FR2482861A1 - Procede de preparation d'un antigene et d'un anticorps du glucagon intestinal - Google Patents

Abstract

PROCEDE DE PREPARATION D'UN ANTIGENE DU GLUCAGON INTESTINAL CONSTITUE D'UN COMPLEXE PEPTIDE-SUPPORT ET PERMETTANT, PAR ADMINISTRATION A DES MAMMIFERES, LA PRODUCTION D'UN ANTICORPS LUI-MEME UTILISABLE DANS DES DOSAGES BIOLOGIQUES. ON UTILISE EN TANT QUE HAPTENE UN PEPTIDE REPONDANT A LA FORMULE GENERALE:R-LYS-ARG-ASN-LYS-ASN-ASN-ILE-ALA-OHDANS LAQUELLE R REPRESENTE UN ATOME D'HYDROGENE, UN RESTE D'AMINO-ACIDE OU UN RESTE DE PEPTIDE CONTENANT DE 2 A 20 RESTES D'AMINOACIDE, ET ON LE FAIT REAGIR AVEC UN SUPPORT EN PRESENCE D'UN AGENT DE FIXATION QUI PROVOQUE LA FIXATION MUTUELLE DU HAPTENE ET DU SUPPORT.

Description

La présente invention se rapporte è un procédé de

préparation d'un antigène et d'un anticorps du glucagon intestinal.

Dans toute la présente demande, pour désigner les aminoacides, les peptides, les groupes protecteurs, les groupes actifs, etc., on a utilisé les abréviations recommandées par les règles de V'IUPAC ou de I'IUB ou bien on a utilisé des symboles classiques dont des exemples sont donnés ci-après. D'autre part, lorsque des aminoacides existent sous les formes d'isomères optiques, les énantiomères dont il sera question sont les énantiomères L. sauf mention contraire: Arg: arginine Trp: tryptophane Asn: asparagine Asp: acide aspartique Thr: thréonine Ser: sérine Glu: acide glutamique Gln: glutamine Ala: alanine Val: valine Met: méthionine Leu: leucine Phe: phénylalanine Lys: lysine Tyr: tyrosine Ile: isoleucine Cys: cystéine Cys cystine Cys Gly: glycine His: histidine Pro: proline Z: groupe carbobenzoxy Su: groupe succinimido Tos: groupe p-toluènesulfonyle Boc: groupe tert-butoxycarbonyle Le glucagon intestinal est une hormone qui joue un rôle important dans le métabolisme d'absorption des sucres. Le dosage du glucagon intestinal permet de diagnostiquer divers états pathologiques dans lesquels cette hormone intervient, par exemple le diabète sucré ou le cancer de l'intestin, et de diagnostiquer des maladies telles que les maladies intestinales (par exemple la diarrhée, la constipation, etc.), l'ulcère duodénal, le carcinoïde, le noma du glucagon intestinal, etc. Ainsi donc, dans les domaines de la diagnose, de la pathologie, de la physiologie, etc., on

constate de plus en plus souvent des dosages du glucagon intetlnal.

Ce dosage est réalisé par des techniques telles que la méthode:e radioimmunotest (méthode RIT) à l'aide d'un anticorns (antiséruri qui réagit avec le glucagon intestinal. Jusqu'à man-tenant, on connaissait en tant qu'anticorps capable de réagir a-ec le -lucagon

intestinal l'anticorps R-64 préparé par Ravazzola et col. [cf. Endo-

crinology, volume 105, n 2, pages 499 à 508 (1979'l. Toutefois,

cet anticorps n'est paE spécifique du glucagon intestinal.

Tenu compte de la situation qui vient d'être exposée, la demanderesse a procédé à des recherches approfondies en vue de

mettre au point un procédé permettant d'obtenir un anticorps s,-

fique pour le glucagon intestinal et permettant de doser de mani:.

extremement précise le glucagon intestinal par une technique RIT tu une technique analogue; à la suite de ces recherches, la demanderesse

a découvert que la séquence peptidique de la glicentine porcine consis-

tant en les 93e à 100e aminoacides à partir de l'extrémité N [cf.Horm.

Mietab. Res.,8, 366-371 (1976)], c'est-à-dire R-Lys-Arg-Asn-Lys-Asn-Asn-

Ile-Ala-OH, était un antigène déterminant d'un anticorps présentant la spécificité à l'égard du glucagon intestinal. A la suite de nouvelles

recherches basées sur ces découvertes, la demanderesse a réussi à pré-

parer par synthèse un antigène contenant en tant que haptène un p p-

tide contenant la séquence peptidique spécifique décrite ci-dessus et

répondant à la formule générale (I) ci-après, et elle a prépare à par-

tir de cet antigène, intentionnellement, un excellent anticorps préOsen-

tant une haute spécificité à l'égard du glucagon intestinal, ce qui

constitue la présente invention.

Ainsi donc, l'invention concerne un procédé pour préparer un antigène du glucagon intestinal constitué d'un complexe peptide-support, procédé qui se caractérise en ce que l'on utilise en tant que haptène un peptide répondant à la formule générale (I) ci-après: * R-Lys-Arg-Asn-Lys-Asn-AsnIle-Ala-OH (I) dans laquelle R représente un atome d'hydrogène, un reste d'aminoacide ou un reste de peptide contenant 2 à 20 restes d'aminoacide, et.on le fait réagir avec un support en présence d'un fixateur qui provoque la fixation mutuelle du haptène et du support, ainsi qu'un procédé pour

préparer un anticorps à l'aide de cet antigène.

Les figures 1 à 4 du dessin annexé sont des graphiques

illustrant la spécificité d'anticorps selon l'invention.

Dans le procédé selon l'invention, il est indispensable d'utiliser en tant que haptène un peptide répondant à la formule générale (I) ci-dessus. Parmi les restes d'aminoacide représentés par R dans la formule générale (I) ci-dessus, on peut citer par exemple les suivants: H-Arg-, H-Trp-, HAsn-, H-Ala-, H-Val-, H-Met-, H-Leu-, H-Phe-, H-Lys-, H-Thr-, H-Ile-, HCys-, H-Cys-, H-Gly-, H-Cys

H-His-, H-Pro-.

Parmi les restes de peptide contenant 2 à 20 restes d'aminoacide, on citera par exemple les suivants: H-Gly-Lys-, H-Asn-Tyr-, H-Met-Thr-, HMet-Asn-, H-Leu-Thr-, H-Trp-Thr-,

H-Phe-Val-, H-Gln-Ala-, H-Asp-Arg-, H-Leu-Tyr-, H-Ser-Lys, H-Met-Asn-

Thr-, H-Leu-Met-Asn-Thr-, H-Trp-Leu-Met-Asn-Thr- G-Gln-Trp-Leu-Met-

Asn-Thr-, H-Va!-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-, H-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-

Asn-Thr-, H-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-, H-Gln-Asp-Phe-Val-

Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-, H-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-

Thr-, H-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-, H-Arg-

Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-, H-Ser-Arg-Arg-

Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-, H-Asp-Ser-Arg-Arg-

Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-, H-Leu-Asp-Ser-Arg-

Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Va l-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-, H-Tyr-Leu-Asp-

Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-, H-Lys-

Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-,

2482 861

H-S er-Lys -Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Glu-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-

Met-Asn-Thr-. Parmi ces peptides, on préfère ceux dans lesquels R représente un reste de peptide ou un reste d'aminoacide formé par élimination successive de 1 à 19 restes d'aminoacide à l'azote terminal de la séquence à azote terminal 73 à 92 de la glicentine

du porc.

Les supports qu'on doit fixer sur le haptène peuvent être choisis dans une grande variété de protéines naturelles ou synthétiques à haut poids moléculaire couramment utilisées pour préparer des antigènes. Ainsi, par exemple, on peut citer des sérum-albumines animales (par exemple la sérumalbumine équine, la sérum-albumine de bovin, la sérum-albumine de lapin, la sérum-albumine humaine, la sérum-albumine de mouton, etc.), des sérumglobulines animales (par exemple la

sérum-albumine équine, la sérum-globuline de bovin, la sérum-

globuline de lapin, la sérum-globuline humaine, la sérum-globuline de mouton, etc.), des thyroglobulines animales (par exemple la thyroglobuline équine, la thyroglobuline de bovin, la thyroglobuline de lapin, la thyroglobuline humaine, la thyroglobuline de mouton, etc.), des hémoglobines animales (par exemple l'hémoglobine équine, l'hémoglobine de bovin, l'hémoglobine de lapin, l'hémoglobine humaine, l'hémoglobine de mouton, etc.), des hémocyanines animales, l'extrait protéique d'Ascaris (extrait d'Ascaris: cf. demande de brevet japonais publiée sous le n0 16414/1981), la polylysine, l'acide polyglutamique, le copolymère lysineacide glutamique, des copolymères contenant de la lysine ou de l'ornithine, etc. On décrira maintenant plus en détail l'extrait d'Ascaris. L'extrait d'Ascaris est obtenu par l'extraction d'Ascaris

de porc broyés par une technique ordinaire d'extraction des protéines.

On peut utiliser comme solvants d'extraction divers solvants connus pour l'extraction des protéines comme l'eau, un sérum physiologique, une solution aqueuse de méthanol ou d'éthanol à 50%, une solution

tampon à peu près neutre, etc.; on préfère le sérum physiologique.

Plus précisément, l'extrait en question est obtenu par exemple de la manière suivante: on lave les Ascaris de porc débarrassés des viscères à l'aide d'un sérum physiologique et de préférence on découpe en morceaux fins pour faciliter l'extraction. On introduit ces morceaux fins dans un solvant d'extraction des protéines, tel que du sérum physiologique, puis on extrait en homogénisant le mélange. Cette extraction est habituellement effectuée à basse température, de préférence d'environ 2 à 10 C. La solution d'extraction obtenue est ensuite centrifugée; on recueille le liquide surnageant. Après dialyse de ce dernier, on lyophilise le dialysat. Ou bien encore, on centrifuge a nouveau le dialysat, on recueille le liquide surnageant et,après élimination des matières en suspension, on lyophilise. On obtient ainsi l'extrait d'Ascaris

recherché. Celui-ci peut ttre utilisé dans l'invention, si néces-

saire après une nouvelle purification selon une technique classi-

que de purification des protéines, telle que la dialyse, la filtration sur gel, l'adsorption, la chromatographie, etc. On peut également utiliser dans l'invention les extraits d'Ascaris décrits par exemple dans J. Immun., 111, 260-268 (1973), J. Immun., 122, 302-308 (1979), J. Immun., 98, 893-900 (1967) et Am. J. Physiol., 199, 575-578 (1960),

éventuellement soumis à une nouvelle purification. -

Les fixateurs utilisés pour fixer mutuellement le haptène et le support peuvent consister en ceux couramment utilisés pour la préparation des antigènes. Plus précisément, on citera des dialdéhydes aliphatiques capables de provoquer une réticulation des groupes amino entre eux, comme le glyoxal, le dialdéhyde malonique, l'aldéhyde glutarique, l'aldéhyde succinique, l'aldéhyde adipique, etc.; des dimaléimides capables de réticuler des groupes thiol entre eux comme le N,N'-o-phénylènedimaléimide,le N'-n-phénylènedimaléimide, etc.; des maléimidoesters carboxyliques de N-hydroxysuccinimide capables de réticuler un groupe amino avec un groupe thiol comme

le m-maléimidobenzoate de N-hydroxysuccinimide, le 4-(maléimido-

méthyl)-cyclohexane-l-carboxylate de N'-hydroxysuccinimide, etc.; des réactifs utilisés dans des réactions courantes de formation de peptide et capables de relier un groupe amino à un groupe carboxyle

par une liaison amido, par exemple des agents de condensation-

déshydratation du type carbodiimides (comme le N,N-dicyclohexyl-

carbodiimide, le N-éthyl-N'-diméthylaminocarbodiimide, le 1-éthyl-

3-diisopropylaminocarbodiimide, le l-cyclohexyl-3-(2-morpholinyl-4-

éthyl)-carbodiimide, etc.); et les composés analogues. On peut en outre utiliser une combinaison d'un acide diazonium-arylcarboxylique (par exemple l'acide p-diazonium-phénylacétique) et d'un réactif courant de formation de peptide (par exemple un agent de condensation-

déshydratation tel que décrit ci-dessus).

L'antigène selon l'invention est préparé par réaction du haptène décrit ci-dessus avec le support en présence du fixateur qui provoque leur fixation mutuelle. Cette réaction est effectuée dans une solution aqueuse ou dans une solution tampon ordinaire à un pH de 7 à 10, de préférence de 8 à 9, à une température de O à C, de préférence au voisinage de la température ambiante. La réaction est terminée en 1 à 24 h environ. Comme exemples typiques de tampons utilisables pour cette réaction, on peut citer les suivants:

tampon hydroxyde de sodium 0,2 M-acide borique 0,2 M-

chlorure de potassium 0,2 M;

tampon-carbonate de sodium 0,2 M-acide borique 0,2 M-

chlorure de potassium 0,2 M;

tampon tétraborate de sodium 0,05 M-acide borique 0,2 M-

chlorure de sodium 0,05 M; et tampon phosphate monosodique 0,1 Mtétraborate de sodium 0,05 M. Dans cette réaction, on peut déterminer correctement

les proportions relatives de haptène, de fixateur et de support.

Habituellement, les proportions relatives préférées en poids support/

haptène sont de 2:1 à 6:1 et mieux encore de 3:1 a 5:1, et les pro-

portions molaires préférées fixateur/haptène sont de 5:1 à 10:1. La réaction qu'on vient de décrire donne un bon antigène du glucagon selon l'invention constitué du complexe peptide-support, dans lequel le support et le haptène sont associés l'un à l'autre par le fixateur. L'antigène formé dans la réaction peut Etre isolé et purifié facilement par des techniques classiques, par exemple par dialyse, filtration sur gel, précipitation fractionnde ou par une

technique analogue. L'antigène obtenu peut être conservé par lyo-

philisation de la manière habituelle. Dans les antigènes selon l'invention ainsi obtenus, il y a en moyenne habituellement 5 à moles du peptide fixées sur 1 mole de la protéine. Chacun de ces antigènes permet de préparer un anticorps présentant une haute

spécificité à l'égard du glucagon intestinal avec une bonne repro-

ductibilité. En particulier, on préfère les antigènes dans lesquels le rapport molaire de fixation peptide/protéine est de

1:8à 1:15, qui ont une haute spécificité et permettent de préparer -

un anticorps à haute activité et haute sensibilité.

Le peptide de formule générale (1) à utiliser dans l'invention peut consister en un composé connu ou en un composé

nouveau qu'on peut alors préparer par les procédés décrits ci-après.

Le peptide de formule générale (I) peut être préparé selon un procédé classique de synthèse des peptides. On peut faire appel à des procédés en phase solide et à des procédés en phase liquide; dans de nombreux cas, ce sont ces derniers qui sont les plus avantageux. De tels procédés de. synthèse des peptides sont décrits par exemple dans "The Peptides", volume 1 (1966) de Schrider et Luhke (Academic Press, New York, Etats- Unis d'Amérique) ou "Peptide Synthesis" de Isumiya et col. [Maruzen Co., Ltd. (1975>j; on citera par exemple le procédé aux azides, le procédé aux chlorures, le procédé aux anhydrides, un procédé mixte aux acides et aux anhydrides, le procédé DCC, le procédé aux esters actifs, le procédé dans lequel on utilise le réactif K de Woodward, le procédé au carbodiimidazole, le procédé par oxydoréduction, le procédé par DCCIadditif (par

exemple HONB, HOBt, HOSu, etc.), et les procédés analogues.

Le peptide de formule générale (1) peut être préparé facilement par synthèse selon un procédé général de synthèse des polypeptides, parexemple le procédé par condensation successive d'aminoacides, un par un, sur l'aminoacide terminal, ou le procédé dans lequel on couple plusieurs fragments. Plus précisément, le peptide décrit ci-dessus peut être préparé en condensant un produit de départ contenant un groupe carboxyle réactif et correspondant à l'un des deux fragments formés en séparant le peptide dans une position de liaison arbitraire avec un autre produit de départ contenant un groupe amino réactif et correspondant à l'autre fragment, selon un mode opératoire courant pour la synthèse des peptides; lorsque le condensat obtenu contient un ou plusieurs groupes protecteurs, on élimine ces groupes protecteurs de la

manière habituelle.

Dans les réactions successives de préparation du peptide de formule générale (I), il est souhaitable dans de nombreux cas de protéger l'acide aspartique et, dans le stade final, tous les groupes protecteurs sont éliminés du peptide protégé, contenant au moins un reste d'aminoacide protégé; on obtient ainsi le peptide recherché. La protection des groupes fonctionnels qui ne doivent

pas participer à la réaction par des groupes protecteurs, l'élimina-

tion des groupes protecteurs et l'activation des groupes fonctionnels participant à la réaction pevent btre réaliséescorrectement selon une

technique classique ou choisie parmi les techniques connues.

Parmi les groupes protecteurs convenant pour un groupe amino d'un produit de départ, on citera par exemple les groupes

carbobenzoxy, tert-butoxycarbonyle, tert-amyloxycarbonyle, isobornyl-

oxycarbonyle, p-mdthoxybenzyloxycarbonyle, 2-chlorobenzyloxycarbo-

nyle, adamantyloxycarbonyle, trifluoroacétyle, phtalyle, formyle, onitrophénylsulfényle, diphénylphosphinothioyle, etc. Parmi les groupes protecteurs du groupe carboxyle, on peut citer par exemple les groupes esters alkyliques (par exemple ester méthylique, ester éthylique, ester propylique, ester butylique, ester tert-butylique,

etc.), ester benzylique, ester p-nitrobenzylique, ester p-méthoxy-

benzylique, ester p-chlorobenzylique, ester benzhydrylique, le groupe carbobenzoxyhydrazido, le groupe tert-butyloxycarbonylhydrazido, le groupe tritylhydrazido, etc. Comme groupes protecteurs du groupe guanidino de l'arginine, on citera par exemple le groupe nitro, le groupe toluânesulfonyle, le groupe p-méthoxybenzènesulfonyle, le groupe

carbobenzoxy, le groupe isobornyloxycarbonyle, le groupe adamantyl-

oxycarbonyle, etc. Le groupe guanidino peut également être protégé

sous la forme d'un sel d'acide (par exemple de l'acide benzènesul-

fonique, toluènesulfonique, chlorhydrique, sulfurique, etc.).

Le groupe hydroxy de la thréonine peut être protégé par estérification ou éthérification. Les groupes qui conviennent pour l'estérification sont par exemple les groupes alcanoyle inférieurs (par exemple acétyle, etc.), les groupes aroyle (par exemple benzoyle, etc.), les groupes dérivés de l'acide carbonique (par exemple benzoyloxycarbonyle, éthyloxycarbonyle, etc.), et les groupes analogues; parmi les groupes qui conviennent pour l'éthéri-

fication, on citera par exemple les groupes benzyle, tétrahydro-

pyrannyle, tert-butyle, etc. Toutefois, le groupe hydroxy de la thréonine n'est pas nécessairement protégé. La méthionine peut être

protégée sous la forme de sulfoxyde.

Comme exemples de groupe carboxyle activé dans les produits de départ, on citera par exemple les groupes anhydride, azide, estersactifs (esters de pentachlorophénol, de p-nitrophénol,

de N-hydroxysuccinimide, de N-hydroxybenzotriazole, de N-hydroxy-5-

norbornène-2,3-dicarboximide, etc.), et les groupes analogues.

Dans certains cas, la réaction de formation du peptide est effectuée en présence d'un agent déshydratant tel qu'un réactif du type carbodiimide (par exemple le dicyclohexylcarbodiimide ou

le carbodiimidazole).

La réaction de formation du peptide peut être effectuée en présence d'un solvant. On peut choisir un solvant parmi les

solvants connus pour être utilisables dans les réactions-de conden-

sation de peptide. On citera par exemple le diméthylformamide anhydre ou aqueux, le diméthylsulfoxyde, la pyridine, le chloroforme, le dioxanne, le dichlorométhane, le tétrahydrofuranne, l'acétate

d'éthyle, la N-méthylpyrrolidone et leurs mélanges.

La température de réaction est choisie correctement dans l'intervalle connu pour les réactions de formation de peptide, habituellement entre 40 et +60 C, et de préférence entre -20 et 0OC environ. Lorsque la réaction de condensation décrite ci-dessus est terminée, on peut éliminer les groupes protecteurs éventuels de

la manière habituelle. On citera par exemple le procédé par réduc-

tion (ainsi l'hydrogénation sur un catalyseur, telle que la réduc-

tion par le noir de palladium utilisant le sodium dans l'ammoniac liquide, etc.), l'acidolyse (par exemple à l'aide d'un acide fort tel que l'acide trifluoroacétique, le fluorure d'hydrogène ou l'acide méthanesulfonique). Le peptide de formule générale (I) ci-dessus est isolé du mélange de réaction et purifié par des techniques connues

pour les peptides, comme l'extraction, la, distribution, la chroma-

tographie sur colonne, etc. On prépare un peptide marqué, en tant que produit de départ de la préparation d'un antigène marqué à utiliser dans une méthode RIT en introduisant de l'iode radioactif tel 125I ou 131I dans le peptide préparé comme décrit ci-dessus. L'introduction de

l'iode radioactif est réalisée par une technique classique d'iodura-

tion, par exemple une technique d'ioduration par oxydation dans laquelle on utilise la chloramine-T [cf. W.M. Hunter et F.C. Greanwood; Nature, 194, 495 (1962), Biochem. J. 89, 114 (1963)]. Ainsi, par exemple, l'ioduration est effectuée dans un solvant approprié tel qu'une solution tampon au phosphate 0,2 M (pH 7,4) en présence de chloramine T à une température voisine de la température ambiante en 10 à 30 s. Pour ce qui concerne les proportions relatives du

peptide, d'iode radioactif et de chloramine T, on utilise de préfé-

rence environ 1 mc d'iode radioactif et environ 10 à 100 nanomoles de chloramine T par nanomole de tyrosine contenue dans le peptide si l'on veut introduire 1 atome d'iode radioactif dans la tyrosine, et environ 2 mc d'iode radioactif et environ 10 à 100 nanomoles de chloramine T par nanomole de tyrosine contenue dans le peptide si l'on veut introduire 2 atomes d'iode dans la tyrosine. Le peptide - radio-iodé obtenu dans ces conditions est isolé et purifié par des techniques ordinaires de séparation, par exemple par extraction, distribution, chromatographie sur colonne, dialyse, etc. Ce peptide

peut être conservé lorsque c'est nécessaire par lyophilisation.

Pour préparer l'anticorps par utilisation de l'antigène obtenu ci-dessus, on administre ce dernier à un mammifère de la manière habituelle et on recueille l'anticorps produit in vivo. La nature du mammifère ne constitue pas un facteur particulièrement critique. Toutefois, habituellement, on obtient de bons résultats avec les lapins et les cobayes. Pour préparer l'anticorps, on dilue une quantité déterminée de l'antigène obtenu ci-dessus par du sérum physiologique, à une concentration déterminée. On mélange ensuite cette solution avec de l'Adjuvant Complet de Freund, formant ainsi une dispersion qu'on administre au mammifère. Ainsi, par exemple, la dispersion en question est administrée à un lapin par voie

intradermique à une dose de 0,5 à 5 mg de l'antigène à la fois.

On répète ensuite l'administration à une-dose de 0,5 à 5 mg une fois toutes les deux semaines pendant 2 à- 10 mois, de préférence 4 à 6 mois, afin d'immuniser le lapin.'

Lorsqu'on veut obtenir une grande quantité de l'anti-

corps, on peut le recueillir par saignée du lapin immunisé après la dernière administration de la dispersion contenant l'antigène, en

général 1 à 2 semaines après la dernière administration; on centri-

fuge le sang, afin de séparer l'antisérum.

Le procédé selon l'invention présente les avantages suivants: il permet d'obtenir de manière reproductible un anticorps à haute activité et haute sensibilité possédant une spécificité extrême à l'égard du glucagon intestinal humain et animal, ceci en

raison de la nature particulière de l'antig6ne utilisé.

L'anticorps obtenu dans ces conditions présente une excellente spécificité à l'égard du glucagon intestinal comme on le verra ci-après; il permet de doser le glucagon intestinal humain avec une grande exactitude par la méthode de radioimmunotest. Cet

anticorps peut également être utilisé pour la technique d'immuno-

test enzymatique (ITE), la technique d'immunotest par fluorescence (ITF), etc., à condition de marquer par une enzyme ou par une substance fluorescente. En outre, on peut préparer à partir de cet anticorps un anticorps insoluble en le faisant réagir avec une

substance insolubilisante connue.

Les exemples qui suivent illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée; dans ces exemples, les indications de parties et de pourcentages s'entendent en poids, sauf mention

contraire.

D'autre part, les valeurs de Rf données dans les préparations ci-après ont été mesurées par chromatographie sur couche mince sur gel de silice avec les mélanges solvants ci-après Rf... 1-butanol/acide acétique/eau, 4:1:5 Rf... 1-butanol/pyridine/acide acétique/eau, 31:20:6:24 On décrira en premier lieu la préparation du

peptide de formule générale (I).

(1) Préparation de Z-Ile-Ala-OH: On ajoute 10,87 g de Z-Ile-OSu en solution dans 50 ml de tétrahydrofuranne à 30 ml d'une solution aqueuse contenant 2,67 g

de H-Ala-OH et 4,20 ml de triéthylamine en refroidissant à la glace.

On agite la. solution à température ambiante pendant 20 h puis on distille le solvant. On redissout le résidu dans 100 ml de solution

aqueuse de triéthylamine à 27. et on lave à trois reprises par-

l'acétate d'éthyle. L'acidification de la solution aqueuse par l'acide citrique 3 N donne un précipité huileux qu'on extrait par l'acétate d'éthyle. On lave l'extrait par l'acide citrique N puis

une saumure saturée et on distille le solvant. Le résidu est soli-

difié dans un mélange méthanol-éther; rendement 6,5 g du produit

recherché fondant à 156-161 C; [ra _29$40 (C 1,0; méthanol).

(2) Préparation de Z-Asn-Ile-Ala-OlH: On soumet 3,36 g de Z-Ile-Ala-OH à réduction catalytique dans un mélange de 20 ml de méthanol et 15 ml d'eau en présence de noir de palladium. On dissout le dipeptide formé dans 20 ml d'eau contenant 1,4 ml de triéthylamine et 16 ml de tétrahydrofuranne et on refroidit à -10 C. A cette solution, on ajoute un anhydride mixte

obtenu à partir de 3,46 g de Z-Asn-OH, 1,67 ml de chloroformiate d'iso-

butyle et 1,42 ml de N-méthylmorpholine à -10 C dans un mélange de ml de diméthylformamide et 20 ml de tétrahydrofuranne. On agite le mélange de réaction à O C pendant 5 min, puis à 15 C pendant min et on distille le solvant. On aJoute de l'acide citrique N au résidu; on lave le précipité qui s'est formé à l'eau, on le sèche et on reprécipite dans un mélange méthanol-acétate d'éthyie pour le purifier. On obtient 3,60 g du produit recherché fondant à 240-244 C

(d19omposition); [a]9 = 138 (C = 1,0; dimthylformamide).

(décomposition); [a]D -13 80 (C =1,0; diméthylformamide).

(3) Préparation de Z-Asn-Asn-Ile-Ala-OH: On dissout 4,74 g de Z-Asn-IleAla-OH dans 20 ml d'acide acétique glacial. On ajoute 25 mi de bromure d'hydrogène à % dans l'acide acétique et on abandonne à température ambiante pendant 1 h. On forme un précipité par addition d'éther anhydre, on filtre le précipité, on le lave à l'éther et on sèche sur hydroxyde de potassium. Le produit duquel on a éliminé le groupe carbobenzoxy est dissous dans 50 ml de diméthylformamide contenant 3,08 ml de triéthylamine; on refroidit à -10 C. On ajoute à cette solution un anhydride mixte de Z-Asn préparé à partir de 4,18 g de Z-Asn-OH, 1,60 ml de N-méthylmorpholine et du chloroformiate d'isobutyle. On termine comme en (2) ci-dessus; on obtient 3,60 g du produit recherché fondant à 235 C (décomposition); [a]23 = -10,10 (C = 0,5; acide

acétique à 80%).

(4) Préparation de Z-Lys(Tos)-Asn-Asn-Ile-Ala-OH: On dissout 3,41 g de ZAsn-Asn-Ile-Ala-OH dans 15 ml d'acide acétique glacial et on ajoute 25 ml de bromure d'hydrogène à % dans l'acide acétique afin d'éliminer le groupe carbobenzoxy comme en (3) ci-dessus. Le produit obtenu est dissous dans 30 ml de diméthylformamide contenant 1,70 mi de triéthylamineo A cette solution, on ajoute un anhydride mixte obtenu à partir de 3,13 g de Z-Lys(Tos)-OH,

0,73 ml de N-méthylmorpholine et 0,95 g de chloroformiate d'isobutyle.

En opérant ensuite comme décrit en (2) ci-dessus, on obtient 4,01 g du produit recherché fondant à 229-2300C (décomposition); [a]3 = 19 40 D

(C = 1,0; diméthylformamide).

(5) Préparation de Z-Arg-(N02)-Asn-Lys(Tos)-Asn-Asn-Ile-Ala-OH: On dissout 2,03 g de Z-Lys(Tos)-Asn-Asn-Ile-Ala-OH dans ml d'acide acétique glacial. On ajoute ensuite 20 ml de bromure d'hydrogène à 25% dans l'acide acétiqueafin d'éliminer le groupe

carbobenzoxy comme décrit en (2) ci-dessus.

D'autre part, on maintient 4,19 g de Z-Arg-(N02)-Asn-

N2H2-Boc dans l'acide trifluoroacétique pendant 30 min à température ambiante afin d'éliminer le groupe Boc, puis on dissout dans 20 ml de diméthylformamide. A cette solution, on ajoute successivement 3,61 ml d'acide chlorhydrique 6 N dans le dioxanne et 0,96 mi de nitrite d'isoamyle à -15 C et on agite le mélange à -10 C pendant s, puis on règle à pH 7,5. On ajoute cette solution à -10 C à 30 ml de la solution du produit décarbobenzoxylé ci-dessus en solution dans le diméthylformamide et 064 ml de triéthylamine et on agite

le mélange de réaction à 4 C pendant 20 h puis on élimine le solvant.

On ajoute au résidu de l'acide acétique à 10%; on recueille la substance solide par filtration, on la lave à l'eau, on la sèche et on la reprécipite dans le mélange méthanol-acétate d'éthyle; rendement: 2,19 g du produit recherché fondant à 232-234 C;

[a]D = -14,3 (C = 1,0; acide acétique à 80%).

(6) Préparation de Z-Lys(Tos)-Arg-Asn-Lys-(Tos)-Asn-Asn-Ile-Ala-0H: On élimine le groupe carbobenzoxy dans 2,14 g de Z-Arg-(N02)-Asn-Lys(Tos)Asn-Asn-Ile-Ala-OH par réduction catalytique

dans 50 ml d'acide acétique à 50% en présence de noir de palladium.

On dissout le produit obtenu dans 20 ml de diméthylformamide cente-

nant 2,52 ml de triéthylamine. A cette solution, on ajoute le Z-Lys(Tos)OSu préparé par réaction de 2,40 g de Z-Lys(Tos)-OH

avec O,64 g de N-hydroxysuccinimide en présence de 1,14 g de dicyclo-

hexylcarbodiimide sans purification. On agite le mélange de réaction

à température ambiante pendant 20 h, puis on distille le solvant.

On agite au résidu de l'acide acétique à 10%; il y a précipitation d'une substance solide; rendement: 1,42 g du produit recherché

fondant à 200-204 C; [a]3 = _30,5o (C = 1,0; acide acétique à 80%).

(7) Préparation de Boc-Leu-Met-Asn-Thr-Lys(Tos)-Arg-Asn-Lys(Tos)-

Asn-Asn-Ile-Ala-OR:

On dissout 1,38 g de Z-Lys(Tos)-Arg-Asn-Lys(Tos)-Asn-Asn-

Ile-Ala-OH dans 5 ml d'acide acétique glacial et on ajoute 7 ml de bromure d'hydrogène à 25% dans l'acide acétique afin d'éliminer le

groupe carbobenzoxy comme décrit en (3) ci-dessus.

On dissout 1,75 g de Boc-Leu-Met-Asn-ThrN2H3 dans 2 3

ml de diméthylformamide et on traite par 1,43 ml d'acide chlorhy-

drique 6 N dans le dioxanne et 0,38 ml de nitrite d'isoamyle comme

2482-861

décrit en (5) ci-dessus, puis on ajoute à 15 ml de diméthylformamide contenant le produit décarbobenzoxylé décrit ci-dessus et 0,28 ml de triéthylamine. On agite le mélange de réaction à 4 C pendant h, puis on distille le solvant. On soumet le résidu à une opération de distribution à contre-courant dans un système o-butanol/acide acétique à 2%, on recueille la couche de 1-butanol et on distille le solvant. On ajoute de l'acétate d'éthyle au résidu et on lave la substance solide avec du méthanol; rendement: 1,10 g du produit

recherché; valeur de Rf = 0,28.

f

(8) Préparation de Boc-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Lys(Tos)-Arg-Asn-Lys(Tos)-

Asn-Asn-Ile-Ala-OH:

On abandonne 1,05 g de Boc-Leu-Met-Asn-Thr-Lys(Tos)-

Arg-Asn-Ile-Ala-OH dans 6 ml d'acide trifluoroacétique à température ambiante pendant 30 min, et on ajoute de l'éther sec. On filtre le précipité formé, on le lave à l'éther et on le sèche sous vide sur hydroxyde de potassium; on obtient ainsi le produit débarrassé du

groupe Boc.

On dissout du Boc-Trp-OSu (préparé par réaction de 700 mg de Boc-Trp-OH avec 265 mg de N-hydroxysuccinimide en présence de 475 mg de dicyclohexylcarbodiimide) dans 20 ml de dioxanne, et on ajoute cette solution à 15 ml d'une solution du produit débarrassé du groupe Boc cidessus, en solution dans le din6thylformamide, et

0,16 ml de triéthylamine. On agite le mélange de réaction à tempé-

rature ambiante pendant 24 h, puis on distille le solvant. On ajoute de l'acétate d'éthyle au résidu; on lave la substance solide à

l'éthanol; on obtient 798 mg du produit recherché; R = 0,44.

f (9) Préparation de Boc-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Lys(Tos)-Arg-Asn Lys(Tos)-Asn-Asn-Ile-Ala-OH:

On traite 777 mg de Boc-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Lys(Tos)-

Arg-Asn-Lys(Tos)-Asn-Asn-Ile-Ala-OH dans 4 ml d'acide trifluoro-

acétique afin d'éliminer le groupe Boc comme en (8) ci-dessus.

On ajoute une solution de 513 mg de Boc-Val-Gln-OSu dans 10 ml de diméthylformamide à une solution du produit débarrassé du groupe Boc cidessus et 0,02 ml de triéthylamine dans 5 ml de diméthylformamide. On agite ce mélange de réaction à température ambiante pendant 24 h puis on distille le solvant. On ajoute au résidu de l'acide acétique à 10% et on lave la substance solide à l'eau et à l'éthanol; rendement: 662 mg du produit recherché; RIf =0,26.

(10) Préparation de H-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-

Asn-Thr-Lys(Tos)-Arg-Asn-Lys(Tos)-Asn-Asn-Ile-Ala-OH: On abandonne à température ambiante pendant 40 min

645 mg de Boc-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Lys(Tos)-Arg-Asn-Lys(Tos)-

Asn-Asn-Ile-Ala-OH en présence de 4 ml d'acide trifluoroacétique, 0,4ml d'éthanedithiol et 0,2 ml d'anisole afin d'éliminer le groupe

Boc comme décrit en (8) ci-dessus.

On dissout 783 mg de Boc-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-N2H3 (fondant à 158163 C (décomposition); [a]2 = -1,00 (C = 1,0; diméthylsulfoxyde) dans 10 ml de diméthylformamide et, après addition de 0,35 ml d'acide chlorhydrique 6 N dans le dioxanne à -15 C, on ajoute encore 0,09 ml de nitrite d'isoamyle. On agite la solution

à -10 C pendant 5 min, puis on règle le pH à 7,5 par la triéthyl-

amine. On ajoute la solution obtenue à une solution du produit débarrassé du groupe Boc ci-dessus et 0,12 ml de triéthylamine dans - 10 ml'de diméthylformamide à -10 C. On agite le mélange de réaction à 4 C pendant 20 h, puis on distille le solvant. On provoque la solidification du résidu par addition d'acétate d'éthyle, on filtre

et on sèche.

On soumet ce produit de réaction sans autre purification à

l'élimination du groupe Boc pars5 ml d'acide trifluoroacétique en pré-

sence deO0,5ml d'éthanedithiol. Le produit débarrassé du groupe Boc est dissous dans 20 ml d'un mélange l-butanol/méthanol/eau, 1:1:1, et la solution jetée sur une colonne de résine Amberlite IRA-410 (2x4 cm) afin de convertir le produit en-acétate. On lyophilise l'acétate, on redissout dans l'acide acétique M, on jette sur une colonne de Sephadex G25 (3x190 cm), et on soumet à filtration sur gel en utilisant l'acide acétique M comme éluant. On recueille les fractions contenant le produit final (n 64 à 80), et on distille le solvant puis on lyophilise le résidu. On le redissout dans 5 ml de la couche inférieure d'un système de partage 1butanol/acide acétique/eau, 4:1:5, et on purifie par une technique de distribution goutte à goutte à contre-courant en utilisant une-couche supérieure du même système solvant. On recueille les fractions contenant le produit final et on distille le solvant puis on lyophilise; rendement: 260 mg

I = _,0I,5

du produit recherché; Rf = 0,20; Rf = 0,65.

Analyse des aminoacides du produit décompbsé à l'acide: Lys (2) 2,11, Arg (3) 2,60, Asp (5) 4,74, Thr (1) 0,87, Arg (2) 2,08, Ala (2) 2,17, Val (1) 1,18, Met (1) 1,03, Ile (1) 0,95,

Leu (1) 1,02, Phe (1) 1,06.

(11) Préaration de H-Ser-Lys(Tos)-Tyr-Leu-Asp-S er-Arg-Arg-Ala-Gn-

Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Lys(Tos) -Arg-Asn-Lys(Tos) -

Asn-Asn-Ile-Ala-OH:

On condense 485 mg de Boc-Ser-Lys(Tos)-Tyr-Leu-Asp-Ser-

N2H3 (fondant à 174-175 C (décomposition); [a]D= 21,8o (C = 1,0;

diméthylformamide)) avec H-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-

Met-Asn-Thr-Lys(Tos)-Arg-Asn-Lys(Tos)-Asn-Asn-Ile-Ala-OH par un mode opératoire a l'azide en utilisant 0,15 ml d'acide chlorhydrique 6 N dans le dioxanne et 0,31 ml d'une solution de nitrate d'isoamyle

à 20% dans le diméthylformamide comme décrit en (10) ci-dessus.

Lorsque la réaction est terminée, on distille le solvant. L'addi-

tion d'acétate d'éthyle provoque la solidification. On redissout le produit brut dans 5 ml de la couche inférieure d'un système de partage (1butanol/acide acétique/eau, 4:1:5), et on soumet à une opération de distribution à contre-courant au goutte à goutte pour purification. On recueille les fractions contenant le produit final et on distille le solvant. On redissout le résidu dans 7 ml d'un mélange 1butanol/méthanol/eau, 1:1:1, et on jette sur une colonne de Sephadex LH 20 (3 x 108 cm) sur laquelle on procède à une filtration sur gel avec un mélange l-butanol/méthanol/eau, 1:1:1 comme éluant. On recueille les fractions contenant le produit final et on distille le solvant. On provoque la solidification en ajoutant de l'acétate d'éthyle au résidu. Le produit solidifié est traité par 3 ml d'acide trifluoroacétique et 0,2 ml d'éthane-dithiol

248 286 1

pour élimination du groupe Boc. Après cette élimination et séchage du produit, on le dissout dans 5 ml d'acide acétique M et on jette sur une colonne de Sephadex G50 (3 x 145 cm) sur laquelle on procède à une filtration sur gel avec l'acide acétique M comme éluant. On recueille les fractions contenant le produit recherché (n 43 à 57) et on distille le solvant. La lyophilisation du résidu donne 93 mg

du produit recherché; RI = 0,25; RII = 0,54.

Analyse des aminoacides du produit décomposé à l'acide

(HC1 6 N; 110 C; 24 h): -

Lys (3) 2,80, Arg (3) 2,89, Asp (6) 6,10, Thr (1) 0,97, Ser (2) 1,79, Glu (2) 2,06, Ala (2) 2,03, Val (1) 0,99, Met (1) 0,87, Ile (1) 1,00, Leu (2) 1,98, Thr (1) 1,00,

Phe (1) 1,00.

(12) Préparation de H-Lys-Arg-Asn-Lys-Asn-Asn-Ile-Ala-0H:

On dissout 25 mg de Z-Lys(Tos)-Arg-Asn-Lys(Tos)-Asn-Asn-Ile-

Ala-OH dans 30 ml d'ammoniac liquéfié et on ajoute du sodium métal-

lique en petits morceaux. Lorsque la solution de réaction a pris une coloration bleue, on ajoute 0,5 g de chlorure d'ammonium sec et on distille l'ammoniac. On redissout le résidu dans l'acide acétique M et on soumet à filtration sur gel sur Sephadex G10 (4 x 43 cm) en utilisant l'acide acétique M comme éluant. On recueille les fractions

* contenant le produit final et on distille le solvant, puis on lyophi-

lise le résidu; rendement: 10 mg du produit recherché; R = 0,01; II

RfI 0,27.

Analyse des aminoacides du produit décomposé à l'acide: Lys (2) 1,84, Arg (1) 0,94, Asp (3) 3,08,

Ala (1) 1,08, Ile (1) 1,05.

(13) Préparation de H-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Lys-Arg-Asn-Lvs-

Asn-Asn-Ile-Ala-OH:

On traite 10 mg de Boc-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-

Lys(Tos)-Arg-Asn-Lys(Tos)-Asn-Asn-Ile-Ala-OH dans 1 ml d'acide trifluoroacétique et 0,1 ml d'éthane-dithiol afin d'éliminer le groupe Boc, puis on traite par le sodium métallique dans l'ammoniac liquéfié comme décrit en (12) ci-dessus afin d'éliminer les groupes protecteurs. La purification par filtration sur gel donne 5 mg du produit recherché; R O; Rf 49; [a]2D3 -50 (C = 007;

acide acétique M).

(14) Préparation de H-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met- AsnThr-Lys-Arg-Asn-Lys-Asn-Asn-Ile-Ala-OH:

On traite 100 mg de H-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-

Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Lys(Tos)-Arg-Asn-Lys(Tos)-Asn-Asn-Ile-Ala-OH comme décrit en (12) afin d'éliminer tous les groupes protecteurs. La

purification par filtration sur gel donne 40 mg du produit recher-

I II0 U "-23

ché; RIf=0,20; RfI=0,51; [a]D =46,3o (c-=O,2,.acide acétique M).

(15) Préparation de H-Ser-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-

Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Lys-Arg-Asn-Lys-Asn-Asn-Ile-Ala-OH:

On traite 10 mg de H-Ser-Lys(Tos)-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-

Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Lys(Tos)-Arg-Asn-Lys(Tos) -

Asn-Asn-Ile-Ala-OH comme décrit en (12) ci-dessus afin d'éliminer la totalité des groupes protecteurs, puis on soumet à filtration sur gel de Sephadex G-50 (2,5 x 135 cm) en utilisant l'acide acétique M comme éluant. On recueille les fractions contenant le produit recherché et on lyophilise; rendement: 4 mg du produit recherché; I il 23

R = 0,20; RI 049; [a]23 -60,9 (C = 0,1; acide acétique M).

f Rf 0 [

On décrira maintenant la préparation d'un anticorps.

EXEMPLE 1

On dissout 10 mg du peptide obtenu dans la préparation (14) ci-dessus (qu'on appellera "Peptide A" ci-après pour des raisons de commodité) et 5 mg de sérum-albumine de bovin (en abrégé ci-après "BSA") dans 2 ml de solution tampon h l'acétate d'ammonium (0,1 M;

pH 7,0) et on ajoute 0,11 ml d'une solution 0,1 M d'aldéhyde gluta-

rique; on agite à température ambiante pendant 5 h. On dialyse le mélange de réaction pendant 48 h à 4 C en utilisant 1 litre d'eau et en changeant l'eau cinq fois. La solution obtenue contenant le complexe peptideprotéine est ensuite lyophilisée; on obtient 14 mg

de l'antigène du glucagon intestinal (en abrégé ci-après "antigène I").

On soumet l'antigène I à filtration sur gel de Sephadex G-50 (éluant: sérum physiologique; détection: DO 280 nm; vitesse d'élution: 3 ml/h; quantité traitée: portion de 1 ml). On sépare la fraction [I] contenant le peptide A fixé sur la BSA de la fraction [II] contenant un autre produit (dimère du peptide A), et on dialyse la fraction [I] contre une solution aqueuse de chlorure de sodium à 0,6% à 4 C pendant 24 h, puis on lyophilise; on obtient

7 mg d'un complexe peptide A-BSA pulvérulent blanc (en abrégé ci-

après "antigène I' "). Il s'agit d'un complexe de 1 mole de BSA couplée avec en moyenne 13 moles de peptide A. Ce rapport de fixation

a été déterminé de la manière suivante.

On a d'abord établi une courte d'étalonnage pour la concentration du dimère du peptide A en se basant sur le fait qu'on ne retrouve pas de BSA ni de peptide A non convertis et, à partir de la courbe d'étalonnage, on détermine la quantité du dimère de peptide A qui se trouve dans la fraction ci-dessus. On déduit cette quantité de la quantité de peptide A introduite à l'origine. Et on suppose que cette quantité correspond à la quantité de peptide A

couplée avec la BSA.

EXEMPLE 2

On dissout 5 mg du peptide H-Leu-Met-Asn-Thr-Lys-Arg-

Asn-Lys-Ash-Asn-IIe-Ala-OH obtenu comme décrit dans les préparations cidessus (en abrégé ci-après "peptide B'i) et 5 mg de BSA dans 2 ml de tampon à l'acétate d'ammonium (0,1 M; pH 7,0). On ajoute à cette solution 0,11 ml d'une solution 0,1 M d'aldéhyde glutarique puis on agite à température ambiante pendant 5 h. On dialyse ensuite ce mélange de réaction contre 1 litre d'eau à 4 C pendant 48 h durant lesquelles l'eau est changée cinq fois. On lyophilise la solution obtenue contenant le complexe peptide-protéine; on obtient 9 mg

d'un antigène du glucagon intestinal (en abrégé ci-après "antigène II").

Cet antigène Il a été soumis à filtration sur gel de Sephadex G-50, ce qui a permis de séparer la fraction [I] contenant le peptide B couplé avec la BSA de la fraction [II] contenant un autre produit (dimère du peptide B); on a dialysé la fraction [I] contre du sérum physiologique à 0,6% à 4 C pendant 24 h, puis on a lyophilisé; on a obtenu 6 mg de complexe peptide B-BSA pulvérulent blanc. Il s'agit d'un complexe de 1 mole de BSA avec en moyenne

moles de peptide B couplé.

EXEMPLE 3

On dissout 4 mg du peptide obtenu dans la préparation (12) ci-dessus (en abrégé ci-après "peptide C") et 5 mg de BSA dans

2 ml d'une solution tampon à l'acétate d'ammonium (0,1 M; pH 7,0).

A cette solution, on ajoute 0,11 ml d'une solution 0,1 M d'aldéhyde glutarique puis on agite à température ambiante pendant 5 h. On dialyse ensuite le mélange de réaction contre 1 litre d'eau à 4 C pendant 48 h en changeant l'eau cinq fois pendant ce temps. On lyophilise la solution contenant le complexe peptide-protéine; on

obtient 7,5 mg d'un antigène du glucagon intestinal (en abrégé ci-

après "antigène III").

Cet antigène III est encore soumis à filtration sur gel de Sephadex G-50; on sépare la fraction [I] contenant le peptide C couplé à la BSA de la fraction [II] contenant un autre produit (dimère du peptide C) et on dialyse la fraction [I] contre du sérum physiologique à 0,6% à 4 C pendant 24 h; la lyophilisation donne 5,5 mg d'un complexe peptide C-BSA pulvérulent blanc. Il s'agit d'un complexe de 1 mole de BSA avec en moyenne 8 moles de peptide C couplé.

EXEMPLE 4

On dissout 4 mg du peptide H-Lys-Lys-Arg-Asn-Lys-Asn-

Asn-Ile-Ala-OH obtenu dans les préparations ci-dessus (en abrégé ci-après "peptide D") et 5 mg de BSA dans 2 ml de solution tampon à l'acétate d'ammonium (0,1 M; pH 7,0). A cette solution, on ajoute 0,11 ml d'une solution 0,1 M d'aldéhyde glutarique et on agite à température ambiante pendant 5 h. On dialyse ensuite le mélange de réaction contre 1 litre d'eau à 4 C pendant 48 h pendant lesquelles on change l'eau cinq fois. On lyophilise la solution obtenue contenant le complexe peptide-protéine; on obtient 8 mg d'un antigène du

glucagon intestinal (en abrégé ci-après "antigène IV").

On soumet cet antigène IV à filtration sur gel de Sephadex G-50; on sépare la fraction [I] contenant le peptide D fixé à la BSA et la fraction [II] contenant un autre produit (dimère du peptide D); on dialyse la fraction [I] contre du sérum physiologique à 0,6% à 4 C pendant 24 h et on lyophilise; on obtient 6 mg d'un complexe peptide D- BSA pulvérulent blanc. Il s'agit d'un complexe

de 1 mole de BSA avec en moyenne 9 moles de peptide D couplé.

EXEMPLE 5

On dissout 4 mg du peptide H-Tyr-Lys-Arg-Asn-Lys-Asn-

Asn-Ile-Ala-OH obtenu dans les préparations ci-dessus (en abrigé ci-après "peptide E") et 5 mg de BSA dans 2 ml de solution tampon à l'acétate d'ammonium (0,1 M; pH 7,0). A cette solution, on ajoute 0,11 ml d'une solution 0.1 M d'aldéhyde glutazique puis on agite à température ambiante pendant 5 h. On dialyse le mélange de réaction contre 1 litre d'eau à 4 C pendant 48 h durant lesquelles on change l'eau cinq fois. On lyophilise la solution obtenue contenant le complexe peptide-protéine; on obtient 7 mg d'un antigène du glucagon

intestinal (en abrégé ci-après "antigène V").

Cet antigène V est soumis à filtration sur gel de Sephadex G-50; on sépare la fraction [I] contenant le peptide E fixé sur la BSA et la fraction [II] contenant un autre produit (dimère

du peptide E); on dialyse la fraction [I] contre du sérum physiolo-

gique à 0,6% à 4 C pendant 24 h et on lyophilise; on obtient 5 mg d'un complexe peptide E-BSA pulvérulent blanc. Il s'agit d'un complexe de

1 mole de BSA avec en moyenne 6 moles de peptide E couple.

EXEMPLE 6

On dissout 5 mg du peptide H-Gly-Lys-Lys-Arg-Asn-Lys-

Asn-Asn-Ile-Ala-OH obtenu dans les préparations ci-dessus (en abrégé ciaprès "peptide F") et 5 mg de BSA dans 2 ml de solution tampon à l'acétate d'ammonium (0,1 M; pH 7,0). A cette solution, on ajoute 0,11 ml d'une solution 0,1 M d'aldéhyde glutarique puis on agite à température ambiante pendant 5 h. On dialyse le mélange de réaction contre 1 litre d'eau à 4 C pendant 48 h durant lesquelles on change l'eau cinq fois. On lyophilise la solution obtenue contenant le complexe peptide-protéine; on obtient 9 mg d'un antigène du glucagon

intestinal (en abrégé ci-après "antigène VI").

On soumet cet antigène VI, filtration sur gel de Sephadex G-50; on sépare la fraction [I]'contenant le peptide F fixé sur la BSA et la fraction [II] contenant un autre produit (dimère du peptide F); on dialyse la fraction [I] contre du sérum physiologique à 0,6% à 4 C pendant 24 h et on lyophilise; on obtient 6 mg de complexe peptide F-BSA pulvérulent blanc. Il s'agit d'un complexe

de 1 mole de BSA avec en moyenne 14 moles de peptide F couplé.

EXEMPLE 7

On dissout 4 mg du peptide H-Ala-Lys-Arg-Asn-Lys-Asn-

Asn-Ile-Ala-OH obtenu dans les préparations ci-dessus (en abrégé ci-après "peptide G") et 5 mg de BSA dans 2 ml de solution tampon à l'acétate d'ammonium (0,1 M; pHli 7,0). A cette solution, on ajoute 0,11 ml d'une solution 0,1 M d'aldéhyde glutarique puis on agite à température ambiante pendant 5 h. On dialyse ensuite le mélange de réaction contre 1 litre d'eau à 4 C pendant 48 durant lesquelles on change l'eau cinq fois. On lyophilise la solution obtenue contenant le complexe peptide-protéine; on obtient 7,5 mg d'un antigène du

glucagon intestinal (en abrégé ci-après "antigène VII").

On soumet cet antigène VII à filtration sur gel de Sephadex G-50; on sépare la fraction [I] contenant le peptide G fixé sur la BSA et la fraction [II] contenant un autre produit (dimère

du peptide G); on dialyse la fraction [I] contre du sérum physiolo-

gique à 0,6% à 4 C pendant 24 h puis on lyophilise; on obtient 5,5 mg de complexe peptide G-BSA pulvérulent blanc. Il s'agit d'un complexe

de 1 mole de BSA avec en moyenne 9 moles de peptide G couplé.

EXEMPLE 8

On dissout 4 mg du peptide H-Gly-Lys-Arg-Asn-Lys-Asn-

Asn-Ile-Ala-OH obtenu dans les préparations ci-dessus (en abrégé ci-après "peptide H") et 5 mg de BSA dans 2 ml de solution tampon b l'acétate d'ammonium (O,1 M; pH 7,0). A cette solution, on ajoute 0,11 ml d'une solution 0,1 M d'aldéhyde glutarique puis on agite-à température ambiante pendant 5 h. On dialyse ensuite le mélange de

-2482861

réaction contre 1 litre d'eau à 4 C pendant 48 h durant lesquelles

on change l'eau cinq fois. On lyophilise la solution obtenue conte-

nant le complexe peptide-protéine; on obtient 7,5 mg d'un antigène

du glucagon intestinal (en abrégé ci-après "antigène VIII").

Cet antigène VIII estsoumis à filtration sur gel de Sephadex G-50; on sépare la fraction [I] contenant le peptide H fixé sur la BSA et la fraction [II] contenant un autre produit (dimère

du peptide H) et on dialyse la fraction [I] contre du sérum physio-

logique à 0,6% à 4 C pendant 24 h, puis on lyophilise; on obtient 6 mg de complexe peptide H-BSA pulvérulent blanc. Il s'agit d'un complexe de 1 mole de BSA avec en moyenne 10 moles du peptide H couplé.

EXEMPLE 9

On dissout 12 mg du peptide obtenu dans la préparation (15) ci-dessus (en abrégé ci-après "peptide I") et 5 mg de BSA dans 2 ml de solution tampon à l'acétate d'ammonium (0,1 M; pH 7,0). A cette solution, on ajoute 0,11 ml d'une solution 0,1 M d'aldéhyde glutarique puis on agite a température ambiante pendant 5 h. On dialyse ensuite le mélange de réaction contre 1 litre d'eau à 4 C pendant 48 h durant lesquelles on change l'eau cinq fois. La solution obtenue contenant le complexe peptide-protéine est lyophilisée; on

obtient 15 mg d'un antigène du glucagon intestinal (en abrégé ci-

après "antigène IX").

On soumet cet antigène IX à filtration sur gel de Sephadex G-50; on sépare la fraction [I] contenant le peptide I fixé sur la BSA et la fraction [II] contenant un autre produit (dimère du peptide I), et'on dialyse la fraction [I] contre du sérum physiologique à 0,67. à 4 C pendant 24 h puis on lyophilise; on obtient 7,5 mg d'un complexe peptide I-BSA pulvérulent blanc. Il s'agit d'un complexe de 1 mole de BSA avec en moyenne 10 moles de

peptide I couplé.

On décrira maintenant la préparation d'un anticorps.

EXEMPLE 10

On dissout 3 mg de l'antigène I obtenu dans l'exemple 1 dans 1,5 ml de sérum physiologique et on, ajoute 1,5 ml d'Adjuvant Complet de Freund; on forme ainsi une dispersion qu'on administre par voie intradermique à trois lapins pesant 2,5 à 3 kg chacun. Les administrations aux mêmes doses sont répétées cinq fois à raison d'une fois toutes les deux semaines. En outre, on procède à cinq administrations à une dose moitié de la dose initiale une fois par mois. 10 jours après l'administration finale, on saigne les animaux immunisés et on centrifuge le sang; on sépare l'antisérum. On obtient ainsi un anticorps du glucagon intestinal selon l'invention (en

abrégé ci-après "anticorps I").

EXEMPLE l1

On dissout 3 mg de l'antigène I' obtenu dans l'exemple 1 dans 1,5 ml de sérum physiologique et on ajoute 1,5 ml d'Adjuvant Complet de Freund, formant ainsi une dispersion qu'on administre

par voie intradermique à trois lapins pesant 2,5 à 3 kg chacun.

L'administration est ensuite répétée à la même dose cinq fois, une fois toutes les deux semaines. En outre, on administre une dose

moitié de la dose initiale cinq fois à raison d'une fois par semaine.

10 jours après l'administration finale, on saigne les animaux immunisés et on sépare l'antisérum par centrifugation du sang. On obtient ainsi un anticorps du glucagon intestinal selon l'invention

(en abrégé ci-après "anticorps II").

EXEMPLE 12

On dissout 3 mg de l'antigène IX obtenu dans l'exemple 9 dans 1,5 ml de sérum physiologique et on ajoute 1,5 ml d'Adjuvant Complet de Freund formant ainsi une dispersion qu'on administre

par voie intradermique à trois lapins pesant chacun 2,5 à 3 kg.

L'administration est répétée à la même dose cinq fois à raison d'une fois toutes les deux semaines. En outre, on administre une dose moitié de la dose initiale en répétant cinq fois, une fois chaque semaine. 10 jours après l'administration finale, on saigne les animaux immunisés et on sépare l'antisérum par centrifugation du sang. On obtient ainsi un anticorps du glucagon intestinal selon

l'invention (en abrégé ci-après "anticorps III").

EXEMPLE 13

On dissout 3 mg de l'antigène II obtenu dans l'exemple 2 dans 1,5 ml de sérum physiologique et on ajoute 1,5 ml d'Adjuvant Complet de Freund, formant ainsi une dispersion qu'on administre

par voie intradermique à trois lapins pesant chacun 2,5 à 3 kg.

L'administration est ensuite répétée A la même dose cinq fois à raison d'une fois toutes les deux semaines. En outre, on admi-nistre une dose moitié de la dose initiale en répétant cinq fois à rai'or d'une fois par semaine. 10 jours après l'administration finale, les

animaux immunisés sont saignés et l'antisérum est séparé par centri-

fugation du sang. On obtient ainsi un anticorps du gluCagon intes-

tinal selon l'invention (en abrégé ci-après "anticorps IV").

EXEMPLE 14

On dissout 3 mg de l'antigène III obtenu dans l'exemple 3 dans 1,5 ml de sérum physiologique et on ajoute 1,5 ml d'Adjuvant Complet de Freund, formant ainsi une dispersion qu'on administre

par voie intradermique à trois lapins pesant chacun 2,5 à 3 kg.

L'administration à la même dose est répétée cinq fois à raison d'une fois toutes les deux semaines. En outre, on administre une dose moitié de la dose initiale en répétant cinq fois à raison d'une fois par semaine. 10 jours après l'administration finale, on saigne les animaux immunisés et on sépare l'antisérum par centrifugation du sang. On obtient ainsi un anticorps du glucagon intestinal selon

l'invention (en abrégé ci-après "anticorps V").

EXEMPLE 15

Lorsqu'on traite les antigènes obtenus dans les

exemples 4 à 8 comme décrit dans l'exemple 10, on obtient des anti-

corps à haute activité et haute spécificité à l'égard du glucagon intestinal.

PREPARATION 15 (PREPARATION D'UN PEPTIDE MARQUE)

On marque le peptide H-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-

Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Lys-Arg-Asn-Lys- Asn-Asn-Ile-Ala-OH par le procédé à la chioramine T. On ajoute peu à peu

10/ul d'une solution aqueuse contenant 5 mg du peptide ci- dessus et 10/ul d'une solution aqueuse contenant 1 mc de [125I]Na (MEN) et 20/ug de chloramine T à 20/ul d'une solution de tampon phosphaté 1,0 M (pH 7,4). 30 s plus tard, on arrête la réaction en ajoutant /ul d'une solution aqueuse contenant 100/ug de métadisulfate de

sodium. On jette le mélange de réaction sur une colonne de Sephadex-

G-10 (1,0 x 30 cm) en utilisant l'acide acétique 0,1 M comme éluant.

On recueille l'éluat par portionsde 1 ml et on rassemble les fractions n 8 à 11; on obtient ainsi une solution contenant

H-Ser-Lys-[I 125-monoiodo-Tyr]-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-

Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Lys-Arg-Asn-Lys-Asn-Asn-Ile-Ala-OH.

DETERMINATION DE L'ACTIVITE DES ANTICORPS

L'activité de chacun des anticorps ainsi obtenus a été déterminée de la manière suivante: on a dilué a l'origine chacun des anticorps par du sérum physiologique, à des concentrations de 10', 102 10 3 104, 105... A 100/ul de chacune des solutions diluées, on a ajouté 100/ul de peptide marqué à l'iode 125I (préparé

par dilution de la solution décrite ci-dessus jusqu'à un comp-

tage d'environ 10.000 cpm) et 400/ul de tampon phosphaté 0,05 M (pH 7,5) [contenant 0,25% de BSA, 0,01 M d'EDTA et du Trasylol

(500 KIV/ml], et on a soumis le mélange à incubation de 66 h à 4 C.

On a séparé le complexe d'anticorps et d'antigène marqué a l'iode I du peptide non converti ou du peptide marqué mais à l'état libre à l'aide de charbon actif revêtu de dextrane en centrifugeant à 4 C à une vitesse de 3000 tr/min pendant 15 min. On a compté la radioactivité du complexe obtenu afin de déterminer le rapport de (%) du à l'iode 125 fixation (%) du peptide marqué l'iode 25I et de l'anticorps à chacune des concentrations. On a reporté le rapport de fixation à chacune des concentrations sur un graphique, avec le rapport de fixation en ordonnées et la dilution initiale de l'anticorps en abscisses. Le degré de dilution de l'anticorps auquel le rapport de

fixation est de 50% est indiqué ci-après.

Anticorps Activité Anticorps I 20000 Anticorps II 25000 Anticorps III 25000 Anticorps IV 10000 Anticorps V 5000

DETERMINATION DE LA SPECIFICITE A L'EGARD DU GLUCAGON INTESTINAL

On'a utilisé dans les essais du glucagon pancréatique la séquence peptidique 80 à 100 de la glicentine du porc et du glucagon intestinal (pic I décrit dans Kenny J., J. Clin. Endocr., , 865 (1955)) à des concentrations variées. Comme diluant pour tous les essais, on a utilisé un sérum physiologique 0,05 M en phosphate (pH 7,5) contenant 0,25%7. de BSA, 0,01 M d'EDTA, du Trasylol

(500 KIV/ml) et 0,01% de NaN3.

On a placé dans un tube à essais 400/ul de ce diluant,

/ul de chacun des échantillons de glucagon, 100 ml de l'anti-

corps I obtenu dans l'exemple 10 (activité: 20000) et 100/ul du peptide marqué à l'iode 125I (préparé par dilution du peptide marqué obtenu cidessus à un comptage d'environ 10000 cpm) et on a soumis à incubation de 66 h à 4 C. Au mélange, on a ajouté 1 ml d'une dispersion de 0,25% de charbon actif revttu de 0,0257. de -dextrane et on a soumis à incubation de 30 min à 44C. On a ensuite séparé ce mélange en peptide normal marqué à l'iode 125I et fixé sur l'anticorps et peptide normal marqué non converti ou libre par centrifugation à la vitesse de 3000 tr/min à 4 C. On a mesuré la radio-activité de chaque peptide. On a déterminé le rapport de

fixation (%) du peptide marqué à l'iode 25I pour chacun des échan-

tillons à chacune des concentrations et dilutionsen prenant une valeur de 100%. pour le rapport de fixation (Bo) correspondant à l'activité de l'anticorps utilisé. Les résultats obtenus sont représentés graphiquement sur la figure 1 des dessins annexes. Sur cette figure, on a représenté en ordonnées le rapport de fixation (%) (B/Bo x 100) et en abscisses la concentration de l'échantillon (glucagon pancréatique et séquence peptidique 80 à 100 de la glicentine de porc) et le taux de dilution du glucagon intestinal 2482861 i (pic I). Sur cette figure, la courbe (a) correspond au glucagon pancréatique, la courbe (b) à la séquence peptidique 80 à 100 de la glicentine du porc et la courbe (c) correspond au glucagon

intestinal. On peut constater que la courbe représentant la réacti-

vité de l'anticorps I avec le glucagon pancréatique se distingue clairement de la courbe représentant sa réactivité avec le glucagon intestinal. On peut en déduire que l'anticorps selon l'invention ne dmne pas de réaction secondaire avec le glucagon pancréatique et

présente donc une excellente spécificité.

On a procédé avec les anticorps III, IV et V aux mêmes déterminations de spécificité à l'égard du glucagoan intestinal de la mâme manière que décrit ci-dessus; les résultats obtenus sont représentés graphiquement sur les figures 2, 3 et 4 des dessins annexes.

La figure 2 est un graphique qui représente la spéci-

ficité de l'anticorps IiI; en ordonnées, on a représenté le rapport de fixation (%) (B/Bo x 100) et en abscisses la concentration de l'échantillon (glucagon pancréatique et séquence peptidique 74 à 100

de la glicentine de porc) et le taux de dilution du glucagon intes-

tinal (pic I), La courbe (a) correspond au glucagon pancréatique, la courbe (b) au glucagon intestinal et la courbe (d) à la séquence

peptidique 74 à 100 de la glicentine de porc.

Sur la figure 33 on a représenté graphiquement la spéci-

ficité de l'antigène IV; en ordonnées, on a représenté le rapport de fixation (%) (B/Bo x 100) et en abscisses la concentration de l'échantillon (glucagon pancréatique et séquence peptidique 89 a 100

de la glicentine de porc) et le taux de dilution du glucagon intes-

tinal (pic I). La courbe (a) correspond au glucagon pancréatique, la courbe (c) au glucagon intestinal et la courbe (e) à la séquence

peptidique 89 à 100 de la glicentine de porc.

La figure 4 représente graphiquement la spécificité de l'anticorps V; en ordonnées, on a représenté le rapport de fixation (%) (B/Bo x 100) et en abscisses la concentration de l'échantillon

(glucagon pancréatique et séquence peptidique 93 à 100 de la glicen-

tine de porc) et le taux de dilution du glucagon intestinal (pic I)o La courbe (a) correspond au glucagon pancréatique, la courbe (c) au glucagon intestinal et la courbe (f) à la séquence peptidique

93 à 100 de la glicentine de porc.

L'examen des figures 2 à 4 montre que les courbes représentant la réactivité des anticorps III, IV et V avec le glucagon pancréatique-se distinguent nettement des courbes repré- sentant la réactivité avec le glucagon intestinal. On peut en déduire que les anticorps selon l'invention ne donnent pas de réaction secondaire avec le glucagon pancréatique et possèdent une

excellente spécificité à l'égard du glucagon intestinal.

Il est clair que l'invention n'est nullement limitée aux modes de réalisation préférés décrits ci-dessus à titre d'exemples et que l'homme de l'art peut y apporter des modifications sans pour

autant sortir de son cadre.

R E V E N D I CA T I O N S

1. Procédé de préparation d'ui antigène du glucagon intestinal constitué d'un complexe peptide-support, caractérisé en ce que l'on utilise en tant que haptène un peptide répondant à la formule générale: R-Lys-Arg-Asn-LysAsn-Asn-Ile-Ala-OH

dans laquelle R représente un atome d'hydrogène, un reste d'amino-

acide ou un reste de peptide contenant de 2 à 20 restes d'aminoacide, et on le fait réagir avec un support en présence d'un agent de

fixation qui provoque la fixation mutuelle du haptène et du support.

2. Procédé de préparation d'un anticorps du glucagon intestinal, caractérisé en ce que l'on administre l'antigène selon

la revendication 1 à des mammifères et on recueille l'anticorps produit.