FI98643C - Menetelmä luonnollisesti tuotetun kymosiinin talteenottamiseksi - Google Patents

Description

98643

Menetelmä luonnollisesti tuotetun kymosiinin talteenotta-miseksi

Keksinnön tausta 5 1. Keksinnön aihepiiri Tämä keksintö koskee luonnollisesti tuotetun kymosiinin talteenottoa ja puhdistusta. Erityisesti tämä keksintö kohdistuu menetelmiin kymosiinin talteenottamiseksi ja puhdistamiseksi vesiliuoksista, jotka sisältävät kymo-10 siinia ja jotka on saatu uuttamalla luonnollisia kymosii-nilähteitä.

2. Alan tekninen taso

Kymosiini on tunnettu entsyymi, joka on erityisen käyttökelpoinen juuston valmistuksessa. Kun kymosiinin 15 luonnollisia lähteitä ovat vasikanmahat, naudanmahat, vuo-henmahat, sianmahat jne., kaupallista kymosiinia on tähän asti saatu pääasiassa maidolla syötettyjen vasikoiden 4. mahasta. Tämä on seurausta siitä seikasta, että tällaiset vasikat tuottavat suurempia määriä kymosiinia kuin pepsii-20 niä, kun taas muut kymosiinilähteet sisältävät yleensä suurempia määriä pepsiiniä kuin kymosiinia, jolloin kymosiinin talteenotto tällaisista muista lähteistä on vaikeampaa ja taloudellisesti tehottomampaa, eli on vähemmän kymosiinia talteenotettavaksi.

25 Kuitenkin viimeaikaisen laskun vasikoiden tuotan nossa johdosta kymosiinin tähän asti edullinen luonnollinen lähde on vähentynyt, mikä puolestaan on toiminut kimmokkeena tehokkaampien menetelmien kehittämiseksi luonnollisesti tuotetun kymosiinin talteenottamiseksi ja puhdis-30 tamiseksi. Spesifisesti tehokkaammista menetelmistä seu-raisi kymosiinin aiempaa parempi talteenotto ja puhdistus vasikanmahoista, jolloin ne niinikään mahdollistaisivat kymosiinin taloudellisen talteenoton ja puhdistuksen muista luonnollisista kymosiinilähteistä.

98643 2 Pääasiallinen kompastuskivi tällaisen metodiikan kehityksessä on ollut se hyvin korkea epäpuhtauksien taso, joka tavataan kymosiiniliuoksessa, joka on saatu luonnollisista kymosiinilähteistä. Pepsiinin lisäksi näistä luon-5 nollisista kymosiinilähteistä saatu vesiuute sisältää muita epäpuhtauksia mukaan lukien esimerkiksi muita mahaent-syymejä ja -proteiineja. Tällaiset epäpuhtaudet ovat mutkistaneet tehokkaan talteenotto- ja puhdistusmetodiikan kehitystä.

10 Vaikka lukuisia menetelmiä on julkistettu entsyy mien eristämiseksi vesiliuoksista, kuten fermentaatiolie-mestä, missään niistä viitteistä, joista hakijat ovat tietoisia, ei julkisteta sellaisia menetelmiä luonnollisesti tuotetun kymosiinin talteenottamiseksi ja puhdistamiseksi, 15 etenkään luonnollisesti tuotetun kymosiinin, joka on sekoittunut pepsiiniin ja muihin epäpuhtauksiin, joissa käytettäisiin neste-nestekaksifaasisysteemiä.

Tältä osin US-patentti julkaisussa nro 4 144 130 kuvataan, miten käytetään (1) seosta, jossa on substituoi-20 matonta tai substituoitua polyalkoholia, polyeetteriä, polyvinyylipyrrolidonia tai polysakkaridia, jonka molekyy-lipaino on korkea, ja epäorgaanista suolaa, (2) seosta, jossa on ainakin kahta edeltävää polymeeriä, joiden mole-kyylipaino on korkea, solunsisäisten entsyymien talteenot-25 tamiseksi vesiliuoksesta, johon entsyymit ovat vapautuneet soluista. Käytettäessä polyetyleeniglykolin ja epäorgaanisen suolan seosta haluttu solunsisäinen entsyymi menee polyetyleeniglykolipäälikerrokseen, kun taas solujäte ja muut fermentaatiotuotteet menevät alempaan suolapitoiseen 30 kerrokseen. Tässä viitteessä julkistetaan, että jakauma- kertoimet eri entsyymeille, jotka otettiin talteen glyko-likerroksesta, olivat noin 0,3 käsiteltäessä normaalia solumassaa, ja ne voitiin nostaa noin 3:ksi sekoittamalla jäädytetyt solut veteen ja rikkomalla ne niiden entsyymien 35 vapauttamiseksi.

Il 98643 3

Vastaavasti US-patenttijulkaisussa nro 4 728 613 julkistetaan menetelmä solunulkoisesti tuotettujen entsyymien, kuten proteaasin, amylaasin ja mikrobisen renniinin, talteenottamiseksi täysfermentaatioliemestä käyttäen epä-5 orgaanista suolaa yhdistettynä polymeeriin, joka on valittu ryhmästä, jonka muodostavat polyetyleeniglykoli, po-lyetyleeniglykolin amiinijohdannainen, polyetyleeniglyko-lin karboksylaattijohdannainen, polypropyleeniglykoli, polypropyleeniglykolin amiinijohdannainen, polypropyleeni-10 glykolin karboksylaattijohdannainen, poly(etyleeniglyko- li)esteri, polyetyleeni-imiini, trimetyyliaminopolyetylee-niglykoli, polyvinyylialkoholi, polyvinyylipyrrolidoni ja mainittujen seokset. Tämän viitteen esimerkeissä julkistetaan päästävän jakaumakertoimiin aina noin 80 tällaisille 15 solunulkoisille entsyymeille.

Samoin Kula et ai., "Purification of Enzymes by Liquid-Liquid Extraction" (suom. "Entsyymien puhdistus neste-nesteuutolla"), kuvaavat lukuisia menetelmiä entsyymien puhdistamiseksi neste-nesteuutolla. Lukuisten julkis-20 tettujen menetelmien puitteissa Kula et ai. julkistavat, että lisättäessä polyetyleeniglykoli/epäorgaaninen suola -seosta entsyymin sisältävään vesiliuokseen muodostuu 2-faasisysteemi, jossa polyetyleeniglykolifaasi sisältää entsyymin. Kula et ai. julkistavat edelleen sivulla 111, 25 että faasin muodostava polymeeri (polyetyleeniglykoli) voidaan poistaa entsyymistä adsorboimalla entsyymi ionin-vaihtajiin; minkä jälkeen faasin muodostava polymeeri pestään pois; ja entsyymi otetaan sitten talteen.

Toisaalta US-patenttijulkaisussa nro 4 508 825 jul-30 kistetaan, että solunulkoiset proteaasi ja amylaasi, jotka on tuotettu yhdessä fermentoimalla niitä tuottamaan kykenevää mikro-organismia, erotetaan lisäämällä polyetyleeni-glykolia ja kationista epihalogeenihydriini/polyamiiniko-polymeeriä tai dekstraanipolymeeriä fermentaatioalustaan 35 ja antamalla polymeerien erottua faaseiksi proteaasia run- 98643 4 säästi sisältävän faasin ja amylaasia runsaasti sisältävän faasin muodostamiseksi.

Samoin US-patenttijulkaisussa nro 4 591 563 julkistetaan menetelmä dekstraanisakkaraasientsyymin samanaikai-5 seksi puhdistamiseksi ja konsentroimiseksi sakkaroosia sisältävästä kasvualustasta. Erityisesti julkistetun menetelmän mukaan lisätään polyeetteriä kuten polyetyleeni-glykolia kahden faasin muodostamiseksi; ensimmäinen on raskas runsaasti dekstraania sisältävä faasi, joka sisäl-10 tää konsentroidun ja puhdistetun dekstraanisakkaraasientsyymin, ja toinen on kevyempi runsaasti polyeetteriä sisältävä faasi, joka sisältää epäpuhtautena läsnä olevat entsymaattiset aktiivisuudet ja joka poistetaan.

Edeltävä huomioon ottaen on ilmeistä, että alan 15 viitteiden puitteissa ei julkisteta luonnollisesti tuotetun kymosiinin talteenottoa ja puhdistusta vesiliuoksista, jotka sisältävät pepsiiniä ja muita epäpuhtauksia, käyttämällä vesipohjaista kaksifaasisysteemiä, joka on saatu lisäämällä polyetyleeniglykolia ja epäorgaanista suolaa, 20 yhdistettynä ioninvaihtohartsin käyttöön. Toisaalta luonnollisesti tuotetun kymosiinin talteenottoa ja puhdistusta teollisessa tai kaupallisessa mittakaavassa helpotetaan suuresti käyttämällä tällaista neste-nestekaksifaasisys-teemiä kymosiinin talteenottamiseksi ja käyttämällä ionin-25 vaihtohartsia kymosiinin puhdistamiseksi.

Täten tämän keksinnön päämääränä on antaa käyttöön tehokkaita menetelmiä luonnollisesti tuotetun kymosiinin talteenottamiseksi ja puhdistamiseksi vesiseoksista, jotka sisältävät kymosiinia, pepsiiniä ja muita epäpuhtauksia, 30 jotka ovat syntyneet uuttamalla vesipitoisella nesteellä luonnollisia kymosiinilähteitä.

Tämän keksinnön seuraava päämäärä on antaa käyttöön menetelmä luonnollisesti tuotetun kymosiinin talteenottamiseksi ja puhdistamiseksi, jonka mukaan talteenottoon

II

98643 5 päästään käyttämällä neste-nestekaksifaasisysteemiä ja puhdistukseen päästään käyttämällä ioninvaihtohartsia.

Tämän keksinnön edelleen seuraava päämäärä on antaa käyttöön menetelmä luonnollisesti tuotetun kymosiinin tal-5 teenottamiseksi ja puhdistamiseksi, jonka mukaan talteenottoon päästään käyttämällä neste-nestekaksifaasisysteemiä, jolla päästään kymosiinin ja pepsiinin selektiiviseen talteenottoon muista vesiliuoksessa esiintyvistä epäpuhtauksista.

10 Tämän keksinnön päämääränä on edelleen antaa käyt töön menetelmä luonnollisesti esiintyvän kymosiinin puhdistamiseksi vesi/polyetyleeniglykoli-liuoksesta, joka sisältää kymosiinia ja pepsiiniä.

Näihin ja muihin päämääriin päästään esillä olevan 15 keksinnön mukaan kuten esitetään oheisessa yhteenvedossa keksinnöstä, yksityiskohtaisessa kuvauksessa keksinnöstä, esimerkeissä ja patenttivaatimuksissa.

Yhteenveto keksinnöstä

Yhtenä näkökohtana tämä keksintö on menetelmä ky-20 mosiinin talteenottamiseksi ja puhdistamiseksi vesiliuoksesta, joka sisältää luonnollisista lähteistä saatua kymosiinia ja joka sisältää lisäksi pepsiiniä ja muita epäpuhtauksia, jonka menetelmän mukaan: (a) vesiliuokseen lisätään tehokas määrä polyety-25 leeniglykolia (PEG) ja epäorgaanista suolaa kaksifaasisys-teemin muodostamiseksi; b) vesiliuos-polyetyleeniglykoli-epäorgaaninen suola -seoksen annetaan erottua kymosiinia ja pepsiiniä runsaasti sisältäväksi polyetyleeniglykolifaasiksi ja kymo- 30 siinia ja pepsiiniä niukasti sisältäväksi suolafaasiksi; c) kymosiinia ja pepsiiniä runsaasti sisältävä po-lyetyleeniglykolifaasi otetaan talteen; d) kymosiinia ja pepsiiniä runsaasti sisältävä po-lyetyleeniglykolifaasi saatetaan kosketuksiin ioninvaih- 35 tohartsin kanssa olosuhteissa, joissa kymosiini sitoutuu 98643 6 hartsiin ja polyetyleeniglykoli ja pepsiini kulkevat hartsin läpi; ja e) kymosiini otetaan talteen hartsista.

Yllättäen uuttovaiheessa valtaosa kymosiinista ja 5 pepsiinistä jakautuu polyetyleeniglykolifaasiin, kun taas muut epäpuhtaudet kuin pepsiini jäävät suolafaasiin. Lisäksi saatettaessa polyetyleeniglykolifaasi kosketuksiin sopivan ioninvaihtohartsin kanssa kymosiini sitoutuu hartsiin, kun taas pepsiini kulkee sen läpi. Jälkeenpäin kymo-10 siini, joka oleellisesti ei sisällä pepsiiniä ja muita epäpuhtauksia (eli epäpuhtauksien määrä on alle noin 10 paino-% laskettuna kymosiinin painosta), otetaan talteen hartsista. Täten esillä olevan keksinnön mukainen menetelmä on varsin tehokas menetelmä luonnollisesti tuo-15 tetun kymosiinin talteenottamiseksi ja puhdistamiseksi.

Yleensä ottaen vesiliuoksen pH voi olla mikä tahansa pH, jossa kymosiini on stabiili, eli noin 6,5 tai alle. Kuitenkin edullisessa suoritusmuodossa on todettu, että käyttämällä alhaisempia pH-arvoja, eli pH 3 tai alle, 20 ja edullisesti pH:ta noin 2 - noin 2,5, vesiliuoksessa saadaan korkeampia jakaumakertoimia (korkeampi selektiivi-syys) kymosiinin erotukselle polyetyleeniglykolifaasiin verrattuna pH-arvojen käyttöön, jotka ovat > 3 - noin 6,5.

Täten esillä olevan keksinnön edullinen menetelmä-25 näkökohta koskee menetelmää kymosiinin talteenottamiseksi ja puhdistamiseksi vesiliuoksesta, joka sisältää kymosii-nia, joka on saatu luonnollisista lähteistä, ja joka lisäksi sisältää pepsiiniä ja muita epäpuhtauksia, jonka menetelmän mukaan: 30 a) vesiliuoksen pH säädetään alle noin 3:een, minkä jälkeen vesiliuokseen lisätään tehokas määrä polyetyleeni-glykolia (PEG) ja epäorgaanista suolaa kaksifaasisysteemin muodostamiseksi; b) vesiliuos-polyetyleeniglykoli-epäorgaaninen 35 suola -seoksen annetaan erottua kymosiinia ja pepsiiniä li 98643 7 runsaasti sisältäväksi polyetyleeniglykolifaasiksi ja ky-mosiinia ja pepsiiniä niukasti sisältäväksi suolafaasiksi; c) kymosiinia ja pepsiiniä runsaasti sisältävä po-lyetyleeniglykolifaasi otetaan talteen; 5 d) kymosiinia ja pepsiiniä runsaasti sisältävä po- lyetyleeniglykolifaasi saatetaan kosketuksiin kationin-vaihtohartsin kanssa olosuhteissa, joissa kymosiini sitoutuu hartsiin ja polyetyleeniglykoli ja pepsiini kulkevat hartsin läpi; ja 10 e) kymosiini otetaan talteen hartsista.

Yksityiskohtainen kuvaus keksinnöstä Erilaisten entsyymien erotus vesiliuoksista käyttäen polymeerejä kuten polyetyleeniglykolia, jonka mole-kyylipaino vaihtelee, yhdistettynä muihin polymeereihin, 15 esim. dekstraaniin, tai epäorgaanisiin suoloihin, on alalla tunnettua. Kuitenkin tämä keksintö kohdistuu osaksi siihen odottamattomaan havaintoon, että kymosiini voidaan tehokkaasti ottaa talteen ja puhdistaa vesiliuoksista, jotka sisältävät luonnollisesti tuotettua kymosiinia, pep-20 siiniä ja muita epäpuhtauksia, lisäämällä riittävä määrä sekä polyetyleeniglykolia että epäorgaanista suolaa vesi-liuokseen kaksifaasisysteemin muodostamiseksi. Näissä olosuhteissa lähes kaikki kymosiini ja pepsiini jakautuu polyetyleeniglykolifaasiin. Tätä osoittavat kymosiinin ja 25 pepsiinin jakaumakertoimet polyetyleeniglykolifaasiin, jotka ovat suurempia kuin noin 30, ja edullisesti suurempia kuin noin 85. Toisaalta valtaosa muista epäpuhtauksista jää suolafaasiin. Täten tämä uuttovaihe tarjoaa keinon kymosiinin talteenottamiseksi ja sen erottamiseksi muista 30 epäpuhtauksista kuin pepsiinistä.

Esillä oleva keksintö kohdistuu edelleen osaksi siihen odottamattomaan havaintoon, että kun sitten polyet-yleeniglykolifaasi saatetaan kosketuksiin ioninvaihtohart-sin kanssa olosuhteissa, joissa kymosiini sitoutuu hart-35 siin, polyetyleeniglykoli ja pepsiini kulkevat hartsin 98643 8 läpi. Täten kun nämä kaksi vaihetta yhdistetään, esillä olevan keksinnön mukaisella menetelmällä on mahdollista ottaa talteen ja puhdistaa kymosiinia, joka oleellisesti ei sisällä pepsiiniä ja muita epäpuhtauksia.

5 Kuitenkin ennen tämän keksinnön yksityiskohtaista käsittelyä määritellään ensin seuraavat ilmaisut: "Luonnollisesti tuotetulla kymosiinilla" tarkoitetaan kymosiinia, joka on saatu nisäkäslähteistä mukaan lukien esimerkiksi naudanmahat (mukaan lukien vasikoiden 10 4. mahat), vuohen-, sian-, lampaan- jne. mahat.

"Pepsiinillä" tarkoitetaan pepsiiniä, joka on saatu nisäkäslähteistä mukaan lukien esimerkiksi naudanmahat (mukaan lukien vasikoiden 4. mahat), vuohen-, sian-, lampaan- jne. mahat. Kymosiinin lisäksi myös pepsiini saadaan 15 talteen uutettaessa pehmitettyjä mahoja.

"Muilla epäpuhtauksilla" tarkoitetaan muita ainesosia kuin kymosiini ja pepsiini, jotka saadaan uutettaessa nisäkkäiden pehmitettyjä mahoja. Tällaisia muita epäpuhtauksia ovat esimerkiksi proteiinit (esim. albumiini), 20 entsyymit ja samankaltaiset.

"Vesiliuoksilla, jotka sisältävät luonnollisesti tuotettua kymosiinia, pepsiiniä ja muita epäpuhtauksia" tarkoitetaan vesiliuoksia, jotka on saatu uuttamalla pehmitettyä nisäkkään mahakudosta luonnollisesti tuotetun 25 kymosiinin saamiseksi. Menetelmät tällaisen kudoksen val mistelemiseksi (pehmittämiseksi) ja kymosiinin uuttamiseksi siitä ovat hyvin tunnettuja alalla ja niitä kuvataan esimerkiksi kirjassa "Fundamentals of Dairy Chemistry", 2. painos, Webb et ai., toim., AVI Publishing Company, 1983, 30 ss. 674 - 679. Tällaiset tunnetut uuttomenettelyt uuttavat myös pepsiinin mahakudoksesta sekä muita epäpuhtauksia. Yleensä ottaen vesiliuokseen uutetun pepsiinin määrä riippuu sen kaltaisista tekijöistä kuten sen eläimen ikä, josta maha saatiin, sekä siitä, oliko eläin vierotettu. Nuo-35 ren eläimen, jota edelleen imetetään, maha sisältää mer-

II

98643 9 kittävästi enemmän kymosiinia ja vähemmän pepsiiniä verrattuna vanhempaan eläimeen, joka on vierotettu. Toisaalta tällaisten vanhempien eläinten mahat sisältävät yhä tal-teenottokelpoisia määriä kymosiinia.

5 "Polyetyleeniglykolilla" tarkoitetaan polyetylee- niglykolia, jonka molekyylipaino voi olla mikä tahansa, jota voidaan käyttää kymosiinin uuttamiseksi tämän keksinnön mukaisesti. Polyetyleeniglykolia on saatavana molekyy-lipainorajoissa noin 400 - noin 22 000. Tässä käy- 10 tettäväksi edullisen polyetyleeniglykolin molekyylipainon tulisi olla noin 600 - noin 12 000. Erityisen edullinen polyetyleeniglykoli on PEG - 8000, eli polyetyleeniglyko-li, jonka molekyylipaino on noin 8 000. Käytetyn polyetyleeniglykolin valinta riippuu osaksi sen seoksen koostu-15 muksesta, josta kymosiini on määrä uuttaa, sekä osaksi menetelmän kustannustekijöistä sekä muista tekijöistä.

"Epäorgaanisella suolalla" tarkoitetaan mitä tahansa epäorgaanista suolaa, jota voidaan käyttää kymosiinin uuttamiseksi tämän keksinnön mukaisesti. Sopivia epäorgaa-20 nisiä suoloja ovat esimerkiksi sulfaattisuolat, fosfaatti-suolat ja samankaltaiset. Edullisia ovat sulfaattisuolat, mukaan lukien natriumsulfaatti, magnesiumsulfaatti, ammo-niumsulfaatti ja samankaltaiset. Lisäksi sopivien suolojen seoksia voidaan myös käyttää sekä tällaisten suolojen 25 seoksia yhdistettynä yhteen (tai useampaan) muuhun suolaan kuten natriumkloridiin, joka sinänsä ei jakaudu polyetyleeniglykolia käsittävään kaksifaasisysteemiin, mutta jonka yhdistettynä sopivaan epäorgaaniseen suolaan tiedetään tehostavan entsyymien jakaumakertoimia.

30 "Jakaumakerroin (K)" määritellään yhtälöllä: K = Ct/Cb jossa Ct merkitsee jakautuneen yhdisteen tasapai-35 nopitoisuutta päälifaasissa ja Cb merkitsee jakautuneen 98643 10 yhdisteen tasapainopitoisuutta pohjafaasissa. Täten on ilmeistä, että jakautuneen yhdisteen kvantitatiivinen määrä kummassa tahansa faasissa riippuu sen jakaumakertoimesta sekä faasien tilavuudesta. Toisin sanoen, jos jakautuneen 5 yhdisteen jakaumakerroin on yksi (yhdiste on tasaisesti jakautunut pääli- ja pohjafaaseihin), faasit sisältävät samat määrät jakautunutta yhdistettä vain, jos faasien tilavuudet ovat samat. Jos päälifaasin tilavuus on 10 % poh-jafaasin tilavuudesta, niin silloin kun jakaumakerroin on 10 yksi, päälifaasi sisältää vain 10 % jakautuneesta yhdisteestä. Edeltävä huomioon ottaen on edelleen ilmeistä, että jakautuneen yhdisteen hyvin korkea jakaumakerroin on varsin arvokas, koska se mahdollistaa suurten määrien tätä yhdistettä talteenoton ylemmästä faasista silloinkin, kun 15 ylemmän faasin tilavuus on suhteellisen pieni verrattuna pohjafaasiin. Täten esillä olevassa keksinnössä hyvin korkeat jakaumakertoimet mahdollistavat pienempien määrien polyetyleeniglykolia käytön samalla, kun edelleen päästään hyvin korkeisiin kymosiinisaantoihin.

20 "Isoelektrisellä pisteellä (IP)" tarkoitetaan pH:ta, jossa polypeptidi on sähköstaattisesta neutraali, eli polypeptidissä on sama lukumäärä positiivisesti ja negatiivisesti varattuja funktionaalisuuksia. Kymosiinin isoelektrinen piste on noin 4,6 ja pepsiinin isoelektrinen 25 piste on myös noin 4,6. Isoelektrisen pisteen alittavassa pH :ssa kymosiinilla ja pepsiinillä on positiivinen netto-varaus; ja isoelektrisen pisteen ylittävässä pH:ssa kymosiinilla ja pepsiinillä on negatiivinen nettovaraus.

"Ioninvaihtohartsilla" tarkoitetaan proteiinien 30 kanssa yhteensopivaa hartsimaista materiaalia, joka kykenee sitoutumaan sähköstaattisesti varattuihin yhdisteisiin. Ioninvaihtohartseja tunnetaan hyvin alalla ja niihin lukeutuu sekä kationin- että anioninvaihtohartseja.

Tämän keksinnön käytännössä vesipohjainen polyety-35 leeniglykoliliuos, joka sisältää kymosiinia ja pepsiiniä, I! 98643 11 saatetaan kosketuksiin ioninvaihtohartsin kanssa olosuhteissa, joissa kymosiini sitoutuu hartsiin. Se, käytetäänkö esillä olevassa keksinnössä kationin- vai anionin-vaihtohartsia, riippuu polyetyleeniglykolifaasin pHrsta, 5 eli siitä, onko liuoksen pH kymosiinin isoelektrisen pisteen ylä- vai alapuolella. Täten kymosiinia sisältävän liuoksen kosketuksiin saattaminen ioninvaihtohartsin kanssa olosuhteissa, joissa kymosiini sitoutuu hartsiin, viittaa pelkästään siihen, että liuoksen pH säädetään ky-10 mosiinin isoelektrisen pisteen ylä- tai alapuolelle siten, että kymosiini sitoutuu käytettyyn hartsiin.

Toisaalta on yllättäen havaittu, että näissä olosuhteissa pepsiini ei sitoudu ioninvaihtohartsiin, vaikka pepsiinin isoelektrinen piste on samankaltainen kuin ky-15 mosiinin.

Vesipohjaisen polyetyleeniglykoliliuoksen pH on yleensä noin 6,5 tai alle, joskaan pH-arvot kymosiinin isoelektrisen pisteen läheisyydessä, eli pH:t noin 3,6 -noin 5,0, eivät ole edullisia, mikä johtuu kymosiinin al-20 haisesta sähköstaattisesta nettovarauksesta, joka alentaa sen tehoa hartsiin sitoutumisessa. Lisäksi pidettäessä po-lyetyleeniglykoliliuosta (faasia) pH:ssa noin 3-5 kymo-siinissa tapahtuu tehokkaampi autolyysi, vaikkakin huomattavasti hitaammalla nopeudella kuin vedessä. Joka tapauk-25 sessa vesipitoisen polyetyleeniglykolifaasin pitäminen lukemissa noin 3-5 johtaa jonkin asteiseen autolyysistä johtuvaan hävikkiin kymosiinisaannossa. Täten käytettäessä kationinvaihtohartsia liuoksen pH pidetään edullisesti alle noin 3,0:ssa; kun taas käytettäessä anioninvaihto-30 hartsia pH pidetään edullisesti yli noin 5,0:ssa.

Edullisia kationinvaihtohartseja käytettäviksi tässä keksinnössä ovat esimerkiksi IBF SP-Spherodex, Pharmacia SP-Sephadex, Indion SP-2, IBF SP-Trisacryl ja samankaltaiset. Edullisia anioninvaihtohartseja käytettä-35 viksi tässä keksinnössä ovat esimerkiksi IBF Q-Spherodex, 98643 12

Pharmacia Q-Sephadex, Indion Q-2, IBF Q-Trisacryl ja samankaltaiset .

Tämän keksinnön mukaiset menetelmät ovat käyttökelpoisia luonnollisesti tuotetun kymosiinin talteenotta-5 miseksi ja puhdistamiseksi. Luonnollisesti tuotettua kymo-siinia talteenotettaessa ja puhdistettaessa voidaan käyttää vesiliuosta, joka sisältää kymosiinin, pepsiinin ja muita epäpuhtauksia, epäpuhtaassa muodossaan, eli liuosta, joka on saatu uuttamalla pehmitettyä mahaa, tai 10 haluttaessa vesiliuos voidaan ensin suodattaa kiintoaineksen poistamiseksi valtaosin tai kokonaisuudessaan, minkä jälkeen nestemäistä suodosta käytetään tämän keksinnön mukaisissa menetelmissä.

Tämän keksinnön ensimmäisessä vaiheessa luonnolli-15 sesti tuotettu kymosiini otetaan talteen lisäämällä vesi-liuokseen, joka sisältää kymosiinia, pepsiiniä ja muita epäpuhtauksia, tehokas määrä polyetyleeniglykolia (PEG) ja tehokas määrä epäorgaanista suolaa kaksifaasisysteemin muodostamiseksi. Saadun liuoksen annetaan seistä sen erot-20 tamiseksi kymosiinia ja pepsiiniä runsaasti sisältäväksi polyetyleeniglykolifaasiksi ja kymosiinia ja pepsiiniä niukasti sisältäväksi suolafaasiksi. Kymosiinia ja pepsiiniä runsaasti sisältävä polyetyleeniglykolifaasi otetaan sitten talteen tavanomaisilla tekniikoilla.

25 On todettu, että näissä olosuhteissa päästään ky mosiinin ja pepsiinin jakaumakertoimiin polyetyleenigly-kolifaasiin, jotka ovat korkeampia kuin 30 ja edullisesti korkeampia kuin 85. Vaikka polyetyleeniglykoliuutto on käyttökelpoinen kymosiinin talteenottamiseksi korkeah-30 koilla pH-tasoilla, eli pH 6,5 tai alle, se on tehokkaampi suoritettaessa menetelmä pH:ssa alle noin 3. Tällaisissa alhaisemmissa pH-arvoissa voidaan päästä kymosiinille/pep-siinille jakaumakertoimiin aina 100 tai enemmän. Korkeat jakaumakertoimet ovat erityisen edullisia, koska ne mah-35 dollistavat pienempien määrien polyetyleeniglykolia käytön

II

98643 13 haluttuun kymosiinin erotukseen fermentaatioliemestä pääsemiseksi, mikä puolestaan helpottaa kymosiinin myöhempää erotusta polyetyleeniglykolista, eli läsnä on vähemmän erotettavaa polyetyleeniglykolia.

5 On edelleen todettu, että tuloksena yhdestä yksit täisestä uutosta polyetyleeniglykolifaasi voi sisältää niinkin paljon kuin 95 % tai enemmän vesiliuoksen alunperin sisältämästä kokonaiskymosiinista ja sisältää hyvin vähän jos lainkaan muita epäpuhtauksia. Täten sen lisäksi, 10 että esillä olevan keksinnön tämä näkökohta antaa käyttöön keinon oleellisesti kaiken luonnollisesti tuotetun kymosiinin ja pepsiinin talteenottamiseksi, mikä sisältyy vesiliuokseen, se niinikään antaa käyttöön keinon kymosiinin talteenottamiseksi ja sen erottamiseksi muista epäpuhtauk-15 sista kuin pepsiinistä.

Tämän keksinnön seuraavassa vaiheessa uutetun kymosiinin ja pepsiinin sisältävä polyetyleeniglykolifaasi erotetaan yhdestä tai useammasta muusta faasista ja polyetyleeniglykolifaasi saatetaan kosketuksiin ioninvaihto-20 hartsin kanssa, jolloin pH pidetään sellaisena tai säädetään sellaiseksi, että kymosiini sitoutuu hartsiin. Koska polyetyleeniglykolilla ei ole varausta näissä olosuhteissa, se kulkee hartsin läpi. Yllättäen näissä olosuhteissa pepsiinikään ei sitoudu ioninvaihtohartsiin vaan kulkee 25 hartsin läpi. Täten tämä vaihe saa aikaan kymosiinin puhdistuksen ei ainoastaan polyetyleeniglykolista vaan myös pepsiinistä. Täten kun eristetty polyetyleeniglykolifaasi, joka sisältää uutetun kymosiinin ja pepsiinin, saatetaan kosketuksiin ioninvaihtohartsin kanssa olosuhteissa, jois-30 sa kymosiini sitoutuu hartsiin, kymosiini oleellisesti kokonaisuudessaan poistuu polyetyleeniglykolista ja sitoutuu ioninvaihtohartsiin ja polyetyleeniglykoli ja Pepsiini kulkevat hartsikolonnin läpi. Ensimmäisen kosketuksiin saattamisen jälkeen hartsi pestään joko vedellä tai 35 vedellä ja suolalla, edullisesti sellaisissa olosuhteissa, 98643 14 ettei kymosiini irtoa hartsista, jäljellä olevan polyety-leeniglykolin ja pepsiinin poistamiseksi. Sitten kymosiini eluoidaan kolonnista käyttäen suolaliuosta ja puskuria, joka pidetään pHrssa, jossa kymosiini poistuu hartsista.

5 Koska selektiivisyys kymosiinin talteenotolle on korkea, ei tarvitse käyttää gradienttia tai hartsin vaiheittaista eluointia, koska oleellisesti ainoa entsyymi tai materiaali, joka on sitoutunut hartsiin polyetyleeniglykolifaasista ja sitten irrotetaan hartsista, on kymosiini. Tämän 10 vuoksi kymosiini voidaan eluoida yhdessä panosvaiheessa suolaliuosta käyttäen ja nostaen tai laskien pH:ta (riippuen luonnollisesti siitä, käytetäänkö kationin- vai anioninvaihtohartsia), jotta hartsiin sitoutunut kymosii-nisisältö kokonaisuudessaan saadaan eluoiduksi yhtenä erä-15 nä. Edullisesti eluointiliuokseen lisätään suolaa avustamaan eluoinnin nopeudessa tai asteessa, tai joissain tapauksissa, eli anioninvaihtohartsin kyseessä ollen, kymosiinin eluution hartsista saamiseksi, esim. 50 mM natrium-fosfaatti/2 M NaCl, pH 5,8. Suoloja käytetään edullisesti 20 eluointiliuoksen kanssa, sillä kymosiinia myydään tavallisesti kaupallisessa muodossa suolaliuoksena, jolloin on kätevää sisällyttää suola kymosiiniin tässä vaiheessa.

Täten talteenottamalla ja puhdistamalla kymosiinia tämän keksinnön mukaan saadaan kymosiinia, joka oleelli-25 sesti ei sisällä pepsiiniä ja muita epäpuhtauksia, eli epäpuhtauksien määrä on alle noin 10 paino-% laskettuna kymosiinin painosta ja edullisesti alle noin 5 paino-% laskettuna kymosiinin painosta. Tämä merkitsee, että saadun kymosiinituotteen puhtausaste on ainakin noin 90 pai-30 no-% ja sitä voidaan valmistaa kaupalliseen käyttöön ilman, että käytetään merkittävää jatkokäsittelyä epäpuhtauksien poistamiseksi. Kaupallinen kymosiinituote laimennetaan tavallisesti pitoisuuteen noin 1,5 g/litra kymosiinia. Suola (tavallisesti NaCl) -pitoisuus nostetaan 35 normaalisti noin 18 %:iin ja lisätään säilytysaine kuten li 98643 15 natriumbentsoaatti. Valmiilla konsentroidulla tuotteella, joka on tarkoitettu elintarvikelaatukäyttöön, suoritetaan samoin tavallisesti viimeinen suodatus mahdollisesti esiintyvien epätoivottavien kiinteiden aineiden tai hiuk-5 kasten poistamiseksi.

Vaikka korkeampia pH-tasoja voidaan käyttää kautta menetelmän (pH:t aina noin 6,5:een), polyetyleeniglyko-li/epäorgaaninen suola -seoksen teho kymosiinin uutossa vesiliuoksesta, joka sisältää kymosiinia, pepsiiniä ja 10 muita epäpuhtauksia, ja siten menetelmäteho eivät ole yhtä korkeita kuin pidettäessä pH alhaisena kautta uuttovai-heen. Tämän vuoksi edullisesti käytetään alhaista pH:ta ja siten kationinvaihtohartsia menetelmän kokonaisuudessaan tehon nostamiseksi.

15 Kun edeltävän keksinnön edulliset näkökohdat yhdis tetään suorittamalla polyetyleeniglykoliuutto pHrssa noin 3 tai alle ja saattamalla erotettu polyetyleeniglykolifaasi kosketuksiin kationinvaihtohartsin kanssa samalla kun pH pidetään alhaisena, on todettu, että yhdellä polyety-20 leeniglykoliuutolla ja yhden läpäisyn kosketuksiin saattamisella ioninvaihtohartsin kanssa saadaan talteen niinkin paljon kuin 90 - 95 % alkuperäisen vesiliuoksen sisältämästä kokonaiskymosiinista.

Toisaalta käyttämällä korkeampaa pH:ta polyetylee- 25 niglykoliuuttovaiheessa sekä anioninvaihtohartsia samalla kun pH pidetään kymosiinin isoelektrisen pisteen yläpuolella saadaan myös hyväksyttäviä tuloksia. Kuitenkin jos käytetään korkeampaa pH:ta kymosiinin uuttamiseksi ja liuoksen kosketuksiin saattamiseen hartsin kanssa halutaan 30 alhaisempi pH, tähän voidaan päästä helposti yksinkertai sesti säätämällä polyetyleeniglykoliuutteen pH kymosiinin isoelektrisen pisteen alapuolelle ja edullisesti noin pH:hon 3,6 tai alle ja edullisemmin noin pH:hon 3 tai alle, minkä jälkeen kymosiini saatetaan kosketuksiin katio-35 ninvaihtohartsin kanssa.

98643 16

Sen korkean tehon lisäksi, joka saadaan kymosiinin ja pepsiinin, etenkin kymosiinin, talteenotolle käyttämällä tässä kuvattua polyetyleeniglykoli/epäorgaaninen suola -seosta, on edelleen todettu, että kymosiinin liu-5 koisuus polyetyleeniglykoliin on ilmeisesti niin korkea, että kymosiini siirtyy vesifaasista polyetyleeniglykoli-faasiin hyvin nopeasti. Aika, joka tarvitaan kymosiinin uuttamiseksi polyetyleeniglykolifaasiin, on tavallisesti niin lyhyt, ettei se ole merkittävä menetelmäsuunnittelu-10 tekijä. Tämä menetelmä on siten hyvin tehokas ja taloudellinen käyttää ja se on helposti muutettavissa suurempaan mittakaavaan kaupallista tuotantoa silmällä pitäen.

Kuten ilmeistä on ja käytetystä pH:sta riippumatta tässä kuvatussa menetelmässä kymosiini ja pepsiini siir-15 retään vesiseoksesta hydrofobisempaan polyetyleeniglykolifaasiin. Tätä pitää käynnissä ainakin osittain suolapitoisuus ei-polyetyleeniglykolifaasissa tai -faaseissa. Jos käytetään polyetyleeniglykolia, jonka molekyylipaino on alhainen, polyetyleeniglykolifaasi on vähemmän hydrofobi-20 nen ja korkeampi suolapitoisuus on tarpeen ei-polyetyleeniglykolifaasi e )issa, mikä lisää käyttökustannuksia. Jos käytetään hydrofobisempaa polyetyleeniglykolia, jonka molekyylipaino on korkeampi, menetelmässä tarvitaan vähemmän suolaa, mutta erotusnopeus saattaa olla alhaisempi, koska 25 molekyylipainoltaan korkeamman polyetyleeniglykolin visko siteetti on korkea. Täten tämän keksinnön mukainen menetelmä voidaan optimoida mihin tahansa nimenomaiseen käyttöön valitsemalla halutut polyetyleeniglykolin molekyyli-paino, suolapitoisuus ja muut parametrit, joilla saadaan 30 toivomuksia vastaavat kustannukset. Yksi päämäärä on tavallisesti sen ajan minimointi, joka tarvitaan kymosiinin siirtämiseksi polyetyleeniglykolifaasiin, mutta toinen päämäärä on tavallisesti minimoida suolamäärä, joka käytetään oleellisesti kaiken kymosiinin siirtämiseksi poly-35 etyleeniglykolifaasiin. Vaikka suolapitoisuus ei-polyety- li 98643 17 leeniglykolifaaseissa voi olla 20 paino-% tai enemmän, tavallisesti tarvitaan vähemmän kuin noin 15 % tarkoituksenmukaista polyetyleeniglykolia käytettäessä. Esimerkiksi PEG-8000:aa käytettäessä noin 10 - 13 % natriumsulfaattia 5 on riittävä. Toisaalta epäorgaanisen suolan minimipitoisuuden määrää se suolapitoisuus, joka on välttämätön 2-faasisysteemin muodostamiseksi käyttäen polyetyleeniglykolia. Kuitenkin edullisessa suoritusmuodossa epäorgaanisen suolan pitoisuus on noin 8,5 - noin 20 % (w/v) lasket-10 tuna vesiliuoksen tilavuudesta, joka sisältää kymosiinin, pepsiiniä ja muita epäpuhtauksia.

Samoin edullisesti tässä käytetty polyetyleenigly-kolipitoisuus on vähemmän kuin noin 20, ja edullisemmin vähemmän kuin noin 15, % (w/v) laskettuna vesiliuoksen, 15 joka sisältää kymosiinin, pepsiiniä ja muita epäpuhtauksia, tilavuudesta. Taloudellisuutta ja myöhemmän erotuksen helppoutta silmällä pitäen käytetään edullisimmin niin vähän polyetyleeniglykolia kuin mahdollista.

Alan ammattilainen kykenee vaikeuksitta määrittä-20 mään tässä käytetyn polyetyleeniglykolin ja epäorgaanisen suolan tarkan pitoisuuden.

Sitten kun kymosiini on sidottu ioninvaihtohart-siin, talteen saatu polyetyleeniglykolifaasi sisältää epäpuhtautena pepsiiniä. Pepsiini voidaan ottaa talteen 25 tästä liuoksesta tunnetuilla menetelmillä ja uudelleen-kierrättää polyetyleeniglykoli. Vaihtoehtoisesti polyetyleeniglykoli voidaan heittää pois.

Toisaalta ioninvaihtohartsi voidaan regeneroida käytettäväksi seuraavien kymosiinia sisältävien polyety-30 leeniglykolierien kanssa pesemällä ioninvaihtohartsi vesiliuoksella, jonka pH on säädetty tarkoituksenmukaiseksi. Esimerkiksi käytettäessä kationinvaihtohartsia se voidaan regeneroida pesemällä se vesiliuoksella, joka sisältää riittävästi rikkihappoa pH:n laskemiseksi noin 2:een.

98643 18 Tämän keksinnön edeltävät näkökohdat, jotka mahdollistavat ioninvaihtohartsien uudelleenkäytön, erityisesti tekevät tämän keksinnön mukaisista menetelmistä sopivia tehokkaaseen kaupalliseen ja teolliseen käyttöön teollis-5 ten määrien kymosiinia, erityisesti luonnollisesti tuotettua kymosiinia, puhdistamiseksi.

Kun keksintöä nyt on kuvattu yleisessä mielessä, keksintö voidaan ymmärtää paremmin tutustumalla keksinnön seuraaviin suoritusmuotoihin, joita havainnollistetaan 10 seuraavissa esimerkeissä. Kuitenkin tämän keksinnön laajuuden määräävät oheiset patenttivaatimukset, kun taas seuraavat esimerkit ovat pelkästään havainnollistavia suoritusmuotoja nimenomaisista tavoista, joilla tässä julkistettua keksintöä voidaan harjoittaa.

15 Esimerkkejä

Esimerkki 1 Tämä esimerkki kuvaa vesipohjaisen kaksifaasipoly-etyleeniglykoliuuttomenetelmän käyttöä, jota seuraa kosketuksiin saattaminen ioninvaihtohartsin kanssa elintarvi-20 kelaatua olevan kymosiinin tuottamiseksi naudanmahoista. Kymosiini otetaan talteen härän (naudan) mahoista, jotka sisältävät suuria määriä nautapepsiiniä ja pienemmän määrän kymosiinia. Tässä käytetty vesiliuos valmistetaan jauhamalla naudanmahoja sopivassa nestevällaineessa ja suo-25 dattamalla solujäte eroon. Saatava vesiliuos sisältää luonnollisesti tuotettua kymosiinia, pepsiiniä ja muita epäpuhtauksia.

Tässä esimerkissä 500 ml:n härkäuutetta pH säädettiin 2:ksi rikkihapolla. 20 g PEG-8000:aa (4 %, w/v) ja 30 55 g kidevedetöntä natriumsulfaattia (11 %, w/v) lisättiin uutteeseen. Uute lämmitettiin 37 °C:seen sulfaattisuolan liukenemisen helpottamiseksi. Seos erotettiin kahdeksi faasiksi sentrifugoimalla (Sorvall-sentrifugi) noin 5 000 x g:ssä noin 15 minuutin ajan ja polyetyleeniglyko-35 lifaasi (päälifaasi) erotettiin suolafaasista (pohjafaasi) l! 98643 19 poistamalla pohjafaasi käyttäen keskipakoisvoimapumppua. Polyetyleeniglykolifaasia laimennettiin 1:3 deionisoidulla vedellä. Tämän faasin pH:ksi määritettiin 2,7 ja se säädettiin 2,3:ksi rikkihapolla. Laimennettu polyetyleenigly-5 kolifaasi käytettiin sitten ioninvaihtohartsin läpi, joka koostui IBF Spherodex SP -hartsista (proteiinien kanssa yhteensopiva kationinvaihtohartsi), jota oli aiemmin tasapaino! tettu vedellä pH 2:ssa kymosiinin sitomista silmällä pitäen. Läpi virtaava polyetyleeniglykoliliuos kerättiin 10 ja sen todettiin sisältävän pepsiiniä. Hartsia eluoitiin 0,5 M NaCl-liuoksella pH:ssa 2,0 mahdollisten polyetyleeniglykoli- ja pepsiinijäämien poistamiseksi ja pesuliuos otettiin talteen. Hartsia eluoitiin sitten 0,05 M nat-riumfosfaattiliuoksella, pH 5,8, joka sisälsi pitoisuuden 15 2 M NaCl, kymosiinin vapauttamiseksi yhtenä eränä. Eluoitu neste, joka sisälsi kymosiinia, joka oleellisesti ei sisältänyt pepsiiniä ja muita epäpuhtauksia, otettiin sitten talteen.

Nautapepsiinin ja -kymosiinin suhteellisten määrien 20 tuotteessa erottamiseksi toisistaan käytettiin seuraavaa määritystä. Eri liuosten maitoa hyydyttävä kyky mitattiin käyttäen rullapullolaitetta. Valmistettiin rasvatonta maitoa, jonka pH oli 6 ja 6,5. Nautapepsiini on aktiivisempi pHissa 6 ja kymosiini on aktiivisempi pH:ssa 6,5. Hyydy-25 tysaktiivisuuksia verrataan standardiin, joka koostuu 90 %:sta kymosiinia, 10 %:sta pepsiiniä. Aktiivisuuden pH:ssa 6 suhde aktiivisuuteen pH:ssa 6,5 on sitten näiden kahden entsyymin suhteellisten määrien mitta. Standardi antaa määritelmän mukaan suhteeksi 1. Koska nautapepsiini 30 on aktiivisempi pHrssa 6 kuin pH:ssa 6,5, aktiivisuuden pH:ssa 6 suhde aktiivisuuteen pH:ssa 6,5 on suurempi kuin 1 ja lähestyy 2:ta puhtaalle pepsiinille. Toisaalta korkeilla kymosiinitasoilla suhde on alle 1 ja lähestyy 0,5:tä tai alle.

98643 20 Tässä määrityksessä vesiliuoksen, jossa oli kymo-siinia, pepsiiniä ja muita epäpuhtauksia, kokonaispitoisuus kymosiinia ja pepsiiniä oli 16,64 CHU/ml (pH 6,5). Kun päälifaasi oli otettu talteen, se panostettiin hart-5 siin. Hartsipesun tulokset ilmoitetaan läpivirtauksena (materiaali, joka kulki hartsin läpi siihen sitoutumatta); pesuna (materiaali, joka poistui hartsista pepsiinin ja muiden epäpuhtauksien poistamiseksi suoritetussa pesuvai-heessa); ja eluaattina (materiaali, joka saatiin talteen 10 eluoitaessa kolonnia kymosiinin talteenottamiseksi). Tämän määrityksen tulokset ovat seuraavat: Määritetty Kymosiinin ja pepsiinin näyte pitoisuus Suhde (6/6,5) 15 lähtömateriaali 1,41 500 ml:n uutto 8 320 CHU* (16,54 CHU/ml) päälifaasib 7 830 CHU (115,15 CHU/ml) 1,34 pöhjafaasi 454,5 CHU (1,01 CHU/ml) 20 läpivirtaus 971,6 CHU (6,94 CHU/ml) 1,08 pesu 179,75 CHU (7,19 CHU/ml) 1,54 eluaatti 822,25 CHU (32,89 CHU/ml) 0,49 a = CHU, Chris. Hansen -yksikkö, 1 CHU/ml vastaa 25 seuraavia olosuhteita:

Substraatti: 110 g alhaisessa lämpötilassa spray-kuivattua rasvatonta maitojauhetta lietetään 1 000 ml:aan 0,05-%:ista kalsiumkloridiliuosta. Maitoa sekoitetaan 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa, minkä jälkeen se jäte-30 tään seisomaan vielä 30 minuutiksi. Maitoa tulisi säilyttää lämpötilassa 4 - 25 °C eikä yli 3 tunnin ajan. Maidon pH on noin 6,5.

Lämpötila: 32 °C ± 0,2 °C termostaatilla varustetussa vesihauteessa.

Il 98643 21

Entsyymin lisääminen: 25 ml:aan rekonstituoitua rasvatonta maitoa lisätään 0,5 ml entsyymiliuosta, laimennetaan siten, että hyytymisajaksi saadaan 380 - 500 sekuntia, jolloin hyytymisajaksi saadaan 410 - 460 sekuntia.

5 b = jakaumakerroin kymosiini/pepsiinille on 114.

Edeltävistä tulostiedoista ilmenee, että eluaatissa talteenotettu materiaali on kymosiinia, joka oleellisesti ei sisällä pepsiiniä ja muita epäpuhtauksia. Täten tämän keksinnön mukaisella menetelmällä on mahdollista ottaa 10 kymosiini tehokkaasti talteen luonnollisista kymosiiniläh-teistä.

Samoin noudattamalla edellä esitettyjä menettelyjä kymosiini voidaan samoin ottaa talteen ja puhdistaa uuttamalla pH:ssa noin 5 - 6,5 ja käyttäen anioninvaihtohart-15 siä. Sopivia anioninvaihtohartseja, joilla kationinvaihto- hartsi voitaisiin korvata edeltävässä esimerkissä, ovat esimerkiksi IBF Q-Spherodex, Pharmacia Q-Sephadex, Indion Q-2, IBF Q-Trisacryl ja samankaltaiset.

Esimerkki 2 20 Samalla tavalla kuin edellä esimerkissä 1 esite tyssä uuttomenettelyssä mutta käyttäen pH:ta noin 5,8 alla luetellut entsyymit uutettiin erikseen vesiliuoksesta nes-te-nestekaksifaasisysteemin polyetyleeniglykolifaasiin ja saatiin seuraavat tulokset (käytettiin puhtaita entsyyme-25 jä): 98643 22

Proteiinia Aktiivisuus Jakauma-

Entsyymi (mg/ml) CHU/ml kerroin vasikkakymosiini 1,7 28 87 5 nautapepsiini 1,9 31 31,5 sikapepsiini 2,3 29,7 1,45 E. parasitica aspara- giinihappoproteaasi 3,6 27 0,33 M. miehei aspara- 10 giinihappoproteaasi 2,4 20,5 0,24 Tämä koe toistettiin, mutta tällä kertaa pH:ssa 2 - 2,5, jolloin tulokset olivat seuraavat: 15 Proteiinia Aktiivisuus Jakauma-

Entsyymi (mg/ml) CHU/ml kerroin vasikkakymosiini 1,2 89 >943c nautapepsiini 1,3 50 >462c 20 sikapepsiini 1,6 23,7 >206c E. parasitica aspara- giinihappoproteaasi 2,5 15,2 1,18 M. miehei aspara- giinihappoproteaasi 1,7 48 0,94 25 c = Noin 200:n tai korkeampia jakaumakertoimia on vaikea mitata tarkasti määritysrajoitusten vuoksi. Toisin sanoen koska jakaumakerroin on suhde kymosiinin pitoisuus päälifaasissa jaettuna kymosiinin pitoisuudella pohjafaa-30 sissa ja edelleen koska kymosiinin määrä pohjafaasissa on yleensä hyvin pieni, pienet muutokset tässä pohjapitoi-suudessa tuottavat suuria heilahduksia jakaumakertoimessa. Lisäksi määritysmetodiikalla määritetty pitoisuus on erityisen altis vaihteluille hyvin alhaisissa pitoisuuksissa.

li 98643 23

Edeltävät tulokset osoittavat, että kymosiinin ja pepsiinin jakaumakertoimet ovat korkeita tässä systeemissä. Kuitenkin on samoin selvää, että nautapepsiinin jakaumakertoimet kasvavat huomattavasti siirryttäessä pH:sta 5 5,8 pH:hon 2 - 2,5. Täten saattaa olla edullista suorittaa uuttaminen pH:ssa, joka on yli noin 5, pepsiinin määrän polyetyleeniglykolifaasissa vähentämiseksi. Toisaalta myös kymosiinin jakaumakertoimet kasvavat huomattavasti siirryttäessä pHrsta 5,8 pH:hon 2 - 2,5. Täten jos uuttaminen 10 suoritetaan pH:ssa yli noin 5, myös talteenotetun kymosiinin määrä laskisi jonkin verran, joskin alhaisemmalla tasolla, koska kymosiinin jakaumakerroin pH:ssa 5,8 on korkeampi kuin nautapepsiinin.

Claims (14)

98643

1. Menetelmä kymosiinin talteenottamiseksi ja puhdistamiseksi vesiliuoksesta, jonka pH on noin 6,5 tai vä- 5 hemmän ja joka sisältää luonnollisista lähteistä saatua kymosiinia ja joka sisältää lisäksi pepsiiniä ja muita epäpuhtauksia, joka menetelmä on tunnettu siitä, että: a) vesiliuokseen lisätään tehokas määrä polyetylee- 10 niglykolia (PEG) ja epäorgaanista suolaa kaksifaasisystee- min muodostamiseksi; b) vesiliuos-polyetyleeniglykoli-epäorgaaninen suola -seoksen annetaan erottua kymosiinia ja pepsiiniä runsaasti sisältäväksi polyetyleeniglykolifaasiksi ja ky- 15 mosiinia ja pepsiiniä niukasti sisältäväksi suolataasiksi; c) kymosiinia ja pepsiiniä runsaasti sisältävä po-lyetyleeniglykolifaasi otetaan talteen; d) kymosiinia ja pepsiiniä runsaasti sisältävä polyetyleeniglykolif aasi saatetaan kosketuksiin ioninvaih- 20 tohartsin kanssa olosuhteissa, joissa kymosiini sitoutuu hartsiin ja polyetyleeniglykoli ja pepsiini kulkevat hartsin läpi; ja e) kymosiini otetaan talteen hartsista.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 25 tunnettu siitä, että vesiliuoksen pH on noin 3 tai vähemmän.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vesiliuoksen pH on vähemmän kuin noin 2,8.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että polyetyleeniglykolin keskimääräinen molekyylipaino on noin 600 - noin 12 000.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että polyetyleeniglykolin keski-35 määräinen molekyylipaino on noin 5 000 - noin 10 000. 98643

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että epäorgaaninen suola valitaan ryhmästä, jonka muodostavat sulfaattisuolat ja fosfaat-tisuolat.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että epäorgaaninen suola on sul-faattisuola.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sulfaattisuola valitaan ryh- 10 mästä, jonka muodostavat natriumsulfaatti, magnesiumsul faatti ja ammoniumsulfaatti.

9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vesiliuos suodatetaan ensin ennen polyetyleeniglykolin ja epäorgaanisen suolan lisää- 15 mistä.

10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kymosiinia ja pepsiiniä runsaasti sisältävän polyetyleeniglykolifaasin pH on joko 5,0 - 6,5 tai on noin 3,0 tai vähemmän.

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kymosiinia ja pepsiiniä runsaasti sisältävän polyetyleeniglykolifaasin pH on noin 3,0 tai vähemmän ja käytetään kationinvaihtohartsia.

12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, 25 tunnettu siitä, että kymosiinia ja pepsiiniä run saasti sisältävän polyetyleeniglykolifaasin pH on noin 2,0 - 2,5.

13. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kymosiinia ja pepsiiniä run- 30 säästi sisältävän polyetyleeniglykolifaasin pH on noin 5,0 - noin 6,5 ja käytetään anioninvaihtohartsia.

14. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että uuttovaihe a) suoritetaan pH:ssa noin 3,0 tai vähemmän ja kun polyetyleeniglykoli- 35 faasi on eristetty, tämän faasin pH säädetään lukemaan noin 5,0 - noin 6,5 ja käytetään anioninvaihtohartsia. 98643