FI93309C - Menetelmä stabiilin sinkki-protamiini- -interferonikompleksin valmistamiseksi - Google Patents

Description

93309

Menetelmä stabiilin sinkki-protamiini-a-interferonikom-pleksin valmistamiseksi - Förfarande för framställning av ett stabilt zink-protamin-a-interferonkomplex 5 Esillä olevan keksinnön kohteena on menetelmä stabiilin sinkki-protamiini-a-interferonikompleksin valmistamiseksi.

Injisoitavat farmaseuttiset formulaatiot ovat alalla yleisesti tunnettuja. Kts. Remington's Pharmaceutical Sciences. 10 Mack Publishing Company, Easton, PA 16. painos, 1980. Tällaiset formulaatiot ovat tavallisesti dispersioina, kuten kolloideina, emulsioina ja suspensioina. Viime aikoina on käytetty hitaasti vapauttavia, injisoitavia formulaa-tioita, jotka sisältävät polymeerejä.

15

Vesipitoiset tai veden kanssa sekoittuvat suspensiot kuuluvat tyypillisiin hitaasti vapauttaviin, injisoitaviin for-mulaatioihin, mutta näillä suspensioilla on usein stabii-lisuusongelmia eikä niillä ehkä saada aktiivisen aineen 20 riittävän pitkää retentioaikaa formulaatiossa. Tämä johtuu joko siitä, että dispersio hajoaa tai siitä, että dispersio liukenee liiaksi ympäröiviin kehon nesteisiin (esimerkiksi verenkiertosysteemi ja imusolmusysteemi).

25 Eräs esimerkki menestyksellisestä, vesipohjaisesta hitaasti vapauttavasta suspensiosta on protamiini-sinkki-insu-liinisuspensio. United States Pharmacopeia (USP) kertoo suspension olevan standardiformulaation, joka sisältää 40 - 100 USP insuliiniyksikköä sinkin (0,15 - 0,25 mg 30 sinkkiä/100 USP insuliiniyksikköä) ja protamiini (1 - 1,5 mg protamiini/100 USP insuliiniyksikköä) vesiliuoksen, pH 7,1 - 7,4 ml kohti. pH ylläpidetään tyypillisesti 0,15 - 0,25 %:lla (paino/paino) kaksiemäksistä natrium-formulaattia, ja formulaatio sisältää myös 1,4 - 1,8 % 35 (paino/tilavuus) glyseriiniä ja 0,18 - 0,22 % (paino/tila-vuus) kresolia tai 0,22 - 0,28 % (paino/tilavuus) fenolia.

2 93309

Insuliinin konsentraatiosta ja potilaan vasteesta riippuen yksi ruiske vapauttaa insuliinia 3 päivään asti.

Interferonit ovat perheproteiineja, joilla on virustenvas-5 täinen aktiivisuus tiettyjä viruksia vastaan ja syövänvas-tainen aktiivisuus tiettyjä syöpiä vastaan. Interferoneihin kuuluvat luonnonmukaiset tai rekombinantit alfa (leukosyytti) , beta (fibroplasti) ja gamma (immuuni)-interferonit, mutta tämän keksinnön mukaisissa seoksissa käytetään mie-10 luummin alfa-interferoneja. Ihmisen alfa-interferoni on luonnossa esiintyvä vähintään 11 komponentin, mukaanlukien nk. alfa! ja alfa2-interferonien seos. Näistä kahdesta tässä keksinnössä käytetään mieluummin jälkimmäistä. Ihmisen alfa-interferoni, jolla on samankaltaisia biologisia 15 ominaisuuksia kuin luonnossa esiintyvällä alfa-interferonilla, voidaan tehdä myös rekombinanttimenetelmillä. Rubenstein, Biochem. Biophys. Acta.. 695. 5-16 (1982); Nagata et ai., Nature. 284. 316 - 320 (1980); EP 32.234, ja US-patentti 4.289.690 ovat julkaisseet alfa2-interferonin 20 valmistusmenetelmiä. Tämän keksinnön piiriin sisältyvät myös nk. alfa-hybridi-interferonit, joissa on liitetty toisiinsa kahden tai useamman natiinin α-interferonilajin fragmentit (kts. esimerkiksi EP 51.873). α-interferonin parenteraalisen antamisen on ilmoitettu olevan tehokas 25 Kaposi'n sarkooman, tyvisolusyövän, multippelimyelooman ja virussyylien hoidossa. Alan ammattimiehet voivat helposti määrittää alfa-interferonin tehokkaan annoksen.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että se 30 käsittää seuraavat vaiheet: a) säädetään liuenneen lyofilisoidun a-interferonin 2.106 - 200.106 kansainvälisiä yksiköitä sisältävän liuoksen pH-arvoon 7,5 - 8,5 puskurissa, joka sisältää 0 - 50 mg glysiinia/ml ja ihmisseerumialbumiinia/ml; mieluummin 35 pH 8,2, ja joka valinnaisesti sisältää ihmisen seerumialbu-miinia ja/tai glysiiniä; 3 93309 b) a-interferonin puskuroitu liuos saatetaan reagoimaan 0,25 - 5 mg:n kanssa vapaata protamiiniemästä tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävän suolan kanssa sekoittaen ja lisätään 1 - 20 mg sinkkisuolaa sekoittaen, joka sinkki-5 suola lisätään samanaikaisesti vapaan protamiiniemäksen tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävän suolan lisäämisen kanssa tai tämän lisäämisen jälkeen.

Kun tunnetun sinkki-protamiini-insuliini-kompleksin liu-10 kenemattomuus perustuu näihin kolmeen komponenttiin, esillä olevan keksinnön mukainen sinkki-protamiini-a-interferoni-kompleksi sisältää mieluummin myös toista proteiinia, ihmisen seerumialbumiinia, jotta liukenematon kompleksi muodostuisi maksimaalisesti, ja se voi yllättäen sisältää 15 jopa mooliylimäärän glysiiniä, sinkkikelaattoria. Eräässä suositellussa menetelmässä, jolla esillä olevan keksinnön mukainen liukenematon kompleksi muodostetaan, lisätään protamiinia liuokseen ennen sinkkiä, jotta varmistettaisiin se, että liukoista proteiinia pysyy minimimäärä supernatan-20 tissa, ja jotta varmistettaisiin se, että liukenematon kompleksi on hienojakoisina kolloidaalisina hiukkasina, jotka pysyvät dispersiossa pidemmän aikaa, eikä suurina kolloidaalisina kasaumina, jotka laskeutuvat helposti. Liukenemattoman kompleksin toisessa suositellussa muodosta-25 mismenetelmässä lisätään samanaikaisesti protamiinia ja sinkkiä.

Taulukossa 1 on annettu tulokset, kun jätetään pois eri komponentit ja sinkin ja protamiinin lisäämisjärjestyksen 30 vaikutus, kun seos sisältää 1 mg HSA/ml, 0,1 mg a-interfe-ronia (IFN)/ml ja 20 mg glysiiniä (G)/ml 0,02M fosfaatti-puskurissa (p) ; lisäämällä sinkki ensin päästään 5 %:iin liukoista proteiinia, kun taas lisäämällä ensin protamiinia päästään alle 1 % liukoiseen proteiiniin. Pystyrivit 3, 4 35 ja 5 osoittavat, että ilman puskuria ja glysiiniä ja ilman ihmisen seerumialbumiinia, ei vastaavasti muodostu kompleksia maksimaalinen määrä, koska kussakin näissä yhdistel- 4 93309 missä päästään vähintään 5 % liukoiseen proteiiniin. Vaikkakin pystyrivi 2 osoittaa, että glysiinin läsnäolo ei ole välttämätöntä maksimaalisesti liukenemattoman kompleksin muodostumiselle, pystyrivi 1 osoittaa, että glysiini ei ole 5 kompleksille haitallinen huolimatta sen sinkkiä gelatoivis-ta ominaisuuksista, mikäli protamiini lisätään ennen sinkkiä .

TAULUKKO 1 10

Liukoisen proteiinin havaitun määrän riippuvuus koostumuksesta ia sinkin/protamiinin lisäämisiäriestvksestä

Yhd.

15 Lisäämis- HSA/IFN HSA/IFN HSA/IFN HSA/IFN IFN

järjestys (p/G)_(pj_(H2Q/G)_(H2Q]_iH2Ql.

Zn/protamiini 5% <1% 10% 5% 5%

Protamiini/Zn <1% <1% >10% 5% 5% 20 Glysiiniä on mukana esillä olevassa keksinnössä 0-50 mg/ml, koska sitä on mukana siinä lyofilisoidus-sa interferonissa, jota mieluummin käytetään tämän keksinnön mukaisten seosten valmistamiseen. Kts. US-patent-ti 4.496.537, jossa biologisen stabiilisuuden takaamiseksi 25 lisätään interferoniliuoksiin puskuria, glysiiniä ja ihmisen seerumialbumiinia ennen lyofilisointia.

Liukenemattoman kompleksin muodostuminen on tasapainoilmiö. Kuten taulukosta 1 havaitaan, lähes täydellinen liukenemat-30 tomuus (so. 99 %) voidaan saavuttaa, kun halutaan maksimoida hitaasti vapautuminen. Kuitenkin, jos tietyn liukoisen jakeen halutaan vapautuvan välittömästi, komponenttien suhdetta voidaan muuttaa tai mieluummin muutetaan pH-arvoa. Liukenemattoman kompleksin muodostuminen on maksimaalista, 35 kun interferoniliuos on säädetty pH-arvoon 8,0 - 8,4, mieluummin 8,2, mutta pH-arvon säätö välille pH 7,5 ja 8,5 sallii liukoisten lajien muodostumisen, jolloin alfa-interferonia vapautuu välittömästi. Taulukossa 2 on esitetty 5 93309 pH-arvon muutoksista johtuva kompleksin muodostumisen muuttuminen.

TAULUKKO 2 5 LIUKENEMATTOMAN KOMPLEKSIN MUODOSTUMINEN vs pH Sidonta

700 nm_pH

10 0,2 7,0 1,12 7,5 2.64 8,0 2.64 8,3 2,44 8,4 15 1,80 8,6

Alfa-interferonin vapautumista komplekseista ei voida mitata in vitro, koska laimentaminen ei sitä tee liukenevaksi vaan pikemminkin fysiologisten gelatointiaineiden 20 korvaantuminen sekä seerumialbumiini. Vapautumisnopeus in vivo voidaan mitata käyttämällä radio-jodattua alfa-interferonia ja seuraamalla radioaktiivisuuden häviämistä injisointikohdassa ja radioaktiivisuutta seerumissa ja virtsassa. Tällaiset rotilla suoritetut testit osoittivat 25 hitaasti tapahtuvan vapautumisen kestävän yli 2 viikkoa.

Alfa-interferonin määrä keksinnön mukaisissa formulaatiois-sa on 2 x 106 - 200 x 106 kansainvälistä yksikköä (I.U.) kompleksin ml kohti, mieluummin 2 x 107 I.U./ml.

30

Sinkki voidaan tuottaa 1 - 20 mg:na sinkkisuolaa/ml, jolloin sinkkisuola voi olla valittu sinkkiasetaatista, sink-kikloridista tai sinkkisulfaatista. Näistä suositellaan sinkkiasetaattia.

35

Protamiini voidaan tuoda 0,25 - 5 mg, mieluummin 2,5 mg protamiinina/ml, jolloin protamiini on valittu vapaasti 6 93309 protamiini-emäksestä, protamiinikloridista, protamiinifos-faatista tai protamiinisulfaatista. Näistä suositeltu on sulfaatti.

5 Ihmisen seerumialbumiinia on mukana konsentraatiovälillä 0-10 mg/ml, mieluummin 0,5-1 mg/ml.

Mitä tahansa kemiallisesti ja farmaseuttisesti yhteensopivaa puskuria voidaan käyttää interferoniliuoksen valmis-10 tamiseen. Näistä suositeltu on fosfaattipuskuri. Interfe-roniliuoksilla on maksimaalinen stabiilisuus pH-välillä 6,5 - 8,0, mieluummin välillä 7,0 - 7,4 (kts. US-patentti 4.496.537). Ennen kompleksin muodostumista käytetään interferoniliuoksen pH-arvon säätämiseen välillä 7,5 - 8,5 mie-15 luummin natriumhydroksidia. Puskurointlaineella ei saa olla voimakasta affiniteettia sinkin suhteen, koska tämä pyrkisi poistamaan sinkkiä kompleksista. Sinkkiin kohdistuvan affiniteetin puute on erityisen tärkeää, kun mukana on glysii-niä, koska glysiini on sinkin kelaattori; kun glysiini ei 20 ole mukana, voidaan sallia, että puskurilla on jonkin verran affiniteettia sinkin suhteen. Puskuria, jolla on jonkin verran affiniteettia sinkkiin (esimerkiksi sitraattia tai asetaattia), voidaan käyttää, kun halutaan lisätä liukoista jaetta, joka välittömästi vapauttaa interferonia.

25

Eräässä hyvänä pidetyssä esillä olevan keksinnön mukaisen liukenemattoman kompleksin valmistusmenetelmässä rekonsti-tuoidaan US-patentissa 4.496.537 kuvatulla tavalla valmistettu lyofilisoitu alfa-interferoninäyte liuoksella, joka 30 sisältää sinkkiasetaattia ja protamiinisulfaattia halutussa pH-arvossa. Seuraavassa on annettu esimerkkejä lyofilisoi-dun alfa-interferonin ja rekonstituoidun kompleksin valmistamisesta .

35 7 93309 ESIMERKKI 1

LYQFILISOITU ALFA-INTERFERONI

Lvofilisointiliuos mg/ml 5 Alfa-l-interferoni 2 x 107 I.U.

Natriumfosfaatti, kaksiemäksinen, vedetön reagenssi 2,27

Yksiemäksinen natriumfosfaatti, USP 0,55

Glysiini, USP 20,0 10 Albumiini, ihmis, USP 1,0

Injektiovesi, USP q.s. ad 1,0 ml

Lisätään osa injektiovedestä (USP) sopivaan, sekoittimella varustettuun astiaan. Sen jälkeen lisätään ja liuotetaan 15 samalla sekoittaen natriumfosfaatti (kaksiemäksinen, vedetön reagenssi); yksiemäksinen natriumfosfaatti (USP); albumiini (ihmis-, USP) ja alfa-2-interferoni. Panos säädetään lopputilavuuteen injektiovedellä (USP).

20 Steriilissä paikassa suodatetaan liuos aseptisesti steriloituun astiaan steriloidun 0,2 mikronin suodattimen läpi, joka on pesty ja jonka ehjyys on testattu. Suodattimen ehjyys testataan suodattamisen jälkeen.

25 Liuos käytetään aseptisesti steriloituihin pulloihin, käytetyt pullot laitetaan steriloituun lyofilisaattoriin ja liuos lyofilisoidaan. Pullot suljetaan aseptisesti, sulatetaan ja reuna käännetään.

8 93309 ESIMERKKI 2

ALFA-INTERFERONIKOMPLEKSI

Ainesosat mg/ml 5 Lyofilisoitu alfa2-interferoni-pullo (kts. esimerkki 1) Sinkkiasetaatti 4,0

Protamiinisulfaatti 2,5

Natriumhydroksidi 0,6

Injektiovesi, q.s. 1 ml 10

Lyofilisoitu alfa2-interferoni liuotetaan osaan injektio-vettä. pH säädetään arvoon 8,2 natriumhydroksidilla. Lisätään protamiinisulfaatti ja sekoitetaan; lisätään sinkkiasetaatti ja sekoitetaan. Tämä kaikki säädetään lopputi-15 lavuuteen jäljellä olevalla injektiovedellä. Natriumhydroksidi, protamiinisulfaatti ja sinkkiasetaatti lisätään parhaiten väkevinä vesiliuoksina (esimerkiksi protamiinin tapauksessa 100 mikrolitraa 25 mg/ml vesiliuosta).

20 Tämän keksinnön mukaisen kompleksin muodostamiseen voidaan käyttää alfa-interferonin kantaliuoksia (so. lyofilisoimat-tomia) tai muita sopivia alfa-interferoninäytteitä. Mieluummin käytetään samaa komponenttien lisäämisjärjestystä kuin edellä on kuvattu, so. fosfaattipuskuri, HSA ja gly-25 siini lisätään vesipitoiseen alfa-interferoniin, pH säädetään, lisätään protamiini, lisätään sinkki ja liuos säädetään lopputilavuuteen.

Claims (1)

1. 93309 Patenttivaatimus Menetelmä stabiilin sinkki-protamiini-a-interferonikomp-leksin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että se 5 käsittää seuraavat vaiheet: a) säädetään liuenneen lyofilisoidun a-interferonin 2.106 - 200.106 kansainvälisiä yksiköitä sisältävän liuoksen pH-arvoon 7,5 - 8,5 puskurissa, joka sisältää 0 - 50 mg glysiinia/ml ja ihmisseerumialbumiinia/ml; mieluummin 10 pH 8,2, ja joka valinnaisesti sisältää ihmisseerumialbumii-nia ja/tai glysiiniä; b) a-interferonin puskuroitu liuos saatetaan reagoimaan 0,25 - 5 mg:n kanssa vapaata protamiiniemästä tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävän suolan kanssa sekoittaen ja 15 lisätään 1 - 20 mg sinkkisuolaa sekoittaen, joka sinkki- suola lisätään samanaikaisesti vapaan protamiiniemäksen tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävän suolan lisäämisen kanssa tai tämän lisäämisen jälkeen. 93309 Förfarande för framställning av ett stabilt zink-protamin-ό-interferonkomplex, kännetecknat därav, att 5 det orafattar följande steg: a) justering av en loaning av 2.106 - 200.106 internatio-nella enheter av upplöst lyofiliserat a-interferon till ett pH-värde av 7,5 - 8,5, i en buffert innehällande 0 - 50 mg glycin/ ml och 0 - 10 mg humant serumalbumin/ml; företrä- 10 desvis pH 8,2, och som alternativt innehäller humanseruma1-burnin och/eller glycin; b) omsättning av α-interferonets buffrade lösning med 0,25 - 5 mg fri proteinbas eller dess farmaceutiskt accep-tabla salt under omrörning och tillsättning av 1 - 20 mg 15 zinksalt under omrörning, vilket zinksalt tillsätts samti-digt med eller efter tillsättningen av den fria protamin-basen eller dess farmaceutiskt acceptabla sait.