FR2472612A1 - PROCESS FOR OBTAINING STABLE PREPARATION HAVING IMMUNOGLOBULIN FIXATION PROPERTIES - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENTION CONCERNE UN PROCEDE POUR L'OBTENTION D'UNE PREPARATION STABLE POSSEDANT DES PROPRIETES DE FIXATION DE L'IMMUNOGLOBULINE. CE PROCEDE EST CARACTERISE EN CE QUE L'ON CULTIVE DES BACTERIES APPARTENANT AUX ESPECES POSSEDANT UNE CAPACITE DE FIXATION DE L'IMMUNOGLOBULINE AU-DELA DE CELLE BASEE SUR UNE REACTION ENTRE LES ANTIGENES DE LA BACTERIE ET LES ANTICORPS SPECIFIQUES CORRESPONDANT A CES ANTIGENES, PAR EXEMPLE LE STAPHYLOCOCCUS AUREUS OU LE STREPTOCOCCUS PYOGENES, SUR UN SUBSTRAT DANS LEQUEL LES BACTERIES FORMENT UNE SUBSTANCE DE FIXATION D'IMMUNOGLOBULINE, ON TUE LES BACTERIES PORTANT LADITE SUBSTANCE, SANS AUTRE TRAITEMENT PREALABLE QU'UN LAVAGE ET LES BACTERIES TUEES SONT LYOPHILISEES POUR OBTENIR UNE SUSPENSION DE BACTERIES QUI PEUT ETRE RECONSTITUEE AVEC UN LIQUIDE.THE PRESENT INVENTION CONCERNS A PROCESS FOR OBTAINING A STABLE PREPARATION HAVING BINDING PROPERTIES OF IMMUNOGLOBULIN. THIS PROCESS IS CHARACTERIZED IN THAT BACTERIA BELONGING TO SPECIES WITH A CAPACITY OF BINDING IMMUNOGLOBULIN BEYOND THAT BASED ON A REACTION BETWEEN THE BACTERIAL ANTIGENS AND THE SPECIFIC ANTIBODIES CORRESPONDING TO THESE ANTIBODIES, THEREFORE. EXAMPLE STAPHYLOCOCCUS AUREUS OR PYOGENIC STREPTOCOCCUS, ON A SUBSTRATE IN WHICH THE BACTERIA FORM AN IMMUNOGLOBULIN BINDING SUBSTANCE, THE BACTERIA BEARING THE SUCH SUBSTANCE, WITHOUT FURTHER PRIOR TREATMENT, AND WHICH IS OBTAINED FOR LAVAGE, ARE KILLED SUSPENSION OF BACTERIA WHICH CAN BE RECONSTITUTED WITH A LIQUID.

Description

La plupart des souches de Staphylococcus aureus contien-Most strains of Staphylococcus aureus contain

nent une protéine, désignée par protéine A, partiellement sous  a protein, referred to as protein A, partially under

forme d'une substance liée à l'extérieur de la paroi de la cel-  form of a substance bound to the outside of the cell wall

lule et d'autre part sous forme d'une substance soluble excrétée dans le milieu de culture de la bactérie. A l'origine,la protéine  lule and secondly in the form of a soluble substance excreted in the culture medium of the bacterium. Originally, the protein

A était obtenue sous forme soluble après un processus d'extrac-  A was obtained in soluble form after an extraction process.

tion thermique initial de la bactérie lavée. Par chauffage des staphylocoques en suspension, au voisinage du point d'ébullition la protéine A de la paroi cellulaire était solubilisée.vers le milieu des années 1960 il fut démontré de nombreuses manières que des anticorps de l'homme et de nombreux mammifères,dont on peut montrer qu'ils réagissent avec la protéine A soluble de manière telle qu'il apparaît un précipité, prennent part à la réaction,  initial thermal reaction of the washed bacterium. By heating the staphylococci in suspension, near the boiling point protein A of the cell wall was solubilized. By the mid-1960s it was demonstrated in many ways that human antibodies and many mammals, of which can show that they react with the soluble protein A in such a way that a precipitate appears, take part in the reaction,

non pas en raison d'une immunisation préalable résultant d'anti-  not because of previous immunization resulting from

corps vis-à -vis des structures de la protéine A, raisonnement qui aurait pu se concevoir si l'on considère la présence générale du Staphyloccocus aureus dans 1 'environnement, mais en raison du fait que la protéine A comportant au moins un récepteur pour une structure présente dans la portion en Fc d'une large fraction des molécules d'anticorps (immunoglobuline) chez l'homme et  body with respect to the structures of protein A, a reasoning that could have been conceived if one considers the general presence of Staphyloccocus aureus in the environment, but because protein A has at least one receptor for a structure present in the Fc portion of a large fraction of the antibody (immunoglobulin) molecules in humans and

chez tous les mammifères, quelle que soit la direction vers la-  in all mammals, irrespective of the direction to

quelle sont orientés ces anticorps réactifs vis-à-vis de la pro-  what are these reactive antibodies directed towards the

téine A en vertu des structures de fixation d'antigènes de leurs portions FaB. Chez l'homme et certains mammifères tels que le lapin, le cobaye, le porc,le chien et le singe, plus de 90% de l'immunoglobuline G sont réactifs avec la protéine A. Il a été démontré que des staphylocoques contenant de la protéine A, préparés d'une manière convenable, peuvent être  A protein under the antigen binding structures of their FaB portions. In humans and some mammals such as rabbit, guinea pig, pig, dog and monkey, more than 90% of immunoglobulin G is reactive with protein A. Staphylococci containing protein A, prepared in a suitable manner, may be

appliqués de diverses manières dans un certain nombre de métho-  applied in a number of ways in a number of ways.

des de laboratoire d'immunologie, en tant que réactifs de fixa-  immunology laboratory, as reagents for

tion de l'immunoglobuline, présentant l'avantage propre d'être une phase solide naturelle finement dispersée et possédant en  immunoglobulin, which has the advantage of being a natural solid phase finely dispersed and

plus la capacité de fixer les molécules d'anticorps très rapi-  plus the ability to fix antibody molecules very quickly

dement,qu'elles. aient ou non déjà fixé les antigènes. Il doit être bien clair qu'une molécule d'anticorps IgG, bien que fixée à la protéine A par sa portion Fc, peut effectivement fixer un antigène par l'une ou les deux de ses portions Fab.Une manière  Dement, they. have or have not already fixed the antigens. It must be clear that a molecule of IgG antibody, although attached to protein A by its Fc portion, can effectively fix an antigen by one or both of its Fab portions.

particulière d'utiliser des staphylocoques contenant dés protéi-  the use of staphylococci containing protein

nes A comme réactifs dans un travail de laboratoire d'immunologie consiste à les appliquer en tant que réactifs dits de séparation  As A reagents in an immunology laboratory work is to apply them as so-called separation reagents

dans les radio-immuno-essais (RIA).in radioimmunoassays (RIA).

Le radio-immuno-essai est la désignation d'une  The radioimmunoassay is the designation of a

méthode radio-immunologique désormais classique d'identifica-  radioimmunoassay now a classic method of identifying

tion, grâce à laquelle il est possible de réaliser des détermi-  thanks to which it is possible to carry out determin-

nations quantitatives d'une substance donnée (antigène)même  quantitative nations of a given substance (antigen) even

quand elle est présente en très petites quantités, en s'arran-  when it is present in very small quantities,

geant pour provoquer une inhibition compétitive de la réaction entre les quantités fixées du même antigène, purifié et marqué par une substance radio-active tel que l'iode radio-actif, et des anticorps, par exemple du lapin ou du cobaye, orientés vers la même substance.Quand cette réaction approche de l'équilibre o s'est déroulée pendant une période qui, selon l'expérience, est suffisante, de 4 jours à moins de 15 mn, l'antigène marqué est séparé sous forme d'une part d'une fraction libre et d'autre  to cause competitive inhibition of the reaction between the fixed amounts of the same antigen, purified and labeled with a radioactive substance such as radioactive iodine, and antibodies, eg rabbit or guinea pig, oriented towards the same substance.When this reaction approaches equilibrium o has taken place during a period which, according to experience, is sufficient, from 4 days to less than 15 min, the labeled antigen is separated in the form of of a free fraction and other

part d'une fraction fixée à l'anticorps.  from a fraction bound to the antibody.

Pour cette séparation, on a appliqué un grand nombre de méthodes, par exemple la précipitation chimique par des réactifs tel que le sulfate d'ammonium et l'éthanol, qui exigent une différence chimique entre l'antigène (marqué) libre et les complexes anticorps-antigènes et la méthode déjà classique du double anticorps, dans laquelle l'anticorps spécifique par exemple du lapin, est précipité par voie immunologique après addition d'un antisérum orienté vers l'immunoglobuline du  For this separation, a large number of methods have been applied, for example chemical precipitation by reagents such as ammonium sulphate and ethanol, which require a chemical difference between the free (labeled) antigen and the antibody complexes. antigens and the already conventional method of the double antibody, in which the specific antibody, for example rabbit, is precipitated immunologically after addition of an antiserum directed towards the immunoglobulin of the

lapin. Les problèmes rencontrés dans cette dernière procédureim-  rabbit. The problems encountered in this last procedure

pliquient la durée prolongée nécessaire pour la précipitation, qui est parfois de 24h, la sensibilité relative à des facteurs pertubants sans intérêt et le fait que la séparation, que 1 'on  the length of time required for the precipitation, which is sometimes 24 hours, the relative sensitivity to disturbing factors without interest and the fact that the separation, which one

achève par une centrifugation et l'élimination du fluide sur-  finishes by centrifugation and removal of the fluid

nageant, peut être incomplète.swimming, may be incomplete.

Cependant, des staphylocoques contenant de la  However, staphylococci containing

protéine A,ajoutés sous forme d' une suspension finement dis-  protein A, added in the form of a finely

persée, ont été montrés atteindre leur point final dans la réaction avec l'immunoglobuline en une minute. Ensuite, on réalise la.centrifugation, on décante le fluide surnageant et on porte le tube à un compteur de radiations gamma en vue de déterminer la fraction fixée à l'antigène de l'antigène marqué,  Perseus, have been shown to reach their end point in the reaction with immunoglobulin in one minute. Then, the centrifugation is carried out, the supernatant fluid is decanted and the tube is taken to a gamma radiation counter to determine the antigen-bound fraction of the labeled antigen.

associé à la bactérie dans le fond du tube.  associated with the bacteria in the bottom of the tube.

Les préparations de staphylocoques qui ont été d'abord appliquées à cet usage, provenaient d'un bouillon de culture, les bactéries étant traitées par lavages répétés dans une centrifugeuse, remisesen suspension dans une solution à 0,5% (en volume) de formaline dans un tampon neutre, dans laquelle les staphylocoques étaient laissés à incuber pendant 3 heures  The staphylococcal preparations that were first applied for this purpose came from a culture broth, the bacteria being treated by repeated washing in a centrifuge, resuspended in a 0.5% (by volume) solution of formalin in a neutral buffer, in which the staphylococci were allowed to incubate for 3 hours

avec mélangeage constant et un lavage répété final dans la cen-  with constant mixing and repeated final washing in the center.

trifugeuse. On conservait la suspension résultante dans une so- lution saline neutre tamponnée au phosphate avec un agent de  trifugeuse. The resulting suspension was stored in a phosphate buffered neutral saline solution with a phosphate buffered saline.

conservation tel que l'azoture de sodium (NaN3) à raison de lg/l.  storage such as sodium azide (NaN 3) at a rate of 1 g / l.

Le traitement à la formaline des staphylocoques tel qu'il a été exécuté pour la première fois par Lind et Mansa, avait pour but de "fixer"les couches superficielles contenant la protéine A des bactéries et de cette façon 1 'extraction spontanée de la  The formalin treatment of staphylococci, as first performed by Lind and Mansa, was intended to "fix" the surface layers containing protein A of bacteria and in this way the spontaneous extraction of the

protéine A par le milieu de suspension environnant était retardée.  Protein A by the surrounding suspension medium was delayed.

Il n'y avait cependant pas de destruction des bactéries et après deux semaines de stockage au réfrigérateur, les bactéries tendaient à s'autolyser. Au surplus, il était nécessaire de-laver à nouveau  However, there was no destruction of the bacteria and after two weeks of storage in the refrigerator, the bacteria tended to self-pollinate. In addition, it was necessary to wash again

la quantité nécessaire de réactifs immédiatement avant emploi.  the necessary amount of reagents immediately before use.

Ces inconvénients ainsi que le fait que des bactéries  These disadvantages as well as the fact that bacteria

vivantes essentiellement pathogènes étaient utilisées, ont sti-  living mainly pathogenic were used,

mulé un travail de mise au point, amorcé par G.Kronvall, et basé principalement sur la stabilité thermique évidente de la protéine A dont il a été démontré par la méthode d'extraction thermique précédemment appliquée à la production de la protéine A soluble, mais également sur la possibilité de fixer la protéine A par  developed by G.Kronvall, and based mainly on the obvious thermal stability of protein A, which has been demonstrated by the thermal extraction method previously applied to the production of soluble protein A, but also on the possibility of fixing protein A by

la formaline à la paroi cellulaire au cours du traitement ther-  formalin at the cell wall during heat treatment

mique, ce qui tend à en libérer la protéine A. Le résultat a été décrit dans des publications dont la première concernait le  which has the tendency to release protein A. The result has been described in publications, the first of which

premier radio-immun-o-essai avec les staphylocoques en tant queréac-  first radioimmunoassay with staphylococci as a reactive

tifs.de séparations dont les auteurs étaients.Jonsson et G.Kronvall: L'application de Staphyloccocus aureus contenant de la protéine A comme réactif anti-IgG en phase solide dans les radios-immuno-essais, avec pour exemple le dosage quantitatif de  Jonsson and G. Kronvall: The Application of Staphyloccocus aureus Containing Protein A as a Solid-Phase IgG Anti-IgG Reagent in Radiosimmunoassays, with the Quantitative Quantitative Assay

la foetoprotéine-alpha dans le sérum humain normal (Eur.J.Immu-  fetoprotein-alpha in normal human serum (Eur.J.Immu-

logy 4:29, 1974). Dans cet article se trouve décrit un traitement thermique reproductible en ce qui concerne la température et la  logy 4:29, 1974). In this article is described a reproducible heat treatment with respect to temperature and

durée, et destiné à tuer les staphyloccoques traités à la forma-  duration, and intended to kill staphylococcus treated with

line (Staphylococcus aureus) de souche Cowan I, de manière  line (Staphylococcus aureus) strain Cowan I, so

efficace, cette méthode étant réalisée par pompage d'une telle sus-  effective, this method being carried out by pumping such a sus-

pension à une vitesse donnée à travers une tubulure métallique  pension at a given speed through a metal tubing

relativement étroite immergée dans un bain-marie à une tempéra-  relatively narrow immersed in a water bath at a temperature of

ture de 80 C, puis directement à travers une tubulure métallique semblable immergée dans un bain d'eau glacée ou un bain-marie réfrigéré. Dans ce montage, le volume de la tubulure totale dans laquelle est maintenue la suspension à 80WC et la vitesse de pompage déterminée par le temps dit de maintien, à savoir de 4 à 6 minutes s'étaient trouvés convenables à cette tempéra-  80 C, then directly through a similar metal tubing immersed in an ice-water bath or a refrigerated water bath. In this arrangement, the volume of the total tubing in which the suspension is maintained at 80 ° C. and the pumping rate determined by the so-called holding time, namely from 4 to 6 minutes, were suitable at this temperature.

ture donnée. De cette façon, on obtenait une supension de sta-  given. In this way, we obtained a suspension of

phylocoques tués possédant une capacité de fixation IgG d'envi-  killed phylococci with an IgG binding capacity of

% de la capacité de fixation des staphylocoques seulement traités à la formaline. Cette suspension s'est révélée être stable quant à sa capacité de fixation d'immunoglobuline, quand elle était stockéeà la température du. réfrigérateur pendant plus  % of the binding capacity of staphylococci only treated with formalin. This suspension was found to be stable in immunoglobulin binding capacity when stored at room temperature. refrigerator for longer

d'une année, mais elle présentait une tendance -à la fragmenta-  one year, but it had a tendency to fragment

tion pour une partie des bactéries, à une libération de la pro-  for some of the bacteria, to release the

téine A et à une coloration jaune du milieu de suspension. Ega-  A protein and a yellow color of the suspension medium. EGA-

lement avec cette préparation, il était nettement nécessaire de laver la quantité désirée de staphylocoques- avant usage.Les bactéries, quand elles étaient stockées pendant plus de trois ans au réfrigérateur, formaient une masse mucolde difficile ou  With this preparation, it was clearly necessary to wash the desired amount of staphylococci before use. The bacteria, when they were stored for more than three years in the refrigerator, formed a difficult mucoid mass or

impossible à remettre en suspension -avant emploi.  impossible to re-suspend - before use.

Le b-ut de la présente invention est de simplifier la production de préparations ayant des propriétés de fixation d'immunoglobuline d'une manière très importante, et à procurer ainsi une telle préparation stable et facile à transporter et à répartir et même à stocker pendant des périodes de temps  The object of the present invention is to simplify the production of preparations having immunoglobulin binding properties in a very important manner, and thus to provide such a stable preparation which is easy to transport and distribute and even to store during periods of time

pratiquement illimitées sans destruction notable.  virtually unlimited without significant destruction.

Ces buts de l'invention sont atteints par un procé-  These objects of the invention are achieved by a method

dé qui, selon l'invention,est caractérisé en ce que des bactéries appartenant aux espèces possédant une capacité de fixation de l'immunoglobuline au-delà de celle basée sur une réaction entre  which according to the invention is characterized in that bacteria belonging to the species having an immunoglobulin binding capacity beyond that based on a reaction between

les antigènes de la bactérie et des anticorps spécifiques diri-  antigens of the bacterium and specific antibodies

gés vis-à-vis de ces antigènes, par exemple le Staphylococcus aureus ou le Streptococcus pyogenes, sont cultivés sur un substrat dans lequel les bactéries forment une substance de fixation d'immunoblobuline, les bactéries snnt tuées et ces bactéries tuées sont lyophilisées en vue de produire une suspension de  These antigens, such as Staphylococcus aureus or Streptococcus pyogenes, are cultured on a substrate in which the bacteria form an immunoblobulin binding substance, the bacteria are killed and these killed bacteria are freeze-dried for to produce a suspension of

bactéries que l'on peut reconstituer avec un liquide.Une prépa-  bacteria that can be reconstituted with a liquid.

ration produite de cette manière peut être constituée à n'impor-  produced in this way may be

te quel moment au cours d'une période pouvant atteindre probable-  at what time during a period of time likely to reach

ment plusieurs années de manière à former une suspension de bactéries tuées que l'on peut utiliser directement sans autres lavages, par exemple dans le cas des staphylocoques: appliqués  several years to form a suspension of killed bacteria which can be used directly without further washing, for example in the case of staphylococci: applied

dens le radio-immuno-essai décrit précédemment.  in the radioimmunoassay described above.

Comme exemple non limitatif du procédé selon l'in-  As a non-limiting example of the process according to

vention, on va décrire la méthode de préparation de bactéries de fixation d'immunoglobuline appartenant à l'espèce Staphylocob-  tion, the method for the preparation of immunoglobulin binding bacteria belonging to the Staphylococcus

cus aureus.cus aureus.

Les staphylocoques utilisés dans le procédé selon l'invention sont cultivés de préférence sur un substrat sous vide désigné également par milieu ou bouillon nutritif, car il comprend souvent un extrait obtenu à partir de viande par ébullition. A  Staphylococci used in the process according to the invention are preferably grown on a vacuum substrate also referred to by nutrient medium or broth, since it often comprises an extract obtained from meat by boiling. AT

l'échelle de laboratoire, on a utilisé des ballons secoués d'en-  the laboratory scale, balloons shaken from

viron 1 litre de volume et des fermentateurs d'environ 10 1 de volume, c'est-à-dire des enceintes dans lesquelles il est possible d'effectuer un mélangeage, une aération, une neutralisation par  Viron 1 liter volume and fermentors of about 10 1 volume, that is to say the speakers in which it is possible to perform a mixing, aeration, neutralization by

contrôle du pi etc... de manière à ren dre optimales les condi-  control of the pi, etc., so as to make optimal the conditions

tions de croissance. Il existe des possibilités correspondantes à l'échelle industrielle en utilisant des bacs dontla taille  growth. There are corresponding opportunities on an industrial scale using bins whose size

peut atteindre plusieurs mètres cubes. Cette méthode a été ap-  can reach several cubic meters. This method has been

pliquée avec succès à un matériel procurant 250 litres de milieu de culture dans un fermentateur standard situé au Département de Bactériologie du Karolinska Institute de Stockholm en SUEDE. A la fin d'une fermentation poursuivie pendant environ 8 heures après inoculation, la masse de bactérie dans le substrat a atteint un degré d'environ 25g par litre (poids humide); en l'absence  successfully applied to equipment providing 250 liters of culture medium in a standard fermentor located in the Bacteriology Department of the Karolinska Institute in Stockholm, SWEDEN. At the end of a fermentation continued for about 8 hours after inoculation, the mass of bacterium in the substrate reached a degree of about 25g per liter (wet weight); without

de défaut technique, on peut s'attendre régulièrement à des ren -  technical defect, we can regularly expect

dements d'au moins 15 grammes par litre.  at least 15 grams per liter.

Dans les expériences exécutées par l'inventeur,  In the experiments performed by the inventor,

il a été démontré que l'on peut tuer des staphglocoques fraiche-  it has been shown that fresh staphglococci can be killed

ment cultivés directement après lavage avec la même méthode sem-  grown directly after washing with the same method

blable à la pasteurisation que celle décrite dans l'article décrit cidessus et appliquée aux bactéries traitées à la formaline.On a fait la découverte surprenante qu'il s'est révélé inexact, bien qu'apparemment considéré comme vrai et pris comme point-de départ pour les raisonnements et les expériences depuis très longtemps, que le traitement à la formaline exécuté avant destruction thermique, peut être un préalable nécessaire pour éviter l'extraction thermique de la protéine A. En fait, les  pasteurization as described in the article described above and applied to formalin-treated bacteria. It was surprisingly discovered that it was found to be inaccurate, although apparently considered true and taken as a point of interest. reasoning and experiments for a very long time, that the formalin treatment performed before thermal destruction, may be a prerequisite to avoid the thermal extraction of protein A. In fact, the

bactéries qui ont été directement tuées thermiqûement après cul-  bacteria that were directly killed thermally after

ture semblent avoir pratiquement largement la même capacité de  ture seem to have practically the same ability to

fixation que les staphylocoques- traités à la formaline et ther-  staphylococci-treated with formalin and ther-

miquement provenant de la même culture, ou au moins 90 de cette capacité.  from the same crop, or at least 90 of that capacity.

Au surplus, les expériences de l'inventeur ont démon-  In addition, the inventor's experiments demon-

tré que la compositition chimique du substrat peut affecter le traitement ultérieur de la matière. Ainsi, il a été démontré que  The chemical composition of the substrate may affect the subsequent processing of the material. Thus, it has been shown that

le milieu connu sous la dénomination CCY, un substrat particuliè-  the medium known under the name CCY, a particular substrate

rement riche pour la culture de staphylocoques, présente un inconvénient dans le cas o l'on essaie de tuer thermiquement les bactéries directement après culture quand elles sont encore en suspension dans ce substrat, en maintenant les bactéries à 80 C pendant environ 4 mn. Apparemment, le substrat contient une ou  For the sake of staphylococci culture, this is a disadvantage in the case of attempting to thermally kill the bacteria directly after culturing when they are still suspended in this substrate, keeping the bacteria at 80 ° C. for about 4 minutes. Apparently, the substrate contains one or

plusieurs substances tendant à précipiter et/ou à maintenir l'ag-  several substances that tend to precipitate and / or maintain

gréaation des bactéries elles-mêmes à 80 Cpar exemple des protéi-  of the bacteria themselves at 80 C, for example protein

nes qui se dénaturent à cette température. Cependant, il existe d'autres milieux qui peuvent être utilisés pour la culture de staphylocoques,tel que le milieu connu sous la dénomination  which are denatured at this temperature. However, there are other media that can be used for the culture of staphylococci, such as the medium known under the name

TSB, qui a été utilisé avantageusement par l'inventeur simple-  TSB, which has been advantageously used by the simple inventor

ment parce qu'il permet de tuer thermiquement les bactéries en  because it allows the bacteria to be killed thermally

suspension à 80 C sans précipitation ou aggrégation notable.  suspension at 80 C without precipitation or notable aggregation.

Par ailleurs, l'inventeur a également fait la décou-  In addition, the inventor also made the discovery

verte que l'on peut tuer thermiquement le Staphylococcus aureus après croissance dans un milieu CCY en évitant le phénomène de  that Staphylococcus aureus can be thermally killed after growth in a CCY medium by avoiding the phenomenon of

précipitation et/ou d'aggrégation observé par le traitement ther-  precipitation and / or aggregation observed by the heat treatment

mique à 801C précité, c'est-à-dire si on réalise le traitement thermique/à titre d'exemple non limitatif, à 60 C pendant un temps d'incubation plus long correspondant, environ 30 mn selon l'expérience del'inventeur. La transition à la température de  801C above, that is to say if one carries out the heat treatment / by way of non-limiting example, at 60 C for a corresponding longer incubation time, about 30 minutes according to the experience of the inventor . The transition to the temperature of

destruction doit de préférence se produire rapidement, par exem-  destruction should preferably occur rapidly, for example

ple dans un échangeur de chaleur situé dans un bain -marie à la température désirée,et ne doit pas être calculée en fonction du temps de maintien (temps d'incubation)d'environ 30 mn nécessaire pour achever la destruction.On a également démontré qu'il est possible de tuer des staphylocoques à 56 C sans précipitation ou aggrégation mais la durée totale de destruction demande alors 3 heures d'incubation à cette température et apparemment on ne tire pas d'avantages additionnels en tuant les bactéries,dans  in a heat exchanger located in a bath-marie at the desired temperature, and should not be calculated according to the time of maintenance (incubation time) of about 30 minutes necessary to complete the destruction.On has also demonstrated that it is possible to kill staphylococci at 56 C without precipitation or aggregation but the total duration of destruction then requires 3 hours of incubation at this temperature and apparently no additional benefits are gained by killing the bacteria,

le but de la présente invention,à cette température plus basse.  the object of the present invention, at this lower temperature.

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L'inven^teur a également cultivé diverses souches de Streptococcus pgogenes fixant l'immunoglobuline dans le bouillon dit de TODD-HEWITT, milieu fluide bien connu pour ses bons  The inventor has also cultivated various strains of Streptococcus pgogenes fixing the immunoglobulin in the so-called TODD-HEWITT broth, a fluid medium well known for its good

rendements en streptocaqueset en provoquant la destruction ther-  streptococci and causing the destruction of

mique à 80C selon le même principe que pour le Staphylococcus aureus selon l'article cité ci-dessus. Egalement dans le cas des streptocoques, la plus grande part de la capacité de fixation d'immunoglobuline présente dans les souches vivantes est conservée  at 80C according to the same principle as for Staphylococcus aureus according to the article cited above. Also in the case of streptococci, most of the immunoglobulin binding capacity present in living strains is retained

après la destruction thermique directe, c'est-à-dire sans traite-  after direct thermal destruction, that is to say without

ment préalable à la formaline.Au surplus, également comme pour les staphylocoques, les streptocoques cultivés laissés dans le milieu TODD HEWITT riche au cours du traitement thermique à 80WC  Beforehand, as for staphylococci, the cultivated streptococci left in the rich TODD HEWITT medium during heat treatment at 80WC

forment des aggrégats. On peut réduire cet inconvénient égale-  form aggregates. This disadvantage can be reduced

ment dans le cas des streptocoques soit en échangeant le milieu TODDHEWITT pour un tampon frais avant la destruction thermique à 801C soit en réalisation le traitement thermique dans le  in the case of streptococci, either by exchanging TODDHEWITT medium for a fresh buffer before the thermal destruction at 801C, or in effect the heat treatment in the

milieu de croissance utilisé mais à environ 601C. On préfère cet-  growth medium used but at about 601C. This is preferred

te seconde solution car elle implique moins de traitement des bactéries. Les bactéries tuées thermiquement par L'une des manières précitées,sans traitement préalable à la.formaline, nnt été lavées et stockées sous forme de suspensions dans un  the second solution because it involves less treatment of bacteria. Bacteria killed thermally by one of the above-mentioned ways, without prior treatment with formalin, have not been washed and stored as suspensions in a

tampon neutre aux températures du réfrigérateur.  Neutral buffer at refrigerator temperatures.

Cependant, l'inventeur a enregistré un inconvénient très notable de ces suspensions de bactéries, par exemple des staphylocoques traités uniquement à la chaleur en vue de tuer  However, the inventor has noted a very notable disadvantage of these bacterial suspensions, for example staphylococci treated only with heat in order to kill

les bactéries, en ce que ces suspensions, après seulement quel-  bacteria, in that these suspensions, after only

ques semaines de stockage au réfrigérateur, même avec un agent  weeks of refrigerated storage, even with an agent

chimique de conservation dans le tampon, dégénèrent par frag-  chemical storage in the buffer, degenerate

mentation des particules constituées par les bactéries tuées.  the particles formed by the killed bacteria.

On a observé le même problème avec les staphylocoques traités à la formaline et chauffés thermiquement, en particulier quand ils ont été cultivés dans des conditions donnant le rendement optimal, tels que l'aération et que le mélangeagemaximaux.Une explication possible de ces problèmes inattendus pourrait être que la quantité absolue(pas la concentration) de formaline ajoutée aux bactéries récoltées peut avoir été trop faible pour  The same problem has been observed with thermally heated, formalin-treated staphylococci, especially when grown under optimal yield conditions, such as aeration and mixing. A possible explanation for these unexpected problems might be the following: be that the absolute amount (not the concentration) of formalin added to the harvested bacteria may have been too low for

avoir un effet suffisant sur la grande masse de bactéries.  have a sufficient effect on the large mass of bacteria.

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Pour diverses raisons, il apparaît avantageux dans certains  For various reasons, it appears advantageous in some

cas de séparer effectivement la masse de bactéries de son subs-  case of actually separating the mass of bacteria from its subset

trat avant les étapes ultérieures; une raison, déjà mentionnée, est la possibilité d'effets négatifs provenant du substrat sur les bactéries au cours du traitement thermique et une autre peut être le désir de recueillir dans le substrat une ou plusieurs  before the next steps; one reason, already mentioned, is the possibility of negative effects from the substrate on the bacteria during heat treatment and another may be the desire to collect in the substrate one or more

substances qui seraient détruites par le traitement thermique.  substances that would be destroyed by heat treatment.

On peut appliquer pour le lavage de la masse de bactéries un processus de centrifugation ou de filtration. Dans un autre cas, il peut être suffisant et désirable de réduire dans une ceratine mesure le volume des bactéries en suspension et destinées.à être traitées thermiquement, sans qu'il soit besoin de changer la  A centrifugation or filtration process can be applied for the washing of the bacterial mass. In another case, it may be sufficient and desirable to reduce in a certain measure the volume of bacteria in suspension and intended to be heat treated, without the need to change the

composition du substrat.composition of the substrate.

Après le traitement thermique, il est avantageux de sépa-  After the heat treatment, it is advantageous to separate

rer les bactéries de leur substrat présent, en particulier parce que ce dernier contient en solution une certaine quantité de substances de fixation d'immunoglobuline. Dans ce cas également,  the bacteria in their substrate present, especially because the latter contains in solution a certain amount of immunoglobulin binding substances. In this case too,

la centrifugation ou la filtration peut être utilisée. Les bacté-  centrifugation or filtration can be used. Bacteria

ries lavées sont ensuite recueillies sous forme de suspensions  washed fabrics are then collected as suspensions

concentrées ou de dépôts humides tassés.  concentrated or wet deposition packed.

Les suspensions de staphylocoques et de streptocoques  Suspensions of staphylococci and streptococci

spécifiquement non traités à la formaline mais tués thermique-  specifically not treated with formalin but killed

ment sont soumises à un séchage par congélation(lyophilisation),  are freeze-dried (freeze-dried),

notamment comme moyens de stockage des bactéries tuées thermique-  especially as means of storage of killed bacteria thermal-

ment qui ne peuvent pas être stockées en suspension telles quelles, et dans le but d'obtenir des suspensions de bactéries que l'on peut reconstituer dans un tampon convenable. Dans le cas présent, après lyophilisation,qui se produit sous vide, les matériaux  which can not be stored in suspension as is, and in order to obtain suspensions of bacteria that can be reconstituted in a suitable buffer. In this case, after lyophilization, which occurs under vacuum, the materials

lyophilisés ont été mis en contact avec de l'air sec. Après re-  lyophilized were brought into contact with dry air. After

constitution,on pouvait s'attendre à obtenir des suspensions pos-  constitution, one could expect to obtain suspensions

sèdant des propriétés reproductibles, y compris la tendance pré-  with reproducible properties, including the prevailing trend

cédente à l'autolyse des particules de bactéries en quelques semaines dans les suspensions correspondantes de bactéries non lyophilisées. Ces prévisions ont été confirmées en ce qui concerne 351es propriétés de fixation d'immunoglobuline et la possibilité  yielded to the autolysis of bacteria particles within a few weeks in the corresponding suspensions of non-lyophilized bacteria. These predictions have been confirmed with respect to immunoglobulin binding properties and the possibility of

d'appliçation dans diverses applications de ces bactéries recons-  of application in various applications of these bacteria

tituées. Cependant, on a noté une notable absence de tendance à l'autolyse, observation qui peut être considérée comme surprenante et inattendue, car aucun effet de ce genre n'avait été décrit  tituées. However, there was a notable lack of autolysis, which can be considered surprising and unexpected, as no effects of this kind were described.

jusqu'à présent, ce qui potentiellement présente une grande impor-  so far, which potentially has a great deal of

tance pratique.practice.

L'effet de l'exposition de la matière lyophilisée à l'air sec n'a pas été soumis à une étude telle que l'on puisse en conclure que l'un ou l'autre des composants de l'air sec puisse cnntribuer à la stabilité de la suspension, qui est une caractéristique de la préparation obtenue selon 1 'invention.La préparation du Staphylococcus aureus tué, cultivé dans le milieu TSB et traité selon la méthode précitée, y compris la destruction thermique à 80 C pendant environ 4 mn, a été démontrée à plusieurs reprises posséder une capacité de fixation de l'IgG humaine de plus de 1, 5 mg IgG par ml d'une suspension à 10% (en volume) ce qui correspond à au moins 0, 75 mg pour 20 mg de staphylocoques  The effect of the exposure of the freeze-dried material to dry air has not been subjected to a study such that it can be concluded that any of the components of the dry air can contribute the stability of the suspension, which is a characteristic of the preparation obtained according to the invention.The preparation of killed Staphylococcus aureus, grown in TSB medium and treated according to the above method, including the thermal destruction at 80 C for about 4 has repeatedly been demonstrated to have a binding capacity of human IgG of greater than 1.5 mg IgG per ml of a 10% suspension (by volume) which corresponds to at least 0.75 mg per 20 mg staphylococci

lyophilisés, habituellement environ 2mg et lmg respectivement.  lyophilized, usually about 2 mg and 1 mg respectively.

Ces chiffres doivent être comparés à ceux donnés dans l'article précité (Johnson & Kronvall 1974) concernant les staphglocoques traités à la formaline puis thermiquement, dont la capacité  These figures should be compared with those given in the above-mentioned article (Johnson & Kronvall 1974) concerning staphglococci treated with formalin and then thermally, whose capacity

de fixation était indiquée être d'environ 1 mg par ml d'une sus-  fixation was indicated to be approximately 1 mg per ml of a

pention à 10% (en volume). A cet égard, il faut insister cepen-  10% (in volume). In this respect, it should be stressed

dant sur le fait que les conditions de structure étaient assez différentes de celles qui sont relatées dans cet article. Un  on the fact that the structural conditions were quite different from those described in this article. A

substrat différent a été utilisé ainsi qu'un équipement diffé-  different substrate was used as well as different equipment

rent et perfectionné pour l'oxygénation, avec l'addition d'un  and improved for oxygenation, with the addition of a

agent de contrôle du pH.pH control agent.

Les expériences de 1 'inventeur ont démontré que  The inventor's experiments demonstrated that

des préparations équivalentes de staphylocoques et de streptoco-  equivalent preparations of staphylococci and streptococci

ques fixant l'immunoglobuline peuvent être obtenues également après modification du traitement thermique de la bactérie,la première modification étant le traitement thermique des bactéries à des températures inférieures à 80 C. Ainsi, on a trouvé que les Staphylococcus aureus de la souche Cowan I sont tués après incubation à 601C pendant 30mn, qu'ils soient en suspension dans un bouillon nutritif ou remis en suspension dans un tampon, et largement quelle que soit la densité de la suspension.D'une manière correspondante, des deux souches de fixation d'immunoglobuline  The first modification is the thermal treatment of the bacteria at temperatures below 80 ° C. Thus, it has been found that the Staphylococcus aureus of Cowan strain I are resistant to immunoglobulin binding. killed after incubation at 60 ° C. for 30 minutes, whether they are suspended in a nutrient broth or resuspended in a buffer, and widely regardless of the density of the suspension. In a corresponding manner, two strains of fixation of immunoglobulin

des streptocoques soumises à des études au laboratoire de l'inven-  streptococci under study in the laboratory of the invention.

teur, l'une était tuée au bout de 30 mn à 56WC et l'autre deman-  one was killed after 30 minutes at 56WC and the other was

dait au moins 60 mn à 56WC.at least 60 minutes at 56WC.

De plus, il a été démnntré par l'inventeur que la  Moreover, it was revealed by the inventor that the

destruction thermique peut être exécutée à des températures sen-  thermal destruction can be carried out at sensible temperatures

siblement plus basses, par exemple à 37WC par addition de formal-  lower, for example to 37WC by addition of formaldehyde

déhyde jusqu'à une concentration finale bien au-dessous de la concentration en formaldéhyde qui serait nécessaire pour tuer au moyen de formaldéhyde à température ambiante. Il est clair  dehyde to a final concentration well below the formaldehyde concentration that would be required to kill with formaldehyde at room temperature. It's clear

d'après les expériences que le traitement à la formaldéhyde(c'est-  from experience that formaldehyde treatment (ie

à-dire à la formaline)& exige un contrôle très serré des paramè- tres tels que la température, le pH, la concentration des bactéries à tuer, la matière réactive à l'aldéhyde dans le tampon (en particulier les amines primaires,à savoir les protéines,les  formalin) & requires tight control of parameters such as temperature, pH, concentration of bacteria to be killed, aldehyde reactive material in the buffer (especially primary amines, know the proteins,

amino-acides etc... présentes dans ces substrats) et naturelle-  amino acids etc ... present in these substrates) and naturally

ment de la formaldéhyde active ajoutée (si l'on considère la tendance de la formaldéhyde à se polymériser ou à réagir d'une autre manière au cours du stockage). Comme le traitement à la formaline des bactéries de fixation d'immunoglobuline avant traitement thermique n'a pas été exécuté jusqu'à maintenant avec  added active formaldehyde (considering the tendency of formaldehyde to polymerize or otherwise react during storage). As the formalin treatment of immunoglobulin binding bacteria before heat treatment has not been performed until now with

un degré élevé de contrôle sauf pour ce qui est de la concen-  a high degree of control except for the concentration

tration finale calculée en formaldéhyde, c'est-à-dire sans con-  final concentration calculated as formaldehyde, that is to say without

sidérer la concentration en bactéries,les conditions de tampon-  the concentration of bacteria, the buffer conditions

nage et la température, l'étape étudiée par l'inventeur consis-  and temperature, the stage studied by the inventor

tant à modifier le traitement thermique par addition d'une  both to modify the heat treatment by adding a

petite quantité de formaldéhyde, incapable de tuer par elle-  small amount of formaldehyde, unable to kill by

même à la température dite ambiante, constitue une étape impor-  even at the so-called ambient temperature, is an important step

tante dans l'amélioration du traitement des bactéries de fixa-  aunt in improving the treatment of

tion d'immunoglobuline, étape devant être suivie par la lyophi-  immunoglobulin, which should be followed by lyophilic

lisation pour l'exploitation de l'effet stabilisant complémen-  for the exploitation of the complementary stabilizing effect

taire de ce traitement.to avoid this treatment.

Les préparations obtenues selon 1 'invention ont été  The preparations obtained according to the invention have been

soumises à des essais comme réactifs dans divers radioimmuno-  tested as reagents in various radioimmunoassays.

essais, par exemple pour l'antigène B de l'hépatite, comme anti-  tests, for example for hepatitis B antigen, as anti-

corps vis-à-vis à de cet antigène et pour les antibiotiques ami-  body against this antigen and for the antibiotics

noglucosidestelle que la gentamicine. Dans ces essais, on utili-  noglucosidestelle than gentamicin. In these tests, we use

sait une suspension de staphylocoques provenant de staphyloco-  a suspension of staphylococci from staphylococci

ques lyophilisés, et reconstitués dans une solution saline neu-  lyophilized, and reconstituted in a neutral saline solution

tre tamponnée au phosphate avec addition d'un détergent dit R non ionique, Tween 20 jusqu'à une concentration finale de 0,1% (en volume), exactement comme il a été trouvé avantageux avec les préparations de staphylocoques (Jonsson & Kronvall 1974),  be phosphate buffered with the addition of a non-ionic R detergent, Tween 20 to a final concentration of 0.1% (by volume), exactly as found to be advantageous with staphylococcal preparations (Jonsson & Kronvall 1974). )

connues antérieurement.Il a été trouvé que les suspensions recons-  previously known. It was found that the suspensions

tituées peuvent être utilisées directement sans autre lavage  can be used directly without further washing

pour les applications envisagées. Cependant, pour des applica-  for the intended applications. However, for applications

tions particulières, une étape unique de centrifugation et de remise en suspension dans du tampon frais peut être recommandée pour l'élimination de traces de protéine A soluble ou de protéine  In particular, a single step of centrifugation and resuspension in fresh buffer may be recommended for removal of traces of soluble protein A or protein

A entraînée sur de petits fragments de débris cellulaires prove-  Trapped on small fragments of cellular debris from

nant des bactéries tuées, par exemple à la suite de la congéla-  killed bacteria, for example as a result of freezing

tion préalable à la lyophilisation. Au surplus, le réactif constitué par le staphylocoque reconstitué a été soumis à des essais satisfaisants suivant  prior to lyophilization. In addition, the reagent constituted by the reconstituted staphylococcus was subjected to satisfactory tests according to

une méthode connue pour la classification des anticorps spécifi-  a known method for the classification of specific antibodies

ques destinés à des agents infectieux tels que le virus de la rubéole ou les toxoplasma parasites. Des infections par l'un de ces agents au cours de la grossesse font courir un risque notable d'infection et de malformation du foetus. Par suite diverses procédures classiques ont été mises au point pour l'étude de la réponse immunologique vis-à-vis de ces antigènes et de bien d'autres. Il est bien reconnu que la réponse des anticorps primaires des mammifères vis-à-vis des substances étrangères (antigènes) commence par la production d'anticorps spécifiques de la classe IgM puis d'anticorps spécifiques (c'est-à-dire des anticorps dirigés vers le même antigène que celui considéré) appartenant à la classe des IgA et plus tard des anticorps de la classe IgG. Ces derniers tendent à demeurer détectables dans le sérum/plasma pendant une longue période  for infectious agents such as rubella virus or toxoplasma parasites. Infections with any of these agents during pregnancy pose a significant risk of infection and malformation of the fetus. As a result, various standard procedures have been developed for the study of the immunological response to these antigens and many others. It is well recognized that the response of mammalian primary antibodies to foreign substances (antigens) begins with the production of antibodies specific for the IgM class and then for specific antibodies (i.e. antibodies directed to the same antigen as that considered) belonging to the IgA class and later IgG class antibodies. These tend to remain detectable in the serum / plasma for a long time

et à augmenter de manière permanente quand ils sont mis en pré-  and to increase permanently when they are put in pre-

sence ultérieurement avec l'antigène. Les anticorps IgG consti-  later with the antigen. IgG antibodies constitute

tuent l'izmunité protectrice à long terme des anticorps vis-à-  protect the long-term protective immunity of antibodies against

vis des agents infectieux> que l'on a souvent renforcé par diverses injections de vaccins que cela a été possible. Par ailleurs, les anticorps IgM et aussi IgA tendent à disparaître en quelques semaines après leur première apparition. Inversement, la présence des anticorps IgM spécifiques-et dans une certaine  infectious agents> that have often been reinforced by various vaccine injections that this has been possible. In addition, IgM and IgA antibodies tend to disappear within a few weeks after their first appearance. Conversely, the presence of specific IgM antibodies-and in some

mesure également la présence des anticorps IgA spécifiques-  also measures the presence of specific IgA antibodies

est généralement considérée comme une indication d'une infection récenteprovoquée par un agent infectieux formant l'antigène en  is generally considered an indication of a recent infection caused by an infectious agent

question. Comme il a été démontré par des chercheurs indépen-  question. As has been demonstrated by independent researchers

dants, les staphylocoques contenant de la protéine A traités à la formaline et thermiquement peuvent avantageusement être utilisés pour la caractérisation des anticorps spécifiques à cet égard. Cela vient du fait que plus de 90% de l'IgG sérique et pas plus d'environ 25% de l'igM --et 25% d'IgA sont absorbés par  For example, staphylococci containing formalin-treated and thermally treated protein A may advantageously be used for the characterization of specific antibodies in this regard. This is because more than 90% of serum IgG and no more than about 25% IgM and 25% IgA are absorbed by

la protéine A et du fait que l'on n'a pas été capables de démon-  protein A and the fact that we have not been able to demon-

trer dans l'IgG résiduel appartenant à la sous-classe IgG3 la présence des anticorps du virus de la rubéole. Cependant, une expérience a montré que des réactions non spécifiques peuvent être rencontrées avec certaines préparations de staphylocoques apparemment au moins partiellement comme conséquence de la frag- mentation des staphylocoques au vieillissement des suspensions  in the residual IgG belonging to the subclass IgG3 the presence of the antibodies of the rubella virus. However, experience has shown that nonspecific reactions may be encountered with some staphylococcal preparations apparently at least partially as a consequence of staphylococcal fragmentation at aging suspensions.

conservées telles quelles au réfrigérateur. Ces fragments sem-  kept as is in the refrigerator. These fragments

blent ne pas se sédimenter de la manière normale au cours de la centrifugation du mélange sérum-réactif et à gêner par exemple la sédimentation des globules rouges du sang dans les plaques  may not settle in the normal way during the centrifugation of the serum-reactive mixture and to disturb for example the sedimentation of red blood cells in the plates

dites de mictrotitrage dans le test d'inhibition de l'hemag-  mictrotitration in the hemoglobin inhibition test.

glutination pour les anticorps du virus de la rubéole. Sans  glutination for antibodies of the rubella virus. Without

exception, les préparations de staphylocoques selon l'inven-  exception, staphylococcal preparations according to the invention

tion ont donné des résultats surs dans les recherches sérologi-  have produced reliable results in serological research

ques des anticorps de la rubéole et d'une manière générale,il y a une très bonne concordance, comme on pouvait s'y attendre,  rubella antibodies and in general, there is a very good match, as might be expected,

avec les résultats obtenus avec des systèmes de contrôle indé-  with the results obtained with inde-

pendant telle que la technique d'ultra-centrifugation, coûteuse  during such as expensive ultra-centrifugation technique

et pénible.and painful.

Pour résumer, par le procédé selon l'invention, il  To summarize, by the process according to the invention,

est possible d'obtenir des préparations possédant des proprié-  It is possible to obtain preparations with proprietary

tés de fixation d'immunoglobuline d'une manière radicalement simplifiée. Ces préparations sont d'une nature permettant une répartition et un stockage aisés, avec un maintien des propriétés pendant de très lnngues périodes, probablement des  immunoglobulin binding tees in a radically simplified manner. These preparations are of a nature allowing an easy distribution and storage, with a maintenance of the properties during very long periods, probably of

années,pour autant qu'on puisse le juger à présent,avec l'in-  years, as far as can be judged now, with the

tention d'obtenir par des moyens usuels de reconstitution, une préparation de première classe pour l'application dans des procédures de tests immunologiques. Dans ce contexte, il faut insister sur le fait en particulier que l'invention conduit  attempt to obtain, by conventional means of reconstitution, a first-class preparation for application in immunoassay procedures. In this context, it must be emphasized in particular that the invention leads to

à une suspension de bactéries de fixation d'immunoglobuline re-  to a suspension of immunoglobulin binding bacteria

constituées, sensiblement stablesen ce qui concerne leurs  constituted, substantially stable with respect to their

propriétés en tant que particules. Le processus de lyophilisa-  properties as particles. The freeze-drying process

tion parait, pour ce qu'on peut en conclure des faits,expliquer la stabilité des particules que l'on n'avait jamais obtenue jusqu'à présent par simple traitement thermique ou avec le  seems possible to explain the stability of the particles which had never before been obtained by simple heat treatment or with

traitement classique à la formaline avant traitement thermique.  conventional treatment with formalin before heat treatment.

L'effet de stabilisation de particules du traitement à la forma-  The particle stabilizing effect of the treatment in the forma-

line avant traitement thermique, bien connu, peut ainsi selon l'invention non seulement être remplacé mais être sensiblement  line before heat treatment, well known, can thus according to the invention not only be replaced but be substantially

dépassé en efficacité par l'effet de lyophilisation pour simple-  exceeded in effectiveness by the freeze-drying effect for simple

ment tuer thermiquement -les bactéries.  thermally kill the bacteria.

R E V E N D I CA T I O N SR E V E N D I CA T IO N S

1. Procédé pour l'obtention d'une préparation stable possédant des propriétés de fixation de l'immunoglobuline, caractérisé en ce que l'on cultive des bactéries appartenant aux espèces possédant une capacité de fixation de l'immunoglobuline au delà de celle basée sur une réaction entre les antigènes de la bactérie et les anticorps spécifiques correspondant à ces antigènes> par exemple le Staphylococcus aureus ou le  A method for obtaining a stable preparation having immunoglobulin binding properties, characterized in that bacteria belonging to species having an immunoglobulin binding capacity beyond that based on a reaction between the antigens of the bacterium and the specific antibodies corresponding to these antigens> for example Staphylococcus aureus or

Streptococcus pyogenes, sur un substrat dans lequel les bac-  Streptococcus pyogenes, on a substrate in which the bac-

téries forment une substance de fixation d'immunoglobuline,on tue les bactéries portant ladite substance, sans autre traitement préalable qu'un lavage et les bactéries tuées sont lyophilisées pour obtenir une suspension  series form an immunoglobulin binding substance, the bacteria carrying the substance are killed without further treatment before washing and the killed bacteria are lyophilized to obtain a suspension

* de bactéries qui peut être reconstituée avec un liquide.* of bacteria that can be reconstituted with a liquid.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les  2. Method according to claim 1, characterized in that the

bactéries sont tuées par chauffage.  bacteria are killed by heating.

3. Procédé selon l'une quelconque des revendications I ou 2,  3. Method according to any one of claims I or 2,

caractérisé en ce que les bactéries sont tuées en présence d'une substance possédant des propriétés de destruction de bactéries. 204. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que ladite  characterized in that the bacteria are killed in the presence of a substance having bacterial killing properties. 204. Process according to claim 3, characterized in that said

substance est la formaldéhyde.substance is formaldehyde.

5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4,carac-  5. Process according to any one of claims 1 to 4,

térisé en ce que les bactéries sont enrichies jusqu'à une concentration supérieure avant d'être tuées, par exemple par  in that the bacteria are enriched to a higher concentration before being killed, for example by

centrifugation ou filtration.centrifugation or filtration.

6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5,  6. Process according to any one of claims 1 to 5,

caractérisé en ce que la masse de bactéries est lavé-e avant d'être tuée de manière à être pratiquement débarassée du substrat.  characterized in that the bacterial mass is washed before being killed so as to be substantially disposed of from the substrate.

307. Procédé selon l'.,une quelconque des revendications 1 à 6,carac-  307. The process according to any one of claims 1 to 6, wherein

térisé en ce que la préparation de bactéries est, après lyo-  in that the preparation of bacteria is, after

philisation, exposée à un mélange de gaz sec, par exemple d'air. 8. Préparation stable possédant des propriétés.: de fixation de l'immunoglobuline, caractérisée en ce qu'elle est obtenue par  philization, exposed to a mixture of dry gas, for example air. 8. Stable preparation having immunoglobulin binding properties, characterized in that it is obtained by

un procédé selon l'une quelconque des revendications I à 7.  a process according to any one of claims I to 7.