FR2494717A1 - Producing resting spores of entomopathogenic fungi - by fermenting hyphae, blending pre:spores with carrier and maturing - Google Patents

Abstract

Prodn. of resting spores (A) of Entomophthorales, pathogenic on insect pests, comprises first aerobically fermenting the appropriate hyphae on a fermentation medium contg. C and N sources at pH 6-7 for 2-5 days so as to form spherical, double-walled prespores (B). These are sepd. and thoroughly washed under non-sterile conditions, then mixed with an inert, wet carrier (C) such as clay. The mixt. is matured at 15-25 deg.C so that (B) are converted to spores having wall thickness at least 10% of the spore diam. and usually consisting of a single lipid globule of min. diam. one-third to two-thirds of the spore diam. The (C)-coated spores are then stored at 2-7 deg.C and opt. then formulated with other standard components to give a plant-protection compsn. having high infectious power. Compared with known processes the fermentation time is reduced and there are significantly fewer checks to fermentation caused by contamination. The coated spores can be stored for a long time without loss of germination capacity and can be applied to already infested plants (if spone germination is rapid) or two plants before they are attacked by insects (if germination is slow).

Description

La présente invention est relative a des perfectionnements aux procédés de préparation de spores durables de champignons Entomophthorales pathogènes d'insectes, aux préparations de spores ainsi obtenues et aux applications phytosanitaires de ces préparations. De façon plus spécifique, la présente invention est relative & un nouveau procédé de formation, de maturation et de germination de spores durables de champignons Entomophthorales pathogènes d'insectes, et aux spores obtenues par ce procédé, ainsi qu'à l'utilisation de ces dernières notamment dans des compositions phytosanitaires. The present invention relates to improvements in processes for the preparation of long-lasting spores of entomophthoric insect pathogenic fungi, to the spore preparations thus obtained and to the phytosanitary applications of these preparations. More specifically, the present invention relates to a novel process for forming, maturing and germinating long-lasting spores of entomophthoric insect pathogenic fungi, and to spores obtained by this method, as well as to the use of these spores. especially in phytosanitary compositions.

Les Entomophthorales sont des champignons entomopathogènes très répandus dans le monde entier, qui infectent divers insectes nuisibles, notamment en agriculture, et exercent une action pathogène particulièrement efficace à l'égard des aphides. Entomophthorales are entomopathogenic fungi that are widespread throughout the world, which infect various insect pests, particularly in agriculture, and have a particularly effective pathogenic action against aphids.

Comme on le sait, les Entomophthorales produisent deux types de spores : les conidies, dont la durée de vie est brève et qui sont à l'origine de l'infection et de la propagation de la maladie, et les spores durables ("resting spores") - zygosporesou azygospores suivant l'espèce - qui assurent la conservation du champignon d'année en année, sont résistantes aux conditions climatiques adverses et fournissent l'inoculum pour l'infection primaire des insectes au début de leur cycle de pullulation. Les spores durables,en raison de leur résistance, représentent actuellement les propagules les mieux adaptées pour l'emploi des
Entomophthorales dans la lutte contre les insectes nuisibles, et notamment contre les aphides (cf. Bull. Soc.As is known, Entomophthorales produce two types of spores: conidia, which have a short lifespan and are the source of infection and the spread of the disease, and long-lasting spores ("resting spores"). ") - zygospores or azygospores depending on the species - which ensure the conservation of the fungus from year to year, are resistant to adverse climatic conditions and provide the inoculum for the primary infection of insects at the beginning of their breeding cycle. The durable spores, because of their resistance, currently represent the most suitable propagules for the employment of the
Entomophthorales in the fight against harmful insects, especially aphids (see Bull Soc.

Pathol. Exot., vol. 71, p. 196-203, 1978, J.P. Latge,
G. Remaudiere & B. Papierok) L'infection des insectes est en outre possible à partir du mycélium (corps hyphaux) et des coniaies proauits in vitro,en particulier dans le cas des espèces qui ne donnent pas de spores durables en culture corne par exemple Erynia neoaphidis
Remaudière & Keller.Pathol. Exot., Vol. 71, p. 196-203, 1978, JP Latge,
G. Remaudiere & B. Papierok) Infection of insects is furthermore possible from the mycelium (hyphaux body) and coniaia produced in vitro, in particular in the case of species which do not give lasting spores in horn culture. example Erynia neoaphidis
Remaudière & Keller.

Les procédés de préparation de spores durables d'Entomophthorales connus consistent à fermenter, pendant 5 à 15 jours, sous agitation et insufflation d'air, à une température comprise entre 10 et 30C (variable suivant l'espèce), un inoculum constitué par des corps hyphaux d'Entomophthorales âgés de 1 à 8 jours dans un milieu de culture liquide approprié, (cf. Biotechnol. Bioengin. vol. 19, p. The methods for the preparation of durable spores of known Entomophthorales consist in fermenting, for 5 to 15 days, with stirring and insufflation of air, at a temperature of between 10 and 30 ° C. (variable according to the species), an inoculum consisting of Entomophthorales hyphal bodies aged from 1 to 8 days in a suitable liquid culture medium, (see Biotechnol Bioengine, vol 19, p.

1269-1284, 1977, J.P. Latgé, R.S. Soper & C.D. Madore et
Canad. J. Microb., vol. 26,p. 1038-1048,1980,J.P. Latgé).1269-1284, 1977, JP Latgé, RS Soper & CD Madore and
Canad. J. Microb., Vol. 26, p. 1038-1048, 1980, JP Latgé).

La première phase de fermentation est une phase de croissance. L'affamement du mycélium déclenche la sporulation dans le milieu de culture. Les spores immatures sont appe lées 'wprespores(voir figure unique). La maturation de ces préspores a lieu au cours d'une deuxième phase de fermentation liquide. Les spores mûres sont généralement caractérisées par un globule lipidique central dont le diamètre est compris entre 1/3 et 2/3 du diamètre sporal et une paroi dont l'épaisseur est au moins égale au 1/10 du diamètre sporal. Les spores sont séparées de la phase liquide, par exemple par centrifugation, puis rincées à l'eau, avant stockage à l'état humide ou séchage à l'air, suivant les espèces.The first fermentation phase is a growth phase. The starvation of the mycelium triggers sporulation in the culture medium. Immature spores are called wprespores (see single figure). The maturation of these prespores takes place during a second phase of liquid fermentation. The mature spores are generally characterized by a central lipid globule whose diameter is between 1/3 and 2/3 of the spore diameter and a wall whose thickness is at least equal to 1/10 of the spore diameter. The spores are separated from the liquid phase, for example by centrifugation, then rinsed with water, before storage in the wet state or air drying, depending on the species.

La production des spores durables peut être effectuée sur milieu solide,notamment chez Zoophthora radicans (Brefeld) BathD.un procède de production sur vermiculite a été développé chez Canidiobolus thromboldes Drechsler (=Entomophthora virulenta Hall & Dunn). I1 a pu être établi que la croissance et le développement des cultures ainsi réalisées étaient considérablement augmentés, et que, après conservation pendant 6 mois à -200C, ces cultures étaient encore vivantes (cf.Lantbrukshögskolans Annaler, Vol. 35, p. 235-274, 1969, M. Gustafsson; Ces cultures ont cependant été réalisées avec des espèces dont la conservation in vitro est très facile. The production of durable spores can be carried out on a solid medium, in particular in Zoophthora radicans (Brefeld) BathD. A vermiculite production method has been developed in Canidiobolus thromboids Drechsler (= Entomophthora virulenta Hall & Dunn). It could be established that the growth and development of the crops thus produced was considerably increased, and that, after storage for 6 months at -200 ° C, these crops were still alive (cf., Lantbrukshögskolans Annaler, Vol 35, p. 274, 1969, M. Gustafsson These cultures have, however, been carried out with species whose in vitro conservation is very easy.

Plus récemment, (cf. Brevet français Sandoz 2 317 882), il a été proposé d'enrober des préparations de virus obtenues par broyage dans l'eau de larves infectées ou par extraction par l'acétone, d'une matrice solide comprenant une matière protéique inerte solide et/ou de l'argile, pour réaliser des compositions insecticides microbiologiques sous forme de fines particules mouillables, dures, de dimensions inférieures 150 pm. I1 a, par ail leurs,été proposé (cf. Brevet français INRA-REmS nO 2 3n4 606 et Smn. Zool. Ecol. anim.,1979,11, p. 247-257, Fargues,J., Robert,P. More recently, (see French patent Sandoz 2,317,882), it has been proposed to coat virus preparations obtained by grinding in the water of infected larvae or by extraction with acetone, of a solid matrix comprising a solid inert protein material and / or clay, for producing microbiological insecticidal compositions in the form of fine, wettable fine particles of dimensions less than 150 μm. On the other hand, they have been proposed (see French patent INRA-REmS Nos. 2 3n4 606 and Smn Zool, Ecol anim, 1979, 11, pp. 247-257, Fargues, J., Robert, P.

& Reisinger,O) ,de protéger et de conserver des microorganismes utilisables en tant qu'insecticides de lutte contre les insectes nuisibles en agriculture et en arboriculture en les enrobant d'argile, en assurant en même temps le maintien de leur efficacité lors d'un stockage prolongé. & Reisinger, O), to protect and conserve microorganisms that can be used as insecticides for pest control in agriculture and arboriculture by coating them with clay, while at the same time ensuring that they remain effective at the same time. extended storage.

Le procédé décrit consiste à mélanger une préparation aqueuse de microorganismes tels que virus, champignons ou bactéries obtenus sur milieu nutritif et préalablement lavés pour éliminer toute trace d'un tel milieu, avec une suspension aqueuse d'argile, I soumettre ce mélange à agitation, puis à éliminer l'eau en excès, notamment par séchage par atomisation ou par lyophilisation, ce qui permet d'obtenir des propagules, notamment des spores fongiques entomopathogènes, enrobées d'argile, stabilisées par la combinaison du traitement de déshydratation, de l'enrobage par l'argile et de la conservation à basse température (+ 50C) et qui conservent leur pouvoir infectieux au bout d'un mois de conservation, ce pouvoir subissant une diminution au bout de 3 a 5 mois de conservation.The method described consists in mixing an aqueous preparation of microorganisms such as viruses, fungi or bacteria obtained on nutrient medium and previously washed to remove any trace of such a medium, with an aqueous suspension of clay, stirring this mixture, and then removing the excess water, in particular by spray drying or by lyophilization, which makes it possible to obtain propagules, in particular entomopathogenic fungal spores, coated with clay, stabilized by the combination of the dehydration treatment, the coating with clay and preservation at low temperature (+ 50C) and which retain their infectivity after one month of preservation, this power being reduced after 3 to 5 months of storage.

L'on sait, par ailleurs, que les espèces d'Entomophthorales se distinguent par leurs comportements différents en ce qui concerne la croissance mycélienne, la formation et la germination des spores durables. Certaines espèces telles Neozygites fresenii (Nowak) Remaudière & BR<
Keller, n'ont jamais été cultivées in vitro. Des espèces, notamment c. obscurus (Hall & Dunn) Remaudière & -Keller ou c. thromboldes Drechsler f o r m e n t d é s spores durables in vitro, en culture liquide, alors que d' a u t r e s , n o t a m m e n t Z. radicans produisent des spores sur substrat solide après ou sans développement mycélien en culture liquide agitée.Les spores durables de certaines espèces, notamment c. thromboldes germent immédiatement lorsqu'elles sont placées dans l'eau à température ambiante, alors que d'autres espèces, notamment C. obscurus et z radicans produisent d e s spores dormantes qui requièrent un séjour de longue durée à basse température pour lever leur dormance et ensuite germer lorsqu'elles sont remises dans l'eau I température ambiante.La dénomination des espèces d'Entomophthorales est conforme aux travaux de Remaudière & Hennebert (1980,
Mycotaxon, 11, 269-321) et Remaudière & Keller (1980,
Mycotaxon, 11, 323-338)
La présente invention s'est donné pour but de pourvoir à un procédé de préparation de spores durables de champignons Entomophthorales pathogènes d'insectes nuisibles, qui répond mieux aux nécessités de la pratique que les procédés visant au même but proposés dans l'Art antérieur, notamment en ce qu'il réduit la durée de fermentation du champignon, en ce qu'il diminue considérablement les échecs de fermentation par contamination tardive dans les cuves de culture, en ce qu'il donne lieu à des spores mûres obtenues par maturation des pré spores dans des conditions non stériles, en présence d'un support inerte, en ce que ces spores se conservent pendant des durées prolongées et en ce que leur germination ultérieure est activée, en ce que les spores germées obtenues conservent une activité pathogène, en ce que les spores ainsi traitées permettent des applications phytosanitaires plus souples que les préparations entomopathogènes proposées conformément I l'Art antérieur.It is known that Entomophthorales species are distinguished by their different behavior with respect to mycelial growth, formation and germination of long-lasting spores. Some species such Neozygites fresenii (Nowak) Remaudière & BR <
Keller, have never been grown in vitro. Species, including c. obscurus (Hall & Dunn) Remaudiere & -Keller or c. Drechsler thromboids form durable spores in vitro, in liquid culture, while others, especially Z. radicans, produce solid substrate spores after or without mycelial growth in agitated liquid culture.Sustainable spores of some species, including c. thromboids germinate immediately when placed in water at room temperature, while other species, including C. obscurus and z radicans produce dormant spores that require long-term low-temperature dormancy and then germinate when put back into the water at room temperature.The name of the Entomophthorales species is in line with the work of Remaudière & Hennebert (1980,
Mycotaxon, 11, 269-321) and Remaudière & Keller (1980,
Mycotaxon, 11, 323-338)
It is an object of the present invention to provide a process for the preparation of long-lasting spores of entomophthora pathogenic insect pest fungi which is more relevant to the requirements of the practice than the methods for the same purpose provided in the prior art. in particular in that it reduces the fermentation time of the fungus, in that it considerably reduces the fermentation failures by late contamination in the culture tanks, in that it gives rise to mature spores obtained by maturation of the meadow spores under non-sterile conditions, in the presence of an inert support, in that these spores are preserved for prolonged periods of time and in that their subsequent germination is activated, in that the germinated spores obtained retain a pathogenic activity, in that that the spores thus treated allow more flexible plant protection applications than the entomopathogenic preparations proposed in accordance with the Prior art.

La présente invention a pour objet un procédé de préparation de spores durables de champignons Entomophthorales pathogènes d'insectes, nuisibles notamment en agricul ture, caractérisé en ce qu'il comprend les etapes suivantes: - une première étape de fermentation d'un inoculum composé de corps hyphaux d'Entomophthorales dans un milieu de fermentation approprié contenant une source de carbone et une source d'azote, sous agitation et insufflation d'air, à un pH variable selon les especes et de préférence compris entre 6 et 7, ladite étape de fermentation donnant lieu, après une durée de 2 à 5 jours suivant les espèces, à la formation de pré spores sphériques présentant une paroi composée de deux couches, la couche interne isolant la spore du milieu ambiant ; - une deuxième étape, réalisée dans des conditions non stériles, au cours de laquelle les préspores sont séparées du milieu de fermentation et lavées abondamment et soigneusement ; - une troisième étape au cours de laquelle les pré spores sont mélangées avec un support inerte humide tel que de l'argile ; - une quatrième étape d'évolution des pré spores mélangées audit support inerte humide, à une température comprise entre 15 et 250C, pendant un temps suffisant pour o b t e n i r 1 e s s p o r e s d u r a b 1 e s présentant une épaisseur de paroi au moins égale au 1/10 du diamètre sporal et comprenant un seul globule lipidique de diamètre minimum égal au 1/3 du diamètre sporal ; - une cinquième étape au cours de laquelle lesdites spores durables, en mélange avec le support inerte, sont gardées au froid I une température moyenne comprise entre 2 et 70C,et -une sixième étape ol les spores enrobées du support inerte sont éventuellement mélangées à des composés usuels pour l'obtention d'une composition phytosanitaire entomopathogène à l'égard des insectes nuisibles, notamment en agriculture, laquelle composition présente un pouvoir infectieux élevé. The subject of the present invention is a process for the preparation of long-lasting spores of entomophthoric fungi which are pathogenic for insects, harmful in particular in agriculture, characterized in that it comprises the following steps: a first fermentation step of an inoculum composed of Entomophthorales hyphal bodies in a suitable fermentation medium containing a source of carbon and a nitrogen source, with stirring and insufflation of air, at a pH varying according to the species and preferably between 6 and 7, said step of fermentation giving rise, after a period of 2 to 5 days depending on the species, to the formation of spherical pre spores having a wall composed of two layers, the inner layer isolating the spore from the ambient medium; a second step, carried out under non-sterile conditions, during which the prespores are separated from the fermentation medium and washed thoroughly and carefully; a third step during which the pre spores are mixed with a wet inert support such as clay; a fourth stage of evolution of the pre-spores mixed with said wet inert support, at a temperature of between 15 and 250 ° C., for a time sufficient to obtain 1 solid phase with a wall thickness at least equal to 1/10 of the spore diameter; and comprising a single lipid globule of minimum diameter equal to 1/3 of the spore diameter; a fifth step during which said durable spores, mixed with the inert support, are kept cold at an average temperature of between 2 and 70 ° C., and a sixth stage, wherein the spores coated with the inert support are optionally mixed with conventional compounds for obtaining an entomopathogenic phytosanitary composition with regard to harmful insects, especially in agriculture, which composition has a high infectivity.

Selon un mode de réalisation avantageux du procédé objet de la présente invention, particulièrement adapté I la maturation des spores d'Entomophthorales présentant un temps de dormance, l'étape de maturation des préspores mélangées I un support inerte humide, en spores durables fournit des spores dormantes qui sont soumises I une étape supplémentaire de traitement qui a pour but de lever leur dormance et qui consiste I maintenir le mélange de spores durables et d'argile humide a une température moyenne de l'ordre de 2 à 70C pendant une durée d'au moins deux mois pour obtenir des spores mûres dont la dormance est levée. According to an advantageous embodiment of the method which is the subject of the present invention, particularly adapted to the maturation of Entomophthorales spores having a dormant time, the stage of maturation of the prespores mixed with a moist inert support, in durable spores, provides spores. dormantes which are subjected to an additional treatment step which aims at lifting their dormancy and which consists in maintaining the mixture of durable spores and moist clay at an average temperature of the order of 2 to 70.degree. C. for a period of time. at least two months to obtain ripe spores whose dormancy is lifted.

Selon un autre mode de realisation avantageux du procédé conforme à l'invention, les préspores sont séparées du milieu de culture a leur sortie du fermenteur, dans la deuxième étape, par centrifugation ou par filtration, et lavées soigneusement. According to another advantageous embodiment of the process according to the invention, the prespores are separated from the culture medium at their outlet from the fermenter, in the second stage, by centrifugation or by filtration, and washed thoroughly.

Selon une disposition préférée de ce mode de réalisation, la séparation des préspores du milieu de culture est réalisée par filtration éventuellement en présence d'un adjuvant de filtration approprié. According to a preferred arrangement of this embodiment, the separation of the prespores from the culture medium is carried out by filtration optionally in the presence of a suitable filter aid.

Selon encore un autre mode de réalisation avantageux du procédé objet de la présente invention, le support inerte utilisé dans la troisième étape est une argile choisie dans le groupe qui comprend notamment la rhyolite, la terre de diatomées, l'attapulgite, l'argile complexe "Le
Buisson" à base essentiellement de bentonite et d'attapulgite.According to yet another advantageous embodiment of the method which is the subject of the present invention, the inert support used in the third step is a clay chosen from the group which notably comprises rhyolite, diatomaceous earth, attapulgite, complex clay. "The
Bush "essentially based on bentonite and attapulgite.

Selon une disposition préférée de l'invention, les
Entomophthorales mises en oeuvre dans le cadre de la présente invention pour la production et/ou la maturation et/ou la germination de spores-azygospores ou zygospores -, sont choisies notamment dans le groupe qui comprend
C. osmodes, C. obscurus, C. thrcmboîdes, N. fresendi et
Z. radicans.According to a preferred arrangement of the invention, the
Entomophthorales used in the context of the present invention for the production and / or the maturation and / or the germination of spores-azygospores or zygospores - are chosen especially from the group which comprises
C. osmodes, C. obscurus, C. thrcmboides, N. fresendi and
Z. radicans.

Le procéde conforme à la présente invention comprend la totalité des étapes ci-dessus ou seulement certaines de ces dernières. En particulier, les spores durables, formées in vivo, d'une espèce non cultivable (telle que
N. fresenii) ou celles produites en milieu solide pour les espèces ne sporulant pas en milieu liquide, notamment z. radicans, peuvent subir les étapes 3, 4, 5 et 6. D'un autre cté, les spores ne présentant pas de dormance comme notamment celles de c. thromboides peuvent subir en particulier les étapes 1, 2, 3 et 4.The process according to the present invention comprises all or some of the above steps. In particular, the durable spores, formed in vivo, of a non-cultivable species (such as
N. fresenii) or those produced in solid medium for species not sporulating in a liquid medium, in particular z. radicans, may undergo steps 3, 4, 5 and 6. On the other hand, spores that do not have dormancy, such as those of c. In particular, thromboids can undergo steps 1, 2, 3 and 4.

Selon un mode de réalisation préféré du procédé objet de la présente invention, la maturation des préspores en spores en mélange avec un support inerte, est réalisée en présence d'eau, la proportion des constituants du mélange préspores: eau: support inerte étant fonction de l'argile et de l'espèce (ou souche) considérée et comprise dans les limites suivantes
Pré spore (poids humide) Eau Argile (poids sec)
2-6 1-7 2-15
Selon un mode de réalisation préféré de l'étape supplémentaire de levée de la dormance des spores dormantes obtenues à l'issue de la quatrième étape, cette étape supplémentaire comprend le maintien pendant au moins deux mois à une température moyenne de 2 à 70C d'un mélange de spores, d'un support inerte et d'eau présents dans des proportions variables suivant le support et l'espèce (ou souche) considérés.According to a preferred embodiment of the method which is the subject of the present invention, the maturation of the prespores in spores mixed with an inert support is carried out in the presence of water, the proportion of the constituents of the mixture being substantial: water: inert support being a function of clay and the species (or strain) considered and included within the following limits
Pre spore (wet weight) Water Clay (dry weight)
2-6 1-7 2-15
According to a preferred embodiment of the additional step of lifting the dormancy of the dormant spores obtained at the end of the fourth step, this additional step comprises maintaining for at least two months at an average temperature of 2 to 70 ° C. a mixture of spores, an inert support and water present in variable proportions depending on the support and the species (or strain) considered.

La présente invention a en outre pour objet en tant que produit intermédiaire nouveau utilisé pour la production de spores d'Entomophthorales présentant un pouvoir entomopathogène élevé, un mélange de préspores sphériques présentant une paroi bituniquée obtenues par fermentation dans un milieu de culture approprié, et d'une argile choisie dans le groupe qui comprend notamment la rhyolite, la terre de diatomées, l'argile "Le Buisson" (mélange complexe naturel à base de bentonite et d'attapulgite) et l'attapulgite. The present invention furthermore relates to the novel intermediate product used for the production of Entomophthorales spores with high entomopathogenic potency, a mixture of spherical prespores having a bitunicated wall obtained by fermentation in a suitable culture medium, and a clay selected from the group which comprises in particular rhyolite, diatomaceous earth, clay "Le Buisson" (natural complex mixture based on bentonite and attapulgite) and attapulgite.

La présente invention a également pour objet en tant que produit nouveau, un mélange d'argile et de spores dont la dormance a été levée par maintien du mélange pendant au moins deux mois à une température moyenne comprise entre 2 et 70C. The subject of the present invention is also, as a novel product, a mixture of clay and spores whose dormancy has been lifted by maintaining the mixture for at least two months at an average temperature of between 2 and 70 ° C.

La présente invention a également pour objet une composition phytosanitaire entomopathogène, caractérisée en ce qu'elle est constituée par un mélange de spores présentant un pouvoir infectieux élevé à l'égard des insectes nuisibles, notamment en agriculture, et d'argile, obtenu par le procédé de l'invention, associé aux composés usuels pour la préparation d'une telle composition tels qu'agents collants, mouillants, dispersants, propres à faciliter la pulvérisation ou l'aspersion ultérieure desdites compositions en plein champ, et I favoriser le collage des spores sur le substrat végétal. The present invention also relates to an entomopathogenic phytosanitary composition, characterized in that it consists of a mixture of spores having a high infectivity with regard to harmful insects, especially in agriculture, and clay, obtained by the method of the invention, associated with the usual compounds for the preparation of such a composition such as sticking agents, wetting agents, dispersants, capable of facilitating the spraying or subsequent sprinkling of said compositions in the open field, and I to promote the sticking of spores on the plant substrate.

Selon un mode de réalisation avantageux de la composition phytosanitaire conforme à la présente invention, son constituant actif est constitué par des spores enrobées d'argile, à pouvoir entomopathogène élevé obtenues par maturation de préspores sphériques issues d'une fermentation. According to an advantageous embodiment of the phytosanitary composition according to the present invention, its active constituent is formed by clay-coated spores with high entomopathogenic power obtained by maturation of spherical prespores resulting from fermentation.

Selon un autre mode de réalisation avantageux de la composition phytosanitaire conforme à la présente invention,son constituant actif est constitue par des spores enrobées d'argile, à pouvoir entcOOpathogène élevé obtenues par maturation de préspores sphériques issues d'une fermentation et maintien des spores résultantes pendant au moins deux mois à 2 à 70C, pour lever la dormance desdites spores. According to another advantageous embodiment of the phytosanitary composition according to the present invention, its active constituent is constituted by clay-coated spores with high enthalogenicity obtained by maturation of spherical prespores resulting from fermentation and maintenance of the resulting spores. for at least two months at 2 to 70C, to lift the dormancy of said spores.

La présente invention a en outre pour objet un procédé de traitement de cultures à l'aide de la composition phytosanitaire entomopathogène conforme l'invention, lequel procédé consiste à appliquer sur la plante et/ou au sol, par pulvérisation ou aspersion, la composition phytosanitaire conforme à l'invention, pour contrdler des populations d'insectes nuisibles importantes déjà établies sur la plante, dans le cas où le constituant actif, c'est-àdire la spore, est à germination rapide (environ 48 heures), ou avant l'apparition des insectes ou dès la détection des premiers insectes, pour contrôler la population d'insectes avant qu'elle n'ait atteint un seuil dommageable pour la culture, dans le cas où le constituant actif, c'est-à-dire la spore, est à germination lente (8 à 15 jours ou plus).  The subject of the present invention is furthermore a process for the treatment of cultures with the aid of the entomopathogenic phytosanitary composition according to the invention, which process consists in applying to the plant and / or to the soil, by spraying or spraying, the phytosanitary composition. according to the invention, to control populations of important pests already established on the plant, in the case where the active component, ie the spore, is fast germinating (about 48 hours), or before the appearance of insects or as soon as the first insects are detected, to control the insect population before it has reached a threshold that is harmful to the crop, in the case where the active constituent, that is to say the spore, is slow-germinating (8 to 15 days or more).

Les spores mûres peuvent être incubées dans l'eau pendant
plusieurs jours avant formulation définitive et application.Par ce
traitement, les spores ayant une germination lente peuvent être uti
lisées dans les mêmes conditions que celles à germination rapide.Ripe spores can be incubated in water for
several days before final formulation and application.By this
spores with slow germination can be used
under the same conditions as those with rapid germination.

Parmi les Entomophthorales qui sont susceptibles
d'être utilisées dans le cadre de l'invention, on peut citer,
à titre d'exemples non limitatifs, c. obscurus, C. osmodes,
C. thromboides, étant cependant bien entendu que tout au
tre représentant du groupe des Entomophthorales que ceux
qui viennent d'être mentionnés peut être utilisé dans le
cadre de la présente invention
Pour la mise en oeuvre du procédé conforme à las présente invention, on procède avantageusement comme suit, les modalités du procédé précisées ci-après étant applicables en particulier dans le cas de c. obscurus::
La figure unique annexée schématise les différentes étapes du développement de c. obscurus réalisé en mettant en oeuvre le procédé conforme à la présente invention, depuis l'inoculation du mycélium dans le milieu de culture du fermenteur jusqu'à l'obtention des spores germées qui exercent directement ou par l'intermédiaire des conidies qu'elles projettent dans l'air, leur action entomopathogène sur les insectes nuisibles notamment I l'égard des plantes.Among the Entomophthorales that are susceptible
to be used in the context of the invention, mention may be made of
as non-limiting examples, c. obscurus, C. osmodes,
C. thromboides, although it is understood that everything
representatives of the Entomophthorales group than those
which have just been mentioned can be used in the
of the present invention
For the implementation of the process according to the present invention, it is advantageous to proceed as follows, the method conditions specified below being applicable particularly in the case of c. obscurus ::
The single appended figure schematizes the different stages of the development of c. obscurus carried out by carrying out the process according to the present invention, since the inoculation of the mycelium in the culture medium of the fermenter until the germinated spores which exert directly or via the conidia they project in the air, their entomopathogenic action on harmful insects, particularly with regard to plants.

I - Conditions de culture
1. Inoculum
L'inoculum choisi est, de préférence, un mycé
lium agé de 24 I 72 heures, et plus particulièrement âgé
de 24 heures, développé en fermenteur sur un milieu de
culture approprié, notamment sur un milieu agité contenant
1 a 2 % d'extrait de levure (Difco) et 3 à 6 % de glucose,
et cet inoculum représente 1 à 20 % (v/v) du milieu de cul
ture ensemencé.I - Cultivation conditions
1. Inoculum
The chosen inoculum is, preferably, a fungus
aged from 24 to 72 hours, and more particularly aged
24 hours, developed in a fermenter on a medium of
appropriate culture, especially on a stirred medium containing
1 to 2% yeast extract (Difco) and 3 to 6% glucose,
and this inoculum represents 1 to 20% (v / v) of the middle of ass
seeded.

2. Milieu de culture
Le milieu de culture utilisé pour réaliser la
sporulation, est un milieu solide ou liquide aqueux qui contient essentiellement une source de carbone et une source d'azote,
la source de carbone étant constituée par exemple par du glucose ou
d'autres sucres commercialisés notatrt sous les Marques "XslBREX",
"GLOBE", "FLEURINE", "CERELOSE" (commercialisés par la
SOCIETE DES PRODUITS DU MAIS), ou e n c o r e p a r une huile végétale telle que l'huile de tournesol ou l'huile de mais non raffinée,commercialisée notamment par la SOCIETE Urus
PRODUITS DUS MAÏS et la source d'azote par exemple par de 1 'extrait de levure ou de l'extrait soluble de mals (Produit commercialisé
par la SOCIETE DES PRODUITS DU MAIS).Le rapport C/N doit
être au moins egal à 5.2. Culture medium
The culture medium used to carry out the
sporulation, is an aqueous solid or liquid medium that essentially contains a source of carbon and a source of nitrogen,
the carbon source being constituted for example by glucose or
other sugars sold under the trademarks "XslBREX",
"GLOBE", "FLEURINE", "CERELOSE" (marketed by the
SOCIETY OF MAIZE PRODUCTS), or by a vegetable oil such as sunflower oil or unrefined corn oil, marketed in particular by SOCIETY Urus
PRODUCTS OF CORN and the source of nitrogen for example by yeast extract or soluble extract of maize (marketed product
by the MAIZE PRODUCTS CORPORATION) .The C / N report must
be at least 5.

La teneur en carbone du milieu est,de préférence, de l'ordre de 1,2 à 2,4 %, et sa teneur en azote de l'ordre de 0,1 à 0,2 %. Il est avantageux de lui ajouter un agent antimousse approprie. The carbon content of the medium is preferably of the order of 1.2 to 2.4%, and its nitrogen content of the order of 0.1 to 0.2%. It is advantageous to add an appropriate antifoam agent.

Ce milieu est inoculé par le mycélium mentionné en 1. ci-dessus. This medium is inoculated with the mycelium mentioned in 1. above.

3. Conditions de fermentation
La fermentation est réalisée dans un fermenteur contenant un milieu de culture tel que l'un de ceux décrits en 2. ci-dessus
La température de la fermentation est continuellement régulée à + 200C + 10C. L'agitation est comprise entre 400 et 1200 tpm et l'aération comprise entre 0,1 et 1,0 volume d'air/volume de milieu/minute (vvm). Le pH optimal est compris entre 6 et 7. Il est ajusté à 6,5 avant autoclavage et peut être régulé à 6,5 pendant toute la fermentation.3. Fermentation conditions
The fermentation is carried out in a fermenter containing a culture medium such as one of those described in 2. above
The temperature of the fermentation is continuously regulated at + 200C + 10C. The agitation is between 400 and 1200 rpm and aeration between 0.1 and 1.0 volume of air / volume of medium / minute (vvm). The optimum pH is between 6 and 7. It is adjusted to 6.5 before autoclaving and can be regulated at 6.5 throughout the fermentation.

Dans un milieu de culture contenant 3 I 4 % de glucose ou analogue et 1 % d'extrait de levure, la phase de latence, ou phase stationnaire, dure 6 à 8 heures ; à la suite de cette phase de latence, il s'instaure dans le milieu une phase de croissance linéaire qui atteint son maximum 40 à 50 heures après l'inoculation du milieu de culture. Le mycélium se développe toujours sous forme d'éléments unicellulaires plurinuclés,les corps hyphaux (1) ,séparés ou en amas,plus ou moins importants suivant le temps de fermentation et l'espèce considérée. In a culture medium containing 3-4% glucose or the like and 1% yeast extract, the latency phase, or stationary phase, lasts 6 to 8 hours; as a result of this latency phase, a linear growth phase is established in the medium which reaches its maximum 40 to 50 hours after the inoculation of the culture medium. The mycelium always develops in the form of unicellular plurinuclear elements, the hyphaux bodies (1), separated or in clusters, more or less important according to the fermentation time and the species considered.

La sporulation débute dès la fin de la phase de croissance qui correspond à la métabolisation quasicomplète de la source de carbone et/ou d'azote, et le nombre de préspores augmente pendant une vingtaine d'heures. Sporulation begins at the end of the growth phase, which corresponds to the quasicomplete metabolism of the source of carbon and / or nitrogen, and the number of prespores increases for about twenty hours.

Le début de la sporulation est caractérisé par la condensation du protoplasme en un endroit précis (centre de sporulation) du corps hyphal (2). Ce centre de sporulation (2a) peut avoir une position terminale, latérale ou médiane (comme représenté au dessin) sur l'élément mycélien. Une vacuole se forme aux extrémités distales et propulse le protoplasme granuleux vers le centre de sporulation en même temps que des cloisons successives isolent la préspore. The beginning of sporulation is characterized by the condensation of protoplasm at a precise location (sporulation center) of the hyphal body (2). This sporulation center (2a) may have a terminal, lateral or medial position (as shown in the drawing) on the mycelial element. A vacuole forms at the distal ends and propels the granular protoplasm towards the sporulation center at the same time as successive partitions isolate the prespore.

Il se forme ainsi une préspore sphérique (3-4) à protoplasme granuleux.Thus a spherical prespore (3-4) with granular protoplasm is formed.

La paroi unituniquée de la préspore très jeune est de composition similaire I celle du mycélium et est essentiellement constituée de glucanes. Le nombre de préspores est maximal entre la 60ème et la 84ème heure et après ce temps, le nombre des préspores n'augmente plus. Celles-ci évoluent ensuite pendant 3 I 5 jours : de s g 1 o bu 1 e s 1 i p i d iq u e s s'individualisent au centre de la préspore 5.The unitunicated wall of the very young prespore is of similar composition to that of the mycelium and is essentially composed of glucans. The number of prespores is maximum between the 60th and the 84th hour and after this time, the number of prespores does not increase any more. These then evolve during 3 to 5 days: of the 1 i p i d i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i

Le nombre de globules lipidiques va progressivement diminuer en même temps que leur taille augmente et que la paroi de la préspore s'épaissit. Les jeunes préspores contiennent plus de 50 globules lipidiques individualisés, de 3,5 I 5 pm de diamètre et présentent une épaisseur de paroi inférieure I 1 pm. L'augmentation de l'épaisseur de la paroi résulte de la synthèse d'une couche interne (CI) qui comprend essentiellement de la chitine et des protéines et qui est différente de la couche externe (CE) qui est surtout constituée de glucanes. La préspore devient alors insensible I toute variation du milieu extérieur, alors que les corps hyphaux (mycélium) ou les préspores en formation sont, eux, très dépendants du milieu ambiant.The number of lipid globules will gradually decrease as their size increases and the wall of the prespore thickens. Young prespores contain more than 50 individualized lipid globules, 3.5-5 microns in diameter and have a wall thickness of less than 1 micron. The increase in wall thickness results from the synthesis of an inner layer (IC) which essentially comprises chitin and proteins and which is different from the outer layer (CE) which is mainly composed of glucans. The prespore then becomes insensitive to any variation of the external environment, whereas the hyphal bodies (mycelium) or the prespores in formation are themselves very dependent on the environment.

La mise en évidence du fait que le nombre des préspores n'augmente plus après la 60ème I la 84ème heure et que la seconde couche pariétale interne caractéristique de la préspore isole celle-ci du milieu ambiant, a permis aux Inventeurs d'en tirer parti en libérant le fermenteur au bout de 3,5 jours i 12 heures pour réaliser la maturation des préspores I l'extérieur du fermenteur, ce qui permet une réduction de moitié du temps d'utilisation du fermenteur. The demonstration that the number of prespores no longer increases after the 60th to the 84th hour and that the second internal parietal layer characteristic of the prespore isolates it from the ambient environment, allowed the Inventors to take advantage of it by releasing the fermentor after 3.5 days at 12 hours to achieve the maturation of the prespores outside the fermenter, which allows a reduction of half the time of use of the fermenter.

Le nombre de pré spores produites est de 5 x 105 à 2 x 106 préspores par ml pour les milieux indiqués en 2. ci-dessus. The number of pre spores produced is 5 x 105 to 2 x 106 prespores per ml for the media indicated in 2 above.

Il - Formation des spores durables à partir des pré-
spores
1. Recupération des préspores
La fermentation étant alors arrêtée 3,5 jours i 12 heures après l'inoculation, lorsque les préspores ont une paroi bituniquée, les préspores sont récupérées par centrifugation ou filtration et abondamment lavées I l'eau ordinaire. La filtration peut être éventuellement réalisée en présence d'un adjuvant de filtration tel qu'une perlite de filtration par exemple, ou tout autre adjuvant de filtration approprié, pour séparer les préspores.It - Formation of sustainable spores from the pre-
spore
1. Recapture of prespores
The fermentation being then stopped 3.5 days at 12 hours after the inoculation, when the prespores have a bitunicate wall, the prespores are recovered by centrifugation or filtration and abundantly washed with ordinary water. The filtration may optionally be carried out in the presence of a filter aid such as filtration perlite, for example, or any other suitable filter aid, to separate the prespores.

2 Conditionnement des Erespores Ear de l'argile
Les préspores sont alors mélangées de façon homogène dans un malaxeur approprié, I palette par exemple, dans des conditions non stériles, avec une argile, en présence d'eau, notamment une argile prise dans le groupe qui comprend, en particulier, la rhyolite, la terre de diatomées, l'attapulgite, l'argile "Le Buisson".2 Conditioning Erespores Ear of clay
The prespores are then mixed homogeneously in a suitable kneader, for example pallet, under non-sterile conditions, with a clay, in the presence of water, in particular a clay selected from the group which comprises, in particular, rhyolite, diatomaceous earth, attapulgite, clay "The Bush".

Les proportions respectives de préspores, d'argile et d'eau dans le mélange ne sont pas critiques, bien que certaines proportions soient optimales en ce qu'elles donnent des spores de meilleure qualité. De plus, les proportions optimales du mélange préspores:argile:eau, varient selon le type d'argile. Lesdites proportions sont entendues en poids humide pour les préspores et en poids
sec pour l'argile et sont données dans ce qui va suivre, dans l'ordre qui vient d'être indiqué. Les [] 7 expriment
des concentrations en grammes
C'est ainsi qu'il a été constaté que la meilleure
maturation est obtenue avec l'attapulgite (Clarsol BBC, Ceca)
dans le mélange suivant : préspores:eau:argile: 1:2:5.The respective proportions of prespores, clay and water in the mixture are not critical, although some proportions are optimal in that they give better quality spores. Moreover, the optimal proportions of the prespores mixture: clay: water, vary according to the type of clay. Said proportions are understood by wet weight for prespores and by weight
dry for clay and are given in what follows, in the order just indicated. The [] 7 express
concentrations in grams
This is how it was found that the best
maturation is obtained with attapulgite (Clarsol BBC, Ceca)
in the following mixture: prespores: water: clay: 1: 2: 5.

L'attapulgite est un support qui permet les écarts
de concentration les plus importants. Ainsi, une bonne ma
turation est obtenue dans les limites de concentration
suivantes
Pré spore Eau Argile
2 à 6 1 à 7 5 à 15
à condition de respecter la condition suivante :
[préspores] # [argile] < [ceau + préspores7 x 2
I1 a été constaté, par exemple, qu'avec la rhyolite
(Cecaperl AM, Ceca), on obtient des spores de qualité satis
faisante à partir d'un mélange
Pré spores Eau Argile
2 1 à 2 2 dans lequel
(eau] # [Argile]
(préspores] 4 [argile]
I1 a été constaté qu'avec l'argile "Le Buisson" (Clarsol STF, Ceca), le mélange optimal est un mélange
Pré spore Eau Argile
2 à 12 1 I 2 5 à 15 dans lequel :: eau7 < [argile].Attapulgite is a support that allows the deviations
of the most important concentration. So, a good ma
turation is obtained within the concentration limits
following
Pre spore Water Clay
2 to 6 1 to 7 5 to 15
provided that the following condition is met:
[prespores] # [clay] <[water + prespores7 x 2
It has been found, for example, that with rhyolite
(Cecaperl AM, Ceca), we obtain quality spores satis
doing from a mixture
Pre spores Water Clay
2 1 to 2 2 in which
(water) # [Clay]
(prespores) 4 [clay]
It has been found that with "Le Buisson" clay (Clarsol STF, Ceca), the optimal mixture is a mixture
Pre spore Water Clay
2 to 12 1 I 2 5 to 15 wherein :: water7 <[clay].

3. Evolution des Eréspores Eroprement dite
Les préspores enrobées d'argile comme il vient
d'être décrit, sont alors maintenues pendant 3 à 7 jours à
+ 20 C i 10C jusqu'à l'achèvement de la formation des spores.3. Evolution of the Erespores Eroprement
Prespores coated with clay as it comes
to be described, are then maintained for 3 to 7 days at
+ 20 ° C until completion of spore formation.

Lors de cette- é v o l u t i o n, le nombre des globu
les lipidiques diminue, alors que leur taille augmente. Par
ailleurs, le dépôt de la couche interne de la spore s'inten
sifie. Ainsi, lorsque le nombre des globules est compris contre 5 et 10, leur taille est de 5 à 12 um et la paroi
sporale a alors une épaisseur de 1 à 2 ijm. La spore (6) fina lement obtenue est caractérisée par un globule unique de 20 I 25 pm de diamètre et son épaisseur de paroi est d'abord de l'ordre de 2,5 pm à 3 llm pour attelndre parfois 4 pm. During this evolution, the number of globu
lipids decrease, while their size increases. By
elsewhere, the deposition of the inner layer of the spore becomes
fied. Thus, when the number of globules is comprised against 5 and 10, their size is 5 to 12 μm and the wall
The spore then has a thickness of 1 to 2 μm. The spore (6) finally obtained is characterized by a single globule of 20 μm in diameter and its wall thickness is first of the order of 2.5 μm to 3 μm to sometimes 4 μm.

Elle presente toutes les caractéristiques d'un organe de résistance : faibles teneurs en acides nucléiques, protéines, glycogène et sucres acidosolubles et fortes teneurs en lipides et polyosides (chitine incluse).It has all the characteristics of a resistance organ: low levels of nucleic acids, proteins, glycogen and acid-soluble sugars and high levels of lipids and polysaccharides (including chitin).

III - Levee de la dormance des spores
Lorsque les spores durables obtenues sont des spores dormantes, comme c'est le cas r.o ment des spores de
C. obscurus, il est alors nécessaire de les traiter pour lever leur dormance et les rendre aptes I germer. Il s'est avéré qu'aucun des chocs physicochimiqes utilisés habituellement pour stimuler la germination des spores fongiques, n'est capable de lever la dormance des spores durables de
C. obscurus.III - Raise of spore dormancy
When the durable spores obtained are dormant spores, as is the case with the spores of
C. obscurus, it is then necessary to treat them to raise their dormancy and make them fit to sprout. It has been found that none of the physicochemical shocks usually used to stimulate the germination of fungal spores is able to lift the dormancy of the long-lasting spores.
C. obscurus.

Conformément I la présente invention, les spores dormantes résultant de la maturation des pré spores telle que décrite en II.3. ci-dessus, ou effectuée en culture liquide agitée, doivent être stockées dès la fin de la maturation dans une enceinte humide à 2 à 70C pendant deux mois minimum. Ainsi, ces spores sont capables de germer au bout de trois mois de stockage I une HR supérieure I 90 % et à 40C t 1QC ou 60C + 10C, le taux de germination étant maximum après 5 mois de stockage à 40C + 10C I 100 % d'HR et étant supérieur I 80 %.Le taux de germination ne varie pas de façon significative jusqu'à 10 mois de stockage pour des spores stockées à 100 z d'HR. Des spores stockées à 60C + 10C sont capables de germer après 3 mois de stockage à des humidités relatives supérieures à 95 %. A 95 % d'HR, le taux de germination atteint 20 % après 5 mois de stockage, puis devient nul au-delà de cette durée. A 100 % et 9o % d'HR, la germination dépasse 40 % même après 10 mois de stockage à 60C et 40C (cf Tableau I). According to the present invention, dormant spores resulting from the maturation of pre spores as described in II.3. above, or performed in stirred liquid culture, should be stored at the end of ripening in a humid chamber at 2 to 70C for two months minimum. Thus, these spores are capable of germinating at the end of three months of storage at an RH greater than 90% and at 40 ° C. or 60 ° C. + 10 ° C., the germination rate being maximum after 5 months of storage at 40 ° C. ± 100 ° C. of RH and being greater than 80%. The germination rate does not vary significantly up to 10 months storage for spores stored at 100% RH. Spores stored at 60C + 10C are able to germinate after 3 months of storage at relative humidities greater than 95%. At 95% RH, the germination rate reaches 20% after 5 months of storage, then becomes zero beyond this time. At 100% and 9o% RH, the germination exceeds 40% even after 10 months of storage at 60C and 40C (see Table I).

Cette levée de la dormance est réalisable sur le plan industriel, conformément à l'invention, grâce à l'enrobage des spores par un support inerte tel que l'argile. De plus, l'enrobage des spores par de l'argile est important pour la conservation ultérieure des spores. La conservation et la levée de la dormance sont fonction de l'argile considérée. Ainsi, un taux de germination maximum de 80 8 a été obtenu avec des spores enrobées d'attapulgite, d'argile "Le Buisson" et de rhyolite, stockées à 40C i 10C à 100 8 d'humidité relative, l'attapulgite permettant la meilleure conservation des spores : les spores sont capables de germer après 3 mois de stockage, le maximum de germination de 80 % est atteint à 5 mois de stockage et ce taux se maintient sensiblement au même niveau jusqu'à une durée de 10 mois de stockage.Avec les deux autres substrats, les temps de survie des spores sont plus courts : 6 mois avec la rhyolite et 7 mois avec l'argile "Le Buisson" (Tableaux II, III). This lifting of the dormancy is industrially feasible, according to the invention, by coating the spores with an inert support such as clay. In addition, the coating of spores with clay is important for the subsequent conservation of the spores. The conservation and the lifting of the dormancy depend on the considered clay. Thus, a maximum germination rate of 80% was obtained with attapulgite, "Le Buisson" clay and rhyolite-coated spores, stored at 40 ° C. at 10 ° C. at 100 ° C., the attapulgite permitting better spore conservation: the spores are able to germinate after 3 months of storage, the germination maximum of 80% is reached at 5 months of storage and this rate is maintained substantially at the same level for up to 10 months of storage With the other two substrates, the survival times of spores are shorter: 6 months with rhyolite and 7 months with "Le Buisson" clay (Tables II, III).

Aucun changement morphologique n'est décelable en microscopie optique entre des spores dormantes et des spores dont la dormance est levée. No morphological change is detectable in light microscopy between dormant spores and spores dormant.

Les proportions du mélange spores:eau:argile soumis au traitement de levée de la dormance décrit ci-dessus, peuvent être légèrement différentes de celles indiquées pour les mélanges préspores:eau:argile utilisés pour la maturation des préspores en spores durables. The proportions of the mixture spore: water: clay subjected to the treatment of lifting of the dormancy described above, may be slightly different from those indicated for the main mixtures: water: clay used for the maturation of prespores in durable spores.

IV - Germination des sEores durables obtenues confor-
mement I l'invention
A - Les spores durables d'Entomophthorales comme par exemple celles de c. thromboîdes qui sont aptes I germer immédiatement après 1 e u r f o r m a t i o n, peuvent être utilisées immédiatement après le processus de maturation des préspores en spores conforme à l'invention après 48 heures dans l'eau, le taux de germination peut atteindre ou dépasser 50 %, ce qui permet d'utiliser ces spores I germination rapide pour lutter contre des populations d'aphides importantes déjà établies sur la plante.IV - Germination of the lasting serum obtained according to
the invention
A - The lasting spores of Entomophthorales such as those of c. Thromboids which are able to germinate immediately after 1 eurformation, can be used immediately after the process of maturation of the spores in accordance with the invention after 48 hours in water, the germination rate can reach or exceed 50%, which allows to use these spores I rapid germination to fight against populations of important aphids already established on the plant.

B - Les spores d'Entomophthorales qui présentent une dormance et dont c. obscurus constitue un exemple, ne sont pas capables de germer avant d'avoir subi un traitement d'au moins 2 mois I 2-70C et généralement même d'au moins 3-4 mois, en milieu humide. A l'issue de ce traitement, la germination de ces spores mures débute après 5 à 15 jours d'incubation dans l'eau entre 6 et 200C,de préférence entre 12 et 160C. B - Entomophthorales spores with dormancy and c. obscurus is an example, are not able to sprout before having undergone a treatment of at least 2 months I 2-70C and usually even at least 3-4 months, in a humid environment. At the end of this treatment, the germination of these mature spores begins after 5 to 15 days of incubation in water between 6 and 200C, preferably between 12 and 160C.

La spore mûre (7) prête à germer, placée dans des conditions de germination appropriées (humidité et température) subit des transformations morphologiques au cours desquelles la paroi sporale s'amincit et le volume du globule lipidique diminue (spore 8) ; puis des granulations denses apparaissent dans le cytoplasme, la spore augmente de volume, la réduction du globule lipidique et la lyse de toutes les couches internes de la paroi se poursuivent. Au stade de gonflement maximal de la spore, le globule lipidique a disparu et le protoplasme est entièrement granuleux. The mature spore (7) ready to germinate, placed under appropriate germination conditions (humidity and temperature) undergoes morphological transformations during which the spinal wall thins and the volume of the lipid globule decreases (spore 8); then dense granulations appear in the cytoplasm, the spore increases in volume, reduction of the lipid globule and lysis of all internal layers of the wall continue. At the stage of maximal swelling of the spore, the lipid globule has disappeared and the protoplasm is entirely granular.

Un tube germinatif(9a) apparaît. Il forme au contact de l'air un conidiophore qui projettera une conidie.A germ tube (9a) appears. It forms in contact with the air a conidiophore which will project a conidium.

V - Prearation de compositions phytosanitaires
I1 est avantageux d'associer les spores durables préparées conformément I la présente invention, a des agents collants, mouillants et/ou dispersants, afin de rendre la pulvérisation ou l'aspersion ultérieure des compositions phytosanitaires I base de ces spores entomopathogènes, plus facile et plus efficace sur les sols ou sur les plantes à traiter, de tels agents étant présents aux doses usuelles dans les compositions phytosanitaires.V - Prearation of phytosanitary compositions
It is advantageous to combine the durable spores prepared in accordance with the present invention with tackifying, wetting and / or dispersing agents in order to make the subsequent spraying or spraying of the phytosanitary compositions based on these entomopathogenic spores easier and more convenient. more effective on the soil or on the plants to be treated, such agents being present at the usual doses in the phytosanitary compositions.

- - Modalites d'application des compositions Ehyto-
sanitaires conformes à l'invention
Les compositions phytosanitaires conformes I la présente invention peuvent être appliquées suivant différentes modalités, selon que les spores durables qui en sont les constituants actifs sont des spores d'Entomophthorales à germination rapide ou I germination lente a) les compositions phytosanitaires à base de spores dura
bles d'Entomophthorales à germination rapide (telle
c. thromboldes) qui germent au bout de 48 heures, peu
vent être pulvérisées sur les plantes porteuses de po-
pulations d'aphides relativement importantes, déjà éta
blies sur la plante, en raison de l'action entomopathogene
rapide qu'elles sont aptes 9 exercer b) les compositions phytosanitaires à base de spores dura
bles d'Entomophthorales dont la germination débute seule
ment 8 à 15 jours après l'application, mais se prolonge
pendant au moins un mois dans la nature
bl) peuvent être pulvérisées sur la plante dès l'appari
tion des premiers insectes nuisibles : les popula
tions d'aphides se développeront en même temps que
les processus de germination se débloqueront et per
mettront de contrôler la population d'aphides avant
que celle-ci n'ait atteint un seuil dommageable pour
la culture
b2) peuvent être appliquées sur le sol cultivé avant la
sortie de la plante : la présence des spores à la
surface du sol ou à une faible profondeur, joue
un rôle préventif, les spores étant prêtes I germer
et I contaminer les aphides nuisibles dès leur appa
rition sur la culture.- - Modalities of application of Ehyto-
sanitary devices according to the invention
The phytosanitary compositions according to the present invention can be applied in different ways, depending on whether the durable spores which are its active constituents are spores of fast-germinating or slow-germinating entomophthorals (a) the spore-based phytosanitary compositions.
fast-growing Entomophthorales (such as
c. thromboids) that germinate after 48 hours,
should be sprayed on plants with
relatively important aphid populations, already
blights on the plant, due to the entomopathogenic action
fast that they are able to exert b) the phytosanitary compositions based on spores dura
of Entomophthorales whose germination begins alone
8 to 15 days after application, but continues
for at least a month in nature
bl) can be sprayed on the plant as soon as
the first pests: the popula
aphids will develop at the same time as
the germination processes will unblock and
will put to control the population of aphids before
that it has reached a damaging threshold for
Culture
b2) may be applied to cultivated soil before
out of the plant: the presence of spores at the
ground surface or at shallow depth, plays
a preventive role, the spores being ready to germinate
and I contaminate the harmful aphids as soon as they
rition on culture.

Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre. In addition to the foregoing, the invention also comprises other provisions, which will emerge from the description which follows.

La présente invention vise plus particulièrement les procédés de préparation de spores durables de champignons Entomophthorales pathogènes d'insectes nuisibles, notamment en agriculture, les préparations de spores durables ainsi obtenues, les compositions phytosanitaires contenant lesdites préparations et les procédés de traitement de cultures l'aide desdites compositions, conformes aux dispositions qui précèdent, ainsi que les moyens pour la mise en oeuvre de ces procédés et la préparation de ces produits, préparations et compositions et pour l'application desdites compositions phytosanitaires au traitement de cultures.  The present invention relates more particularly to the processes for the preparation of long-lasting spores of entomophthoric fungi which are pathogenic for harmful insects, in particular in agriculture, the durable spore preparations thus obtained, the phytosanitary compositions containing the said preparations and the methods for treating crops. of said compositions, in accordance with the foregoing, as well as the means for the implementation of these processes and the preparation of these products, preparations and compositions and for the application of said phytosanitary compositions to the treatment of cultures.

Les caractéristiques de l'invention énoncées plus haut, sont mises en évidence dans les Tableaux qui vont suivre.  The features of the invention set out above, are highlighted in the tables that follow.

TABLEAU I
INFLUENCE DE LA TEMPERATURE ET DE L'HUMIDITE SUR
LA LEVEE DE LA DORMANCE DES SPORES DURABLES DE
C. OBSCUR US (1)

TABLE I
INFLUENCE OF TEMPERATURE AND MOISTURE
THE LIFT OF THE DORMANCE OF SUSTAINABLE SPORES
C. OBSCUR US (1)

<tb> Température <SEP> % <SEP> % <SEP> H.R <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> mois
<tb> <SEP> OC <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> 9 <SEP> 10
<tb> <SEP> Témoin <SEP> (2)
<tb> <SEP> 100
<tb> <SEP> 0 <SEP> 100
<tb> <SEP> 99
<tb> <SEP> 96
<tb> <SEP> 79
<tb> <SEP> Temoin <SEP> 10 <SEP> 60 <SEP> 80 <SEP> 76 <SEP> 80 <SEP> 80 <SEP> 70 <SEP> 80
<tb> <SEP> 100 <SEP> 5 <SEP> 60 <SEP> 80 <SEP> 60 <SEP> 70 <SEP> 70
<tb> <SEP> 4 <SEP> 98 <SEP> 20 <SEP> 60 <SEP> 90 <SEP> 80 <SEP> 60 <SEP> 40 <SEP> 30 <SEP> 40
<tb> <SEP> Témoin <SEP> 10 <SEP> 60 <SEP> 85 <SEP> 90 <SEP> 80 <SEP> 70 <SEP> 60 <SEP> 50
<tb> <SEP> 100 <SEP> 5 <SEP> 50 <SEP> 75 <SEP> ; <SEP> 90 <SEP> 70 <SEP> 60 <SEP> 50 <SEP> 50
<tb> <SEP> 6 <SEP> 98 <SEP> 10 <SEP> 55 <SEP> 50 <SEP> 40 <SEP> 50 <SEP> 40 <SEP> 40 <SEP> 40
<tb> <SEP> 95 <SEP> 20
<tb> <SEP> 79
<tb> <SEP> Témoin
<tb> <SEP> 100
<tb> <SEP> 98
<tb> 12
<tb> <SEP> 93
<tb> <SEP> Témoin
<tb> <SEP> 79
<tb> <SEP> Témoin
<tb> <SEP> 100
<tb> <SEP> 92 <SEP>
<tb> <SEP> 79
<tb> <SEP> Témoin <SEP> III <SEP>
<tb> <SEP> 100
<tb> <SEP> 18 <SEP> 98
<tb> <SEP> 91
<tb> <SEP> 79
<tb> (1) Exprimée en pourcentage de germinatiom après 16 jours d'incubation
dans l'eau à 14 + 10C.<tb> Temperature <SEP>% <SEP>% <SEP> HR <SEP> Number <SEP> of <SEP> months
#### 8 <SEP> 9 <SEP> 10
<tb><SEP> Witness <SEP> (2)
<tb><SEP> 100
<tb><SEP> 0 <SEP> 100
<tb><SEP> 99
<tb><SEP> 96
<tb><SEP> 79
<tb><SEP> Witness <SEP> 10 <SEP> 60 <SEP> 80 <SEP> 76 <SEP> 80 <SEP> 80 <SEP> 70 <SEP> 80
<tb><SEP> 100 <SEP> 5 <SEP> 60 <SEP> 80 <SEP> 60 <SEP> 70 <SEP> 70
<tb><SEP> 4 <SEP> 98 <SEP> 20 <SEP> 60 <SEP> 90 <SEP> 80 <SEP> 60 <SEP> 40 <SEP> 30 <SEP> 40
<tb><SEP> Control <SEP> 10 <SEP> 60 <SEP> 85 <SEP> 90 <SEP> 80 <SEP> 70 <SEP> 60 <SEP> 50
<tb><SEP> 100 <SEP> 5 <SEP> 50 <SEP> 75 <SEP>;<SEP> 90 <SEP> 70 <SEP> 60 <SEP> 50 <SEP> 50
<tb><SEP> 6 <SEP> 98 <SEP> 10 <SEP> 55 <SEP> 50 <SEP> 40 <SEP> 50 <SEP> 40 <SEP> 40 <SEP> 40
<tb><SEP> 95 <SEP> 20
<tb><SEP> 79
<tb><SEP> Witness
<tb><SEP> 100
<tb><SEP> 98
<tb> 12
<tb><SEP> 93
<tb><SEP> Witness
<tb><SEP> 79
<tb><SEP> Witness
<tb><SEP> 100
<tb><SEP> 92 <SEP>
<tb><SEP> 79
<tb><SEP> Witness <SEP> III <SEP>
<tb><SEP> 100
<tb><SEP> 18 <SEP> 98
<tb><SEP> 91
<tb><SEP> 79
<tb> (1) Expressed as a percentage of germination after 16 days of incubation
in water at 14 + 10C.

(2) Spores maintenues dans un sol à 40 8 de sa capacité de rétention d'eau (*) Les barres représentent la viabilité des spores estimée par observa-
tion en microscopie photonique;la germination est nulle dans toutes
les cases ne contenant pas de chiffres
TABLEAU II
INFLUENCE DE LA TEMPERATURE ET DU SUBSTRAT ENROBAGE SUR LA
LEVEE DE LA DORMANCE ET LA CONSERVATION DES SPORES DURABLES
DE C.OBSCURUS STOCKEES A 98 % H.R. (1)

(2) Spores maintained in a soil at 40 8 of its water retention capacity (*) Bars represent spore viability estimated by observa-
light microscopy, germination is zero in all
boxes not containing numbers
TABLE II
INFLUENCE OF TEMPERATURE AND COATING SUBSTRATE ON
LIFTING THE DORMANCE AND CONSERVATION OF SUSTAINABLE SPORES
OF C.OBSCURUS STORED AT 98% RH (1)

<tb> Température <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> mois
<tb> C <SEP> Substrat
<tb> <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> 9 <SEP> 10
<tb> <SEP> Rhyolite <SEP> (*)
<tb> <SEP> Argile
<tb> <SEP> Le <SEP> Buisson
<tb> <SEP> Attapulgite
<tb> <SEP> Trerre <SEP> de
<tb> <SEP> diatomées
<tb> <SEP> Témoin <SEP> (2)
<tb> <SEP> Argile <SEP> 30 <SEP> 30 <SEP> 40 <SEP> 30 <SEP> 30 <SEP> 30 <SEP> 20
<tb> <SEP> 4 <SEP> Attapulgite <SEP> 20 <SEP> 60 <SEP> 80 <SEP> 60 <SEP> 70 <SEP> 70 <SEP> 70 <SEP> 60
<tb> <SEP> Terre <SEP> de <SEP> 30 <SEP> 50
<tb> <SEP> diatomées <SEP>
<tb> <SEP> Témoin <SEP> 10 <SEP> 60 <SEP> 80 <SEP> 70 <SEP> 80 <SEP> 80 <SEP> :<SEP> 70 <SEP> 80
<tb> <SEP> Rhyolite <SEP> = <SEP> <SEP> 40 <SEP> 50 <SEP> 10
<tb> <SEP> Argile <SEP> 30 <SEP> 40 <SEP> 40 <SEP> 40 <SEP> 30 <SEP> 30 <SEP> 20
<tb> <SEP> Le <SEP> Buisson
<tb> <SEP> Attapulgite <SEP> 50 <SEP> 70 <SEP> 70 <SEP> 60 <SEP> 70 <SEP> 60 <SEP> 60 <SEP> 60
<tb> <SEP> 6 <SEP>
<tb> <SEP> Terre <SEP> de <SEP> 20 <SEP> 20
<tb> <SEP> diatomées
<tb> <SEP> Témoin <SEP> 10 <SEP> 60 <SEP> 85 <SEP> 90 <SEP> 70 <SEP> 60 <SEP> 50
<tb> <SEP> Rhyolite
<tb> <SEP> Argile
<tb> <SEP> Le <SEP> Buisson
<tb> <SEP> 12 <SEP> Attapulgite
<tb> <SEP> Terre <SEP> de
<tb> <SEP> diatomées
<tb> <SEP> Témoin
<tb> <SEP> Rhyolite
<tb> <SEP> Argile
<tb> <SEP> Le <SEP> Buisson
<tb> <SEP> 15 <SEP> Attapulgite
<tb> <SEP> Terre <SEP> de
<tb> <SEP> diatomées <SEP>
<tb> <SEP> Le <SEP> Buisson
<tb> <SEP> 18 <SEP> Attapulgite
<tb> <SEP> Terre <SEP> de
<tb> diatomées
<tb> (1) Exprimée en pourcentage de germination apres 16 jours d'incubation
dans l'eau à 14 + 1 C.<tb> Temperature <SEP> Number <SEP> of <SEP> months
<tb> C <SEP> Substrate
<tb><SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> 9 <SEP> 10
<tb><SEP> Rhyolite <SEP> (*)
<tb><SEP> Clay
<tb><SEP> The <SEP> Buisson
<tb><SEP> Attapulgite
<tb><SEP> Trere <SEP> of
<tb><SEP> diatoms
<tb><SEP> Witness <SEP> (2)
<tb><SEP> Clay <SEP> 30 <SEP> 30 <SEP> 40 <SEP> 30 <SEP> 30 <SEP> 30 <SEP> 20
<tb><SEP> 4 <SEP> Attapulgitis <SEP> 20 <SEP> 60 <SEP> 80 <SEP> 60 <SEP> 70 <SEP> 70 <SEP> 70 <SEP> 60
<tb><SEP> Earth <SEP> from <SEP> 30 <SEP> 50
<tb><SEP> diatom <SEP>
<tb><SEP> Control <SEP> 10 <SEP> 60 <SEP> 80 <SEP> 70 <SEP> 80 <SEP> 80 <SEP>: <SEP> 70 <SEP> 80
<tb><SEP> Rhyolite <SEP> = <SEP><SEP> 40 <SEP> 50 <SEP> 10
<tb><SEP> Clay <SEP> 30 <SEP> 40 <SEP> 40 <SEP> 40 <SEP> 30 <SEP> 30 <SEP> 20
<tb><SEP> The <SEP> Buisson
<tb><SEP> Attapulgite <SEP> 50 <SEP> 70 <SEP> 70 <SEP> 60 <SEP> 70 <SEP> 60 <SEP> 60 <SEP> 60
<tb><SEP> 6 <SEP>
<tb><SEP> Earth <SEP> from <SEP> 20 <SEP> 20
<tb><SEP> diatoms
<tb><SEP> Control <SEP> 10 <SEP> 60 <SEP> 85 <SEP> 90 <SEP> 70 <SEP> 60 <SEP> 50
<tb><SEP> Rhyolite
<tb><SEP> Clay
<tb><SEP> The <SEP> Buisson
<tb><SEP> 12 <SEP> Attapulgite
<tb><SEP> Earth <SEP> from
<tb><SEP> diatoms
<tb><SEP> Witness
<tb><SEP> Rhyolite
<tb><SEP> Clay
<tb><SEP> The <SEP> Buisson
<tb><SEP> 15 <SEP> Attapulgite
<tb><SEP> Earth <SEP> from
<tb><SEP> diatom <SEP>
<tb><SEP> The <SEP> Buisson
<tb><SEP> 18 <SEP> Attapulgite
<tb><SEP> Earth <SEP> from
<tb> diatoms
<tb> (1) Expressed as a percentage of germination after 16 days of incubation
in water at 14 + 1 C.

(2)Spores maintenues dans un sol à 40 % de sa capacité de rétention d'eau.(2) Spores maintained in soil at 40% of its water retention capacity.

(*) Les barres représentent la viabilité des spores estimée par observa
tion en microscopie photonique ; la germination est nulle dans toutes
les cases ne contenant pas de chiffres. (*) Bars represent spore viability estimated by observation
photon microscopy; germination is zero in all
boxes not containing numbers.

TABLEAU III
INFLUENCE DE LA TEMPERATURE ET DU SUBSTRAT D'ENROBAGE LORS DU
TRAITEMENT DE LEVEE DE LA DORMANCE ET LA CONSERVATION DES SPORES pE DE C.OBUSCURUS STOCKEES A 100 % H.R. (1)

TABLE III
INFLUENCE OF TEMPERATURE AND COATING SUBSTRATE DURING
TREATMENT OF DORMANCE RESTORATION AND SPORTS CONSERVATION pE OF C.OBUSCURUS STOCKEES AT 100% RH (1)

<tb> température <SEP> Substrat <SEP> ! <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> mois
<tb> <SEP> C <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> 9 <SEP> 10 <SEP>
<tb> <SEP> Rhyolite
<tb> <SEP> Argile
<tb> <SEP> 0 <SEP> Le <SEP> Buisson
<tb> <SEP> Attapulgite
<tb> <SEP> Terre <SEP> de
<tb> <SEP> diatomées
<tb> <SEP> Témoin <SEP> (2) <SEP>
<tb> <SEP> 50 <SEP> 80 <SEP> 40 <SEP> 10
<tb> <SEP> Argile <SEP> 50 <SEP> 80 <SEP> 40 <SEP> 10 <SEP> 80 <SEP> 70 <SEP> 70
<tb> <SEP> 30 <SEP> 30 <SEP> 30 <SEP> 80 <SEP> 80 <SEP> 70 <SEP> 70
<tb> <SEP> Attapulgite <SEP> 15 <SEP> 60 <SEP> 80 <SEP> 80 <SEP> 80 <SEP> 80 <SEP> 70 <SEP> 70
<tb> <SEP> 4
<tb> <SEP> Terre <SEP> 30 <SEP> 50 <SEP> 50 <SEP> 10
<tb> <SEP> Témoin <SEP> 5 <SEP> 60 <SEP> 80 <SEP> 60 <SEP> 70 <SEP> 80 <SEP> 70 <SEP> 70
<tb> <SEP> Rhyolite <SEP> 40 <SEP> 30 <SEP> 10
<tb> <SEP> Argile <SEP> 30 <SEP> 50 <SEP> 30 <SEP> 20 <SEP> 20
<tb> <SEP> Le <SEP> Buisson
<tb> <SEP> Attapulgite <SEP> 50 <SEP> 80 <SEP> 70 <SEP> 60 <SEP> 60 <SEP> 60
<tb> <SEP> Terre <SEP> de
<tb> <SEP> diatomées <SEP> 30 <SEP> 30 <SEP>
<tb> <SEP> Témoin <SEP> 10 <SEP> 60 <SEP> 85 <SEP> 90 <SEP> 80 <SEP> 70 <SEP> 60 <SEP> 50
<tb> <SEP> Argile <SEP> Le <SEP> Buisson
<tb> <SEP> Le <SEP> Buisson
<tb> <SEP> Attapulgite
<tb> <SEP> Terre <SEP> de <SEP>
<tb> <SEP> 12 <SEP> diamotées
<tb> <SEP> Témoin
<tb> <SEP> Rhyolite
<tb> <SEP> Argile <SEP>
<tb> <SEP> Le <SEP> Buisson
<tb> <SEP> Attapulgite
<tb> <SEP> 15
<tb> <SEP> Terre <SEP> de
<tb> <SEP> diatomées
<tb> <SEP> Témoin
<tb> <SEP> Rhyolite
<tb> <SEP> Argile
<tb> <SEP> 18 <SEP> Attapulgite <SEP>
<tb> <SEP> Terre <SEP> de
<tb> <SEP> diatomées.
<tb> <SEP> Témoin
<tb> <tb> temperature <SEP> Substrate <SEP>! <SEP> Number <SEP> of <SEP> months
<tb><SEP> C <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> 9 <SEP> 10 <SEP>
<tb><SEP> Rhyolite
<tb><SEP> Clay
<tb><SEP> 0 <SEP> The <SEP> Bush
<tb><SEP> Attapulgite
<tb><SEP> Earth <SEP> from
<tb><SEP> diatoms
<tb><SEP> Witness <SEP> (2) <SEP>
<tb><SEP> 50 <SEP> 80 <SEP> 40 <SEP> 10
<tb><SEP> Clay <SEP> 50 <SEP> 80 <SEP> 40 <SEP> 10 <SEP> 80 <SEP> 70 <SEP> 70
<tb><SEP> 30 <SEP> 30 <SEP> 30 <SEP> 80 <SEP> 80 <SEP> 70 <SEP> 70
<tb><SEP> Attapulgite <SEP> 15 <SEP> 60 <SEP> 80 <SEP> 80 <SEP> 80 <SEP> 80 <SEP> 70 <SEP> 70
<tb><SEP> 4
<tb><SEP> Earth <SEP> 30 <SEP> 50 <SEP> 50 <SEP> 10
<tb><SEP> Control <SEP> 5 <SEP> 60 <SEP> 80 <SEP> 60 <SEP> 70 <SEP> 80 <SEP> 70 <SEP> 70
<tb><SEP> Rhyolite <SEP> 40 <SEP> 30 <SEP> 10
<tb><SEP> Clay <SEP> 30 <SEP> 50 <SEP> 30 <SEP> 20 <SEP> 20
<tb><SEP> The <SEP> Buisson
<tb><SEP> Attapulgite <SEP> 50 <SEP> 80 <SEP> 70 <SEP> 60 <SEP> 60 <SEP> 60
<tb><SEP> Earth <SEP> from
<tb><SEP> diatoms <SEP> 30 <SEP> 30 <SEP>
<tb><SEP> Control <SEP> 10 <SEP> 60 <SEP> 85 <SEP> 90 <SEP> 80 <SEP> 70 <SEP> 60 <SEP> 50
<tb><SEP> Clay <SEP> The <SEP> Bush
<tb><SEP> The <SEP> Buisson
<tb><SEP> Attapulgite
<tb><SEP> Earth <SEP> from <SEP>
<tb><SEP> 12 <SEP> diamonds
<tb><SEP> Witness
<tb><SEP> Rhyolite
<tb><SEP> Clay <SEP>
<tb><SEP> The <SEP> Buisson
<tb><SEP> Attapulgite
<tb><SEP> 15
<tb><SEP> Earth <SEP> from
<tb><SEP> diatoms
<tb><SEP> Witness
<tb><SEP> Rhyolite
<tb><SEP> Clay
<tb><SEP> 18 <SEP> Attapulgite <SEP>
<tb><SEP> Earth <SEP> from
<tb><SEP> diatoms.
<tb><SEP> Witness
<Tb>

(1) Exprimée en pourcentage de germination apres 16 jours d'incubation
dans l'eau a 14 + 10C.(1) Expressed as a percentage of germination after 16 days of incubation
in water at 14 + 10C.

(2)Spores maintenues dans un sol a 40 % de sa capacité de rétention d'eau.(2) Spores maintained in soil at 40% of its water retention capacity.

(*) Les barres représentent la viabilité des spores estimée par observa
tion en microscopie photonique ; la germination est nulle dans toutes
les cases ne contenant pas de chiffres. (*) Bars represent spore viability estimated by observation
photon microscopy; germination is zero in all
boxes not containing numbers.

L'invention sera mieux comprise à l'aide du com plément de description qui va suivre, qui se réfère à un exemple de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention. The invention will be better understood with the aid of the following description which will follow, which refers to an example of implementation of the method which is the subject of the present invention.

Il doit être bien entendu, toutefois, que cet exemple et les parties descriptives correspondantes, sont donnés uniquement I titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. It should be understood, however, that this example and the corresponding descriptive parts are merely illustrative of the subject matter of the invention, of which they in no way constitute a limitation.

EXEMPLE
I. - Conditions de culture
1. Inoculum
La souche utilisée dans cet exemple est la souche
IP I 015 de c. obscurus déposée dans la Collection Nationale des Cultures Microbiennes (CNCM) de l'Institut Pasteur; elle porte aussi les nO IPLB 542 et 722 (Laboratoire de lutte biologique contre les Insectes, Institut Pasteur).EXAMPLE
I. - Cultivation conditions
1. Inoculum
The strain used in this example is the strain
IP I 015 of c. obscurus deposited in the National Collection of Microbial Cultures (CNCM) of the Institut Pasteur; it also bears IPLB Nos. 542 and 722 (Insect Biological Control Laboratory, Institut Pasteur).

L'inoculum est constitue par du mycélium agé de 24 heures, developpé sur un milieu agité à base de 6 % de glucose et 2 % d'extrait de levure (Difco). I1 est ajoute au milieu à la dose de 10 % (v/v). The inoculum is constituted by mycelium aged 24 hours, developed on a stirred medium based on 6% glucose and 2% yeast extract (Difco). It is added to the medium at a dose of 10% (v / v).

2. Milieu de culture
Le milieu de culture a la composition suivante
Dextrose 3 %
Extrait de levure (Difco) 1 %
Antimousse "Rhodorsil 426R" 1 %
Eau Q.S.P. 2. Culture medium
The culture medium has the following composition
Dextrose 3%
Yeast extract (Difco) 1%
Antimousse "Rhodorsil 426R" 1%
QSP Water

3. Conditions de la fermentation
La fermentation est réalisée dans un fermenteur contenant le milieu de culture ci-dessus, par exemple un fermenteur "Biolafitte", lequel milieu de culture est inoculé par le mycélium identifié en 1. ci-dessus.3. Conditions of fermentation
The fermentation is carried out in a fermenter containing the above culture medium, for example a "Biolafitte" fermenter, which culture medium is inoculated with the mycelium identified in 1. above.

La température est continuellement régulée à 200C i 0,50C. L'agitation du milieu est maintenue à 700 t/m, l'aération est de 0,5 volume d'air/volume du milieu/minute (vvm) ; le pH est continuellement régulé pour être maintenu à 6,5. The temperature is continuously regulated at 200 ° C ± 0.50 ° C. The agitation of the medium is maintained at 700 rpm, the aeration is 0.5 volume of air / volume of the medium / minute (vvm); the pH is continuously regulated to be maintained at 6.5.

Après une phase stationnaire, ou phase de latence, de 6-8 heures, la phase de croissance linéaire dure jusqu'à la 40ème heure + 4 heures, puis elle est suivie d'une phase de sporulation multiplicative pendant laquelle il se forme des préspores dont le nombre augmente, jusqu'à la 68ème heure + 4 heures. After a stationary phase, or lag phase, of 6-8 hours, the linear growth phase lasts until the 40th hour + 4 hours, then it is followed by a multiplicative phase of sporulation during which the presporates are formed. whose number increases, until the 68th hour + 4 hours.

il. - Formation des spores l'extérieur du fermenteur
1. On arrête la fermentation après 3 à 4 jours de
culture, I la fin de la phase de formation des
préspores, lorsque toutes les préspores sont sphé
riques, à paroi bituniquée,c'est-à-dire après le
dbut de coalescence des globules lipidiques (dont
le diamètre est alors supérieur I 3 pm).he. - Formation of spores outside the fermenter
1. The fermentation is stopped after 3 to 4 days of
at the end of the training phase of the
prespores, when all prespores are spherical
with a bitunicated wall, that is to say after
coalescence of lipid globules (of which
the diameter is then greater than 3 μm).

On évacue la masse liquide du fermenteur, on en sé
pare les préspores par centrifugation ou filtra
tion, dans ce dernier cas après mélange éventuel
avec un adjuvant de filtration tel, par exemple,
qu'une perlite. Les préspores sont lavées abondam
ment I l'eau du robinet.The liquid mass of the fermenter is evacuated,
Prespores by centrifugation or filtra
tion, in the latter case after any mixing
with a filter aid such as, for example,
than a pearlite. The prespores are washed abundam
I tap water.

2. On mélange ensuite les préspores de façon homogène
avec une argile appropriée, telle que de l'atta
pulgite (Clarsol BBC, Ceca) par exemple, et de
l'eau, dans des conditions non stériles, dans un
malaxeur palette (de type Lodige par exemple),
pendant 2 minutes, sans échauffement, les propor
tions du mélange préspores (poids humide)/eau/
attapulgite étant par exemple, 1:1:1,5. 2. The prespores are then mixed homogeneously
with a suitable clay, such as
pulgite (Clarsol BBC, Ceca) for example, and
water, under non-sterile conditions, in a
pallet mixer (of the Lodige type for example),
for 2 minutes, without heating, the proportion
presumptive mixing (wet weight) / water /
attapulgite being for example, 1: 1: 1.5.

3. On laisse mûrir les préspores ainsi enrobées
d'argile pendant 3 à 7 jours dans des cuves fer
mées ou des sacs fermés, à 200C + 0,50C jusqu'à
l'achèvement de la formation des spores, qui pré
sentent alors un seul globule lipidique central vo
lumineux et une paroi de 2,5 pm d'épaisseur mini
male. 3. The prespores thus coated are allowed to ripen
of clay for 3 to 7 days in iron tanks
bags or closed bags, at 200C + 0,50C up to
completion of spore formation, which pre
then feel a single central lipidic globule vo
bright and a wall of 2.5 pm minimum thickness
male.

III. - Levee de la dormance des azygosEores
On incube le mélange de spores enrobées avec de
l'argile humidifiée, en sacs fermés, à 40C + 10C dans une
chambre froide pendant 4 mois minimum. La proportion
spores:eau:argile du mélange est maintenue à 1: 1:1,5. III. - Lift of the dormancy of the azygosEores
The mixture of coated spores is incubated with
moistened clay, in closed bags, at 40C + 10C in a
cold room for 4 months minimum. The proportion
spores: water: Clay of the mixture is maintained at 1: 1: 1.5.

On effectue des prélèvements tous les mois pour évaluer le taux de germination dans de l'eau à 140C + 10C, en effectuant des évaluations tous les 2 jours pendant
16 jours, au bout desquels la germination maximum est
habituellement e n r e g i s t r é e. T o u t e s le s évaluations ont été effectuées sur des champs oculaires contenant plus de 100 spores, en comptant 100 spores et en reproduisant chaque contrôle à trois reprises ; la germination est enregistrée lorsque la longueur du tube germinatif est supérieure I la moitié du diamètre de la spore (environ 20 pm). Samples are taken monthly to evaluate the germination rate in 140C + 10C water, making assessments every 2 days during
16 days, after which maximum germination is
usually registered. All evaluations were performed on ocular fields containing more than 100 spores, counting 100 spores and replicating each control three times; germination is recorded when the length of the germ tube is greater than half the diameter of the spore (about 20 μm).

Les préparations de spores enrobées sont alors des spores mures prêtes à l'emploi dans des copositions phytosanitaires dont le constituant actif est à genBiation lente. The coated spore preparations are then ready-to-use mature spores in phytosanitary coatings whose active constituent is of slow genesis.

Ainsi que cela ressort de ce qui precède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse, au contraire, toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention.  As is apparent from the foregoing, the invention is not limited to those of its modes of implementation, implementation and application which have just been described more explicitly; it embraces, on the contrary, all the variants that may come to the mind of the technician in the field, without departing from the scope or scope of the present invention.

Claims (1)

REVENDICATIONS 30- Procedé selon la Revendication 1, caractérisé en ce que les pré spores sont séparées du milieu de culture à leur sortie du fermenteur, dans la deuxième étape, par centrifugation ou par filtration, et lavees abondamment avec de l'eau. 20- Procédé selon la Revendication 1 particulière ment adapté à la maturation des spores d'Entomophthorales présentant un temps de dormance, caractérisé en ce que l'étape de maturation des préspores mélangées I un support inerte humide, en spores durables, fournit des spores dormantes qui sont soumises une étape supplémentaire de traitement qui a pour but de lever leur dormance et qui consiste à maintenir le mélange de spores durables et d'argile humide à une température moyenne de l'ordre de 2 à 70C pendant une durée d'au moins deux mois pour obtenir des spores mûres dont la dormance est levée30- Process according to claim 1, characterized in that the pre spores are separated from the culture medium at their outlet from the fermenter, in the second stage, by centrifugation or by filtration, and washed extensively with water. 20- A method according to claim 1 particularly suited to the maturation of spores of Entomophthorales having a dormancy time, characterized in that the step of maturing the prespores mixed I a wet inert support, in durable spores, provides dormant spores which are subjected to an additional treatment step which is intended to overcome their dormancy and which consists in maintaining the mixture of durable spores and moist clay at an average temperature of the order of 2 to 70C for a duration of at least two months to obtain mature spores whose dormancy is lifted 1 - Procédé de préparation de spores durables de champignons Entomophthorales pathogènes d'insectes nuisibles, notamment en agriculture, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - une première étape de fermentation d'un inoculum composé de corps hyphaux d'Entomophthorales, dans un milieu de fermentation approprié contenant une source de carbone et une source d'azote, sous agitation et insufflation d'air, à un pH variable selon les espèces et de préférence compris entre 6 et 7, à une température variable suivant les espèces, ladite étape de fermentation, après une durée de 2 à 5 jours suivant les espèces et le milieu employés, donnant lieu à la formation de préspores sphériques présentant une double paroi ; - une deuxième étape réalisée dans des conditions non stériles, au cours de laquelle les préspores sont séparées du milieu de fermentation et lavées abondamment ; - une troisième étape au cours de laquelle les préspores sont mélangées avec un support inerte humide tel que de l'argile ; - une quatrième étape de maturation des pré spores mélangées audit support inerte humide, à une température comprise entre 15 et 250C suivant les espèces, pendant un temps suffisant pour obtenir l'evolution desdites préspores en spores durables présentant une épaisseur de paroi égale ou supérieure au 1/10 du diamètre sporal et comprenant généralement un seul globule lipidique de diamètre minimum compris entre 1/3 et 2/3 du diamètre sporal ; - une cinquième étape au cours de laquelle lesdites spores durables en mélange avec le support inerte susdit, sont gardées au froid à une température moyenne comprise entre 2 et 70C, et - une sixième étape où les spores enrobées du support inerte sont éventuellement mélangées à des composés usuels pour l'obtention d'une composition phytosanitaire entomopathogène à l'égard des insectes nuisibles, notamment en agriculture, laquelle composition présente un pouvoir infectieux élevé 1 - Process for the preparation of long-lasting spores of entomophthoric fungi which are pathogenic for harmful insects, especially in agriculture, characterized in that it comprises the following steps: a first fermentation step of an inoculum composed of hyphal bodies of Entomophthorales, in a suitable fermentation medium containing a carbon source and a nitrogen source, with stirring and insufflation of air, at a pH that varies according to the species and preferably between 6 and 7, at a temperature that varies according to the species, said fermentation step, after a period of 2 to 5 days depending on the species and the medium used, giving rise to the formation of spherical prespores having a double wall; a second stage carried out under non-sterile conditions, during which the prespores are separated from the fermentation medium and washed thoroughly; a third step during which the prespores are mixed with a wet inert support such as clay; a fourth stage of maturation of the pre spores mixed with said wet inert support, at a temperature of between 15 and 250 ° according to the species, for a time sufficient to obtain the evolution of said prespores in durable spores having a wall thickness equal to or greater than 1/10 of the spore diameter and generally comprising a single lipid globule with a minimum diameter of between 1/3 and 2/3 of the spore diameter; a fifth stage during which said durable spores mixed with the aforesaid inert support are kept cold at an average temperature of between 2 and 70 ° C., and a sixth step in which the spores coated with the inert support are optionally mixed with conventional compounds for obtaining an entomopathogenic phytosanitary composition with regard to harmful insects, in particular in agriculture, which composition has a high infectivity 40- Procédé selon la Revendication 3, caractérisé en ce que lorsque la séparation des pré spores du milieu de culture est réalisée par filtration, elle peut l'être en présence d'un adjuvant de filtration approprié. 40- Method according to claim 3, characterized in that when the separation of pre spores of the culture medium is carried out by filtration, it may be in the presence of a suitable filter aid. 5 - Procédé selon la Revendication 1, caractérisé en ce que le support inerte utilisé dans la troisième étape est une argile choisie dans le groupe qui comprend notamment la rhyolite, la terre de diatomées, lattapulgite, l'argile complexe l'Le Buisson1, à base essentiellement de bentonite et d'attapulgite. 5 - Process according to claim 1, characterized in that the inert support used in the third step is a clay selected from the group which comprises in particular rhyolite, diatomaceous earth, lattapulgite, complex clay Le Buisson1, to essentially based on bentonite and attapulgite. C. thromboîdes, N. fresenji et Z. radicans.C. thromboids, N. fresenji and Z. radicans. 60- Procédé selon la Revendication 1, caractérisé en ce que les Entomophthorales mises en oeuvre pour la production et/ou la maturation et/ou la germination de spores azygospores ou zygospores - sont choisies notamment dans le groupe qui comprend C. osmodes, C. obscur us, 60- Method according to claim 1, characterized in that the Entomophthorales used for the production and / or the maturation and / or germination of azygospores or zygospores spores - are chosen in particular in the group which comprises C. osmodes, C. obscure us, 7 - Procédé selon la Revendication 1, caractérisé en ce que la maturation des préspores en spores en mélange avec un support inerte, est réalisée en présence d'eau, la proportion des constituants du mélange préspores:eau:support inerte étant comprise entre 2-6:1-7:2-15, en fonction du type d'argile et de l'espèce (ou souche) considérés. 7 - Process according to claim 1, characterized in that the maturation of prespores in spores mixed with an inert support, is carried out in the presence of water, the proportion of the constituents of the mixture prespores: water: inert carrier being between 2- 6: 1-7: 2-15, depending on the type of clay and species (or strain) considered. 80- Procédé selon les Revendications 1 et 2, caractérisé en ce que l'étape supplémentaire de levée de la dormance des spores obtenues à l'issue de la quatrième étape, comprend le maintien pendant au moins deux mois à une température moyenne de 2 I 70C, d'un mélange de spores, d'un support inerte et d'eau présents dans des proportions variables suivant l'espèce (ou souche) et le type d'argile considérés. 80- A method according to claims 1 and 2, characterized in that the additional step of lifting the spore dormancy obtained at the end of the fourth step, comprises maintaining for at least two months at an average temperature of 2 I 70C, a mixture of spores, an inert support and water present in varying proportions depending on the species (or strain) and type of clay considered. 90- Produit intermédiaire nouveau utile pour la production de spores d'Entomophthorales présentant un pouvoir entomopathogène élevé, caractérisé en ce qu'il est constitué par un mélange de préspores sphériques à paroi bituniquée obtenues par fermentation dans un milieu de culture approprié, et d'une argile choisie dans le groupe qui comprend notamment la rhyolite, la terre de diatomées, l'argile "Le Buisson1, et l'attapulgite, selon la Revendication 1. 90- New intermediate product useful for the production of Entomophthorales spores with a high entomopathogenic power, characterized in that it consists of a mixture of spherical prespores bitunicate wall obtained by fermentation in an appropriate culture medium, and a clay selected from the group which includes rhyolite, diatomaceous earth, Le Buisson1 clay, and attapulgite, according to claim 1. 100- Produit présentant un pouvoir entomopathogène élevé, caractérisé en ce qu'il est constitué par un mélange d'argile et de spores d'Entomophthorales dont la dormance a été levée par maintien dudit mélange pendant au moins deux mois à une température moyenne comprise entre 2 et 70C, obtenu selon la Revendication 1 et la Revendication 2. 100- Product having a high entomopathogenic power, characterized in that it consists of a mixture of clay and Entomophthorales spores whose dormancy was lifted by maintaining said mixture for at least two months at an average temperature between 2 and 70C, obtained according to Claim 1 and Claim 2. 110 - Composition phytosanitaire entomopathogène caractérisée en ce qu'elle est constituée par un mélange de spores présentant un pouvoir infectieux élevé à l'égard des insectes nuisibles, notamment en agriculture, et d'argile, obtenu selon l'une quelconque des Revendications 1 à 8, associé aux composés usuels pour la préparation d'une telle composition tels qu'agents collants, mouillants, dispersants, propres à faciliter la pulvérisation ou l'aspersion ultérieure desdites compositions en plein champ. 110 - Entomopathogenic phytosanitary composition, characterized in that it consists of a mixture of spores with high infectivity with regard to harmful insects, in particular in agriculture, and clay, obtained according to any one of Claims 1 to 8, associated with the usual compounds for the preparation of such a composition such as tackifying agents, wetting agents, dispersants, suitable for facilitating the spraying or subsequent spraying of said compositions in the open field. 120- Composition phytosanitaire selon la Revendication 11, caractérisée en ce que son constituant actif est constitué par des spores enrobées d'argile, à pouvoir entomopathogène élevé, obtenues par maturation de préspores sphériques issues d'une fermentation. 120- phytosanitary composition according to claim 11, characterized in that its active constituent is formed by clay-coated spores, high entomopathogenic power, obtained by maturation of spherical prespores resulting from fermentation. 130- Composition phytosanitaire selon la Revendication 11, caractérisée en ce que son constituant actif est constitué par des spores enrobées d'argile, & pouvoir entomopathogène élevé, obtenues par maturation de préspores sphériques issues d'une fermentation, et maintien des spores résultantes pendant au moins deux mois à 2-70C, pour lever la dormance desdites spores. 130- phytosanitary composition according to claim 11, characterized in that its active constituent consists of spores coated with clay, & entomopathogenic high, obtained by maturation of spherical prespores resulting from fermentation, and maintaining the resulting spores for at at least two months at 2-70C, to lift the dormancy of said spores. Revendications 11 à 13, caractérisé en ce qu'il consiste à appliquer sur la plante et/ou au sol, par pulvérisation ou aspersion, ladite composition phytosanitaire pour contrôler des populations d'insectes nuisibles importantes déjà établies sur la plante, dans le cas ol le constituant actif est à germination rapide (environ 48 heures), ou avant l'apparition des insectes ou dës la détection des premiers insectes nuisibles, pour contrôler la population d'insectes avant qu'elle n'ait atteint un seuil dommageable pour la culture, dans le cas où le constituant actif est à germination lente (8 à 15 jours ou plus). Claims 11 to 13, characterized in that it consists in applying to the plant and / or the ground, by spraying or spraying, said phytosanitary composition for controlling important insect pest populations already established on the plant, in the case ol the active ingredient is fast-germinating (approximately 48 hours), or before the onset of insects or the detection of the first pests, to control the insect population before it has reached a threshold that is harmful to the crop in the case where the active ingredient is slow-germinating (8 to 15 days or more). 140- Procédé de traitement de cultures à l'aide de la composition phytosanitaire selon l'une quelconque des 140- Method for treating crops using the phytosanitary composition according to any one of