FI94261B - Process for increasing the molecular weight of alkali lignin - Google Patents

Abstract

A process for treating alkali lignin with enzymes for the purpose of increasing the molecular weight of the lignin, in which process alkali lignin is treated in an aqueous mixture which contains lignin-modifying enzymes, which form radicals in the lignin, and a suitable organic solvent at a concentration which is advantageous for the activity of the enzyme such that the radicals which are formed in the treatment are polymerised. The quantity of the organic solvent is advantageously less than 50% by volume, calculated on the total volume, advantageously less than 40% by volume, more advantageously 1-30% by volume, and most advantageously approx. 2-20% by volume, such as approx. 10% by volume.

Description

9426194261

MENETELMÄ ALKALI-LIGNIININ MOLEKYYLIPAINON NOSTAMISEKSIMETHOD FOR INCREASING ALKALI-LIGNINE MOLECULAR WEIGHT

Keksintö koskee menetelmää alkaliligniinin käsittelemiseksi entsyymeillä siten, että sen molekyy-5 lipaino kasvaa.The invention relates to a process for treating alkali lignin with enzymes so that its molecular weight increases.

Ligniini on selluloosan ja hemiselluloosan jälkeen yleisin luonnon uusiutuvista yhdisteistä. Biomassaa arvioidaan kertyvän maapallolla vuodessa 1011 tonnia, josta noin 20 % on ligniiniä. Havupuut sisältä-10 vät 27 - 30 %, lehtipuut 20 - 25 % ja oljet noin 13 -20 % ligniiniä. Rakenteitaan ligniini on aromaattinen amorfinen kolmiulotteinen polymeeri, jossa on monenlaisia vaikeasti hajoavia sidoksia. Havupuiden ligniini on suhteellisen kondensoitunutta ja vähän metoksyyliryhmiä 15 sisältävää. Lehtipuiden ligniini on enemmän metoksyloi-tunutta.After cellulose and hemicellulose, lignin is the most common of the naturally occurring renewable compounds. It is estimated that 1011 tonnes of biomass accumulates on the planet per year, of which about 20% is lignin. Conifers contain -10 to 30-30%, deciduous trees 20-25% and straw about 13-20% lignin. In its structure, lignin is an aromatic amorphous three-dimensional polymer with a wide variety of persistent bonds. Softwood lignin is relatively condensed and low in methoxyl groups. Deciduous lignin is more methoxylated.

Ligniinin ominaisuudet ja sijainti kasvisolujen seinissä ovat syynä siihen, että ligniini määrää puun ominaisuudet, käyttötavat ja siis puuhun perustu-20 vat teollisuusprosessit. Ligniini on monimutkainen luonnon polymeeri, joka liittää puusolut eli kuidut lujaksi rakenteeksi ja saa näin aikaan puun hyvät ominaisuudet esimerkiksi rakennusmateriaalina. Suurin osa ligniinistä poistetaan kemiallisessa massanvalmistuk-25 sessa, jolloin se joutuu keittokemikaalien kanssa jäte-• ; ; liemeen.The properties and location of lignin in the walls of plant cells are the reason why lignin determines the properties of wood, the uses and thus the wood-based industrial processes. Lignin is a complex natural polymer that connects wood cells or fibers to a strong structure and thus provides the good properties of wood as a building material, for example. Most of the lignin is removed in chemical pulping, whereupon it comes into contact with cooking chemicals. ; broth.

Kemialliset puumassan valmistusmenetelmät, joissa puuhaketta kuumennetaan keittoliuoksessa paineen alla, voidaan jakaa ryhmiin käytettyjen keittokemikaa-30 lien mukaan.Chemical pulp production methods in which wood chips are heated in a cooking solution under pressure can be divided into groups according to the cooking chemicals used.

Sulfiittiprosesseissa puuhake käsitellään sul-fiitti-ioneilla happamissa tai neutraaleissa oloissa.In sulphite processes, wood chips are treated with sulphite ions under acidic or neutral conditions.

**

Niissä puun ligniini sulfonoituu ja siten se muuttuu hydrofiiliseksi. Puusta liukenevat hiilihydraatit jää-35 vät yleensä keittoliuokseen monomeereinään. Sulfiitti-jäteliemestä erotettavien lignosulfonaattien valmistus ja käyttö ovat laajasti tunnettua tekniikkaa.In them, the lignin in the wood is sulfonated and thus becomes hydrophilic. Wood-soluble carbohydrates generally remain in the cooking solution as monomers. The preparation and use of lignosulfonates separable from sulfite waste liquor are widely known in the art.

2 942612,94261

Sulfaattikeitossa puuhake käsitellään sulfidi-ioneilla aikalisissä oloissa. Alkalinen sulfidi pilkkoo puun ligniinissä yleisiä nk. β-Ο-4-sidoksia, mikä aiheuttaa ligniinin molekyylipainon alenemisen ja ligniinin 5 liukenemisen. Keitossa 70-90 % alkuperäisestä ligniinistä liukenee (Marton, J. 1971, Lignins, Occurrence, formation, structure and reactions, Sarkanen, K. ja Ludwig, C., toim., Wiley-Interscience, New York, London, Sydney, Toronto, ss. 639-694) ja muodostaa nat-10 riumsuolan muodossa noin puolet mustalipeän orgaanisesta aineksesta. Sivureaktiona tapahtuu mm. alkalin aiheuttamaa ligniinin kondensoitumista eli liuoksessa olevien ligniiniyksiköiden liittymistä toisiinsa hiili-hiili-sidoksin yleisimmin aromaattisen renkaan 5-ase-15 masta.In sulphate cooking, wood chips are treated with sulphide ions under temporal conditions. Alkaline sulfide cleaves common so-called β-Ο-4 bonds in wood lignin, causing a decrease in the molecular weight of lignin and dissolution of lignin. In cooking, 70-90% of the original lignin dissolves (Marton, J. 1971, Lignins, Occurrence, formation, structure and reactions, Sarkanen, K. and Ludwig, C., eds., Wiley-Interscience, New York, London, Sydney, Toronto , pp. 639-694) and forms about half of the black liquor organic matter in the form of the sodium salt. As a side reaction, e.g. alkali-induced condensation of lignin, i.e. the association of lignin units in solution with carbon-carbon bonds, most commonly from the 5-position of the aromatic ring.

Keittoa seuraavissa pesuvaiheissa jäteliemi eli mustalipeä, joka sisältää liuenneen ligniinin ja keittokemikaalit, otetaan talteen ja haihdutetaan. Mustalipeän suurin orgaaninen komponentti on ligniini.In the washing steps following cooking, the waste liquor, i.e. black liquor, which contains dissolved lignin and cooking chemicals, is recovered and evaporated. The largest organic component of black liquor is lignin.

20 Sulfaatti-ligniiniä muodostuu 400-600 kg sellutonnia kohti. Suomen sulfaattisellukapasiteetti v. 1990 oli n.20 Sulphate-lignin is formed per 400-600 kg of pulp. Finland's sulphate pulp capacity in 1990 was approx.

5 milj. tonnia, joten ligniinivarat ovat 2-3 milj. tonnia vuodessa. Tästä suurin osa käytetään polttoaineena soodakattilassa, jossa myös keittokemikaalit 25 otetaan talteen. Soodakattila on kuitenkin yleensä sel-.. lutehtaan tuotantokapasiteettia rajoittava tekijä kor kean investointikustannuksensa vuoksi. Suurimolekyy-lisen ligniinijakeen erottaminen mustalipeästä on edullista sellutehtaan kannalta myös sen vuoksi, että se 30 mahdollistaa mustalipeän haihduttamisen korkeampaan kuiva-ainepitoisuuteen ilman haitallista viskositeetin - nousua.5 million tons, so lignin reserves are 2-3 million. tons per year. Most of this is used as fuel in the recovery boiler, where the cooking chemicals 25 are also recovered. However, a soda ash boiler is usually a limiting factor in the pulp mill's production capacity due to its high investment cost. Separation of the high molecular weight lignin fraction from the black liquor is advantageous for the pulp mill also because it allows the black liquor to evaporate to a higher dry matter content without a detrimental increase in viscosity.

Tässä hakemuksessa termillä alkaliligniini tarkoitetaan sulfaatti- ja mistä tahansa sinänsä tunne-35 tusta alkalisesta keittoprosessista sivutuotteena saatavaa ligniiniä.In this application, the term alkali lignin means lignin obtained as a by-product of sulphate and any alkaline cooking process known per se.

Alkaliligniinin molekyylipainojakauma on melko 94261 3 tasainen välillä n. 100 - 50000. Jakeen molekyylimassa >5000, osuus on 24 % ja jakeen, molekyylimassa >10000, osuus on 12 %. Alkaliligniinin keskimääräinen molekyy-lipaino, vaihdellen välillä 1500 - 5000 mutta sisältäen 5 myös suurimolekyylistä osaa, on huomattavasti alhaisempi kuin natiivin ligniinin.The molecular weight distribution of alkali lignin is fairly 94261 3 uniform between about 100 and 50,000. The fraction has a molecular weight> 5000, 24%, and the fraction, molecular weight> 10,000, accounts for 12%. The average molecular weight of alkali lignin, ranging from 1,500 to 5,000 but also including the high molecular weight moiety, is significantly lower than that of native lignin.

Havupuusta valmistetussa alkaliligniinissä vapaiden fenoliryhmien määrä on 72/100 fenyylipropaa-niyksikköä, karboksyyliryhmien määrä 16/100 fenyylipro-10 paaniyksikköä, karbonyyliryhmien määrä 15/100 fenyyli-propaaniyksikköä, metoksyyliryhmien määrä 82/100 fe-nyylipropaaniyksikköä ja alifaattisten alkoholiryhmien määrä 48/100 fenyylipropaaniyksikköä.In softwood lignin, the number of free phenol groups is 72/100 phenylpropane units, the number of carboxyl groups is 16/100 phenylpropane units, the number of carbonyl groups is 15/100 phenylpropane units, the number of methoxyl groups is 82/100 phenylalkane units of phenylpropane units.

Alkaliligniini on liukoista vain aikalisissä 15 oloissa natriumsuolanaan; pH 3:ssa myös pienimolekyylinen ligniini saostuu jokseenkin täydellisesti. Sulfaat-tiligniini liukenee laimeaan emäsliuokseen ja useimpiin emäksisiin liuottimiin sekä eräisiin neutraaleihin polaarisiin liuottimiin (taulukko, Marton, J. 1971, I. 20 Lignins, Occurrence, formation, structure and reac tions, Sarkanen, K. ja Ludwig, C., toim., Wiley-Inters-cience, New York, London, Sydney, Toronto, s. 687). Vesiliuoksessa alkaliligniini toimii hydrokolloidin tavoin. Ligniini on veteen liukenevaa alhaisissa kon-25 sentraatioissa ja alkaa saostua pH:ta alennettaessa.Alkali lignin is soluble only under temporal conditions as its sodium salt; At pH 3, small molecule lignin also precipitates more or less completely. Sulfate tilignin is soluble in dilute alkaline solution and most basic solvents, as well as in some neutral polar solvents (Table, Marton, J. 1971, I. 20 Lignins, Occurrence, formation, structure and reactions, Sarkanen, K. and Ludwig, C., eds. , Wiley-Interscience, New York, London, Sydney, Toronto, p. 687). In aqueous solution, alkali lignin acts like a hydrocolloid. Lignin is soluble in water at low concentrations and begins to precipitate as the pH is lowered.

·/·*; Elektrolyytin läsnäollessa ligniini saostuu pH 6:n tienoilla.· / · *; In the presence of electrolyte, lignin precipitates around pH 6.

Sulfiittiprosessissa muodostuva sulfonoitunut ligniini on alkaliligniiniä suurimolekyylisempää; val-30 mistettaessa paperimassoja jakeen, jonka molekyylimassa on >5000, osuus on 51 % ja jakeen, jonka molekyylimassa . · i on >10000, osuus on 39 %. Valmistettaessa liukoselluja vastaavat osuudet ovat 42 % ja 30 %. Sulfonoitunut ligniini on lisäksi hydrofiilistä, joten se on vesi-35 liukoista happamalla ja neutraalilla pH-alueella.The sulfonated lignin formed in the sulfite process is more molecular than alkali lignin; in the preparation of pulps, the fraction with a molecular weight> 5000 is 51% and the fraction with a molecular weight. · I is> 10,000, the share is 39%. In the production of soluble pulps, the corresponding proportions are 42% and 30%. In addition, the sulfonated lignin is hydrophilic, making it water-35 soluble in the acidic and neutral pH range.

Erotettaessa mustalipeästä suurimolekyylistä ligniiniä ultrasuodattamalla ligniinistä muodostuu 4 94261 ultrasuodatuskalvon pinnalle geeli, joka määrää mole-kyylipainorajaksi n. 10000; molekyylipainon vaihteluväli on siis n. 10000 - 50000. Julkaisun FI 871010 mukaan valmistetussa ultrasuodatetussa ligniinituotteessa 5 vähintään 35 % ligniinistä on molekyylimassaltaan yli 5000. Tämä ligniini on alkaliligniinin tapaan natrium-suolana ja pysyy täysin liukoisena vain aikalisissä oloissa pH-arvon ollessa yli 10. Ligniinituotteen puhtautta kuvataan sillä, että vähintään 70 p-% kokonais-10 kuiva-aineesta saostuu 1-5 % vesiliuoksesta 1 M suolahapolla pH:ssa 3.When ultrafiltration of high molecular weight lignin from black liquor by ultrafiltration, 4,94261 a gel is formed on the surface of the ultrafiltration membrane, which determines a Mole alkylation limit of about 10,000; the molecular weight range is thus about 10,000 to 50,000. In the ultrafiltered lignin product 5 prepared according to FI 871010, at least 35% of the lignin has a molecular weight above 5000. This lignin, like alkali lignin, is a sodium salt and remains completely soluble only under temporal conditions at a pH greater than 10. purity is described by the fact that at least 70% by weight of the total-10 dry matter precipitates from 1-5% aqueous solution with 1 M hydrochloric acid at pH 3.

Ultrasuodatettua ligniiniä voidaan suomalaisen patenttihakemuksen FI 871010 mukaan käyttää esim. lig-noselluloosatuotteiden lujitukseen ilman kopolymeroin-15 tia hartsien kanssa. Kuitulevyjen valmistuksessa tarvitaan kuitenkin kuumapuristusta ligniinin kovettamisek-si. Edelleen kartonkituotteiden valmistuksessa ligniinin retentiota voidaan parantaa saostuskemikaaleilla. Ligniiniä tai sen ultrasuodatettua suurimolekyylistä 20 osaa (MP > 10.000) voidaan käyttää edelleen liimana. Tällöin tarvitaan kuitenkin lisäksi kemiallisia kovettamia. Näissä sovellutuksissa ylimääräisten prosessi-vaiheiden ja kemikaalien käytöstä aiheutuu kustannuksia ja ne lisäävät työvaiheita.According to Finnish patent application FI 871010, ultrafiltered lignin can be used, for example, to reinforce lignocellulose products without copolymerization with resins. However, in the manufacture of fibreboards, hot pressing is required to cure lignin. Furthermore, in the manufacture of paperboard products, lignin retention can be improved by precipitating chemicals. Lignin or its ultrafiltered high molecular weight 20 (MP> 10,000) can still be used as an adhesive. In this case, however, additional chemical hardeners are required. In these applications, the use of additional process steps and chemicals incurs costs and increases work steps.

25 Ligniiniä voidaan modifioida myös entsy- . ; maattisesti. Tähän mennessä tutkittuja ligniinin hajo tukseen osallistuvia entsyymejä ovat peroksidaaseihin ja oksidaaseihin kuuluvat ligniiniperoksidaasi, mangaaniperoksidaasi ja lakkaasi sekä vetyperoksidia tuot-30 tavat entsyymit (Eriksson, K.-E., Blanchette, R.A. ja Ander, P. 1990, Microbial and enzymatic degradation of • wood and wood components; Springer-Verlag, Berlin-Hei- ’ ‘ * delberg, ss. 253-307, taulukko 1).Lignin can also be modified by enzyme. ; matically. Enzymes involved in lignin degradation to date include peroxidases and oxidases, including lignin peroxidase, manganese peroxidase and laccase, and hydrogen peroxide-producing enzymes (Eriksson, K.-E., Blanchette, RA and Ander, P. 1990, Microbial and Enz. wood and wood components; Springer-Verlag, Berlin-Hei- '* * delberg, pp. 253-307, Table 1).

35 94261 535 94261 5

Taulukko 1. Makromolekulaarisen ligniinin hajottamiseen osallistuvia entsyymejäTable 1. Enzymes involved in the degradation of macromolecular lignin

Entsyymiaktiivi- Kofaktori/ Vaikutus/reaktio 5 suus substraatti__Enzyme Active Cofactor / Effect / Reaction 5 Oral Substrate__

Ligninaasi H202 aromaattinen rengasLigninase H202 aromatic ring

Ligniiniperoksi- hapettuu kationiradikaa- daasi liksiLignin peroxyacid oxidizes to cation radicalase

Lakkaasi 02 fenolit hapettuvat fe- noksiradikaaleiksi 10 Mangaaniperoksi- H,O, Mn11 hapettuu Mnm:ksi * 2 jj j daasi (Mn hapettaa fenoleja _fenoksiradikaaleiksi)Laccase 02 phenols are oxidized to phenoxy radicals 10 Manganese peroxy-H, O, Mn11 is oxidized to Mnm * 2 and jase (Mn oxidizes phenols to phenoxy radicals)

Julkaisun mukaan lakkaasientsyymi (bentseeni-dioli : happi oksidoreduktaasi, EC 1.10.3.2) hapettaa 15 fenolit fenoksiradikaaleiksi, joilla on taipumus spontaanisti polymeroitua. Lakkaasi käyttää molekulaarista happea hapettajana. Ligniinin fenolisissa malliyhdis-teissä tapahtuu monenlaisia reaktioita, mm. Ca-hydrok-syylin hapetusta ketoniksi, demetoksylaatiota, aryyli-20 C -sidoksen ja C -C -sidoksen katkeamista.According to the publication, the enzyme laccase (benzene diol: oxygen oxidoreductase, EC 1.10.3.2) oxidizes phenols to phenoxy radicals, which tend to polymerize spontaneously. Your lacquer uses molecular oxygen as an oxidant. Phenolic model compounds of lignin undergo a variety of reactions, e.g. Oxidation of Ca-hydroxyl to ketone, demethoxylation, cleavage of the aryl-20 C bond and the C -C bond.

Lakkaasia tuottavat lähes kaikki valkolahosienet, joista mainittakoon Phlebia radiata, Coriolus versicolor ja Trametes hirsuta. Lakkaasia voidaan tuottaa alustalla, johon on lisätty fenolista aromaattista ' · 25 yhdistettä tai muuta yhdistettä, kuten ksylidiiniä in- duktoriksi. Lakkaasi toimii pH-alueella 4-6, edullisesti 5. Lakkaasigeeni on voitu siirtää parempaan tuotta-jaorganismiin, kuten P. radiatan lakkaasigeeni Tric-hoderma lonqibrachiatumiin (Saloheimo, M. ja Niku-Paa-30 vola, M.-L. 1991, Bio/technology 9:987-990), jolloin sen tuotto voidaan saada edulliseksi. Lakkaasin aktii-visuusmäärityksissä käytetään substraattina esimerkiksi syringaldatsiinia tai guajakolia.Laccase is produced by almost all white fungi, including Phlebia radiata, Coriolus versicolor and Trametes hirsuta. The laccase can be produced on a medium to which a phenolic aromatic compound or another compound such as xylidine has been added as an inducer. Your laccase functions in a pH range of 4 to 6, preferably 5. The laccase gene may have been transferred to a better producer organism, such as the P. radiata laccase gene Tric-hoderma lonqibrachiatum (Saloheimo, M. and Niku-Paa-30 vola, M.-L. 1991, Bio / technology 9: 987-990), whereby its yield can be obtained advantageously. For example, syringaldazine or guaiacol are used as substrates in laccase activity assays.

Ligniiniperoksidaasin ja mangaaniperoksidaasin 35 osalta mainittakoon, että valkolahosienet tuottavat 6 94261 myös näitä ligniinin rakennetta muuntavia entsyymejä. Ne ovat hemoproteiineja, ja niiden suurimittainen tuotto on verrattain vaikeaa. Myöskään geeninsiirto siten, että tuottajaorganismi tuottaisi aktiivista 5 entsyymiä, ei ole helppoa (Saloheimo, M. 1991, Molecular biology of lignin-degrading enzymes from Phlebia radiata. VTT Publications 76, 73 s. ja liitteet). Lak-kaasia on siten helpompi ja halvempi tuottaa kuin em. peroksidaaseja.With regard to lignin peroxidase and manganese peroxidase 35, it should be noted that white lung fungi also produce 6,94261 of these lignin-modifying enzymes. They are hemoproteins and their large-scale yield is relatively difficult. Gene transfer in such a way that the producer organism produces the active enzyme is also not easy (Saloheimo, M. 1991, Molecular Biology of lignin-degrading enzymes from Phlebia radiata. VTT Publications 76, 73 p. And appendices). Lak gas is thus easier and cheaper to produce than the above-mentioned peroxidases.

10 Lakkaasientsyymi on siten helpommin teollises ti tuotettavissa ja käytettävissä. Se kestää korkeita lämpötiloja (>60 °C) ja sillä on suhteellisen laaja pH-alue (pH 3,5 - 6).10 The laccase enzyme is thus easier to produce and use industrially. It withstands high temperatures (> 60 ° C) and has a relatively wide pH range (pH 3.5 to 6).

Lakkaasi poistaa ligniinistä metoksyyliryhmiä 15 eli demetoksyloi ligniiniä ligniiniperoksidaasin ja Mn-peroksidaasin tavoin, sillä 014CH3-leimatusta synteettisestä ligniinistä eli DHP:stä (dehydrogenaatiopolymee-ri) saadaan 14CH3OH:ia (Ander, P., Hatakka, A., Lundell, T., Pettersson, B., Stalmasek, M. ja Vole, J. 1992, 20 Lignocellulosics, Science, Technology, Development and Use, Ellis Horwood Ltd., Chichester, ss. 109 - 119). Entsyymin vaikutuksen seurauksena ligniinissä muodostuu fenoksiradikaaleja, jolloin seurauksena voi olla polymeroitumista .Laccase removes methoxyl groups from lignin, i.e. demethoxylates lignin like lignin peroxidase and Mn-peroxidase, since 014CH3-labeled synthetic lignin, or DHP (dehydrogenation polymer), gives 14CH3OH (Ander, P., L., Hatakka, A., Hatakka, A., Hatakka). Pettersson, B., Stalmasek, M. and Vole, J. 1992, Lignocellulosics, Science, Technology, Development and Use, Ellis Horwood Ltd., Chichester, pp. 109-119). As a result of the action of the enzyme, phenoxy radicals are formed in the lignin, which can lead to polymerization.

25 Mainittakoon, että ligniiniperoksidaasin ja , „ lakkaasin vaikutuksesta ligniinivalmisteita tai jäte- < v vesien fenolisia yhdisteitä on saatu polymeroitumaan.It should be noted that under the action of lignin peroxidase and laccase, lignin preparations or phenolic compounds of wastewater have been polymerized.

Esimerkkinä tästä on lakkaasin käyttömahdollisuus kuo- rimo- ja valkaisujätevesien sekä mekaanisen massan val- 30 mistuksessa syntyvien jätevesien käsittelyssä. Lakkaa- sientsyymin on Oy Keskuslaboratorio-Centrallaboratorium . Ab: n tutkimusten mukaan todettu polymeroivan paitsi » lignosulfonaatteja myös kuorimon jätevesien ja val-• kaisujätevesien ligniinikomponentteja (Forss, K., Joki- 35 nen, K., Savolainen, M. ja Williamson, H. 1987, Proceedings of the 4th International Symposium on Wood and Pulping Chemistry, 1987, Pariisi, ss. 179-183).An example of this is the possibility of using laccase in the treatment of peeling and bleaching effluents as well as effluents from the production of mechanical pulp. The laccase enzyme is Oy Keskuslaboratorio-Centrallaboratorium. According to Ab's studies, it has been found to polymerize not only lignosulfonates but also the lignin components of • shellfish effluents and bleach effluents (Forss, K., Jokinen, K., Savolainen, M. and Williamson, H. 1987, Proceedings of the 4th International Symposium on Wood and Pulping Chemistry, 1987, Paris, pp. 179-183).

94261 794261 7

Alkaliligniinin tapauksessa tällaisilla ligniiniä modifioivilla entsyymeillä tapahtuva käsittely ei ole ollut toteutettavissa, sillä esim. lakkaasikä-sittelyn ongelmana on se, että ko. entsyymien vaati-5 maila pH-alueella alkaliligniini on suureksi osaksi saostuneena.In the case of alkali lignin, treatment with such lignin-modifying enzymes has not been feasible, since the problem with e.g. the laccase treatment is that the enzymes require -5 miles in the pH range of alkali lignin is largely precipitated.

Ultrasuodatetun tai saostetun alkaliligniinin entsyymikäsittelyn ongelmana on ligniinituotteen korkea pH (>11), jolloin ligniiniin vaikuttavat entsyymit ei-10 vät voi toimia. Eräs mahdollisuus olisi käyttää normaalia korkeammassa pH:ssa toimivaa lakkaasia, jota tuottaa mm. Rhizoctonia praticola (Bollag, J.-M. ja Leono-wicz, A., 1984. Appi. Environ. Microbiol. 48:849 - 854). Tällaisen lakkaasin tuotto on kuitenkin olennai-15 sesti vaikeampaa kuin happamassa toimivan lakkaasin, eikä sen toiminnan pH-alue ole riittävän korkea sellaisenaan.The problem with the enzymatic treatment of ultrafiltered or precipitated alkali lignin is the high pH (> 11) of the lignin product, which prevents the enzymes acting on the lignin from functioning. One possibility would be to use a lacquer operating at a higher pH than normal, which is produced e.g. Rhizoctonia praticola (Bollag, J.-M. and Leonowicz, A., 1984. Appl. Environ. Microbiol. 48: 849-854). However, the production of such a laccase is substantially more difficult than that of an acidic laccase and the pH range of its action is not high enough as such.

Siten alkaliligniinin yhteydessä on tutkittu ainoastaan entsyymikäsittelyjä, joissa ligniiniä hajoi-20 tetaan entsyymien avulla.Thus, in the case of alkali lignin, only enzyme treatments in which lignin is degraded by enzymes have been studied.

Orgaanisten liuottimien käyttöä ligniiniä modifioivien entsyymien yhteydessä on tutkittu jonkin verran muita tuotteita kuin alkaliligniiniä käyttäen. Esim. patenttihakemuksessa DE 3827001 Cl (Hiittermann, 25 A., Milstein, O. ja Nicklas, B.) on käytetty ligniiniä • : · modifioivaa, immobilisoitua entsyymiä orgaanisessa liuottimessa erilaisten ligniinien tai niiden johdannaisten modifioimiseksi. Julkaisussa tutkittiin mm. immobilisoidun lakkaasin stabiilisuutta ja aktiivisuut-30 ta orgaanisen liuottimen pitoisuuden ollessa korkea (20 - 99 til-%) suhteessa veden määrään. Esimerkkinä on esitetty synteettisen ligniinin ja organosolv-ligniinin • i * polymeroituminen. Toisessa tutkimuksessa (Milstein, O., Hiittermann, A., Majcherczyk, A., Liidemann, H.-D. ja 35 Frvind, R., Fifth International Conference on Biotechnology in the Pulp and Paper Industry, 27-30 May, 1992, Kyoto, abstrakti, s. 32 ja esitelmä) immobilisoitua 8 94261 lakkaasia samoin käytettiin organosolv-ligniinin poly-meroimiseen seoksessa, jossa oli 70 til-% dioksaania.The use of organic solvents with lignin-modifying enzymes has been studied with some products other than alkali lignin. For example, patent application DE 3827001 Cl (Hiittermann, 25 A., Milstein, O. and Nicklas, B.) uses a lignin •: · modifying, immobilized enzyme in an organic solvent to modify various lignins or their derivatives. The publication examined e.g. the stability and activity of the immobilized laccase at a high content of organic solvent (20 to 99% by volume) relative to the amount of water. An example is the polymerization of synthetic lignin and organosolv lignin. In another study (Milstein, O., Hiittermann, A., Majcherczyk, A., Liidemann, H.-D. and 35 Frvind, R., Fifth International Conference on Biotechnology in the Pulp and Paper Industry, 27-30 May, 1992 , Kyoto, Abstract, p. 32 and presentation) immobilized 8,94261 laccase was also used to polymerize organosolvin lignin in a mixture of 70% by volume dioxane.

Esillä olevan keksinnön tarkoituksena on poistaa edellä esitetyt epäkohdat ja tuoda esiin uusi ent-5 syymikäsittelyyn perustuva menetelmä alkaliligniinin käsittelemiseksi, jonka avulla alkaliligniinin moolimassaa voidaan nostaa siten, että ligniinin käyttökelpoisuus sideaineena paranee. Edelleen keksinnön tarkoituksena on tuoda esiin menetelmä, jossa ligniinin modi-10 fiointiin käytettyä entsyymiä ei tarvitse immobilisoida .It is an object of the present invention to obviate the above drawbacks and to provide a new method for treating alkali lignin based on ent-5 enzyme treatment, by means of which the molecular weight of alkali lignin can be increased so as to improve the usefulness of lignin as a binder. It is a further object of the invention to provide a method in which the enzyme used to modify the lignin does not need to be immobilized.

Edelleen keksinnön tarkoituksena on parantaa suurimolekyylisten alkaliligniinituotteiden, kuten ult-rasuodatettujen tai saostettujen alkaliligniini-15 tuotteiden, geeliytymisominaisuuksia ja siten niiden kovettumis- ja liimautuvuusominaisuuksia.It is a further object of the invention to improve the gelling properties of high molecular weight alkali lignin products, such as ultrafiltered or precipitated alkali lignin-15 products, and thus their curing and adhesion properties.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista se, mitä on esitetty patenttivaatimuksen 1 tunnusmerkkiosassa.The method according to the invention is characterized by what is set forth in the characterizing part of claim 1.

20 Keksintöön liittyvien entsyymi tutkimuksien yh teydessä on yllättäen havaittu, että kun alkaliligniinin vesiliuoksesta koostuva seos sisältää orgaanista liuotinta pienenä pitoisuutena, liuotin vaikuttaa reak-tioseokseen edullisesti siten, että käytetty ligniiniä 25 modifioiva entsyymi pysyy aktiivisena reaktioseoksessa ja aiheuttaa esim. fenoliradikaalien muodostusta ligniinissä ja edelleen alkaliligniinin polymeroitumista, so molekyylipainon nousun.In connection with the enzyme studies of the invention, it has surprisingly been found that when a mixture of an aqueous alkali lignin solution contains a low concentration of an organic solvent, the solvent preferably acts on the reaction mixture so that the lignin-modifying enzyme used remains active in the reaction mixture. polymerization, i.e., an increase in molecular weight.

Suoritetuissa tutkimuksissa jo pienen pitoi-30 suuden orgaanista liuotinta, so. alle 50 til-% kokonaistilavuudesta laskettuna, edullisesti alle 40 til-%, edullisemmin 1-30 til-%, edullisimmin 2-20 til-%, esim. n. 10 til-%, on havaittu liuottavan alkalilig-niiniä riittävästi ja pitämään se liuenneena halutuissa 35 olosuhteissa siten, että alkaliligniinin pH:ta voidaan laskea ilman, että alkaliligniini saostuu. Siten keksinnön mukaisessa menetelmässä reaktioseoksen pH voi- 9 94261 daan saattaa käytetyn entsyymivalmisteen toiminnalle edulliselle, kuten happamalle, pH-alueelle alkalilig-niinin pysyessä liukoisessa muodossa. Toiseksi, keksinnön mukainen orgaanisen liuottimen määrä ei inakti-5 voi käytettyä entsyymivalmistetta, jolloin entsyymikä-sittely voidaan suorittaa esim. nestemäisellä entsyymi-valmisteella liuosfaasissa ilman, että entsyymiä tarvitsee immobilisoida. Keksinnön mukaisen orgaanisen li-uotinmäärän on havaittu jopa tehostavan entsyymien 10 vaikutusta käsittelyn aikana.In the studies carried out, even a low concentration of 30 organic solvents, i.e. less than 50% by volume of the total volume, preferably less than 40% by volume, more preferably 1-30% by volume, most preferably 2-20% by volume, e.g. about 10% by volume, has been found to sufficiently dissolve the alkali lignin and keep it dissolved under the desired conditions so that the pH of the alkali lignin can be lowered without precipitating the alkali lignin. Thus, in the process of the invention, the pH of the reaction mixture may be adjusted to a pH range of 9,94261, which is preferred for the operation of the enzyme preparation used, while the alkali lignin remains in a soluble form. Second, the amount of the organic solvent according to the invention cannot inactivate the enzyme preparation used, whereby the enzyme treatment can be performed e.g. with a liquid enzyme preparation in solution phase without the need to immobilize the enzyme. The amount of organic solvent according to the invention has even been found to enhance the effect of the enzymes during the treatment.

Keksinnön mukaisessa menetelmässä entsyymikä-sittely vaikuttaa alkaliligniiniin kasvattaen sen keskimääräistä molekyylikokoa. Edelleen käsittely muuttaa ligniinin konsistenssia geelimäisemmäksi.In the process of the invention, the enzyme treatment acts on the alkali lignin, increasing its average molecular size. Further, the treatment makes the lignin consistency more gel-like.

15 Alkaliligniinissä tapahtuva geelin muodostumi nen on seurausta silloittumisesta eli kovalenttisten sidosten muodostumisesta makromolekyylien välille. Jo 5 % konsentraatio silloittunutta molekyyliä riittää gee-limäisen rakenteen saavuttamiseen. Molekyylipaino kas-20 vaa ristisilloittumisen johdosta, jolloin esimerkiksi ekskluusiokromatografian mittaama hydrodynaaminen tilavuus kasvaa, ja saadaan suurempia molekyylipainoja. Laimeassa lähtöaineen pitoisuudessa saattaa kuitenkin muodostua polymeerimolekyylin sisäisiä sidoksia, jol-25 loin muodostuu mikrogeelejä. Koska molekyylien välisiä , r . sidoksia ei muodostu kovinkaan paljon, hydrodynaaminen tilavuus ei kasva, molekyylit vetäytyvät kokoon, eikä molekyylipaino kasva. Tärkeä ominaisuus geelejä arvioitaessa on polydispersisyys, Mw/Mn. Suurissa molekyy-30 lipainoissa polydispersisyys saattaa olla korkea. Joissakin oloissa ligniinin kaltaisten ei-lineaaristen polymeerien polyfunktionaalinen kondensoituminen johtaa * geelifraktioon, jossa on rajaton verkosto (Goring, D.Gel formation in alkali lignin results from crosslinking, i.e. the formation of covalent bonds between macromolecules. Already a 5% concentration of crosslinked molecule is sufficient to achieve a gel-like structure. The molecular weight increases due to crosslinking, whereby, for example, the hydrodynamic volume measured by exclusion chromatography increases, and higher molecular weights are obtained. However, at a dilute starting material concentration, intramolecular bonds may form in the polymer molecule to form microgels. Since intermolecular, r. the bonds are not formed very much, the hydrodynamic volume does not increase, the molecules shrink, and the molecular weight does not increase. An important property when evaluating gels is polydispersity, Mw / Mn. In large molecular weight lipids, polydispersity may be high. Under some conditions, polyfunctional condensation of lignin-like nonlinear polymers results in * a gel fraction with an infinite network (Goring, D.

1971, Lignins, Occurrence, formation, structure and 35 reactions, Sarkanen, K. ja Ludwig, C., toim., Wiley-Interscience, New York, London, Sydney, Toronto, ss. 695 - 768). Tällöin M voi olla rajallinen, mutta M/M1971, Lignins, Occurrence, formation, structure and 35 reactions, Sarkanen, K. and Ludwig, C., eds., Wiley-Interscience, New York, London, Sydney, Toronto, p. 695 - 768). In this case, M may be finite, but M / M

' n J 9 w n 1„ 94261 saattaa tulla äärettömäksi loppuunmenneessä geelinmuo-dostumisessa.'n J 9 w n 1 „94261 may become infinite in completed gel formation.

Keksinnön mukaisessa entsyymin ja orgaanisen liuottimen avulla alkaliligniinistä valmistetussa gee-5 limäisessä tuotteessa havaitaan polydispersisyyttä. Geeli on vaikeasti liukeneva ja liukenee vasta kuumennettaessa 0.1 M NaOH-liuoksessa. Tällainen geelinmuo-dostus jo huoneenlämmössä on edullista esim. liima-ominaisuuksien kannalta.Polydispersity is observed in the gel-5-like product prepared from alkali lignin by means of an enzyme and an organic solvent according to the invention. The gel is sparingly soluble and only dissolves when heated in 0.1 M NaOH solution. Such gel formation already at room temperature is advantageous, e.g. in terms of adhesive properties.

10 Keksinnön eräässä edullisessa sovellutuksessa raaka-aineena käytettävä alkaliligniini omaa suuren molekyylikoon ollen valmistettu mustalipeästä saosta-malla tai ultrasuodattamalla. Menetelmässä käytettävän alkaliligniinin molekyylimassa on edullisesti yli 5000. 15 Edullisesti jakeen, moolimassa > 5000, osuus on yli 35 %, edullisemmin yli 40 % ja edullisimmin yli 50 % koko ligniinimäärästä. Käsiteltävässä alkaliligniinissä on edullisesti 70 - 90 p-% kuiva-aineesta laskettuna hapolla saostuvaa ligniiniä.In a preferred embodiment of the invention, the alkali lignin used as raw material has a large molecular size and is prepared from black liquor by precipitation or ultrafiltration. The alkali lignin used in the process preferably has a molecular weight of more than 5000. Preferably, the fraction, molecular weight> 5000, represents more than 35%, more preferably more than 40% and most preferably more than 50% of the total lignin. The alkali lignin to be treated preferably contains 70 to 90% by weight, based on the dry matter, of acid-precipitating lignin.

20 Käsiteltävä alkaliligniinimäärä voi vaihdella riippuen mm. käytetystä entsyymivalmiste- ja liuotin-tyypistä sekä näiden käyttömääristä.20 The amount of alkali lignin to be treated may vary depending on e.g. the type of enzyme preparation and solvent used and the amounts used.

Alkaliligniinin tiedetään liukenevan moniin orgaanisiin liuottimiin (esim. Lindberg, J. 1965. Suo-25 men Kemistilehti B38:95-100; Lindberg, J. ja Ekman, R.Alkali lignin is known to be soluble in many organic solvents (e.g. Lindberg, J. 1965. Finnish Chemistry Journal B38: 95-100; Lindberg, J. and Ekman, R.

. , . 1966. Suomen Kemistilehti B39:89-96). Keksinnön mukai- « > e sessa menetelmässä käytettävä orgaaninen liuotin on edullisesti alkoholi, jossa on 1 - 5 hiiliatomia, tai muu polaarinen liuotin tai näiden seos, edullisemmin 30 dimetyyliformamidi, dimetyylisulfoksidi, 1,2-dimetok-sietaani, hydroksimetoksiglykoli, isopropanoli, 1-pro-panoli, metanoli tai etyyliasetaatti, tai näiden seos.. ,. 1966. Suomen Kemistilehti B39: 89-96). The organic solvent used in the process of the invention is preferably an alcohol having 1 to 5 carbon atoms, or another polar solvent or a mixture thereof, more preferably dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, 1,2-dimethoxyethane, hydroxymethoxyglycol, isopropanol, 1- propanol, methanol or ethyl acetate, or a mixture thereof.

• Menetelmässä käytettävä entsyymivalmiste voi sisältää mitä tahansa yleisesti saatavaa alkalilig-35 niiniä polymeroivasti modifioivaa entsyymiä tai täl-läisten entsyymien seosta. Entsyymivalmiste sisältää edullisesti ligniiniä modifioivaa oksidaasia ja/tai 94261 11 peroksidaasia, edullisemmin lakkaasia, ligniiniperoksidaasia ja/tai mangaaniperoksidaasia. Entsyymivalmiste voi koostua entsyymistä sellaisenaan tai entsyymin ja sopivan nestemäisen tai kiinteän kantajan seoksesta.The enzyme preparation used in the method may contain any of the commonly available alkali ligand-polymerizing modifying enzymes or a mixture of such enzymes. The enzyme preparation preferably contains lignin-modifying oxidase and / or 94261 11 peroxidase, more preferably laccase, lignin peroxidase and / or manganese peroxidase. The enzyme preparation may consist of the enzyme as such or of a mixture of the enzyme and a suitable liquid or solid carrier.

5 Käytettävä entsyymimäärä on sellainen, että alkaliligniinin molekyylipaino kasvaa käsittelyn seurauksena ja edullisesti sellainen, että ligniini muodostaa geelin käsittelyn seurauksena. Entsyymivalmistetta voidaan käyttää esim. määrinä, jotka vastaavat 10 aktiivisuutta 0,01 - 50,0, edullisemmin 0,5 - 5,0, kuten 3,8 mkat/kg alkaliligniiniä, kun määritys suoritetaan syringaldatsiinilla. Lisättävä määrä riippuu mm. käytetystä entsyymistä, liuotintyypistä, liuottimen käyttömäärästä ja käsiteltävästä alkaliligniinimääräs-15 tä. Entsyymivalmiste voidaan lisätä reaktioseokseen missä tahansa sopivassa muodossa, esim. nestemäisessä tai jauhemaisessa muodossa. Entsyymikäsittely voidaan suorittaa haluttaessa myös immobilisoidulla entsyymillä .The amount of enzyme used is such that the molecular weight of the alkali lignin increases as a result of the treatment, and preferably such that the lignin forms a gel as a result of the treatment. The enzyme preparation can be used, for example, in amounts corresponding to an activity of 0.01 to 50.0, more preferably 0.5 to 5.0, such as 3.8 mcc / kg of alkali lignin, when the assay is performed with syringaldazine. The amount to be added depends on e.g. the enzyme used, the type of solvent, the amount of solvent used and the amount of alkali lignin to be treated. The enzyme preparation may be added to the reaction mixture in any suitable form, e.g. in liquid or powder form. If desired, the enzyme treatment can also be performed with an immobilized enzyme.

• 20 Menetelmän mukaisesti käsiteltävän reaktio- • · · seoksen pH säädetään välille 2-7, edullisesti välille 2,5 - 6,5, edullisemmin välille 3-6, edullisimmin välille 3,5 - 5,5.The pH of the reaction mixture to be treated according to the process is adjusted to between 2 and 7, preferably between 2.5 and 6.5, more preferably between 3 and 6, most preferably between 3.5 and 5.5.

Keksinnön mukainen menetelmä suoritetaan so-25 pivassa lämpötilassa, kuten huoneenlämpötilassa, esim. n. 1-48 h, edullisesti n. 24 h, aikana.The process according to the invention is carried out at a suitable temperature, such as room temperature, e.g. for about 1 to 48 hours, preferably for about 24 hours.

Keksinnön mukaisen menetelmän eräässä edullisessa sovellutuksessa ultrasuodatettu suurimolekyylinen alkaliligniinivalmiste turvotetaan ensin orgaanisessa 30 liuottimessa, jonka lopullinen määrä on 1 - 20 til-% kokonaistilavuudesta laskettuna, edullisesti 2-20 til-%, kuten n. 10 til%, jolloin ligniiniliuoksen pH voidaan laskea entsyymin toiminnalle edulliselle pH-alueelle niin, ettei muodostu saostumaa. pH voidaan 35 laskea käyttämällä puskuria tai edullisesti myös pelkällä mineraalihapolla kuten laimealla rikkihapolla.In a preferred embodiment of the process according to the invention, the ultrafiltered high molecular weight alkali lignin preparation is first swollen in an organic solvent in a final amount of 1 to 20% by volume based on the total volume, preferably 2 to 20% by volume, such as about 10% by volume, to lower the pH of the enzyme. to the preferred pH range so that no precipitate forms. The pH can be lowered using a buffer or, preferably, also with a mineral acid alone such as dilute sulfuric acid.

12 9426112 94261

Orgaanisen liuottimen kuten dimetyyliformamidin avulla voidaan alkaliligniini dispergoida veteen, jolloin saadaan kolloidiligniiniä (Kurek, B., Monties, B. ja Odier, E. 1990, Holzforshcung 44:407 - 414). Molekyyli-5 painoltaan tällainen ligniini ei eroa natiivista ligniinistä merkittävästi, mutta se on huomattavasti helpompaa hapettaa entsymaattisesti ligniiniperoksidaasil-la. Keksinnön mukaisessa käsittelyssä ei kuitenkaan poisteta orgaanista liuotinta vaan entsyymin annetaan 10 vaikuttaa orgaanisen liuottimen läsnäollessa, jolloin vaikutus tehostuu.With the aid of an organic solvent such as dimethylformamide, alkali lignin can be dispersed in water to give colloidal lignin (Kurek, B., Monties, B. and Odier, E. 1990, Holzforshcung 44: 407-414). The molecular weight of such lignin does not differ significantly from native lignin, but it is much easier to be enzymatically oxidized by lignin peroxidase. However, the treatment according to the invention does not remove the organic solvent, but allows the enzyme to act in the presence of an organic solvent, whereby the effect is enhanced.

Keksinnön mukainen menetelmä soveltuu erityisen edullisesti lignoselluloosatuotteiden valmistuksessa käytettävän ligniinituotteen (esim. FI 871010) 15 geelinmuodostusominaisuuksien parantamiseen. Keksinnön mukaisessa menetelmässä ultrasuodatuksen avulla aikaansaatu suurimolekyylinen alkaliligniini, joka on entsyymin toiminta-alueella vaikealiukoinen, saadaan keksinnön mukaisessa liuotinmäärässä lakkaasin katalysoi-20 mana reagoimaan siten, että keskimääräinen molekyylikoko nousee entisestään ja tuotteen konsistenssi muodostuu geelimäiseksi. Ultrasuodatetun suurimolekyylisen fraktion molekyylipainon nostaminen entisestään entsy-maattisen reaktion avulla on edullista, koska tällöin 25 alkaliligniini voi muodostaa geelin jo huoneenlämpöti-. . . lassa. Siten polymeroitumisreaktiossa ligniini-entsyy- miyhdistelmän käytöllä voidaan välttää ja/tai vähentää aikaisemmin mainittuja epäkohtia esim. kuumapuristuk-sen, saostuskemikaalien tai kemiallisten kovettajien 30 käyttöä.The process according to the invention is particularly suitable for improving the gelling properties of a lignin product (e.g. FI 871010) used in the production of lignocellulosic products. In the process according to the invention, the high-molecular alkali lignin obtained by ultrafiltration, which is sparingly soluble in the range of the enzyme, is reacted in the amount of solvent according to the invention with laccase-catalyzed mana further increasing the average molecular size and gel-like consistency of the product. Further increase of the molecular weight of the ultrafiltered high molecular weight fraction by means of an enzymatic reaction is advantageous, since then the alkali lignin can form the gel at room temperature. . . mode. Thus, in the polymerization reaction, the use of a lignin-enzyme combination can avoid and / or reduce the aforementioned disadvantages, e.g. the use of hot pressing, precipitating chemicals or chemical hardeners.

Edelleen, keksinnön mukaisessa menetelmässä käytetystä orgaanisen liuottimen pienestä pitoisuudesta j·· * johtuen keksintö on vaarattomampi ja edullisempi kuin tekniikan tason mukaiset ligniinin entsyymikäsittely-35 menetelmät, joissa orgaanisia liuottimia käytetään suurina pitoisuuksina.Furthermore, due to the low concentration of organic solvent used in the process of the invention, the invention is safer and more advantageous than the prior art lignin enzyme treatment methods in which organic solvents are used in high concentrations.

Menetelmän etuna on edelleen, että sillä voi- X3 94261 daan parantaa teollisuudessa sulfaattikeittoprosessin yhteydessä muodostuvan alkaliligniinin käyttömahdollisuuksia .A further advantage of the process is that it can improve the use of the alkali lignin formed in the sulphate cooking process in industry.

Keksintöä selostetaan yksityiskohtaisemmin 5 seuraavien esimerkkien ja kuvien avulla rajoittamatta keksintöä niihin, jolloin kuva 1 esittää kalibrointikäyrää molekyylikoon muutoksen mittaamista varten, kuvat 2-7 esittävät ekskluusiokromatografiästä esi-10 merkeissä 1-6 saatuja tuloksia, ja kuva 8 esittää kuvaajaa, josta ilmenee pH:n vaikutus lakkaasin aktiivisuuteen.The invention will be described in more detail by the following non-limiting examples and figures, in which Figure 1 shows a calibration curve for measuring the change in molecular size, Figures 2-7 show the results of exclusion chromatography in Examples 1-6, and Figure 8 shows a graph showing pH. effect on laccase activity.

Keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetun tuotteen käyttösovellutuksien osalta viitataan esim.With regard to the applications of the product produced by the method according to the invention, reference is made e.g.

15 julkaisussa FI 871010 esitettyihin sovellutuksiin.15 for the applications described in FI 871010.

ESIMERKIT:EXAMPLES:

Entsyymiaktiivisuuden määritysDetermination of enzyme activity

Valmistetaan 0,1 M sitraatti-fosfaattipuskuria 20 varten 0,1 M sitruunahappoa punnitsemalla 21,01 g sitruunahappoa (MP = 210,4) ja liuottamalla se 1000 ml veteen, sekä ja 0,2 M Na-fostaattiliuos punnitsemalla 71,64 g Na2HP04 x 12H20 (MP = 358,1) ja liuottamalla se 1000 ml veteen. Näitä sekoitetaan keskenään siten, että 25 liuoksen pH tulee 5,0.For 0.1 M citrate-phosphate buffer 20, prepare 0.1 M citric acid (MP = 210.4) by weighing 21.01 g of citric acid and dissolving it in 1000 ml of water, and weigh 0.2 71 g of Na2HPO4 and weigh 0.2 M Na-phosphate solution. x 12H 2 O (MP = 358.1) and dissolving it in 1000 ml of water. These are mixed together so that the pH of the 25 solution becomes 5.0.

... Esimerkeissä käytettävä lakkaasi on peräisin... The lacquer used in the examples is from

Trametes hirsuta-valkolahosienestä (Cultor, Oy, Kant-vik). Lakkaasivalmiste laimennetaan suhteessa 1/1000 0,1 M sitraatti-fosfaattipuskurilla (pH 5,0). Lakkaa-30 siaktiivisuus määritetään spektrofotometrisesti mittaamalla absorbanssin muutos aallonpituudella 525 nm käyttäen substraattina syringaldatsiinia (Lundell, T., Leonowicz, A., Rogalski, J. ja Hatakka, A., 1990, Appi. Environ. Microbiol. 56:2623-2629). Määritykseen käyte-35 tään 850 μΐ 0,1 M sitraatti-fosfaattipuskuria (pH 5,0), 0,1 M sitraatti-fosfaattipuskuriin 1/1000 -laimennettua lakkaasia 100 μΐ, sekä syringaldatsiinia 50 μΜ. Entsyy- 94261 14 miaktiivisuus lasketaan kaavastaTrametes from hirsuta white fungus (Cultor, Oy, Kant-vik). The laccase preparation is diluted 1/1000 with 0.1 M citrate-phosphate buffer (pH 5.0). Lacquer-30 activity is determined spectrophotometrically by measuring the change in absorbance at 525 nm using syringaldazine as a substrate (Lundell, T., Leonowicz, A., Rogalski, J. and Hatakka, A., 1990, Appl. Environ. Microbiol. 56: 2623-2629) . 850 μΐ of 0,1 M citrate-phosphate buffer (pH 5,0), 100 μΐ of laccase diluted 1/1000 in 0,1 M citrate-phosphate buffer and 50 μΜ of syringaldazine are used for the assay. The activity of enzyme 94261 14 is calculated from the formula

ΔΑ x VΔΑ x V

» tot A= - 5 t x V x e n syrald jossa A = aktiivisuus, Vtot = 1,0 ml, t = aika s; ΔΑ = absorbanssin muutos/525 nm; Vn = 0,1 ml, esyrald = syrin galdatsiin molaarinen absorptiokerroin = 6,5 x 104 M^m1.»Tot A = - 5 t x V x e n syrald where A = activity, Vtot = 1,0 ml, t = time s; ΔΑ = change in absorbance / 525 nm; Vn = 0.1 ml, esyrald = molar absorption coefficient of syrin galdazine = 6.5 x 104 M ^ m1.

1010

Entsyymiaktiivisuusyksikkönä käytetään katalia (kat), joka tarkoittaa substraatin muuttumista tai tuotteen syntymistä mol/sekunnissa. Yleensä käytetään aktiivisuusyksikköinä μkat = 10 mol/s tai nkat = 10 15 mol/s. Tällä tavoin määritettynä lakkaasivalmisteen aktiivisuus on 4,2 ^kat/ml.Catalyst (cat) is used as the unit of enzyme activity, which means the change of substrate or the formation of product in mol / second. Generally, μkat = 10 mol / s or nkat = 10 15 mol / s are used as units of activity. As determined in this way, the activity of the laccase preparation is 4.2 μg / ml.

Proteiinipitoisuuden määritysDetermination of protein content

Proteiinipitoisuus määritetään menetelmällä 20 (Bradford, M. 1976. Anal. Biochem, 72:248-254), jossa 0,8 ml näytteeseen lisätään 0,2 ml reagenssia (Bio-Rad Protein Assay). Vertailunäytteenä on 0,8 ml H20. Standardina käytetään naudan seerumialbumiinia. Lakkaasivalmisteen spesifiseksi aktiivisuudeksi saadaan 5,3 25 pkat/mg.The protein content is determined by Method 20 (Bradford, M. 1976. Anal. Biochem, 72: 248-254), in which 0.2 ml of reagent (Bio-Rad Protein Assay) is added to a 0.8 ml sample. The reference sample is 0.8 ml of H 2 O. Bovine serum albumin is used as the standard. The specific activity of the laccase preparation is 5.3 pkat / mg.

Molekyylikoon muutoksen mittaaminenMeasuring molecular size change

Geelipermeaatiokromatografia (GPC) on sopiva menetelmä ligniinin kaltaisten rakenteiden molekyyli-30 painojen määritykseen (mm. Pellinen, J., ja Salkinoja-Salonen, M., 1985, J. Chromatogr., 322:129-138 ja J.Gel permeation chromatography (GPC) is a suitable method for determining the molecular weights of lignin-like structures (e.g., Pellinen, J., and Salkinoja-Salonen, M., 1985, J. Chromatogr., 322: 129-138 and J.

Chromatogr., 328:299-308). Ekskluusiokromatografiaa (size exclusion chromatography, SEC) käytetään ko. kromatografiästä silloin, kun ajoliuoksena käytetään * 35 vesiliuoksia. Tällöin molekyylit erottuvat pylväässä kokonsa perusteella kulkiessaan huokoisella geelillä täytetyssä kolonnissa. Erottumisen perusteella voidaan päätellä, onko näytteessä tapahtunut polymeroitumista ja/tai depolymeroitumista, eli toteamaan molekyylipa!- 15 9426Ί non muutoksia. Ekskluusiokromatografiästä saadut mole-kyylipainot ovat aina suhteellisia ja riippuvat standardien laadusta sekä niiden ja näytteiden erosta. Laitteistona voidaan käyttää korkean erotuskyvyn nes-5 tekromatografia (HPLC). Esimerkeissä käytetään Hewlett-Packard 1090M -HPLC, joka on varustettu diodirivide-tektorilla, automaatti-injektorilla ja HP Chemstation (malli 300) tietokoneella. Molekyyli-massakeskiarvot lasketaan GPC-laskentaohjelmalla. Pylvääksi valitaan 10 TSK-GEL 4000PW (7,5 mm x 30 cm, Tosoh Corporation,Chromatogr., 328: 299-308). Size exclusion chromatography (SEC) is used. chromatography when * 35 aqueous solutions are used as eluent. In this case, the molecules are separated on the column by their size as they pass through a column packed with a porous gel. On the basis of the separation, it can be concluded whether polymerization and / or depolymerization has taken place in the sample, i.e. to detect changes in molecular weight. Mole weight weights obtained from exclusion chromatography are always relative and depend on the quality of the standards and the difference between them and the samples. High performance liquid chromatography (HPLC) can be used as equipment. The examples use a Hewlett-Packard 1090M HPC equipped with a diode array detector, an automatic injector, and an HP Chemstation (model 300) computer. Molecular weight averages are calculated using a GPC calculation program. 10 TSK-GEL 4000PW (7.5 mm x 30 cm, Tosoh Corporation,

Japani), joka on stabiili pH-alueella 1 - 14 ja jota voidaan käyttää myös hydrofiilisille orgaanisille e-luenteille 20 % (til/til) asti. Ajoliuoksen (veden) virtausnopeus on 0,4 ml/min, ja näytteiden ulostuloa 15 seurataan aallonpituuksilla 230 nm ja 280 nm. Esimerkeissä ilmoitetaan vain aallonpituudella 280 detek-toidut tulokset. Injektiotilavuus on 10 μΐ.Japan), which is stable in the pH range 1 to 14 and can also be used for hydrophilic organic e-readings up to 20% (v / v). The flow rate of the driving solution (water) is 0.4 ml / min, and the sample output 15 is monitored at 230 nm and 280 nm. In the examples, only the results detected at wavelength 280 are reported. The injection volume is 10 μΐ.

Alkaliligniinien molekyylipainon määrittämiseen sopivien standardien löytäminen on hankalaa, mikä 20 johtuu siitä, että standardien tulisi olla konformaa-tioltaan ligniinin kaltaisia. Parhaiten sopisivat fraktioimalla valmistetut tunnetun ja kapean molekyylipainon ligniinifraktiot. Voidaan käyttää kaupallisesti saatavia globulaarisia proteiineja (esimerkiksi Pharma-25 cia). Polyetyleeniglykoleja (PEG) voidaan joissakin i , tapauksissa käyttää standardeina, joskaan ei hyvin pieniä molekyylikokoja, koska pienimolekyyliset polymeerit jäivät geelin huokosiin. GPC:lla saadut molekyy-lipainojakaumat ja niistä päätellyt molekyylipainot 30 ovat aina suhteellisia ja eri tavoin kalibroiduissa systeemeissä saatetaan päätyä toisistaan eroaviin lopputuloksiin. Esimerkeissä kalibraatiokäyrä tehtiin puh-taiden proteiinin ajosta saatujen arvojen perusteella HP GPC-ohjelmalla. Ajoliuoksen virtausnopeus vaikutti 35 retentioaikaan siten, että mitä hitaampi virtaus, sitä pidempi retentioaika. Esimerkeissä käytettiin virtausnopeutta 0,4 ml/min. TSK-GEL 4000PW -pylvään lineaari- 94261 16 sin alue oli molekyylipainoalue 1000 - 500.000 (103 - 5 x 105). Eksluusiokromatografiässä erottuminen tapahtui molekyylikoon mukaan ja suurimolekyylisemmät yhdisteet eluoituvat pienimolekyylisiä nopeammin. Kromatogrammin 5 piikit edustavat erilaisen molekyylikoon omaavia joukkoja, jotka ohjelma muuttaa valituilla aallonpituuksilla 230 nm ja 280 nm molekyylipainojakaumatarkasteluksi.It is difficult to find suitable standards for determining the molecular weight of alkali lignins, due to the fact that the standards should be lignin-like in conformation. Lignin fractions of known and narrow molecular weight prepared by fractionation would be best suited. Commercially available globular proteins (e.g., Pharma-25 cia) can be used. Polyethylene glycols (PEG) can be used as standards in some cases, although not very small molecular sizes because the low molecular weight polymers remained in the pores of the gel. The molecular weight distributions obtained by GPC and the molecular weights inferred from them are always relative, and differently calibrated systems may lead to different results. In the examples, the calibration curve was made based on the values obtained from the pure protein run with the HP GPC program. The flow rate of the driving solution affected the retention time 35 so that the slower the flow, the longer the retention time. A flow rate of 0.4 ml / min was used in the examples. The linear 94261 16 sin range of the TSK-GEL 4000PW column was in the molecular weight range of 1000 to 500,000 (103 to 5 x 105). In exclusion chromatography, separation occurred according to molecular size and more macromolecular compounds elute faster than micromolecules. The peaks in chromatogram 5 represent sets of different molecular sizes, which the program converts at selected wavelengths 230 nm and 280 nm into a molecular weight distribution analysis.

Kuvassa 1 on esitetty saatu kalibrointikäyrä, proteiinien eluoituminen vesiäjoliuoksella TSKGEL-10 G4000PW pylväässä; standardien molekyylipainot 13700 (ribonukleaasi A), 43000 (muna-albumiini), 67000 (naudan seerumialbumiini) ja 440000 (ferritiini).Figure 1 shows the calibration curve obtained, elution of proteins with aqueous running solution on a TSKGEL-10 G4000PW column; molecular weights of 13,700 (ribonuclease A), 43,000 (egg albumin), 67,000 (bovine serum albumin) and 440,000 (ferritin).

HPLC-laitteistoon voidaan myös asentaa esiko-lonni (TSK Guardcolumn PWH, 7,5 mm ID x 7,5 cm, Tosoh 15 Corporation, Japani), jolloin ajoliuoksena voidaan käyttää 0,01 M NaOH. Ligniiniyhdisteille olisi myös eduksi käyttää ionivahvuudeltaan suurempaa ajoliuosta kuten 0,01 M NaOH, jonka I = 0,01.A precolumn (TSK Guardcolumn PWH, 7.5 mm ID x 7.5 cm, Tosoh Corporation, Japan) can also be mounted on the HPLC equipment, allowing 0.01 M NaOH to be used as eluent. It would also be advantageous for lignin compounds to use a driving solution with a higher ionic strength, such as 0.01 M NaOH with I = 0.01.

Molekyylimassakeskiarvot lasketaan HPLC-lait-20 teen valmistajan kehittämällä GPC-tietokoneohjelman avulla. Ohjelma viipaloi kromatogrammin ja laskee kullekin viipaleelle molekyylimassan kalibrointikäyrän avulla. Näin saatiin lukukeskimääräinen molekyylimassa Mn, painokeskimääräinen molekyylimassa Mw, Z-keskimää-25 räinen molekyylimassa Mz, piikin huipun sijainti kroma-, , . togrammissa M . Polydispersiteetti D lasketaan kaavasta D = M /M .Molecular weight averages are calculated using a GPC computer program developed by the HPLC equipment manufacturer. The program slices the chromatogram and calculates the molecular weight for each slice using a calibration curve. Thus, the number average molecular weight Mn, the weight average molecular weight Mw, the Z-average molecular weight Mz, the location of the peak peak chromium,,. in the gram M. The polydispersity D is calculated from the formula D = M / M.

w nw n

Ligniinivalmiste 30 Esimerkeissä käytetään ultrasuodatettua suuri- molekyylistä alkaliligniiniä, jossa saostuvien ligniinien osuus on vähintään 85 % ja kuiva-ainepitoisuus 20 > r - 28 %. Ultrasuodatuksella poistetetaan pienimolekyyli set yhdisteet, joiden molekyylikoko on alle 10000. Val-35 misteen liukoisuus eräisiin orgaanisiin liuottimiin (etyyliasetaatti, asetonitriili, asetoni, dietyylieet-teri, etanoli, metanoli ja 75 % etikkahappo) 24 °C:ssa 17 94261 esitetään taulukossa 2. Ligniinivalmiste liukenee verrattain huonosti lämpötilassa 24 °C, liukoisuus paranee vettä lisättäessä ja kuumennettaessa. Valmiste liukenee hydrofiilisiin liuottimiin hyvin. Esimerkeissä käyte-5 tään näiden kokeiden ja kirjallisuuden (Lindberg. J., 1965, Suomen Kemistilehti B38:95-100; Ekman, R. ja Lindberg, J., 1966, Suomen Kemistilehti, B39:89-96;Lignin Preparation 30 The examples use ultrafiltered high molecular weight alkali lignin with a precipitated lignin content of at least 85% and a dry matter content of 20% to 28%. Ultrafiltration removes low molecular weight compounds having a molecular size of less than 10,000. The solubility of the preparation in certain organic solvents (ethyl acetate, acetonitrile, acetone, diethyl ether, ethanol, methanol and 75% acetic acid) at 24 ° C is shown in Table 2. The lignin preparation dissolves relatively poorly at 24 ° C, the solubility improves with the addition of water and heating. The preparation is highly soluble in hydrophilic solvents. The examples use these experiments and the literature (Lindberg. J., 1965, Suomen Kemistilehti B38: 95-100; Ekman, R. and Lindberg, J., 1966, Suomen Kemistilehti, B39: 89-96;

Pellinen, J. ja Salkinoja-Salonen, M., 1985, J. Chroma-togr., 322:129-138 ja J. Chromatogr., 328:299-308) mu-10 kaan ligniiniyhdisteille sopivia hydrofiilisiä liuottimia, dimetyyliformamidia, 1,2-dimetoksietaania ja dimetyylisulfoksidia.Pellinen, J. and Salkinoja-Salonen, M., 1985, J. Chromatogr., 322: 129-138 and J. Chromatogr., 328: 299-308), hydrophilic solvents suitable for lignin compounds, dimethylformamide, 1 , 2-dimethoxyethane and dimethyl sulfoxide.

. « · « <. · 94261 18. «·« <. · 94261 18

Taulukko 2. Ultrasuodatetun alkaliligniinin (28 % kuiva-ainetta) liukeneminen orgaanisiin liuottimiin liuotin liukoisuus liukoisuus lisättä- 24 °C:ssa essä vettä ja kuuTable 2. Dissolution of ultrafiltered alkali lignin (28% dry matter) in organic solvents solvent solubility solubility at addition of water and water at 24 ° C

mennettaessa vesi-hauteessa 100 °Cwhen going in a water bath at 100 ° C

1. asetoni hieman liukenee 5 2. asetonitriili hieman liukenee 3. etanoli saostuu hieman 4. etikkahappo saostuu saostuu 5. etyyliasetaatti ei liukene liukenee 6. dietyylieetteri ei liukene liukenee 10 7. metanoli hieman liukenee 8. 0,1 M NaOH liukenee liukenee 9. 0,01 M NaOH liukenee liukenee 10. 0,025 M NaHC03 ei liukene liukenee pH = 8,9 151. acetonitrile slightly soluble 5 2. acetonitrile slightly soluble 3. ethanol precipitates slightly 4. acetic acid precipitates precipitates 5. ethyl acetate insoluble soluble 6. diethyl ether insoluble soluble 10 7. methanol slightly soluble 8. 0.1 M NaOH soluble soluble 9. 0.01 M NaOH soluble soluble 10. 0.025 M NaHCO 3 insoluble soluble pH = 8.9 15

Esimerkki 1.Example 1.

Esimerkissä käytetään nestemäistä ultrasuoda-·.;« tettua alkaliligniinifraktiota, jonka molekyylikoko on vähintään 10.000 ja välillä 10.000 - 50.000, ja kuiva-20 ainepitoisuus 28 %. 1,7 mg näytettä liuotetaan 1,0 ml veteen ja ajetaan ekskluusiokromatografia. Kuvassa 2 on esitetty saatu ultrasuodatetun alkaliligniinin ekskluusiokromatograf ia .The example uses a liquid ultrafiltered alkali lignin fraction having a molecular size of at least 10,000 and between 10,000 and 50,000 and a dry matter content of 28%. Dissolve 1.7 mg of the sample in 1.0 ml of water and subject to flash chromatography. Figure 2 shows the exclusion chromatography of the obtained ultrafiltered alkali lignin.

• · 25 Esimerkki 2.• · 25 Example 2.

Suurimolekyylistä ultrasuodatettua alkalilig-niinivalmistetta mitataan 0,5 ml (0,56 g) ja sekoitetaan 4,0 ml 0,1 M sitraatti-fosfaattipuskuriin (pHMeasure 0.5 ml (0.56 g) of the high molecular weight ultrafiltered alkali lignin preparation and mix with 4.0 ml of 0.1 M citrate-phosphate buffer (pH

l « 19 94261 5,0), ja lisätään 0,5 ml lakkaasia (2100 nkat) (3800 nkat/g ligniiniä). Näytettä sekoitetaan ravistelijassa (Celloshaker Variospeed, 80 rpm) huoneenlämpötilassa ja sen todetaan 24 tunnin reaktioajan jälkeen olevan kiin-5 teän suspensiomainen ja konsistenssiltaan ryynimäinen. Suspensiosta otetaan 0,5 ml näyte, joka liuotetaan 1 ml 0,1 M NaOH:in kuumentamalla sitä 100 °C:ssa vesihauteessa 30 min ajan. 200 μΐ näytteeseen sekoitetaan 800 μΐ vettä, jolloin näytteen konsentraatio alkuperäisen 10 ligniinimäärän mukaan laskettuna on 7,4 mg/ml. Näyte analysoidaan ekskluusiokromatografiällä. Kuvassa 3 on esitetty saatu lakkaasilla käsitellyn ultrasuodatetun alkaliligniinin ekskluusiokromatografia.l <19 94261 5.0), and 0.5 ml of laccase (2100 nkat) (3800 nkat / g lignin) is added. The sample is mixed on a shaker (Celloshaker Variospeed, 80 rpm) at room temperature and after a reaction time of 24 hours is found to be a solid-like suspension and a grainy consistency. A 0.5 ml sample of the suspension is taken and dissolved in 1 ml of 0.1 M NaOH by heating at 100 ° C in a water bath for 30 min. Mix 800 μΐ of water with the 200 μΐ sample to give a sample concentration of 7,4 mg / ml, calculated on the initial amount of lignin. The sample is analyzed by exclusion chromatography. Figure 3 shows the exclusion chromatography of laccase-treated ultrafiltered alkali lignin obtained.

Näytteen edustaman hallitsevan molekyylikoon 15 piikin huippu on 15,8 min, joskin piikki on epäsymmetrinen ja eluoituminen alkaa jo noin 12 min kohdalla. Verrattaessa kromatogrammia esimerkin 1 mukaiseen käsittelemättömään alkaliligniiniin, jonka eluoitumisen huippupiikit ovat 15,7 min ja 16,2 min kohdalla, huo-20 mättävä osa esimerkin 2 edustamasta näytteestä edustaa suurempaa molekyylikokoa.The peak of the predominant molecular size of 15 represented by the sample is 15.8 min, although the peak is asymmetric and elution begins as early as about 12 min. When comparing the chromatogram to the crude alkali lignin of Example 1 with peak elution peaks at 15.7 min and 16.2 min, a significant portion of the sample represented by Example 2 represents a larger molecular size.

Esimerkki 3.Example 3.

Suurimolekyylistä kuiva-ainepitoisuudeltaan 28 25 % olevaa ultrasuodatettua alkaliligniinivalmistetta · mitataan 0,5 ml (0,56 g) ja lisätään veteeniiukenevaa orgaanista liuotinta, dimetyyliformamidia (DMF) 0,5 ml siten, että DMF on 10 % (til/til) kokonaistilavuudesta. Liuotin imeytyy näytteeseen, minkä jälkeen lisätään 4 30 ml 0,1 M sitraatti-fosfaattipuskuria (pH 5,0), jolloin muodostuu homogeeninen seos. Seoksen kokonaistilavuus on 5 ml. Näytettä sekoitetaan ravistelijassa huoneen- - · · * lämmössä kuten esimerkissä 2 ja näytteen todetaan 24 tunnin reaktioajan jälkeen olevan lievästi geelimäinen.Measure 0.5 ml (0.56 g) of a high molecular weight ultrafiltered alkali lignin preparation with a dry matter content of 28 25% and add 0.5 ml of water-soluble organic solvent, dimethylformamide (DMF), so that DMF is 10% (v / v) of the total volume. The solvent is absorbed into the sample, after which 4 30 ml of 0.1 M citrate-phosphate buffer (pH 5.0) are added to form a homogeneous mixture. The total volume of the mixture is 5 ml. The sample is stirred on a shaker at room temperature as in Example 2 and the sample is found to be slightly gel-like after a reaction time of 24 hours.

35 Geelimäisestä osasta otetaan 0,5 ml näyte ja se liuotetaan 1,5 ml 0,1 M NaOH:in kuumentamalla 30 min kuten esimerkissä 2. 200 μΐ näytettä sekoitetaan 800 μΐ ve- i * 94261 20 teen, jolloin kokonaislaimennukseksi saadaan 1/20. Näyte analysoidaan ekskluusiokromatografiällä. Kuvassa 4 on esitetty saatu dimetyyliformamidi-puskuriliuokseen liuotetun ultrasuodatetun alkaliligniinin ekskluusio-5 kromatografia.35 A 0.5 ml sample is taken from the gel-like portion and dissolved in 1.5 ml of 0.1 M NaOH by heating for 30 min as in Example 2. The 200 μΐ sample is mixed with 800 μΐ of water * 94261 20 to give a total dilution of 1/20 . The sample is analyzed by exclusion chromatography. Figure 4 shows the exclusion chromatography of ultrafiltered alkali lignin dissolved in dimethylformamide buffer solution.

Näytteen edustaman molekyylikoon piikin reten-tioajan huippu on 15,8 min, joka osoittaa aikaisempaa eluoitumista kuin esimerkissä 1 esitetty käsittelemätön substraatti, jonka vastaavat retentioajat ovat 15,6 10 min ja 16,2 min.The peak retention time of the molecular size peak represented by the sample is 15.8 min, indicating earlier elution than the untreated substrate shown in Example 1, with corresponding retention times of 15.6 min and 16.2 min.

Esimerkki 4.Example 4.

Suurimolekyylistä ultrasuodatettua alkalilig-niinipreparaattia mitataan 0,5 ml (0,56 g) ja lisätään 15 esimerkin 3 mukaisesti veteenliukenevaa orgaanista liuotinta dimetyyliformamidia (DMF) 0,5 ml siten, että DMF tulee olemaan 10 % (til/til). Liuotin imeytyy näytteeseen, minkä jälkeen lisätään 3.5 ml 0,1 M sitraatti-fosfaattipuskuria (pH 5,0), jolloin muodostuu homo-.1. 20 geeninen seos, jonka kokonaistilavuus on 5 ml. Sekoite taan ja lisätään lakkaasia 0,5 ml (2100 nkat) (3800 nkat/g ligniiniä), jolloin entsyymitoiminta käynnistyy. Näytettä sekoitetaan huoneenlämmössä kuten esimerkissä 2, ja näytteen todetaan 24 tunnin reaktioajan jälkeen 25 sisältävän homogeenisen, selvästi geelimäisen osan sekä erillisen vesifaasin. 0,5 ml geelimäistä näytettä liuotetaan 0,5 ml 1 M NaOH kuumentamalla sitä 30 min kuten esimerkissä 2. Näyte laimennetaan 1,0 ml vedellä, ja lopuksi 1 : 4 vedellä, jolloin kokonaislaimennus on 30 1/20. Näyte analysoidaan ekskluusiokromatografiällä, esitetty kuvassa 5. Kuvassa 5 on esitetty saatu dime- * · · tyyliformamidi-puskuriliuoksessa lakkaasilla käsitellyn ultrasuodatetun alkaliligniinin ekskluusiokromatogra-f ia.0.5 ml (0.56 g) of the high molecular weight ultrafiltered alkali lignin preparation is weighed and 0.5 ml of water-soluble organic solvent dimethylformamide (DMF) is added according to Example 3 so that the DMF is 10% (v / v). The solvent is absorbed into the sample, after which 3.5 ml of 0.1 M citrate-phosphate buffer (pH 5.0) is added to form homo-.1. 20 genetic mixture with a total volume of 5 ml. Mix and add 0,5 ml (2100 nkat) (3800 nkat / g lignin) of laccase to initiate enzyme activity. The sample is stirred at room temperature as in Example 2, and after a reaction time of 24 hours, the sample is found to contain a homogeneous, clearly gel-like part and a separate aqueous phase. 0.5 ml of the gel sample is dissolved in 0.5 ml of 1 M NaOH by heating for 30 min as in Example 2. The sample is diluted with 1.0 ml of water, and finally with 1: 4 water to give a total dilution of 30 1/20. The sample is analyzed by exclusion chromatography, shown in Figure 5. Figure 5 shows the exclusion chromatography of laccase-treated ultrafiltered alkali lignin obtained in dimethylformamide buffer solution.

35 Kromatogrammista erottuu kaksi huippua, joiden retentioajat ovat 13,5 min ja 18,5 min. Ensimmäinen piikki osoittaa selvästi aikaisempaa eluoitumista kuin 94261 21 esimerkin 1 mukainen käsittelemätön alkaliligniinival-miste, jonka eluoituimishuiput ovat 15,6 min ja 16,2 min kohdalla. Tämä osoittaa, että esimerkin 4 mukaisen näytteen molekyylijakauma osoittaa suurempaa molekyyli-5 kokoa. Näytteessä voidaan päätellä tapahtuneen mole-kyylipainon lisääntymistä. Eluoituminen tapahtuu myös aikaisemmin kuin esimerkin 2 eli ilman orgaanista liuotinta ja esimerkin 3 eli ilman lakkaasia käsitellyn näytteen eluoituminen. Tämä osoittaa, että molekyyli-10 painon kasvuun tarvitaan entsyymi ja orgaaninen liuotin yhdessä.35 Two peaks stand out from the chromatogram, with retention times of 13.5 min and 18.5 min. The first peak clearly shows an earlier elution than the crude alkali lignin preparation of Example 1 of Example 94261 21, with elution peaks at 15.6 min and 16.2 min. This indicates that the molecular distribution of the sample of Example 4 indicates a larger molecular size. An increase in Mole weight in the sample can be inferred. The elution also takes place earlier than the elution of the sample treated in Example 2, i.e. without organic solvent, and in Example 3, i.e. without laccase. This indicates that enzyme and organic solvent together are required for molecular weight gain.

Esimerkki 5.Example 5.

Suurimolekyylistä ultrasuodatettua alkalilig-15 niinipreparaattia mitataan 0,5 ml (0,56 g) ja lisätään 0,5 ml orgaanista liuotinta 1,2-dimetoksietaania (DME) siten, että DME:a tulee olemaan 10 % (til/til). Liuotin imeytyy näyteeseen, minkä jälkeen lisätään 0,1 M sit-raattifosfaattipuskuria (pH 5,0), jolloin muodostuu 20 homogeeninen seos. Näytettä sekoitetaan huoneenlämpö-tilassa kuten esimerkissä 2, ja näytteen todetaan 24 tunnin reaktioajan jälkeen olevan homogeenisen mutta ei hyytelömäisen. Seoksesta otetaan 0,5 ml näyte, joka liuotetaan 0,5 ml:aan 1 M NaOH:in kuumentamalla sitä 30 25 min kuten esimerkissä 2. 200 μΐ näytettä sekoitetaan , , . 800 μΐ veteen, jolloin näytteen kokonaislaimennukseksi tulee 1/10. Näyte analysoidaan ekskluusiokromatogra-fiällä. Kuvassa 6 on esitetty saatu 1,2-dimetoksitaani-puskuriliuokseen liuotetun ultrasuodatetun alkalilig-30 niinin ekskluusiokromatografia.Measure 0.5 ml (0.56 g) of the high molecular weight ultrafiltered alkali lignin preparation and add 0.5 ml of organic solvent 1,2-dimethoxyethane (DME) so that the DME is 10% (v / v). The solvent is absorbed into the sample, followed by the addition of 0.1 M citrate phosphate buffer (pH 5.0) to form a homogeneous mixture. The sample is stirred at room temperature as in Example 2, and after a reaction time of 24 hours, the sample is found to be homogeneous but not gelatinous. Take a 0,5 ml sample of the mixture, dissolve in 0,5 ml of 1 M NaOH by heating for 30 to 25 minutes as in Example 2. Mix 200 μΐ of the sample,. 800 μΐ to water, giving a total dilution of the sample of 1/10. The sample is analyzed by exclusion chromatography. Figure 6 shows the exclusion chromatography of the obtained ultrafiltered alkali lignin dissolved in 1,2-dimethoxytane buffer solution.

Kromatogrammista erottuu pääkomponenttina yksi huippu, jonka retentioaika on 16,3 min. Piikki osoittaa • myöhäisempää tai samanaikaista eluoitumista kuin esi merkin 1 mukainen käsittelemätön alkaliligniiniprepa-35 raatti, jonka eluoituimishuiput ovat 15,6 min ja 16,2 min kohdalla. Molekyylijakauma osoittaa, ettei näytteen molekyylipaino ole muuttunut.One peak with a retention time of 16.3 min stands out from the chromatogram as the main component. The peak shows a later or simultaneous elution than the untreated alkali lignin prep-35 of Example 1, with elution peaks at 15.6 min and 16.2 min. The molecular distribution indicates that the molecular weight of the sample has not changed.

22 9426122 94261

Esimerkki 6.Example 6.

Suurimolekyylistä ultrasuodatettua alkalilig-niinipreparaattia mitataan 0,5 ml (0.56 g) ja lisätään 0,5 ml veteenliukenevaa orgaanista liuotinta 1,2-dime-5 toksietaania (DME) 10 % kokonaistilavuudesta (5 ml). Liuotin imeytyy näyteeseen, minkä jälkeen lisätään 3,5 ml 0,1 M sitraatti-fosfaattipuskuria (pH 5,0), jolloin muodostuu homogeeninen seos. Sekoitetaan ja lisätään lakkaasia 0,5 ml (2100 nkat) (3800 nkat/g ligniiniä), 10 jolloin entsyymitoiminta käynnistyy. Näytteen todetaan 24 tunnin reaktioajan jälkeen olevan ulkonäöltään epähomogeeninen siten, että selvästi geelimäisen kokka-reisen osan lisäksi on erillinen vesifaasi. Otetaan 0,5 ml geelimäistä osaa ja liuotetaan se 0,5 ml 1 M NaOH:in 15 kuumentamalla sitä 30 min kuten esimerkissä 2. Laimennetaan näyte veteen siten, että kokonaislaimennus on 1/16. Näyte analysoidaan ekskluusiokromatografiällä. Kuvassa 7 on esitetty saatu 1,2-dimetoksietaani-pusku-riliuoksessa lakkaasilla käsitellyn ultrasuodatetun 20 alkaliligniinin ekskluusiokromatograf ia.Measure 0.5 ml (0.56 g) of the high molecular weight ultrafiltered alkali lignin preparation and add 0.5 ml of water-soluble organic solvent 1,2-dimethyl-5-toxetane (DME) in 10% of the total volume (5 ml). The solvent is absorbed into the sample, followed by the addition of 3.5 ml of 0.1 M citrate-phosphate buffer (pH 5.0) to form a homogeneous mixture. Mix and add 0.5 ml (2100 nkat) of laccase (3800 nkat / g lignin) to initiate enzyme activity. After a reaction time of 24 hours, the sample is found to be inhomogeneous in appearance, with a distinct aqueous phase in addition to the clearly gel-like part of the cooked Reisen. Take 0.5 ml of the gel-like portion and dissolve it in 0.5 ml of 1 M NaOH by heating for 30 min as in Example 2. Dilute the sample in water to a total dilution of 1/16. The sample is analyzed by exclusion chromatography. Figure 7 shows the exclusion chromatography of laccase-treated ultrafiltered alkali lignin in 1,2-dimethoxyethane-buffer solution.

Kromatogrammista erottuu kolme huippua, joiden retentioajat ovat 13,2 min, 16,0 ja 17,9 min. Ensimmäinen huippu osoittaa selvästi aikaisempaa eluoitumista kuin esimerkin 1 mukainen käsittelemätön sulfaattilig-25 niinivalmiste, jonka eluoituimishuiput ovat 15,6 min ja 16,2 min kohdalla. Siten esimerkin 6 molekyyli jakauma osoittaa suurempaa molekyylikokoa, mikä osoittaa sitä, että esimerkissä 6 tapahtuu näytteen molekyylipainon lisääntyminen. Eluoituminen tapahtuu myös aikaisemmin 30 kuin esimerkin 2 mukaisessa ilman orgaanista liuotinta tapahtuvassa ja esimerkin 5 mukaisessa ilman entsyymiä käsitellyn näytteen eluoitumisessa. Tämä osoittaa, että molekyylipainon kasvuun tarvitaan lakkaasi ja orgaaninen liuotin yhdessä.Three peaks with retention times of 13.2 min, 16.0 and 17.9 min stand out from the chromatogram. The first peak clearly shows an earlier elution than the untreated sulphate lignin-25 preparation according to Example 1, with elution peaks at 15.6 min and 16.2 min. Thus, the molecular distribution of Example 6 indicates a larger molecular size, indicating that in Example 6 there is an increase in the molecular weight of the sample. Elution also occurs earlier than in the organic solvent-free elution of Example 2 and the enzyme-free elution of Example 5. This indicates that laccase and an organic solvent are required together to increase molecular weight.

35 23 9426135 23 94261

Taulukko 3. Yhteenveto esimerkeistä 1-6.Table 3. Summary of Examples 1-6.

näyte no./ sitr.- lak- org. liuo- konsen- re- 5 substraatti = fosf. kaasi tin/ traatio ten- ultrasuoda- pusk. määrä ajossa tio- tettu pH 5 (IM NaOH) aika ligniini min 1. ultra- 1/7mg/ml 15,7 10 suodatettu - - H20 16,2 ligniini 2. 4,0 ml 0,5ml - 7,4mg/ml 15,8 0,5ml (0,56g) 3. 4,0 ml - DMF/0,5ml 5,55mg/ml 15,8 15 0,5ml (0,56g) 4. 3,5 ml 0,5ml DMF/0,5ml 5,55mg/ml 13,5 0,5ml (0,56g) 18,5 5. 4,0 ml - DME/0,5ml 6,3mg/ml 16,0 0,5ml (0,56g) 18,3 18,8 19,5 20 6. 3,5 ml 0,5ml DME/0,5ml 6,9mg/ml 13,2 0,5ml (0,56g) 16,0 17,9 20,1 DMF = dimetyyliformamidi DME = 1,2-dimetoksietaani I- 25sample no./citr.- lac- org. solution-concentrated substrate = phosph. gas tin / trait ten- ultrafiltration bag. amount in running thionated pH 5 (IM NaOH) time lignin min 1. ultra-1 / 7mg / ml 15.7 10 filtered - - H 2 O 16.2 lignin 2. 4.0 ml 0.5ml - 7.4mg / ml 15.8 0.5ml (0.56g) 3. 4.0ml - DMF / 0.5ml 5.55mg / ml 15.8 15 0.5ml (0.56g) 4. 3.5ml 0.5ml DMF / 0.5ml 5.55mg / ml 13.5 0.5ml (0.56g) 18.5 5. 4.0 ml - DME / 0.5ml 6.3mg / ml 16.0 0.5ml (0.56g) ) 18.3 18.8 19.5 20 6. 3.5 ml 0.5 ml DME / 0.5 ml 6.9 mg / ml 13.2 0.5 ml (0.56 g) 16.0 17.9 20.1 DMF = dimethylformamide DME = 1,2-dimethoxyethane I-25

Esimerkki 7.Example 7.

Esimerkissä lakkaasia, aktiivisuudeltaan 3000 - 5000 nkat/ml, laimennetaan 1/1000. 850 pl:aan 0,1 M (pH 5) sitraatti-fosfaattipuskuria lisätään 100 μΐ 94261 24 laimennettua lakkaasia sekä juuri ennen mittausta 50 μΐ 0,5 mM syringaldatsiinia. Näytteen kokonaistilavuudeksi tulee 1000 μΐ. Näyte temperoidaan 25 °C:ssa, ja absor-banssi mitataan aallonpituudella 525 nm spektrofoto-5 metrillä. Lakkaasin aktiivisuus määritetään maksiminopeuden (V ) kohdalta eli silloin kun reaktion alusta on kulunut 20 sekuntia. Näytteen lakkaasin aktiivisuudeksi saadaan 2820 nkat/ml.In the example, the laccase, having an activity of 3000 to 5000 nkat / ml, is diluted 1/1000. To 850 μl of 0.1 M (pH 5) citrate-phosphate buffer is added 100 μΐ of 94261 24 diluted laccase and 50 μΐ of 0.5 mM syringaldazine just before measurement. The total volume of the sample becomes 1000 μΐ. The sample is tempered at 25 ° C and the absorbance is measured at 525 nm with a spectrophoto-5 meter. Laccase activity is determined at the maximum rate (V), i.e., 20 seconds after the start of the reaction. The laccase activity of the sample is 2820 nkat / ml.

10 Esimerkki 8.10 Example 8.

Lakkaasin aktiivisuus mitataan orgaanisen liuottimen läsnäollessa kuten esimerkissä 7 siten, että 10 til-% 0,1 M sitraatti-fosfaattipuskurista (pH 5) korvataan orgaanisella liuottimena. 750 μΐ 0,1 M (pH 15 5) sitraattifosfaattipuskuriin lisätään 100 μΐ laimen nettua lakkaasia, 100 μΐ dimetyyliformamidia ja juuri ennen mittausta 50 μΐ 0,5 mM syringaldatsiinia. Näytteen lakkaasin aktiivisuudeksi saadaan 1439 nkat/ml, mikä osoittaa, että 10 % dimetyyliformamidissa saavute-20 taan 49 % ilman orgaanista liuotinta määritetystä aktiivisuudesta .The laccase activity is measured in the presence of an organic solvent as in Example 7, replacing 10% by volume of 0.1 M citrate-phosphate buffer (pH 5) as the organic solvent. To 750 μΐ 0,1 M (pH 15 5) citrate phosphate buffer add 100 μΐ diluted laccase, 100 μΐ dimethylformamide and just before measurement 50 μ ennen 0,5 mM syringaldazine. The laccase activity of the sample is 1439 nkat / ml, indicating that 10% in dimethylformamide gives 49% of the activity determined without the organic solvent.

Esimerkki 9.Example 9.

Esimerkin 8 mittaus toistetaan, lisäten dime-25 tyylisulfoksidia. Lakkaasin aktiivisuudeksi saadaan k : i 1964 nkat/ml, mikä osoittaa, että 10% dimetyylisulfok- sidissa saavutetaan 70 % ilman orgaanista liuotinta määritetystä aktiivisuudesta.The measurement of Example 8 is repeated, adding dime-25 style sulfoxide. The activity of the laccase is k to 1964 nkat / ml, indicating that 10% in dimethyl sulfoxide achieves 70% of the activity determined without the organic solvent.

30 Esimerkki 10.30 Example 10.

Esimerkin 8 mittaus toistetaan lisäten dime-toksietaania.The measurement of Example 8 is repeated with the addition of dimethoxyethane.

» ·»·

Esimerkki 11.Example 11.

35 Esimerkin 8 mittaus toistetaan lisäten me- tanolia.The measurement of Example 8 is repeated with the addition of methanol.

94261 2594261 25

Esimerkki 12.Example 12.

Esimerkin 8 mittaus toistetaan lisäten 1-pro- panolia.The measurement of Example 8 is repeated with the addition of 1-propanol.

5 Esimerkki 13.5 Example 13.

Esimerkin 8 mittaus toistetaan lisäten hydrok-simetoksiglykolia.The measurement of Example 8 is repeated with the addition of hydroxymethoxyglycol.

Esimerkki 14.Example 14.

10 Esimerkin 8 mittaus toistetaan lisäten isopro- panoli:etyyliasetaattia (1:1).The measurement of Example 8 is repeated with the addition of isopropanol: ethyl acetate (1: 1).

Esimerkki 15.Example 15.

Esimerkin 8 mittaus toistetaan lisäten me-15 tanoli:etyyliasetaatti (1:1).The measurement of Example 8 is repeated with the addition of methanol: ethyl acetate (1: 1).

Esimerkki 16.Example 16.

Lakkaasia aktiivisuudeltaan 3000 - 5000 nkat-/ml laimennetaan 1/1000 ja aktiivisuus mitataan kuten 20 esimerkissä 7. 850 ul:aan rikkihapolla pH 5:een säädettyä vettä (rikkihapotettua vettä) lisätään 100 μΐ laimennettua lakkaasia sekä juuri ennen mittausta 50 μΐ 0,5 mM syringaldatsiinia. Näytteen kokonaistilavuudeksi saadaan 1000 μΐ. Lakkaasin aktiivisuus määritetään 25 kuten esimerkissä 7 maksiminopeuden (V ) kohdalta eli ; : silloin kun reaktion alusta oli kulunut 20 sekuntia.Laccase with an activity of 3000-5000 nkat- / ml is diluted 1/1000 and the activity is measured as in Example 7. To 850 μl of water adjusted to pH 5 with sulfuric acid (sulfuric acid water) is added 100 μΐ of diluted laccase and just before the measurement 50 μΐ of 0.5 mM syringaldazine. The total volume of the sample is 1000 μΐ. Laccase activity is determined as in Example 7 for the maximum rate (V) i.e.; : when 20 seconds had elapsed since the start of the reaction.

·· <.·· <.

Näytteen lakkaasin aktiivisuudeksi saadaan 4607 nkat/ ml, jolloin todetaan, että lakkaasi säilyttää aktiivisuutensa myös silloin kun pH säädetty rikkihapolla (pH 30 5).The laccase activity of the sample is 4607 nkat / ml, in which case it is stated that the laccase retains its activity even when the pH is adjusted with sulfuric acid (pH 30 5).

Esimerkki 17.Example 17.

Lakkaasin aktiivisuus mitataan orgaanisen liuottimen läsnäollessa, siten, että 10 til-% rikkiha-35 polla pH 5:een säädetystä vedestä (eli rikkihapotetusta vedestä) korvataan orgaanisella liuottimena. 750 pl:aan rikkihapotettua vettä lisätään 100 μΐ laimen- 94261 26 nettua lakkaasia, 100 μΐ dimetyyliformamidia ja juuri ennen mittausta 50 μΐ 0,5 mM syringaldatsiinia. Näytteen kokonaistilavuudeksi saadaan 1000 μΐ. Lakkaasin aktiivisuus määritetään kuten esimerkissä 7. Näytteen 5 lakkaasin aktiivisuudeksi saadaan 1660 nkat/ml, joka osoittaa, että 10 til-% dimetyyliformamidissa saavutetaan 49 % ilman orgaanista liuotinta määritetystä aktiivisuudesta, joten tämän mukaan lakkaasi säilyttää aktiivisuutensa myös silloin kun pH säädetty rikkiha-10 polla (pH 5).The activity of the laccase is measured in the presence of an organic solvent, so that 10% by volume of sulfur wax-35 in water adjusted to pH 5 (i.e. sulfuric acidified water) is replaced by an organic solvent. 100 μl of dilute lacquer, 100 μΐ of dimethylformamide and 50 μΐ of 0.5 mM syringaldazine are added to 750 μl of sulfuric acid water. The total volume of the sample is 1000 μΐ. The laccase activity is determined as in Example 7. The laccase activity of Sample 5 is 1660 nkat / ml, indicating that 10% by volume of dimethylformamide achieves 49% of the activity determined without organic solvent, so that the laccase retains its activity even when the pH is adjusted with sulfuric acid. (pH 5).

Esimerkki 18.Example 18.

Esimerkin 17 mittaus toistetaan lisäten dime-tyylisulfoksidia.The measurement of Example 17 is repeated with the addition of dimethyl sulfoxide.

1515

Esimerkki 19.Example 19.

Esimerkin 17 mittaus toistetan lisäten 1,2-dimetoksietaania.The measurement of Example 17 is repeated with the addition of 1,2-dimethoxyethane.

20 Esimerkki 20.Example 20.

Esimerkin 17 mittaus toistetaan lisäten 100 μΐ metanolia.The measurement of Example 17 is repeated by adding 100 μΐ of methanol.

Esimerkki 21.Example 21.

25 Lakkaasin aktiivisuus mitataan kuten esimer- - . , kissä 16, mutta rikkihapotetun veden pH säädetään * · · 4,5:een. Näytteen lakkaasin aktiivisuudeksi saadaan 4213 nkat/ml, jolloin todetaan, että lakkaasi säilyttää aktiivisuutensa myös silloin kun pH säädetty rikkiha-30 polla (pH 4,5).Laccase activity is measured as in Example. , cat 16, but the pH of the sulfurized water is adjusted to * · · 4.5. The laccase activity of the sample is 4213 nkat / ml, in which case it is found that the laccase retains its activity even when the pH is adjusted with sulfuric acid (pH 4.5).

Esimerkki 22.Example 22.

Lakkaasin aktiivisuus mitataan kuten esimerkissä 17, mutta rikkihapotetun veden pH säädetään 35 4,5:een. Näytteen lakkaasin aktiivisuudeksi saadaan 2065 nkat/ml, joka osoitti, että 10 til-% dimetyyliformamidissa saavutetaan 49 % ilman orgaanista liuo- 94261 27 tinta määritetystä aktiivisuudesta, myös silloin kun pH säädetty rikkihapolla (pH 4,5).Laccase activity is measured as in Example 17, but the pH of the sulfuric acid water is adjusted to 35 4.5. The laccase activity of the sample is 2065 nkat / ml, which showed that 10% by volume in dimethylformamide achieves 49% of the activity determined without an organic solvent, even when the pH is adjusted with sulfuric acid (pH 4.5).

Esimerkki 23.Example 23.

5 Esimerkin 22 mittaus toistetaan käyttäen dime- tyylisulfoksidia.The measurement of Example 22 is repeated using dimethyl sulfoxide.

Esimerkki 24.Example 24.

Esimerkin 22 mittaus toistetaan käyttäen dime-10 toksietaania.The measurement of Example 22 is repeated using dime-10 toxin ethane.

Esimerkki 25.Example 25.

Esimerkin 22 mittaus toistetaan käyttäen me- tanolia.The measurement of Example 22 is repeated using methanol.

1515

Taulukossa 4 on esitetty tulokset esimerkeistä 7 - 25. Taulukossa näkyy lakkaasin aktiivisuus (nkat/ml) syringaldatsiini substraattina liuoksessa, jossa 10 til-% orgaanista liuotinta on sekoitettu 0,1 M 20 sitraatti-fosfaattipuskuriin (90 til-%) (pH 5,0) tai rikkihapotettuun veteen (pH 5,0 tai 4,5) (- 1 ei tehty).Table 4 shows the results of Examples 7 to 25. The table shows the laccase activity (nkat / ml) of syringaldazine as a substrate in a solution in which 10% by volume of organic solvent was mixed with 0.1 M citrate-phosphate buffer (90% by volume) (pH 5, 0) or sulfuric acid water (pH 5.0 or 4.5) (- 1 not made).

• 1 • le , , 94261 28• 1 • le,, 94261 28

Liuotin H2S04 H2S04 sitr.fosf.Solvent H2SO4 H2SO4 citr.phosph.

pusk. suhteellinen pH 5,0 pH 4,5 pH 5,0 aktiivuus 5 nkat/ml nkat/ml nkat/mlbuf. relative pH 5.0 pH 4.5 pH 5.0 activity 5 nkat / ml nkat / ml nkat / ml

Ei 4607 100 liuotinta 4213 100 2959 100 10No 4607 100 solvent 4213 100 2959 100 10

Dimetyyli- 1660 36 formamidi 2065 49 1439 49 15 Dimetyyli- sulfoksidi 2939 70 1964 70 1,2-Di- 4460 96 20 metoksisi- 3115 74 etaani 2795 99Dimethyl 1660 36 formamide 2065 49 1439 49 15 Dimethyl sulfoxide 2939 70 1964 70 1,2-Di- 4460 96 20 methoxysi- 3115 74 ethane 2795 99

Metanoli 3576 78 25 2495 88 1-Propanoli 2336 51 1639 39 2714 92 30Methanol 3576 78 25 2495 88 1-Propanol 2336 51 1639 39 2714 92 30

Isopropano- 4918 107 : r ·. li/etyyli- 3885 92 asetaatti(1:1) 2885 102 35 Metanoli/- 4105 89 etyyliase- 1481 35 taatti(l:l) 2988 106Isopropano-4918 107: r ·. / ethyl 3885 92 acetate (1: 1) 2885 102 35 Methanol / 4105 89 ethyl acetate 1481 35 acetate (1: 1) 2988 106

Hydroksime- - c 40 toksigly- 3514 83 köli 2417 86Hydroxime- - c 40 toxigly- 3514 83 keel 2417 86

Esimerkkien 7-25 mukaan lakkaasi toimii 45 useiden orgaanisen liuottimen läsnäollessa paitsi pus- 94261 29 kurissa myös rikkihapolla hapotetussa vedessä.According to Examples 7-25, the laccase acts 45 in the presence of several organic solvents not only in the buffer but also in sulfuric acidified water.

Esimerkki 26.Example 26.

Valmistetaan 0,1 M sitraatti-fosforipuskurei-5 ta, joiden pH on 3,5, 4,0, 4,2, 4,4, 4,6, 4,8, 5,0,Prepare 0.1 M citrate-phosphorus buffer with pH 3.5, 4.0, 4.2, 4.4, 4.6, 4.8, 5.0,

5,2, 5,4, 5,6, 5,8, 6,0 ja 6,5. Esimerkissä lakkaasia, aktiivisuudeltaan 3000-5000 nkat/ml, laimennetaan 1/-1000. 850 μΐ vuoronperään yhtä edelläkuvattuun 0,1 M5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0 and 6.5. In the example, laccase, having an activity of 3000-5000 nkat / ml, is diluted 1 / -1000. 850 μΐ alternately equal to 0.1 M as described above

sitraatti-fosfaattipuskuriin lisätään 100 μΐ laimennet-10 tua lakkaasia sekä juuri ennen mittausta 50 μΐ 0,5 mM syringaldatsiinia. Näytteen kokonaistilavuudeksi tulee 1000 μΐ. Näyte temperoidaan 25 °C:ssa ja absorbanssi mitataan aallonpituudella 525 nm spektrofotometrillä. Lakkaasin aktiivisuus määritetään maksiminopeuden (V^) 15 kohdalta eli silloin kun reaktion alusta on kulunut 20 sekuntia. Näytteen lakkaasin aktiivisuudeksi saadaan 148 - 2670 nkat/ml.add 100 μΐ of diluted laccase to the citrate-phosphate buffer and 50 μ ennen of 0,5 mM syringaldazine just before measurement. The total volume of the sample becomes 1000 μΐ. The sample is tempered at 25 ° C and the absorbance is measured at 525 nm with a spectrophotometer. Laccase activity is determined at a maximum rate (V ^) of 15, i.e. after 20 seconds from the start of the reaction. The laccase activity of the sample is 148 to 2670 nkat / ml.

Kuvassa 8 on esitetty tällä tavoin saatu lakkaasin optimiaktiivisuuskäyrä, so. pH:n vaikutus lak-20 kaasin aktiivisuuteen. Esimerkin mukaisesti lakkaasi toimii parhaiten alueella pH 4 - 5,5.Figure 8 shows the optimum activity curve of laccase thus obtained, i. Effect of pH on lak-20 gas activity. According to the example, lacquer works best in the pH range of 4 to 5.5.

Esimerkki 27Example 27

Suurimolekyylistä ultrasuodatettua alkalilig-25 niinipreparaattia mitataan 5,0 ml (5,6 g) ja lisätään ; dimetyyliformamidia (DMF) 0,5 ml siten, että DMF tulee • I < olemaan n. 5 % (til/til). Liuotin imeytyy näytteeseen, minkä jälkeen lisätään 4 ml 0,1 M sitraatti-fosfaatti-puskuria (pH 5,0), jolloin muodostuu homogeeninen seos, 30 jonka kokonaistilavuus on 9.5 ml. Sekoitetaan ja lisätään lakkaasia 0,5 ml (2100 nkat) (n. 380 nkat/g ligniiniä) , jolloin entsyymitoiminta käynnistyy. Näytettä sekoitetaan huoneenlämmössä kuten esimerkissä 2, ja näytteen todetaan 24 tunnin reaktioajan jälkeen sisäl-35 tävän homogeenisen, selvästi geelimäisen osan sekä erillisen vesifaasin.Measure 5.0 ml (5.6 g) of the high molecular weight ultrafiltered alkali lignin preparation and add; dimethylformamide (DMF) 0.5 ml so that the DMF will be about 5% (v / v). The solvent is absorbed into the sample, followed by the addition of 4 ml of 0.1 M citrate-phosphate buffer (pH 5.0) to form a homogeneous mixture with a total volume of 9.5 ml. Mix and add 0.5 ml (2100 nkat) of laccase (about 380 nkat / g lignin) to initiate enzyme activity. The sample is stirred at room temperature as in Example 2, and after a reaction time of 24 hours, the sample is found to contain a homogeneous, clearly gel-like part and a separate aqueous phase.

94261 3094261 30

Esimerkki 28.Example 28.

N. 1 1 (n. 1,12 kg) ultrasuodatettuun suuri-molekyyliseen alkaliligniiniin, jonka kuiva-ainepitoisuus on 28 %, lisätään huoneenlämpötilassa ja normaa-5 lissa ilmanpaineessa n. 1 1 dimetoksietaania (n. 10 %, til/til). Tämän jälkeen joukkoon lisätään n. 8 1 lievästi rikkihapotettua vettä. Saatuun liuokseen lisätään lakkaasientsyymiä (n. 0.7 g proteiinia, 3.8 mkat ak tiivisuutta) 100 ml:ssa vettä. Käsittely kestää n. 1 -10 48, esim. 24 h, jona aikana geeliytyminen tapahtuu.About 1 L of dimethoxyethane (about 10%, v / v) is added to about 1 L (about 1.12 kg) of ultrafiltered high molecular weight alkali lignin with a dry matter content of 28% at room temperature and normal atmospheric pressure. After this, about 8 l of slightly sulfurized water is added to the set. To the resulting solution is added the enzyme laccase (ca. 0.7 g protein, 3.8 mkat activity) in 100 ml water. The treatment takes about 1 to 10 48, e.g. 24 hours, during which time gelation takes place.

Esimerkki 29.Example 29.

Suoritetaan käsittelyt A ja B esimerkissä 28 esitetyn mukaisesti, mutta käyttäen seuraavia määriä: 15 Käsittely _A_B_Perform treatments A and B as described in Example 28, but using the following amounts: 15 Treatment _A_B_

Ultrasuodatettua suuri-molekyylistä alkalilig-20 niiniä, 1 11 (kg) (1,12) (1,12)Ultrafiltered high molecular weight alkali ligin-20, 11 (kg) (1.12) (1.12)

Entsyymiä, g n. 0,06 n. 0,7 (mkat/kg alkaliligniini) (0,5) (3,8) 25 . . . Dimetoksietaania, 1 0,2 2 (%, til/til) (2) (20)Enzyme, g about 0.06 about 0.7 (mkat / kg alkali lignin) (0.5) (3.8) 25. . . Dimethoxyethane, 1 0.2 2 (%, v / v) (2) (20)

Rikkihapotettua vettä, 1 8,8 7 30 _ Käsittelyn kesto on n. 24 h sekä A että B tapauksessa, jona aikana geeliytyminen tapahtuu.Sulfurized water, 1 8,8 7 30 _ The duration of the treatment is about 24 h in both A and B, during which time gelation takes place.

««

Claims (10)

9426194261 1. Menetelmä alkaliligniinin molekyylipainon nostamiseksi, tunnettu siitä, että alkalilig-5 niiniä polymeroidaan käsittelemällä alkaliligniinin ve-siseosta, joka sisältää orgaanista liuotinta 1-20 til-%, ligniiniä polymeroivasti modifioivalla entsyymi valmisteella, joka sisältää oksidaasia ja/tai perok-sidaasla, seoksen pH-arvon ollessa 2-7.A process for increasing the molecular weight of alkali lignin, characterized in that the alkali lignin is polymerized by treating an aqueous mixture of alkali lignin containing 1 to 20% by volume of an organic solvent with a lignin polymerizing modifying enzyme preparation containing oxidase and / or peroxidase. at a pH of 2-7. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä tunnettu siitä, että seoksen pH sovitetaan välille 2,5 - 6,5, edullisemmin 3-6, edullisimmin 3,5 - 5,5.Process according to Claim 1, characterized in that the pH of the mixture is adjusted to between 2.5 and 6.5, more preferably between 3 and 6, most preferably between 3.5 and 5.5. 3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen me-15 netelmä tunnettu siitä, että orgaanisen liuottimen määrä on n. 2 - 10 til-% kokonaistilavuudesta laskettuna.Process according to Claim 1 or 2, characterized in that the amount of organic solvent is about 2 to 10% by volume, based on the total volume. 4. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen menetelmä tunnettu siitä, että orgaaninen , .·, 20 liuotin on alkoholi, jossa on 1 - 5 hiiliatomia, muu polaarinen liuotin tai näiden seos, edullisesti dime-tyyliformamidi, dimetyylisulfoksidi, 1,2-dimetoksietaa-ni, hydroksimetoksiglykoli, isopropanoli, 1-propanoli, metanoli tai etyyliasetaatti, tai näiden seos.Process according to one of Claims 1 to 3, characterized in that the organic solvent is an alcohol having 1 to 5 carbon atoms, another polar solvent or a mixture thereof, preferably dimethylformamide, dimethylsulfoxide, 1,2-dimethoxyethane. hydroxymethoxyglycol, isopropanol, 1-propanol, methanol or ethyl acetate, or a mixture thereof. 5. Jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukainen : : < menetelmä tunnettu siitä, että käsiteltävän alkaliligniinin jakeen, jonka moolimassa on yli 5000, osuus on yli 35 %, edullisesti yli 40 %, edullisesti yli 50 %.Process according to one of Claims 1 to 4: characterized in that the fraction of alkali lignin to be treated having a molecular weight of more than 5000 is more than 35%, preferably more than 40%, preferably more than 50%. 6. Jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukainen menetelmä tunnettu siitä, että alkaliligniini on valmistettu mustalipeästä seostamalla tai ultrasuo-dattamalla.Process according to one of Claims 1 to 5, characterized in that the alkali lignin is prepared from black liquor by doping or ultrafiltration. 7. Jonkin patenttivaatimuksista 1-6 mukainen 35 menetelmä tunnettu siitä, että alkalilignii- nissä on hapolla saostuvaa ligniiniä 70 - 90 %.Process according to one of Claims 1 to 6, characterized in that the alkali lignin has an acid-precipitating lignin of 70 to 90%. 8. Jonkin patenttivaatimuksista 1-7 mukainen 94261 menetelmä tunnettu siitä, että käytettävät entsyymit ovat lakkaasi, ligniiniperoksidaasi ja/tai mangaaniperoksidaasi.Process 94261 according to one of Claims 1 to 7, characterized in that the enzymes used are laccase, lignin peroxidase and / or manganese peroxidase. 9. Jonkin patenttivaatimuksista 1-8 mukainen 5 menetelmä tunnettu siitä, että käsittelyssä polymeroituva alkaliligniini muodostaa geelin.Process according to one of Claims 1 to 8, characterized in that the alkali lignin polymerizable in the treatment forms a gel. 10. Jonkin patenttivaatimuksista 1-9 mukai sella menetelmällä valmistetun tuotteen käyttö sideaineena lignoselluloosamateriaalista valmistettavien 10 tuotteiden, esim. paperin, kartongin, kuitulevyjen ja lastulevyjen valmistuksessa. ' · < • · · <· · c • · < • · 94261Use of a product made by a process according to any one of claims 1 to 9 as a binder in the manufacture of products made of lignocellulosic material, e.g. paper, board, fibreboard and particle board. '· <• · · <· · c • · <• · 94261