ° C.

pendant la nuit et ensuite été filtrée de manière stérile.  overnight and then sterile filtered.

Le produit de filtration a été lyophilisé On a ajouté 4 g du produit lyophilisé à la préparationde SPS-ase, KRF 68 BIII (exemple 1) Les deux enzymes ont été dissoutes dans 172 g d'eau avant d'être ajoutées au mélange de lavage Les déterminations du-bilan massique de cet  Filtrate was lyophilized. 4 g of the lyophilized product was added to the SPS-ase preparation, KRF 68 BIII (Example 1). Both enzymes were dissolved in 172 g of water before being added to the wash mixture. Mass-balance determinations of this

exemple sont représentées dans le tableau 4 1.  example are shown in Table 4 1.

L'essai prouve que cette préparation particu-  The test proves that this particular preparation

lière de SPS-ase contient déjà une cellulase efficace étant donné qu'une addition de CELLUCLAST ne semble pas affecter le rapport protéine/matière sèche Cependant, d'autres préparations de SPS-ase peuvent contenir moins de cellulase, par exemple KRF 92, voir le tableau précédant immédiatement l'exemple 2:  However, other SPS-ase preparations may contain less cellulase, for example KRF 92, see the table immediately preceding Example 2:

Tableau 4 1:Table 4 1:

* Calculs du bilan massique du lavage isoélec-* Calculations of the mass balance of the isoelectric wash

trique comportant une préparation de SPS-ase et du CELLUCLAST pour la'production du p v p. Opérations et Massede E Protéine Matière endement Rendement fractions fraction % sèche en enmatière ___ granmes (Nx 6,25) % irotéine% sèche % Lavage: Farine de soja 425,8 55,2 94,0 100,0 100,0 Eau 3546,2 O O O O H Cl 6 N 43,1 O 21,3 O 2,3 SPS-ase:KRF 68-BIII 24,0 75,3 96 7,7 5,8  with a preparation of SPS-ase and CELLUCLAST for the production of pv p. Operations and Mass of E Protein Ingredient Yield Fractions fraction dry% enmatière ___ granmes (Nx 6,25)% iroteine% dry% Washing: Soy flour 425,8 55,2 94,0 100,0 100,0 Water 3546, 2 OOOOH Cl 6 N 43.1 O 21.3 O 2.3 SPS-ase: KRF 68-BIII 24.0 75.3 96 7.7 5.8

CELLUCLAST 4,0 43,6 96 0,7 1,0CELLUCLAST 4.0 43.6 96 0.7 1.0

Centrifugation: ú 4043,1 Centrifugat I 3382,0 1,9 5,5 27,3 46,5 Solides I 661,0 Nouveau lavage: Solides I 661,0 Eau 3339,0 O O O O  Centrifugation: ú 4043,1 Centrifugat I 3382.0 1,9 5,5 27,3 46,5 Solids I 661,0 New wash: Solids I 661,0 Water 3339,0 O O O O

HC 1 6 N O O O O OHC 1 6 N O O O O O

2 e Centrifugation:Z 000,0 Centrifugat II 3414,0 0,2 0,7 2,9 6,0 Solides II 582,0 Neutralisation: Solides II 582,0 Eau 1691,0 O O O O O Na OH 4 N 25,3 O 16,0 O 1,0 Séchage: Poudre 206,0 88,8 98,9 7718 5-09 Exemple 5 (exemple d'application) On a produit une p v p. suivant le procédé décrit dans l'exemple 3 C sauf que toutes les masses ont eté divisées par un facteur de 5 et que le mélange réactionnel a été refroidi à environ 5 C avant la centrifugation Sur base des résultats analytiques en rapport avec les produits de centrifugation, on obtient un rendement théorique en  2nd Centrifugation: Z 000.0 Centrifugate II 3414.0 0.2 0.7 2.9 6.0 Solids II 582.0 Neutralization: Solids II 582.0 Water 1691.0 OOOOO NaOH 4 N 25.3 O 16.0 O 1.0 Drying: Powder 206.0 88.8 98.9 7718 5-09 Example 5 (Application example) A pv p. following the procedure described in Example 3 C except that all the masses were divided by a factor of 5 and the reaction mixture was cooled to about 5 ° C. before centrifugation Based on the analytical results in relation to the centrifugation products a theoretical yield is obtained

protéine précipitée, comme montré dans le tableau 5 1.  precipitated protein, as shown in Table 1.

Tableau 5 1: Rendements théoriques en protéine obtenus lors de la production d'une p v p. a Moyenne de 87,5 (Bioteknisk Institut) et 86,9 (Qvist's  Table 5 1: Theoretical yields of protein obtained during the production of a p v p. a Average of 87.5 (Bioteknisk Institute) and 86.9 (Qvist's

Laboratorium); la teneur en matière sèche est respective-  Laboratorium); the dry matter content is respectively

ment de 97,6 et 98,0 %.97.6 and 98.0%.

b Calculé en tant que masse totale de protéine perte en  b Calculated as the total mass of protein loss in

protéine dans les produits de centrifuqations.  protein in the centrifuge products.

Exemple 6: (exemple d'application) D Amonstration de la liaison Drotéique du SPS On a dissous 40 g de (Nx 6,25) d'un isolat de protéine de soja commercial (Purina 500 E de Ralston Purina) dans 680 g d'eau On a chauffé le mélange dans un bain d'eau à 50 C et on a règlé le p H à 4,50 au moyen de H Cl 6 N On a transféré 90 g de ce mélange dans 5 flacons d'Erlenmeyersde 250 ml et on y a ajouté 10 g de solution aqueuse contenant respectivement O g, 0,2 g, 0,4 g 0,8 g et 1,6 g du SPS préparé comme décrit précédemment dans ce mémoire maintenus sous agitation au moyen d'un aimant dans-un bain  Example 6: (Application Example) D SPS Drotein Binding Amonstration 40 g of (N x 6.25) of a commercial soy protein isolate (Purina 500 E from Ralston Purina) were dissolved in 680 g d The mixture was heated in a 50 C water bath and adjusted to pH 4.50 with 6 N HCl. 90 g of this mixture was transferred to 5 250 ml Erlenmeyer flasks. 10 g of aqueous solution containing 0 g, 0.2 g, 0.4 g, 0.8 g and 1.6 g of the SPS prepared as described previously in this specification, which were kept stirring by means of magnet in a bath

d'eau à 50 C pendant 240 minutes.of water at 50 C for 240 minutes.

On a ensuite centrifugé les suspensions à 3000 x g Masse Protéine Rendement Exemple 3 Fractions g (Nx 6,25)en pro Protéine Rendement % téine % (Nx 6,25) en rotine Farine de soja 85,2 55,2 10055,2 100 SPS-ase KRF-68 BIII 4,8 75,3 7,7 75,3 7,7 lère centrifugation639 0,99 13,5 1,7 24, 7 2 è centrifugation595 0,13 1,6 0,2 2,9 p.v p 87,2 a 92,6 b 87,1 801 b _______________________________________ ____________ _________________ ____________________ _ 8 O, 1 b__________ pendant 15 minutes et les produits de centrifugation I ont été analysés suivant Kjeldahl-N et pour la détermination des matières sèches Les phases solides-ont été lavées à l'eau à température ambiante et centrifugées une nouvelle fois Cette étape a été répétée Ensuite on a dispersé les solides dans 50 ml d'eau et on a règlé le p H à 6,50 par une addition goutte à goutte de Na OH 6 N Les produits neutralisés ont été lyophilisés et analysés suivant Kjeldahl- N et pour déterminer les matières sèches (MS) En se basant sur les analyses représentées au tableau 6 1, on a  The suspensions were then centrifuged at 3000 xg Protein Mass Yield Example 3 Fractions g (N x 6.25) pro Protein Yield%% whey (N x 6.25) in rotin Soy flour 85.2 55.2 10055.2 100 SPS-ase KRF-68 BIII 4.8 75.3 7.7 75.3 7.7 1st centrifugation639 0.99 13.5 1.7 24, 7 2nd centrifugation595 0.13 1.6 0.2 2, 9 pv p 87.2 to 92.6 b 87.1 801 b _______________________________________ ____________ _________________ _____________________ 8 O, 1 b__________ for 15 minutes and the centrifugation products I were analyzed according to Kjeldahl-N and for the determination of the solids. solid phases were washed with water at room temperature and centrifuged again This step was repeated Then the solids were dispersed in 50 ml of water and the pH was adjusted to 6.50 by dropwise addition. The neutralized products were lyophilized and analyzed according to Kjeldahl-N and to determine the materials. On the basis of the analyzes shown in Table 6 1, we have

calculé le pourcentage de protéine récupérée et le pour-  calculated the percentage of protein recovered and the

centage de SPS qui a été lié à la protéine au moyen des  percent of SPS that has been bound to the protein by means of

formules représentées en relation au tableau 6 2.  formulas shown in relation to Table 6 2.

Cet exemple démontre que le SPS est lié intime-  This example demonstrates that the SPS is intimately linked

ment à la protéine de telle sorte que le rapport protéine/  to the protein so that the ratio of protein to

matière sèche diminue pour une teneur croissante en SPS.  dry matter decreases for increasing SPS content.

Le rapport protéine/SPS présent dans la farine de soja correspond à une teneur en SPS comparable à environ 0,4 g  The protein / SPS ratio present in the soy flour corresponds to an SPS content comparable to about 0.4 g

dans 10 g d'eau, ajouté à 5 g d'isolat de protéine.  in 10 g of water, added to 5 g of protein isolate.

Le pourcentage de liaison du SPS est une valeur calculée Le pourcentage de liaison du SPS diminue à cause de la saturation de la protéine en SPS aux faiblesrapports protéines/SPS. Tableau 6 1: Mesures suivant l'exemple 6 Rapport Produit de Précipité sèché Protéine/ centrifugation I  The percent binding of the SPS is a calculated value The percent binding of the SPS decreases because of the saturation of the protein in SPS at low protein / SPS ratios. Table 6 1: Measurements according to Example 6 Report Product of Dry precipitate Protein / centrifugation I

SPS 62SPS 62

% N %M 4 S % N % N x 6,25%MS % MS% N% M 4 S% N% N x 6.25% MS% MS

0 0,068 20,62 13,2 82,5 93,1 88,60 0.068 20.62 13.2 82.5 93.1 88.6

0,045 0,49 13,4 83,8 97,3 86,10.045 0.49 13.4 83.8 97.3 86.1

12,5 0,038 0,45 13,0 81,3 97,9 83,012.5 0.038 0.45 13.0 81.3 97.9 83.0

6,25 0,031 0,45 12,6 78,8 98,1 80,36.25 0.031 0.45 12.6 78.8 98.1 80.3

3,125 0,026 0,61 11,8 73,8 97,9 75,3  3.125 0.026 0.61 11.8 73.8 97.9 75.3

: 2518570: 2518570

Tableau 6 2: Récupération de protéine liaison du SPS et pourcentage de Rapport Pourcentage de récupé % de liaison du SPS )2) Protéine/ pération de protéine I) SPS  Table 6 2: SPS Binding Protein Recovery and Percentage Ratio Percentage of Recovered% SPS Binding) 2) Protein Protein / Protein I) SPS

91,5 O91.5 O

94,4 7794.4 77

12,5 95,3 9012.5 95.3 90

6,25 96, 1 706.25 96, 1 70

3,125 96,8 603,125 96.8 60

Pourcentage de récupération de protéine = -l 1 NC 1 x 6,25 lx 100, o NC 1 = pourcentage d'azote dans le produit de centrift gation I. 2) pourcentage de liaison du SPS =  Percentage of protein recovery = -l 1 NC 1 x 6.25 lx 100, where NC 1 = percentage of nitrogen in centripation product I. 2) percent binding of SPS =

(% P/H) (% P/H)(% W / w) (% w / w)

x (% reurration protine) 5 x(% recuperation protine 100 1- l 5/ rapport de SPS J o, (% P/H) est le rapport protéine/matière sèche dans le précipité séché, et  x (% protein reurration) 5 x (% protein recovery 100-1 / 5 SPS ratio), (% w / w) is the protein / dry matter ratio in the dried precipitate, and

(% P/H) se rapporte au précipité sans addition de SPS.  (% W / w) refers to the precipitate without the addition of SPS.

Exemple 7 (exemple d'application) Cet exemple décrit la préparation d'une p v p.  Example 7 (Application example) This example describes the preparation of a p v p.

en utilisant la préparation de SPS-ase KRF 92 B-I compor-  using the preparation of SPS-ase KRF 92 B-I comprising

tant 5 % de matière sèche Le procédé de préparation est le même que celui de l'exemple 3 C, sauf que toutes les masses sont divisées par un facteur 5 La p v p a été analysée comme décrit à l'exemple 2 Les résultats obtenus  5% dry matter The preparation method is the same as that of Example 3C, except that all the masses are divided by a factor 5. The pvp was analyzed as described in Example 2. The results obtained

dans l'essai apparaissent dans le tableau 7 1.  in the test appear in Table 7 1.

Tableau 7 1: Résultats obtenus à l'exemple 7 a Analysé par Bioteknisk Institut, Holbergsvej 10, DK-6000  Table 7 1: Results obtained in Example 7 a Analyzed by Bioteknisk Institute, Holbergsvej 10, DK-6000

Kolding.Kolding.

b Analysé par Qvist's Laboratorium, Marselis Boulevard 169, DK-8000 Aarhus C. Exemple 8 (exemple d'applicatio: Cet exemple montre l'effet d'un pré-traitement de la farine de soja par une cuisson au jet de vapeur avant la préparation de la p v p. Pré-traitement:  b Analyzed by Qvist's Laboratorium, Marselis Boulevard 169, DK-8000 Aarhus C. Example 8 (Application example: This example shows the effect of pre-treatment of soy flour by steam jet cooking before preparation of the pv Pre-treatment:

Une suspension de farine de soja dans l'eau con-  A suspension of soy flour in the water

sistant en 10 kg de farine de soja (Sojamel 13 produit par Aarhus Oliefabrik A/S) par 100 kg a été pompée à travers un éjecteur de vapeur (type Hydroheater B-300) et mélangée avec de la vapeur à 8 bars en une telle quantité et à une telle vitesse qu'on a pu maintenir une température finale de 150 C pendant 25 sec dans un réacteur tubulaire pressurisé Ensuite la pression a été réduite dans une chambre de détente (un cyclone) d'o la suspension a été envoyée dans un échangeur de chaleur à plaque dans lequel  10 kg of soy flour (Sojamel 13 produced by Aarhus Oliefabrik A / S) per 100 kg was pumped through a steam ejector (type Hydroheater B-300) and mixed with steam at 8 bar in such a way. amount and at such a rate that it was possible to maintain a final temperature of 150 C for 25 sec in a pressurized tubular reactor. Then the pressure was reduced in a flash chamber (a cyclone) where the suspension was sent to a plate heat exchanger in which

elle a été refroidie à environ 50 C La boue refroi-  it was cooled to about 50 ° C. The cooling sludge

die a pu être utilisée telle quelle pour la préparation de p v p suivant l'invention, mais, dans ce cas, la suspension Composant Masse (Nx 6,25) Matièr Rendement Rendement en sèche sn protéine mat sèche Il % % % Farine de soja 85,2 55,2 94,0 100 100  It could be used as such for the preparation of pvp according to the invention, but, in this case, the suspension Component Mass (Nx 6.25) Material Yield Yield in dry sn dry protein dry II%% Soy flour 85 , 2 55.2 94.0 100 100

Préparation d'enzyrce4,0 71,2 6,1 -  Preparation of enzyrce4,0 71,2 6,1 -

ler produit de cen632 1,88 5,44 25,3 43,0 trifugation 28 produit de cen 673 0,30 0,80 4,3 6,7 trifugation p.v p; 39,8 85, 6 a98,1 71,9 48,8 84,4 98,1 b a été séchée par pulvérisation à une température d'entrée de 200 C et à une température de sortie de 90 C Le produit pré-traité indique une teneur en matière sèche de  the product of cen632 1.88 5.44 25.3 43.0 trifugation 28 product of cen 673 0.30 0.80 4.3 6.7 trifugation p.v p; 39.8 85, 6 a98.1 71.9 48.8 84.4 98.1 b was spray dried at an inlet temperature of 200 C and an outlet temperature of 90 C The pre-treated product indicates a dry matter content of

96,5 % et une teneur en protéine de 56-,9 % (N x 6,25).  96.5% and a protein content of 56-, 9% (N x 6.25).

Préparation de la p v p. Cette préparation a été effectuée de la manière suivante: On a mis 70 g de matière sèche de farine de soja jet de vapeur et sèchée en suspension et on a sous agitation à 50 C dans 560 g d'eau et on a règlé le p H à 4,50 au moyen transféré 6 x 90 g de cette 250 mlet on a maintenu sous d'eau au moyen d'agitateurs Erlenmeyer on a ajouté 10 g respectivement O g, 0,025 g, 0,40 g de la préparation de mrlanges réactionnels ont ensuite de 6,5 ml d'H Cl 6 N On a suspension dans-6 flacons d'Erlenmeyers de agitation à 50 C dans un bain magnétiques -A chaque flacon d' d'une solution contenant 0,050 g, 0,10 g, 0,20 g et SPSase KRF-68-B-III Les té agités pendant 240 minutes à 50 C On a ensuite effectué une centrifugation pendant  Preparation of the p v p. This preparation was carried out as follows: 70 g dry matter soybean meal was steamed and dried in suspension and it was stirred at 50 [deg.] C. in 560 g of water and the pH was adjusted. at 4.50 with the transferred medium 6 x 90 g of this 250 ml was kept under water by means of Erlenmeyer stirrers 10 g, 0.025 g, 0.40 g of the reaction mixture mixture were added respectively. Then 6.5 ml of 6N HCl were suspended in 6 flasks of stirring Erlenmeyer flasks at 50 ° C. in a magnetic bath. Each flask of a solution containing 0.050 g, 0.10 g , 0.20 g, and SPSase KRF-68-B-III. Stirred for 240 minutes at 50 ° C.

minutes à 3000 x g.minutes to 3000 x g.

Le surnageant a ensuite été analyse suivant la méthode de Kjeldahl-N et la phase solide a été lavée à l'eau l volumes égaux et a été centrifugée Cette opération a été effectuée deux fois La phase solide a ensuite été lyophilisée et analysée pour la détermination de Kjeldahl-N  The supernatant was then analyzed according to the Kjeldahl-N method and the solid phase was washed with equal volumes of water and centrifuged. This operation was carried out twice. The solid phase was then lyophilized and analyzed for the determination. from Kjeldahl-N

et des matières sèches.and dry matter.

Un essai semblable a été effectué avec une farine de soja non traitée (Sojamel 13 de Aarhus Oliefabrik A/S) utilisée en tant que substance de départ Dans ce cas, les rapports de l'enzyme au substrat étaient de O %, 1 %, 2 %, 3 %,  A similar test was carried out with untreated soy flour (Aarhus Oliefabrik Sojamel 13 A / S) used as the starting material. In this case, the ratio of enzyme to substrate was 0%, 1%, 2%, 3%,

4 % et 8 %.4% and 8%.

En se basant sur la teneur en protéine des sur-  Based on the protein content of

nageants, on a pu calculer le pourcentage de protéine récupérée Le rendement en protéine est basé sur cuite au maintenu l'hypothèse que la substance d'enzyme est solubilisée à 100 % après la réaction Le tableau ci-dessous indique les  The percentage of recovered protein was calculated based on the percentage of protein recovered. The yield of protein is based on the following assumption: the enzyme substance is solubilized at 100% after the reaction.

résultats obtenus par les deux essais.  results obtained by both tests.

Tableau 8 1: Rendements en protéine et rapport protéine/ matière sèche pour une p v p préparée à  Table 8 1: Protein yields and protein / dry matter ratio for a pvp prepared in

partir de farine de soja cuite ou brute.  from cooked or raw soy flour.

En ce qui concerne les processus d'extraction  With regard to extraction processes

(isolation) appliqués à des substances différentes des pro-  (insulation) applied to substances different from

téines ou les processus de liquéfaction et les techniques qui y sont apparentées, on se référera au schéma général de procédés pour des applications, comme représenté au tableau  the process of liquefaction and related techniques, reference is made to the general process flow diagram for applications, as shown in the table.

synoptique n 3.synoptic n 3.

Le substrat peut consister en un ou plusieurs hydrates de carbone présents dans la substance brute ou bien  The substrate may consist of one or more carbohydrates present in the raw material or

il peut consister en la totalité de la substance brute.  it can consist of the whole of the raw substance.

Ce substrat peut être soumis à un prétraitement de nature chimique ou physique, comme expliqué plus loin à titre d'exemple, constitué par un traitement acide ou alcalin, un trempage ou un mouillage et/ou une cuisson avec ou sans vapeur. La substance brute peut être macérée, coupée, moulue à l'état humide et/ou homogénéisée (tous ces traitements étant qualifiés d'homogénéisation au tableau synoptique n 3), Farine de soja cuite Farine de soja non-traitée E/S % Rendement Protéine des Rendement en Protéine de en protéine mat sêches protéine mat sèches  This substrate may be subjected to a pretreatment of a chemical or physical nature, as further explained by way of example, consisting of acidic or alkaline treatment, dipping or wetting and / or cooking with or without steam. The raw material can be macerated, cut, milled in the wet state and / or homogenised (all these treatments being referred to as homogenization in Table 3), Cooked soy flour Untreated soybean flour I / O% Yield Protein Protein Yield Protein Mat Dry Dried Protein Protein

O 92,9 76,5 90,7 73,9O 92.9 76.5 90.7 73.9

0,25 90,1 86,60.25 90.1 86.6

0,50 89,3 88,70.50 89.3 88.7

1,0 88,1 89,7 87,1 86,21.0 88.1 89.7 87.1 86.2

2,0 86,6 91,7 85,7 88,12.0 86.6 91.7 85.7 88.1

3,0 84,3 -89,53.0 84.3 -89.5

4,0 84,7 92,2 82,6 90,94.0 84.7 92.2 82.6 90.9

8,0 76,2 91,18.0 76.2 91.1

avec ou sans addition d'eau, d'autres additifs pouvant être ajoutés pendant cette étape L'homogénéisation peut  with or without the addition of water, other additives may be added during this step Homogenization may be

être effectuée avec différents degrés d'efficacité, diffé-  be carried out with different degrees of efficiency, different

rentes pressions n'étant, par exemple, qu'une fraction de la pression maximum donnée pour l'équipement d'h Iomogénéisa- tion spécifique utilisée On peut ajouter différents  For example, some pressures are only a fraction of the maximum pressure given for the specific homogenization equipment used.

additifs avant ou pendant l'homogénéisation, comme représen-  additives before or during homogenization, as a representative

té par bl, b 2 bn dans le tableau synoptique n 3.  by bl, b 2 bn in the synoptic table n 3.

Le processus réactionnel y compris la prénaration de la SPS-ase est effectué dans des conditions spécifiques, par exemple de température, de pression, de durée, de p H et de dosage d'enzyme; de même, des recommandations concernant le réacteur utilisé (par exemple discontinu, écoulement tamponné) et l'agitation, si nécessaire, sont importantes On peut utiliser-une série d'additifs pour différentes substances  The reaction process including SPS-ase prENARATION is carried out under specific conditions, for example temperature, pressure, time, pH and enzyme assay; similarly, recommendations concerning the reactor used (eg batch, buffered flow) and agitation, if necessary, are important. A series of additives for different substances can be used.

brutes, représentés par c c 2 cn dans le tableau synop-  raw, represented by c c 2 cn in the synoptic table.

tique n 3.tick 3.

De même, les opérations de séparation peuvent être effectuées avec différents degrés d'efficacité Dans de nombreux cas, la séparation est omise ou facilitée, par  Similarly, separation operations can be performed with varying degrees of efficiency. In many cases, separation is omitted or facilitated by

exemple lorsque la substance brute est complètement liqué-  example when the raw substance is completely

fiée On peut utiliser différents dispositifs de sépara-  It is possible to use different separating devices

tion (par exemple des centrifugeuses, des filtres, des dis-  (eg centrifuges, filters,

positifs d'ultrafiltration, des hydrocyclones, des épaissis-  positive ultrafiltration, hydrocyclones, thickeners

seurs, des tamis ou cribles ou des simples décanteurs).  sieves, sieves or screens or simple decanters).

L'efficacité de la séparation est définie comme la proportion entre la teneur absolue en boues dans la phase  The efficiency of the separation is defined as the proportion between the absolute content of sludge in the phase

des solides et la teneur absolue en boues du mélange réac-  solids and the absolute sludge content of the reaction mixture

tionnel -tional -

Les phases liquides ou solides obtenues peuvent être traitées ultérieurement,par exemple concentrées, séchées ou  The liquid or solid phases obtained can be further processed, for example concentrated, dried or

être extraites par solvant, -afin d'éliminer certaines com-  be extracted by solvent, in order to eliminate certain

posants comme la graisse ou l'huile; elles peuvent également fermenter pour produire une biomasse, de l'alcool ou d'autres  poses like fat or oil; they can also ferment to produce biomass, alcohol or other

produits (des enzymes, des antibiotiques ou d'autres compo-  products (enzymes, antibiotics or other

sants utilisables).usable).

De même, les produits obtenus peuvent être recyclés  Similarly, the products obtained can be recycled

dans le processus de manière à répéter le traitement.  in the process so as to repeat the treatment.

Tableau synoptique n 3 Préparation de SPS-ase cl c 2. c n  Synopsis Table 3 Preparation of SPS-ase cl c 2. c n

( H 1 = O 100 %)(H 1 = O 100%)

Hom Conditions de réaction à préciser -upra) ( p= O 100 %-) (sep 3 olides Traitements ultérieurs (voir texte) ou réutilisation en tant que substrat Les exemples qui suivent montrent des applications des préparations de SPS-ase et la liste suivante donne un  Hom Reaction conditions to be specified -upra) (p = O 100% -) (sep 3 olides Subsequent treatments (see text) or reuse as substrate The following examples show applications of SPS-ase preparations and the following list give a

résumé de ces applications.summary of these applications.

De même, le tableau 1 annexé indique certaines  Similarly, the annexed Table 1 indicates certain

caractéristiques concernant le tableau synoptique n 3.  characteristics concerning the synoptic table n 3.

-2518570-2518570

Liste d'applications de préparations de SPS-ase, à titre  List of applications of SPS-ase preparations, as a

d'exemples.examples.

l Xype de prépa Référence rations de N SPS-ase Préparation de  l Xype of prepa Reference N SPS-ase rations Preparation of

PS-ase sub-PS-ase sub-

tantiellennt pxempte d'une Du plusieurs  tantiellennt the price of one of several

activités en-activities

% 5 matiques non _ L 6 sirées% 5 non _ L 6 subjects

A 1A 1

A 2A 2

A 3A 3

A 4A 4

A 5AT 5

Ba 1 Ba 2 Ba 3 Ba 5 Ba 6 Ba 7 Bb 1 Bb 2 Bb 3 Bb 4 Bb 5 Bb 6 Bc 1 Bc 2 Bc 3 Bc 4 Bc 5 Bc 6 Bc 7 Extraction d'amidon de mais, de blé et de poemmes de terre Extraction de lipides de substances végétale E Extraction d'huiles éthériques de substances végétales  Ba 1 Ba 2 Ba 3 Ba 5 Ba 6 Ba 7 Bb 1 Bb 2 Bb 3 Bb 4 Bb 5 Bb 6 Bc 1 Bc 2 Bc 3 Bc 4 Bc 5 Bc 6 Bc 7 Corn starch, wheat and poem extraction soil Extraction of lipids from vegetable substances E Extraction of etheric oils from vegetable substances

Extraction de colorants naturels de substan-  Extraction of natural dyes of substances

ces v&éétales Extraction de caoutchouc du buisson guayul  these vététales Extraction rubber guayul bush

Production d'un substitut de lait pour ani-  Production of a milk substitute for animals

maux domestiques Production de substances brutes contenant de l'amidon saccharifié Liquéfaction complète de poires ou d'autres fruits Production de jus par traitement de fruits et de végétaux Traitement concernant l'extraction ou le  domestic ailments Production of raw materials containing saccharified starch Complete liquefaction of pears or other fruits Production of juices by treatment of fruits and vegetables Treatment concerning the extraction or

pressage de la canne à sucre ou de la bette-  pressing of sugar cane or sugar beet

rave à sucre Production de lait de soja Traitement destiné à accroître la quantité récupérable de matières solubles de café Prévention et/ou décorposition du louche de pomme Utilisation en tant que agent clarifiant de vin blanc Production de ISSPH ou d'autres hydrolisats de protéine végétale Enzyme de brassage pour l'industrie de la bière Additif enzymatique pouvant être utilisé pendant la fermentation et/ou le stockage de la bière Agent destiné à enlever la beau de l'amande Décomposition de différents déchets Saccharification et fermentation simultanée Décomposition de cellulose Application en tant que additif de cuisson Amélioration du rendement en alcool et en biomasse pendant la fermentation de la liqueur de sulfite dans la production du papier Assèchement de produits de boue biologique  sugar roe Production of soy milk Treatment to increase the recoverable amount of coffee solubles Prevention and / or decoration of apple ladle Use as a clarifying agent for white wine Production of ISSPH or other vegetable protein hydrolisates Enzyme brewing equipment for the beer industry Enzymatic additive that can be used during the fermentation and / or storage of beer Agent to remove the almond's beauty Decomposition of different waste Saccharification and simultaneous fermentation Decomposition of cellulose Application as cooking additive Improvement of alcohol and biomass yield during fermentation of sulphite liquor in paper production Dewatering of organic sludge products

Additif pour aliment de bétail ensilé.  Additive for silage feed.

1_ I1_ I

u 10 Bau 10 Ba

Liquéfac-liquefaction

tion com-com

plète ouplete or

traite-treaty-

ment sem-semantically

blable Additifsblable additives

de pro-of pro-

cessus AutresOther

appli-applicable

cations Pa- ta- ltion PPS- ase bon Iix Eiée w (A w CD Lni CD (Ai Ln Additifs___ lè hcuto 2 è homo Sépara Phase Traitements ultérieurs Réf Substrat ___ génèisa généisa tion liquide a b C tion tion Phase Phase comnbinée Hc Hanq 1 Iam Sép solide (sans séparation) * i Mats Eau Eau, Na OII (Contient Opération E  cations Table PPS-ase good Iix Eee w (A w CD Lni CD (Ai Ln Additives___ hcuto 2 è homo Separate Phase Subsequent treatments Ref Substrate ___ genesis liquid generation ab C tion tion Phase Phase comnbinée Hc Hanq 1 Iam Solid Sep (without separation) * i Mats Water Water, Na OII (Contains Operation E

ou 20 -50 10 -30 30 -50 des ger de lavage-  or 20 -50 10 -30 30 -50 washing ger-

fici fles) lavage,fici fles) washing,

récupéra-récupéra-

tion de l'huile * 2 Germe de Na QUI (Huile +  oil * 2 germ of Na WHO (oil +

mais ou O O 100 eau) Déchets-but or O O 100 water) Waste-

Ui Ci Purifica-Ui Ci Purifica-

tion Ba i iarne de Pasteurisation" soja (dé Eau H Cl O O O O concentration,  the "Pasteurisation" soybean (water HCl O O O O concentration,

graissée) séchage par pulvé-greased) spray drying

risationauthorization

2 a Patate Terma Na OH Levure pour la fer-  2 a Potato Terma Na OH Yeast for the fer-

douce Eau myl ou nntation de l'alcool H Cl distillation Ba Betterave Na OH Cristal (Déchet) à sucre Eau ou 10 % 10 lisation IICL Bc 12 i dtu I k Eau Cl 1 % Lvure pour la forern ______ 1 ai de tation d Ie I 'alcool, -tC ie_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ i W a i o w Ln -4.j C> A 1 Extraction d'amidon de mais, de blé et de pommes de terre. L'extraction d'amidon de mals, de blé, de pommes de terre et d'autres plantes contenant de l'amidon est effectuée par l'une ou plusieurs des étapes suivantes macération, broyage à l'eau et séparation L'utilisation d'une préparation de SPS-ase ne comportant essentiellement aucune activité amylolytique fournit les avantages suivants, le mais étant utilisé à titre d'exemple 1 La libération d'amidon est facilitée pour une période de macération plus courte, 2 La consommation d'eau peut être réduite, 3 La libération du germe de mals est facilitée sans libération de l'huile du germe de mals, 4 On peut obtenir la protéine en une pureté plus élevée, La récupération de l'eau de macération de  Sweet Water or methyl alcohol H Cl distillation Ba Beetroot Na OH Sugar crystal or water 10% IICL Bc 12 i dtu I k Water Cl 1% Lvure for the forern ______ 1 ai de tation d Ie Alcohol, -tC ie_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ i W aiow Ln -4.j C> A 1 Starch extraction from maize, from wheat and potatoes. The extraction of starch from maize, wheat, potatoes and other starch-containing plants is carried out by one or more of the following steps: maceration, water grinding and separation. A SPS-ase preparation having essentially no amylolytic activity provides the following advantages, maize being used as an example. The release of starch is facilitated for a shorter maceration period. The release of the corn germ is facilitated without releasing the oil of the mal germ, 4 The protein can be obtained in a higher purity, The recovery of the maceration water

mals est facilitée.it's easier.

A 2 Extraction de lipides de substances végétales.  A 2 Extraction of lipids from vegetable substances.

Etant donné que les-lipides d'une substance végétale sont enfermés à l'intérieur de cellules et généralement liés aux protéines, on peut extraire les lipides en phase aqueuse en les traitant avec une préparation de SPS-ase qui est essentiellement exempte de lipases Ainsi, l'huile de germe de mais est normalement isolée par extraction à l'hexane des germes sèchés de mais Cependant, l'opération de séchage est superflue si les germes de mais humides sont  Since the lipids of a plant substance are enclosed within cells and generally bound to proteins, the lipids can be extracted in the aqueous phase by treating them with an SPS-ase preparation which is essentially free of lipases. , corn germ oil is normally isolated by hexane extraction of the dried corn germs. However, the drying operation is superfluous if the wet corn sprouts are

traités avec une préparation de SPS-ase du genre susmen-  treated with a SPS-ase preparation of the kind

tionné De manière analogue, l'extraction de l'huile d'olive en phase aqueuse peut être améliorée, si l'enzyme utilisée pour le traitement enzymatique est une préparation de SPS-ase eu genre susmentionné, voir, par exemple, Food, Pharmaceutical and Bioengineering, No 172, volume 74, pages 93 à 94 De même, l'extraction aqueuse, par exemple,  In a similar manner, the extraction of olive oil in the aqueous phase can be improved, if the enzyme used for the enzyme treatment is a SPS-ase preparation of the above kind, see, for example, Food, Pharmaceutical and Bioengineering, No. 172, volume 74, pages 93 to 94 Similarly, aqueous extraction, for example,

de l'huile de soja, l'huile de colza et l'huile de tourne-  soybean oil, rapeseed oil and

''

sol peut être améliorée de manière analogue.  soil can be improved in a similar way.

A 3 Extraction d'huiles éthériques de substances végétales Si des substances végétales contenant des huiles éthériques sont extraites au moyen d'une solution aqueuse d'une préparation de SPS-ase qui est essentiellement exempte d'activité enzymatique capable de décomposer ou de  A 3 Extraction of etheric oils from vegetable substances If vegetable substances containing etheric oils are extracted using an aqueous solution of an SPS-ase preparation which is essentially free of enzymatic activity capable of decomposing or

modifier d'une autre manière les huiles éthériques, celle-  modify in another way the etheric oils, that

ci sont récupérées en des rendements élevés, à des frais  they are recovered in high returns, at a cost

très bas.very low.

A 4 Extraction de colorants naturels de substances végé-  A 4 Extraction of natural dyes from vegetable substances

tales.tales.

Si l'on traite des substances végétales conte-  If we treat vegetal substances containing

nant des colorants, par exemple des racines de betteraves  dyes, for example beetroot roots

contenant le colorant rouge bétanine ou le colorant conte-  containing the red betain dye or the

nu dans les airelles, avec une préparation de SPS-ase qui  naked in cranberries, with a preparation of SPS-ase that

est essentiellement exempte d'activités enzymatiques capa-  is essentially free of enzyme activities which are

bles de décomposer ou de modifier d'une autre manière les colorants, ceuxci sont récupérés en de hauts rendements, à  decays or otherwise modify the dyes, they are recovered in high yields,

des frais très bas.very low fees.

A 5 Extraction de caoutchouc du buisson guayul.  A 5 Extraction of rubber from guayul bush.

Un autre exemple de substrat pour une prépara-  Another example of a substrate for a preparation

tion de SPS-ase qui est essentiellement exempte d'une activité enzymatique capable de décomposer le caoutchouc naturel est la substance de parois cellulaires dans les  of SPS-ase which is essentially free of enzymatic activity capable of decomposing natural rubber is the cell wall

racines et branches du buisson guayul.  roots and branches of guayul bush.

Ba 1 Production d'un substitut de lait pour animaux domes-  Ba 1 Production of a domestic animal milk substitute

tiques, de préférence un substitut de lait pour veau.  ticks, preferably a milk substitute for veal.

On peut produire un substitut de lait pour veau qui est soluble dans l'eau froide à un p H d'environ 4,5 par une liquéfaction complète en milieu aqueux de fèves de soja, de graines de tournesol, de graines de c oton, de fèves faba ou de pois des champs En utilisant une substance brute contenant de l'amidon comme des fèves faba ou pois des champs,on peut accomplir la liquéfaction-de l'amidon au moyen d'une alpha-amylase avant, après ou  A calf-milk substitute which is soluble in cold water can be produced at a pH of about 4.5 by complete liquefaction of soya beans, sunflower seeds, coconut seeds in an aqueous medium, of faba beans or field peas By using a raw material containing starch such as faba beans or field peas, the liquefaction of starch can be accomplished by means of an alpha-amylase before, after or after

1857018570

66.66.

pendant le traitement avec la SPS-ase qui solubilise fina-  during treatment with SPS-ase, which solubilizes

lement les polysaccharides qui ne sont pas de l'amidon et  polysaccharides which are not starch and

qui sont présents en tant que substance formant la structu-  which are present as a substance forming the structure

re des parois cellulaires On montre un exemple détaillé ci-dessous, en utilisant des fèves faba, qui scnt c Pparées au soja,en se référant au tableau I Le prétraitement des fèves de soja peut, de préférence, consister en une cuisson par jet  The following is an example detailed below, using faba beans, which are prepared with soybean, with reference to Table I. Pre-treatment of soybeans may preferably consist of jet cooking.

de vapeur, ce qui améliore la solubilisation de la rémanen-  of steam, which improves the solubilization of

ce. Exemple Ba 1 1 On met 15 kg de farine de fève faba (Farine de Fèves  this. Example Ba 1 1 15 kg of faba bean flour (beans flour)

des GRANDES MINOTERIES A FEVES DE FRANCE, Paris) en suspen-  MAJOR MINOTERIES IN FEVES DE FRANCE, Paris)

sion dans 35 litres d'eau On ajoute 75 g de Termamyl L et 18 g de Ca C 12 On a chauffé la suspension à 95 C  35 g of water are added. 75 g of Termamyl L and 18 g of Ca C 12 are added. The suspension is heated to 95 ° C.

en utilisant un récipient à chemise de vapeur et en agitant.  using a steam jacketed container and stirring.

La suspension a ensuite été traitée à cette température pendant 60 minutes Ensuite on a règlé le p H à 4,5 et le produit a été refroidi à 50 C On a dissous 300 g de la préparation de SPS-ase KRF 68 dans 1 litre d'eau et on l'a ajouté à la suspension La réaction a été effectuée pendant 440 minutes Lorsqu'on a introduit 10 g de  The suspension was then treated at this temperature for 60 minutes. The pH was then adjusted to 4.5 and the product was cooled to 50 ° C. 300 g of the SPS-ase KRF 68 preparation was dissolved in 1 liter of The reaction was carried out for 440 minutes when 10 g of

Fungamyl 800 L la fraction d'amidon a été transformée prin-  Fungamyl 800 L the starch fraction has been transformed primarily

cipalement en disaccharide (maltose) Ensuite, le mélange de réaction a été pasteurisé à 90 C, pendant 2 mn Une partie aliquote du produit est ensuite lyophilisée et utilisée pour des essais de stabilité L'échantillon a ens:ite été solubilisé à 10 % de matière sèche et la solution du  The reaction mixture was then pasteurized at 90 ° C. for 2 minutes. An aliquot of the product was then freeze-dried and used for stability tests. The sample was then solubilized at 10% concentration. dry matter and the solution of

produit a pu être maintenue stable sans sédimentation pen-  The product could be kept stable without sedimentation

dant plusieurs jours.several days.

De la graisse ou de l'huile fondue peut être  Fat or melted oil can be

facilement émulsifiée dans le produit en obtenant une com-  easily emulsified in the product by obtaining a

position finale très semblable au lait de vache Une  final position very similar to cow's milk A

émulsion contenant 3,5 % d'huile (huile de soja) a égale-  emulsion containing 3.5% oil (soybean oil) also

ment pu être maintenue stable sans sédimentation pendant  could have been maintained stable without sedimentation during

plusieurs jours.several days.

Exemple Ba 1 2Example Ba 1 2

On a fait cuire au jet de vapeur à 150 'C pendant secondes, comme décrit à l'exemple 8, de la farine de soja (Sojamel 13) La farine de soja cuite au jet de vapeur a été sèchée par pulvérisation et utilisée pour des recher-  The soya flour (Sojamel 13) was steam cooked at 150 ° C. for 2 seconds as described in Example 8. The steamed soy flour was spray-dried and used for steaming. recher-

ches ultérieures décrites ci-après.  subsequent steps described below.

A: On a mélangé 50 g de farine de soja cuite au jet de vapeur avec 450 g d'eau et on a règle le p H à 4,5 au moyen de 4,1 ml de H Cl 6 N Le mélange a ensuite été chauffé à 450 C dans un bain d'eau et on a ajouté 0, 250 g de la préparation de SPS-ase KRF-68 au mélange chauffé que  A: 50 g of steamed soy flour was mixed with 450 g of water and the pH was adjusted to 4.5 by means of 4.1 ml of 6 N HCl. heated to 450 ° C. in a water bath and 0.250 g of the SPS-ase KRF-68 preparation was added to the heated mixture which

l'on a fait réagir pendant 5 heures sous agitation.  it was reacted for 5 hours with stirring.

Ensuite, on a chauffé le mélange à 80 C pendant 2 minutes-  Then, the mixture was heated at 80 ° C. for 2 minutes.

afin d'inactiver l'enzyme On a centrifugé un échantillon de 100 ml à température ambiante pendant 15 minutes à 3000 x g (g = gravité) Le surnageant a été soumis à un échange  In order to inactivate the enzyme A 100 ml sample was centrifuged at room temperature for 15 minutes at 3000 x g (g = gravity). The supernatant was exchanged.

ionique et a été analysé par HPLC pour déterminer la compo-  ionic and was analyzed by HPLC to determine the

sition de l'hydrate de carbone Le surnageant a également été analysé pour la détermination de l'azote par la méthode de Kjeldahl, des matières sèches et du degré de solubilité de l'azote 'nitrogen solubility index NSI); on a également calculé le degré de solubilité des matières sèches (dry matter solubility index DSI); voir les résultats du  The supernatant was also analyzed for nitrogen determination by the Kjeldahl method, solids, and the degree of solubility of nitrogen (nitrogen solubility index NSI); the degree of dry matter solubility index (DSI) has also been calculated; see the results of the

tableau Ba I On a introduit 100 ml du mélange réaction-  Table I was charged with 100 ml of the reaction mixture.

nel refroidi à 200 C dans un récipient de 100 ml gradué et  nel cooled to 200 ° C in a 100 ml graduated container and

on l'a maintenu à 40 C pendant 2 jours La stabilité à la.  it was kept at 40 ° C. for 2 days.

dispersion ( %) a été mesurée en lisant le volume des dis-  dispersion (%) was measured by reading the volume of dis-

persions obtenues (tableau Ba II) après l et 2 jours.  obtained persions (Table Ba II) after 1 and 2 days.

On a ajouté 8 g d'huile de soja à 200 ml du mélange réactionnel (à 20 'C) On a préparé une émulsion en  8 g of soybean oil were added to 200 ml of the reaction mixture (at 20 ° C.).

mélangeant pendant 2 minutes dans un mélangeur de Waring.  mixing for 2 minutes in a Waring blender.

La stabilité de l'émulsion (%) a été mesurée comme ci-  The stability of the emulsion (%) was measured as above

dessus après 1 et 2 jours.above after 1 and 2 days.

B: On a effectué une réaction comme ci-dessus, dans ce cas, cependant, on a utilisé 1,00 g de la préparation de SPS-ase On a effectué les mêmes genres d'analyse et de mesures de stabilité que ceux décrit à la partie A Les- résultats sont représentés dans les tableaux Ba I et Ba II.  B: A reaction was carried out as above, in this case, however, 1.00 g of the SPS-ase preparation were used. The same kinds of analysis and stability measurements were carried out as described in US Pat. Part A The results are shown in Tables Ba I and Ba II.

Des analyses chimiques des surnageants, il apparaît que les valeurs de NSI (%) et de DSI (%) obtenues dans l'essai B sont plus élevées que celles obtenues pour l'essai A Cependant, les essais de stabilité effectués sur les mélanges réactionnels donnent une meilleure valeur pour les échantillons A Ceci est probablement da à la plus grande longueurde la chaine de peptides des protéines du mélange réactionnel résultant du dosage plus  Chemical analyzes of the supernatants show that the NSI (%) and DSI (%) values obtained in test B are higher than those obtained for test A. However, the stability tests carried out on the reaction mixtures give better value for samples A This is probably da at the greatest length of the peptide chain of the proteins in the reaction mixture resulting from the higher dosage.

faible en enzymes.low in enzymes.

De la composition de l'hydrate de carbone déter-  The composition of the carbohydrate deter-

minée par HPLC, il apparait que l'on produit principalement des monosaccharides et des disaccharides De ce fait, des oligosaccharides dont il est connu qu'ils provoquent la diarrhée et la flatulance lorsqu'on les donne aux veaux en de quantités trop importantes, ne sont présentes qu'en de  HPLC results in the production of mainly monosaccharides and disaccharides. As a result, oligosaccharides known to cause diarrhea and flatulence when given to calves in are present

faibles quantités.low quantities.

Tableau Ba I Propriétés chimiques du surnageant.  Table Ba I Chemical properties of the supernatant.

EssaisDosage des x Résultats enzymes par NSI, % DSI, % H P L C (compo rapport (à p H = (à p H = sition de -sucres au substrat 4,5) 4,5) neutres) % en poids  TestsDose of x Results enzymes by NSI,% DSI,% H P L C (compo ratio (at p H = (at p H = sition of -sugar at the substrate 4,5) 4,5) neutral)% by weight

DP + DP 2:79,7 %DP + DP 2: 79.7%

A E/S = 0,5 % 39,9 62,4 1 2,At I / O = 0.5% 39.9 62.4 1 2,

DP 3: 7,4 %DP 3: 7.4%

DP:12,2 %DP: 12.2%

DP 4 +: 8,1 %DP 4 +: 8.1%

DP_ + DP:84,4 %DP_ + DP: 84.4%

B E/S = 2,0 % 57,0 67 DP 2 6,1 %B I / O = 2.0% 57.0 67 DP 2 6.1%

DP 3: 6,1 %DP 3: 6.1%

DP: 3,7 %DP: 3.7%

DP: 5,7 %DP: 5.7%

NSI = Degré de solubilité de l'azote "DSI= Degré de solubilité des matières sèches 1 O Tableau Ba II Essais de stabilité des mélanges réactiornnels Essais Dosage des Essai de stabilité enzymes par Sans huile Avec huile rapport au substrat Dispersion Dispersion Emulsion Emulsion % en poids ler jour 2 è jour ler jour 2 è jour  NSI = Degree of solubility of nitrogen DSI = Degree of solubility of solids 1 O Table Ba II Tests of stability of reaction mixtures Tests Assay of stability test enzymes by Oil-free With oil compared to substrate Dispersion Dispersion Emulsion Emulsion% en weight 1st day 2nd day 1st day 2nd day

A E/S = 0,5 % 80 % 63 % 100 % 87 %At I / O = 0.5% 80% 63% 100% 87%

*B E/S = 2,0 % 66 % 35 % 85 % 71 %* B I / O = 2.0% 66% 35% 85% 71%

Ba 2 Production de substances brutes contenant de l'amidon saccharifié. En ce qui concerne la saccharification du manioc et de patates douces et d'autres substances végétales  Ba 2 Production of raw substances containing saccharified starch. With regard to the saccharification of cassava and sweet potatoes and other vegetable substances

contenant de l'amidon, l'addition d'une préparation de SPS-  containing starch, the addition of a SPS-

ase peut résoudre des problèmes de viscosité En utilisant une préparation de SPS-ase, il est possible de produire des suspensions d'amidon présentant une teneur en matières sèches de 25 à 30 %, et après saccharification, la pate  cane can solve viscosity problems Using a SPS-ase preparation, it is possible to produce starch suspensions with a solids content of 25 to 30%, and after saccharification, the dough

peut fermenter pour obtenir un éthanol bon marché.  can ferment to obtain a cheap ethanol.

Exemple Ba 2 1Example Ba 2 1

On prépare une purée présentant uneteneur en matières sèches de 24 % à partir de patates douces (Japon) fraîches et rapées La teneur en amidon des patates douces se situe aux environs de 70 % de la teneur en matières sèches de celles-ci Une première liquéfaction au moyen de l'amylase bacterielle Termamyl 60 L (désignation commerciale) en me quantité de 0,5 kg/t, d'amidon a ôté effectu Ae en chauffant la purée C Ensuite elle a été maintenue à 90 C pendant 30 minutes On a ensuite mesuré la viscosité 771 du mélange réactionnel au moyen d'un fuseau HAAKE à 90 C.  A puree with a dry matter content of 24% is prepared from sweet potatoes (Japan) fresh and grated. The starch content of sweet potatoes is around 70% of the dry matter content thereof. A first liquefaction by means of the bacterial amylase Termamyl 60 L (commercial designation) in the amount of 0.5 kg / t, starch was removed by heating the purée C Then it was kept at 90 C for 30 minutes then measured the viscosity 771 of the reaction mixture by means of a 90 ° HAAKE spindle.

On a ensuite fait refroidir le mélange réaction-  The reaction mixture was then cooled

nel à 55 C, et on a règlé le p H à 5,0 au moyen de H 2 SO 4 2 N. On a ensuite initié une saccharification par addition de la gluco-amylase SAN 150 (marque déposée par NOVO INDUSTRIA/S) en un dosage de 1,75 litre/tonne d'amidon Le mélange de I Si 18570 X saccharification a ensuite été divisé en trois parties, A, B et C qui ont été traitées pendant 15 minutes par des enzymes comme représenté ci-dessous avant qu'on ne mesure la viscosité: At Cette partie est l'essai A blanc La viscosité 7 2 a été mesurée, voir tableau  at 55 ° C., and the pH was adjusted to 5.0 by means of H 2 SO 4 2 N. Sachalification was then initiated by the addition of the SAN 150 glucoamylase (registered trademark of NOVO INDUSTRIA / S). in a dosage of 1.75 liter / ton of starch The I Si 18570 X saccharification mixture was then divided into three parts, A, B and C which were treated for 15 minutes by enzymes as shown below before the viscosity is measured: At This part is the A white test The viscosity 7 2 has been measured, see table

Ba III.Ba III.

B: On a ajouté la cellulase Tricoderma viride de Celluclast 200 N en une quantité de 1 kg  B: Celluclast 200 N Tricoderma viride cellulase was added in an amount of 1 kg

par tonne de matières sèches de patates douces.  per tonne of sweet potato dry matter.

La viscosité q 3 a été mesurée, voir tableau  The viscosity q 3 has been measured, see table

Ba III.Ba III.

C: On a ajouté la préparation de SPS-ase KRF-68  C: The preparation of SPS-ase KRF-68 was added

en une quantité de 0,25 kg/tonne de matières.  in an amount of 0.25 kg / tonne of material.

sèches de patates douces On a mesuré la  dried sweet potatoes We measured the

viscosité 74, voir tableau Ba III.viscosity 74, see Table Ba III.

Tableau Ba III: Viscosités Ainsi, on peut donc constater que la viscosité du mélange réactionnel peut effectivement être réduite au moyen de la SPSase à dosage faible par rapport au  Table Ba III: Viscosities Thus, it can be seen that the viscosity of the reaction mixture can effectively be reduced by means of SPSase at low dosage compared to

CELLUCLAST (désignation commerciale) et au SAN 150.  CELLUCLAST (trade designation) and SAN 150.

Ba 3 Liquéfaction complète de poires ou d'autres fruits.  Ba 3 Complete liquefaction of pears or other fruits.

Si l'on traite ultérieurement avec une prépara-  If one deals later with a preparation

tion de SPS-ase des poires entières qui ont été écrasées mécaniquement, on effectue une liquéfaction complète et on produit un jus de poires clair après avoir éliminé de faibles quantités de matières solides Un procédé analogue peut être utilisé pour d'autres fruits semblables, par Mélange réactionnel Viscosité Viscosité  SPS-ase whole pears that have been crushed mechanically, complete liquefaction is performed and a clear pear juice is produced after the removal of small amounts of solids. A similar process can be used for other similar fruits, for example. Reaction mixture Viscosity Viscosity

à 90 C à 55 Cat 90 C to 55 C

Patates douces X = 770 cp X 2 = 2190 cp  Sweet potatoes X = 770 cp X 2 = 2190 cp

A 2 = 2190 cp -A 2 = 2190 cp -

B B 73 = 1970 cp C 4 = 950 cpB B 73 = 1970 cp C 4 = 950 cp

exemple les pommes.example apples.

Exemple Ba 3 1.Example Ba 3 1.

Des pommes fraîches sont grossièrement broyées au moyen d'un broyeur central Bucher La purée de pommes est ensuite pasteurisée dans un réservoir chauffé à 90 C,  Fresh apples are crushed by means of a Bucher central crusher. The applesauce is then pasteurized in a tank heated to 90 C,

pendant 5 minutes, et elle est ensuite refroidie à tempé-  for 5 minutes, and then cooled to

rature ambiante Les pommes pré-broyéessont ensuite écrasées  ambient crush The pre-crushed apples are then crushed

une deuxième fois dans un broyeur Fryma comportant un appa-  a second time in a Fryma mill with a

reillage à pierre de corindon,jusqu' à ce que la purée soit lisse au toucher La pàte a ensuite été pasteurisée une  cornelian stone, until the puree is smooth to the touch The pastry was then pasteurized a

seconde fois à 80 C pendant 10 minutes et refroidie à 50 C.  second time at 80 ° C. for 10 minutes and cooled to 50 ° C.

Les réactions enzymatiques ont ensuite été effectuées à 50 C pendant 30 minutes au moyen du dispositif  The enzymatic reactions were then carried out at 50 ° C. for 30 minutes using the device

Contraves Rheomat 15 en agitant et en effectuant simultané-  Contraves Rheomat 15 with simultaneous stirring and

ment la mesure de viscosité (par rapport à un pourcentage lu sur le Rhéometre à vitesse 13) Après la fin de la réaction enzymatique on a retiré un échantillon de 100 g et on l'a centrifugé dans un tube gradué à 3000 x g pendant minutes A ce stade, on a mesuré le pourcentage de jus  The viscosity measurement (relative to a percentage read on the speed 13 Rheometer) was completed. After the end of the enzymatic reaction, a 100 g sample was removed and centrifuged in a graduated tube at 3000 xg for minutes. At this stage, we measured the percentage of juice

et le pourcentage de dépôt On a également mesuré le p H et-  and the percentage of deposit was also measured p H and-

le pourcentage en matières sèches au réfractomètre, en o Brix Le tableau Ba IV montre une comparaison entre l'effet de la SPS-ase, la combinaison de Celluclast et de SPS-ase et la combinaison de Celluclast et de Pectinex On  the percentage of dry matter in the refractometer, in o Brix Table Ba IV shows a comparison between the effect of SPS-ase, the combination of Celluclast and SPS-ase and the combination of Celluclast and Pectinex On

a utilisé la préparation de SPS-ase KRF-68.  used the preparation of SPS-ase KRF-68.

Tableau Ba IV: Résultats des essais de liquéfaction totale avec une purée de pommes à 50 C pendant 30 minutes P-ase Celluclast| Pectinex Viscosité Centrifugation Jus -/hl de 200 1 3 x g/hl de finale% %jus % dépt p H purée g/hl de purée pure  Table Ba IV: Results of total liquefaction tests with apple puree at 50 ° C for 30 minutes P-ase Celluclast | Pectinex Viscosity Centrifugation Juice - / hl 200 1 3 x g / hl final%% juice% dept p H puree g / hl pure puree

0 O O 100 59 49 3,8 9,70 Y O 100 59 49 3.8 9.7

O O 19 81 19 3,510,5O O 19 81 19 3,510.5

50 O O 15 79 21 3,510,750 O O 15 79 21 3,510.7

50 O 4,8 83 17 3,5 10,850 O 4.8 83 17 3.5 10.8

3,8 83 17 3,1 12,53.8 83 17 3.1 12.5

0 50 200 9,5 83 17 3,2 12,90 50 200 9.5 83 17 3.2 12.9

0 50 2000 4,0 -82 18 3,1 13,20 50 2000 4.0 -82 18 3.1 13.2

Ba 4 Production de jus par traitement de fruits et de végétaux. On a trouvé que des préparationrsde SPS-ase conviennent bien pour la production de jus par traitements de différents fruits, baies et de végétaux, par exemple la carotte, les pois, les tomates, les pommes, les poires, le cassis, les fèves et -le choux Dans ce cas, on obtient des rendements améliorés en jus et une meilleure extraction des pigments et arômes par rapport aux préparations commerciales  Ba 4 Juice production by fruit and vegetable processing. It has been found that SPS-ase preparations are well suited for the production of juices by the processing of various fruits, berries and vegetables, for example carrots, peas, tomatoes, apples, pears, blackcurrants, beans and the like. In this case, we obtain improved yields of juice and better extraction of pigments and flavors compared to commercial preparations

de pectinase et de cellulase.of pectinase and cellulase.

Exemple Ba 4 1 On se réfère à l'exemple Ba 3 1 dans lequel on a comparé la préparation de SPS-ase aux produits commerciaux de cellulase et de pectinase Celluclast 200 L (désignation coamerciale) et  Example Ba 4 1 Referring to Example Ba 3 1 in which the SPS-ase preparation was compared to the commercial Celluclast 200 L cellulase and pectinase products (co-commercial designation) and

Pectinex 3 x (désicnation camoerciale) Il apparaît du tableau que le rende-  Pectinex 3 x (camouflage deicnation) It appears from the table that the

ment en jus peut être légèrement amélioré avec seulement 50 g/hl de SPSase par rapport à 2000 g/hl de Pectinex, les deux étant en combinaison avec 50 g/hl de Celluclast La viscosité était également légèrement plus basse De ce fait, il semble que la SPS-ase-est environ 40 fois plus efficace que  The juice content can be slightly improved with only 50 g / hl of SPSase compared to 2000 g / hl of Pectinex, both being in combination with 50 g / hl of Celluclast. The viscosity was also slightly lower. that SPS-ase is about 40 times more efficient than

le Pectinex.Pectinex.

Ba 5 Traitement concernant l'extraction ou le'pressage de  Ba 5 Treatment Concerning the Extraction or Pressing of

la canne à sucre ou de la betterave à sucre.  sugar cane or sugar beet.

On a trouvé qu'il est possible d'améliorer le rendement de processus de simple extraction, si l'on utili- se la préparation de SPS-ase pour le traitement de la canne à sucre ou de la betterave à sucre avant et/ou pendant l'extraction ou le pressage de celles-ci De même, la rémanence (la bagasse) peut être traitée avec la préparation de SPS-ase, ladite rémanence étant partiellement convertie en sucres fermentables qui peuvent être utilisés en tant  It has been found that it is possible to improve the yield of simple extraction process, if the SPS-ase preparation is used for the treatment of sugar cane or sugar beet before and / or During the extraction or pressing of the same, the remanence (the bagasse) can be treated with the SPS-ase preparation, said remanence being partially converted into fermentable sugars which can be used as

que substance brute pour une fermentation d'éthanol.  as raw material for a fermentation of ethanol.

Exemple Ba 5 1Example Ba 5 1

On a broyé 2 fois, dans un broyeur Fryma (type MZ-110), 10 kg de rémanence de betterave sucrière tpulpe) obtenue par une extraction continue à contre-courant dans un diffuseur-DDS chez Nakskov Sugar Factory On a ajouté  Two times, in a Fryma mill (type MZ-110), 10 kg of sugar beet tulip remanence) obtained by a continuous countercurrent extraction in a DDS-diffuser at Nakskov Sugar Factory was milled.

de l'eau de traitement pendant l'opération de broyage.  treatment water during the grinding operation.

On a traité par enzyme des fractions de 300 g de  Enzymes treated with 300 g

pulpe à 450 C pendant 18 heures au moyen des dosages d'en-  pulp at 450 C for 18 hours using the dosages of

zymes représentés au tableau Ba V On a ajouté le produit enzymatique sec (KRF-68) à la pulpe qui a été agitée par une tige pendant la première heure Ensuite, la pulpe a été liquéfiée de manière à pouvoir effectuer une agitation par agitateur magnétique pendant le temps restant A la fin de la réaction on a mesuré le p H (on n'a pas effectué de correction de pli pendant le début de la réaction) et on a centrifugé le mélange réactionnel jusqu'à ce que l'on  Zymes shown in Table Ba V Dry enzyme product (KRF-68) was added to the pulp which was agitated by a stem for the first hour. Next, the pulp was liquefied so as to be able to carry out stirring with a magnetic stirrer for one hour. the time remaining At the end of the reaction, the pH was measured (no wrinkle correction was made during the start of the reaction) and the reaction mixture was centrifuged until

obtienne un surnageant clair On a effectué des détermina-  obtain a clear supernatant.

tions de matières sèches du mélange réactionnel et des sur-  dry matter contents of the reaction mixture and the

nageants Les pourcentages de matières sèches solubilisées ont été calculés sur base de ces résultats Les corrections ont été faites pour les matières sèches solubles du produit enzymatique dans  The percentages of solubilized solids were calculated on the basis of these results. The corrections were made for the soluble solids of the enzymatic product in

tous les calculs.all the calculations.

Les surnageants N's 2, 3 et 4 ont été soumis à un échange ionique et ont été analysés par HPLC pour déterminer  Supernatants N's 2, 3 and 4 were ion exchanged and analyzed by HPLC to determine

la composition des hydrates de carbone.  the composition of carbohydrates.

Tableau Ba V Résultats obtenus par une liquéfaction enzymatique d'une pulpe de betterave Essais Dosage des No enzymes par Mesures finales rapport aux Mélange réactionnel Surnageants matières sèches FI p H (final) matières matières matières sèches __ èches_ E 5 sèches % sèches % solubilisées %  Table Ba V Results obtained by an enzymatic liquefaction of beet pulp Tests Assay of No Enzymes by Final Measurements compared with the reaction mixture Supernatants dry matter FI p H (final) solids dry matter dry E dry 5% solubilized%

1 O 5,5 4,18 0,0 0,01 O 5.5 4.18 0.0 0.0

2 0,35 3,6 3,85 2,85 66,92 0.35 3.6 3.85 2.85 66.9

3 0,56 3,5 3,81 2,56 66,23 0.56 3.5 3.81 2.56 66.2

4 1,02 3,5 3,86 2,73 70,44 1.02 3.5 3.86 2.73 70.4

1,58 3,3 3,17 2,34 73,4.1.58 3.3 3.17 2.34 73.4.

6 3,10 3,4 3,23 2,49 76,46 3.10 3.4 3.23 2.49 76.4

7 7,52 3,4 2,66 2,18 80,57 7.52 3.4 2.66 2.18 80.5

Conditions de réaction: M = 300 g S = 4,18 % de matières sèches E/S commemontré ci-dessus p H non règlé  Reaction conditions: M = 300 g S = 4.18% dry solids I / O as shown above p H not adjusted

T = 45 CT = 45 C

t = 18 heures Tableau Ba VI: Données HPLC Genre de sucre Essais ne (neutre) 2 1 3 4 % de sucres neutres Poids moléculaire élevé 43,6 31,9 25, 3  t = 18 hours Table Ba VI: HPLC data Type of sugar Tests ne (neutral) 2 1 3 4% neutral sugars High molecular weight 43.6 31.9 25, 3

(DP 4 +)(DP 4 +)

Disaccharides 4,6 4,8 -Disaccharides 4,6 4,8 -

Glucose 20,4 23,7 27,8 Falactose 5,0 5,9 7,3 Fructose/Arabinose 26,4 32,2 33,2 Acide Galacturonique pas mesuré Tous les sucres formés suivant le tableau Ba VI ci-dessus peuvent fermenter en alcool ou être utilisés dans  Glucose 20.4 23.7 27.8 Falctose 5.0 5.9 7.3 Fructose / Arabinose 26.4 32.2 33.2 Galacturonic acid not measured All sugars formed according to Table VI VI above may ferment in alcohol or be used in

d'autres buts.other goals.

Ba 6 Production de lait de soja On peut facilement produire du lait de soja par  Ba 6 Soymilk production Soymilk can be easily produced by

une liquéfaction totale de soja broyé et par une homogénéi-  total liquefaction of crushed soybean and a homogenous

sation ultérieure du mélange obtenu Le lait de soja est  the resulting mixture The soymilk is

souvent produit en trempant les fèves de soja dans de l'eau bouillan-  often produced by soaking soya beans in boiling water

te, en broyant les fèves imprégnées en extrayant l'eau et en séparant ensuite les résidus insolubles, par exemple les  by grinding the impregnated beans by extracting the water and then separating the insoluble residues, for example the

protéines et les polysaccharides Afin d'améliorer le ren-  proteins and polysaccharides In order to improve the

dement en lait de soja, ces résidus insolubles peuvent être liquéfiés par réaction avec la SPS-ase  soybean milk, these insoluble residues can be liquefied by reaction with SPS-ase

Exemple Ba 6 1Example Ba 6 1

Le procédé de production de lait de soja est  The process of producing soymilk is

expliqué plus en détail par les séries de réaction enzymati-  explained in more detail by the enzymatic reaction series

que suivantes, les calculs du degré de solubilité de protéine (PSI, %, protein solubility index) et du degré de  than the following, calculations of the degree of protein solubility (PSI,%, protein solubility index) and the degree of

solubilité de matières sèches (DSI, %, dry matter solubili-  solubility of dry matter (DSI,%, dry matter solubili-

ty index) représentent les rendements obtenus après sépara-  index) represent the returns obtained after

tion à p H 7 (voir tableau Ba VII) Les réactions enzymati-  at pH 7 (see Table Ba VII) Enzymatic reactions

ques ont été effectuées dans les conditions suivantes  were carried out under the following conditions

Substrat: farine de soja non dégraissée (Dansk Sojakage-  Substrate: non-defatted soy flour (Dansk Sojakage-

fabrik A/S) Masse du mélange réactionnel: 220 g Masse du substrat: 20 g Température: 50 C p H: 4,5 (H Cl 6 N) Temps de reaction: Séries A: I heure Temps de réaction: Séries B: 0,5 à 6 heures Enzyme: SPS-ase (KRF-68) Quantité d'enzyme: Séries A: rapport E/S (poids/poids) O à 8,0 % Séries B: rapport E/S (poids/poids): 1,0 % Après la réaction, on a règlé le p H à 7 au moyen de Na Ol H 4 N et on a effectué une séparation par centrifugation à 3000 x g, pendant  manufactk A / S) Mass of the reaction mixture: 220 g Substrate mass: 20 g Temperature: 50 ° C H: 4.5 (HCl 6 N) Reaction time: Series A: 1 hour Reaction time: Series B: 0.5 to 6 hours Enzyme: SPS-ase (KRF-68) Amount of enzyme: Series A: I / O ratio (w / w) O to 8.0% Series B: I / O ratio (w / w) After the reaction, pH 7 was adjusted with Na 2 H 4 N and centrifugation was carried out at 3000 x g

minutes.minutes.

Tableau Ba VII: Calculs du bilan en masse du procédé enzymatique de production de lait de soja eries Tunps de Quantité d' Mélange réactionnel Surnageant Indices de solubilit réaction ezfl Zets % protéine %mat % protéine % mat % PSI % DSI hures E/S sèches sches  Table Ba: Mass Balance Calculations of the Enzymatic Soymilk Milk Production Process Tunnels of Quantity of Reaction Mix Supernatant Solubility Indices ezfl Zets% Protein% Matte% Protein% Mat%% PSI% DSI Hures Dry I / O Sches

1,0 O 3,65 8,70 1,87 5,72 49,6 63,,7  1.0 O 3.65 8.70 1.87 5.72 49.6 63,, 7

1,0 0,5 3,68 8,74 2,41 6,28 63,7 70,0  1.0 0.5 3.68 8.74 2.41 6.28 63.7 70.0

A 1,0 1,0 3,71 8,78 2,48 6,43 65,1 71,4  A 1.0 1.0 3.71 8.78 2.48 6.43 65.1 71.4

1,0 2,0 3,78 8,86 2,98 7,18 77,5 79,5  1.0 2.0 3.78 8.86 2.98 7.18 77.5 79.5

1,0 4,0 3,92 9,03 3,36 7,69 84,6 83,9  1.0 4.0 3.92 9.03 3.36 7.69 84.6 83.9

1,0 8,0 4,19 ' 9,37 3,76 8,08 88,5 85,0  1.0 8.0 4.19 '9.37 3.76 8.08 88.5 85.0

0,5 1,0 3,64 8,78 2,39 6,41 64,0 71,1  0.5 1.0 3.64 8.78 2.39 6.41 64.0 71.1

1,0 1,0 3,64 8,78 2,56 6,60 68,7 73,4  1.0 1.0 3.64 8.78 2.56 6.60 68.7 73.4

B 2,0 1,0 3,63 8,78 2,79 6,91 75,2 77,'1  B 2.0 1.0 3.63 8.78 2.79 6.91 75.2 77, 1

4,0 1,0 3,63 8,78 3,10 7,29 84,0 81,7  4.0 1.0 3.63 8.78 3.10 7.29 84.0 81.7

6,0 1,0 3,63 8,78 3,39 7,69 92,3 86,5  6.0 1.0 3.63 8.78 3.39 7.69 92.3 86.5

-J a' r%> Ui C.à Co Ln Ba 7 Traitement destiné à accroître la quantité  -J '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' 7 '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '

récupérable de matières-solubles de café.  recoverable coffee solubles.

On a trouvé que le traitement de graines de café  It has been found that the treatment of coffee beans

à différentes étapes, pendant la production de -café instan-  at different stages during the production of coffee

tané, résulte en une augmentation du rendementde matières solubles de café Ainsi, par exemple,le marc de café épuisé ou des graines vertes peuvent être traitées par des enzymes  In this way, for example, spent coffee grounds or green seeds can be treated with enzymes.

avec des résultats avantageux.with advantageous results.

Bb 1 Prévention et/ou décomposition du louche de pomme Après la production d'un jus de pomme ou de poire ou d'autres jus de fruits, qui doivent être clairs et qui ont antérieurement été traités avec des préparations de  Bb 1 Prevention and / or decomposition of apple ladle After the production of an apple or pear juice or other fruit juice, which must be clear and which has previously been treated with

pectinase et cellulase classiques afin d'éviter la forma-  conventional pectinase and cellulase to prevent the formation of

tion de turbidité, il peut apparaître un louche de pomme ou des louches de fruits analogues On a trouvé que des  turbidity, an apple ladle or similar fruit ladles may have appeared.

préparations de SPS-ase conviennent bien pour la décomposi-  SPS-ase preparations are suitable for the decomposition

tion de tels louches qui consistent principalement en  such ladles, which consist mainly of

arabanne liée aux protéines.Araban protein bound.

Exemple Bb 1Example Bb 1

On a constaté que le concentrat de jus de poire  It has been found that the concentrate of pear juice

produit par liquéfaction enzymatique de déchets de conser-  produced by enzymatic liquefaction of waste

veries de poires en utilisant du Celluclast et du Pectinex se trouble au repos Le louche a été isolé et hydrolysé au moyen de H 2 SO 4 0,01 N pendant 24 heures et a  pear syrups using Celluclast and Pectinex cloudy at rest The ladle was isolated and hydrolysed with 0.01 N H 2 SO 4 for 24 hours and

été analysé par HPLC Le chromatogramme montre de l'ara-  has been analyzed by HPLC The chromatogram shows the

binose et de faibles quantités d'oligosaccharides.  binose and low amounts of oligosaccharides.

En faisant incuber 0,5 % poids/volume de cet hydrate de carbone dans 1 m M de tampon acétate à p H 4,5, pendant 3 heures, à 40 C, avec la SPS-ase (KRF-68 + KRF 92, 1:1) présentant une concentration en enzyme de 0,05 % poids/volume, on a trouvé que 84 % de l'hydrate de carbone du louche initial (matière sèche) ont été transformés en arabinose. On a également traité un concentré de poire dilué ( 20 'Brix) pendant 2 heures à 40 C avec une quantité d'enzyme SPS-ase susmentionée de 0,15 % poids/volume ou avec un produit commercial connu sous la désignation o Emerciale de Clarex en une quantité de 1 % poids/volume On a trouvé que la SPS-ase était capable de réduire de 86 % la surface relative du pic HPLC du louche semblable à l'arabanne, alors que la réduction  Incubating 0.5% w / v of this carbohydrate in 1 mM of acetate buffer at pH 4.5 for 3 hours at 40 ° C with SPS-ase (KRF-68 + KRF 92, 1: 1) having an enzyme concentration of 0.05% w / v, it was found that 84% of the initial ladle carbohydrate (dry matter) was converted to arabinose. A diluted pear concentrate (20 'Brix) was also treated for 2 hours at 40 ° C. with a quantity of the above-mentioned SPS-ase enzyme of 0.15% weight / volume or with a commercial product known under the trade name "Emerciale". Clarex in an amount of 1% w / v. SPS-ase was found to be capable of reducing by 86% the relative area of the HPLC peak of the Arabian-like ladle, while the reduction

correspondante au moyen de Clarex -(utilisé en une quan-  corresponding by means of Clarex - (used in a

tité nettement supérieure à la préparation de SPS-ase)  much higher than the SPS-ase preparation)

n'était que de 78 %.was only 78%.

Bb 2 Utilisation en tant que agent clarifiant de vin  Bb 2 Use as a wine clarifying agent

blanc.White.

On a trouvé que les vins blancs présentant une  It has been found that white wines with a

turbidité très indésirable peuvent ûtre clarifiés efficace-  highly undesirable turbidity can be clarified effectively

ment au moyen d'une SPS-ase On a montré que la substance trouble consiste principalement en arabinogalactanes qui sont liés à des résidus d'hydroxyproline dans une protéine  SPS-ase has been shown to consist mainly of arabinogalactans which are bound to hydroxyproline residues in a protein.

structurelle de parois cellulaires.structural cell walls.

Bb 3 Production de ISSPH ou d'autres hydrolisats de  Bb 3 Production of ISSPH or other hydrolysis products

protéine végétale.vegetable protein.

Avant la séparation du ISSPH (isoelectric soluble soy protein hydrolyzate hydrolisat de protéine de soja,  Prior to separation of ISSPH (isoelectric soluble soy protein hydrolyzate hydrolisate from soy protein,

isoélectriquement soluble) ou d'autres hydrolysats de pro-  isoelectrically soluble) or other hydrolysates of

téine végétale de la boue, comme décrit dans le brevet des Etats-Unis N 4 100 024 ou dans Process Biochemistry, vol. 14, No 7 ( 1979), pages 6 à 8 et 10 11, on peut traiter  vegetable seed of the sludge, as described in U.S. Patent No. 4,100,024 or in Process Biochemistry, vol. 14, No. 7 (1979), pages 6 to 8 and 10 11, it is possible to treat

le mélange réactionnel avec une préparation de SPS-ase.  the reaction mixture with a SPS-ase preparation.

Ceci permet d'obtenir une séparation plus facile.  This allows for easier separation.

Bb 4 Enzyme-de brassage pour l'industrie de la bière.  Bb 4 Enzyme-brewing for the beer industry.

Dans la production d'hydrates de carbone de bière à partir de substances brutes, par exemple les beta-glucannes  In the production of beer carbohydrates from raw substances, for example beta-glucans

de malt et d'orge,on observe une influence sur la viscosi-  malt and barley, there is an influence on the viscosity

té et la filtrabilité du moût L'addition d'une SPS-ase pendant le brassage réduit la viscosité du moût et améliore sa filtrabilité ainsi que le rendement à l'extraction En  The addition of an SPS-ase during the stirring reduces the viscosity of the must and improves its filterability as well as the extraction yield.

outre, l'addition d'une SPS-ase pendant le brassage augmen-  addition, the addition of an SPS-ase during brewing increases

te la fermentabilité du moût ainsi que la teneur en azote 2518570 g  the fermentability of the must and the nitrogen content 2518570 g

dans le moût.in the must.

Exemple Bb 4 1Example Bb 4 1

Au laboratoire, on a brassé ensemble 50 g de gruau d'avoine moulu consistant en 50 % de malt et 50 % d'orge avec 275 gr d'eau ( 15 % de matières sèches) selon le schéma de brassage suivant: 52 o C ( 60 minutes) / 63 C ( 60 minutes)/76 C ( 30 minutes):  In the laboratory, 50 g of ground oatmeal consisting of 50% malt and 50% barley were mixed together with 275 g of water (15% solids) according to the following brewing scheme: 52 o C (60 minutes) / 63 C (60 minutes) / 76 C (30 minutes):

Afin de prouver l'effet de la SPS-ase on a effec-  In order to prove the effect of SPS-ase we have

tué quatre essais, voir le tableau donné ci-dessous, dans lesquels les enzymes  killed four trials, see the table given below, in which the enzymes

(p H du brassin 5,5 -(p H of the brew 5.5 -

ont 6,0) été ajoutés pendant le brassage BGU représente des unités de béta-glucanase  6.0) were added during brewing BGU represents beta-glucanase units

déterminées selon le procédé analytique AF 70/4-GB, dis-  determined according to the analytical method AF 70/4-GB,

ponible chez NOVO Industri A/S.available at NOVO Industri A / S.

FBG représente des unités de béta-glucanase fongiques déterminées selon le procédé analytique AF 70 1/  FBG represents fungal beta-glucanase units determined according to the analytical method AF 70 1 /

2-GB disponible chez NOVO Industri A/S.  2-GB available from NOVO Industri A / S.

Enzyme Néant Cerefl SPS-ase (KRF-68) Activité de béta-gluca O 200 BGU 1630 FBG 1630 FBG nase/g  Enzyme None Cerefl SPS-ase (KRF-68) Beta-Gluca Activity O 200 BGU 1630 FBG 1630 FBG nase / g

Dosage d'en-Dosage of

zyme par kg O 1,5 g 0,05 g 0,18 g de gruau  zyme per kg O 1.5 g 0.05 g 0.18 g oatmeal

Quantité to-Quantity to-

tale d'unités d'activité O 300 BGU 80 FBG 300 FBG d'enzyme par g de gruau itesse de filtration 120 ml 135 ml 160 ml 170 ml u moût après 10 mn Viscosité du mont 10 Bal 1,52 c P 1,36 c P 1,36 c P 1,30 c P ling ( 25 C) o '  range of activity units O 300 BGU 80 FBG 300 FBG of enzyme per g of filtration grease 120 ml 135 ml 160 ml 170 ml wort after 10 min Viscosity of mount 10 Bal 1.52 c P 1.36 c P 1.36 c P 1.30 c P ling (25 C) o '

La seule différence entre BGU et FBG est le-  The only difference between BGU and FBG is

p H auquel on effectue la détermination de l'enzyme: p H 7,5  p H to which the determination of the enzyme is made: p H 7.5

pour BGU et p H 5,0 pour FBG.for BGU and p H 5.0 for FBG.

Cereflo est une préparation de béta-gluonase bactérielle décrite dans le document d'information B 214 b-  Cereflo is a bacterial beta-gluonase preparation described in Information Document B 214 b-

GB 1500, Juillet 1981, disponible chez NOVO Industri A/S.  GB 1500, July 1981, available from NOVO Industri A / S.

Exemple Bb 4 2Example Bb 4 2

Au laboratoire, on a brassé ensemble 50 g de gruau d'avoine moulu consistant en 40 % de malt et 60 % d'orge avec 150 g d'eau ( 25 % de matières sèches) selon le schéma de brassage suivant: 450 C ( 60 minutes) /63 C  In the laboratory, 50 g of ground oatmeal consisting of 40% malt and 60% barley with 150 g of water (25% solids) were brewed together according to the following brewing scheme: 450 C ( 60 minutes) / 63 C

( 90 minutes)/75 C ( 15 minutes).(90 minutes) / 75 C (15 minutes).

Afin de prouver l'effet de la SPS-ase on a effectué trois essais, cfr le tableau ci-dessous, dans lesquels on a ajouté les enzymes pendant le brassage (p H  In order to prove the effect of SPS-ase, three tests were carried out, see the table below, in which the enzymes were added during the stirring (p H

de la boue 5,5 6,0).mud 5.5 6.0).

Enzyme Néant Ceremix SPS-ase (KRF-68;+Ceremix ajouté comme dans les essais précédents Activité de 200 BGU 1630 BGU béta-glucanase/ g Dosage d'enzyme 1,65 g 0,033 g par kg de gruau Quantité totale d'unités d'acti O 330 BGU 50 FBG vité d'enzyme par kg de gruau  Enzyme Nil Ceremix SPS-ase (KRF-68; + Ceremix added as in previous trials Activity of 200 BGU 1630 BGU Beta-Glucanase / g Assay of enzyme 1.65 g 0.033 g per kg of gruel Total amount of units acti O 330 BGU 50 FBG enzyme activity per kg of oatmeal

Vitesse de fil-Thread speed

tration du moût 48 ml 98 ml 111 ml après 15 min. Extrait, Balling 18,6 19,0 19,5 Viscosité du moût 10 Balling 1,72 c P1,37 c 1,27 c P  wort treatment 48 ml 98 ml 111 ml after 15 min. Extract, Balling 18.6 19.0 19.5 Viscosity of must 10 Balling 1.72 c P1.37 c 1.27 c P

( 25 C)(25 C)

,. La définition de BGU et FBG est la même que celle donnée à l'exemple Bb 4 1 La dernière colonne du tableau ci-dessus ne donne que l'activité et la quantité  ,. The definition of BGU and FBG is the same as that given in Example Bb 4 1 The last column of the table above gives only the activity and quantity

provenant de la SPS-ase comme indiqué.  from the SPS-ase as indicated.

Ceremix est une préparation de béta-glucanase bactérielle décrite dans le document d'information B 216  Ceremix is a bacterial beta-glucanase preparation described in Information Document B 216

b-GB 1000, Février 1982, disponible chez NOVO Industri A/S.  b-GB 1000, February 1982, available from NOVO Industri A / S.

Bb 5 Additif enzymatique pouvant être utilisé pendant  Bb 5 Enzymatic additive that can be used during

la fermentation et/ou le stockage de la bière.  fermentation and / or storage of the beer.

On peut ajouter de la SPS-ase pendant la fermen-  SPS-ase can be added during fermentation.

tation du moût ou pendant le stockage de la bière afin de  the wort or during the storage of the beer in order to

réduire la teneur en béta glucannes et pour améliorer la f il-  to reduce the beta-glucan content and to improve the

tration-de la bière et la stabilité de celle-ci par rapport au louche La SPS-ase exerce également un effet sur les  beer and the stability of beer compared to the ladle. SPS-ase also has an effect on

protéines responsables d'un louche se formant à froid.  proteins responsible for a ladle forming cold.

Bb 6 Agent destiné à enlever la peau de l'amande.  Bb 6 Agent intended to remove the skin from the kernel.

Pendant l'étape mécanique qui consiste à enlever la peau des amandes, qui suit l'étape d'émondage des amandes, un certain pourcentage de peau d'amandes n'est pas éliminé On a trouvé qu'un traitement enzymatique des  During the mechanical step of removing the skin from the almonds, which follows the pruning step of the almonds, a certain percentage of almond skin is not removed. It has been found that an enzymatic treatment of

amandes provoque une diminution du pourcentage indiqué ci-  almonds causes a decrease in the percentage indicated below.

dessus.above.

Bc 1 Décomposition de différents déchets.  Bc 1 Decomposition of different wastes.

Dans certains procédés de fabrication, on produit  In some manufacturing processes, one produces

de grandes quantités de carbohydrates contenus dans des dé-  large quantities of carbohydrates contained in

chets, Ceci est le cas, par exemple, lors de la produc-  This is the case, for example, during the produc-

tion d'un isolat de soja par extraction à l'eau et préci-  of a soy isolate by water extraction and

pitation au moyen de l'acides de lait de soja et de tofu (un type particulier de fromage japonais)-A cet égard, on peut également citer la pulpe résiduelle des pommes, des poires ou des agrumes On a trouvé qu'une préparation de SPS-ase est capable de liquéfier complètement ces déchets contenant des hydrates de carbone et de produire des sucres fermentables qui peuvent être utilisés en tant que  with the help of soy milk acid and tofu (a particular type of Japanese cheese). In this respect, the residual pulp of apples, pears or citrus fruits SPS-ase is able to completely liquefy these carbohydrate-containing wastes and produce fermentable sugars that can be used as

substance de départ pour une fermentation d'éthanol.  starting material for a fermentation of ethanol.

Exemple Bc 1 1Example Bc 1 1

Lors de la production classique de lait de soja ou de tofu, on plonge souvent les fèves de soja dans l'eau bouillante, mélange et extrait avec de l'eau chaude, après quoi on effectue une séparation Le résidu de cette sépa- ration est la substance utilisée dans cet essai La phase liquide est constituée par le lait de soja qui peut être  In the conventional production of soymilk or tofu, soya beans are often immersed in boiling water, mixed and extracted with hot water, after which separation is carried out. The residue of this separation is the substance used in this test The liquid phase consists of soy milk which can be

traité ultérieurement pour produire du tofu.  later processed to produce tofu.

On a broyé 10 kg de fèves de soja entières ob tenues chez Aarhus Oliefabrik A/S simultanément avec 70 litres d'eau bouillante dans un broyeur Fryma du type MZ La boue de broyage a-été maintenue au-dessus de 85 'C pendant 15 minutes afin d'inactiver les enzymes de graines  10 kg of whole soybeans were obtained from Aarhus Oliefabrik A / S simultaneously with 70 liters of boiling water in a Fryma MZ grinder. The grinding mud was kept above 85 ° C for 15 minutes. minutes in order to inactivate the seed enzymes

naturelles qui développent l'odeur désagréable connue du soja.  that develop the unpleasant odor known from soy.

Ensuite on centrifuge 5 litres de cette boue de soja dans  Then 5 liters of this soy mud are centrifuged

le laboratoire pendant 15 minutes à 3000 x g (g = gravité).  the laboratory for 15 minutes at 3000 x g (g = gravity).

On a trouvé, par analyse, que la rémanence contenait 20,45 % et 20,06 % de matières sèches (mesures faites en double, moyenne calculée: 20,26 %) On a ajouté lentement du HCI 6 N qui a été trituré dans la rémanence au moyen d'une spatule jusqu'à ce qu'un p H-mètreindique 4,50, lorsque  It was found by analysis that the remanence contained 20.45% and 20.06% solids (measurements made in duplicate, calculated average: 20.26%). 6N HCl which was triturated was slowly added. the remanence using a spatula until a p H-meterindicates 4.50, when

l'électrode est introduite directement dans la masse.  the electrode is introduced directly into the mass.

On a effectué, à 500 C, dans un becher de 500 ml des réactions d'enzyme avec 2 x 200 g de la masse avec les deux dosages de SPS-ase (KRF-68), E/S = 0,5 % par rapport aux matières sèches et E/S = 3,0 % par rapport aux  At 500 ° C., in a 500 ml beaker, enzyme reactions with 2 x 200 g of the mass were carried out with both SPS-ase assays (KRF-68), I / O = 0.5% by weight. dry matter ratio and I / O = 3.0% compared to

matières sèches L'enzyme sèche a été ajoutée à-la masse.  dry matter The dry enzyme was added to the mass.

Pendant les 1 à 2 premières heures, on a effectué l'agita-  During the first 1 to 2 hours, agitation was

tion au moyen d'une spatule et-ensuite la masse a été  by means of a spatula and then the mass has been

liquéfiée à une telle mesure que l'on puisse efficace-  liquefied to such an extent that we can effectively

ment effectuer l'agitation au moyen d'un agitateur magné-  stir with a magnetic stirrer.

tique Le temps de réaction total était de 21 heures On a mesuré l'osmolalité au moyen d'un osmomètre, pendant la durée de la réaction (Advanced Digimatic 3 DII disponible  The total reaction time was 21 hours Osmolality was measured using an osmometer for the duration of the reaction (Advanced Digimatic 3 DII available

chez Advanced Instruments Inc) Les résultats du tableau -  at Advanced Instruments Inc) The results of the table -

Bc I montrent l'évolution de la réaction A la fin de l'essai, les mélanges ont été centrifugés à 3000 x g pendant 15 minutes Une couche d'huile est apparue à la surface du surnageant et le volume de celle-cia été déterminé Une couche de boue non tassée est -apparue comme couche de fond Le surnageant contenant l'huile  Bc I show the evolution of the reaction At the end of the test, the mixtures were centrifuged at 3000 xg for 15 minutes. A layer of oil appeared on the surface of the supernatant and the volume thereof was determined. layer of loose mud is -appeared as a primer The supernatant containing the oil

a été retiré au moyen d'une pipette L'huile a été co mbi-  was removed with a pipette The oil was co-

née avec la phase d'eau claire par homogénéisation et on a retiré un échantillon pour la détermination des matières sèches Les résultats donnés au tableau Bc I montrent  born with the clear water phase by homogenization and a sample was removed for the determination of solids The results given in Table Bc I show

clairement que ce déchet peut être liquéfié par une réac-  clearly that this waste can be liquefied by a reaction

tion enzymatique et que l'on peut produire de l'huile brute comme mentionné à la partie A 4 Après avoir récupéré l'huile, on peut utiliser de différentes manières la rémanence solubilisée, par exemple pour une fermentation en composés utilisables ou par une utilisation en tant que  Enzymatic and can produce crude oil as mentioned in Part A 4 After recovering the oil, the solubilized remanence can be used in different ways, for example for a fermentation in usable compounds or by use as

aliment pour bétail ou produit alimentaire après concen-  livestock feed or food product after

tration et séchage ou pour des produits utiles après  and drying or for useful products after

une purification ultérieure.a subsequent purification.

Tableau Bc I Résultats obtenus lors de la liquéfaction  Table Bc I Results obtained during liquefaction

de lait de soja et de boue de tofu.soy milk and tofu mud.

Conditions de réaction et résultats Essai A Essai B Masse de résidus 200 g 200 g asse de SPS-ase 0,20 g 1,20 g  Reaction conditions and results Test A Test B Residue mass 200 g 200 g of SPS-ase 0.20 g 1.20 g

(KRF-68)(KRF-68)

empérature 50 C 50 C p H 4,50 4,50 Temps de réaction 21 heures 21 heures Résultats mesurés sur t osmo a os t osmo àosmo lalité morma mali maaité n osmomètre pendant mn m Osm lité mn té m Osm l'évolution de la r Osn m Osr r 15éaction O 287 0 O 282 O  temperature 50 C 50 C p H 4.50 4.50 Reaction time 21 hours 21 hours Results measured on osmo os osmo osso lality morma mali maaity n osmometer during mn m osm lity mn te m Osm the evolution of the r Osn m O rreaction O 287 0 O 282 O

313 26 10 386 86313 26 10 386 86

A Osmolalité est la 25 497 215 vaieur corrigée dp 40 391 104 45 601 319 l'osmolalité du mélange 95 501 214 95 718 436 t = O 250 634 347 250 875 593  A Osmolality is the corrected value of 25,497,215 dp 40 391 104 45 601 319 the osmolality of the mixture 95 501 214 95 718 436 t = O 250 634 347 250 875 593

1260 907 620 1260 1145 8631260 907 620 1260 1145 863

élange réactionnel: 4 atière sèche 20,3 % 20,7 % surnageant: katière sèche 18,0 % 19,4 % Surnageant: reneur en huile 8 à 10 % 8 à 10 % 3 alculs du % des matières sèches solubi 88,6 % 93,5 % lisées  reaction mixture: dry skin 20.3% 20.7% supernatant: dry katier 18.0% 19.4% Supernatant: oil renter 8 to 10% 8 to 10% 3 alculs of solids% solubi 88.6 % 93.5% lized

Bc 2 Saccharification et fermentation simultanées.  Bc 2 Saccharification and simultaneous fermentation.

Les substances végétales contenant des hydrates  Vegetable substances containing hydrates

de carbone, par exemple les tubercules comme les topinam-  carbon, eg tubers such as topinam

* bours, les pommes de terre, les patates douces, le manioc ou la pulpe de tels tubercules, à savoir la substance* beans, potatoes, sweet potatoes, cassava or the pulp of such tubers, namely the substance

restant après avoir éliminé les composants extraits, peu-  remaining after removing the extracted components, may

vent être saccharifiés par un traitement avec une prepara-  can be saccharified by treatment with a prepara-

tion de SPS-ase et, simultanément, les saccharides fermen-  SPS-ase and, simultaneously, the fermented saccharides

tables obtenus peuvent être fermentés en éthanol.  Tables obtained can be fermented in ethanol.

Exemple Bc 2 1 La production d'éthanol par fermentation des topinambours décomposés contenant de l'inuline à été  Example Bc 2 1 Production of ethanol by fermentation of decomposed Jerusalem artichokes containing inulin at summer

expérimentée à l'échelle de laboratoire par une sacchari-  experimented on a laboratory scale with sacchari-

fication simultanée avec une SPS-ase et une inulinase et  simultaneous application with SPS-ase and inulinase and

par quatre prétraitements différents des topinambours.  by four different pretreatments of Jerusalem artichokes.

SPS-ase: On a utilisé la préparation de SPS-ase KRF-68.  SPS-ase: The preparation of SPS-ase KRF-68 was used.

Inulinase: L'inulinase a été produite par fermentation de Asp ficuum (CBS 55 565) L'activité d'inulinase est déterminée comme décrit dans Research Disclosure No 21234  Inulinase: Inulinase was produced by fermentation of Asp ficuum (CBS 55,565) Inulinase activity is determined as described in Research Disclosure No. 21234

(Décembre 1981) p 456 à 458.(December 1981) p 456 to 458.

Fermentation au laboratoire: On a fait fermenter des fractions de 150 gr de purée prétraitée (décrite plus loin) après avoir ajouté 4,5 g de levure de boulangerie et 1 ml  Fermentation in the laboratory: Fractions of 150 g pretreated mash (described later) were fermented after adding 4.5 g baker's yeast and 1 ml

d'une solution de Pluronic à 4 % en tant qu' agent anti-  a solution of 4% Pluronic as an anti-

moussant Les flacons de fermentation sont munis de pièges de CO 2 contenant de l'acide sulfurique à 98 % et la fermentation est suivie par une mesure de la perte en poids du à la libération de CO 2 Le contenu du flacon est agité pendant la fermentation qui est effectuée à 300 C On a  foaming The fermentation flasks are equipped with CO 2 traps containing 98% sulfuric acid and the fermentation is followed by a measurement of the loss in weight due to the release of CO 2 The contents of the flask are agitated during the fermentation which is done at 300 C

utilisé trois flacons pour chaque paramètre étudié.  used three vials for each parameter studied.

Dans le tableau Bc II, la perte en poids due à la libération de CO 2 est convertie en éthanol, en supposant qu'lmole de C 02 libérée équivaut à 1 mole de C 2 H 50 H,  In Table Bc II, the loss in weight due to the release of CO 2 is converted into ethanol, assuming that 1 mole of C 02 released equals 1 mole of C 2 H 50 H,

à savoir 1 g CO 2 4 g C 25 OH.namely 1 g CO 2 4 g C 25 OH.

Prétraitements des topinambours: Traitement A: On a effectué une cuissonsuivant le procédé de Henze de 14,1 kg de topinambours à 140 C et à 4 à 5 atm pendant 20 minutes Le poids après cuisson était de 19,0 kg  Jerusalem artichoke pretreatment: Treatment A: Henze's process was carried out with 14.1 kg of Jerusalem artichokes at 140 ° C and at 4 to 5 atm for 20 minutes. The weight after cooking was 19.0 kg.

( 16,9 % de matière sèche) Les fermen-  (16.9% dry matter) The fermenta-

tations-ont été effectuées directement sur  tations-were carried out directly on

la purée.puree.

Traitement B: Des topinambours lavés et coupés en tranches ont été mélangés avec de l'eau ( 1:1) et ont été mêlés dans un mélangeur Waring La Durée  Treatment B: Washed and sliced Jerusalem artichokes were mixed with water (1: 1) and mixed in a Waring blender.

a ensuite été soumise à un traitement ther-  was then subjected to a heat treatment

mique-pendant une heure, à 85 C et à p H= 4,5.  for one hour, at 85 ° C. and at pH = 4.5.

Traitement C: Comme le traitement B, mais le p H n'a pas  Treatment C: As treatment B, but p H does not have

été règlé.been settled.

Traitement D: Comme le traitement B, mais on n'a pas effec-  Treatment D: Like treatment B, but we did not do

tué de traitement thermique et on n'a pas règlé le p H. Résultats: Les résultats du tableau Bc II montrent l'effet de l'addition d'une SPS-ase à la purée prétraitée sur le rendement en éthanol On a obtenu une amélioration nette du  The results of Table Bc II show the effect of the addition of an SPS-ase to the pretreated purée on the ethanol yield. net improvement

rendement en éthanol sur toutes les purées prétraitées lors-  ethanol yield on all the pre-treated purees during

qu'on a ajouté une SPS-ase.we added an SPS-ase.

Tableau Bc II Résultats de fermentation l Qrs d'une fermentation simultanée et d'une saccharification enzymatique de  Table Bc II Fermentation results l Qrs of a simultaneous fermentation and enzymatic saccharification of

topinambours.Jerusalem artichokes.

Prétrai Unité d'inuli SPS-ase Perte en CO 2 (g)% éthanol produit temoent nase ajoutée E/S % après 42 à 44 par rapport aux à 1 g de ma I hres de fernmen matières,sèches tière sèche tation  Pretreat Unit of Inuli SPS-ase Loss in CO 2 (g)% ethanol produced temoent nase added I / O% after 42 to 44 compared to 1 g of man of fernmen fernmen materials, dry drying

1,5 O 7,65 + 0,05 31,51.5 O 7.65 + 0.05 31.5

AAT

1,5 0,27 8,07 + 0,08 33,21.5 0.27 8.07 + 0.08 33.2

B 1,5 O 4,85 + 0,03 29,7B 1.5 O 4.85 + 0.03 29.7

_ _ 1,5 0,40 5,41 + 0,03 33,1_ _ 1.5 0.40 5.41 + 0.03 33.1

1,5 O 5,70 + 0,05 34,81.5 O 5.70 + 0.05 34.8

1,5 0,10 5,97 + 0,01 36,51.5 0.10 5.97 + 0.01 36.5

C 1,5 0,20 6,13 + 0,06 37,5C 1.5 0.20 6.13 + 0.06 37.5

1,5 0,30 6,13 + 0,00 37,51.5 0.30 6.13 + 0.00 37.5

1,5 0,40 6,18 + 0,05 37,81.5 0.40 6.18 + 0.05 37.8

1,5 O 5,77 + 0,02 35,31.5 O 5.77 + 0.02 35.3

1,5 0,10 5,89 + 0,00 36,01.5 0.10 5.89 + 0.00 36.0

D 1,5 0,20 6,04 + 0,11 36,9D 1.5 0.20 6.04 + 0.11 36.9

1,5 0,30 6,01 + 0,01 36,71.5 0.30 6.01 + 0.01 36.7

1,5 0,40 6,02 + 0,03 36,81.5 0.40 6.02 + 0.03 36.8

0 0,40 5,48 + 0,02 33,50 0.40 5.48 + 0.02 33.5

Bc 3 Décomposition de cellulose On a trouvé que des substances contenant de la cellulose comme de la paille, par exemple la paille de blé, la sciure, du papier et de la lignocellulose, peuvent être hydrolysées en une mesure plus grande au moyen d'une pré- paration de SPS-ase qu'avec des cellulases classiques Ceci  Bc 3 Decomposition of cellulose It has been found that substances containing cellulose such as straw, for example wheat straw, sawdust, paper and lignocellulose, can be hydrolysed to a greater extent by means of preparation of SPS-ase with conventional cellulases This

est montré par l'exemple suivant dans lequel une substan-  is shown by the following example in which a substance

ce de cellulose cristalline (AVICEL) est traitée au moyen d'une cellulase classique Celluclast 200 produite par la souche Trichoderma reesei et au moyen de la préparation de  crystalline cellulose (AVICEL) is treated with a conventional cellulase Celluclast 200 produced by the strain Trichoderma reesei and by means of the preparation of

SPS-ase KRF-68 -SPS-ase KRF-68 -

Exemple Bc 3 1Example Bc 3 1

On a mis 1 ' Avicel en suspension dans l'eau ( 20 % de matière sèche); on a réglé le p H à 5 et on a maintenu la température à 50 C Après un temps de réaction de 24 heures, on a filtré la boue et on a mesuré la teneur en sucre réducteur (mg de glucose/g AVICEL) En utilisant des quantités d'enzyme de 5 et 20 % de la teneur en cellulose,  Avicel was suspended in water (20% dry matter); The pH was adjusted to 5 and the temperature was maintained at 50 ° C. After a reaction time of 24 hours, the sludge was filtered and the reducing sugar content (mg glucose / g AVICEL) was measured. enzyme amounts of 5 and 20% of the cellulose content,

on a obtenu les valeurs suivantes.the following values were obtained.

Tableau Bc III.Table Bc III.

Bc 4 Application en tant que additif de cuisson.  Bc 4 Application as a cooking additive.

On a également constaté que les préparations de SPS-ase conviennent particulièrement comme additifs (adjuvants)de cuisson de boulangerie Ainsi, lorsqu'on ajoute une préparation de SPS-ase à une farine sèche, avant production de la pâte, il est possible d'obtenir un pain présentant une qualité supérieure en ce qui concerne le volume, la mie et le goût De ce fait, il est possible d'obtenir un pain de haute qualité avec une *farine de blé Enzyme f E/S % mg glucose/g AVICEL Celluclast 5 80 SPS-ase 5 200 Celluclast 20 100 SPS-ase 20 340  It has also been found that SPS-ase preparations are particularly suitable as baking additives (additives). Thus, when a SPS-ase preparation is added to a dry meal, before production of the dough, it is possible to To obtain a bread with a superior quality in terms of volume, crumb and taste As a result, it is possible to obtain a high quality bread with a wheat flour Enzyme I / O% mg glucose / g AVICEL Celluclast 5 80 SPS-ase 5 200 Celluclast 20 100 SPS-ase 20 340

2.5185702.518570

de moins bonne qualité si on utilise la préparation de SPS-ase en tant que additif  of lower quality if the SPS-ase preparation is used as an additive

Bc 5 Amélioration du rendement en alcool et en bio-  Bc 5 Improved alcohol and organic yield

masse pendant la fermentation de la liqueur de sulfite dans la production du papier. On a également trouvé que le rendement en éthanol peut être amélioré si l'on traite la liqueur de sulfite du papier avec une préparation de SPS-ase avant qu'elle ne soit utilisée à titre de source d'hydrate de carbone pour la fermentation en éthanol La liqueur de sulfite du papier peut également être utilisé pour la  mass during fermentation of the sulphite liquor in paper production. It has also been found that the ethanol yield can be improved by treating the paper sulfite liquor with a SPS-ase preparation before it is used as a carbohydrate source for fermentation. Ethanol The paper sulphite liquor can also be used for the

production de biomasse, par exemple une protéine unicellu-  biomass production, for example a unicellular protein

laire, par fermentation; même dans ce cas, le rendement  by fermentation; even in this case the performance

en biomasse a été amélioré lorsqu'on a traité préalable-  biomass has been improved when

ment la liqueur de sulfite avec une préparation de SPS-ase.  sulphite liquor with a SPS-ase preparation.

De même, la décomposition due à-la présence de la prépara-  Similarly, the decomposition due to the presence of

tion de SPS-ase et la fermentation peuvent être effectuées simultanément.  SPS-ase and fermentation can be performed simultaneously.

Bc 6 Assèchement de produits de boue biologique.  Bc 6 Dewatering of biological sludge products.

Lors d'extraction classique à l'eau de nombreuses substances biologiques provenant de substances végétales brutes, on obtient de grands volumes de résidus insolubles  During conventional extraction with water of many biological substances derived from raw vegetable substances, large volumes of insoluble residues are obtained.

consistant en grande partie de polysaccharides gonflés.  consisting largely of swollen polysaccharides.

Ce cas se présente, par exemple lorsqu'on produit-du lait de soja, du tofu ou un isolat de soja par extraction à l'eau de fèves desoja,defarine de soja dégraissée ou de flocons  This is the case, for example when producing soymilk, tofu or soy isolate by extraction with water of desmoya beans, defatted soy flour or flakes.

blancs La substance de polysaccharides gonflés structu-  The substance of structurally swollen polysaccharides

rée peut ensuite être traitée en une petite mesure avec une SPS-ase, ce qui ouvre la structure en réseau de la substance et, de ce fait, il n'y a que de faibles quantités d'hydrates de carbone qui sont solubilisés Ainsi, la substance est déshumidifiée et on obtient, par conséquent, une teneur en matière sèche plus élevée dans la boue par rapport au produit obtenu sans traitement enzymatique De ce fait, le procédé enzymatique présente l'avantage qui consiste en une consommation en énergie considérablement plus faible pour éliminer l'eau par séchage et ledit traitement permet également de produire un aliment pour bétail sec meilleur marché ou un agent de masse pour des applications alimentaires,  can then be treated in a small measure with SPS-ase, which opens up the network structure of the substance and, as a result, there are only small amounts of carbohydrates which are solubilized. the substance is dehumidified and, consequently, a higher solids content in the sludge is obtained compared to the product obtained without enzymatic treatment. As a result, the enzymatic process has the advantage of considerably lower energy consumption. to remove water by drying and said treatment also makes it possible to produce a cheaper dry livestock feed or a mass agent for food applications,

Bc 7 Additif pour aliment de bétail ensilé.  Bc 7 Additive for silage feed.

Il est connu d'ajouter des additifs enzymatiques au fourrage ensilé afin d'accroître la vitesse du processus d'ensilage et la digestibilité du fourrage ensilé On a  It is known to add enzymatic additives to silage to increase the speed of the silage process and the digestibility of ensiled forage.

trouvé qu'une préparation de SPS-ase est supérieure com-  found that a SPS-ase preparation is superior

paré aux additifs enzymatiques connus pour le fourage ensilé. Afin d'être plus clair, on donne ci-dessous un  prepared with the enzymatic additives known for silage. In order to be clearer, we give below a

aperçu des figures auxquelles on a déjà fait référence.  overview of the figures to which reference has already been made.

La fig N Concerne Décrit 1 La partie générale L'effet de liaison entre le  Figure N Pertains Described 1 The general part The binding effect between the

de la description SPS et la protéine de soja  of the description SPS and soy protein

2 La partie générale Tableau synoptique décrivant  2 General part Synoptic table describing

de la description la préparation du SPS  of the description the preparation of the SPS

3 2 ème partie Courbe de calibrage pour la  3 Part 2 Calibration curve for the

chromatographie HPLC à fil-HPLC chromatography with

tration sur gelgel treatment

4 2 ème partie Chromatogramme HPLC à fil-  4 Part 2 Chromatogram HPLC with filter

tration sur gel du SPS 2 ème partie Chromatogramme HPLC à filtra  gel filtration of the SPS Part 2 HPLC chromatogram to filtra

tion sur gel du SPS décompo-gel on the SPS decomposed

sé par la SPS-ase 6 2 ème et 3 ème C Oranatogramie HPLC à filtration parties _ sur gel du surnageant provenant de 3 PS, soumis a incubation avec une prot&ine de soja 7 2 ème partie Chromatogramme HPLC à filtration sur gel du surnageant provenant  SPS-ase 6 2 nd and 3 rd C Oranatogram HPLC filtration gel parts of the supernatant from 3 PS, incubated with a soy protein 7 Part 2 HPLC gel filtration chromatogram of the supernatant

de SPS décaposé, soumis à incuba-  of SPS decaposed, subjected to incubation

tion avec une protéine de sojawith a soy protein

2518570-2518570-

La fig N Concerne Décrit 8 3 ème partie Chromatogramme HPL à filtration sur  Figure N Relates Described 8 Part 3 HPL chromatogram with filtration on

gel de APS déocposé par Pectoly-APS gel released by Pectoly-

ase 9 3 ème partie Chromatogramre HPLC à filtration sur gel de APS décarposé par la SPS-ase 3 ême partie Chromatogramme HPLC à filtration sur gel du SPS traité avec la Pectolyase  ase 9 Part 3 Chromatogram HPLC gel filtration of APS decarposed by SPS-ase Part 3 HPLC chromatography gel filtration of SPS treated with Pectolyase

11 7 ème partie Pics immunoélectrophorétique-  11 Part 7 Immunoelectrophoretic peaks

comportant un pic de SPS-ase identifié par la technique de recouvrement 12 8 ème partie Chromatogramme à échange ionique d'une SPS-ase 13 9 ème partie Dépendance de l'activité du p H d'une SPS-ase 14 9 ème partie Dépendance de l'activité de la température d'une SPS-ase 9 ème partie Stabilité à la température d'une SPS-ase  with a SPS-ase peak identified by the recovery technique 12 8 th part IPS-ion chromatogram 13 Part 9 Dependence of p H activity of an SPS-ase 14 Part 9 Dependence of the activity of the temperature of a SPS-ase 9 th part Stability at the temperature of an SPS-ase

16 10 ème partie Stabilité du p H d'une proté-  16 10 th part Stability of the p H of a protein

ase dans une préparation de SPS-ase Et  ase in a preparation of SPS-ase And

Claims (18)

REVENDICATIONS 1 S P S -a S e, c o N S t i t u é e p a r une carbohydrase sous une forme utilisable et capable de décomposer le SPS de soja dans des conditions appropriées pour donner des produits de décomposition qui se fixent euxmêmes sur une protéine, en milieu aqueux, à un degré moindre que celui auquel le SPS de soja se serait fixé lui-méme, avant décomposition, sur la même protéine  The SPS is a carbohydrase in a usable form and capable of decomposing soy SPS under appropriate conditions to yield decomposition products which bind to a protein in an aqueous medium at a rate of one to one. lesser degree than that to which the SPS soybean would have fixed itself, before decomposition, on the same protein dans des conditions correspondantes.  under corresponding conditions. 2 SPS-ase suivant la revendication 1 caractérisée en ce qu'elle est capable de décomposer le SPS de soja, en milieu aqueux, pour donner des produitsde décomposition qui se fixent eux-mêmes sur une protéine végétale, en milieu aqueux, à un degré moindre que celui auquel le SPS de soja se serait fixé lui-même, avant décomposition, sur la même  2 SPS-ase according to claim 1 characterized in that it is capable of decomposing SPS soybeans, in an aqueous medium, to give decomposition products which themselves bind to a vegetable protein, in aqueous medium, to a degree less than that to which the SPS of soya would have fixed itself, before decomposition, on the same protéine végétale, en milieu aqueux.  vegetable protein in an aqueous medium. 3 SPS-ase suivant l'une des revendications 1 ou 2  3 SPS-ase according to one of claims 1 or 2 caractérisée en ce qu'elle est capable de décomposer le SPS de soja, en milieu aqueux, à un p H ne s'écartant pas plus de 1,5 unités de la valeur 4,5, pour donner des produits de décomposition qui se fixent eux-mêmes sur une protéine de soja, en milieu aqueux, à un degré moindre que celui auquel le SPS de soja se serait fixé lui-même, avant décompositio 4  characterized in that it is capable of decomposing soybean SPS in an aqueous medium to a pH of not more than 1.5 units of value 4.5 to yield decomposition products which bind to each other; themselves on a soy protein, in an aqueous medium, to a lesser degree than that to which the SPS soybean would be fixed itself, before decompositio 4 sur la protéine de soja, en milieu aqueux.  on the soy protein, in an aqueous medium. 4 SPS-ase suivant l'une quelconque des revendica-  4 SPS-ase according to any of the claims tions 1 à 3 caractérisée en ce que les produits de décompo-  1 to 3, characterized in that the decompo- sition du SPS de soja se fixent eux-mêmes,après dégradation complète, sur la protéine de soja à un degré,représentant une valeur inférieunà 50 %, en particulier inférieure à 20 %, que celui auquel le SPS de soja se serait fixé lui-même, avant décomposition, sur la protéine végétale, en milieu aqueux. SPS-ase suivant l'une quelconque des revendica- tions 1 à 4 caractérisée en ce qu'elle réagit positivement au test de la SPS-ase lorsqulil est exécuté suiivant le procédé de détermination qualitative et quantitative de la SPS-ase.  soybean SPS bind themselves, after complete degradation, to the soybean protein to one degree, representing less than 50%, in particular less than 20%, than that to which the soybean SPS would have set itself. even, before decomposition, on the vegetable protein, in an aqueous medium. SPS-ase according to any one of claims 1 to 4, characterized in that it reacts positively to the SPS-ase test when it is carried out following the method of qualitative and quantitative determination of SPS-ase. 6 SPS-ase suivant l'une quelconque des revendica-  6 SPS-ase according to any of the claims tions 1 à 5 caractérisée en ce que la SPS-ase est produite au moyen d'un microorganisme appartenant au genre Aspergillus, de préférence appartenant au groupe Aspergillus niger.  1 to 5 characterized in that the SPS-ase is produced by means of a microorganism belonging to the genus Aspergillus, preferably belonging to the group Aspergillus niger. 7 SPS-ase suivant l'une quelconque des r 3 nvendica-  7 SPS-ase according to any of the 3 nvendica- tions 1 à 6 caractérisée en ce qu'elle est dérivée des enzymes qui peuvent être produites par Asp -aculeatus CBS  1 to 6 characterized in that it is derived from the enzymes that can be produced by Asp -aculeatus CBS 101 43.101 43. 8 SPS-ase suivant l'une quelconque des revendica-  8 SPS-ase according to any of the claims tions 1 à 7 caractérisée en ce qu'elle est identique au point de vue de l'immunoélectrophorèse à la SPS-ase produite au moyen de Asp aculéatus CBS 101 43 et qu'elle  1 to 7, characterized in that it is identical from the point of view of SPS-ase immunoelectrophoresis produced by means of Asp aculatus CBS 101 43 and that it peut être identifiée au moyen de la technique de recouvre-  can be identified by means of the recovery technique. ment immunoélectrophorétique.immunoelectrophoretic 9 SPS isolé caractérisé en ce qu'il est produit à partir d'une protéine végétale brute servant de substance de départ ' SPS isolé suivant la revendication 9 et caracté-' risée en ce que la protéine végétale brute est une farine  9 isolated SPS characterized in that it is produced from a raw vegetable protein as an isolated SPS starting material according to claim 9 and characterized in that the raw vegetable protein is a flour de soja dégraissée.defatted soybeans. 11 Procédé de sélection d'un microorganisme produi-  11 Process for selecting a microorganism produced sant une SPS-ase permettant de produire la SPS-ase suivant-  an SPS-ase to produce the next SPS-ase l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en  any of claims 1 to 8, characterized in that que le microorganisme à tester est cultivé sur un milieu de fermentation dont la source principale de carbone est du SPS suivant la revendication 9 ou 10, après quoi un échantillon du milieu de fermentation est analysé pour déterminer la SPS-ase et le-microorganisme en question est choisi en tant que microorganisme produisant une SPS-ase,  that the microorganism to be tested is cultured on a fermentation medium whose main source of carbon is SPS according to claim 9 or 10, after which a sample of the fermentation medium is analyzed to determine the SPS-ase and the microorganism in question is chosen as a microorganism producing an SPS-ase, si l'analyse de la SPS-ase est positive.  if the analysis of SPS-ase is positive. 12 Procédé de production de SPS-ase suivant l'une  12 Process for producing SPS-ase according to one quelconque des revendications 1 à 8 caractérisé en ce  any of claims 1 to 8 characterized in that qu'une souche choisie suivant le procédé de-sélection de  that a strain chosen according to the process of selection of la revendication 11 est cultivée dans un milieu nutritif.  claim 11 is cultivated in a nutrient medium. 13 Procédé suivant la revendication 12 caractérisé en ce que la souche Asp aculeatus CBS 101 43 ou Asp.  Process according to Claim 12, characterized in that the strain Asp aculeatus CBS 101 43 or Asp. japonicus IFO 4408 est cultivée dans un milieu nutritif.  japonicus IFO 4408 is grown in a nutrient medium. 14 Procédé suivant la revendication 12 ou 13 carac-  Process according to Claim 12 or 13, térisé en ce que la culture est effectuée en culture noyée à un p H compris dans l'intervalle de 3 à 7, de 1-référence de 4 à 6, à une température dans l'intervalle de 20 à 40 C, de préférence de 25 à 350 C, et en ce que le milieu nutritif contient des sources de carbone et d'azote et des sels inorganiques  characterized in that the culture is carried out in a drowned culture at a pH in the range of 3 to 7, a 1-reference of 4 to 6, at a temperature in the range of 20 to 40 C, preferably 25 to 350 C, and in that the nutrient medium contains carbon and nitrogen sources and inorganic salts Procédé suivant l'une quelconque des revendica-  Process according to any one of the claims tions 12 à 14 caractérisé en ce que le milieu nutritif  12 to 14 characterized in that the nutrient medium contient de la farine de soja.contains soy flour. 16 Procédé suivant la revendication 15 caractérisé en ce que la farine de soja est traitée par une enzyme protéolytique avant d'être utilisée comme composant du substrat, l'enzyme protéolytique étant, de préférence, produite par voie microbienne au moyen de Bacillus licheniformis.  A process according to claim 15 characterized in that the soy flour is treated with a proteolytic enzyme before being used as a component of the substrate, the proteolytic enzyme preferably being produced microbially by means of Bacillus licheniformis. 17 Procédé suivant l'une quelconque des revendica-  Process according to any one of the claims tions 12 à 16 caractérisé en ce qu'une solution stérile de pectine est ajoutée de manière aseptique au bouillon de  12 to 16 characterized in that a sterile solution of pectin is added aseptically to the broth of fermentation pendant la culture.fermentation during cultivation. 18 Procédé de décomposition de polysaccharides, de préférence des polysaccharides de parois cellulaires de plantes, au moyen d'une carbohydrase, caractérisé en ce  Process for the decomposition of polysaccharides, preferably plant cell wall polysaccharides, using a carbohydrase, characterized in that qu'on met une préparation de SPS-ase suivant l'une quel-  that a SPS-ase preparation is conque des revendicationsi à 8 en-contact avec un substrat  conque of claimsi to 8 in-contact with a substrate pour ladite préparation de SPS-ase, exception faite des décompositionsdéjà décrites dans la demande de brevet  for said preparation of SPS-ase, except for the decompositions already described in the patent application danois N O 5691/81.Danish No. 5691/81. 19 Procédé de décomposition de polysaccharides, suivant la revendication 18, caractérisé en ce que la  Polysaccharide decomposition method according to claim 18, characterized in that the décomposition est accompagnée par l'isolement ou l'extrac-  decomposition is accompanied by isolation or extrac- tion d'une substance biologique différente de la protéine de soja et des protéines végétales apparentées provenant  of a biological substance different from the soy protein and related plant d'une substance biologique brute, la préparation de SPS-  of a raw biological substance, the preparation of SPS- ase étant essentiellement exempte de-toute enzyme capable  ase being essentially free of any enzyme capable of de décomposer ladite substance biologique.  to decompose said biological substance. Procédé de décomposition de polysaccharides suivant la revendication 18 ou 19 caractérisé en ce que un ou plusieurs des produits de réaction, sans distinguers'ils sont des produits finals recherchés ou des déchets, sont traités ultérieursement en même temps que le traitement  Process for the decomposition of polysaccharides according to Claim 18 or 19, characterized in that one or more of the reaction products, irrespective of whether they are desired end products or waste, are subsequently treated together with the treatment. enzymatique ou après celui-ci.enzymatic or after it. 21 Procédé de décomposition de polysaccharides  21 Method of decomposing polysaccharides suivant la revendication 20 caractérisé en ce que le trai-  according to claim 20 characterized in that the treatment tement ultérieur est une fermentation alcoolique dans le cas o l'un des produits de la réaction est un sucre  The following is an alcoholic fermentation in the case where one of the products of the reaction is a sugar fermentable.fermentable.
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