FR2461006A1 - Procede de preparation de l-threonine - Google Patents

Abstract

L'INVENTION CONCERNE LES PROCEDES MICROBIOLOGIQUES. LE PROCEDE FAISANT L'OBJET DE L'INVENTION EST DU TYPE CONSISTANT A EFFECTUER UNE CULTURE EN PROFONDEUR D'UNE SOUCHE PRODUCTRICE ESCHERICHIA COLI AU SEIN D'UN MILIEU DE CULTURE CONTENANT DES SOURCES DE CARBONE, D'AZOTE ET DE SELS MINERAUX, EN PRESENCE D'ANTIBIOTIQUES, SUIVIE DE LA SEPARATION DE LA MASSE BIOLOGIQUE D'AVEC LE LIQUIDE DE CULTURE ET DE L'ISOLEMENT DU PRODUIT VISE, ET EST CARACTERISE EN CE QU'ON UTILISE COMME SOUCHE PRODUCTRICE LA SOUCHE ESCHERICHIA COLI VNIIGENETIKA M-1 DEPOSEE AU MUSEE CENTRAL DES MICRO-ORGANISMES POUR USAGES INDUSTRIELS AUPRES DE L'INSTITUT "VSESOJUZNY NAUCHNO-ISSLEDOVATELSKY INSTITUT GENETIKI I SELEKTSII PROMYSHLENNYKH MICROORGANIZMOV" SOUS LE N D'ENREGISTREMENT TSMPV-1856, SELECTIONNEE SUR LA BASE DE LA VARIABILITE NATURELLE DE LA SOUCHE ESCHERICHIA COLI VNIIGENETIKA VL 334 (PYN7) OBTENUE AU MOYEN DE METHODES D'INGENIERIE GENETIQUE PAR AUGMENTATION DE LA DOSE DES GENES MUTANTS ASSURANT UNE PRODUCTION ELEVEE DE L-THREONINE, PAR INTRODUCTION, DANS LA SOUCHE MUTANTE RECEPTRICE, DE PLASMIDE HYBRIDE A EXEMPLAIRES MULTIPLES PORTANT LESDITS GENES, LA CULTURE ETANT EFFECTUEE EN PRESENCE DE PENICILLINE. LA L-THREONINE EST UN AMINO-ACIDE ESSENTIEL QUI EST LARGEMENT UTILISE COMME CONSTITUANT DE DIVERS MELANGES NUTRITIFS POUR USAGES MEDICAUX.

Description

La présente invention se rapporte au domaine de l'industrie

microbiologique et a notamment pour objet un

procédé de préparation de L-thréonine.

La L-thréonine est un amino-acide essentiel qui est largement utilisé comme constituant de divers mélanges nutriftifs pour usages médicaux. En outre, la L-thréonine peut être utilisée en qualité d'additif aux aliments humains et aux fourrages des animaux, ainsi que comme réactif dans l'industrie pharmaceutique et dans l'industrie

chimique.

Sont déjà connus des procédés de préparation de

L- thréonine par culture en profondeur de souches productri-

ces, de types tels que Brevibacterium flavum, Escherichia coli, Corinebacterium acetoacidophilum, Proteus rettgeri, Serratia marcescens, Aerobacter aerogenes, Corynebacterium glutamicum, au sein de milieux de culture contenant en tant que sources de carbone le glucose, le fructose, l'acide acétique, l'éthanol, avec addition de vitamines et d'amino-acides ou bien de substrats qui les contiennent, et contenant aussi des sources d'azote et les sels minéraux nécessaires (voir les brevets anglais none 1223470, 1260995, 1286208, les brevets francais n n 1573433, 1580549,

1579835, 1603855, le brevet RFA ne 2044907).

Le meilleur rendement en L-thréonine est obtenu au moyen des souches mutantes Br. flavum, qui, au sein d'un milieu contenant du glucose, produisent Jusqu'à 18 g/l de L- thréonine (Agr. Biol. Chem. 1973, 37, 653) , Jusqu'à g/l de L-thréonine au sein d'un milieu de culture contenant de l'acide acétique (brevet anglais ne 1260995) et Jusqu'à 33,8 g/l de Lthréonine au sein d'un milieu de

culture contenant de l'éthanol (brevet anglais n" 1286208).

Les souches mutantes utilisées étaient résistantes à l'acide

O-amino- X -oxyvalérique.

Il est connu un procédé de préparation de L-thréo-

nine consistant en ce que l'on effectue une culture en profondeur de souches mutantes Escherichia coli au sein de milieux de culture contenant des hydrates de carbone, des sources d'azote, des sels minéraux, au cours duquel on additionne au milieu de culture des amino-acides purs et des vitamines ou bien des hydrolysats de la masse protéique qui les contiennent. Selon ce procédé, on atteint le rendement maximum en Lthréonine de 10,4 g/l de L-thréonine dans le milieu de fermentation pendant 96 heures de fermentation (voir le brevet Grande-Bretagne n 1223470, le brevet Etats-Unis n 3711375, les brevets France

nen 1551414 et 1580545).

Les souches mutantes utilisées dans les procédés indiqués sont caractérisées par leur demande en isoleucine ou en isoleucine et en méthionine (voir le brevet anglais ne 1223470), ou bien en acide diaminopimélique (voir les

brevets Etats-Unis ne 3711375, France nÀ 1551414).

Les procédés précités sont caractérisés par un faible niveau d'accumulation de la L-thréonine, notamment au sein des milieux hydrocarbonés, ainsi que par la durée

prolongée de la fermentation (96 à 120 heures).

Il est aussi connu un procédé de préparation de L-thréonine par culture en profondeur d'un producteur de L-thréonine au sein d'un milieu de culture comprenant des sources de carbone, d'azote, des sels minéraux. Comme

producteur de L-thréonine on utilise des mutants polyauxo-

trophes Escherichia coli, des souches telles que E. coli ATCC 21272, E. coli ATCC 21148, E.coli ATCC 21149. Comme

source de carbone on utilise le glucose et le fructose.

Les souches précitées sont caractérisées par leur demande

en acide diaminopimélique, en isoleucine, en méthionine.

Ainsi, la souche E.coli ATCC 21272, par exemple, à besoin d'acide diaminopimélique, de méthionine, d'isoleucine, la souche E.coli ATCC 21148 a besoin d'acide diaminopimélique, de méthionine, la souche E.coli ATCC 21149 a besoin d'acide diaminopimélique. Au cours de la culture, outre les facteurs de croissance précités, il est nécessaire d'ajouter de la lysine. On effectue la culture & une température de 20 à 400C. Lors de la culture au sein du milieu contenant

7,5% de fructose, les souches indiquées produisent la.

L-thréonine, la concentration en L-thréonine du milieu de culture allant d'abord en croissant, mais diminuant ensuite avec le temps du fait de sa dégradation. Pour prolonger la période d'accumulation de la L-thréonine et empêcher la baisse de sa concentration dans le milieu de culture, on utilise des antibiotiques. En tant qu'antibiotiques on met en oeuvre de la streptomycine, de la tétracycline, de la canamycine (antibiotique à large spectre d'action inhibant la synthèse de l'albumine dans les bactéries), de la

polymyxine ou bien leurs mélanges.

Dans le cas o 40 heures après le début de la fermentation on ajoute de la streptomycine, la durée du processus de fermentation se prolonge Jusqu'à 120 heures et le niveau d'accumulation de la L-thréonine atteint 13,2 g/l, si l'on utilise un milieu contenant 7.5% de fructose sur la souche-E.coli ATCC 21148 demandant de l'acide diaminopimélique et de la méthionine. La quantité d'antibiotiques introduite dans le milieu est de 10 à

1000 mg/l. (brevet France NO 1579835).

L'inconvénient essentiel dudit procédé tient à la faible vitesse moyenne d'accumulation du produit visé au cours de la fermentation, qui ne dépasse pas 0,15 à 0,20 g/i par heure, ce qui conduit à un faible niveau d'accumulation de la L-thréonine et à une prolongation de la durée du processus de fermentation. En outre, la mise en application du procédé précité impose la nécessité d'introduire dans le milieu de culture des constituants supplémentaires, tels que, par exemple, l'acide diaminopimélique, la méthionine, l'isoleucine, dont les producteurs utilisés dans ledit

procédé ont besoin.

La présente invention vise à élever la vitesse d'accumulation du produit visé, la L-thréonine, dans le milieu de culture et de réduire la durée de fermentation en mettant en oeuvre une nouvelle souche productrice et en modifiant les conditions dans lesquelles s'effectue la culture. Ce but est atteint du fait que le procédé de préparation de L-thréonine par culture en profondeur du producteur Escherichia coli au sein d'un milieu de culture contenant des sources de carbone, d'azote, des sels minéraux, en présence d'antibiotiques, suivie de la séparation de la

masse biologique d'avec le liquide de culture et de l'isole-

ment du produit visé, est caractérisé, suivant l'invention, en ce qu'on utilise comme souche productrice la souche Escherichiea coli VNII génétika M-1 déposée au Musée central des micro-organismes à destination industrielle sous le numéro d'enregistrement TsMPMV-1856, sélectionnée sur la base de la variabilité naturelle de la souche Escherichia coli VNII génétika VL 334 (pYN7), qui a été obtenue au moyen de méthodes d'ingéniérie génétique par augmentation de la dose de gènes mutants qui assurent une production élevée de L-thréonine, par introduction, dans la souche mutante réceptrice, de plasmide (petite molécule cyclique d'acide désoxyribonucléique portant des gènes et capable de

duplication dans une bactérie indépendamment de la duplica-

tion du chromosome) hybride à exemplaires multiples portant lesdits gènes, la culture étant effectuée en présence de pénicilline, la résistance à laquelle est déterminée par le même plasmide. Il est avantageux d'introduire dans le milieu de culture initial la pénicilline à raison de 0,1 à 0,5 g/l. Ceci permet, au cours de la fermentation, d'utiliser le milieu enrichi par des substances nutritives, ce qui offre la possibilité de réduire considérablement la durée de l'étape initiale (improductive) de fermentation en augmentant de plusieurs fois, au cours de cette- période, la vitesse spécifique de croissance de la culture sans altérer les propriétés principales du producteur. En vue d'enrichir le milieu de culture initial, on a recours à un hydrolysat acide ou fermentatif de levures, ou bien à un autolysat de levures, introduit à raison de 1 à 5 g/l en comptant en poids sec de levures. Afin de maintenir les

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valeurs optimales de concentration en carbone, en azote et de la valeur du pH du milieu fermentatif au cours de la culture, on introduit périodiquement dans le milieu de culture une matière d'alimentation d'appoint équilibrée sous forme d'un mélange contenant une solution d'ammoniac

et une source de carbone.

Le procédé, objet de l'invention, est mis en

oeuvre comme suit.

En tant que souche productrice on utilise la souche Escherichia coli VNII génétika M-1, sélectionnée sur la base de la variabilité naturelle de la souche initiale E.coli VNIIgénétika VL 344 (pYN7). Le procédé de préparation de la souche E.coli VNIIgénétika VL 334 (pYN7) consiste en ce qu'un fragment d'acide désoxyribonucléique ADN du chromosome de la souche donatrice E.coliVUI génétika MG-442, obtenu au moyen de l'endonucléase Hind 111 contenant tous les gènes de l'opéron de thréonine, et dans lequel, par suite de leur mutation, les ferments-produits du gène thr A sont résistants à l'inhibition par la thréonine, est réuni avec une molécule vectorielle d'ADN, en qualité de laquelle on utilise le plasmide pBR 322, ce qui a pour effet de créer un plasmide hybride dont le poids moléculaire est de 11,4 mégadaltons et qui est constitué de deux exemplaires

de plasmide pBR 322 et du fragment précité d'acide désoxy-

ribonucléique du chromosome de la souche donatrice. Le plasmide hybride obtenu est traité avec des endonucléases spécifiques Hind 111 et Bam I, et les fragments qui se

forment sont réunis par traitement avec de la polynucléo-

tidelygase. Le plasmide hybride qui se forme a un poids moléculaire de 5, 7 mégadaltons, est constitué d'une molécule

de plasmide pBR 322 et du fragment précité d'acide désoxy-

ribonucléique du chromosome de la souche donatrice, assure la résistance des cellules à la pénicilline et peut se

trouver dans les cellules au stade de croissance logari-

thmique en quantité de 40 à 50 exemplaires. On se sert du plasmide hybride obtenu précité pour transformer les cellules de la souche réceptrice E.coli VL 334 présentant des mutations qui bloquent la synthèse de la L-thréonine et de la L-isoleucine, le blocage en isoleucine étant partiel et pouvant être compensé par la teneur élevée en thréonine de la cellule. Les mutations précitées offrent un avantage sélectif aux cellules contenant un plasmide hybride amplifié au cours de la culture dans un milieu minimum. On obtient la souche E.coli VNIIgénétika VL 334 (pYN7) productrice de L-thréonine déposée au Musée central des micro-organismes à destination industrielle de Vsesoyuzny nauchno-issledovatelsky institut genetiki i selektsii promyshlennykh microorganismov, et dont le

numéro d'enregistrement est TsMPMV-1684.

A la suite de l'ensemencement avec cette souche du milieu de culture agarisé et de la vérification de l'aptitude d'un grand nombre de colonies séparées à produire de la L-thréonine au sein d'un milieu minimum contenant du glucose et du sel, ainsi que son aptitude à conserver le plasmide'au cours de la fermentation, on est

arrivé à isoler la souche E.coli VlTEgénétika M-1.

La souche productrice Escherichia coli VNIIgéné-

tika M-1 utilisée dans le procédé proposé présente la

caractéristique suivante.

Morphologie. BAtonnets fins, gram-négatifs, faiblement mobiles, à bouts arrondis, de 1,5 à 2 mm de

longueur.

Caractéristiques physiologiques et de culture Agar de boeuf peptonisé. Après 24 heures de croissance à la température de 37 C, il se forme des colonies de forme ronde, blanchâtres, semi-transparentes à la lumière, de 2 à 3 mm de diamètre; la surface des colonies est lisse, leurs bords sont soit unis, soit légèrement ondulés; le centre de la colonie est un peu relevé, sa structure est homogène, sa consistance est

pAteuse et elle est facilement émulsifiable.

Milieu minimum agarisé (d'Adams) contenant du glucose Après deux journées de croissance à la température

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de 371C, il se forme des colonies de ? à 1,5 mm de diamètre, de couleur blanc-grisâtre, de forme ronde, à bords unis, légèrement bombées, de sousstructure homogène. Leur surface est brillante. Après 4 à 5 jours la consistance des colonies devient mucilagineuse (mucolde). Croissance sur bouillon de boeuf peptonisé Après 24 heures de croissance à la température

de 370C, on observe un trouble régulier considérable.

Dépôt faible, odeur typique. -

Croissance au sein d'un milieu liquide minimum d'Adams Après deux jours de croissance à la température de-371C et sous aération, on observe un trouble régulier considérable. Croissance suivant la piqûre dans l'agar de boeuf peptonisé

La croissance est bonne suivant toute la piqûre.

La gélatine n'est pas fluidifiée sous son action.

Dans le lait on observe une bonne croissance

accompagnée de la coagulation du lait.

Elle forme de l'indol.

Croissance au sein des divers hydrates de carbone On observe une bonne croissance au sein de glucose,

de lactose, de mannose, de galactose, de xylose, de fruc-

tose, de glycérol, de mannitol, avec la formation d'acide

et de gaz.

Résistance aux antibiotiques. Elle est résistante

à la pénicilline.

La souche n'est pas pathogène.

Teneur en plasmide. Au stade logarithmique de la

croissance les cellules contiennent environ 40 à 50 exem-

plaires de plasmide pYN7 (poids moléculaire de 5,7 méga-

daltons) qui assure la résistance de la souche à la

pénicilline et porte les gènes de l'opéron de thréonine.

Demande de facteurs de croissance. Elle croit au

sein du milieu minimum à glucose et à sel (durée de généra-

tion 240 min). La croissance est stimulée par l'isoleucine

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(durée de génération 60 min) au sein d'un milieu de culture enrichi par un hydrolysat fermentatif ou acide de levures, ou bien par un autolysat de levures (durée de génération

de 30 à 40 min).

La souche E.coliVUI génétika M-1 sélectionnée dans les semences de la souche E.coli VNIIgénétika VL 334 (pYN7) se distingue de la souche initiale par le caractère mucoide manifeste de la surface des colonies, par son aptitude à la production de L-thréonine, par sa plus grande résistance au cours de la croissance au sein de milieux contenant des additifs nutritifs, c'est-à-dire par l'aptitude de la

polulation des cellules à conserver ses propriétés princi-

pales (production de L-thréonine et résistance à la pénicil-

line) après la culture dans les conditions précitées. Les caractéristiques comparatives des souches précitées sont

présentée dans le tableau ci-dessous.

TABLEAU

- Caractéristique comparative de la souche E.coli VNII génétika M-1 de la couche initiale E.coliMNI génétika VL 334 (pYN7) d'après l'aptitude de la population des cellules à conserver les propriétés principales (production de L-thréonine et résistance à la pénicilline) après la culture

dans différentes conditions.

Fréquence des cellules conservant les propriétés principales après la culture (%) Souche au sein du milieu au sein du bouillon à glucose et à de culture (de sel boeuf peptonisé) (BBP) E.coli VNIIgénétika VL 334 (pYN7) 72-98 2-42 E.coli VNIIgénétika

M-1 88-100 82-98

Les cultures ont été réalisées sur une bascule à la température de 37 C au sein des milieux mentionnés dans le

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tableau et, après 10 générations, ont été semées dans des boites contenant du bouillon agarisé de Hottinger, afin d'obtenir des colonies séparées. Ensuite, au moins 100 colonies de chaque essai ont été contrôlées au moyen d'un réplicateur en vue de vérifier leur résistance à la pénicilline, ainsi que leur aptitude à produire de la thréonine. Comme on le voit d'après les résultats présentés dans le tableau, après la culture au sein du milieu à glucose et à sel, les populations des cellules des deux souches conservent de manière presque identique leur capacité de production de la thréonine, c'est-à-dire

qu'elles sont identiquement stables dans ces conditions.

Cependant, après la culture au sein du milieu riche en substances nutritives (BBP), le nombre de cellules de la nouvelle souche E.coli VNIIgénétika M-1 qui conservent la capacité de production de la thréonine est beaucoup plus grand que celui de la souche initiale, c'est-à-dire que dans des conditions assurant l'enrichissement du milieu

de culture, la nouvelle souche est plus stable.

Cette propriété de la souche E.coli VNIIgénétika M-1, ainsi que l'introduction, dans le milieu, de la pénicilline, la résistance à laquelle est due au plasmide hybride,permettent, au cours de la culture, de mettre en oeuvre des additifs nutritifs accélérant considérablement la croissance des micro-organismes. Ainsi, la durée de génération, au sein du milieu à glucose et à sel, de la souche E.coli VNIIgénétika M-1 est de 240 m-rntandis que dans le milieu enrichi elle est de 30 à 40 min. La vitesse élevée de la croissance de la souche au sein du milieu

enrichi permet à son tour d'exclure du processus technolo-

gique les étapes de préparation de la semence dans des ballons ou dans des appareils de semence, ainsi que de

réduire la durée de la fermentation.

La culture est réalisée de la manière suivante.

Une semence de culture du micro-organisme E.coli VNIIgénétika M-1 est cultivée pendant 40 à 50 heures au

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sein d'un milieu minimum agarisé contenant de la pénicilline (500 M-g/ml), ensuite les cellules sont éliminées de la

surface du squelete par lavage avec une solution physiolo-

gique. La suspension de cellules obtenue est utilisée pour ensemencer le milieu de fermentation. La concentration initiale en cellules dans le fermenteur en fonctionnement peut être d'environ 2 à 5 x 103-107 cellules/ml. Le milieu de culture initial contient du glucose, de l'azote minéral, des sels, de la pénicilline et des additifs nutritifs sous forme d'hydrolysats de la masse protéique, par exemple d'hydrolysats acides, d'autolysats ou de produits de fermentation de levures. Le pH initial du milieu est établi au niveau de 7,0 à 7,2 et, au cours de la fermentation, est automatiquement maintenu dans ces limites au moyen d'un capteur de pH par introduction d'une matière d'alimentation d'appoint équilibrée contenant de l'ammoniac (en solution aqueuse) et de la glucose. Vu que la réduction du pH du milieu au cours de la culture du producteur de Lthréonine est due à une diminution de la concentration en ammonium (azote) du milieu du fait de son utilisation par le producteur, et que le rapport des vitesses d'utilisation de l'azote et de la glucose reste approximativement constant, le rapport des quantités desdits constituants dans le mélange de culture doit correspondre au rapport des vitesses d'utilisation desdits constituants par la culture de producteur, ce qui est obtenu en introduisant, au cours de la fermentation, ladite matière d'alimentation d'appoint. Le processus se déroule sous aération et agitation continues. La température est maintenue au niveau de 30 à 400C. La durée de fermentation

est de 40 à 50 heures.

A la fin de la fermentation, près de 30 g/l de L-thréonine siaccumu] atdans le milieu de culture. La séparation de la L-thréonine est réalisée de la manière

suivante.

La masse biologique des cellules du producteur est isolée soit par séparation, soit par filtration après le

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traitement préalable avec de l'oxyde de calcium et de l'acide orthophosphorique. En prenant en considération la teneur en L-thréonine et en cations de la solution native, ainsi qu'en composés de pigment, on fait passer la solution native par une succession de colonnes raccordées en série et contenant un sorbant clarifiant pour absorber les composés colorés, et le sulfocationite sous forme -H pour assurer la sorption des cations et de la L-thréonine. La

L-thréonine sorbée est éluée de la colonne avec le sulfo-

o cationite par une solution d'ammoniac. Les fractions d'éluat contenant la quantité principale de L-thréonine sont concentrées par évaporation sous vide, et puis refroidies, et la L-thréonine est cristallisée. Pour

accélérer la cristallisation on peut additionner de l'alcoI.

La L-thréonine obtenue est chromatographiquement homogène et contient de 97 à 99% de substance principale. Pour obtenir des préparations pour usages médicaux, il suffit de réaliser une recristallisation supplémentaire. De telles préparations peuvent être utilisées au sein de milieux pour cultiver des cellules de tissus. Le rendement d'après la méthode décrite ci-dessus est de 80 à 95%. Si la concentration du milieu de culture en L-thréonine est élevée (supérieure à 18 g/l), et la teneur en impuretés est relativement basse, la L-thréonine peut être séparée sans utiliser les étapes de sorption sur les ionites. A cet effet, la solution clarifiée

est concentrée par évaporation sous vide aux basses tempé-

ratures et la L-thréonine est cristallisée à la température abaissée avec addition ou non d'alcool éthylique. Après la recristallisation, on obtient la L-thréonine à teneur

en matière principale de 99%.

Du point de vue de l'efficacité, le procédé propos t supérieur à tous les procédés connus de préparation de L-thréonine au sein de milieux hydrocarbonés. Ce procédé permet d'obtenir dans le liquide de culture jusqu'à 30 g/l de L-thréonine sans addition d'amino-acides et de réduire

la durée du procédé de fermentation jusqu'à 40 heures.

La vitesse moyenne d'accumulation de la L-thréonine

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au cours de la fermentation atteint 0,75 g/il par heure,' ce qui est de 5 fois supérieur à la vitesse d'accumulation

de la thréonine selon le procédé connu.

L'invention ressortira mieux de la description

détaillée, qui va suivre, de plusieurs exemples concrets mais non limitatifs de mise en oeuvre du procédé de

préparation de L-thréonine.

Exemple 1

Une semence de culture de producteur E.coli VNII-

génétika M-1 est cultivée pendant 43 heures au sein d'un

milieu minimum agarisé à glucose et à sel, dont la composi-

tion est la suivante (en g/l): glucose - 5,0; NH4Cl - 1,0; KH2P04 - 1,5; Na2HP04 - 3,5; MgS04.7H20 - 0,1; pénicilline - 500JAg/ml; agar-agar - 20, 0; eau distillée - le reste; pH - de 7,0 à 7,2. Le glucose et la pénicilline sont stérilisés séparément et introduits dans le milieu en fusion avant son refroidissement et son ensemencement. La culture obtenue est enlevée avec de l'eau stérilede robinet, et la suspension de cellules obtenue est utilisée-pour réaliser l'ensemencement des fermenteurs. La concentration

initiale en cellules du producteur du milieu de fermenta-

tion est de 106-107 cel./ml.

On effectue la fermentation dans un fermenteur de laboratoire d'une capacité de 0,5 1. La composition du milieu de culture principal de fermentation en % (en vdume) est la suivante:

(NH4)2S04 - 1,5

K2HPO4 - 0,2

MgS04 - 0,04 hydrolysat acide de levures (en calculant en poids sec de levures - 0,3 agent antimousse - 0,1

eau - le reste.

Le milieu de culture est stérilisé en même temps que l'appareil, après quoi on introduit dans ledit milieu

2% de glucose stérilisé et 0,5 g/il de pénicilline.

La fermentation est menée à la température de 35 à 37 C, avec introduction d'une matière d'alimentation d'appoint équilibrée sous forme d'un mélange contenant de l'ammoniac à raison de 2,5 à 2,7% et du glucose à une concentration de 35%. La matière d'alimentation d'appoint est introduite en réponse au signal du capteur de pH. Le

niveau de pH est établi dans les limites de 7,0 à 7,2.

Après 40 heures de fermentation, la L-thréonine s'accumule dans le liquide de culture à raison de 30 g/l. La vitesse moyenne d'accumulation de la L-thréonine est de 0,75 g/l par heure. Les dépenses de glucose pour la synthèse de

L-thréonine sont de 6 g par gramme de L-thréonine.

Ensuite la L-thréonine est séparée du liquide de culture. A cet effet, à 300 ml de liquide de culture à concentration en L-thréonine de 30 g/l on ajoute sous agitation 3 g d'oxyde de calcium, et puis on ajoute de l'acide orthophosphorique jusqu'à ce que la valeur du pH atteigne 5,6. La solution est chauffée à la température de 60 C, maintenue à cette température pendant 10 minutes, après quoi la masse biologique est séparée par filtration sous vide. On fait passer la solution native obtenue (densité optique 0,4 à 525 nm dans 1 cm de cuvette) à travers une colonne contenant 50 ml de résine clarifiante, et on fait passer la solution clarifiée (densité optique

0,08) à travers une colonne contenant 150 ml de sulfo-

cationite sous forme -H. La colonne est lavée avec 300 ml d'eau. La Lthréonine sorbe estérusaec une solution à 3% d'ammoniac, l'éluat est concentré par évaporation sous vide jusqu'à obtention d'une teneur en matières sèches de 25%, ensuite on aJoute de l'alcool éthylique dans un rapport de 1:1, et on laisse séjourner pour la cristallisation pendant heures à une température de 0 à +5 C. Les cristaux de

L-thréonine sont séparés par filtration, lavés et séchés.

On obtient 8,1 g de L-thréonine (rendement 90%). L'analyse par chromatographie en couches minces, avec application sur le chromatogramme, de 10/og de préparation, prouve

l'absence d'autres amino-acides.

Exemple 2

Une semence de culture de producteur E.coli VNII-

génétika M-1 est préparée d'une manière analogue à celle

décrite dans l'exemple 1.

La fermentation est effectuée dans un fermenteur dont la capacité est de 0,5 1. La composition du milieu de culture initial est analogue à celle décrite dans l'exemple 1, à l'exception du fait que l'cnutilise, comme additif nutritif, un hydrolysat fermentatif de levures (au lieu d'hydrolysat acide de levures) dans une proportion de 0,5%

en comptant en poids sec de levures.

Les conditions de la fermentation sont analogues à celles décrites dans l'exemple 1. Après 41 heures de fermentation, la quantité de L-thréonine accumulée dans le milieu de culture est de 29 g/l. La vitesse moyenne d'accumulation de L-thréonine est de 0,71 g/h. Ensuite on procède à la séparation de la L-thréonine dévec le liquide de culture. 1 A cet effet, après la séparation des cellules de producteurpar centrifugation du liquide de culture (matières sèches contenues dans la solution native - 7, 5%, densité optique - 0,6 (525 nm), 300 ml d'une solution native de Lthréonine sont concentrés par évaporation sous vide à la température de 50QC jusqu'à obtention d'un volume de 50 ml, ensuite on ajoute le même volume d'alcool éthylique et on effectue la cristallisation de la Lthréonine pendant heures à la température de 0C. Les cristaux obtenus sont séparés par filtration, lavés avec 15 ml d'alcool éthylique et séchés. On obtient 6,1 g de L-thréonine. Les résultats de l'analyse par chromatographie en couches minces (en appliquant 10 /<-g sur le chromatogramme) prouve l'absence

d'autres amino-acides.

Exemple 3

Une semence de culture du producteur E.coli VNII-

génétika M-1 est préparée d'une manière analogue à celle

décrite dans l'exemple 1.

La fermentation est menée dans un fermenteur d'une

24610C6 capacité de 2 m3. La composition du milieu de culture initial est analogue

à celle décrite à l'exemple 1, à l'exception du fait que l'on utilise, comme additif nutritif dans le milieu de culture, un hydrolysat de levures à raison de 0,4% en calculant en poids sec de

levures, la teneur en pénicilline étant de 0,2 g/l.

La concentration initiale en cellules de producteur

du milieu de fermentation est de 103 à 104 cellules/ml.

Après 43 heures de fermentation, la quantité de L-thréonine accumulée dans le liquide de culture est de 18 g/l. Les dépenses de glucose sont identiques à celles de l'exemple 1. La vitesse moyenne d'accumulation de la

L-thréonine est de 0,42 g/l par heure.

La séparation du produit visé est effectuée d'une manière analogue à celle décrite dans l'exemple 1. Le

rendement en L-thréonine est de 80%.

Bien entendu, l'invention n'est nullement limitée aux modes de réalisation décrits qui n'ont été donnés qu'à titre d'exemple. En particulier, elle comprend tous les moyens constituant des équivalents techniques des moyens décrits ainsi que leurs combinaisons si celles-ci sont exécutées suivant son esprit et mises en oeuvre dans le

cadre de la protection comme revendiquée.

Claims (5)

R E V E N D I C A T I 0 NS

1.- Procédé de préparation de L-thréonine par culture en profondeur d'une souche productrice Escherichia coli au sein d'un milieu de culture contenant des sources de carbone, d'azote, et des sels minéraux, en présence d'antibiotiques, suivie de la séparation de la masse biologique d'avec le liquide de culture et de l'isolement du produit visé, caractérisé en ce qu'on utilise comme souche productrice la souche Escherichia coli VNIIgénétika M-1 déposée au Musée central des microorganismes pour

usages industriels auprès de l'Institut "Vsesojuzny nauchno-

issledovatelsky institut génétiki i selektsii promyshlennykh microorganizmov" sous le numéro d'enregistrement TsMPV-1856, sélectionnée sur la base de la variabilité naturelle de la souche Escherichia coli VNIIgénétika VL 334 (pYN7) obtenue

au moyen de méthodes d'ingéniérie génétique par augmenta-

tion de la dose de gènes mutants assurant une production élevée de Lthréonine, par introduction, dans la souche mutante réceptrice de plasmide hybride à exemplaires multiples portant lesdits gènes, la culture étant effectuée en présence de pénicilline, la résistance à laquelle est

déterminée par ledit plasmide hybride.

2.- Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la pénicilline est introduite à raison de 0,1

à 0,5 g/l.

3. Procédé suivant l'une des revendications 1 et 2,

caractérisé en ce que la culture est effectuée au sein d'un milieu de culture comprenant un hydrolysat acide de levures, un hydrolysat fermentatif de levures ou un autolysat de levures, à raison de 0,1 à 0,5% en calculant en poids sec

de levures.

4.- Procédé selon l'une des revendications 1, 2 et

3, caractérisé en ce que, dans le but de maintenir des cooen-

trations optimales de carbone, d'azote et un niveau constant du pH au cours de la culture, on introduit

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périodiquement dans le milieu de culture un mélange contenant une solution d'ammoniac et une source de carbone.

5.- La L-thréonine, caractérisée en ce qu'elle est obtenue par le procédé faisant l'objet de l'une des

revendications 1, 2, 3 et 4.