FR2486539A1 - Enzyme immobilisee sur un support ayant une activite de g-d-glutamyl-(l)meso-diaminopimelyle endopeptidase ou de d-isoglutamine-(l)meso-diaminopimelyle endopeptidase et son application a la fabrication de substances ou fractions contenant le groupe n-acetyl-muramyl-l-aminoacyl-g-d-glutamyle ou n-acetyl-muramyl-aminoacyl-d-isoglutamine - Google Patents

Abstract

L'INVENTION CONCERNE UNE ENDOPEPTIDASE APPLICABLE A LA FABRICATION DE N-ACETYL-D-GLUCOSAMINYL-B14 N-ACETYLMURAMYL-L-ALANINE-D-ISOGLUTAMINE. CETTE ENZYME A UNE ACTIVITE DE D-GLUTAMYL-(L)MESO-DIAMINOPIMELYLE ENDOPEPTIDASE ET EST IMMOBILISEE SUR UN SUPPORT PAR L'INTERMEDIAIRE DE LIAISONS DE FIXATION NON COVALENTES.

Description

Enzyme immobilisée sur un support ayant une activité je γ-D-glutamyl-(L)meso-diaminopimélyle endopeptidase ou @
D-isoglutamine-(L)meso-diaminopimélyle endopeptidase et son application à la fabrication de substances ou fractions contenant le groupe N-acétyl-muramyl-L-aminoacyl-γ;-D- glutamyle ou $N-acétyl-muramyl-L-aminoacyl-D-isoglutamine
L'invention concerne une enzyme immobilisée sur un support ayant une activité de D-glutamyl-(L)meso- diaminopimélyle endopeptidase, ci-après dénomme pour la commodité du langage ',endopeptidase". Elle est également relative à l'application d'une telle enzyme immobiliste S la fabrication de fractions ou molécules contenant un groupe N-acétyl-muramyl-L-aminoacyl-D-glutamyle.

Il est la encore entendu que l'expression "D-glutamyle" sera utilisée dans ce qui suit pour viser aussi bien un groupe y-D-glutamyle qu'un groupe D-iso glutamique, sauf lorsqu'il sera expressément spécifié que la désignation ne concerne dans un cas particulier que l'ur.

ou l'autre de ces deux groupes. En d'autres termes, et en l'absence de toute réserve au niveau du langage, il est entendu que l'expression "enzyme ayant une activité de D-glutamyl-(L)meso-diaminopimélyle endopeptidase" se réfère à une enzyme ayant en fait aussi bien une activité de γ-D-glutamyl-(L)meso-diaminopimélyle endopeptidase qu'une activité de D-isoglutaminyle-(L)meso-diaminopimélyle endopeptidase.

L'invention concerne enfin plus particulière- ment encore l'application de la susdite enzyme immobilisée à la fabrication de saceharide dipeptide, notamment de la N-acétyl-D glucosaminyl-#1#4 N-acétyl-muramyl-L-alanine-D-isoglutamine (GlcNAc-MurNAc-L-Ala-D-isoGln ou
On sait que des endopeptidases du type sus @dèjà été i isolées à partir de certains micro-

<tb> <SEP> 3
<tb> Sons <SEP> pegtdiques <SEP> ne <SEP> sont <SEP> pas <SEP> amidées <SEP> ou
<tb> dees,t
<tb> D-glutamyl <SEP> représente <SEP> "y-D-gl <SEP> t
<tb> nyl", <SEP> selon
<tb> publications de GUINAND et Coll. ("JOURNAL OF BACTERIOLOGY,
Oct. 74, p. 173-184" et "BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL
RESEARCH COMMUNICATIONS, tome 68, n 4, > 1 > 1976, p. 12d7 1293"), soit d'enzymes solubles.

En particulier une endopeptidase exocellulaire soluble a été mise en évidence dans des milieux de sporulation de B. sphaericus 9602 . Cette enzyme exocellulaire soluble a pu être partiellement -purifiée par des étapes de précipitation fractionnée, notamment par le sulfate d'ammonium, par des chromatographies et filtrations sur différents suports (M.J. VACHERON et Coll., "BIOCHIMIE, 1977, 59, p. 15-21").L'enzyme en question est notamment caractérisée par les caractéristiques physicochimiques suivantes - elle est précipitable à partir d'une de ses solutions
dans un tampon Tris-HCl 20 mM à pH 8, par addition de
sulfate d'ammonium dans des proportions permettant d'at
teindre à un degré de 25 à 65 % de saturation ; - elle est éluable par un tampon Tris 1101 100 mN à pH 8
contenant HaCl 0,12 M à partir de DEAE-cellulose, après
avoir au préalable été fixée sur cette résine au sein
d'un tampon Tris-HCl 100 mN à pPl 8 ; - elle n'est pas retenue sur l'hydroxyapatite équilibrée
avec un tampon phosphate 1 mM à pH 7,4.

Cette dernière enzyme est au surplus caractérisée par une activité endopeptidase sélective à l'égard de molécules qui peuvent être représentées par l'une des deux désignations suivantes
X-L-aminoacyl-D-glutamyl-(L)meso-diaminopimélyle ou
X-L-aminoacyl-D-glutamyl-(L)meso-diaminopimélyl(L)-D-alanine, dans lesquelles - X est un atome d'hydrogène appartenant au groupe amino
de l'élément "L-aminoacyle" ou une molécule renfermant
un groupe N-acétyl-muramyle dont la fonction carboxyli
que est reliée au groupe NH dudit aminoacyle, - ledit aminoacyle est de préférence un alanyle ou un
séryle, - les fonctions carboxyle ou amine de l'acide (L)meso-
diaminopimélique, qui ne sont pas engagées dans des liai
sons peptidiques, ne sont pas amidées ou sont desarii- dées, -"Oglutamyl" représente "y-D-glutamyl" ou "D-isoglutami
nyl", selon ce qui a été indiqué plus haut pour la com
modité du langage.

L'endopeptidase membranaire insoluble est éVi- demment particulièrement difficile à purifier. Il en était encore de même jusqu'à ce jour de l'enzyme soluble. L'utilisation industrielle de cette dernière, notamment pour fabriquer des molécules renfermant au moins un groupe lF- acétyl-muramyl-L-alanyl-D-glutamyle par action de ladite enzyme sur des fractions, notamment originaires de peptidoglycanes bactériens, qui contiennent des groupes correspondants du type N-acétyl-muramyl-L-alanyl-D-glutamyl-(L) meso-diaminopimélyle ou N-acétyl-muramyl-L-alanyl-D glutamyl-(L)meso-diaminopimélyl(L)-D-alanine, ne seraitce que parce que l'enzyme soluble, qui est difficile à isoler et à purifier, ne pouvait qu'être perdue après sa mise en oeuvre.

L'invention a pour but de remédier à ces difficultés, notamment de fournir une enzyme -immobilisée sur un support pouvant de ce fait être récupérée à partir d'un milieu de réaction, cette enzyme immobilisée retenant cependant la quasi- totalité de l'activité de l'enzyme soluble.

L'invention découle de la découverte qui a été faite, à l'occasion d'essais de purification plus poussée d'endopeptidases solubles du genre en question, que cellesci pouvaient se fixer solidement à certaines catégories de macromolécules à longues chaînes, plus particulièrement du type de celles qui forment des gels, en particulier de celles qui portent des groupements moléculaires latéraux ou bras.Cette découverte était d'autant plus inattendue que les premières purifications des endopeptidases du genre en question ont pu être faites en ayant recours à des étapes de chromatographie ou de filtration sur des gels ou tamis cellulaires mettant en jeu de telles macro- molécules et en ayant recours à des étapes de fixation et d'élution mettant en jeu des techniques classiques impliquant des modifications de la force ionique et/ou du pH du milieu.

L'endopeptidase selon l'invention est caractérisée en ce au'elle est immobilisée sur un support par l'idtermédiaire de liaisons de fixation non-covalentes entre l'enzyme et son support.

L'enzyme immobilisée obtenue est caractérisée par une très grande stabilité dans des solutions po- laires, quelles que soient leurs forces ioniques ou les pH de ces solutions, pour autant bien entendu que ces forces ioniques ou ces pH restent compatibles aveo la préservation de l'activité enzymatique de l'endopeptidase. En outre, on constate que l'enzyme immobilisée présente une stabilité dans le temps beaucoup plus importante que l'enzyme soluble; comme il sera démontré par les essais dont les résultats sont rapportés plus loin.De plus, il a été constaté que l'immobilisation desdites enzymes sur un support avait pour effet de déplacer le pH des solutions au sein desquelles elles présentent une activité optimum vers des valeurs plus proches de la neutralité, d'où une plus grande facilité d'application à des substrats sensibles par ailleurs à des variations de pH. Bien entendu, l'immobilisation résulte également dans le fait que l'en- zyme peut être récupérée à partir du milieu dans lequel elle a été auparavant ramenée àexercer son action spécifique. Elle peut être réutilisée pour plusieurs séries de fabrication. Enfin, il est loisible de récupérer les supports, après des utilisations répétées de l'enzyme immobilisée, et ce en produisant la désorption de l'enzyme fixée dans les conditions qui seront indiquées plus loin.

Enfin, la fixation de l'endopeptidase sur les supports du genre en question, notamment dans des tampons à pH inférieur à 9, de préférence en présence d'un sel de magnésium, se fait avec un grand niveau de sélectivité, une proportion considérable des protéines,accompagnant l'endopeptidase même dans les préparations les plus purifiées qui ont pu être préparées jusqu'à ce jour, n'étant pas alors retenue ou aisément éluable surle support par les techniques classiques de modification de pH, de force ionique dp la solution, etc..

L'invention concerne plus particulièrement les endopeptidases immobilisées, dans lesquelles l'endopeptidase fixée présente les caractéristiques physicochimiques qui ont déjà été mentionnées à l'égard des enzymes solubles susdites. Elle concerne donc plus particulièrement les enzymes immobilisées comprenant'l'enzyme présentant l'activité endopeptidasique sélective également mentionne plus haut, notamment le profil de spécificité des endopeptidases extraites de B. sphaericus ou de B. subtlis,
De préférence encore l'invention concerne les enzymes immobilisées sur un support qui est formé .de macromolécules à longues chaînes, du type de celles qui forment des gels, et qui portent des bras dont les longueurs correspondent au moins à celle d'une chaîne aliphatique à 3 atomes de carbone, de préférence à celle d'une chaîne comportant plus de 4 atomes de carbone, notamment de 5 à 10 atomes de carbone.

Bien entendu, on peut avoir recours à des bras constitués par des chaînes non aliphatiques, par exemple contenant des groupes aryle. A ce titre, on considère que la longueur d'un groupe phényle correspond sensiblement à la longueur d'une chaîne aliphatique ayant de 5 à 6 atomes de carbone. Les bras en question, aliphatiques ou non, peuvent être constitués par des chaînes saturées ou non.

Les macromolécules susdites à longues chaines sont avantageusement dérivées de gels pour chromatographie, notamment du type polysaccharidique, tels que dextranes ou agaroses, du type polyacrylamide ou contenant les deux types à la fois. I1 est à note que des interactions de type hydrophobe paraissent constituer l'un des paramètres importants intervenant dans les liaisons de fixation non covalentes du genre en question. Ce paramètre ne semble cependant pas être le seul, comme en témoigne la possibilité qu'ont certains supports dont les bras portent des groupements polaires, tels que NH2, d'assurer la retenue adéquate de l'enzyme dans des milieux polaires.

On obtient des résultats particulièrement intéressants avec des supports d'agarose réticulée portant des bras -amino-hexyl-agarose et phényl-agarose (AH
SEPHAROSE et phényl-SEPHAROSE, fabriquées par PHAW4ACIA).

L'existence d'une interaction hydrophobe est mise en évidence par la difficulté rencontrée à détacher l'enzyme de son support, si ce n'est en provoquant une diminution importante de lapolarité et d'autres paramètres du milieu la contenant. Nais dans une endopeptidase i1mo- bilisée préférée de l'invention, elle est détachable au sein d'une solution à pH 9, exempte d'ions magnésium et ayant une polarité réduite, notamment du fait d.e la présence d'un détergent ou d'éthylène glycol à raison, en ce qui concerne ce dernier, de plus de 40 0, notamment de 40 à 50 % en volume.

L'invention concerne enfin l'application de l'endopeptidase immobilisée à la fabrication de molécules renfermant au moins un groupe N-acétyl-muramyl-Lalanyl-D-glutamyle, par action de la susdite enzyme immobilisée sur des fractions contenant des molécules initiales correspondantes comprenant au moins un groupe N-acétylmuramyl-L-alanyl-D-glutamyl-(L)meso-diaminopimélyle ou
N-acétyl-muramyl-L-alanyl-D-glutamyl-(L)meso-diaminopimélyl(L)-D-alanine, telles qu'obtenues par traitement de peptidoglycanes bactériens, par une D,D-endopeptidase (plus particulièrement une enzyme coupant les liaisons interpeptidiques entre les résidus (L)meso-diaminopimélique , d'une part, et D-alanyle, d'autre part) et, le cas échéant, une muramidase, telle que le lysozyme.

De préférence, cette application est réalisée sur des fractions de peptidoglycanes bactériens donnant lieu, notamment après traitement avec une D,D-endopeptidase et, le cas échéant en outre, une muramidase, telle que le lysozyme, à des molécules initiales contenant des groupes
N-acétyl-muramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-(L)meso-diamino- pimélyle ou N-acétyl-muramyl-L-alanyl-D-isogluglutaminyl- (L)me & -diaminopimélyl(L)-D-alanine et dans lesquelles les -fonctions amino ou carboxyle de l'acide (L)meso-diamino pimélyle, non engagées dans des liaisons peptidiques, sont désamidées. Il en est par exemple ainsi des peptidoglycanes originaires d'Actinomadura R39.

D'autres caractéristiques encore de l'invention apparaîtront au cours de la description qui suit du mode d'obtention préféré de l'endopeptidase stabilisée selon 11 invention, des propriétés de ces endopeptidases et enfin d'une application de l'endopeptidase immobilisée obtenue à la fabrication de GMDP.

A l'occasion de cette description, il sera fait référence aux dessins, dans lesquels les fig: 1 et 2 sont représentatives des variations de pourcentages d'activité éluée à partir de supports divers sur lesquels a, au préalable, été absorbée une endopeptidase soluble, en fonction des caractéristiques variables des supports utilisés. La fig. 3 est un schéma illustrant la structure d'un peptidoglycane bactérien et faisant apparaître les sites actifs des différentes enzymes susceptibles d'etre utilisées pour obtenir des fractions solubles.

D'une façon générale, les fractions actives étudiées dans les exemples qui suivent sont détectées et dosées par l'action qu'elles exercent à l'égard de substrats N-acétyl-muramyl-L-alanyl-&gamma;-D-glutamyl-(L)meso- diaminopimélyl(L)-D-alanine[14C], notamment dans les conditions qui ont été décrites dans l'article de M..T. VACHERON et Coll., intitulé "Mise en évidence et séparation d'une &gamma;-D-glutamyl-(L)meso-diaminopimélate endopeptidase et d'une LD-carboxypeptidase exocellulaire à partir de Bacillus sphaericus 9602", publié dans "BIOCHIMIE,1977, 59, 15-21".

I - PREPARATION D'ENZYMES IMMOBILISEES
L'endopeptidase,destinée à être fixée sur des supports tels qu'identifiés ci-après, est obtenue à partir du milieu de sporulation de B. sphaericus, qui peut être obtenu auprès de la NATIONAL COLLECTION On. TYPE
CULTURES (N.C.T.C.) 9602, dont les conditions d'obtention et de préservation ont été indiquées dans les articles de
J.F. POWELL et COll. "BIOCHEM. J. (1957), 65, 700-708" ou de K.D. HUNGERER et Coll., "BIOCHEMISTRY (1969), 8 > 3577-3587". Le milieu de sporulation est obtenu dans les conditions décrites dans l'article sus-indiqué de
M.J. VACHERON et Coll.. Le milieu de sporulation est précipité par le sulfate d'ammonium entre les concentrations 1,06 et3,45 M.Le précipité, redissous en solution aqueuse, est dialysé contre le tampon Tris-HCl 20mN à pH 8,2, puis chromatographié sur DEAE-SEPHAROSE. L'élut ion est effectuée avec un gradient linéaire croissant de O à 0,5 M en
NaCl dans le tampon Tris-HCl 20 mM à pH 8,2 L'élution de l'endopeptidase commence pour une concentration en NaCl 0.1 M.

Les fixations de l'enzyme sont effectuées en parallèle sur des gels AH-SEPAROSE et phényl-SEPHAROSE. Les colonnes de 0,9 x 1,6 cm sont équilibrées dans le tampon Tris-HCl 20 mM en Mg2+, à pH 8. Une solution partiellement purifiée de l'endopeptidase (0,8 mg.ml 1, activité spécifique de 133 mmoles min-1 mg-1) est chargée sur le gel. On alterne chargements (300 ul ou 100 ul) et lavages par le tampon (2 ml) afin de pouvoir rechercher l'activité enzymatique dans les éluats sur le substrat MurNac L-Ala-&gamma;-D-Glu-ms-A2pm-D-Ala. On cesse le chargement de l'enzyme quand on détecte une activité dans les éluats (libération d'A2pm-D-Ala).Les gels sont alors saturés en endopeptidase. l'AH-sEPHAROSE fixe le contenu de 700 1 de la solution enzymatique. Le phényl-SEPHAROSE fixe le contenu de 1 ml de solution. On conserve avantageusement les enzymes immobilisées formées à 4 C dans le tampon
Tris-HCl 20 mM, 10 mM en Mg à pH 8 renfermant 0,02 % de nitrure de sodium.

I1 est intéressant de noter que la fixation obtenue est remarquablement sélective. On constate en effet, après désorption de l'endopeptidase dans les conditions qui seront décrites plus loin, que ladite fixation sélective avait conduit à un facteur de purification de l'ordre de 10 vis-à-vis du degré de purification de l'endopeptidase antérieurement chargée sur les gels.

II - PROPRIETES DE L'ENZYME IMMOBILISEE
A - Stabilité de l'enzyme immobilisée en fonction du
temps
Cette étude est faite avec l'endopeptidase immobilisée sur AH-SEPHAROSE et, à titre de comparaison, avec l'enzyme libre, à 40C. Les enzymes sont maintenues a cette température pendant des temps croissants. Aux termes de différents temps, on mesure l'activité endopeptidasique restante avec le substrat MurNac-L-Ala-&gamma;-D-Glu-ms-A2pm-D- (14C) Ala.

On constate que l'endopeptidase immobilisée est plus stable qu'à l'état libre. A 40C, par exemple, elle n'a perdu aucune activité au terme d'un délai de 90 jours, tandis que l'endopeptidase libre n'est stable que pendant une vingtaine de jours et perd 70 % de son activité au bout de 3 mois.

B- Influence du tu sur l'activité de l'endopepti-
dase I fixée.

Les activités de l'endopeptidase immobilisée sur AH-SEPHAROSE et, à titre de comparaison, celles de lten- dopeptidase libre sont étudiées à différents pH compris entre 7 et 9.

Les activités sont appréciées par les pourcentages relatifs de ms-A2pm-D-Ala libLé I. partir du substrat L-Ala-&gamma;-D-Glu(NH2)-ms-A2pm-D-(14C)Ala, les incubations étant réalisées dans le tampon Tris-HCl 20 mM et 10 mM en
MgCl2, à ces différents pH.

On constate qu'avec l'enzyme immobilisée le maximum d'activité est obtenu de pH 7,7 à pH 8. L'endopeptidase soluble à un pH optimum de 8,65. On a donc un déplacement du pH optimum vers le pH neutre, lorsque l'enzyme est immobilisée sur AH-SEPHAROSE.

C - Conditions de désorption de l'enzyme
Des colonnes de phényl-SEPHAROSE 4B sont équilibrées avec un tampon Tris-HCl 20 mM, 10 mM en NgCl2 et 1,06 M en (NH4)2 S04. La présence de sulfate d'ammonium augmente les interactions hydrophobes et permet de fixer un maximum de Protéines enzymatiques.

On fixe l'endopeptidase de B. Sphaericus sur les colonnes dans les conditions sus-indiquées (42 mg de protéines par colonne de 5 ml).

Les essais d'élution sont effectués avec les tampons suivants
T1 : Tris-HCl 20 mM, 10 mM en MgCl2 et 1,06 M en (NH4)2SO4,
à pH 8 ;
T2 : gradient linéaire de 1,06 à O M en (NH4)2SO4 et de
O à 0,5 g en Brij 58 dans Tris-HCl 20 mM, 10 mN en
MgCl2, à pH 8 ;
T3 : Tris-HCl 20 mM, 10 mN en MgCl2 et contenant 0,5 % de
Brij 58, à pH 8 ;
T4 : Tris-HCl 20 mM, 10 mM en NgCl2 et contenant 0,5 % de
Brij 58 à pH 9 ;
T5 : gradient linéaire de 10 à O mM en MgCl2 dans Tris-HCl
20 mM et contenant 0,5 % de Brij 58 à pH 8 ;
T6 : Tris-HCl 20 mM et contenant 0,5 % de Brij 58 à pH 8 ;
T7 : Tris-HC1 20 mN et contenant 0,5 % de Brij 58 à pH 9 ;
T11 :Tris-HCl 20mM, 10mM en MgCl2 et 1,06 M en (NH4)2SO4
à pi! 8 ;
T12 : gradient linéaire de 1,06 à O M en (NH4)2SO4 dans
Tris-HC1 20 mM, 10 mM en MgCl2 à pH 8 ;
T13 : Tris-HCl 20 mM à pH 8 ;
T14 : Tris-HCl 20 mM à pH 9 ; T15 : Tris-HCl 20 mM contenant 0,3 % de Brij 58 à pH 9 ;
T21 : Tris-IICl 20 mM, 10 mM en llgCl2 et 1,06 M en (NH4)2SO4
à pH 7,8 ;
T22 : Tris-HCl 20 mI4 et 10 mM en NgCl2 à pH 7,8 ;
T23 : Tris-HCl 20 mM à pH 9 ;
T24 : gradient linéaire croissant de O à 50 % d'éthylène
glycol dans Tris-HCl 20 mM à pH 9.

(Dans les tampons qui précèdent le "Brij 58" est un détergent constitué de polyoxyéthylène monocétyl éther).

Les débits sont de 25 ml/h et les éluats sont collectés par fractions de 2 ml. L'endopeptidase est repé- rée dans les fractions successives par son action sur le substrat MurNac-L-Ala-y- D-Glu-ms-A2pm-D 1 > 1 C)Ala.

Seules les fractions éluées avec les tampons
T7, T15 et T24 (dans le cas du tampon T24 pour des proportions volumiques d'éthylène-glycol supérieures à 40 %) présentent une activité endopeptidasique. On peut en conclure, en comparant entre elles les natures des tampons que l'absence de MgC12, un pH supérieur à 8,0 et la présence soit d'éthylène-glycol en proportions importantes, soit d'un détergent, sont nécessaires à la désorption.

III - INFLUENCE DE LA LONGUEUR DES "BRAS" FIXES SUR LES
CHAINES MACROMOLECULAIRES DES SUPPORTS
Pour cette recherche, on a utilisé un kit d'alkyl-agaroses et d'-amino-alkyl-agaroses dont les groupes alkyle comportent des groupes aliphatiques à nombres n d'atomes de carbone (Cn) croissants.

Des colonnes de 1 ml d'alkyl-agarose (Cn, n = 0, 2, 4, 6, 8, 10) et d'a > -amino-alkyl-agarose (CnNH2, -n n 0, 2, > 1 > 4, 6, 8, 10) sont respectivement chargées avec 2,9 mg de protéines (soit 38,6 unités d'activité endopeptidasique) puis éluées par 2 ml de tampon Tris-HCl 20 mM en MgC12 à pH 8. L'activité endopeptidasique de chaque éluat est exprimée en pourcentage de l'activité chargée.

Les fig. 1 et 2 sont représentatives des variations de pourcentage d'activité éluée ( en % sur les axes des ordonnées) en fonction du nombre d'atomes de carbone des bras (n sur les axes des abscisses), en ce qui concerne les colonnes d'alkyl-agaroses (Cn) et d'u-amino- alkyl-angaroses (CnNH2) respectivement.

On constate que la presence de bras sur lç- chaînes macromoléculaires du genre en question induit rétention de l'enzyme sur les gels ainsi modifiés, rétention qui devient prépondérante pour des bras ayan plus de 2 atomes de carbone, de préférence plus de 4 atomes de carbone. Le maximum d'activité adsorbée est obtenu avec les alkyl-agaroses comprenant 6 atomes de carbone ou plus.

Le phényl-SEPHAROSE 4B a été étudié dans les mêmes conditions en comparaison avec le butyl-agarose et l'hexyl-agarose. Les résultats montrent que l'activité éluée est 10 % de l'activité éluée pour le butyl-agarose 4,7 % pour le phényl-SEPHAROSE 4B et 3,1 % pour l'hexyl- agarose.

On constate aussi que la fixation est d'autant plus forte que la liaison non covalente a un caractère plus hydrophobe. En particulier, on constate que la proportion d'activité éluée est plus faible, lorsque le support est formé de lthexyl-agarose, que lorsqu'il est formé d'-amino-hexyl-agarose. Il est donc avantageux que les bras soient entièrement dépourvus de groupes polaires.

IV - APPLICATION DE L'ENZYME IMMORILISEE SELON L'INVENTIOIQ
A L'OBTENTION DE GMDP A PARTIR DE PEPTIDOGLYCANES
BACTERIENS
Le principe général de la méthodologie utilisée est le suivant
De préférence, on utilise une souche de hacté ries dont le peptidoglycane renferme la séquence peptidique L-alan"l-D-isoglutaminyl-meso-diaminopimélate (L-Ala-Diso-Gln-ms-A2pm). Beaucoup de bactéries à gram (+) possèdent cette séquence et peuvent être utilisées.Généralement le peptidoglycane natif renferme des chaînes tripeptidiques (L-Ala-D-iso-Gln-ms-A2pm-ms), des chaînes tétrapepti diques (L-Ala-D-iso-Gln-ms-A2pm-D-Ala) et essentiellement des chaînes tétrapeptidiques reliées éntre elles par une liaison D-Ala-ms-A2pm entre la D-alanine d'une chaîne et l'acide meso-diaminopimélique d'une autre chaîne peptidique. Le schéma de la fig. 3 indique cette structure.

Les sites d'action des enzymes lytiques ciaprès utilisés sont repérés par les numéros (1) DD-carboxypeptidase de Streptomyces aihus G, (2) lysozyme, (3) endopeptidase selon l'invention.

Le peptidoglycane est obtenu par toute tenh- nique classique, notamment à partir de bactéries cassées par ultrasons ou par tout autre moyen mécanique. Il est d'abord traité par une enzyme qui coupe les liaisons interpeptidiques D-Ala-ms-A2pm (réaction (1) sur le schéma) donnant un glycane substitué par des chaînes tripeptidiques et tétra- peptidiques.

La chaîne glycanique est ensuite coupée par une muramidase, telle que le lysozyme,qui qui hydrolyse les liaisons N-acétyl-muramyl-#1#4 N-acétyl-D-glucosaminiques (MurNAc
GlcNAc) (réaction (2) sur le schéma de la fig. 3). On obtient un mélange de disaccharides tripeptides (GlcNAc MurNAc-L-Ala-D-iso-Gln-ms-A2pm) et de disaccharides tétrapeptides (GlcNAc-MurNAc-L-Ala-D-iso-Gln-ms-A2pm-D-Ala).

Les chaînes peptidiques sont hydrolysées par une endopeptidase spécifique qui coupe la liaison D-iso
Gln-ms-A2pm et donne le disaccharide dipeptide GlcNAc
MurNAc-L-Ala-D-iso-Gln ou GMDP (réaction (3) sur le schérna).

Les réactions (2) et (3) ci-dessus peuvent le cas échéant être interverties. La mise en oeuvre de la réaction (3) après la réaction (1) permet d'obtenir de longues chaînes de glycane soluble portant des groupes L-alanyl-Disoglutamine.

Première étape - Préparation d'un peptidoglycane bactérien
La souche de bactéries choisie est Actinomadura
R39. Cette bactérie a été identifiée en 1975 par le Dr. iwans
Jürgen KUTZNER et déposée dans la Collection de souches dite "DEUTSCHE SAMMLUNG VON MIKROORGANISMEN (D.S.M.) TEILSAMMLUNG" à Darmstadt (Allemagne).

Elle a aussi été déposée le 7 juillet 1980 à la
COLLECTION NATIONALE DES CULTURES DE MICRO-ORGANISMES de 1'INSTITUT PASTEUR à Paris (France). I1 lui a été attribué le n I-127.

Elle est conservée par lyophilisation du myc;- lium ou par culture sur gélose inclinée avec un milieu kératose-caséine selon DUSART et Coll. (1973) "Antimicr. Ag.

Chemother, 3, 181". Après formation des conidies au bout de 4 à 6 jours à 30 C, les cultures sont viables pendant 6 mois ou plus en chambre froide à 40C. Elle est cultivée à 280C avec agitation pendant 72 h dans le milieu si- vant: peptone de caséine 10 g, MgSO4, 7H2O, 1g, K2PO4 1g, NaNO 2 g, KCl OtS g pour 1 litre. Les bactéries sont
3 récoltées par centrifugation à 1700 g pendant 15 minutes à 40 C ; poids obtenu : 8 à 12 g (poids humide) par litre de milieu. Elles sont immédiatement autoclavées pour éliminer les enzymes autolytiques.Les cellules sont ensuite cassées par des ultrasons ou par broyage mécanique jusqu'à destruction presque totale vérifiée par microscopie à contraste de phase. Les débris cellulaires sont éliminés par centrifugation à 7000 g et les parois sont recueillies à partir du surnageant par centrifugation à 30.000 g.

Elles sont lavées plusieurs fois à l'eau et purifiées par un traitement à la trypsine dans une solution de phosphate disodique M/30, avec un rapport pondéral enzyme/parois 1/50 et une concentration parois/tampon de 2 % (poids/vol.).

Le rendement est de 800 mg (poids sec) de peptidoglycane à partir de 140 g (poids humide) de bactéries.

Deuxième étape - Hydrolyse des liaisons interpeptidigues
D-Ala-ms-A2pm
L'enzime utilisée est la DD-carboxypeptidase de Streptomyces aibus G dont la pr-éparation et la purification ont été décrites, notamment dans la publication de
C. DUEZ et Coll. "BIOCHEM. J. 1978, 175, 793-800" (enzyme commercialisée par la firme belge UCB).

La lyse de 100 mg de parois est effectuée dans 4 ml d'un tampon Tris-HCl 10 mM, pH 8,3, avec Mg 5 mM pendant 15 heures à 370C ; le rapport enzyme/parois est 1/250.

Troisième étape - Hydrolyse de la chaîne glycanique
Le milieu d'incubation précédent est ramené à pH 7,3 par addition de Tris-HCl : 0,5 volume de Tris
HCl 0,1 M, pH 7,0 pour 1 volume du milieu précédent, et on ajoute 2 volumes d'eau pour avoir une concentration finale 17 mM en Tris-HCl. A ce milieu, on ajoute le lysozyme : 1 mg pour 100 mg de parois initiales et l'incuba- tion est effectuée pendant 24 h à 37 C.

Les produits de la réaction sont fractionnés par chromatographie sur colonnes couplées des tamis moléculaires,commercialisées sous les désignations SEPHADEX
G-50 (900 ml) et SEPHADEX G-25 (700 ml) avec élution par une solution Q,1 M de chlorure de lithium. T.es fractions correspondant aux unités monomériques du peptidoglycane sont dessalées sur colonne de BIOGEL P2 (65 g).

guatr~ème éfaEe - Hydrolyse de la liaison D-iso-Gln-n-
A2pm
Cette hydrolyse est effectuée par l'endopeptidase, immobilisée sur AH-SEPHAROSE ou phényl-SEPHAROSE.

Le substrat (2 mg), mélange de disaccharide tripeptide et de disaccharide tétrapeptide, est dissous dans 0,5 ml de tampon Tris-HCl 20 mSl à pH 8 et 10 mM en Mg . La solution est pulsée à travers une colonne de 0,9 x 1,6 cm contenant l'enzyme immobilisée, équilibrée avec un tampon Tris-HCl 20 mM pH 8 avec Mg 10 mM.

En fin d'opération, le GMDP est séparé des autres produits de la réaction par chromatographie sur une colonne de DOWEX 50 (0,8 x 4,5 cm) sous forme H avec élution par l'eau. L'analyse du produit indique la présence de glucosamine, acide muramique, alanine et acide glutamique et l'absence de tout contaminant.

Comme il va de soi et eomme il résulte d'ailleurs de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes d'application et de réalisation qui ont été plus spécialement envisagés ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes, notamment celles où l'on utilise à titre d'endopeptidase fixée sur le support celle qui résulte de purifications plus poussées des endopeptidases envisagées dans la présente demande, notamment par l'application des techniques décrites dans des publications antérieures ou autres techniques de chromatographie ; ou encore, au niveau des applications, celles où l'enzyme immobilisée choisie est amenée à agir sur des peptidoglycanes présentant les caractéristiques préférées qui ont été indiquées plus haut et qui peuvent être obtenues à partir de bac té- ries autres qu'Actinomadura R39, telles que BaciZZus
Megaterium et Bacillus Licheniformis.

Au niveau des applications, il est encore à noter que l'on peut également appliquer l'enzvme immobilisée selon l'invention a des disaccharides-tripeptides ou -tétrapeptides obtenus à partir de chaînes de glycane soumis préalablement à l'action d'une glucosaminidase, en lieu et placede-la muramidase. A titre d'exemnle de glucosaminindase susceptible d'être utilisée, on peut mentionné l'endo N-acétyl-glucosaminidase, telle que la muralysine streptoeoccique ("; BIOL. CHEM.", 1964, tome 239, 4027-4033) ou la lysostaphine "(BIOCHEM.

BIOPHYS. RESEARCH COMMUNICATIONS", 1966, tome 22 4866). Dans une de ces variantes encore, l'invention est applicable à la production de N-acétyl-muramyl-L-alanyl
D-isoglutamine ou d'acide N-acétyl-muramyl-L-alanyl-D- glutamique à partir de peptidoglycane bactérien comprenant toutes les étapes sus-indiquées, auxquelles vient s'ajouter, au niveau du traitement de la chaîne de glycane par une muramidase, une étape de traitement par une glucosaminidase (antérieurement ou postérieurement au traitement de la chaine -glutamique par la muramidase).

Claims (12)

REVENDICATIONS

1 - Enzyme ayant une activité de D-glutamyl (L)meso-diaminopimélyle endopeptidase, caractérisée en ce qu'elle le est immobilisée sur un support par l'intermédiaire de liaisons de fixation non covalentes entre l'enzyme et son support.

2 - Enzyme immobilisée selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle a une activité de D-glutamyl (L)meso-diaminopimélyle endopeptidase sélective à l'égard d'une chaîne peptidique qui peut être représentée par l'une des deux désignations suivantes X-L-aminoacyl-D-glutamyl-(L)me so -diaminopimélyle ou

X-L-aminoacyl-D-glutamyl-(L)meso-diaminopimélyl(L)-D

alanine, dans lesquelles - X est un atome d'hydrogène appartenant au groupe amino

de l'élément "L-aminoacyle" ou une molécule renfermant

un groupe N-acétyl-muramyle dont la fonction carboxy

lique est reliée au groupe NH dudit aminoacyle, - ledit aminoacyle est de préférence un alanvle ou un

séryle, - les fonctions carboxyle ou amine de l'acide (L)meso

diaminopimélique, qui ne sont pas engagées dans des

liaisons peptidiques, ne sont pas amidées ou sont dé

samidées, - "D-glutamyl" représente "y-D-glutamyl" ou "D-isogluta

minyl".

3 - Enzyme immobilisée selon la revendication 2, caractérisée en ce qu'elle présente le profil de spécificité de la y-D-glutamyl-(L)meso-diaminopimélyle endopeptidase extraite de B. sphaericus ou de B. subtilis.

4 - Enzyme immobilisée selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que l'endopepti- dase fixée sur ledit support par l'intermédiaire desdites liaisons non covalentes est une enzyme qui - est précipitable à partir d'une de ses solutions dans

un tampon Tris-HCl 20 mM à pH 8, par addition de sul

fate d'ammonium dans des proportions permettant d'at

teindre à un degré de 25 à 65 % de saturation

- est éluable par un tampon Tris-HCl 100 m à pH 8 conte

nant NaCl 0,12 M à partir de DEAE-CELLULOSE, après avoir

au préalable été fixée sur cette résine au sein d'un tam-

pon Tris-HCl 100 mM à pH 8 ;;

- n'est pas retenue sur l'hydroxyapatite équilibrée 7e

un tampon phosphate 1 mM à pH 7,4.

5 - Enzyme immobilisée selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que le support est formé de macromolécules à longues chaînes, du type de celles qui forment- des gels, et qui portent des bras dont-les longueurs correspondent au moins à celle d'une chaine aliphatique à 3 atomes de carbone, de préférence à celle d'une chalne comportant plus de 4 atomes de carbone, notamment de 5 à 10 atomes de carbone.

6 - Enzyme immobilisée selon la revendication 5, caractérisée en ce que les macromolécules susdites sont notamment dérivées de gels pour chromatographie, notamment du type polysaccharidique, tel que dextrane ou agarose, du type polyacrylamide ou des deux à la fois.

7 - Enzyme immobilisée selon la revendication 6, caractérisée en ce que les liaisons de fixation non covalentes mettent en jeu, au moins en partie, des interactions de type hydrophobe.

8 - Enzyme immobilisée selon la revendication 6 ou la revendication 7, caractérisée en ce que les bras sont constitués par des groupes phényle ou alkyle, portant le cas échéant des groupes NH2.

9 - Enzyme immobilisée selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que la susdite endopeptidase est détachable de son support au sein d'une solution à pH 9, exempte d'ions magnésium et ayant une polarité réduite, notamment du fait de la présence d'un détergent ou d'éthylène glycol à raison pou ce dernier de plus de 40 %, notamment de 40 à 50 % en volume.

10 - Application de l'enzyme immobilisée selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 à la fabrication de molécules renfermant au moins un groupe N-acétyl-muramyl

L-alanyl-D-glutamyle, par action de la susdite enzyme il:,mC.,i- lisée sur des fractions contenant des molécules initiales corresporrin.- tes comprenant au moins un groupe N-acétyl-muramyl-L-alanyl-D- glutamyl-(L)meso-diaminopimélyle ou N-acétyl-muramyl-Lalanyl-D-glutamyl-(L)meso-diaminopimélyl(L)-D-alanine, telles qu'obtenues par traitement de peptidoglycanes tacté -riens, par une D,D-endopeptidase et, le cas ramidase ou une glucosaminidase ou les deux successivement.

11 - Application selon la revendication 10,

caractérisée en ce qu'elle est réalisée sur des fractions

de peptidoglycanes bactériens donnant lieu, notamment

après traitement avec une D,D-endopeptidase et, le cas

en outre, une muramidase ou une glucosaminidase ou les deux successive

ment, à des molécules initiales contenant des groupes N-acétyl muramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-(L)meso-diaminopimélyle

ou N-acétyl-muramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-(L)meso-diami-

nopimélyl(L)-D-alanine,et dans lesquelles les fonctions

amino ou carboxyle de l'acide (L)meso-diaminopimélyle, non

engagées dans des liaisons peptidiques, sont désamidées.

d 'Actinomadura R39.

des fractions solubles de peptidoglycane originaires

12 - Application selon la revendication 11 à