FR2460289A1 - Nouveaux tripeptides, leur preparation et les medicaments qui les contiennent - Google Patents

Abstract

NOUVEAUX TRIPEPTIDES DE FORMULE GENERALE DANS LAQUELLE LES SYMBOLES R REPRESENTENT UN ATOME D'HYDROGENE OU UN RESTE D'ACIDE GRAS (L'UN AU MOINS ETANT UN RESTE D'ACIDE GRAS), R REPRESENTE UN RADICAL HYDROXY OU AMINO ET R REPRESENTE UN ATOME D'HYDROGENE OU UN RADICAL CARBAMOYLE, ETANT ENTENDU QUE L'ALANINE EST SOUS FORMEL, L'ACIDE GLUTAMIQUE EST SOUS FORMED, LA LYSINE (RATOME D'HYDROGENE) EST SOUS FORMEL ET L'ACIDE DIAMINO-2,6 PIMELAMIQUE (RCARBAMOYLE) EST SOUS FORME D,D; L,L; DD,LL (RACEMIQUE) OU D,L (MESO), LEURS SELS, LEUR PREPARATION ET LES MEDICAMENTS QUI LES CONTIENNENT. CES NOUVEAUX TRIPEPTIDES SONT PARTICULIEREMENT UTILES COMME ADJUVANTS IMMUNOLOGIQUES ET IMMUNOSTIMULANTS. (CF DESSIN DANS BOPI)

Description

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La présente invention, à la réalisation de laquelle ont participé Messieurs Jean BOUCHAUDON, Daniel FARGE et Claude JAMES, concerne de nouveaux tripeptides de formule générale: R - NH - CH - CO - Nit - Cll CO - R I Ii CH3 ci2CH2 -CO - NH CH- COOH I

(C H2)3

R - NH - CH - R2

éventuellement leurs sels non toxiques, leur préparation et les médicaments

qui les contiennent.

Les parois bactérieunes, par exemple les parois de mycobactéries,

sont constituées essentiellement d'un peptidoglycane formé d'acide Nacétyl-

muramique sur lequel sont fixés des peptides renfermant l1enchatnement L Ala-

D Glu-DAP. Par ailleurs, les parois bactériennes sont très riches en lipides dont certains sont libres et extractibles et d'autres sont liés à la structure de la paroi et sont constitués par des acides mycoliques (acides gras géants,

a-ramifiés et p-hydroxylés). L'ensemble des constituants de la paroi cellu-

laire forme une structure covalente composée d'un peptidoglycane et d'un

mycolate d'arabinogalactane liés entre eux par des liaisons phosphodiesters.

Ces parois bactériennes présentent la plupart des propriétés biologiques des cellules entières lorsqu'elles sont associées à une huile minérale ou végétale

et administrées après mise en suspension dans du soluté physiologique.

Dans les brevets belges 821 385, 852 348 et 852 349 sont décrits

des peptides, couplés avec l'acide N-acétylmuramique, qui contiennent l'enchat-

nement L Ala-b Glu ou L Ser-DL Glu et qui sont efficaces comme adjuvants inmnuno-

logiques et coniie agents antiintecLieux.

Dans le brevet [rancai 75.24440, publié sous le numéro 2 320 107, sont décrits des produiLbts de couplage entre un acide gras et un saccharide heptapepLide isolé à partir d'une mycobactérie contenant une cire "D" et qui peuvent être représentés par la formule suivante:

NAG - NAM =- NAC - NAM

&la Ala U OGlu (R COOH)n (I)

DAP DAP

m

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dans laquelle, en particulier: NAG = N-acéLylglucosaniine; NAM = acide Nacétylmuramique

R = radical alcoyle contenant 9 à 17 atomes de carbone.

Ces produits sont des adjuvants immunologiques de la production d'anticorps et de l'hypersensibilité retardée capables d'agir seuls, c'est-à-

dire sans qu'il soit nécessaire de les administrer en solution huileuse.

Tous ces produits se caractérisent par la présence d'acide Nacétylmuramique qui, d'après KASUMOTO et al., Tetrahedron Letters, 49, 4899

(1978), est considéré comme lié à l'activité immunologique.

Il a maintenant été trouvé que les peptides de formule générale (I)

présentent, malgré l'absence d'acide N-acétylmuramique, des propriétés adju-

vantes et immunostimulantes remarquables. Par ailleurs ces conmposés, qui 'ont bien définis, peuvent être obtenus aisément avec la pureté suffisante requise

pour l'emploi en thérapeutique.

Dans la formule générale (I), les symboles R, identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène ou

un reste d'acide gras, étant entendu que l'un au moins des symboles R repré-

sente un reste d'acide gras, R1 représente un radical hydroxy ou amino, et R2 représente un atome d'hydrogène ou un radical carbamoyle, étant entendu que l'alanine est sous forme L, l'acide glutamique est sous forme D, la lysine, lorsque R2 représente un atome d'hydrogène, est sous forme L et l'acide diamino-2,6 pimélamique, lorsque R2 représente un radical carbamoyle,

peut être sous forme D,D; L,L; DD,LL (racémique) ou D,L (méso).

Par reste d'acide gras, il faut entendre un radical alcanoyle contenant 1 à 45 atomes de carbone (éventuellement substitué par un radical hydroxy, phényle ou cyclohexyle), un radical alcénoyle contenant 3 à 30 atomes de carbone et pouvant contenir plus d'une double liaison ou un reste d'acide mycolique tel que rencontré dans la structure de la paroi bactérienne des

mycobactéries, des Nocardia ou corynébactéries.

Selon la présente invention, les nouveaux tripeptides de formule générale (I) peuvent Etre obtenus selon les méthodes généralement utilisées en synthèse peptidique. Les différentes réactions sont mises en jeu après blocage par des groupements protecteurs convenables des fonctions amines ou

acides qui ne doivent pas participer dans les réactions, et suivies du déblo-

cage de ces fonctions.

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Plus parLiculièreL.hl , les nouveaux tripeptides de formule géné-

rale (I) I>euvent 8tre obteius palr aot ion d'un dipeptide de formule générale: R5 -NH -CH - CO -NMi - Cil - CO-R3 51 1 i (III) CIl3 (1t1I2 2 C2OOt dans laquelle R5 représente un reste d'acide gras ou un groupement protecteur de la fonction amine tel que le radical benzyloxycarbonyle ou t.butyloxycarbo- nyle et R3 représente un radical amino ou un radical alcoyloxy contenant 1 à 4

atomes de carbone (éventuellement substitué par un radical phényle ou nitro-

phényle), sur un aminoacide de formule générale Il2N - CH - CO - R4 (o F2) 3 - (IV) R5 - Nil - CH- R2 dans laquelle R4 représente un radical hydroxy ou un radical alcoyloxy contenant 1 à 4 atomes de carbone (éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle), R2 est défini comme précédemment et R5 représente un reste d'acide gras ou un groupement protecteur de fonction amine tel que le radical benzyloxycarbonyle ou t. butyloxycarbonyle, étant entendu que l'un au moins des symboles R5 des formules (III) et (IV) représente un reste d'acide gras, suivie éventuellement du remplacement du radical R5, lorsqu'il représente un groupement protecteur de fonction amine, par un atome d'hydrogène et des

radicaux R3 et R4 par un radical hydroxy.

Généralement il est nécessaire d'activer la fonction acide libre

du dipeptide de formule générale (III) préalablement à son action sur l'amino-

acide de formule générale (IV). De préférence le dérivé activé du dipeptide de formule générale (III) est un anhydride mixte, préparé in situ par action d'un halogénoformiate d'alcoyle (te] que le chloroformiate d'isobutyle) sur le dipeptide de formule générale (III). La condensation du dérivé activé s'effectue dans un solvant organique tel que le dioxanne, le tétrahydrofuranne, le chloroforme, le toluène ou le diméthylformamide ou dans un milieu hydroorganique, en présence d'une base (minérale, telle que la soude, ou organique, telle que

la triéthylamine), à une température comprise entre -10 et +30 C0.

Le remplacement éventuel du radical R5 par un atome d'hydrogène et des radicaux R3 et R4 par un radical hydroxy peut etre effectué selon les méthodes connues suivant la nature des groupements protecteurs. Il est

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particulièrement avanlLageux de choisir les radicaux R3, R4 et R5 de telle nmanière que leur remplacei2ntL par un radical hydroxy ou par un atome d'hydrogène puisse s'effectuer en une seule pihabe. A cet effet, il convient de choisir de préférence les radicaux R3 et R4 parmi les radicaux benzyloxy ou nitrobenzyloxy et R5 parmi les radicaux benzy] oxycarbonvyle ou nitrobenzyloxycarbonyle. Dans ces conditions le remplacement de ces radicaux s'effectue par hydrogénolyse

en opérant dans un solvant organique approprié-tel que l'acide acétique (éven-

tuellement en mélange avec un autre solvant organique tel que le méthanol) ou dans un solvant hydroorganique en présence d'un catalyseur tel que le palladium, par exemple le palladium sur noir, à une température voisine de 200C et sous

une pression voisine de 760 mm de mercure.

Le dipeptide de formule générale (III) peut être obtenu par action d'un dérivé activé de la L alanine de formule générale

R5 -NH -GH - COOH (V)

CH3

dans laquelle R5 est défini comme précédemment, sur un dérivé de l'acide D gluta-

mique de formule générale: H2N - fH - CO -R3

CH2CH - COOH(V)

dans laquelle R3 est défini comme précédemment, dans les conditions décrites ci-dessus pour l'action d'un dérivé activé d'un dipeptide de formule générale

(III) sur un aminoacide de formule générale (IV).

Le dipeptide de formule générale (III) dans laquelle R5 représente un reste d'acide gras peut être obtenu par action d'un dérivé activé d'un acide gras de formule générale:

R' - CO - OH (VII)

dans laquelle R' - CO - représente un reste d'acide gras tel que défini comme précédexmmeint, sur un dipeptide de formule générale H2N - iCH - CO - NH - CH - CO - R 2 j j 3 (VI)

CH3 CH2 CH2 - COOH

dans laquelle R3 est défini comme précédemment.

Comme dérivé activé de l'acide de formule générale (VII), il est particulièrement avantageux d'utiliser un halogénure d'acide ou un anhydride mixte qui est généralement préparé in situ par action d'un halogénoformiate d'alcoyle, Lel que le clhloroturliiaLe d'isobutyle, sur l'acide de formule

générale (VII), en présence d'une base.

Lorsque l'on utilise l'acide de formule générale (VII) sous forme

d'un halogénure d'acide, plus particulièrement le chlorure, la réaction s'effec-

tue dans un solvant organique tel que l'éther diéthylique ou le chlorure de méthylène, en présence dtune base (minérale, telle que la soude, ou organique,

telle que la triéthylamine), à une température comprise entre 0 et 3000C.

Généralement le dipeptide de formule générale (VIII) est utilisé sous forme d'un

sel tel que le chlorhydrate.

Lorsque l'on utilise l'acide de formule générale (VII) sous forme d'anhydride mixte, la réaction s'effectue dans les conditions décrites cidessus pour l'action d'un dipeptide de formule générale (III) sur l'aminoacide de

formule générale (IV).

Généralement le dipeptide de formule générale (VIII) est utilisé

sous forme d'un sel tel que le chlorhydrate.

L'aminoacide de formule générale (IV) dans laquelle R2 représente un radical carbamoyle, R4 représente un radical hydroxy et R5 représente un

radical benzyloxycarbonyle, c'est-à-dire le (D)-monoamide de l'acide benzyloxy-

carbonyl (D)-méso-diamino-2,6 pimélique, peut itre préparé selon le procédé

décrit dans le brevet belge 821 385.

L'aminoacide de formule générale (IV), dans laquelle R2 représente un radical carbamoyle, R4 représente un radical hydroxy et R5 représente un reste d'acide gras ou un groupement protecteur de fonction amine, sous forme racémique, D,D ou L,L, peut fttre préparé à partir de l'acide diamino-2,6 pimélique correspondant. A cet effet on prépare selon les méthodes connues l'ester dibenzylique de l'acide dibenzyloxycarbonylamino2,6 pimélique, qui est mono-saponifié selon la méthode décrite par A. ARENDT et coll., Roczniki Chemii Ann. Soc. Chim. Polonorum, 48, 1305 (1974), [Chem. Abstr., 82, 31497 g (1975)],

puis transformé, par action du méthanol ammoniacal,en monoamide de formule géné-

rale Z- NH - fH - COOH (CH (lx)

(H2) 3

Z - NH - CH - CO - NH2

(dans laquelle Z représente un radical benzyloxycarbony]) qui, après hydrogéno-

lyse en présence de palladium sur noir, fournit l'acide diamino-2,6 pimélamique.

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Par action d'un sel de cuivre, tel que le bromure cuivrique ou le carbonate basique de cuivre, sur l'acide diamino-2,6 pimélamique, il se forme un complexe qui peut être représenté par la formule lI2N - CH CONH2 à

(CH2)3

( 2) 3

il N - Cil;P 000 - fil - Nil2

H2N - GO - CH - NH2

dans lequel le reste amino en a du groupement carbamoyle peut tre acylé par action d'un dérivé activé d'un acide de formule générale (VII)(de préférence un halogénure tel que le chlorure) ou protégé par action d'un halogénoformiate d'alcoyle ou de benzyle. Le complexe ainsi formé est déplacé par action de l'hydrogène sulfuré pour donner l'aminoacide de formule générale (IV) dans laquelle R2 représente un radical carbamoyle, R4 représente un radical hydroxy

et R5 est défini comme précédemment.

L'aminoacide de formule générale (IV) dans laquelle R2 représente un radical carbamoyle, R4 représente un radical hydroxy et R5 représente un reste d'acide gras, sous forme méso (c'est-à-dire pour lequel la forme D est du c8té des radicaux R2 et R5)peut être préparé par action d'un dérivé activé

d'un acide de formule générale (VII) sur le (D) monoamide de l'acide méso-

diamino-2,6 pimélique (qui est obtenu à partir du (D) monoamide de l'acide benzyloxycarbonyl (D) méso-diamino-2,6 pimélique par hydrogénolyse) en passant

intermédiairement par un complexe cuivrique.

L'aminoacide de formule générale (IV) dans laquelle R2 représente un atome d'hydrogène, R4 représente un radical hydroxy et R5 représente un reste d'acide gras ou un groupement protecteur de la fonction amine peut être obtenu à partir de la L lysine en opérant dans Ies conditions indiquées

ci-dessus par l'intermédiaire d'un complexe cuivrique.

Le dérivé de la L alanine de formule générale (V), dans laquelle R5 représente un reste d'acide gras, peut être obtenu par action d'un acide de formule générale (VII) ou d'un dérivé activé de cet acide sur la L alanine dont la fonction acide est éventuellement protégée sous forme d'ester, suivi$

le cas échéant de l'élimination du groupement protecteur de la fonction acide.

Lorsque la toicLioli acide de la L alanine est protégée, la conden-

sation de l'acide de formule générale (VII) est effectuée généralement en présence d'un agentL de condensation tel que le dicyclohexylcarbodiimide en opérant dans un solvant organique tel que le chlorure de méthylène ou le diinéthylformamide à une tempéraLure comprise entre -10 et +30 C.

Lorsque la fonction acide de la L alanine est libre, il est néces-

saire d'activer l'acide de formule générale (VII) préalablement à son action sur la L alanine. Collme dérivé activé de l'acide de formule générale (VII), il est particulièrement avantageux d'utiliser un halogénure d'acide ou un anhydride mixte. On opère alors dans les conditions décrites précédemment pour l'action d'un acide de formule générale (VII) sur le dipeptide de formule

générale (VIII).

Le dipeptide de formule générale (VIII) peut être obtenu par condensation de la L alanine dont la fonction amine est protégée sur l'acide D glutamique ou ses dérivés selon les méthodes habituelles utilisées en chimie peptidique, suivie de l'élimination du groupement protecteur de la fonction amine. Selon I'invention, les nouveaux tripeptides de formule générale (I) peuvent être obtenus par action d'un dérivé activé de la L alanine de formule générale (V) sur un dipeptide de formule générale:

H2 N - CH - CO - R3

CH2CH2 - CO - NH - CH - CO - R4

(i2 (xi)

(CH2)3

R5 - NH - CH - R2

dans laquelle R2, R3, R4 et R5 sont définis comme précédemment, étant entendu que l'un au moins des symboles R5 des formules (V) et (XI) représente un reste d'acide gras, dans les conditions décrites ci-dessus pour l'action d'un dérivé activé d'un dipeptide de formule générale (III) sur un aminoacide de formule générale (IV), suivie éventuellenment du remplacement du radical R5 lorsqu'il

représente un groupement protecteur de foiation amine par un atome d'hydro-

gène et des radicaux R3 et R4 par un radical hydroxy selon les méthodes connues.

Le dipeptide de formule générale (XI) peut être obtenu par action d'un dérivé de l'acide D glutamique de formule générale: fi -l - (.11-O - R I (xiI) 12(;l2 - CO2 dans laquelle R3 ebL dúilii Loidi., précédemment et Y représente un groupement protecteLur de la fontic:l ioli amille tel que le groupement L.butyloxycarbonyle,

sur un aminoacide de tormule générale (IV) dans les conditions décrites ci-

dessus pour l'action d'un dipeptide de formule générale (III) sur un amino-

acide de formule générale (IV), suivie du remplacement du groupement protec-

teur Y par un atome d'hydrogène selon les méthodes connues sans toucher au

reste de la molécule.

Selon l'invention, les nouveaux tripeptides de formule générale (I) peuvent être obtenus par action d'un acide de formule générale (VII) sur un tripeptide de formule générale: R6- Ni - VIl - CO - Nil- H - CO - R3

CH3 CHH - CO - NH - H - CO - R4 (XIII)

(GH2)3

R6 -NH - CH - R2

dans laquelle les symboles R2, R3 et R4 sont définis comme précédemment et les symboles R6, identiques ou différents représentent un atome d'hydrogène ou le radical R5 défini précédemment, l'un au moins des symboles R6 représentant un atome d'hydrogène, dans les conditions décrites ci-dessus pour l'action d'un acide de formule générale (VII) sur un dipeptide de formule générale (VIII), suivie éventuellement du remplacement de R6, lorsqu'il représente un groupement protecteur de fonction amine, par un atome d'hydrogène et de R3 et R4 par un

radical hydroxy selon les méthodes connues sans toucher au reste de la molécule.

Les nouveaux tripeptides de formule générale (I) peuvent etre

éventuellement purifiés par des méthodes physiques (telles que la cristalli-

sation ou la chromatographie) ou chimiques (telles que formation d'un sel,

cristallisation de celui-ci puis décomposition).

Les nouveaux produits selon l'invention peuvent etre transformés

en sels d'addition avec les acides ou en sels métalliques ou en sels d'addi-

tion avec les bases organiques selon la nature des substituants.

Les sels d'addition avec les acides peuvent 4tre obtenus par

action des nouveaux composés sur des acides dans un solvant approprié. Géné-

ralement on solubilise le produit dans l'eau par addition de la quantité

théorique d'acide puis on lyophilise la solution obtenue.

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Les sels métalliqucs ou les sels d'addition avec les bases organiques peuvent être obtenus par action des nouveaux composés sur des bases dans un solvant approprié. Généralement, on solubilise le produit dans l'eau par addition

de la quantité théorique de base puis on lyophilise la solution obtenue.

Les nouveaux composés selon la présente invention sont des adju-

vants et des stimulants de l'immunité: ils augmentent les réactions d'hyper-

sensibilité et/ou la production d'anticorps circulants vis-à-vis des antigènes avec lesquels ils Sont ddaiibistreb'b cL ilb stLimulent de manière non spécifique des réactions de défense contre certaines infections (par exemple ltinfection de la

souris par la bactérie intracullulaire Listeria monocytogenes).

In vitro, ils sont actits à des concentrations molaires généralement comprises entre 103 et 1-), un particulier dans les tests suivants stimulation de la synthèse de l'ADN (pouvoir mitogène) selon la technique

de G. MARCIHAL, Aiii. Ihwunolll.. (insL. Pasteur), 125 C, 519 (1974).

- stimulation de la réaction allogéuique (réaction d'histoincompatibilité) selon la technique de R.W. DUTTON, J. exp. Med., 122, 759 (1966) et A.B. PECK et F.ol. BACi, J. Imunuol. Methods, 3, 147 (1973) stimulation de la production d'anticorps selon la technique de P.H. KLESIUS, Proc, Soc. xp. Biol. Med. (N.Y.), 135, 155 (1970) et H. VAN DIJK et N. BLOKSMA, J. Inmmunol. Methods, 14, 325 (1977) - augmentation du nombre de macrophages phagocytaires selon la technique de J. MICIL et col., J. exp. Med., 144, 1465 (1976) - stimulation de l'activité phosphatase acide et N-acétylglucosamidinase (enzymes

lysosomiales des macrophages) en l'absence d'une augmentation de la deshydro-

génase lactique selon la technique de P. DAVIES et coil., J. exp. Hed., 139,

1262 (1974).

ln vivo, chez la souris, à des doses comprises entre 1 et 30 mg/kg,

ils augmentent l'hypersensibilité retardée et la production d'anticorps en par-

ticulier selon la technique de T.E. MILLER et coll., J. Nath. Cancer Inst. , 51,

1669 (1973).

Chez le cobaye, ils augmeantent la réaction d'hypersensibilité à l'antigène nmonoazobenzènearsonate - N-acétyltyrosine (ABA-tyrosine) à des doses voisines de 10 mg/kg selon la technique de B. BENACERRAF et coll., J. exp. Med., 118, 945 (1963) et C. NAUCIEL et M. RAYNAUD, Europ. J. Immunol., 1,257 (1971) et ils augmentent la réaction d'hypersensibilité et de production d'anticorps contre la gammnaglobuline bovine couplée avec l'haptène dinitrophénol selon

la technique de F. FLOC"II et coil., luuinunol. Communic., 7, 41 (1978).

Chez la souris, ils stimiulent les réactions de défense contre l'infection de la souris à Listeria monocytogenes à des doses comprises entre

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1 et 100 mg/kg selon la technique de R.M. FAUVE et B. HEVIN, C.R. Acad.. Sci.(D),

285, 1589 (1977).

Chez le lapin, à des doses généralement comprises entre O, 1 et 3 mg/kg, ils stimulent la formation d'anticorps sériques anti-virus grippal selon la technique de G.lt. WERNER et coll., Biomedicine, 22, 440 (1975). Les exemples suivants, donnés à titre non limitatif, montrent

comment l'invention peut être mise en pratique.

Exemple -

On ajoute 1,88 <m3 de chloroformilate d'lsobutyle à une solution, maintenue à 10oC, de 7,03 g de N-lauroyl L alanyl-a-D glutamate de benzyle dans un mélange de 280 cm3 de dioxaine et 2,0 cnm3 de triéthylamine. Le mélange est agité pendant 20 minutes à 100C puis on ajoute une solution de 4,04 g de N e-benzyloxycarbonyl L lysine dans un mélange de 30 cm3 de dioxanne et de 14,4 cm3 de soude IN. Lemélange réactionnel est agité pendant 20 heures à 18oC environ. L'insoluble formé est dissous par addition de 280 cm3 d'eau. La solution obtenue est agitée encore pendant I heure, puis acidifiée à pH 3 par addition de 20 cm3 d'acide chlorhydrique IN.L'Insoluble formé est séparé par filtration, lavé par 20 cm3 d'eau et séché sous pression réduite (0,3 mm de

mercure) à 200C. On obtient ainsi 7,72 g d'un solide blanc que l'on chromato-

graphie sur une colonne de 3,5 ci de dianmtre contenant 230 g de gel de silice neutre. On élue successivement par 700 cin3 d'un mélange acétonecyclohexane (9-1 en volumes), 1,1 litre d'acétone et 1,7 litre de méthanol en recueillant des fractions de 100 cm3. les fractions 22 à 35 sont réunies, concentrées à sec sous pression réduite (20 mm( de mercuire) à 45oC. On obtient ainsi 5,97 g de N a-[O -benzyl N-(N-lauroyl L alanyl)y-D) glutamyll N ó-benzyloxycarbonyl

L lysine.

Rf = 0,84 [silicagel; n.lutanol-pyridine-acide acétique-eau

(50-20-6-24 en volumes)].

a) On dissout 1,77 g de N a-LO -benzyl N-(N-lauroyl L alanyl)-y-D glutamyl] N e-benzyloxycarbonyl L lysine dans 177 cm3 de méthanol. On ajoute 1,77 g de palladium sur noir (à 3 % de palladium) puis on fait passer un léger courant d'hydrogène pendant 4 heures. Apres filtration, concentraction à sec du filtrat, l'huile résiduelle est reprise par 20 cm3 d'acétone. On obtent ainsi 1,06 g d'un solide blanc que l'on recristallise dans un mélange d'éthanol (12 cm3) et d'acétone (24 crn3). On obtient ainsi 0,9 g de. N a-[N-(N-lauroyl

L alanyl)-y-D glutamyll L lysinp fouidait à 1l80-186o( (fusion pâteuse).

Rf = 0,29 [silicagel;.btitaniol-p)yridtne-aclde acétique-eau

(50-20-6-24 en volumes)1.

Analyse C;alc. % C 59,07 Il 9,15 N 10,60 Tr. 58,4 8,8 10,0 ii 2460289 Après hydrolyse toLale, l'analyse sur autoanalyseur Technicon révèlu la présence des acides aind: buivanlts: Ala: 1,02 (Lhéorie - 1) Glu: 1,00 (Llléorie - 1) Lys: 0,d9 (Lhiéorie = 1) Le N-lauroyl L alanyl--D glutaamate de benzyle peut être préparé selon l'une des deux méthodes suivantes:

a) A une solution de 12,75 g de chlorhydrate de L alanyl-a-D gluta-

mate de benzyle dans 75 cm3 de soude 1N,on ajoute simultanément en 37 minutes, 8 g de chlorure de lauroyle dissous dans 75 cm3 d'éther et 37,4 cm3 de soude 1l de façon à maintenir le pli du mélange réactionnel compris entre 8 et 9. Le mélange est agité pendant 1 heure 20 minutes. Après décantation, la phase aqueuse est acidifiée à pH 2 par addition d'acide chlorhydrique IN (60 cm3), extraite 3 fois par 300 cm3 au total d'acétate d'éthyle. Lès extraits organiques réunis sont lavés par 25 cm3 d'eau, séchés sur du sulfate de sodium anhydre et concentrés à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 450C. On obtient ainsi 7,4 g d'un solide blanc que l'on chromatographie sur 80 g de gel de silice neutre contenus dans une colonne de 2 cm de diamètre. On élue successivement par 100 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-méthanol (8-2 en volumes) et 200 cma3 d'un mélange acétate d'éthyle-méthanol (1-i en volumes), en recueillant des fractions de 50 cn3. La fraction 1 est concentrée à sec sous pression réduite (20 lin, de mercure) à 450C. On obtient ainsi 2 g de N-lauroyl L alanyl-a-D glutamate de benzyle fondant à 1300C. Les fractions 2 à 4 sont de même concentrées à sec et chromatographiées sur 100 g de gel de contenus silice neutre (0,063-0,20 nin)/dans une colonne de 2 cm de diamètre. On élue par 250 cm3 d'acétone en recueillant des fractions de 25 cm3. Les fractions 1 et 2 sont concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 0C. On obtient ainsi 4,07 g de N- lauroyl L alanyl-a-D glutamate de benzyle fondant à 1300C dont les caractéristiques sont les suivantes Rf = 0,9 [silicagel; nr.bttanol- pyridine-acide acétique-eau (50-20-6-24 en volumes)] Analyse Calc. % C 6o, 10 Il 8,u3 N 5,71 Tr. 66,3 8,8 5,6 b) On ajoute 31 cm3 de chlorotormiate d'isobutyle à une solution, maintenue à une température voisine de 10oC, de 47,75 g d'acide laurique dans 3 litres de dioxanne et 33,3 cm3 de triéthylamine. Le mélange est agité pendant minutes à 100C, puis on ajoute en 10 minutes une solution, refroidie à 100C, dtc 88,95 g de chlorhydrate le L ala:iyl-o-l) glutamate de benzyle, dans un

mélange de 1 litre de dioxarnne, de 4/() cm3 d'eau et de 476 cn3 de soude iN.

Le mélange réactionnel est agité p)enldant 1 heure à 100C, puis pendant 18 heures à une température voisine de 200C; il est ensuite dilué par addition de 4 litres d'eau, aciltidé à pli 2 par addition d'acide chlorhydrique 1iN (environ 475 ca3) et conservé pendant 2 heures à 0oC. Le précipité obtenu est séparé par filtration, lavé successivement par 500 cm3 d'eau et 500 cm3 d'éther, puis séché sous pression réduite (20 mmin de mercure) à 20OC. Le produit est mis en suspension dans 800 cm3 d'éther, agité pendant 1 heure, séparé par filtration et lavé 2 fois par 200 cmi3 au total d'éther. Après séchage sous pression réduite (20 mu de mercure) à 200C, on obtient 71,79 g de N-lauroyl L alanyl-a-D

glutamate de benzyle fondant à 130 C.

Rf = 0,77 [silicagel; acétate d'éthyle-méthanol (4-1 en volumes)].

Le chlorhydrate de L alanyl-a-D glutamate de benzyle peut être préparé de la façon suivante: On dissout 97,16 g de N-t.butyloxycarbonyl L alanyl-aD glutamate de benzyle'dans 970 cm3 d'une solution anhydre d'acide chlorhydrique 1,7 N dans l'acide acétique. On agite pendant 2 heures, puis on ajoute rapidement 3,8 litres d'éther anhydre et on laisse reposer pendant 2 heures à OoC. Le précipité huileux qui s'est formé; séparé du surnageant par décantation, est dissous dans 500 crm3 d'acétone; la solution ainsi obtenue est concentrée à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50 C. On obtient ainsi 88,9 g de

chlorhydrate de L alanyl-a-D glutamate de benzyle.

Le N-t.butyloxycarbonyl L alanyl-a-D glutamate de benzyle peut être

préparé selon la méthode de E. BRICAS et coll., Biochemistry 9, 823 (1970) .

La N e-benzyloxycarbonyl L lysine peut être préparée selon la méthode de A. Neuberger et coll., Biochem. J., 37, 515 (1943).

Exemple 2 -

on ajoute 0,65 cm3 de chloroformiate d'isobutyle à une solution, maintenue à -10 C, de 2,45 g de N-lauroyl L alanyl-a-D glutamate de benzyle

dans un mélange de 80 cnd de Létrahtydrofuranne et 0,70 cm3 de triéthylamine.

Le mélange est agité pendant 20 miinutes à -10 C puis on ajoute une solution, refroidie à -10 C, de 2,24 g de chlorhydrate de N ebenzyloxycarbonyl L lysinate de benzyle dans un mélange de 40 cm3 de tétrahydrofuranne et 0,77 cm3 de triéthylamine. Lemélangeréactionnel est agité pendant 2 heures à -10 C, puis pendant 2 jours à 20 C environ. On concentre ensuite le mélange réactionnel à sec sous pression réduite (20 nmm de mercure) à 40 C. Le solide blanc obtenu

13 2460289

est repris dans 100 cmi3 d'aLétato d'dthyle à 40c, trituré jusqu'à pulvérisa-

tion, séparé par filtration, trituré a nouveau dans 50 cm3 d'acide chlorhy-

drique 0,1 N, séparé par filtration et séché sous pression réduite (0,3 mm de mercure). On obtient ainsi 2,69 g de N a-LN-(O -benzyl N-lauroyl L alanyl)-y-D glutamyl] N e-benzyloxycarbonyl L lysinaLe de benzyle.

Rf = 0,80 [silicagel; acétate d'éthyle-méthanol (9-1 en volumes)].

i On dissout 2,65 g de N a-LO -benzyl N-(N-lauroyl L alanyl)-y-D glutamyl] N ó-benzyloxycarbony] L lysinate de benzyle dans 265 cm3 d'acide acétique. On ajoute 2,65 g de palladium sur noir (à 3 % de palladium) et on fait passer un léger courant d'hydrogène pendant 3 heures. Après filtration et concentration à sec du filtrat sous pression réduite (20 mmn de mercure) à 50OC, on obtient 1,81 g de N a-[N-(N-lauroyl L alanyl)- y-D glutamyl] L lysine

identique au produit obtenu à l'exemple 1.

Le N c-benzyloxycarbonyl 1 lysinate de benzyle peut être préparé

selon la méthode de T. Shiba et coll., Bull. Chem. Soc. Japan, 33e 1721 (1960).

Exemple 3 -

On ajoute 3,17 cm3 de chloroformiate d'isobutyle à une solution, maintenue vers 10oC, de 11,96 g de N-lauroyl L alanyl-a-D glutamate de benzyle dans un mélange de 490 cm3 de dioxanne et de 3,43 cm3 de triéthylamine. La solution est agitée pendant 20 minutes vers 10OC, puis on ajoute une solution de 8,87 g d'acide N -benzyloxycarbonyl DD,LL diamino-2,6 pimélamique à 88,8 % (dosage perchlorique) dans un mélange de 219 cm3 d'eau et de 24,4 cm3 de soude 1N.Le mélange téactionnel est agité pendant 2 heures à une température voisine de 100C puis pendant 15 heures à une température voisine de 200C; il

est ensuite filtré. Au filtrat, on ajoute 360 cm3 d'eau et on sépare par fil-

tration un léger insoluble formé. Le filtrat est acidifié à pHli 2 par addition

de 49 cm3 d'acide chlorhydrique 1N. Le précipité formé est séparé par filtra-

tion, lavé 3 fois par 750 cm3 au total d'eau et séché. On obtient ainsi 16,3 g d'une poudre blanche que l'on chromatographie sur 800 g de gel de silice neutre (0,0635-0,20 mm) contenus dans une colonne de 6 cm de diamètre. Pour cela on dissout les 16,3 g de poudre dans 800 cm3 de méthanol et à la solution obtenue, on ajoute 160 g de sable de Fontainebleau. On évapore à sec le mélange sous pression réduite (20 mm de mercure) à 600C et le résidu ainsi obtenu est chargé sur la colonne de silice. On élue successivement avec 1 litre d'acétate d'éthyle, 4 litres d'un mélange acétate d'éthyle-méthanol (9-1 en volumes),

14 2460289

7 litres d'un mélange acétate d'éthyle-méLthanol (85-15 en voplumes) et 4 litres d'un mélange acétate d'ôthyle-méthanol (1-1 en volumes) en recueillant des fractions de 250 cm3. Les tractions 45 à 60 sont réunies et concentrées à sec sous pression réduite (20 min de mercure) à 600C. On obtient ainsi 9,4 g d'acide N2-101-benzyl N-(N-lauroyl L alanyl)-y-D glutamyl] N6-benzyloxycarbo-

nyl DD,LL diamino-2,6 pimélamique.

Rf = 0,83 [silicagel; n.butanol-pyridine-acide acétique-eau

(50-20-6-24 en volumes)].

On dissout 4,07 g d'acide N2-[Ol -benzyl N-(N-lauroyl L alanyl)-y-D glutamyl] N -benzyloxycarbonyl DD,LL diamino-2,6 pimélamique dans 200 cm3 d'acide acétique. On ajoute 4 g de palladium sur noir (à 3 % de palladium) et on fait passer un léger courant d'hydrogène pendant 7 heures. Après filtration et concentration à sec du filtrat sous pression réduite (20 mm de mercure) à 600C, la meringue obtenue est reprise par 45 cm3 au total de méthylcyclohexane

et amenée chaque fois à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 60ooc.

La poudre ainsi obtenue est séchée sous pression réduite (0,3 umm de mercure) à 50oC. On obtient 2,76 g d'acide N2-(N-lauroyl L alanyl-y-D glutamyl) DQ,LL

diamino-2,6 pimélamique.

Après hydrolyse totale, l'analyse sur autoanalyseur Technicon révèle la présence des acides aminés suivants: Ala 1,00 (théorie = 1) Dap 0,99 (théorie = 1)

Glu 1,05 (théorie = 1).

b L'acide N -benzyloxycarbonyl bD,LL diamino-2,6 pi,élamique peut être préparé de la façon suivante: A une solution de 9,7 g de dichlorhydrate de P'acide DD,LL diamino-2,6 pimélamique dans 63 cm3 d'eau amenée à pH 10 par addition de 37 cm3 de soude 1N, on ajoute 4,35 g de bromure cuivrique dissous dans 44 cm3 d'eau. On agite

le mélange réactionnel pendant 2 heures à 200C environ. On sépare par filtra-

tion un léger insoluble, puis on refroidit le filtrat à une température comprise entre -30C et OoC. On ajoute 9,2 g de bicarbonate de sodium et ensuite, goutte

à goutte en 30 minutes, 7,9 cm3 de chloroformiate de benzyle.Le mélange réaction-

nel est agité pendant 18 heures à une température voisine de 200C. Le précipité bleu formé est séparé par filtration lavé par 15 cm3 d'eau, 2 fois par 30 cm3 au total d'éthanol et 15 cm3 d'éther. Après séchage sous pression réduite (20 mm de mercure) à 500C, on obtient 9,6 g de complexe cuivrique de lacide N6-benzyloxycarbonyl DDLL diamino-2,6 pimlmique que lon aoute l'acide N.-henzyloxycarbonyl, DD,LL diamino-2,6 pimélamique que l'on ajoute à cm3 d'acide chlorhydriqute 1N. On agite pendant 1 heure à une température voisine de 200C. Un insoluble est séparé par filtration. Au filtrat, on ajoute 30 cm3 de méthanol puis on fait passer un courant d'hydrogène sulfuré pendant 1 heure 1/2. On laisse reposer pendant lb heures. La bouillie noire obtenue est filtrée, lavée 4 lois par 1b0 cm3 au total d'eau. Les filtrats réunis sont concentrés jusqu'à un volume de 30 cn3 sous pression réduite

(20 nmmn de mercure) à 50 0;, amenés 1 pll 9 par addition de 7,5 cm3 de triéthyl-

amine, dilués par addition de 20:m3 d'eau et amenés à pH 6 par addition de ,5 cm3 d'acide chlorhydrique iN. La bouillie blanche ainsi obtenue est conservée à OoC pendant 2 heures. Le produit qui se sépare par filtration est

lavé successivement par 20 ciiL3 d'eau et 20 cm3 d'éthanol et séché sous pres-

sion réduite. On obtient ainsi 5,8 g d'acide N -benzyloxycarbonyl DD,LL

diamino-2,6 pimélamique à 96 % (dosage perchlorique).

Le dichlorhydrate de l'acide DD,LL diamino-2,6 pimélamique peut être préparé de la façon suivante: on dissout 83 g d'acide DD,LL dibenzyloxycarbonylamino-2,6-pimélamique dans un mélange de 1,6 litre de méthanol et de 14,6 cm3 d'acide chlorhydrique concentré (d = 1,19). On ajoute 83 g de palladium sur noir (à 3 % de palladium) et on fait passer un courant d'hydrogène pendant 10 heures. Après filtration et concentration à sec du filtrat sous pression réduite (20 mm de mercure) à 600C, on obtient 40,5 g de dichlorhydrate de l'acide DD,LL diamino-2,6

pimélamique sous forme de meringue.

L'acide DD,LL dibenrzyloxycarbonylamino-2,6 pimélamique peut être préparé de la façon suivante:

On dissout 168 g d'ester monobenzylique de l'a'cide DD,LL dibenzyloxy-

carbonylamino-2,6 pimélamique dans 1,68 litre de méthanol. On refroidit cette solution vers 0oC et on la sature d'ammoniac. Dès qu'elle est saturée, on la transvase dans 3 autoclaves de 1 litre. Après avoir fermé ces autoclaves, on les conserve pendant 40 heures à 200C environ. Après dégazage, la solution

ainsi obtenue est concentrée sous pression réduite (20 mm de mercure) à 60C.

* Le résidu est dissous dans 2 litres d'eau et la solution obtenue est amenée à pH 2 par addition d'acide chlorhydrique 4N. I1 se forme un précipité gommeux qu'on isole par décantation, triture avec 2 litres d'éther, sépare par filtration,

lave 2 fois par 400 cm3 au total d'éther et 2 fois par 400 cm3 au total d'eau.

Après séchage, on obtient 83,5 g d'acide DD,LL dibenzyloxycarbonylamino-2, 6

pimélamique fondant à 145-150OC.

Rf = 0,69 [silicagel; n.butanol-éthanol-eau-ammoniaque concentrée

(4-4-1-1 en volumes)].

16 2460289

Le ionIIoesLer bienzyliqute dle] 'acide DD,LL dibenzyloxycarbonylamino-2, 6 pimélique peut être préparé selon la miieLlhode de A. ARENDT et coll., Roczniki Chemii Ann. Soc. Chim. Polonorum 48, 1305 (1974)]Chem. Abstr., 82, 31497 g

(1975)].

Exemple 4 -

On ajoute 0,1 cm3 de chloroformiiate dlisobutyle dans une solution, maintenue à -5oC, de 2,5 g de N-lauroyl L alanyl-D isoglutamine dans 150. cm3 de diméthylformamide et 0,87 cm3 de triéthylamine. Le mélange est agité pendant minutes à -50C, puis on ajoute une solution, refroidie à + 2 0C, de 2,02 g d'acide N -benzyloxycarbonyl DD,LL diamino-2,6 pimélamique dans un mélange de

62,5 cm3 d'eau et 6,25 cm3 de soude 1 N. Lemélangeréactionnel est agité pen-

dant 1 heure à 0 C puis pendant 18 heures à 20 C environ, et est ensuite filtré.

Le filtrat, dilué par addition de 300 cm3 d'eau, est acidifié à pH 1 par addi-

tion de 15 cm3 dtacide chlorhydrique 1 N. Le précipité apparu est séparé par filtration, lavé 3 fois par 30 cm3 au total d'eau puis séché. On obtient ainsi 2,03 g d'un solide blanc auquel on ajoute 680 mg d'un produit obtenu dans des conditions analogues. Le mélange est dissous dans 30 cm3 d'acide acétique contenant 5 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mn). On concentre à sec puis on dépose le résidu sur une colonne de 2 cm de diamètre contenant 60 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On élue successivement par 400 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (9-1 en volumnnes), 360 cm3 d'un mélange acétate dtéthyle-acide acétique (8-2 en volumes), 240 cm3 d'un mélange acétate

d'éthyle-acide acétique (7-3 en volumes), 160 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-

acide acétique (1-1 en volumes) et 480 cm3 d'acide acétique en recueillant des

fractions de 40 cm3. Les fractions 17 à 49, sont réunies et concentrées à sec.

On obtient ainsi 1,78 g d'acide N -[N-(N-lauroyl L alanyl)-D isoglutaminylJ N -benzyloxycarbonyl DD,LL diamino-2,6 pimélamique Rf = 0, 65 [silicagel; acétate d'éthyle-acide acétique (3-1 en vol utnes)]

On dissout 1,76 g d'acide N -[N-(N-lauroyl L alanyl)-D isogluta-

minyl] N -benzyloxycarbonyl DID,LL diamino-2,6 pimélamique dans 80 cm3 d'acide acétique. On ajoute 1,76 g de palladium sur noir (à 3 % de palladium) puis on fait passer un courant d'hydlrogène pendant 2 heures et demie. Après filtration,

le filtrat est concentré à 5 cm3 environ et dilué par addition de 100 cm3 d'éther.

Le précipité formé est séparé par filtration, lavé 2 fois par 40 cm3 au total

17 2460289

d'éther eL séché. On obtient ainsi 1,37 g d'acide N -[N-(N-lauroyl L alanyl)-D

isoglutaminyl] DD,LL dialinto-2, b pimélamique.

Rf = 0,40 [silicagel; n.butanol-pyridine-acide acétique-eau (50-20-6-24 en volumes)] Le N-lauroyl L alanyl-D isoglutamine peut 4tre préparé de la façon suivante; On dissout b,6 g de N-lauroyl L alanyl-D isoglutaminate de benzyle dans 330 cm3 d'acide acétique. On ajoute 6,6 g de palladium sur noir (à 3 %. de

palladium) puis on fait passer un lent courant d'hydrogène pendant 2 heures.

Après filtration du mélange réactionnel, on verse le filtrat dans 3 litres d'eau.

Après 2 heures de repos à 0 C, le précipité apparu est séparé par filtration, lavé 2 fois par 80 cm3 au total d'eau, puis séché. On obtient ainsi 5,16 g de

produit auquel on ajoute 0,5 g d'un produit obtenu dans des conditions analogues.

Ce mélange est dissous dans 90 cm3 de méthanol bouillant et à la solution obtenue on ajoute 45 cm3 d'eau. Après 2 heures de repos à une température voisine de 200C, les cristaux apparus sont séparés par filtration, lavés 2 fois par 60 cni3 au total d'eau et séchés sous pression réduite (20 mm de mercure). On obtient ainsi 5,1 g de N-lauroyl L alanyl-D isoglutamine fondant

à 163 0C.

Rf = 0,18 [silicagel; acétate d'éthyle-méthanol (4-1 en volumes)] Analyse: Calc. % = C 60,12 Il 9,33 N 10,52 Tr. 60,2 9,5 10,9 Le N-lauroyl L alanyl-D isogiutaminate de benzyle peut 4tre préparé de la façon suivante: On ajoute 2,54 cmni3 de chloroformiate d'isobutyle dans une solution, maintenue à 0 C, de 3,9 g d'acide laurique dans 156 cm3 de toluène anhydre et 2,7 cm3 de triéthylamine. Le mélange est agité pendant 20 minutes à 0 C, puis on ajoute une solution, refroidie à 0 C, de 6,7 g de chlorhydrate de

L alanyl-D isoglutaminate de benzyle dans 52 cm3 d'eau et 2,7 cm3 de triéthyl-

amine. Le mélange réactionnel est agité pendant 65 heures à une température voisine de 200C. On obtient une masse réactionnelle d'aspect gélatineux à laquelle on ajoute 150 cm3 d'acétate d'éthyle. Le précipité est séparé par filtration, lavé par 30 cm3 d'eau puis séché. On obtient 7, 6 g de N-lauroyl L alanyl-D isoglutaminate de benzyle sous forme d'une poudre blanche. La phase aqueuse du filtrat précédent est extraite 2 fois par 100 cm3 au total d'acétate d'éthyle, cette phase acétate d'éthyle est réunie avec la phase organique du filtrat, lavée par 125 cm3 d'acide chlorhydrique 0,1 N, 120 cm3 d'eau, séchée sur sulfate

18 2460289

de magnésium puis concentrée à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à C. On obtient à nouveau 1,5 g de N-lauroyl l. alanyl-D isoglutaminate de

benzyle. Le produit (7,6 g et 1,5 g) est recristallisé dans 120 cm3 de méthanol.

On obtient ainsi 6,6 g de N-lauroyl L alanyl-D isoglutaminate de benzyle fondant

à 169 C.

Rf = 0,13 [silicagel; acétate d'éthyle] Le chlorhydrate de L alanyl-D Lsogtutaminate de benzyle peut 4tre

préparé selon le procédé de S. KJSIIMOTO, Bull. Chem. Soc. Japon 49, 533 (1976).

Exenmple 5-

On ajoute 0,91 cm3 de chloroformiate d'isobutyle dans une solutLonu maintenue à 0 C, de 3,04 g de N-octanoyl L alanyl-a-D glutamate de benzyle dans 150 cm3 de tétrahydrofuranne et 0,98 cm3 de triéthylamine. Le mélange est agité pendant 20 minutes à 0 C, puis on ajoute une solution, refroidie à 2 C, de 2,26 g d'acide N -benzyloxycarbonyl DI),Ll. diamino-2,6 pimélamique dans un mélange de 70 cm3 d'eau et de 7 cm3 de soude 1 N. Le mélange réactionnel est agité pendant 1 heure à 0 C, puis pendant 20 heures à une température voisine de 20 C. Le tétrahydrofuranne est ensuite évaporé sous pression réduite (20 mn de mercure) à 50 C. Le concentrat est dilué par addition de 50 cm3 d'eau et acidifié à pH 1 par addition de 10 cm3 d'acide chlorhydrique 1 N. Le précipité blanc obtenu est séparé par filtration, lavé 3 fois par 75 cm3 au total d'eau puis séché. On obtient ainsi 4,73 g d'un solide blanc qui est chromatbgraphié sur une colonne de 2,2 cm de"diamètre contenant 100 g de gel de silice neutre

(0,04-0,063 mm). Pour cela, le produit est dissous dans 20 cm3 d'acide acétique.

A la solution obtenue, on ajoute 10 g de gel de silice neutre et concentre à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50 C. Le résidu ainsi obtenu est chargé sur la colonne et on élue successivement par 280 cm3 d'acétate d'éthyle, 360 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle- acide acétique (9-1 en volumes), 200 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle- acide acétique (8-2 en volumes), 160 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle- acide acétique (1-1 en volumes) en recueillant des fractions de 40 cm3. Les fractions 13 à 23 réunies sont concentrées à sec sous

pression réduite (20 mm de mercure) à 50 C. On obtient une huile qui se soli-

difie dans l'éther. Après séparation par filtration et séchage, on obtient 2,84 g d'acide N -[O -benzyl N-(N-octanoyl L alanyl)y-D glutamyl] N -benzyloxycarbonyl

DD,LL diamino-2,6 pimélamique.

Rf - 0,68 [silicagel; acétate d'éthyle-acide acétique (3-1 en volumes)]

19 2460289

On dissout 2,82 g d1a' ide N2-[O -benzyl N-(N-octanoyl L alanyl)--y-D glutamyl] N -benzyloxycarbonyl UD,I.i diamnino-2,6 pimiélanmique dans 80 cm3 d'acide acétique. On ajoute 2,82 g de pal ladiumi sur noir (à 3 %. de palladium) puis on fait passer un courant dl'hydrlrgt- petidint 2 hleures 1/2. 'Après filtration, le filtrat est concentré. 5 (li environ sous pression réduite (20 rnu de mercure) à 50 C et dilué par addition!de 100 cm3 d'éther. On obtient un précipité qui est séparé par filtration, lav. par 20 cm3 d'éther puis séché. On obtient ainsi

2,0 g d'acide N2-[N-(N-octanoyl l. alany])-y-D glutamyl] DD,LL diamino-2, 6 pimé-

lamique fondant à lb0-1lb4 C (fusion pâteuse).

Rf = 0,30!silicagel; n.butanol-pyridine-acide acétique-eau (50-20-6-24 en volumies)] Analyse: Calc. % 53,58 il 8,02 N 13,58 Tr. 53,05 8,17 13,06 Après hydrolyse totale, I]'analyse sur autoanalyseur Technicon révèle la présence des acides aminés suivants: Ala 1,00 (théorie = 1) Dap 0,95 (théorie = 1) Glu 1,02 (théorie = 1) Le N-octanoyl L alanyl-a-D glutamate de benzyle peut être préparé de la façon suivante: On ajoute 3,6 cm3 de chlioroformiate d'isobutyle dans une solution, maintenue à -1 C, de 3,95 g d'acide octanorque dans 140 cm3 de tétrahydrofuranne et 3,8 cm3 de triéthylamine. Le mélange est agité pendant 20 minutes à -1 C, puis on ajoute une solution, refroidie à 0 C, de 9,45 g de chlorhydrate de 1. alanyl-a-D glutamate de benzyle dans un mélange de 54,8 cm3 de soude 1 N et

cm3 d'eau. Le mélange réactionnel est agité pendant 1 heure à -10C puis pen-

dant 20 heures à 20 C environ. Il est ensuite acidifié à pH 1 par addition d'acide chlorhydrique 1 N. Le tétrahydrofuranne est évaporé sous pression réduite (20 mm de mercure) à 45 C, puis le concentrat est extrait par 100 cm3 d'acétate d'éthyle. La phase organique ainsi obtenue est lavée 2 fois par 50 cm3 au total d'acide chlorhydrique 1 N et par 25 cm3 d'une solution saturée de chlorure de

sodium et concentrée à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 45 C.

On obtient ainsi 10 g d'une huile jaune pftle qui est chromatographiée sur une

2460289

colonne de 2,5 cm de diainltre coOnt.l it 200 g de gel de silice neutre (0,063-

0,20 am). On élue avec de l'acétale d!etlIyle en recueillant des fractions de cm3. les fractions 7 à 9 ré;unies s;ont concentrées à sec sous pression réduite (20 mmn de nmercure) à L0 C. Le résidu obtenu est trituré dans 100 cm3 d'un mélange éther-éther de pétrole (P.E. = 35-b00 ) (1-4 en volunes), séparé

par filtration et séché. On obtient ainsi 3,27 g de N-octanoyl L alanyl-aD gluta-

mate de benzyle sous forme June poudre blanche.

Rf = 0,56 [silicagel; acétate d'éthyle-néthanol (8-2 en volumes)]

Exemple 6 -

On ajoute 0,70 cmn3 de chloroformiate d'isobutyle dans une solution, maintenue à 20C, de 2,91 g de N-palmitoyl L alanyl-a-D glutamate de benzyle dans 120 cm3 de tétrahydrofuranne et 0,75 cm3 de triéthylamine. Le mélange est agité pendant 20 minutes à 2 C, puis on ajoute une solution, refroidie à 2 0C, de 1,726 g d'acide N -benzyloxycarbonyl DD,I. LL diamino-2,6 pimélamique dans un mélange de 53,4 cm3 d'eau et de 5,34 cm3 de soude 1 N. Le mélange réactionnel est agité pendant 1 heure à 2 0C, puis pendant 18 heures à une température voisine de 20 C. Le tétrahydrofuranne est évaporé sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50 C. Le concentrat est dilué par addition de 50 cm3 d'eau et acidifié à pHl 1 par addition de 10 cm3 d'acide chlorhydrique 1 N. Le précipité blanc obtenu est séparé par filtration, lavé 3 fois par 75 cm3 au total d'eau et séché. On obtient ainsi 4,15 g d'un solide blanc qui est chromatographié sur une colonne de 3 cm de diamètre contenant 85 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). Pour cela, le produit est dissous dans de l'acide acétique à C. A la solution obtenue on ajoute 10 g de gel de silice neutre puis on concentre à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50 0C. Le résidu ainsi obtenu est chargé sur la colonne et on élue successivement par 320 cm3 d'acétate d'éthyle, 360 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (9-1 en volumes),

320 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (8-2 en volumes) en recueil-

lant des fractions de 40 cm3. Les fractions 14 à 22 réunies sont concentrées à

sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50 0C.

Le résidu obtenu est trituré dans 50 cm3 d'éther, séparé par 2_ i

filtration, et séché. On obtient ainsi 2,20 g d'acide N -[O -benzyl N-(N-

palmitoyl L alanyl)-y-D glutamyl] N -benzyloxycarbonyl DD,LL diamino-2,6 pimé-

1 amique.

Rf = 0,75 [silicagel; acétate d'éthyle-acide acétique (3-1 en volumes)]

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On dissour 2,14 g d'acide N -[o -benzyl N(N-palmitoyl L alanyl)-y-

D glutamyl] N 6-benzyloxycarbonyl DD,LL diamino-2,6 pimélamique dans 80 cm3 d'acide acétique. On ajoute 2,14 g de palladium sur noir (à 3 % de palladium) puis on fait passer un lent courant d'hydrogène pendant 2 heures 1/2. Après filtration, le filtrat est concentré à 5 cm3 environ sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50 C puis est dilué par addition de 100 cm3 d'éther. On obtient un précipité qui est séparé par filtration, lavé 2 fois par 20 cm3 au total d'éther et séché. On obtient ainsi 1,58 g d'acide N 2-[N-(N-palmitoyl

L alanyl)y-D glutamyl] DD,LL diamino-2,6 pimélamique.

Rf = 0,30 [silicagel; n.butanol-pyridine-acide acétique-eau

(50-20-6-24 en volumes)].

Le N-palmitoyl L alanyl-a-D glutamate de benzyle peut être préparé de la façon suivante: On ajoute 3,6 cm3 de chloroformiate dfisobutyle dans une solution, maintenue à 0 C, de 7,03 g d'acide palmitique dans 140 cm3 de tétrahydrofuranne et 3,8 cm3 de triéthylamine. Le mélange est agité pendant 20 minutes à 00 C, puis on ajoute une solution, refroidie à 0 C, de 9,45 g de chlorhydrate de L alanyl-a-D glutamate de benzyle dans un mélange de 54,8 cm3 de soude 1 N et de 30 cm3 d'eau. Le mélange réactionnel est agité pendant 1 heure à 0 OC, puis pendant 18 heures à 20 C environ; il est ensuite acidifié à pH 1 par addition de 70 cm3 d'acide chlorhydrique 1 N. Le précipité formé est séparé par filtration, lavé 5 fois par 200 cm3 au total d'eau et séché. On obtient ainsi 12,11 g d'une poudre blanche qui est chromatographte sur une colonne de 2,5 cm de diamètre contenant 200 g de gel de silice neutre (0,063-0,20 mm). On élue successivement par 200 cm3 d'acétate d'éthyle, 300 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle,-mnéthanol (9-1 en volumes), 1,6 litre d'un mélange acétate d'éthyle-méthanol (8-2 en volumes), 400 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-méthanol (6-4 en volumes) en

recueillant des fractions de 100 cm3. Les fractions 5 à 23 réunies sont concen-

trées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 45 C. On obtient ainsi

5,18 g d'un solide que l'on triture dans 50 cm3 d'éther bouillant pendant 1/2 heure.

Après refroidissement à une température voisine de 20 0C, l'insoluble est séparé par filtration, lavé 3 fois par 75 cm3 au total d'éther puis séché. On obtient

ainsi 2,94 g de N-palmitoyl L alanyl-a-D glutamate de benzyle.

Rf -- 0,77 [silicagel; acétate d'éthyle]

La prébtulLe invui ioin concerne également les compositions pharma-

ceuLiqueS qui conLiuileuiL au milloib unl composée selon l'invention en association avec un ou plusieurs diluauiLs ou excipients compatibles et pharmaceutiquement acceptables. Ces colmpositions peuvent être utilisées soit comme adjuvants de vaccins soit comme stimulants non spécifiques de l'immunité anti-infectieuse et anti-tumorale. Utllisés comDe adjuvants de vaccins, les produits selon l'invention sont administrés en nmme temps et par la même voie que l'antigène (viral, bactérien, parasitaire ou d'autre nature) contre lequel on souhaite augmenter chez le sujet immnunisé (homme ou animal domestique) les réactions d'immuniti cellulaire (hypersensibilité du type retardé) ou la production d'anticorps

circulants ou locaux.

Les produits sont administrés à des doses relativement faibles

(de l'ordre du mg), mélangés avec l'antigène et par la même voie (intramuscu-

laire, sous-cutanée, intraveineuse, intranasale, buccale). Si nécessaire, le produit et l'antigène peuvent etre émulsifiés dans un excipient huileux

approprié ou incorporés dans des liposomes.

En tant qu'iltmnunostinzulantLs non spécifiques, ils sont administres à des doses comprises entre 0,1 et 50 nmg/kg par voie parentérale (intraveineuse, sous-cutanée, intramusculaire), iniranasale, buccale rectale, ou éventuellement intratumonrale. Comme compositions solides pour administration orale peuvent être utilisés des comprimés, des pillules, des poudres ou des granulés. Dans ces compositions le produit actif est mélangé à un ou plusieurs diluants tels que saccharose, lactose ou amidon. Ces compositions peuvent également conprendre des substances autres que les diluants, par exemple un lubrifiant# tel que le

stéarate de magnésium.

Comme compositions liquides pour administration orale, on peut utiliser des émulsions pharmaceutiquement acceptables, des solutions, des suspensions, des sirops ou des élixirs contenant des diluants inertes, tels que l'eau ou l'huile de paraffine. Ces compositions peuvent comprendre des

substances autres que les diluants, par exemple des produits mouillants, édul-

corants ou aromatisants.

Les compositions pour administration parentérale peuvent ttre des solutions stériles aqueuses, des suspensions ou des émulsions. Comme véhicule dans ces derniers cas, on peut employer le polyéthylèneglycol le propylèneglycol, les huiles végétales, en particulier l'huile d'olive, et les esters organiques injecLables, par exeqAsl lioldIde ditlhylc. Ces cowpositionb peuvent contenir egalelelnt des adjuvaits, uni l,..! iulier deb agentLb mouillants, émulsifiants ou dispersanLs. La sLUrillijtloi pcuIt bu tairt, de plusieurs façons, par exemple à laide dtun filtre bdaciériologi(tle, en incorporant à la composition des agents tbLérilisaiits ou par chiduttagu. Ellub peuvenl êLre également préparées sous forme de compositions solideb, rendues sbLrileb par exemple par irradiation, qui peuvent être dissouteb danis de teau btérile ou dispersées dans tout autre

milieu stérile injectadble, velllueletlllellLnt au molment de lemploi.

Les compositionb pour adminlistration intra-nasale peuvent être des solutions stériles aqumubes, des subpensions ou des émulsions qui peuvent etre

éventuellement associéeb à un agent propulseur compatible.

Les compositions pour administration rectale sont des suppositoires qui peuvent contenir, ouLre le produiL actif, des excipients, tels que le

beurre de cacao ou la buppo-cire.

L'exemple buivait, do{uaini à Litre non limitatif, illustre une Complosition llselon Il tinvelltiol:

Exemple -

On préparu belol l d Leuuhniique habituelle une solution administrable par voie intraveineusu ayantL la conposition, suivante: - acide N2-(N- lauroyl I alanyl-y-D glutamyl) DD,LL diamino-2,6 pimélamique.. 0,5 g - soluté injectable.. 5 cm3

24 2460289

R E V E N D I G A T 1 0 N S 1. Uin nouveau tripeptide caracterise en ce qu'il répond à la formule

générale: R - NH - CH - GO - NHl - CH - GO - R

I I 1

Cil3 CH2CI 2 - GO - NH - H - COOH

(CH2)3

R - NH - CH - R2

dans laquelle les symboles R, identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène ou un reste d'acide gras, étant entendu que l'un au moins des symboles R représente un reste d'acide gras, R1 représente un radical hydroxy ou amino et R2 représente un atome d'hydrogène ou un radical carbamoyle, étant entendu que l'alanine. est sous forme L, l'acide glutamique est sous forme D, la lysine, lorsque R2 représente un atome d'hydrogène, est sous forme L et l'acide diamino-2,6 pimélamique, Iorsque R2 représente un radical carbamoyle,

est sous forme D,D; L,L; DD,LL (racémique) ou D,L (méso), ainsi que ses sels.

2. Un nouveau tripeptide selon la revendication 1, caractérisé en ce que le reste d'acide gras est un radical alcanoyle contenant 1 à 45 atomes de carbone (éventuellement substitué par un radical hydroxy, phényle ou cyclohexyle), un radical alcénoyle contenant 3 à 30 atomes de carbone et pouvant contenir

plus d'une double liaison,ou un reste d'un acide mycolique.

3. Procédé de préparation d'un produit selon les revendications 1 ou 2, carac-

térisé en ce que l'on fait réagir un dipeptide de formule générale

R5 - NH - CH - CO - NH - CH - CO - R3

CH3 CH2CH2 -COOH

dans laquelle R5 représente un reste d'acide gras ou un groupement protecteur de fonction amine et R3 représente un radical amino ou un radical alcoyloxy contenant l à 4 atomes de carbone éventuellement substitué par un radical benzyle ou nitrobenzyle, sur un aminoacide de formule générale: H2N - Cil - CO - R4

(CH2)3

R5 - NH - CH - R2

dans laquelle R2 est défini comme dans la revendication 1, R4 représente un radical hydroxy ou alcoyloxy contenant 1 à 4 atomes de carbone éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle et R5 représente un reste d'acide gras ou un groupement protecteur de fonction amine, étant entendu que l'un au moins des symboles R5 des formules du dipeptide et de l'aminoacide définis ci-dessus représente un reste d'acide gras, puis éventuellement remplace le radical R5 par un atome d'hydrogène et les radicaux R3 et R4 par un radical hydroxy et isole le produit obtenu, éventuellement sous forme

de sel.

4. Procédé de préparation d'un produit selon les revendications 1 ou 2, carac-

térisé en ce que l'on fait réagir un dérivé activé de la L alanine de formule générale:

R5 -NH - CH - COOH

CH3 dans laquelle R5 représente un reste d'acide gras ou un groupement protecteur de fonction amine, sur un dipeptide de formule générale:

H N - CH - CO - R3

2 I O-3

CH2CH2 - CO - NH - CH - CO - R

(iH2)3

R -NH - CH - R2

dans laquelle R2 est défini comme dans la revendication 1, R3 représente un radical amino ou alcoyloxy contenant 1 à 4 atomes de carbone, éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle, R4 représente un radical hydroxy ou alcoyloxy contenant 1 à 4 atomes de carbone éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle, et R5 représente un reste d'acide gras ou un groupement protecteur de la fonction amine, étant entendu que l'un au moins des symboles R5 des formules du dérivé de l'alanine et du dipeptide définis ci-dessus représente un reste d'acide gras, puis éventuellement remplace le radical R5 par un atome d'hydrogène et les radicaux R3 et R4 par un radical

hydroxy, et isole le produit obtenu, éventuellement sous forme de sel.

5. Procédé de préparation d'un produit selon les revendications 1 ou 2 carac-

térisé en ce que l'on fait réagir un acide de formule générale:

R' - GO - OH

dans laquelle R' - CO - représente un reste d'acide gras, ou un dérivé activé de cet acide, sur un tripeptide de formule générale

R6 - NH - CH - GO - NH - ICH - GO - R

i i 3

CH3 CH2CH2 - CO - NH - CH - CO - R4

CH32N2(-H2)3

R6 - NH - CH - R2

26 2460289

dans laquelle R2 est défini conme dans la revendication 1, R3 représente un radical amino ou alcoyloxy contenant 1 à 4 atomes de carbone éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle, R4 représente un radical hydroxy ou alcoyloxy conLenant 1 à 4 atomes de carbone éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle et les symboles R6, identiques ou

différents, représentent un atome d'hydrogène ou un reste d'acide gras ou un.

groupement protecteur de fonction amine, l'un au moins des symboles R6 repré-

sentant un atome d'hydrogène, puis éventuellement remplace le radical R6 par un atome d'hydrogène et les radicaux R3 et R4 par un radical hydroxy, et

isole le produit obtenu, éventuellement sous forme de sel.

6. Médicament caractérisé en ce qu'il est constitué par un produit selon la revendication 1 à l'état pur ou en présence d'un ou plusieurs diluants ou

adjuvants compatibles et-pharmaceutiquement acceptables.